JP5448369B2 - 粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法、粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子、及びそれを用いた複合粒子 - Google Patents
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Description
本発明は、粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法、粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子、及びそれを用いた複合粒子に関する。
近年、数ｎｍ〜１μｍ程度の微粒子が様々な分野に応用され、注目を集めている。例えば、吸着剤、触媒などに用いられる、多孔質シリカ粒子やゼオライト粒子、顔料に用いられるカーボンブラック、金属酸化物粒子、無機化合物粒子、導電材料に使われる金属ナノ粒子、樹脂の補強剤に使われるシリカ粒子など粒子の材質および用途は多岐にわたる。また、半導体ナノ粒子や、蛍光物質を封入したシリカ粒子は、特にバイオ分野において、新たな蛍光標識剤として、蛍光試薬への応用が期待されている。また、色素を高濃度に封入したシリカ粒子は高いモル吸光係数を有し、高感度な発色試薬への応用が期待される。
蛍光試薬、発色試薬等の標識試薬は、蛍光粒子または発色粒子表面にタンパク質や、ＤＮＡが結合したものであり、このタンパク質やＤＮＡが特定の生体分子と相互作用することによって、生体分子の検出、定量、染色等に利用されるものである。
蛍光粒子や発色粒子を標識試薬として用いるためには、生体分子を結合するための官能基を導入するために表面修飾が必要である。
蛍光試薬、発色試薬等の標識試薬は、蛍光粒子または発色粒子表面にタンパク質や、ＤＮＡが結合したものであり、このタンパク質やＤＮＡが特定の生体分子と相互作用することによって、生体分子の検出、定量、染色等に利用されるものである。
蛍光粒子や発色粒子を標識試薬として用いるためには、生体分子を結合するための官能基を導入するために表面修飾が必要である。
シリカ粒子と生体分子を一体化し安定に機能させるためには、シリカ粒子と生体分子を不可逆的に結合させることが必要である。そのためにはイオン結合や物理化学的吸着ではなく、シリカ粒子と生体分子を共有結合させることが必要である。
タンパク質は、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等を有する。また、ＤＮＡについても、末端修飾によってアミノ基やチオール基を付与することが出来る。よってシリカ粒子にもアミノ基、カルボキシル基、チオール基等を導入すれば、架橋剤や縮合剤を用いて、シリカ粒子と生体分子を共有結合させることが可能である。
タンパク質は、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等を有する。また、ＤＮＡについても、末端修飾によってアミノ基やチオール基を付与することが出来る。よってシリカ粒子にもアミノ基、カルボキシル基、チオール基等を導入すれば、架橋剤や縮合剤を用いて、シリカ粒子と生体分子を共有結合させることが可能である。
以上の観点より、蛍光粒子などの標識粒子への応用には表面修飾が必要となる。粒子の表面修飾の方法には、高分子のビーズに取り込ませる方法、脂質二重膜に内包させる方法、チオール基を介して低分子を結合する方法などが知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。しかし、高分子のビーズに取り込ませる方法は、コストがかかり、また、粒径が増大してしまうことが問題である。脂質二重膜に内包させる方法は、水中での分散安定性は高いものの、脂質二重膜自体が不安定なため、長期的な分散安定性の点で問題がある。チオール基を介して低分子を結合させる方法に関しても、適用できる粒子が金属に限られる。
またシリカ粒子にアミノ基を導入する方法としては、シリカ粒子と３−アミノプロピルトリエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤を結合させる方法が知られている。図６は従来の表面にアミノ基を有するシリカ粒子の模式図である。
しかし、図６から明らかなように、従来のアミノ基を有するシリカ粒子では、シリカ粒子の表面電位が負であるのに対し、アミノ基がカチオン性のため、アミノ基がシリカ粒子表面に吸着してしまい、アミノ基を介して生体分子やポリエチレングリコールを結合することが出来なかった。これを改善するために、アニオン性基を有するシランカップリング剤を一緒に反応させる方法が知られているが、アミノ基の密度が下がり、またアニオン性基を有するシランカップリング剤の立体障害でアミノ基の反応性が低下することが課題であった（例えば、非特許文献１参照。）。
しかし、図６から明らかなように、従来のアミノ基を有するシリカ粒子では、シリカ粒子の表面電位が負であるのに対し、アミノ基がカチオン性のため、アミノ基がシリカ粒子表面に吸着してしまい、アミノ基を介して生体分子やポリエチレングリコールを結合することが出来なかった。これを改善するために、アニオン性基を有するシランカップリング剤を一緒に反応させる方法が知られているが、アミノ基の密度が下がり、またアニオン性基を有するシランカップリング剤の立体障害でアミノ基の反応性が低下することが課題であった（例えば、非特許文献１参照。）。
また、アミノ基の反応性を高めるためにはアミノ基を過剰に導入し、表面電位を正に反転させる方法が考えられるが、一般的なゾル‐ゲル法で用いられるアンモニア水を触媒とする方法では、シリカ粒子の表面電位がマイナスからプラスに変わる過程でシリカ粒子同士が凝集しゲル化してしまい、シリカ粒子の表面電位を正に反転させる程にシリカ粒子表面にアミノ基を存在させることができないことが問題であった。
なお、本発明者らは、静電的引力を利用してカチオン性ポリマーおよびアニオン性ポリマーを粒子表面に交互に積層させる表面修飾方法について、特許出願している（特願２００７−６４２０５）。
Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２２，４３５７‐４３６２（２００６） 特開２００３−１１５０５公報
特開２００４−７７３８９公報
特開２００６−１３１７７１公報
なお、本発明者らは、静電的引力を利用してカチオン性ポリマーおよびアニオン性ポリマーを粒子表面に交互に積層させる表面修飾方法について、特許出願している（特願２００７−６４２０５）。
Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２２，４３５７‐４３６２（２００６）
本発明の目的は、上記の問題点に鑑みて、シリカ粒子へ生体分子等を結合させるために有用なアミノ基を粒子表面に有し、かつ前記アミノ基がシリカ粒子表面に吸着することにより前記生体分子等との反応性が低下することを防止したシリカ粒子の製造方法、前記シリカ粒子、及びそれを用いた複合粒子を提供することにある。
上記課題は下記の手段により達成された。すなわち、本発明は、
（１） 正の表面電位を有するシリカ粒子の表面に、この正の表面電位を維持したまま、アミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基を共有結合させて前記シリカ粒子を表面修飾する工程を含んでなる、粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法。
（２） 酸を含有させた水／アルコール混合溶媒にシリカ粒子を分散させてなる正の表面電位を有するシリカ粒子の分散液に、下記一般式１で表されるシランカップリング剤を含有させ、正の表面電位を有する前記シリカ粒子の表面に、アミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基Ｒ １ を共有結合させる工程を含んでなる、前記（１）に記載の製造方法、
一般式１
Ｒ １ −Ｓｉ（ＯＲ ２ ） ３
（式中、Ｒ １ はアミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基を表し、Ｒ ２ はアルキル基を表す。）
（３） 前記酸が鉱酸である前記（２）に記載の製造方法、
（４） シリカ粒子の表面にアミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基が共有結合することで表面修飾された、粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子であって、ｐＨ７の純水中におけるζ電位が１〜７０ｍＶである、シリカ粒子、
（１） 正の表面電位を有するシリカ粒子の表面に、この正の表面電位を維持したまま、アミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基を共有結合させて前記シリカ粒子を表面修飾する工程を含んでなる、粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法。
（２） 酸を含有させた水／アルコール混合溶媒にシリカ粒子を分散させてなる正の表面電位を有するシリカ粒子の分散液に、下記一般式１で表されるシランカップリング剤を含有させ、正の表面電位を有する前記シリカ粒子の表面に、アミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基Ｒ １ を共有結合させる工程を含んでなる、前記（１）に記載の製造方法、
一般式１
Ｒ １ −Ｓｉ（ＯＲ ２ ） ３
（式中、Ｒ １ はアミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基を表し、Ｒ ２ はアルキル基を表す。）
（３） 前記酸が鉱酸である前記（２）に記載の製造方法、
（４） シリカ粒子の表面にアミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基が共有結合することで表面修飾された、粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子であって、ｐＨ７の純水中におけるζ電位が１〜７０ｍＶである、シリカ粒子、
（５） 平均粒径が１ｎｍ〜１μｍである前記（４）に記載のシリカ粒子、
（６） 前記（４）又は（５）に記載のシリカ粒子に、ポリエチレングリコールが共有結合してなるシリカ粒子／ポリエチレングリコールの複合粒子、
（７） 前記（４）又は（５）に記載のシリカ粒子に、ポリアクリル酸またはアルギン酸が共有結合または吸着してなるシリカ粒子／ポリアクリル酸の複合粒子、またはシリカ粒子／アルギン酸の複合粒子、
（８） 前記（４）又は（５）に記載のシリカ粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子／生体分子の複合粒子、
（９） 前記（６）に記載の複合粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子／ポリエチレングリコール／生体分子の複合粒子、
（１０） 前記（７）に記載の複合粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子／ポリアクリル酸／生体分子の複合粒子、またはシリカ粒子／アルギン酸／生体分子の複合粒子、
（１１） 前記生体分子が、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド及び化学物質からなる群から選ばれた少なくとも１種である前記（８）〜（１０）のいずれか１項に記載の複合粒子、
（１２） 前記（１１）に記載の複合粒子を分散媒中に分散してなる複合粒子コロイド、及び
（１３） 前記（１１）に記載の複合粒子を用いてなる分析試薬
を提供するものである。
（６） 前記（４）又は（５）に記載のシリカ粒子に、ポリエチレングリコールが共有結合してなるシリカ粒子／ポリエチレングリコールの複合粒子、
（７） 前記（４）又は（５）に記載のシリカ粒子に、ポリアクリル酸またはアルギン酸が共有結合または吸着してなるシリカ粒子／ポリアクリル酸の複合粒子、またはシリカ粒子／アルギン酸の複合粒子、
（８） 前記（４）又は（５）に記載のシリカ粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子／生体分子の複合粒子、
（９） 前記（６）に記載の複合粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子／ポリエチレングリコール／生体分子の複合粒子、
（１０） 前記（７）に記載の複合粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子／ポリアクリル酸／生体分子の複合粒子、またはシリカ粒子／アルギン酸／生体分子の複合粒子、
（１１） 前記生体分子が、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド及び化学物質からなる群から選ばれた少なくとも１種である前記（８）〜（１０）のいずれか１項に記載の複合粒子、
（１２） 前記（１１）に記載の複合粒子を分散媒中に分散してなる複合粒子コロイド、及び
（１３） 前記（１１）に記載の複合粒子を用いてなる分析試薬
を提供するものである。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法は、生体分子等を結合させるために有用なアミノ基を粒子表面に有するシリカ粒子を製造することができる。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法は、前記アミノ基がシリカ粒子表面に吸着することによる前記生体分子等との反応性が低下することを防止し、前記生体分子等と高い反応性で結合するシリカ粒子を製造することができる。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法は、反応過程においてシリカ粒子表面の表面電位が正のまま反転することがないので、前記反応過程においてシリカ粒子が凝集してしまうことがない。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子は、前記製造方法により得ることができ、表面に有する前記アミノ基がシリカ粒子表面に吸着することがないので、前記生体分子等と高い反応性を有する。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法は、前記アミノ基がシリカ粒子表面に吸着することによる前記生体分子等との反応性が低下することを防止し、前記生体分子等と高い反応性で結合するシリカ粒子を製造することができる。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法は、反応過程においてシリカ粒子表面の表面電位が正のまま反転することがないので、前記反応過程においてシリカ粒子が凝集してしまうことがない。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子は、前記製造方法により得ることができ、表面に有する前記アミノ基がシリカ粒子表面に吸着することがないので、前記生体分子等と高い反応性を有する。
本発明の複合粒子は、シリカ粒子表面にポリエチレングリコールを有する場合には前記複合粒子間での立体的反発力により、アルギン酸を有する場合には保護コロイド作用により、ポリアクリル酸を有する場合には静電的反発力により分散安定性を向上させることができる。
本発明の複合粒子は、非特異的吸着を防止し、分散安定性に優れ、生理食塩水等イオン強度が高い水分散コロイドとして用いても凝集を起こしにくい。
ここで、「非特異的吸着」とは、特定の官能基又はリガンドに特異的に結合する以外の規則に従わない吸着をいい、意図する以外の吸着現象をいう。
本発明の複合粒子は、分析試薬として用いることにより、非特異的吸着を防止し、分散安定性に優れる前記複合粒子のコロイドを形成することから、測定結果の再現性に優れ、信頼性が高く、シグナル／ノイズ比の高い極微量標的試料の高感度分析が可能である。
本発明の複合粒子は、非特異的吸着を防止し、分散安定性に優れ、生理食塩水等イオン強度が高い水分散コロイドとして用いても凝集を起こしにくい。
ここで、「非特異的吸着」とは、特定の官能基又はリガンドに特異的に結合する以外の規則に従わない吸着をいい、意図する以外の吸着現象をいう。
本発明の複合粒子は、分析試薬として用いることにより、非特異的吸着を防止し、分散安定性に優れる前記複合粒子のコロイドを形成することから、測定結果の再現性に優れ、信頼性が高く、シグナル／ノイズ比の高い極微量標的試料の高感度分析が可能である。
まず、本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法について説明する。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法（以下、単に「本発明の製造方法」ということもある。）は、酸を含有させた水／アルコール混合溶媒に分散させたシリカ粒子の分散液に、前記一般式１で表されるシランカップリング剤を含有させ、前記シリカ粒子の表面にアミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基Ｒ １ を共有結合させる工程を含んでなることを特徴とする。
図１は、本発明の製造方法の模式図を示す図である。
図１に示したように、前記シランカップリング剤を含有させる前に、前記酸により原料となるシリカ粒子の表面電位が正（プラス）になる。よって、前記シランカップリング剤を含有させ、前記シリカ粒子の表面修飾を行うに際しては、前記シリカ粒子の表面電位の反転（正から負）は起こらないので、アンモニア水を用いた従来法におけるような正に帯電した粒子と負（マイナス）に帯電した粒子との凝集・ゲル化、あるいは表面電位の絶対値が非常に小さい粒子同士の凝集・ゲル化が生じることはない。
したがって、従来法よりも多量の前記シランカップリング剤を反応に供することができ、得られるシリカ粒子は、生体分子等と反応し結合しうるアミノ基を粒子表面に、従来法よりも大量に存在させることができる。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法（以下、単に「本発明の製造方法」ということもある。）は、酸を含有させた水／アルコール混合溶媒に分散させたシリカ粒子の分散液に、前記一般式１で表されるシランカップリング剤を含有させ、前記シリカ粒子の表面にアミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基Ｒ １ を共有結合させる工程を含んでなることを特徴とする。
図１は、本発明の製造方法の模式図を示す図である。
図１に示したように、前記シランカップリング剤を含有させる前に、前記酸により原料となるシリカ粒子の表面電位が正（プラス）になる。よって、前記シランカップリング剤を含有させ、前記シリカ粒子の表面修飾を行うに際しては、前記シリカ粒子の表面電位の反転（正から負）は起こらないので、アンモニア水を用いた従来法におけるような正に帯電した粒子と負（マイナス）に帯電した粒子との凝集・ゲル化、あるいは表面電位の絶対値が非常に小さい粒子同士の凝集・ゲル化が生じることはない。
したがって、従来法よりも多量の前記シランカップリング剤を反応に供することができ、得られるシリカ粒子は、生体分子等と反応し結合しうるアミノ基を粒子表面に、従来法よりも大量に存在させることができる。
すなわち、本発明の製造方法は、シリカ粒子表面の正の表面電位を維持したまま、負に反転させることなく、好ましくは、シリカ粒子表面の正のζ電位を負に反転させることなく、前記シリカ粒子の表面にアミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基を共有結合させ表面修飾させる工程を含んでなることを特徴とする。
前記水／アルコール混合溶媒の水素イオン濃度を前記酸によりｐＨ０〜３とすることにより、本発明の製造方法の前後を通して、前記シリカ粒子表面の表面電位を正に維持することができ、ｐＨ０〜２であることが好ましい。
本発明の製造方法において、水／アルコール混合溶媒に含有させる前記酸は特に制限はないが、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸が挙げられ、塩酸であることが好ましい。
用いられる前記水に対し、０．１〜１０ｍｏｌ／ｌの濃度で含有させることが好ましく、前記水に対し、０．５〜２ｍｏｌ／ｌの濃度で含有させることがより好ましい。
前記水／アルコール混合溶媒の水素イオン濃度を前記酸によりｐＨ０〜３とすることにより、本発明の製造方法の前後を通して、前記シリカ粒子表面の表面電位を正に維持することができ、ｐＨ０〜２であることが好ましい。
本発明の製造方法において、水／アルコール混合溶媒に含有させる前記酸は特に制限はないが、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸が挙げられ、塩酸であることが好ましい。
用いられる前記水に対し、０．１〜１０ｍｏｌ／ｌの濃度で含有させることが好ましく、前記水に対し、０．５〜２ｍｏｌ／ｌの濃度で含有させることがより好ましい。
前記一般式１で表されるシランカップリング剤において、アミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基Ｒ１は、ケイ素原子と結合する末端とは反対側の末端にアミノ基を有する炭素数１〜１０のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基）であることが好ましい。前記アルキル基Ｒ２は炭素数１〜１０のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基）であることが好ましい。
前記シランカップリング剤に特に制限はないが、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−アミノプロピルトリメトキシシランが挙げられＡＰＳが好ましい。また、前記シランカップリング剤の使用量としては、原料として用いる前記シリカ粒子１ｍｇに対して、１〜５０ｍｇであることが好ましい。
前記シランカップリング剤に特に制限はないが、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−アミノプロピルトリメトキシシランが挙げられＡＰＳが好ましい。また、前記シランカップリング剤の使用量としては、原料として用いる前記シリカ粒子１ｍｇに対して、１〜５０ｍｇであることが好ましい。
本発明の製造方法は、水／アルコール混合溶媒中で行う。水と混合させるアルコールとしては、エタノール、メタノール等が挙げられるが、エタノールが好ましい。前記水と前記アルコールとの体積比が１：２０〜１：１の混合溶媒であることが好ましく、１：６〜１：４の混合溶媒であることがより好ましい。
本発明の製造方法における反応時間は３０分〜４８時間が好ましい。反応温度は特に制限はないが、４〜６０℃であることが好ましい。
本発明の製造方法における反応時間は３０分〜４８時間が好ましい。反応温度は特に制限はないが、４〜６０℃であることが好ましい。
本発明の製造方法において用いる原料となるシリカ粒子は特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって得られたシリカ粒子であってもよい。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５９，１５０−１５７（１９９３）に記載のゾル−ゲル法で調製されるシリカ粒子等が挙げられる。
国際公開２００７／０７４７２２Ａ１公報に記載された蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の調製方法に準じて得られた、機能性化合物を含有するシリカ粒子を用いることが特に好ましい。
ここで、前記機能性化合物の具体例としては、蛍光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標識化合物、ｐＨ感受性色素化合物等が挙げられる。
具体的には、前記機能性化合物を含有するシリカ粒子は、前記機能性化合物とオルガノアルコキシシラン化合物とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合もしくは吸着させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。
前記機能性化合物を含有するシリカ粒子の好ましい調製方法の態様としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する前記機能性化合物と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するとオルガノアルコキシシラン化合物とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。前記オルガノアルコキシシラン化合物としてＡＰＳ、シラン化合物としてＴＥＯＳを用いた場合の反応を模式的に下記に例示する。
国際公開２００７／０７４７２２Ａ１公報に記載された蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の調製方法に準じて得られた、機能性化合物を含有するシリカ粒子を用いることが特に好ましい。
ここで、前記機能性化合物の具体例としては、蛍光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標識化合物、ｐＨ感受性色素化合物等が挙げられる。
具体的には、前記機能性化合物を含有するシリカ粒子は、前記機能性化合物とオルガノアルコキシシラン化合物とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合もしくは吸着させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。
前記機能性化合物を含有するシリカ粒子の好ましい調製方法の態様としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する前記機能性化合物と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するとオルガノアルコキシシラン化合物とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。前記オルガノアルコキシシラン化合物としてＡＰＳ、シラン化合物としてＴＥＯＳを用いた場合の反応を模式的に下記に例示する。
前記活性基を有する前記機能性化合物の具体例として、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン−ＮＨＳエステル（商品名、ｅｍｐ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ社製）、下記式でそれぞれ表されるＤＹ５５０−ＮＨＳエステル又はＤＹ６３０−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。
前記置換基を有するオルガノアルコキシシラン化合物の具体例として、ＡＰＳ、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル-トリエトキシシラン、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。
前記縮重合させる前記シラン化合物としては、特に制限はされないが、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、ＡＰＳ、３−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、前記シリカ粒子内部のシロキサン成分を形成する観点からはＴＥＯＳが好ましく、前記シリカ粒子内部のオルガノシロキサン成分を形成する観点からはＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。
上述のように調製すると、球状、もしくは、球状に近いシリカ粒子が製造できる。球状に近いシリカ粒子とは、具体的には長軸と短軸の比が２以下の形状である。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収することで可能である。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収することで可能である。
次に、本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子について説明する。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子は、前述のように本発明の製造方法によって製造することができる。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子は、前述のように本発明の製造方法によって製造することができる。
次に、本発明のシリカ粒子／ポリエチレングリコールの複合粒子について説明する。
本発明のシリカ粒子／ポリエチレングリコールの複合粒子は、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子にポリエチレングリコール化合物を共有結合させて製造することができる。
本発明において、「ポリエチレングリコール化合物」とは、ポリエチレングリコールを基本骨格に有し、その両末端に後述する官能基を有する化合物をいう。
本発明のシリカ粒子／ポリエチレングリコールの複合粒子は、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子にポリエチレングリコール化合物を共有結合させて製造することができる。
本発明において、「ポリエチレングリコール化合物」とは、ポリエチレングリコールを基本骨格に有し、その両末端に後述する官能基を有する化合物をいう。
本発明において、前記シリカ粒子が表面に有するアミノ基に共有結合させる前記ポリエチレングリコール化合物は架橋剤もしくは縮合剤を用いて前記アミノ基と共有結合を形成することができる。
また、前記ポリエチレングリコール化合物の分子量は、５０〜１００００であることが好ましく、２０００〜８０００であることがより好ましい（本発明においては、特に断りのない限り、分子量とは重量平均分子量を意味する。高分子化合物は多分散系であり、必ずしも同一の分子量または粒子量を持たない。したがって、分子量を測定して得られた値は、なんらかの形で平均された平均分子量になる。その主なものは次の３種類である。すなわち、１）数平均分子量Ｍｎ、２）重量平均分子量Ｍｗ、３）Ｚ平均分子量Ｍｚであり、Ｍｎ＜Ｍｗ＜Ｍｚの関係が成立する。）。
前記架橋剤ないしは縮合剤の具体例としては、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）との任意の混合比の水溶液ないしは緩衝液等が挙げられる。反応に用いる前記架橋剤ないしは縮合剤の当量数、分散媒ないしは溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については反応が進行する限り特に制限はない。
前記ポリエチレングリコール化合物の末端の官能基に関して、前記シリカ粒子が表面に有する前記アミノ基と共有結合する末端については、水酸基、カルボキシル基、マレイミド基、スクシンイミジルエステル基等が挙げられ、水酸基又はカルボキシル基であることが好ましい。
前記シリカ粒子が表面に有する前記アミノ基と共有結合する末端と反対側の他方の末端の官能基については、後述する生体分子を結合させる観点から、カルボキシル基、チオール基、メトキシ基、水酸基、アミノ基、マレイミド基、スクシンイミジルエステル基等が挙げられ、カルボキシル基又はチオール基であることが好ましい。
また、前記ポリエチレングリコール化合物の分子量は、５０〜１００００であることが好ましく、２０００〜８０００であることがより好ましい（本発明においては、特に断りのない限り、分子量とは重量平均分子量を意味する。高分子化合物は多分散系であり、必ずしも同一の分子量または粒子量を持たない。したがって、分子量を測定して得られた値は、なんらかの形で平均された平均分子量になる。その主なものは次の３種類である。すなわち、１）数平均分子量Ｍｎ、２）重量平均分子量Ｍｗ、３）Ｚ平均分子量Ｍｚであり、Ｍｎ＜Ｍｗ＜Ｍｚの関係が成立する。）。
前記架橋剤ないしは縮合剤の具体例としては、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）との任意の混合比の水溶液ないしは緩衝液等が挙げられる。反応に用いる前記架橋剤ないしは縮合剤の当量数、分散媒ないしは溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については反応が進行する限り特に制限はない。
前記ポリエチレングリコール化合物の末端の官能基に関して、前記シリカ粒子が表面に有する前記アミノ基と共有結合する末端については、水酸基、カルボキシル基、マレイミド基、スクシンイミジルエステル基等が挙げられ、水酸基又はカルボキシル基であることが好ましい。
前記シリカ粒子が表面に有する前記アミノ基と共有結合する末端と反対側の他方の末端の官能基については、後述する生体分子を結合させる観点から、カルボキシル基、チオール基、メトキシ基、水酸基、アミノ基、マレイミド基、スクシンイミジルエステル基等が挙げられ、カルボキシル基又はチオール基であることが好ましい。
次に、本発明のシリカ粒子／ポリアクリル酸の複合粒子、及び本発明のシリカ粒子／アルギン酸の複合粒子について説明する。
本発明のシリカ粒子／ポリアクリル酸の複合粒子は、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子にポリアクリル酸を共有結合または吸着させて製造することができる。
本発明のシリカ粒子／アルギン酸の複合粒子は、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子にアルギン酸を共有結合または吸着して製造することができる。
前記共有結合形成は、前記シリカ粒子が表面に有するアミノ基と、前記ポリアクリル酸又はアルギン酸が有するカルボキシル基との間に縮合剤を用いてアミド結合を形成するかあるいは架橋剤を用いることにより成しうる。また、前記吸着は、前記シリカ粒子が表面に有するアミノ基と、前記ポリアクリル酸又はアルギン酸が有するカルボキシル基との間のイオン結合形成により成しうる。
本発明において、「吸着」とは、イオン結合、静電的引力（正電荷と負電荷間に働くクーロン力）、ファンデルワールス力または疎水性相互作用による一体化をいう。
用いる前記縮合剤または架橋剤の具体例としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、グルタルアルデヒド等が挙げられる。反応に用いる前記縮合剤の当量数、分散媒ないしは溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については反応が進行する限り特に制限はない。
前記ポリアクリル酸又はアルギン酸の分子量に関しては、５０〜１０００００であることが好ましく、２０００〜２００００であることがより好ましい。
ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液中で、本発明の複合粒子を使用する場合、前記緩衝液は吸着性の高いマイナスのイオン種を含有していることから、前記イオン種が前記複合粒子に静電的引力で吸着し、静電的反発力が弱められ凝集が生じる。そこで、アニオン性であるポリアクリル酸又はアルギン酸を前記シリカ粒子表面に共有結合又は吸着させることで、前記複合粒子が凝集することを防止することができる。
本発明のシリカ粒子／ポリアクリル酸の複合粒子は、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子にポリアクリル酸を共有結合または吸着させて製造することができる。
本発明のシリカ粒子／アルギン酸の複合粒子は、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子にアルギン酸を共有結合または吸着して製造することができる。
前記共有結合形成は、前記シリカ粒子が表面に有するアミノ基と、前記ポリアクリル酸又はアルギン酸が有するカルボキシル基との間に縮合剤を用いてアミド結合を形成するかあるいは架橋剤を用いることにより成しうる。また、前記吸着は、前記シリカ粒子が表面に有するアミノ基と、前記ポリアクリル酸又はアルギン酸が有するカルボキシル基との間のイオン結合形成により成しうる。
本発明において、「吸着」とは、イオン結合、静電的引力（正電荷と負電荷間に働くクーロン力）、ファンデルワールス力または疎水性相互作用による一体化をいう。
用いる前記縮合剤または架橋剤の具体例としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、グルタルアルデヒド等が挙げられる。反応に用いる前記縮合剤の当量数、分散媒ないしは溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については反応が進行する限り特に制限はない。
前記ポリアクリル酸又はアルギン酸の分子量に関しては、５０〜１０００００であることが好ましく、２０００〜２００００であることがより好ましい。
ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液中で、本発明の複合粒子を使用する場合、前記緩衝液は吸着性の高いマイナスのイオン種を含有していることから、前記イオン種が前記複合粒子に静電的引力で吸着し、静電的反発力が弱められ凝集が生じる。そこで、アニオン性であるポリアクリル酸又はアルギン酸を前記シリカ粒子表面に共有結合又は吸着させることで、前記複合粒子が凝集することを防止することができる。
次に、本発明のシリカ粒子／生体分子の複合粒子、本発明のシリカ粒子／ポリエチレングリコール／生体分子の複合粒子、本発明のシリカ粒子／ポリアクリル酸／生体分子の複合粒子及び本発明のシリカ粒子／アルギン酸／生体分子の複合粒子について説明する。
本発明のシリカ粒子／生体分子の複合粒子は、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の表面と、前記生体分子との複合化が、縮合剤ないしは架橋剤の存在下又は非存在下にて、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより製造することができる。
ここで「複合化」とは、吸着又は共有結合形成による一体化をいう。
本発明のシリカ粒子／生体分子の複合粒子は、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の表面と、前記生体分子との複合化が、縮合剤ないしは架橋剤の存在下又は非存在下にて、前記粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより製造することができる。
ここで「複合化」とは、吸着又は共有結合形成による一体化をいう。
具体的には、縮合剤等の非存在下、前記シリカ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより、前記生体分子は、前記シリカ粒子の表面と吸着することができる。
また、前記生体分子は、縮合剤により直接または架橋剤を介して前記アミノ基と共有結合することができる。
本発明のシリカ粒子／ポリエチレングリコール／生体分子の複合粒子は、前記シリカ粒子／ポリエチレングリコールの複合粒子の表面のポリエチレングリコール部分と、前記生体分子との複合化が、縮合剤ないしは架橋剤の存在下又は非存在下にて、前記シリカ粒子／ポリエチレングリコールの複合粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより製造することができる。
本発明のシリカ粒子／ポリアクリル酸／生体分子の複合粒子は、縮合剤等の非存在下、前記シリカ粒子／ポリアクリル酸の前記複合粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより、前記生体分子が、前記シリカ粒子の表面及び／又は前記ポリアクリル酸と吸着することにより製造することができる。また、前記生体分子は、縮合剤により直接または架橋剤を介して前記ポリアクリル酸の前記カルボキシル基と共有結合することができる。
また、前記生体分子は、縮合剤により直接または架橋剤を介して前記アミノ基と共有結合することができる。
本発明のシリカ粒子／ポリエチレングリコール／生体分子の複合粒子は、前記シリカ粒子／ポリエチレングリコールの複合粒子の表面のポリエチレングリコール部分と、前記生体分子との複合化が、縮合剤ないしは架橋剤の存在下又は非存在下にて、前記シリカ粒子／ポリエチレングリコールの複合粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより製造することができる。
本発明のシリカ粒子／ポリアクリル酸／生体分子の複合粒子は、縮合剤等の非存在下、前記シリカ粒子／ポリアクリル酸の前記複合粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより、前記生体分子が、前記シリカ粒子の表面及び／又は前記ポリアクリル酸と吸着することにより製造することができる。また、前記生体分子は、縮合剤により直接または架橋剤を介して前記ポリアクリル酸の前記カルボキシル基と共有結合することができる。
本発明のシリカ粒子／アルギン酸／生体分子の複合粒子は、縮合剤等の非存在下、前記シリカ粒子／アルギン酸の前記複合粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより、前記生体分子が、前記シリカ粒子の表面及び／又は前記アルギン酸と吸着することにより製造することができる。また、前記生体分子は、縮合剤により直接または架橋剤を介して前記アルギン酸の前記カルボキシル基と共有結合することができる。
用いる前記縮合剤ないしは架橋剤の具体例としては、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等が挙げられる。
用いる前記縮合剤ないしは架橋剤の具体例としては、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等が挙げられる。
複合化に用いる前記縮合剤ないしは架橋剤の当量数、前記コロイドの分散媒、前記生体分子の溶液の溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については複合化が進行する限り特に制限はない。
前記複合化した後、前記複合粒子と前記シリカ粒子に複合化していない前記生体分子との分離は、遠心分離または限外ろ過によって可能である。
前記シリカ粒子の表面、前記ポリエチレングリコール、前記ポリアクリル酸又は前記アルギン酸と、前記生体分子とを複合化した後は、粒子が基板やターゲット以外の生体分子などと非特異的吸着することを防止する観点から、ＰＥＧ、ＢＳＡなどの任意のブロッキング剤でブロッキング処理を施してもよい。
前記生体分子の複合化が出来たかどうかの確認は、混合液から遠心分離または限外ろ過で粒子を除去した溶液に含まれる前記生体分子を一般的なタンパク質定量法（例えば、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）法、ＵＶ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）で定量し、減少した前記生体分子の量を定量することで行うことができる。
前記複合化した後、前記複合粒子と前記シリカ粒子に複合化していない前記生体分子との分離は、遠心分離または限外ろ過によって可能である。
前記シリカ粒子の表面、前記ポリエチレングリコール、前記ポリアクリル酸又は前記アルギン酸と、前記生体分子とを複合化した後は、粒子が基板やターゲット以外の生体分子などと非特異的吸着することを防止する観点から、ＰＥＧ、ＢＳＡなどの任意のブロッキング剤でブロッキング処理を施してもよい。
前記生体分子の複合化が出来たかどうかの確認は、混合液から遠心分離または限外ろ過で粒子を除去した溶液に含まれる前記生体分子を一般的なタンパク質定量法（例えば、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）法、ＵＶ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）で定量し、減少した前記生体分子の量を定量することで行うことができる。
吸着または共有結合させる前記生体分子としては、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド又は化学物質などが挙げられる。
ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
また化学物質とは天然有機化合物に限らず、人工的に合成された生理活性を有する化合物や環境ホルモン等を含む。
ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
また化学物質とは天然有機化合物に限らず、人工的に合成された生理活性を有する化合物や環境ホルモン等を含む。
本発明の製造方法において、原料として用いる前記シリカ粒子の平均粒径は、１ｎｍ〜１μｍであることが好ましく、２０ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましい。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の平均粒径は、特に制限はないが１ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
本発明の複合粒子の平均粒径は、特に制限はないが１ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個のシリカ粒子又は複合粒子の合計の投影面積からシリカ粒子又は複合粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択したシリカ粒子又は複合粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
本発明の粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の平均粒径は、特に制限はないが１ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
本発明の複合粒子の平均粒径は、特に制限はないが１ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個のシリカ粒子又は複合粒子の合計の投影面積からシリカ粒子又は複合粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択したシリカ粒子又は複合粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
本発明において、前記複合粒子の「動的光散乱法による粒度」とは、動的光散乱法により測定され、前記の平均粒径とは異なり、一次粒子だけでなく、一次粒子が凝集してなる二次粒子をも含めた概念であり、前記複合粒子の分散安定性を評価する指標となる。
その測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
粒度分布の変動係数いわゆるＣＶ値は特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とはＣＶ値１５％以下の粒子群をいう。
その測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
粒度分布の変動係数いわゆるＣＶ値は特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とはＣＶ値１５％以下の粒子群をいう。
次に、本発明の粒子のζ電位について説明する。
分散媒と、それに対して相対的に運動しているコロイド粒子とが接触したときに界面で電荷分離が起こる。このとき粒子表面には粒子と逆の符号を持ったイオンが集まり、層を形成する。これを電気二重層と呼ぶ。粒子表面に十分近い領域では反対電荷を持ったイオンは表面に強く引き付けられ運動性が無いため固定相と呼ばれる。それより外側のイオンは運動性を有しており拡散層と呼ばれる。また固定層と拡散層の接触面を滑り面と呼ぶ。粒子から十分離れた、電荷が中性となっている領域の電位をゼロと定義したときの滑り面の電位がζ電位（以下、単に「ゼータ電位」ということもある）であり、すなわち界面動電電位である。
前記ゼータ電位は、コロイド粒子の分散安定性、凝集性、表面改質等を評価する上での指標となる。すなわち、コロイド粒子は帯電しており、その帯電による静電的反発力の大きさが前記ゼータ電位の絶対値の大きさに対応しているので、前記ゼータ電位の絶対値の大きさは、コロイド粒子の分散安定性の指標となる（例えば、北原文雄、古澤邦夫、尾崎正孝、大島広行、「Ｚｅｔａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌゼータ電位：微粒子界面の物理化学」、サイエンティスト社、１９９５参照。）。
また、コロイド粒子がマイナスに帯電すると前記ゼータ電位は負の値となるのに対し、コロイド粒子がプラスに帯電すると前記ゼータ電位は正の値となる。
本発明のアミノ基を有するアルキル基が共有結合してなるシリカ粒子は、ｐＨ７の純水中におけるζ電位の絶対値が１〜７０ｍＶであることが好ましく、前述のようにアミノ基を粒子表面に豊富に有する観点から、３０〜６０ｍＶであることがより好ましい。
前記絶対値が小さすぎると、容易に凝集体が生じる。また、前記絶対値が大きすぎると、静電的相互作用によって非特異的吸着が増大する。
ゼータ電位測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名、マルバーン社製）、ＥＬＳ−Ｚ１（商品名、大塚電子社製）、ＮＩＣＯＭＰ ３８０ＺＬＳ（商品名、ＩＢＣ社製）等を用いることができる。
分散媒と、それに対して相対的に運動しているコロイド粒子とが接触したときに界面で電荷分離が起こる。このとき粒子表面には粒子と逆の符号を持ったイオンが集まり、層を形成する。これを電気二重層と呼ぶ。粒子表面に十分近い領域では反対電荷を持ったイオンは表面に強く引き付けられ運動性が無いため固定相と呼ばれる。それより外側のイオンは運動性を有しており拡散層と呼ばれる。また固定層と拡散層の接触面を滑り面と呼ぶ。粒子から十分離れた、電荷が中性となっている領域の電位をゼロと定義したときの滑り面の電位がζ電位（以下、単に「ゼータ電位」ということもある）であり、すなわち界面動電電位である。
前記ゼータ電位は、コロイド粒子の分散安定性、凝集性、表面改質等を評価する上での指標となる。すなわち、コロイド粒子は帯電しており、その帯電による静電的反発力の大きさが前記ゼータ電位の絶対値の大きさに対応しているので、前記ゼータ電位の絶対値の大きさは、コロイド粒子の分散安定性の指標となる（例えば、北原文雄、古澤邦夫、尾崎正孝、大島広行、「Ｚｅｔａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌゼータ電位：微粒子界面の物理化学」、サイエンティスト社、１９９５参照。）。
また、コロイド粒子がマイナスに帯電すると前記ゼータ電位は負の値となるのに対し、コロイド粒子がプラスに帯電すると前記ゼータ電位は正の値となる。
本発明のアミノ基を有するアルキル基が共有結合してなるシリカ粒子は、ｐＨ７の純水中におけるζ電位の絶対値が１〜７０ｍＶであることが好ましく、前述のようにアミノ基を粒子表面に豊富に有する観点から、３０〜６０ｍＶであることがより好ましい。
前記絶対値が小さすぎると、容易に凝集体が生じる。また、前記絶対値が大きすぎると、静電的相互作用によって非特異的吸着が増大する。
ゼータ電位測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名、マルバーン社製）、ＥＬＳ−Ｚ１（商品名、大塚電子社製）、ＮＩＣＯＭＰ ３８０ＺＬＳ（商品名、ＩＢＣ社製）等を用いることができる。
次に、本発明の複合粒子を用いてなる複合粒子コロイドについて説明する。
前記複合粒子コロイドは、本発明の複合粒子を分散媒中に分散してなる。
前記複合粒子コロイドの分散媒については特に制限はなく、前記複合粒子を均一に分散するものであればよく、親水性の溶媒が好ましく、例えば、水、メタノール、エタノール、水とメタノールの混合溶媒、水とエタノールの混合溶媒、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液が挙げられる。
また、前記複合粒子コロイドには、前述の非特異的吸着をさらに防止する観点から、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの任意のブロッキング剤を含有させてもよい。
前記複合粒子コロイドは、本発明の複合粒子を分散媒中に分散してなる。
前記複合粒子コロイドの分散媒については特に制限はなく、前記複合粒子を均一に分散するものであればよく、親水性の溶媒が好ましく、例えば、水、メタノール、エタノール、水とメタノールの混合溶媒、水とエタノールの混合溶媒、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液が挙げられる。
また、前記複合粒子コロイドには、前述の非特異的吸着をさらに防止する観点から、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの任意のブロッキング剤を含有させてもよい。
次に、本発明の複合粒子を用いてなる分析試薬について説明する。
本発明の複合粒子を用いてなる分析試薬は、前記複合粒子コロイドを用いてなり、前記複合粒子コロイドに含有される前記複合粒子に、蛍光、吸光、磁性、放射線、ｐＨ感受性等の標識を付与することで達成される。前記複合粒子に前記標識を付与する方法としては、前述のように、蛍光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標識化合物、ｐＨ感受性色素化合物等の前記機能性化合物を含有するシリカ粒子を用いて前記複合粒子を製造する方法などが挙げられる。
前記分析試薬の具体例としては、生体分子検出試薬、生体分子定量試薬、生体分子分離試薬、生体分子回収試薬または免疫染色用試薬が挙げられる。
前記複合粒子コロイドに含有される前記複合粒子が、前記生体分子を分子認識する生体分子ないしは生理活性物質を標的とすることができ、それら標的である生体分子ないしは生理活性物質を検出、定量、分離または回収する分析試薬とすることができる。また、前記生体分子と、標的である生体分子ないしは生理活性物質との分子認識が、抗原−抗体反応である場合は、前記複合粒子コロイドを用いてなる免疫染色用試薬とすることができる。
ここで、分子認識とは、（１）ＤＮＡ分子間又はＤＮＡ−ＲＮＡ分子間のハイブリダイゼーション、（２）抗原抗体反応、（３）酵素（受容体）−基質（リガンド）間の反応など、生体分子間の特異的相互作用をいう。
本発明の複合粒子を用いてなる分析試薬は、前記複合粒子コロイドを用いてなり、前記複合粒子コロイドに含有される前記複合粒子に、蛍光、吸光、磁性、放射線、ｐＨ感受性等の標識を付与することで達成される。前記複合粒子に前記標識を付与する方法としては、前述のように、蛍光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標識化合物、ｐＨ感受性色素化合物等の前記機能性化合物を含有するシリカ粒子を用いて前記複合粒子を製造する方法などが挙げられる。
前記分析試薬の具体例としては、生体分子検出試薬、生体分子定量試薬、生体分子分離試薬、生体分子回収試薬または免疫染色用試薬が挙げられる。
前記複合粒子コロイドに含有される前記複合粒子が、前記生体分子を分子認識する生体分子ないしは生理活性物質を標的とすることができ、それら標的である生体分子ないしは生理活性物質を検出、定量、分離または回収する分析試薬とすることができる。また、前記生体分子と、標的である生体分子ないしは生理活性物質との分子認識が、抗原−抗体反応である場合は、前記複合粒子コロイドを用いてなる免疫染色用試薬とすることができる。
ここで、分子認識とは、（１）ＤＮＡ分子間又はＤＮＡ−ＲＮＡ分子間のハイブリダイゼーション、（２）抗原抗体反応、（３）酵素（受容体）−基質（リガンド）間の反応など、生体分子間の特異的相互作用をいう。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、以下の実施例において「部」とは「質量部」を表し、「％」は「質量％」を表し、「分子量」は「重量平均分子量」を表す。
参考例 （本発明の製造に用いるシリカ粒子の調製）
５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン・スクシンイミジルエステル（商品名、ｅｍｐ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ社製）５．８ｍｇを１ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに２．６μｌのＡＰＳを加え、室温（２３℃）で１時間反応を行った。
得られた反応液３２０μｌにエタノール５．６ｍｌ、ＴＥＯＳ３２０μｌ、蒸留水１．１２ｍｌ、２８質量％アンモニア水２８０μｌを加え、マグネチック・スターラーで撹拌し、室温で２４時間反応を行った。
反応液を１８０００ｘｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。
沈殿したシリカ粒子に蒸留水を４ｍｌ加え、粒子を分散させ、再度１８０００ｘｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、標識シリカナノ粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径２１２ｎｍのシリカ粒子４５．９ｍｇを得た。収率約６６％。
図２は、得られたローダミン含有シリカ粒子のＳＥＭ写真像を示す図である。図２中のスケールバーは５００ｎｍを示す。図中、白く見える球形状物質が、得られたローダミン含有シリカ粒子である。
参考例 （本発明の製造に用いるシリカ粒子の調製）
５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン・スクシンイミジルエステル（商品名、ｅｍｐ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ社製）５．８ｍｇを１ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに２．６μｌのＡＰＳを加え、室温（２３℃）で１時間反応を行った。
得られた反応液３２０μｌにエタノール５．６ｍｌ、ＴＥＯＳ３２０μｌ、蒸留水１．１２ｍｌ、２８質量％アンモニア水２８０μｌを加え、マグネチック・スターラーで撹拌し、室温で２４時間反応を行った。
反応液を１８０００ｘｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。
沈殿したシリカ粒子に蒸留水を４ｍｌ加え、粒子を分散させ、再度１８０００ｘｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、標識シリカナノ粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径２１２ｎｍのシリカ粒子４５．９ｍｇを得た。収率約６６％。
図２は、得られたローダミン含有シリカ粒子のＳＥＭ写真像を示す図である。図２中のスケールバーは５００ｎｍを示す。図中、白く見える球形状物質が、得られたローダミン含有シリカ粒子である。
実施例１ （ローダミン含有シリカ粒子の表面へのアミノ基の導入）
参考例と同様な方法により得られた、濃度３０．２ｍｇ／ｍＬのローダミン含有シリカ粒子（平均粒径１８５ｎｍ）の分散液６６μｌ（分散媒蒸留水）に、エタノール８００μＬ、２Ｍ塩酸（ＨＣｌ）１００μＬ、蒸留水３４μｌを加え、良く混合した。ｐＨ０．９６であり、シリカ粒子表面の電位が正であることが分かる。
ここに３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）を１５μＬ加え、室温で１２時間振とう処理をした。
反応液を１５５００ｘｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。
沈殿したシリカ粒子に蒸留水を１ｍｌ加え、粒子を分散させ、再度１５５００ｘｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、得られたシリカ粒子の分散液に含まれる未反応のＡＰＳや塩酸、エタノール等を除去し、粒子２．０ｍｇを得た。平均粒径は１８８ｎｍであった。
参考例と同様な方法により得られた、濃度３０．２ｍｇ／ｍＬのローダミン含有シリカ粒子（平均粒径１８５ｎｍ）の分散液６６μｌ（分散媒蒸留水）に、エタノール８００μＬ、２Ｍ塩酸（ＨＣｌ）１００μＬ、蒸留水３４μｌを加え、良く混合した。ｐＨ０．９６であり、シリカ粒子表面の電位が正であることが分かる。
ここに３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）を１５μＬ加え、室温で１２時間振とう処理をした。
反応液を１５５００ｘｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。
沈殿したシリカ粒子に蒸留水を１ｍｌ加え、粒子を分散させ、再度１５５００ｘｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、得られたシリカ粒子の分散液に含まれる未反応のＡＰＳや塩酸、エタノール等を除去し、粒子２．０ｍｇを得た。平均粒径は１８８ｎｍであった。
図３は、得られた粒子およびＡＰＳ処理前の粒子の蒸留水中での動的光散乱法による粒度分布測定の結果である。図３から明らかなように、ＡＰＳ処理前後で粒度分布がほとんど変化せず、ＡＰＳによる表面処理によって粒子の凝集が起こっていないことがわかる。
図４（ａ）は、ＡＰＳ処理前の粒子の蒸留水中でのゼータ電位を、図４（ｂ）は、得られた粒子の蒸留水中でのゼータ電位を示した図である。図４（ａ）から明らかなように、処理前の粒子のゼータ電位はマイナスの値を示していたが、処理後の粒子はプラスの値を示している（図４（ｂ））。このことから、得られたシリカ粒子表面にアミノ基が十分に共有結合して存在することが分かる。
図４（ａ）は、ＡＰＳ処理前の粒子の蒸留水中でのゼータ電位を、図４（ｂ）は、得られた粒子の蒸留水中でのゼータ電位を示した図である。図４（ａ）から明らかなように、処理前の粒子のゼータ電位はマイナスの値を示していたが、処理後の粒子はプラスの値を示している（図４（ｂ））。このことから、得られたシリカ粒子表面にアミノ基が十分に共有結合して存在することが分かる。
比較例 （従来法によるローダミン含有シリカ粒子の表面へのアミノ基の導入）
前記ローダミン含有シリカ粒子（平均粒径１８５ｎｍ）の分散液６６μｌ（分散媒蒸留水）に、２Ｍ ＨＣｌ１００μＬの代わりに１６．５Ｍ アンモニア水 １２．１μＬを加え、さらに蒸留水１２２μＬを加え良く混合した。ｐＨ１１．０５であった。
ここにＡＰＳを１５μＬ加え、室温で１２時間振とう処理をした。
この結果、ＡＰＳによる表面修飾が進行し、それが有するアミノ基によりシリカ粒子の表面電位がマイナスからプラスに反転する前に、シリカ粒子同士が凝集しゲル化してしまった。よって、アンモニア水による表面修飾では、シリカ粒子表面にアミノ基を十分に共有結合させ存在させる前に凝集しゲル化してしまうことが分かる。
前記ローダミン含有シリカ粒子（平均粒径１８５ｎｍ）の分散液６６μｌ（分散媒蒸留水）に、２Ｍ ＨＣｌ１００μＬの代わりに１６．５Ｍ アンモニア水 １２．１μＬを加え、さらに蒸留水１２２μＬを加え良く混合した。ｐＨ１１．０５であった。
ここにＡＰＳを１５μＬ加え、室温で１２時間振とう処理をした。
この結果、ＡＰＳによる表面修飾が進行し、それが有するアミノ基によりシリカ粒子の表面電位がマイナスからプラスに反転する前に、シリカ粒子同士が凝集しゲル化してしまった。よって、アンモニア水による表面修飾では、シリカ粒子表面にアミノ基を十分に共有結合させ存在させる前に凝集しゲル化してしまうことが分かる。
実施例２
（ＰＥＧ化合物及びアビジンの結合）
実施例１で得られた粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子のコロイド（１９ｍｇ／ｍｌ）２００μｌをマイクロチューブに入れた。ここに０．５Ｍ ２−モルフォリノエタンスルホン酸（ｐＨ６）６００μｌと、蒸留水を５００μｌ加えた。
１０ｍＭのＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）と２５ｍＭのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）を含む水溶液２００μｌを前記シリカ粒子のコロイドに加え、１５分間、室温で混合した。１５分混合後、一方の末端がカルボキシル基であり、他方の末端がメトキシ基であるＰＥＧ化合物（分子量２，０００、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−２０Ｈ、日本油脂社製）が４ｍＭの濃度で、一方の末端がカルボキシル基であり、他方の末端がアミノ基であるＰＥＧ化合物（分子量２，０００、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＡ−０２０ＨＣ、日本油脂社製）が１ｍＭの濃度で溶解した、前記２種類のＰＥＧ化合物を含む水溶液を２００μｌ加え、３時間、室温で混合を行った。
（ＰＥＧ化合物及びアビジンの結合）
実施例１で得られた粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子のコロイド（１９ｍｇ／ｍｌ）２００μｌをマイクロチューブに入れた。ここに０．５Ｍ ２−モルフォリノエタンスルホン酸（ｐＨ６）６００μｌと、蒸留水を５００μｌ加えた。
１０ｍＭのＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）と２５ｍＭのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）を含む水溶液２００μｌを前記シリカ粒子のコロイドに加え、１５分間、室温で混合した。１５分混合後、一方の末端がカルボキシル基であり、他方の末端がメトキシ基であるＰＥＧ化合物（分子量２，０００、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−２０Ｈ、日本油脂社製）が４ｍＭの濃度で、一方の末端がカルボキシル基であり、他方の末端がアミノ基であるＰＥＧ化合物（分子量２，０００、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＡ−０２０ＨＣ、日本油脂社製）が１ｍＭの濃度で溶解した、前記２種類のＰＥＧ化合物を含む水溶液を２００μｌ加え、３時間、室温で混合を行った。
３時間混合後、遠心分離（２０，０００ｘｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物を１ｍｌの蒸留水に再分散させ、再度遠心分離（２０，０００ｘｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた。同様の操作を３回繰り返し、余分な、ＰＥＧ化合物、ＥＤＣ及びＳｕｌｆｏ−ＮＨＳを除去した。最後に沈殿物を８００μｌの蒸留水に分散させた。
得られた分散液に、１０ｍＭのＥＤＣと２５ｍＭのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳを含む水溶液２００μｌを加え、１５分、室温で混合した。１５分混合後、２ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン（商品名、和光純薬社製）溶液を５０μｌ加え、３時間撹拌した。
３時間混合後、遠心分離（２０，０００ｘｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物を１ｍｌの蒸留水に再分散させ、再度遠心分離（２０，０００ｘｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた。同様の操作を４回繰り返し、余分なストレプトアビジンを除去した。最後に蒸留水１ｍｌに粒子を分散させ、ＰＥＧ／ストレプトアビジンで修飾された複合シリカ粒子を得た（収量３．５ｍｇ／ｍｌ×１ｍｌ）。
得られた分散液に、１０ｍＭのＥＤＣと２５ｍＭのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳを含む水溶液２００μｌを加え、１５分、室温で混合した。１５分混合後、２ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン（商品名、和光純薬社製）溶液を５０μｌ加え、３時間撹拌した。
３時間混合後、遠心分離（２０，０００ｘｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物を１ｍｌの蒸留水に再分散させ、再度遠心分離（２０，０００ｘｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた。同様の操作を４回繰り返し、余分なストレプトアビジンを除去した。最後に蒸留水１ｍｌに粒子を分散させ、ＰＥＧ／ストレプトアビジンで修飾された複合シリカ粒子を得た（収量３．５ｍｇ／ｍｌ×１ｍｌ）。
実施例３ （粒子表面にアミノ基を有するローダミン含有シリカ粒子へのアルギン酸の吸着）
実施例１と同様な方法により得られた、濃度３３．４ｍｇ／ｍｌの粒子表面にアミノ基を有するローダミン含有シリカ粒子（平均粒径２６ｎｍ）の分散液３００μｌ（分散媒蒸留水）に、蒸留水５９０μｌと、濃度１０ｍｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウム水溶液（重量平均分子量７００００）を１００μｌ加え、撹拌子でよく撹拌した。続いて、濃度１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を１０μｌ加え、コロイドを室温（２３℃）で１時間撹拌した。得られたコロイドを１５，０００ｘｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去した。ここに蒸留水を８９０μｌ加え、粒子を再分散させた。続いて、１０ｍｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウム水溶液を１００μｌ加え撹拌子でよく撹拌したあと、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を１０μｌ加え、１時間撹拌した。このコロイドを１５，０００ｘｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水を１ｍｌ加え粒子を分散させた。同様にして更に２回遠心分離と蒸留水への分散を繰り返して粒子を洗浄し、蒸留水１ｍｌに分散させ、ローダミン含有シリカ粒子／アルギン酸の複合粒子（平均粒径２６ｎｍ）のコロイドを得た（収量１０．０ｍｇ／ｍｌ×１ｍｌ）。
実施例１と同様な方法により得られた、濃度３３．４ｍｇ／ｍｌの粒子表面にアミノ基を有するローダミン含有シリカ粒子（平均粒径２６ｎｍ）の分散液３００μｌ（分散媒蒸留水）に、蒸留水５９０μｌと、濃度１０ｍｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウム水溶液（重量平均分子量７００００）を１００μｌ加え、撹拌子でよく撹拌した。続いて、濃度１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を１０μｌ加え、コロイドを室温（２３℃）で１時間撹拌した。得られたコロイドを１５，０００ｘｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去した。ここに蒸留水を８９０μｌ加え、粒子を再分散させた。続いて、１０ｍｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウム水溶液を１００μｌ加え撹拌子でよく撹拌したあと、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を１０μｌ加え、１時間撹拌した。このコロイドを１５，０００ｘｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水を１ｍｌ加え粒子を分散させた。同様にして更に２回遠心分離と蒸留水への分散を繰り返して粒子を洗浄し、蒸留水１ｍｌに分散させ、ローダミン含有シリカ粒子／アルギン酸の複合粒子（平均粒径２６ｎｍ）のコロイドを得た（収量１０．０ｍｇ／ｍｌ×１ｍｌ）。
実施例４ （ローダミン含有シリカ粒子／アルギン酸の複合粒子への抗体の複合化）
遠心管に５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）を１ｍＬと、実施例３で得られたローダミン含有シリカ粒子／アルギン酸の複合粒子（平均粒径２６ｎｍ）のコロイド（１０ｍｇ／ｍＬ）９ｍＬを加えて軽く撹拌した。遠心管に抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅｓ／５００８， Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）１ｍＬ（６０μｇ／ｍＬ）を撹拌しながら加え、室温で１時間静置した。これに１質量％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を０．５５ｍＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１．１ｍＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。この分散液に保存用バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．２）， ０．０５％ ＰＥＧ２０，０００， １％ＢＳＡ， ０．１％ＮａＮ３）を２０ｍＬ加え、再度遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた（コロイドＡ）。コロイドＡ１００μｌに蒸留水を９００μｌ加えて１ｍｌとし、１５，０００ｘｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水を１ｍｌ加え粒子を分散させた。同様にして更に１回遠心分離し、粒子を蒸留水１ｍｌに分散させた。
遠心管に５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）を１ｍＬと、実施例３で得られたローダミン含有シリカ粒子／アルギン酸の複合粒子（平均粒径２６ｎｍ）のコロイド（１０ｍｇ／ｍＬ）９ｍＬを加えて軽く撹拌した。遠心管に抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅｓ／５００８， Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）１ｍＬ（６０μｇ／ｍＬ）を撹拌しながら加え、室温で１時間静置した。これに１質量％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を０．５５ｍＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１．１ｍＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。この分散液に保存用バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．２）， ０．０５％ ＰＥＧ２０，０００， １％ＢＳＡ， ０．１％ＮａＮ３）を２０ｍＬ加え、再度遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた（コロイドＡ）。コロイドＡ１００μｌに蒸留水を９００μｌ加えて１ｍｌとし、１５，０００ｘｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水を１ｍｌ加え粒子を分散させた。同様にして更に１回遠心分離し、粒子を蒸留水１ｍｌに分散させた。
（分子認識試験）
続いて、前記得られたローダミン含有シリカ粒子／アルギン酸／抗ｈＣＧ抗体の複合粒子コロイド（コロイドＡ）１００μｌを９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた。次に、抗ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）を用意した。図５は、分子認識試験に用いたストリップ１の平面図である。一方の末端２から約１５ｍｍの位置３にライン状に、前記溶液を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量（約１ｍｍ幅）で塗布したメンブレン４（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を５ｍｍ幅にカットし、ストリップ１（丈２５ｍｍ）とした。
前記ストリップ１の末端を前記９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた前記ローダミン含有シリカ粒子／アルギン酸／抗ｈＣＧ抗体の複合粒子コロイドに浸し、１時間放置した。
図５から明らかなように、抗ＩｇＧ抗体がライン状に塗布された部分３が赤く発色し、ローダミン含有シリカ粒子／アルギン酸／抗ｈＣＧ抗体の複合粒子が形成されていることが確認された。また、本発明の複合粒子が分析試薬として好適であることが分かる。
続いて、前記得られたローダミン含有シリカ粒子／アルギン酸／抗ｈＣＧ抗体の複合粒子コロイド（コロイドＡ）１００μｌを９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた。次に、抗ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）を用意した。図５は、分子認識試験に用いたストリップ１の平面図である。一方の末端２から約１５ｍｍの位置３にライン状に、前記溶液を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量（約１ｍｍ幅）で塗布したメンブレン４（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を５ｍｍ幅にカットし、ストリップ１（丈２５ｍｍ）とした。
前記ストリップ１の末端を前記９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた前記ローダミン含有シリカ粒子／アルギン酸／抗ｈＣＧ抗体の複合粒子コロイドに浸し、１時間放置した。
図５から明らかなように、抗ＩｇＧ抗体がライン状に塗布された部分３が赤く発色し、ローダミン含有シリカ粒子／アルギン酸／抗ｈＣＧ抗体の複合粒子が形成されていることが確認された。また、本発明の複合粒子が分析試薬として好適であることが分かる。
Claims (13)
- 正の表面電位を有するシリカ粒子の表面に、この正の表面電位を維持したまま、アミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基を共有結合させて前記シリカ粒子を表面修飾する工程を含んでなる、粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子の製造方法。
- 酸を含有させた水／アルコール混合溶媒にシリカ粒子を分散させてなる正の表面電位を有するシリカ粒子の分散液に、下記一般式１で表されるシランカップリング剤を含有させ、正の表面電位を有する前記シリカ粒子の表面にアミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基Ｒ１を共有結合させる工程を含んでなる、請求項１に記載の製造方法。
一般式１
Ｒ１−Ｓｉ（ＯＲ２）３
（式中、Ｒ１はアミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基を表し、Ｒ２はアルキル基を表す。） - 前記酸が鉱酸である請求項２に記載の製造方法。
- シリカ粒子の表面にアミノ基を少なくとも１つ有するアルキル基が共有結合することで表面修飾された、粒子表面にアミノ基を有するシリカ粒子であって、ｐＨ７の純水中におけるζ電位が１〜７０ｍＶである、シリカ粒子。
- 平均粒径が１ｎｍ〜１μｍである請求項４に記載のシリカ粒子。
- 請求項４又は５に記載のシリカ粒子に、ポリエチレングリコールが共有結合してなるシリカ粒子／ポリエチレングリコールの複合粒子。
- 請求項４又は５に記載のシリカ粒子に、ポリアクリル酸またはアルギン酸が共有結合または吸着してなるシリカ粒子／ポリアクリル酸の複合粒子、またはシリカ粒子／アルギン酸の複合粒子。
- 請求項４又は５に記載のシリカ粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子／生体分子の複合粒子。
- 請求項６に記載の複合粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子／ポリエチレングリコール／生体分子の複合粒子。
- 請求項７に記載の複合粒子に、生体分子が共有結合または吸着してなるシリカ粒子／ポリアクリル酸／生体分子の複合粒子、またはシリカ粒子／アルギン酸／生体分子の複合粒子。
- 前記生体分子が、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド及び化学物質からなる群から選ばれた少なくとも１種である請求項８〜１０のいずれか１項に記載の複合粒子。
- 請求項１１に記載の複合粒子を分散媒中に分散してなる複合粒子コロイド。
- 請求項１１に記載の複合粒子を用いてなる分析試薬。
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