JP5448369B2 - 粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法、粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子、及びそれを用いた複合粒子 - Google Patents
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Description
蛍光試薬、発色試薬等の標識試薬は、蛍光粒子または発色粒子表面にタンパク質や、DNAが結合したものであり、このタンパク質やDNAが特定の生体分子と相互作用することによって、生体分子の検出、定量、染色等に利用されるものである。
蛍光粒子や発色粒子を標識試薬として用いるためには、生体分子を結合するための官能基を導入するために表面修飾が必要である。
タンパク質は、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等を有する。また、DNAについても、末端修飾によってアミノ基やチオール基を付与することが出来る。よってシリカ粒子にもアミノ基、カルボキシル基、チオール基等を導入すれば、架橋剤や縮合剤を用いて、シリカ粒子と生体分子を共有結合させることが可能である。
しかし、図6から明らかなように、従来のアミノ基を有するシリカ粒子では、シリカ粒子の表面電位が負であるのに対し、アミノ基がカチオン性のため、アミノ基がシリカ粒子表面に吸着してしまい、アミノ基を介して生体分子やポリエチレングリコールを結合することが出来なかった。これを改善するために、アニオン性基を有するシランカップリング剤を一緒に反応させる方法が知られているが、アミノ基の密度が下がり、またアニオン性基を有するシランカップリング剤の立体障害でアミノ基の反応性が低下することが課題であった(例えば、非特許文献1参照。)。
なお、本発明者らは、静電的引力を利用してカチオン性ポリマーおよびアニオン性ポリマーを粒子表面に交互に積層させる表面修飾方法について、特許出願している(特願2007−64205)。
Langmuir,22,4357‐4362(2006)
(1) 正の表面電位を有するシリカ粒子の表面に、この正の表面電位を維持したまま、アミノ基を少なくとも1つ有するアルキル基を共有結合させて前記シリカ粒子を表面修飾する工程を含んでなる、粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法。
(2) 酸を含有させた水/アルコール混合溶媒にシリカ粒子を分散させてなる正の表面電位を有するシリカ粒子の分散液に、下記一般式1で表されるシランカップリング剤を含有させ、正の表面電位を有する前記シリカ粒子の表面に、アミノ基を少なくとも1つ有するアルキル基R 1 を共有結合させる工程を含んでなる、前記(1)に記載の製造方法、
一般式1
R 1 −Si(OR 2 ) 3
(式中、R 1 はアミノ基を少なくとも1つ有するアルキル基を表し、R 2 はアルキル基を表す。)
(3) 前記酸が鉱酸である前記(2)に記載の製造方法、
(4) シリカ粒子の表面にアミノ基を少なくとも1つ有するアルキル基が共有結合することで表面修飾された、粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子であって、pH7の純水中におけるζ電位が1〜70mVである、シリカ粒子、
(6) 前記(4)又は(5)に記載のシリカ粒子に、ポリエチレングリコールが共有結合してなるシリカ粒子/ポリエチレングリコールの複合粒子、
(7) 前記(4)又は(5)に記載のシリカ粒子に、ポリアクリル酸またはアルギン酸が共有結合または吸着してなるシリカ粒子/ポリアクリル酸の複合粒子、またはシリカ粒子/アルギン酸の複合粒子、
(8) 前記(4)又は(5)に記載のシリカ粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子/生体分子の複合粒子、
(9) 前記(6)に記載の複合粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子/ポリエチレングリコール/生体分子の複合粒子、
(10) 前記(7)に記載の複合粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子/ポリアクリル酸/生体分子の複合粒子、またはシリカ粒子/アルギン酸/生体分子の複合粒子、
(11) 前記生体分子が、抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド及び化学物質からなる群から選ばれた少なくとも1種である前記(8)〜(10)のいずれか1項に記載の複合粒子、
(12) 前記(11)に記載の複合粒子を分散媒中に分散してなる複合粒子コロイド、及び
(13) 前記(11)に記載の複合粒子を用いてなる分析試薬
を提供するものである。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法は、前記アミノ基がシリカ粒子表面に吸着することによる前記生体分子等との反応性が低下することを防止し、前記生体分子等と高い反応性で結合するシリカ粒子を製造することができる。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法は、反応過程においてシリカ粒子表面の表面電位が正のまま反転することがないので、前記反応過程においてシリカ粒子が凝集してしまうことがない。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子は、前記製造方法により得ることができ、表面に有する前記アミノ基がシリカ粒子表面に吸着することがないので、前記生体分子等と高い反応性を有する。
本発明の複合粒子は、非特異的吸着を防止し、分散安定性に優れ、生理食塩水等イオン強度が高い水分散コロイドとして用いても凝集を起こしにくい。
ここで、「非特異的吸着」とは、特定の官能基又はリガンドに特異的に結合する以外の規則に従わない吸着をいい、意図する以外の吸着現象をいう。
本発明の複合粒子は、分析試薬として用いることにより、非特異的吸着を防止し、分散安定性に優れる前記複合粒子のコロイドを形成することから、測定結果の再現性に優れ、信頼性が高く、シグナル/ノイズ比の高い極微量標的試料の高感度分析が可能である。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法(以下、単に「本発明の製造方法」ということもある。)は、酸を含有させた水/アルコール混合溶媒に分散させたシリカ粒子の分散液に、前記一般式1で表されるシランカップリング剤を含有させ、前記シリカ粒子の表面にアミノ基を少なくとも1つ有するアルキル基R 1 を共有結合させる工程を含んでなることを特徴とする。
図1は、本発明の製造方法の模式図を示す図である。
図1に示したように、前記シランカップリング剤を含有させる前に、前記酸により原料となるシリカ粒子の表面電位が正(プラス)になる。よって、前記シランカップリング剤を含有させ、前記シリカ粒子の表面修飾を行うに際しては、前記シリカ粒子の表面電位の反転(正から負)は起こらないので、アンモニア水を用いた従来法におけるような正に帯電した粒子と負(マイナス)に帯電した粒子との凝集・ゲル化、あるいは表面電位の絶対値が非常に小さい粒子同士の凝集・ゲル化が生じることはない。
したがって、従来法よりも多量の前記シランカップリング剤を反応に供することができ、得られるシリカ粒子は、生体分子等と反応し結合しうるアミノ基を粒子表面に、従来法よりも大量に存在させることができる。
前記水/アルコール混合溶媒の水素イオン濃度を前記酸によりpH0〜3とすることにより、本発明の製造方法の前後を通して、前記シリカ粒子表面の表面電位を正に維持することができ、pH0〜2であることが好ましい。
本発明の製造方法において、水/アルコール混合溶媒に含有させる前記酸は特に制限はないが、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸が挙げられ、塩酸であることが好ましい。
用いられる前記水に対し、0.1〜10mol/lの濃度で含有させることが好ましく、前記水に対し、0.5〜2mol/lの濃度で含有させることがより好ましい。
前記シランカップリング剤に特に制限はないが、3−アミノプロピルトリエトキシシラン(APS)、3−アミノプロピルトリメトキシシランが挙げられAPSが好ましい。また、前記シランカップリング剤の使用量としては、原料として用いる前記シリカ粒子1mgに対して、1〜50mgであることが好ましい。
本発明の製造方法における反応時間は30分〜48時間が好ましい。反応温度は特に制限はないが、4〜60℃であることが好ましい。
国際公開2007/074722A1公報に記載された蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の調製方法に準じて得られた、機能性化合物を含有するシリカ粒子を用いることが特に好ましい。
ここで、前記機能性化合物の具体例としては、蛍光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標識化合物、pH感受性色素化合物等が挙げられる。
具体的には、前記機能性化合物を含有するシリカ粒子は、前記機能性化合物とオルガノアルコキシシラン化合物とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合もしくは吸着させて得られた生成物に1又は2種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。
前記機能性化合物を含有するシリカ粒子の好ましい調製方法の態様としては、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する前記機能性化合物と、それら活性基と対応して反応する置換基(例えば、アミノ基、水酸基、チオール基)を有するとオルガノアルコキシシラン化合物とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に1又は2種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。前記オルガノアルコキシシラン化合物としてAPS、シラン化合物としてTEOSを用いた場合の反応を模式的に下記に例示する。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、YM−10、YM−100(いずれも商品名、ミリポア社製)等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収することで可能である。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子は、前述のように本発明の製造方法によって製造することができる。
本発明のシリカ粒子/ポリエチレングリコールの複合粒子は、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子にポリエチレングリコール化合物を共有結合させて製造することができる。
本発明において、「ポリエチレングリコール化合物」とは、ポリエチレングリコールを基本骨格に有し、その両末端に後述する官能基を有する化合物をいう。
また、前記ポリエチレングリコール化合物の分子量は、50〜10000であることが好ましく、2000〜8000であることがより好ましい(本発明においては、特に断りのない限り、分子量とは重量平均分子量を意味する。高分子化合物は多分散系であり、必ずしも同一の分子量または粒子量を持たない。したがって、分子量を測定して得られた値は、なんらかの形で平均された平均分子量になる。その主なものは次の3種類である。すなわち、1)数平均分子量Mn、2)重量平均分子量Mw、3)Z平均分子量Mzであり、Mn<Mw<Mzの関係が成立する。)。
前記架橋剤ないしは縮合剤の具体例としては、1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)とN−ヒドロキシスルホスクシンイミド(Sulfo−NHS)との任意の混合比の水溶液ないしは緩衝液等が挙げられる。反応に用いる前記架橋剤ないしは縮合剤の当量数、分散媒ないしは溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については反応が進行する限り特に制限はない。
前記ポリエチレングリコール化合物の末端の官能基に関して、前記シリカ粒子が表面に有する前記アミノ基と共有結合する末端については、水酸基、カルボキシル基、マレイミド基、スクシンイミジルエステル基等が挙げられ、水酸基又はカルボキシル基であることが好ましい。
前記シリカ粒子が表面に有する前記アミノ基と共有結合する末端と反対側の他方の末端の官能基については、後述する生体分子を結合させる観点から、カルボキシル基、チオール基、メトキシ基、水酸基、アミノ基、マレイミド基、スクシンイミジルエステル基等が挙げられ、カルボキシル基又はチオール基であることが好ましい。
本発明のシリカ粒子/ポリアクリル酸の複合粒子は、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子にポリアクリル酸を共有結合または吸着させて製造することができる。
本発明のシリカ粒子/アルギン酸の複合粒子は、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子にアルギン酸を共有結合または吸着して製造することができる。
前記共有結合形成は、前記シリカ粒子が表面に有するアミノ基と、前記ポリアクリル酸又はアルギン酸が有するカルボキシル基との間に縮合剤を用いてアミド結合を形成するかあるいは架橋剤を用いることにより成しうる。また、前記吸着は、前記シリカ粒子が表面に有するアミノ基と、前記ポリアクリル酸又はアルギン酸が有するカルボキシル基との間のイオン結合形成により成しうる。
本発明において、「吸着」とは、イオン結合、静電的引力(正電荷と負電荷間に働くクーロン力)、ファンデルワールス力または疎水性相互作用による一体化をいう。
用いる前記縮合剤または架橋剤の具体例としては、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)、N−(6−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド(EMCS)、グルタルアルデヒド等が挙げられる。反応に用いる前記縮合剤の当量数、分散媒ないしは溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については反応が進行する限り特に制限はない。
前記ポリアクリル酸又はアルギン酸の分子量に関しては、50〜100000であることが好ましく、2000〜20000であることがより好ましい。
PBS(リン酸緩衝食塩水)、Tris緩衝液、HEPES緩衝液等の緩衝液中で、本発明の複合粒子を使用する場合、前記緩衝液は吸着性の高いマイナスのイオン種を含有していることから、前記イオン種が前記複合粒子に静電的引力で吸着し、静電的反発力が弱められ凝集が生じる。そこで、アニオン性であるポリアクリル酸又はアルギン酸を前記シリカ粒子表面に共有結合又は吸着させることで、前記複合粒子が凝集することを防止することができる。
本発明のシリカ粒子/生体分子の複合粒子は、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の表面と、前記生体分子との複合化が、縮合剤ないしは架橋剤の存在下又は非存在下にて、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより製造することができる。
ここで「複合化」とは、吸着又は共有結合形成による一体化をいう。
また、前記生体分子は、縮合剤により直接または架橋剤を介して前記アミノ基と共有結合することができる。
本発明のシリカ粒子/ポリエチレングリコール/生体分子の複合粒子は、前記シリカ粒子/ポリエチレングリコールの複合粒子の表面のポリエチレングリコール部分と、前記生体分子との複合化が、縮合剤ないしは架橋剤の存在下又は非存在下にて、前記シリカ粒子/ポリエチレングリコールの複合粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより製造することができる。
本発明のシリカ粒子/ポリアクリル酸/生体分子の複合粒子は、縮合剤等の非存在下、前記シリカ粒子/ポリアクリル酸の前記複合粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより、前記生体分子が、前記シリカ粒子の表面及び/又は前記ポリアクリル酸と吸着することにより製造することができる。また、前記生体分子は、縮合剤により直接または架橋剤を介して前記ポリアクリル酸の前記カルボキシル基と共有結合することができる。
用いる前記縮合剤ないしは架橋剤の具体例としては、N−(6−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド(EMCS)、グルタルアルデヒド、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)等が挙げられる。
前記複合化した後、前記複合粒子と前記シリカ粒子に複合化していない前記生体分子との分離は、遠心分離または限外ろ過によって可能である。
前記シリカ粒子の表面、前記ポリエチレングリコール、前記ポリアクリル酸又は前記アルギン酸と、前記生体分子とを複合化した後は、粒子が基板やターゲット以外の生体分子などと非特異的吸着することを防止する観点から、PEG、BSAなどの任意のブロッキング剤でブロッキング処理を施してもよい。
前記生体分子の複合化が出来たかどうかの確認は、混合液から遠心分離または限外ろ過で粒子を除去した溶液に含まれる前記生体分子を一般的なタンパク質定量法(例えば、BCA(ビシンコニン酸)法、UV法、Lowry法、Bradford法)で定量し、減少した前記生体分子の量を定量することで行うことができる。
ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
また化学物質とは天然有機化合物に限らず、人工的に合成された生理活性を有する化合物や環境ホルモン等を含む。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の平均粒径は、特に制限はないが1nm〜1μmであることが好ましい。
本発明の複合粒子の平均粒径は、特に制限はないが1nm〜1μmであることが好ましい。
前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)等の画像から無作為に選択した100個のシリカ粒子又は複合粒子の合計の投影面積からシリカ粒子又は複合粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択したシリカ粒子又は複合粒子の個数(100個)で割った値に相当する円の直径の平均値(平均円相当直径)を求めたものである。
前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
その測定装置としては、ゼータサイザーナノ(商品名;マルバーン社製)が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
粒度分布の変動係数いわゆるCV値は特に制限はないが、10%以下が好ましく、8%以下がより好ましい。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とはCV値15%以下の粒子群をいう。
分散媒と、それに対して相対的に運動しているコロイド粒子とが接触したときに界面で電荷分離が起こる。このとき粒子表面には粒子と逆の符号を持ったイオンが集まり、層を形成する。これを電気二重層と呼ぶ。粒子表面に十分近い領域では反対電荷を持ったイオンは表面に強く引き付けられ運動性が無いため固定相と呼ばれる。それより外側のイオンは運動性を有しており拡散層と呼ばれる。また固定層と拡散層の接触面を滑り面と呼ぶ。粒子から十分離れた、電荷が中性となっている領域の電位をゼロと定義したときの滑り面の電位がζ電位(以下、単に「ゼータ電位」ということもある)であり、すなわち界面動電電位である。
前記ゼータ電位は、コロイド粒子の分散安定性、凝集性、表面改質等を評価する上での指標となる。すなわち、コロイド粒子は帯電しており、その帯電による静電的反発力の大きさが前記ゼータ電位の絶対値の大きさに対応しているので、前記ゼータ電位の絶対値の大きさは、コロイド粒子の分散安定性の指標となる(例えば、北原文雄、古澤邦夫、尾崎正孝、大島広行、「Zeta Potentialゼータ電位:微粒子界面の物理化学」、サイエンティスト社、1995参照。)。
また、コロイド粒子がマイナスに帯電すると前記ゼータ電位は負の値となるのに対し、コロイド粒子がプラスに帯電すると前記ゼータ電位は正の値となる。
本発明のアミノ基を有するアルキル基が共有結合してなるシリカ粒子は、pH7の純水中におけるζ電位の絶対値が1〜70mVであることが好ましく、前述のようにアミノ基を粒子表面に豊富に有する観点から、30〜60mVであることがより好ましい。
前記絶対値が小さすぎると、容易に凝集体が生じる。また、前記絶対値が大きすぎると、静電的相互作用によって非特異的吸着が増大する。
ゼータ電位測定装置としては、ゼータサイザーナノ(商品名、マルバーン社製)、ELS−Z1(商品名、大塚電子社製)、NICOMP 380ZLS(商品名、IBC社製)等を用いることができる。
前記複合粒子コロイドは、本発明の複合粒子を分散媒中に分散してなる。
前記複合粒子コロイドの分散媒については特に制限はなく、前記複合粒子を均一に分散するものであればよく、親水性の溶媒が好ましく、例えば、水、メタノール、エタノール、水とメタノールの混合溶媒、水とエタノールの混合溶媒、PBS(リン酸緩衝食塩水)、Tris緩衝液、HEPES緩衝液等の緩衝液が挙げられる。
また、前記複合粒子コロイドには、前述の非特異的吸着をさらに防止する観点から、ポリエチレングリコール(PEG)、ウシ血清アルブミン(BSA)などの任意のブロッキング剤を含有させてもよい。
本発明の複合粒子を用いてなる分析試薬は、前記複合粒子コロイドを用いてなり、前記複合粒子コロイドに含有される前記複合粒子に、蛍光、吸光、磁性、放射線、pH感受性等の標識を付与することで達成される。前記複合粒子に前記標識を付与する方法としては、前述のように、蛍光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標識化合物、pH感受性色素化合物等の前記機能性化合物を含有するシリカ粒子を用いて前記複合粒子を製造する方法などが挙げられる。
前記分析試薬の具体例としては、生体分子検出試薬、生体分子定量試薬、生体分子分離試薬、生体分子回収試薬または免疫染色用試薬が挙げられる。
前記複合粒子コロイドに含有される前記複合粒子が、前記生体分子を分子認識する生体分子ないしは生理活性物質を標的とすることができ、それら標的である生体分子ないしは生理活性物質を検出、定量、分離または回収する分析試薬とすることができる。また、前記生体分子と、標的である生体分子ないしは生理活性物質との分子認識が、抗原−抗体反応である場合は、前記複合粒子コロイドを用いてなる免疫染色用試薬とすることができる。
ここで、分子認識とは、(1)DNA分子間又はDNA−RNA分子間のハイブリダイゼーション、(2)抗原抗体反応、(3)酵素(受容体)−基質(リガンド)間の反応など、生体分子間の特異的相互作用をいう。
参考例 (本発明の製造に用いるシリカ粒子の調製)
5−(及び−6)−カルボキシテトラメチルローダミン・スクシンイミジルエステル(商品名、emp Biotech GmbH社製)5.8mgを1mlのジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した。ここに2.6μlのAPSを加え、室温(23℃)で1時間反応を行った。
得られた反応液320μlにエタノール5.6ml、TEOS320μl、蒸留水1.12ml、28質量%アンモニア水280μlを加え、マグネチック・スターラーで撹拌し、室温で24時間反応を行った。
反応液を18000xgの重力加速度で30分間遠心分離を行い、上清を除去した。
沈殿したシリカ粒子に蒸留水を4ml加え、粒子を分散させ、再度18000xgの重力加速度で30分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに2回繰り返し、標識シリカナノ粒子分散液に含まれる未反応のTEOSやアンモニア等を除去し、平均粒径212nmのシリカ粒子45.9mgを得た。収率約66%。
図2は、得られたローダミン含有シリカ粒子のSEM写真像を示す図である。図2中のスケールバーは500nmを示す。図中、白く見える球形状物質が、得られたローダミン含有シリカ粒子である。
参考例と同様な方法により得られた、濃度30.2mg/mLのローダミン含有シリカ粒子(平均粒径185nm)の分散液66μl(分散媒蒸留水)に、エタノール800μL、2M塩酸(HCl)100μL、蒸留水34μlを加え、良く混合した。pH0.96であり、シリカ粒子表面の電位が正であることが分かる。
ここに3−アミノプロピルトリエトキシシラン(APS)を15μL加え、室温で12時間振とう処理をした。
反応液を15500xgの重力加速度で30分間遠心分離を行い、上清を除去した。
沈殿したシリカ粒子に蒸留水を1ml加え、粒子を分散させ、再度15500xgの重力加速度で30分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに2回繰り返し、得られたシリカ粒子の分散液に含まれる未反応のAPSや塩酸、エタノール等を除去し、粒子2.0mgを得た。平均粒径は188nmであった。
図4(a)は、APS処理前の粒子の蒸留水中でのゼータ電位を、図4(b)は、得られた粒子の蒸留水中でのゼータ電位を示した図である。図4(a)から明らかなように、処理前の粒子のゼータ電位はマイナスの値を示していたが、処理後の粒子はプラスの値を示している(図4(b))。このことから、得られたシリカ粒子表面にアミノ基が十分に共有結合して存在することが分かる。
前記ローダミン含有シリカ粒子(平均粒径185nm)の分散液66μl(分散媒蒸留水)に、2M HCl100μLの代わりに16.5M アンモニア水 12.1μLを加え、さらに蒸留水122μLを加え良く混合した。pH11.05であった。
ここにAPSを15μL加え、室温で12時間振とう処理をした。
この結果、APSによる表面修飾が進行し、それが有するアミノ基によりシリカ粒子の表面電位がマイナスからプラスに反転する前に、シリカ粒子同士が凝集しゲル化してしまった。よって、アンモニア水による表面修飾では、シリカ粒子表面にアミノ基を十分に共有結合させ存在させる前に凝集しゲル化してしまうことが分かる。
(PEG化合物及びアビジンの結合)
実施例1で得られた粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子のコロイド(19mg/ml)200μlをマイクロチューブに入れた。ここに0.5M 2−モルフォリノエタンスルホン酸(pH6)600μlと、蒸留水を500μl加えた。
10mMのEDC(1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩)と25mMのSulfo−NHS(N−ヒドロキシスルホスクシンイミド)を含む水溶液200μlを前記シリカ粒子のコロイドに加え、15分間、室温で混合した。15分混合後、一方の末端がカルボキシル基であり、他方の末端がメトキシ基であるPEG化合物(分子量2,000、SUNBRIGHT MEPA−20H、日本油脂社製)が4mMの濃度で、一方の末端がカルボキシル基であり、他方の末端がアミノ基であるPEG化合物(分子量2,000、SUNBRIGHT PA−020HC、日本油脂社製)が1mMの濃度で溶解した、前記2種類のPEG化合物を含む水溶液を200μl加え、3時間、室温で混合を行った。
得られた分散液に、10mMのEDCと25mMのSulfo−NHSを含む水溶液200μlを加え、15分、室温で混合した。15分混合後、2mg/mlのストレプトアビジン(商品名、和光純薬社製)溶液を50μl加え、3時間撹拌した。
3時間混合後、遠心分離(20,000xg)を30分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物を1mlの蒸留水に再分散させ、再度遠心分離(20,000xg)を30分行い、粒子を沈降させた。同様の操作を4回繰り返し、余分なストレプトアビジンを除去した。最後に蒸留水1mlに粒子を分散させ、PEG/ストレプトアビジンで修飾された複合シリカ粒子を得た(収量3.5mg/ml×1ml)。
実施例1と同様な方法により得られた、濃度33.4mg/mlの粒子表面にアミノ基を有するローダミン含有シリカ粒子(平均粒径26nm)の分散液300μl(分散媒蒸留水)に、蒸留水590μlと、濃度10mg/mlのアルギン酸ナトリウム水溶液(重量平均分子量70000)を100μl加え、撹拌子でよく撹拌した。続いて、濃度1Mの水酸化ナトリウム水溶液を10μl加え、コロイドを室温(23℃)で1時間撹拌した。得られたコロイドを15,000xgの重力加速度で30分遠心分離し、上清を除去した。ここに蒸留水を890μl加え、粒子を再分散させた。続いて、10mg/mlのアルギン酸ナトリウム水溶液を100μl加え撹拌子でよく撹拌したあと、1Mの水酸化ナトリウム水溶液を10μl加え、1時間撹拌した。このコロイドを15,000xgの重力加速度で30分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水を1ml加え粒子を分散させた。同様にして更に2回遠心分離と蒸留水への分散を繰り返して粒子を洗浄し、蒸留水1mlに分散させ、ローダミン含有シリカ粒子/アルギン酸の複合粒子(平均粒径26nm)のコロイドを得た(収量10.0mg/ml×1ml)。
遠心管に50mM KH2PO4(pH6.5)を1mLと、実施例3で得られたローダミン含有シリカ粒子/アルギン酸の複合粒子(平均粒径26nm)のコロイド(10mg/mL)9mLを加えて軽く撹拌した。遠心管に抗hCG抗体(Anti−hCG clone codes/5008, Medix Biochemica社製)1mL(60μg/mL)を撹拌しながら加え、室温で1時間静置した。これに1質量%のPEG(ポリエチレングリコール、分子量20000、和光純薬工業社製)を0.55mL加え軽く撹拌し、更に10%BSAを1.1mL加え軽く撹拌した。
混合液を12,000xgで15分間遠心分離し、上清を1mL程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。この分散液に保存用バッファー(20mM Tris−HCl(pH 8.2), 0.05% PEG20,000, 1%BSA, 0.1%NaN3)を20mL加え、再度遠心分離し、上清を1mL程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた(コロイドA)。コロイドA100μlに蒸留水を900μl加えて1mlとし、15,000xgの重力加速度で30分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水を1ml加え粒子を分散させた。同様にして更に1回遠心分離し、粒子を蒸留水1mlに分散させた。
続いて、前記得られたローダミン含有シリカ粒子/アルギン酸/抗hCG抗体の複合粒子コロイド(コロイドA)100μlを96穴マイクロプレートのウェルの1つに入れた。次に、抗IgG抗体(Anti Mouse IgG、Dako社製)が1mg/mL含まれる溶液(10mMKH2PO4,pH7.0)を用意した。図5は、分子認識試験に用いたストリップ1の平面図である。一方の末端2から約15mmの位置3にライン状に、前記溶液を0.75μL/cmの塗布量(約1mm幅)で塗布したメンブレン4(Hi−Flow Plus120 membrane、MILLIPORE社製)を5mm幅にカットし、ストリップ1(丈25mm)とした。
前記ストリップ1の末端を前記96穴マイクロプレートのウェルの1つに入れた前記ローダミン含有シリカ粒子/アルギン酸/抗hCG抗体の複合粒子コロイドに浸し、1時間放置した。
図5から明らかなように、抗IgG抗体がライン状に塗布された部分3が赤く発色し、ローダミン含有シリカ粒子/アルギン酸/抗hCG抗体の複合粒子が形成されていることが確認された。また、本発明の複合粒子が分析試薬として好適であることが分かる。
Claims (13)
- 正の表面電位を有するシリカ粒子の表面に、この正の表面電位を維持したまま、アミノ基を少なくとも1つ有するアルキル基を共有結合させて前記シリカ粒子を表面修飾する工程を含んでなる、粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法。
- 酸を含有させた水/アルコール混合溶媒にシリカ粒子を分散させてなる正の表面電位を有するシリカ粒子の分散液に、下記一般式1で表されるシランカップリング剤を含有させ、正の表面電位を有する前記シリカ粒子の表面にアミノ基を少なくとも1つ有するアルキル基R1を共有結合させる工程を含んでなる、請求項1に記載の製造方法。
一般式1
R1−Si(OR2)3
(式中、R1はアミノ基を少なくとも1つ有するアルキル基を表し、R2はアルキル基を表す。) - 前記酸が鉱酸である請求項2に記載の製造方法。
- シリカ粒子の表面にアミノ基を少なくとも1つ有するアルキル基が共有結合することで表面修飾された、粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子であって、pH7の純水中におけるζ電位が1〜70mVである、シリカ粒子。
- 平均粒径が1nm〜1μmである請求項4に記載のシリカ粒子。
- 請求項4又は5に記載のシリカ粒子に、ポリエチレングリコールが共有結合してなるシリカ粒子/ポリエチレングリコールの複合粒子。
- 請求項4又は5に記載のシリカ粒子に、ポリアクリル酸またはアルギン酸が共有結合または吸着してなるシリカ粒子/ポリアクリル酸の複合粒子、またはシリカ粒子/アルギン酸の複合粒子。
- 請求項4又は5に記載のシリカ粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子/生体分子の複合粒子。
- 請求項6に記載の複合粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子/ポリエチレングリコール/生体分子の複合粒子。
- 請求項7に記載の複合粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子/ポリアクリル酸/生体分子の複合粒子、またはシリカ粒子/アルギン酸/生体分子の複合粒子。
- 前記生体分子が、抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド及び化学物質からなる群から選ばれた少なくとも1種である請求項8〜10のいずれか1項に記載の複合粒子。
- 請求項11に記載の複合粒子を分散媒中に分散してなる複合粒子コロイド。
- 請求項11に記載の複合粒子を用いてなる分析試薬。
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