KR20160092406A - 친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR20160092406A
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Abstract

본 발명은 친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 덱스트란 등의 친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 생체분자 검출방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자는 수용액에서 분산성이 향상되어 분자 진단 과정에서 진단 용액에 친수성 고분자 및 계면활성제 등을 추가로 첨가하지 않고도 향상된 분산성를 지속적으로 유지하여 항원항체 반응 등을 이용한 생체분자 검출에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자 및 이의 제조방법{Fluorescent silica nanoparticles coated with hydrophilic macromolecule and preparing method thereof}
본 발명은 친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 덱스트란 등의 친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 생체분자 검출방법에 관한 것이다.
최근에 발광 물질이 도입된 나노 입자는 의학생물학적 이미징 기술, 바이오센서 기술, 마이크로어레이, 약물 전달 등의 분야에서 지시약 및 광자 공급원으로서 매우 주목받고 있다. 그 중에서도, 실리카 나노입자는 높은 안정성 및 생체 적합성을 가질 뿐만 아니라 다량의 형광 물질의 도입이 가능하여 강한 형광 신호를 낼 수 있으며, 산소에 의한 급격한 광표백(photobleaching)을 막을 수 있기 때문에 광안정성을 높일 수 있고, 여러 종류의 작용기를 결합시킬 수 있는 기질로 활용될 수 있어서 다양한 생체분자 혹은 리간드를 도입하기가 용이하다는 장점을 가진다.
그러나, 실리카 입자를 진단이나 치료 등의 의료용으로 쓰기 위해서는 나노입자 크기가 100㎚ 이하인 것이 바람직하지만, 실리카를 나노입자로 만들면 서로 응집하여 500㎚ 이상으로 커져 버려 생체 내의 수용성 환경에서 안정적으로 운반 및 분산되지 않아 나노 바이오 분야에서 실리카 나노입자의 보다 폭 넓은 활용이 이루어지지 않고 있는 실정이다.
또한, 최근 생체분자 진단 시장의 간편화에 대한 요구로 인하여 검출시료 처리 및 처리방법의 간편성과 효율성에 대한 필요성이 증대되고 있으며, 검출대상 시료의 미량으로도 정확한 수치로 검출될 수 있는 검출한계의 개선이 요구되고 있다.
그러나, 기존의 생체분자의 검출방법에서는 미량 물질 검출에 사용되는 나노입자의 분산성을 증대시키기 위하여 검출시마다 친수성 고분자 및 계면활성제를 첨가하여야 하는 번거로움이 있었으며, 이러한 번거로운 검출과정이 추가됨으로 인하여 간단한 검출법이 요구되는 진단 키트 또는 진단용 형광 측정기기에 사용되지 못하는 한계가 있었으며, 또한 검출감도 저하의 문제점도 있었다.
본 발명자들은 검출시마다 친수성 고분자 및 계면활성제를 첨가하여야 하는 검출과정의 복잡성 및 검출감도 저하의 문제점을 해결하고자, 형광 실리카 나노입자의 분산성을 향상시킬 수 있는 방안에 대하여 연구하던 중, 형광 실리카 나노입자의 표면을 친수성 고분자, 예를 들어 덱스트란 등으로 코팅하는 경우에 수용액에서의 분산성이 향상되어, 분자 진단 과정에서 검출/진단 시료에 친수성 고분자 및 계면활성제 등을 추가로 첨가하는 공정 없이도 향상된 분산성를 지속적으로 유지함으로써, 항원항체 반응 등을 이용한 생체분자 검출에 유용하게 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 키토산 및 폴리(락틱-코-글리콜산)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자로 코팅된, 형광물질이 도입된 형광 실리카 나노입자 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG), 키토산(chitosan), 폴리(락틱-코-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자로 코팅된, 형광물질이 도입된 형광 실리카 나노입자가 제공된다.
일 구현예에서, 상기 형광물질은 알렉사 플루오르(Alexa fluor) 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, cy7, 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)), FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 쿠마린(Coumarin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 형광물질은 형광 실리카 나노입자 당 2 ~ 500개로 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 친수성 고분자는 카르복실기, 알데히드기, 히드록시기, 아민기 및 설파이드기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자 작용기를 가질 수 있으며, 상기 친수성 고분자 작용기를 매개로 컨쥬게이션(conjugation)된 분자를 가질 수 있으며, 상기 컨쥬게이션된 분자는 항체, 항원, RNA, DNA, PNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 바이오틴(Biotin) 및 방사선 동위원소 표지 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 형광 실리카 나노입자의 직경은 50 ~ 500 nm일 수 있으며, 제타 전위(Zeta potential)는 -5 ~ -50 mV일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 형광 실리카 나노입자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조영제 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 형광 실리카 나노입자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역분석용 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, (a) 용매에 형광물질, 작용기 도입물질 및 실리카 전구체를 혼합하여 촉매 존재 하에서 반응시켜 형광 실리카 나노입자 중간체를 제조하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 형광 실리카 나노입자 중간체를, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 키토산 및 폴리(락틱-코-글리콜산)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자로 코팅하는 단계를 포함하는 형광 실리카 나노입자의 제조방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 단계(a)의 작용기 도입물질은 3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란, N-메틸-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-메틸-3-아미노프로필트리에톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란, 4-아미노사이클로트리메톡시실란, 4-아미노사이클로트리에톡시실란, p-아미노페닐트리메톡시실란 및 p-아미노페닐트리에톡시실란으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 단계(a)의 실리카 전구체는 테트라메톡시실란 또는 테트라에톡시실란일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계(b)의 친수성 고분자는 카르복실기, 알데히드기, 히드록시기, 아민기 및 설파이드기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자 작용기를 가질 수 있으며, 상기 친수성 고분자 작용기는 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 키토산 및 폴리(락틱-코-글리콜산)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자를 숙신산 무수물(succinic anhydride), 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 에탄올아민(ethanolamine), 글리신(glycine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질과 반응시킴으로써 도입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, (a) 청구항 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 형광 실리카 나노입자를 준비하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 형광 실리카 나노입자 및 검출대상 물질을 반응시킨 후 광을 조사하는 단계; 및 (c) 단계(c)의 반응물의 형광을 측정하는 단계를 포함하는 생체분자 검출방법이 제공된다.
본 발명에 의해, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 키토산 및 폴리(락틱-코-글리콜산)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자로 코팅된, 형광물질이 도입된 형광 실리카 나노입자는 수용액에서의 분산성이 향상되어 분자 진단 과정에서 진단 용액에 친수성 고분자 및 계면활성제 등을 추가로 첨가하지 않고도 생물학적 안정성 및 향상된 분산성를 동시에 지속적으로 유지한다는 것이 밝혀졌다. 또한, 본 발명에 의한 분산성이 향상된 형광 실리카 나노입자를 사용하여 생체분자 검출을 수행하면 검출 단계의 복잡성에 따른 경제적 비용을 감소시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 키토산 및 폴리(락틱-코-글리콜산)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자로 코팅된, 형광물질이 도입된 형광 실리카 나노입자는 항원항체 반응 등을 이용한 생체분자 검출에 유용하게 사용될 수 있으며, 생체분자 검출을 위한 간단하면서도 저렴한 진단 키트 및/또는 진단용 형광 측정기기에 사용될 수 있다.
도 1은 덱스트란을 숙신산 무수물과 반응시켜 카르복실화 덱스트란(Dex-COOH)을 얻는 반응식(A) 및 카르복실화 덱스트란의 FT-IR 스펙트럼(B)이다.
도 2는 형광 실리카 나노입자 중간체를 카르복실화 덱스트란으로 코팅하여 형광 실리카 나노입자를 얻는 공정 및 코팅된 형광 실리카 나노입자의 표면(A), 및 형광 실리카 나노입자 중간체(AF647@SiNPs-NH2)를 카르복실화 덱스트란으로 코팅하여, 덱스트란 코팅된 형광 실리카 나노입자(AF647@SiNPs-Dex-COOH)를 얻는 공정(B)을 나타내는 개념도이다.
도 3은 덱스트란 코팅된 형광 실리카 나노입자(AF647@SiNPs-Dex-COOH)의 입도 측정 결과이다.
도 4는 형광 실리카 나노입자를 이용한 자기 입자-기반 샌드위치 면역측정법을 수행하여 얻은, 스트렙타비딘 농도 100 pg/ml을 포함하는 검량선 결과이다.
도 5는 마그네틱 비드 입자 상의 형광 실리카 나노입자(AF647@SiNPs)를 나타내는 주사 전자 현미경(SEM) 이미지이다.
도 6은 AF647@SiNPs-NH2, AF647@SiNPs-Dex-COOH, AF647@SiNPs-Dex-Biotin을 포함하는 PBS 완충액(0.15 M, pH 7.4)을 교반시켜, 교반 직후 (A), 교반 이후 30분 (B) 및 교반 이후 6시간 (C) 시점에서의 각 물질의 분산된 상태를 나타낸다.
본 발명은 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 키토산 및 폴리(락틱-코-글리콜산)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자로 코팅된, 형광물질이 도입된 형광 실리카 나노입자를 제공한다.
상기 친수성 고분자는 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자의 표면에 코팅되어 상기 형광 실리카 나노입자가 수용액에서 응집되지 않고 높은 분산성을 갖도록 하는 것으로서, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 키토산 및 폴리(락틱-코-글리콜산)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 친수성 고분자는 덱스트란일 수 있으며, 바람직하게는 분자량 약 9,000 내지 11,000 W/M의 덱스트란일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 형광물질은 알렉사 플루오르 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, cy7, 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)), FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 쿠마린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 그 중에서도, 본 발명에서 사용하는 형광물질은 근적외선(near infrared, NIR)을 발광하는 것이 바람직한데, 이는 근적외선은 생체 투과도가 높아서 생체 이미징(imaging)에 적합하기 때문이다.
실리카 나노입자에 도입되는 형광물질의 함량과 관련하여, 통상 나노입자는 일반 염료 분자보다 형광 신호가 강하기 때문에 농도를 낮추는 것이 가능하긴 하지만, 형광 실리카 나노입자 하나 당 2 ~ 500개의 형광분자를 함유한 형광 실리카 나노입자가 바람직한데, 이는 형광물질의 함량이 나노입자 하나 당 2개 미만이면 형광성이 저하되고, 500개를 초과하면 나노입자의 크기가 너무 커지기 때문에 본 발명의 용도에 부합하지 않기 때문이다.
본 발명의 형광 실리카 나노입자에 도입된 상기 형광물질은 광 조사에 의해 여기 상태(excitation state)가 되었다가 기저 상태(ground state)로 돌아가면서 흡수한 에너지를 특정 파장의 빛으로 방출하는 형광 특성을 가진다.
일 구현예에서, 상기 친수성 고분자는 카르복실기, 알데히드기, 히드록시기, 아민기 및 설파이드기 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자 작용기를 가질 수 있으며, 상기 친수성 고분자 작용기를 매개로 생체분자(biomolecue)를 포함한 유용한 다른 분자를 형광 실리카 나노입자에 콘쥬게이션(conjugation) 시킬 수 있다. 이때, 형광 실리카 나노입자에 컨쥬게이션 시키는 분자는 특별히 제한되지 않으나, 생체분자와 특이적으로 결합할 수 있는 물질인 것이 바람직하며, 예를 들면, 항체, 항원, RNA, DNA, PNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 바이오틴(Biotin), C14, I125, P32 및 S35 등의 방사선 동위원소 표지 물질 등이다.
상기 형광 실리카 나노입자의 직경은 바람직하게는 50 ~ 500 nm이며, 더욱 바람직하게는 100 ~ 110 nm이다. 직경이 50nm 미만이면 나노입자가 지나치게 작아서 다루기 힘들어지고, 다른 유용한 분자를 컨쥬게이션 시키는 것이 용이하지 않으며, 직경이 500nm를 초과하면 형광 실리카 나노입자를 멤브레인 타입 진단 키트 또는 생체 시스템에 사용하기에 과도한 크기를 가진다는 문제점이 발생한다.
상기 형광 실리카 나노입자의 제타 전위(Zeta potential)는 -5 ~ -50 mV, 바람직하게는 -20 ~ -30 mV, 가장 바람직하게는 -22 ~ -23 mV이다. 본 발명의 형광 실리카 나노입자는 상기와 같이 유체 내에서 표면에 음전하를 나타냄으로써 입자간 반발력 때문에 응집되지 않고 분산되어 있는 상태를 유지할 수 있다.
본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자는 나노입자 표면에 친수성 고분자가 코팅되어 있어 수용액 내에서 고분산성을 나타낼 뿐만 아니라, 종래 기술의 형광 실리카 나노입자에 비하여 분자 진단 과정에서 진단 용액에 친수성 고분자 및 계면활성제 등을 추가로 첨가하는 과정 없이도 향상된 분산성를 지속적으로 유지할 수 있어, 생체분자의 검출 및 생체분자의 영상화에 유용하게 사용될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자는 형광 현미경을 이용한 영상 진단 프로브(조영제), 바이오칩, 바이오센서 등의 생물의학적 분야에 널리 유용하게 사용될 수 있다.
예를 들어, 항체가 접합된 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자는, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능면역분석, 면역침전, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry) 등의 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)의 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자는 적절한 담체에 담지되어 윤활제, 습윤제, 유화제, 보존제 등과 함께 조성물을 이루어 사용되는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 담체는 약학적으로 허용되는 담체인 것이 바람직하며, 구체적으로, 물, 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 각종 완충 물질, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 등을 들 수 있다. 그리고, 상기 조성물은 진단방법이나 검출방법에 따라 체내에 투여되거나 체외 시료에 투여될 수 있는데, 체내에 투여할 경우에는 의약 분야에서 통상적으로 수행되는 방법에 따라 특별한 제약 없이 투여될 수 있으나, 경구 투여보다는 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 주사용 제제 등으로 수행하는 비경구 투여가 바람직하다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 형광 실리카 나노입자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조영제 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 형광 실리카 나노입자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역분석용 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, (a) 용매에 형광물질, 작용기 도입물질 및 실리카 전구체를 혼합하여 촉매 존재 하에서 반응시켜 형광 실리카 나노입자 중간체를 제조하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 형광 실리카 나노입자 중간체를, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 키토산 및 폴리(락틱-코-글리콜산)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자로 코팅하는 단계를 포함하는 형광 실리카 나노입자의 제조방법이 제공된다.
상기 단계(a)는 형광물질과 작용기 도입물질을 혼합하여 반응시킴으로써, 형광물질을 포함하는 동시에 작용기가 도입된 실리카 나노입자 중간체를 합성하는 단계이다.
상기 단계(a)의 용매는 디메틸설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 에틸 아세테이트, 테트라 하이드로퓨란(THF), 에틸아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴 등의 극성 유기 용매인 것이 바람직하며, 상기 형광물질은 상기에서 이미 설명한 바와 같이 알렉사 플루오르(Alexa fluor) 등을 사용할 수 있다.
상기 작용기 도입물질은 단계 (a)에서 제조되는 형광 실리카 나노입자 중간체의 표면에 작용기를 도입하기 위한 전구체로서, 바람직하게는, 아민기, 알데히드기, 수산기 또는 티올기를 도입할 수 있는 전구체이며, 더욱 바람직하게는 아민기를 도입할 수 있는 아미노알킬트리알콕시실란으로서 3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란, N-메틸-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-메틸-3-아미노프로필트리에톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란, 4-아미노사이클로트리메톡시실란, 4-아미노사이클로트리에톡시실란, p-아미노페닐트리메톡시실란 및 p-아미노페닐트리에톡시실란으로부터 선택될 수 있다.
상기 단계(a)에서는 형광물질과 작용기를 포함하는 물질과 실리카 전구체를 적절한 촉매의 존재 하에 적절한 용매에서 혼합하여 실리카 전구체의 클러스터로의 결합, 가수분해 및 축합반응을 통한 겔화 반응에 의해 형광물질과 작용기가 도입된 실리카 나노입자 중간체가 합성된다.
이때, 상기 용매는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는, 실리카 전구체의 가수 분해 반응을 진행시키는 역할을 하는 탈이온수(D.I. water) 등의 물과, 물 및 실리카 전구체를 균질하게 혼합시켜 가수 분해 반응을 진행시킬 수 있는 알코올의 혼합 용매를 사용한다. 상기 혼합용매에서 물과 알코올의 혼합비는 특별히 제한되지 않고, 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
또한, 상기 실리카 전구체는 테트라메톡시실란(tetramethoxy silane, TMOS), 테트라에톡시실란(tetraethoxy silane, TEOS) 또는 그 혼합물 등의 공지의 알콕시 실란을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 가수 분해 반응을 촉진시키기 위해 촉매하에서 진행되는 것이 바람직한데, 상기 촉매는 염산, 아세트산 등의 산성 촉매 또는 염화암모늄, 염화칼륨 등의 염기성 촉매 등에서 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
상기 단계(b)는 단계(a)에서 형성된 형광 실리카 나노입자 중간체의 표면을 친수성 고분자를 이용해 코팅함으로써 수용액에서 고분산성을 가지는 형광 실리카 나노입자를 제조하는 단계이다.
상기 단계(b)의 친수성 고분자는 카르복실기, 알데히드기, 히드록시기, 아민기 및 설파이드기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자 작용기를 가질 수 있다.
상기 친수성 고분자 작용기는 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 키토산 및 폴리(락틱-코-글리콜산)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자를 숙신산 무수물, 글루타르알데히드, 에탄올아민, 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질과 반응시킴으로써 도입될 수 있으며, 상기 반응은 예를 들어, 숙신산이 개환되어 덱스트란에 카르복실기가 고정되는 반응으로써 수행된다(도 1의 (A) 참조). 일 구현예에서, 상기 반응은 촉매 존재하에 수행될 수 있으며, 바람직하게는 디메틸 아미노피리딘(dimethyl aminopyridine) 존재하에서 수행될 수 있다. 상기 반응에서 숙신산 무수물의 당량을 하이드록시기의 당량보다 낮게 반응시킴으로써 하이드록시기와 카르복실기를 동시에 가지는 덱스트란을 제조할 수 있다.
상기 단계(b)는 형광 실리카 나노입자 중간체의 표면에 존재하는 작용기, 예를 들어 아민기와 친수성 고분자에 도입된 친수성 고분자 작용기, 예를 들어, 카르복실기의 커플링 결합으로써 수행될 수 있다. 상기 카르복실기의 커플링 결합은, 예를 들어, EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)(20 mM)/ NHS(N-Hydroxysuccinimide) 커플링 결합일 수 있다.
상기 형광 실리카 나노입자는 친수성 고분자에 의해 코팅됨으로써 전체 제타 전위(Zeta potential)가 -5 ~ -50 mV 이하의 범위로 제어됨으로써 수용액 내에서 나노입자 간의 엉김 현상이 발생하는 일 없이 높은 분산성을 유지할 수 있다. 상기 제타 전위의 제어는 본 단계에서 사용되는 친수성 고분자의 함량을 적절히 조절함으로써 이루어질 수 있으며, 이와 같이 친수성 고분자의 함량 조절에 의한 형광 실리카 나노입자의 제타 전위 제어는 당업자가 과도한 시행착오 없이 용이하게 수행할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자의 제조방법은, (c) 상기 단계(b)에서 얻어진 형광 실리카 나노입자의 표면에 존재하는 친수성 고분자 작용기를 통해 생체분자(biomolecue)를 포함한 유용한 다른 분자를 형광 실리카 나노입자에 콘쥬게이션(conjugation)시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자에 컨쥬게이션시키는 분자는 특별히 제한되지 않으나, 생체분자와 특이적으로 결합할 수 있는 물질인 것이 바람직하며, 예를 들면, 항체, 항원, RNA, DNA, PNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 바이오틴(Biotin), 방사선 동위원소 표지 물질 등이다.
상기 형광 실리카 나노입자의 작용기에 생체분자를 컨쥬게이션시키는 구체적인 수행 방법은 공지된 기법을 이용하여 당업자가 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 표면에 카르복실기를 가지는 형광 실리콘 나노입자의 경우에는 이를 EDC와 반응시켜 아민기를 함유한 생체분자와 컨쥬게이션시킬 수 있으며, 알데히드기를 가지는 형광 실리콘 나노입자의 경우에는 알데히드기에 의해 항체와 같은 단백질과 접합이 가능하고, 아민기를 가지는 형광 실리콘 나노입자는 무수 숙신산(succinic anhydride) 등으로 아민기를 카르복실기로 전환시킨 후, 이를 EDC와 반응시켜 아민기를 함유한 생체분자와 컨쥬게이션시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, (a) 청구항 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 형광 실리카 나노입자를 준비하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 형광 실리카 나노입자 및 검출대상 물질을 반응시킨 후 광을 조사하는 단계; 및 (c) 단계(c)의 반응물의 형광을 측정하는 단계를 포함하는 생체분자 검출방법이 제공된다.
상기 (a) 단계는 위에서 상세하게 설명한 제조방법에 따라 형광 실리카 나노입자를 제조함으로써 수행될 수 있다. 상기 (b) 단계에서는 실리카 나노입자에 포함된 형광물질의 흡광 영역에 해당하는 파장의 광을 조사한다. 상기 (c) 단계에서는 시료와 반응한 형광물질로부터 발산되는 형광을 형광 현미경 등을 통해 검출한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 카르복실화 덱스트란(Dex-COOH)으로 코팅된 형광 실리카 나노입자(AF647@SiNPs-Dex-COOH)의 제조
(1) 형광 실리카 나노입자 중간체의 합성(AF647@SiNPs-NH 2 )
1 mg의 알렉사 플루오르 647을 디메틸설폭사이드(DMSO) 100 uL에 녹인 후 그 중 10uL 를 취하여 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES) 0.036 uL 및 DMSO 89.964 uL로 이루어진 용액과 혼합하여 알렉사 플루오르 647 및 APTES가 각각 0.77 M 및 1.54 M의 농도를 가지도록 혼합용액을 준비한 후, 이 혼합용액을 상온에서 3시간 동안 600 rpm으로 교반하였다. 그리고나서, 에탄올 15.3 mL를 넣고 테트라에톡시실란(TEOS) 1 mL가 투입된 라운드 플라스크에 상기에서 교반된 혼합용액, 물 2 mL 및 암모니아수 0.2 mL를 차례로 넣고 상온에서 16시간 동안 600 rpm으로 교반한 후, APTES 10 uL를 추가로 넣어주고 상온에서 12시간 동안 600 rpm으로 상온에서 교반하고 나서 에탄올로 3차례 세척하여 표면에 아민기를 가지는 형광 실리카 나노입자 중간체(AF647@SiNPs-NH2)를 합성하였다.
(2) 카르복실화 덱스트란의 합성
덱스트란에 하기와 같은 방법으로 카르복실기(COOH)를 도입하였다(도 1의 (A)). 덱스트란(분자량 10,000 w/M) 1.18 g과 숙신산 무수물(succinic anhydride) 0.5 g, 디메틸 아미노피리딘(dimethyl aminopyridine, DMAP) 0.1 M을 50 mL의 DMSO에서 16시간 동안 교반한 후, 멤브레인(<8,000)에 용액을 넣고 증류수(D.W.)에서 투석(dialysis)하였다. 이후 동결건조기를 이용해 -30 ℃, 20 mmTorr에서 동결건조하였다. 얻어진 생성물에 대하여 적외선 분광분석(Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FT-IR)을 실시한 결과, 덱스트란에서는 볼 수 없었던 O=C-O-(1565 cm-1) 및 C=O(1734 cm-1) 피크를 확인하여 덱스트란에 카르복실기가 도입되었음을 확인하였다(도 1의 (B)).
(3) 형광 실리카 나노입자의 표면 코팅
형광 실리카 나노입자 중간체(AF647@SiNPs-NH2)를 EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)(20 mM), NHS(N-Hydroxysuccinimide) (40 mM), 및 PBS 완충액(pH 7.4, 0.15 M) 중에서 입자 밀도가 14 mg/mL이 되도록 제조하고, 제조된 혼합물 1 mL에 Dex-COOH 2 mg을 넣고 빛을 차단한 상태에서 18시간 동안 교반하였다. 이후 PBS 완충액(pH 7.4, 0.15 M)으로 3회 세척하여 카르복실화 덱스트란으로 코팅된 형광 실리카 나노입자(AF647@SiNPs-Dex-COOH)를 얻었다(도 2의 (B)).
(4) 바이오틴 결합된 덱스트란 코팅 형광 실리카 나노입자 (AF647@SiNPs-Dex-Biotin)의 제조
카르복실화 덱스트란으로 코팅된 형광 실리카 나노입자를 이용해 바이오틴이 컨쥬게이션된 형광 실리카 나노입자를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
바이오틴 하이드라자이드(Biotin hydrazide) 10 mM(2.6 mg)을 상기에서 제조된 AF647@SiNPs-Dex-COOH가 담긴 탄산수소나트륨(NaHCO3) 완충 용액(pH 9, 0.1 M) 1 mL에 넣고 3시간 동안 천천히 교반하였다. 교반이 완료된 후, 미반응한 카르복실기를 제거하기 위해 에탄올아민 1 uL 넣고 상온에서 3시간 동안 흔들어 교반하고, PBS 완충액(pH 7.4, 0.15 M)로 3차례 세척하여, 바이오틴이 컨쥬게이션된 형광 실리카 나노입자(AF647@SiNPs-Dex-Biotin)를 제조하였다.
시험예 1. 친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자의 입도 측정
입자 추적 분석(Particle tracking analysis)을 이용하여 실시예 1-(3)에서 제조된 친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자(AF647@SiNPs-Dex-COOH)의 입도를 측정하였다.
도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1-(3)에서 제조된 친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자들은 약 100 ∼ 110 nm의 평균 입도를 가지는 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, 실리카 나노입자 중간체를 친수성 고분자로 코팅한 후에도 나노 크기를 유지함으로써 나노입자 경향성이 그대로 유지된다는 것을 알 수 있다. 또한, 입도가 단일 피크로 나타나는 것에 의해, 제조된 친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자는 단분산성을 나타냄을 알 수 있으며, 이로써 수용액에서의 분산성이 높다는 것을 확인할 수 있다.
시험예 2. 친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자의 표면 전하 측정
제타 전위차계(Zeta potentiometer)로 실시예 1-(3)에서 제조된 친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자의 표면 전하(Zeta potential)를 측정하였다. 그 결과, 친수성 고분자로 코팅된 형광 실리카 나노입자들은 약 -22.3 mV를 나타내어 음전하를 띄고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터, 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자는 표면이 음전하를 나타냄으로써 수용액에서 고분산성을 가짐을 확인할 수 있었다.
시험예 3. 형광 실리카 나노입자를 이용한 마그네틱 입자-기반 샌드위치 면역측정
실시예 1-(4)에서 제조한 AF647@SiNPs-Dex-Biotin을 형광 입자로 사용하였으며, 마그네틱 입자(MB-Dex-Biotin)를 분리/ 정제의 지지체로 사용하였다. 본 시험은 자석으로 스트렙타비딘에 결합되어 있는 마그네틱 입자를 분리하고, 스트렙타비딘에 형광입자와 마그네틱 입자가 양쪽에서 결합된 상태에서 형광입자의 형광을 측정함으로써 스트렙타비딘의 양을 측정하는 방식이다.
마이크로튜브(microtube)에 MB-Dex-Biotin을 넣고, 각 농도의 스트렙타비딘(100 ng/mL, 10 ng/mL, 1 ng/mL, 100 pg/mL)을 추가로 투입하여 30분간 교반시킨 후, 생성물(MB-Streptavidin)을 PBS 완충액으로 세척하였다. 이 후, AF647@SiNPs-Dex-Biotin을 추가하여 빛을 차단한 조건에서 30분 반응시킨 후 세척함으로써 샌드위치 반응을 종료시켰다. 대조군(네거티브 컨트롤)으로서 스트렙타비딘 대신 BSA를 사용한 경우(Control 1)와 형광 나노입자에 바이오틴을 컨쥬게이션시키지 않은 경우(Control 2)를 사용하였다.
상기와 같이 수행하여 얻은 검량선을 도 4에 나타내었으며, 마그네틱 비드 입자 상의 형광 실리카 나노입자(AF647@SiNPs)를 나타내는 주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 도 5에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 형광 실리카 나노입자를 이용한 면역측정법은 상관계수(R2)가 약 0.98로서 직선성을 나타내어 생체분자 검출에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
또한, 스트렙타비딘 측정 검량선의 낮은 농도 구간인 100 pg/mL ∼ 10 ng/mL에서의 각 형광 강도(fluorescent intensity)를, BSA를 사용한 경우(Control 1) 및 형광 나노입자에 바이오틴을 컨쥬게이션시키지 않은 경우(Control 2)와 비교하였을 때, Control 1 및 Control 2 모두 각 목표값(Target)보다 낮은 형광 강도를 나타냄을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 바이오틴 컨쥬게이션된 형광 실리카 나노입자는 스트렙타비딘 이외의 단백질 분자에 대하여 비특이적으로 반응하지 않음을 알 수 있으며, 이에 따라, 본 발명의 바이오틴 컨쥬게이션된 형광 실리카 나노입자를 사용함으로써 미량의 생체분자를 감지해야 하는 생체분자 검출법에서 비특이적 흡착을 최소화할 수 있음을 확인하였다.
시험예 4. 종래의 형광 실리카 나노입자와의 분산성 비교
실시 예 1-(1), 1-(3), 1-(4)에서 합성한 AF647@SiNPs-NH2, AF647@SiNPs-Dex-COOH, AF647@SiNPs-Dex-Biotin의 분산도를 비교하기 위하여 하기와 같이 시험하였다.
2 mL 마이크로 튜브에 AF647@SiNPs-NH2, AF647@SiNPs-Dex-COOH, AF647@SiNPs-Dex-Biotin을 14 mg/mL의 농도로 포함하는 PBS 완충액(0.15 M, pH 7.4)을 500 μL씩 넣어 충분히 교반하였다. 교반 직후, 교반 이후 30분 및 교반 이후 6시간 시점에서 각 물질의 분산된 상태를 나타내는 혼합액의 성상을 관찰하여 도 6에 나타냈다.
도 6에서 알 수 있는 바와 같이, AF647@SiNPs-NH2은 분산도가 낮음에 비하여, AF647@SiNPs-NH2는 분산도가 증가되었음을 알 수 있고, 바이오틴을 컨쥬게이션시킨 AF647@SiNPs-Dex-Biotin의 경우에도 증가된 분산도가 유지된다는 것을 알 수 있다. 따라서, 덱스트란 코팅에 의해서 형광 실리카 나노입자의 분산성이 증가되었으며, 이러한 증가된 분산성은 바이오틴 컨쥬게이션시킨 이후에도 유지된다는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (19)

  1. 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 키토산 및 폴리(락틱-코-글리콜산)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자로 코팅된, 형광물질이 도입된 형광 실리카 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 형광물질이 알렉사 플루오르 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, cy7, 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)), FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 쿠마린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 형광 실리카 나노입자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 형광물질이 형광 실리카 나노입자 당 2 ~ 500개로 포함된 것을 특징으로 하는 형광 실리카 나노입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 친수성 고분자가 카르복실기, 알데히드기, 히드록시기, 아민기 및 설파이드기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자 작용기를 가지는 것을 특징으로 하는 형광 실리카 나노입자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 친수성 고분자 작용기를 매개로 컨쥬게이션(conjugation)된 분자를 가지는 것을 특징으로 하는 형광 실리카 나노입자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 컨쥬게이션된 분자가 항체, 항원, RNA, DNA, PNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 바이오틴(Biotin) 및 방사선 동위원소 표지 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 형광 실리카 나노입자.
  7. 제1항에 있어서, 직경이 50 ~ 500 nm인 것을 특징으로 하는 형광 실리카 나노입자.
  8. 제1항에 있어서, 제타 전위(Zeta potential)가 -5 ~ -50 mV인 것을 특징으로 하는 형광 실리카 나노입자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 형광 실리카 나노입자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조영제 조성물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 형광 실리카 나노입자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역분석용 조성물.
  11. (a) 용매에 형광물질, 작용기 도입물질 및 실리카 전구체를 혼합하여 촉매 존재 하에서 반응시켜 형광 실리카 나노입자 중간체를 제조하는 단계; 및
    (b) 단계(a)에서 얻어진 형광 실리카 나노입자 중간체를, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 키토산 및 폴리(락틱-코-글리콜산)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자로 코팅하는 단계
    를 포함하는 형광 실리카 나노입자의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단계(a)의 형광물질이 알렉사 플루오르 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, cy7, 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)), FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 쿠마린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 단계(a)의 작용기 도입물질이 3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란, N-메틸-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-메틸-3-아미노프로필트리에톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란, 4-아미노사이클로트리메톡시실란, 4-아미노사이클로트리에톡시실란, p-아미노페닐트리메톡시실란 및 p-아미노페닐트리에톡시실란으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 단계(a)의 실리카 전구체가 테트라메톡시실란 또는 테트라에톡시실란인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 단계(b)의 친수성 고분자가 카르복실기, 알데히드기, 히드록시기, 아민기 및 설파이드기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자 작용기를 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 친수성 고분자 작용기가 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 키토산 및 폴리(락틱-코-글리콜산)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 친수성 고분자를 숙신산 무수물, 글루타르알데히드, 에탄올아민, 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질과 반응시킴으로써 도입되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 제11항에 있어서, (c) 상기 단계(b)에서 얻어진 형광 실리카 나노입자에 분자를 콘쥬게이션시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 단계(c)의 콘쥬게이션된 분자가 항체, 항원, RNA, DNA, PNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 바이오틴(Biotin) 및 방사선 동위원소 표지 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  19. (a) 청구항 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 형광 실리카 나노입자를 준비하는 단계;
    (b) 단계(a)에서 얻어진 형광 실리카 나노입자 및 검출대상 물질을 반응시킨 후 광을 조사하는 단계; 및
    (c) 단계(c)의 반응물의 형광을 측정하는 단계
    를 포함하는 생체분자 검출방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20180117920A (ko) * 2017-04-20 2018-10-30 가천대학교 산학협력단 다공성 실리카 나노복합체 약물전달체 및 그의 제조방법
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