JP4391567B2 - 積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、積層構造のシリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬 - Google Patents
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Description
本発明は、ナノメートルサイズの積層構造のシリカナノ粒子の製造方法に関する。より詳しくは、タンパク質等の特定物質の検出用ないしは定量用の標識試薬として用いる、ナノメートルサイズの積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、該方法により得られた積層構造のシリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬に関する。
テトラエトキシシラン（以下ＴＥＯＳということもある。）に代表されるテトラアルコキシシランに、触媒であるアンモニア存在下、水を加えて加水分解すると縮重合によるシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）形成後、ナノ〜ミクロンサイズのシリカ粒子が形成される（例えば、非特許文献１参照）。
シリカ自身には光吸収特性や磁性がないためその粒子を検出することができず、標識試薬として用いることはできない。しかし、シリカには高い化学的安定性や表面修飾についての高い自由度、生体に対する無害性といった標識試薬にとって好ましい特性をいくつも兼ね備えている。そのため、例えばシリカ粒子の内部もしくは表面に蛍光もしくは発色特性を有する有機色素分子を結合させれば、光学的にその存在を検出することができる標識試薬を得ることができる。
シリカ自身には光吸収特性や磁性がないためその粒子を検出することができず、標識試薬として用いることはできない。しかし、シリカには高い化学的安定性や表面修飾についての高い自由度、生体に対する無害性といった標識試薬にとって好ましい特性をいくつも兼ね備えている。そのため、例えばシリカ粒子の内部もしくは表面に蛍光もしくは発色特性を有する有機色素分子を結合させれば、光学的にその存在を検出することができる標識試薬を得ることができる。
シリカ粒子の内部に有機色素分子を取り込む手法としては、アミノ基と反応しやすいＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを有する色素分子をシランカップリング剤の一種である３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）分子のアミノ基と結合させ、このようにして得られる色素分子とＡＰＳ分子からなる化合物（以下、単に「色素結合ＡＰＳ」という。）のエトキシ基を加水分解させてシリカと重合させることで、結果的にシリカと前記色素分子をペプチド結合によって結合させる方法がある（例えば、特許文献１参照）。しかし前記手法でシリカ粒子を調製する場合、ＴＥＯＳの方が前記色素結合ＡＰＳよりも反応速度が速く、結果として前記色素結合ＡＰＳはシリカ粒子の表面近傍ないしは表面に高濃度に偏在することになる。
色素の種類によっては前記色素結合ＡＰＳのシリカ粒子への取り込み効率が非常に低いものもある。そのような場合十分な量の色素をシリカ粒子に取り込ませるためには過剰量の前記色素結合ＡＰＳを前記アンモニア水含有溶媒に含有させなければならず、前記色素結合ＡＰＳが高価であるため、コストがかさんでしまう。
また、表面修飾の際などに前記の手法で得られたシリカ粒子をアンモニア水や水酸化ナトリウムなどの塩基性溶液に曝すと、前記シリカ粒子表面のシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）が加水分解され、粒子表面に偏在していた色素結合オルガノシロキサン成分が脱離してしまう問題があった。色素分子をシリカ粒子に取り込んで標識試薬とする場合、シリカ粒子から脱離した色素分子はターゲット物質以外のものと非特異的結合を起こしてシグナル／ノイズ比低下の原因となってしまう。さらに、シリカ粒子表面に存在する色素分子がシリカ粒子の表面修飾処理の際に悪影響を及ぼすという問題もあった。
ＥＰ１０３６７６３Ｂ１公報
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６，６２−６９（１９６８）
色素の種類によっては前記色素結合ＡＰＳのシリカ粒子への取り込み効率が非常に低いものもある。そのような場合十分な量の色素をシリカ粒子に取り込ませるためには過剰量の前記色素結合ＡＰＳを前記アンモニア水含有溶媒に含有させなければならず、前記色素結合ＡＰＳが高価であるため、コストがかさんでしまう。
また、表面修飾の際などに前記の手法で得られたシリカ粒子をアンモニア水や水酸化ナトリウムなどの塩基性溶液に曝すと、前記シリカ粒子表面のシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）が加水分解され、粒子表面に偏在していた色素結合オルガノシロキサン成分が脱離してしまう問題があった。色素分子をシリカ粒子に取り込んで標識試薬とする場合、シリカ粒子から脱離した色素分子はターゲット物質以外のものと非特異的結合を起こしてシグナル／ノイズ比低下の原因となってしまう。さらに、シリカ粒子表面に存在する色素分子がシリカ粒子の表面修飾処理の際に悪影響を及ぼすという問題もあった。
本発明の目的は、上記の問題点に鑑みて、蛍光色素分子、吸光色素分子等の機能性分子のシリカ粒子への取り込み効率を向上させる積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、及びそれにより製造される積層構造のシリカナノ粒子を提供することにある。また、本発明の目的は、測定結果の再現性に優れる、極微量標的物質の高感度定量分析が可能な標識試薬を提供することにある。
上記課題は下記の手段により達成された。
（１） 次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とする積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、
［（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させ、機能性分子を含有するシリカ粒子を調製する工程。］
［（ｂ）前記工程（ａ）により前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とにより前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程。］
［前記機能性分子は、蛍光色素分子、吸光色素分子、磁性分子、放射線標識分子、及びｐＨ感受性色素分子から選らばれる。］
（１） 次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とする積層構造のシリカナノ粒子の製造方法、
［（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させ、機能性分子を含有するシリカ粒子を調製する工程。］
［（ｂ）前記工程（ａ）により前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とにより前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程。］
［前記機能性分子は、蛍光色素分子、吸光色素分子、磁性分子、放射線標識分子、及びｐＨ感受性色素分子から選らばれる。］
（２） 前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）のアミノ基と機能性分子のカルボキシル基とをペプチド結合により連結させた化合物であることを特徴とする（１）に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
（３） 前記（１）又は（２）に記載の製造方法によって得られた積層構造のシリカナノ粒子であって、蛍光色素分子、吸光色素分子、磁性分子、放射線標識分子、及びｐＨ感受性色素分子から選らばれる前記機能性分子を含有するシリカ粒子の表面上に、該機能性分子を含有するシリカの層を有することを特徴とするシリカナノ粒子。
（３） 前記（１）又は（２）に記載の製造方法によって得られた積層構造のシリカナノ粒子であって、蛍光色素分子、吸光色素分子、磁性分子、放射線標識分子、及びｐＨ感受性色素分子から選らばれる前記機能性分子を含有するシリカ粒子の表面上に、該機能性分子を含有するシリカの層を有することを特徴とするシリカナノ粒子。
（４） 平均粒径が２０〜１００ｎｍであり、かつ変動係数が１５％以下であることを特徴とする（３）に記載の積層構造のシリカナノ粒子、
（５） 平均粒径が１００〜５００ｎｍであり、かつ変動係数が１０％以下であることを特徴とする（３）に記載の積層構造のシリカナノ粒子、及び
（６） 前記（３）〜（５）のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子を用いて調製される標識試薬
を提供するものである。
本明細書及び特許請求の範囲において、「シリカナノ粒子」とは、平均粒径が、１，０００ｎｍ以下のコロイドシリカ粒子をいう。前記シリカナノ粒子を標識試薬として用いる場合、検出物質や検出法によって使用するのに好適な粒子径は様々であるが、２０〜５００ｎｍの範囲内である場合が多く、この範囲にあるシリカナノ粒子であることが好ましい。
（５） 平均粒径が１００〜５００ｎｍであり、かつ変動係数が１０％以下であることを特徴とする（３）に記載の積層構造のシリカナノ粒子、及び
（６） 前記（３）〜（５）のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子を用いて調製される標識試薬
を提供するものである。
本明細書及び特許請求の範囲において、「シリカナノ粒子」とは、平均粒径が、１，０００ｎｍ以下のコロイドシリカ粒子をいう。前記シリカナノ粒子を標識試薬として用いる場合、検出物質や検出法によって使用するのに好適な粒子径は様々であるが、２０〜５００ｎｍの範囲内である場合が多く、この範囲にあるシリカナノ粒子であることが好ましい。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法は、機能性分子の前記シリカ粒子への取り込み効率を向上させることができる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、蛍光色素分子、吸光色素分子等の機能性分子を高濃度に含有させられ、高感度の標識試薬として用いることが可能である。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は平均粒径がナノメートルサイズであり、かつ粒度分布の幅が狭く粒径が揃っている。
本発明の標識試薬は、平均粒径が揃った前記シリカナノ粒子を用いてなるので、測定結果の再現性に優れ、信頼性が高い極微量標的物質の高感度定量分析が可能である。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は平均粒径がナノメートルサイズであり、かつ粒度分布の幅が狭く粒径が揃っている。
本発明の標識試薬は、平均粒径が揃った前記シリカナノ粒子を用いてなるので、測定結果の再現性に優れ、信頼性が高い極微量標的物質の高感度定量分析が可能である。
まず、本発明の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法（以下、単に「本発明の製造方法」という。）について説明する。
本発明の製造方法は、次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなる。
（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物に由来する機能性分子結合オルガノシロキサン成分を含有するコアとなるシリカ粒子（以下、「機能性分子含有シリカ粒子」という。）を調製する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）により前記コアとなる前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒に前記テトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とによるシロキサン結合形成により、前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程。
本発明の製造方法は、次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなる。
（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物に由来する機能性分子結合オルガノシロキサン成分を含有するコアとなるシリカ粒子（以下、「機能性分子含有シリカ粒子」という。）を調製する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）により前記コアとなる前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒に前記テトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とによるシロキサン結合形成により、前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程。
本発明の製造方法において前記工程（ｂ）を、２回以上繰り返すことにより、得られるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量をさらに増大させることが好ましい。ただし前記工程（ｂ）を何度も繰り返すのは煩雑であり、またそれによって合成されるシリカ粒子の粒度分布が広くなるという弊害もあることから、前記工程（ｂ）の繰り返し回数をいくらでも多くすればよいというわけではない。実際には、前記コアとなる前記シリカ粒子の表面上に１〜６層の前記機能性分子を含有するシリカの層を形成するために、前記工程（ｂ）を１〜６回行うことが好ましい。
本発明に用いる前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物は、互いに反応して結合を形成する活性部位を持つ機能性分子とオルガノアルコキシシランとを反応させることで得ることができる。例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）のアミノ基と機能性分子が持つカルボキシル基を脱水縮合させてペプチド結合を形成させる手法がある。カルボキシル基とスクシンイミドを縮合させたＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を持つ機能性分子であれば、ＡＰＳと混合させるだけでアミノ基と反応してペプチド結合でつながれた機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を得ることができ、好ましい。
本発明に用いる前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物は、互いに反応して結合を形成する活性部位を持つ機能性分子とオルガノアルコキシシランとを反応させることで得ることができる。例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）のアミノ基と機能性分子が持つカルボキシル基を脱水縮合させてペプチド結合を形成させる手法がある。カルボキシル基とスクシンイミドを縮合させたＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を持つ機能性分子であれば、ＡＰＳと混合させるだけでアミノ基と反応してペプチド結合でつながれた機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を得ることができ、好ましい。
本発明において前記機能性分子は、蛍光色素分子（例えば、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、フルオレセイン）、吸光色素分子、磁性分子、放射線標識分子、及びｐＨ感受性色素分子から選ばれる。
前記活性基を有する前記機能性分子の好ましい具体例として、下記式でそれぞれ表される５−カルボキシＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステル、５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＮＨＳエステル、５−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステル（いずれも商品名；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。
前記活性基を有する前記機能性分子の好ましい具体例として、下記式でそれぞれ表される５−カルボキシＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステル、５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＮＨＳエステル、５−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステル（いずれも商品名；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。
前記活性基を有する前記オルガノアルコキシシランは、商業的に市販のものを入手することも可能である。
前記反応性基を有するオルガノアルコキシシランの具体例として、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するオルガノアルコキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン等のメルカプト基を有するオルガノアルコキシシラン等を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。メルカプト基を有するオルガノアルコキシシランを用いる場合は、マレイミド基を持つ機能性分子と結合させることができる。
前記反応性基を有するオルガノアルコキシシランの具体例として、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するオルガノアルコキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン等のメルカプト基を有するオルガノアルコキシシラン等を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。メルカプト基を有するオルガノアルコキシシランを用いる場合は、マレイミド基を持つ機能性分子と結合させることができる。
前記ＮＨＳエステル基を有する機能性分子と前記アミノ基を有するオルガノアルコキシシランとの反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）やＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）等の溶媒に溶解した後、室温（例えば、２５℃）条件下で攪拌しながら反応することによって行うことができる。
その場合反応に用いる前記ＮＨＳエステル基を有する機能性分子と前記アミノ基を有するオルガノアルコキシシランとの割合は、モル換算で等量であることが好ましい。ＮＨＳエステル基を有する機能性分子は一般に高価なためできるだけ無駄を少なくしたいが、アミノ基を有するオルガノアルコキシシランの割合が高いと未反応のアミノ基を持つオルガノアルコキシシランがシリカ粒子に取り込まれることになり、シリカ粒子が純水中で凝集傾向を持ってしまうことがある。
その場合反応に用いる前記ＮＨＳエステル基を有する機能性分子と前記アミノ基を有するオルガノアルコキシシランとの割合は、モル換算で等量であることが好ましい。ＮＨＳエステル基を有する機能性分子は一般に高価なためできるだけ無駄を少なくしたいが、アミノ基を有するオルガノアルコキシシランの割合が高いと未反応のアミノ基を持つオルガノアルコキシシランがシリカ粒子に取り込まれることになり、シリカ粒子が純水中で凝集傾向を持ってしまうことがある。
本発明の製造方法に用いられる前記テトラアルコキシシランとしては、例えば、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、テトラメトキシシラン等が挙げられ、ＴＥＯＳが好ましい。
前記テトラアルコキシシランのアルコキシ基は前記アンモニア水含有溶媒の中で加水分解されてヒドロキシル基となり、さらにそれらが脱水縮合してシロキサン結合を形成する。
一般にシリカとは、シロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）に基づくケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体を指すが、ここでは前述のようなオルガノシロキサン成分を含有するケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体を含むものとする。
一般にシリカとは、シロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）に基づくケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体を指すが、ここでは前述のようなオルガノシロキサン成分を含有するケイ素原子及び酸素原子からなる３次元構造体を含むものとする。
本発明における前記工程（ａ）について、テトラアルコキシシランとしてＴＥＯＳを用いた場合を下記スキームに例示する。
本発明の製造方法の前記工程（ａ）において、前記テトラアルコキシシランの前記アンモニア水含有溶媒に含有させる量は、高すぎると粒子同士の融合が発生しやすくなり、逆に低すぎても粒度分布が広がる傾向にある。具体的には０．１〜２．０体積％であることが好ましく、０．２〜１．０体積％であることがより好ましい。
本発明の製造方法の前記工程（ａ）において、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物の前記アンモニア水含有溶媒中に含有させる量は、前記テトラアルコキシシランとの混合モル比率として、１：１００〜１：５の範囲で反応させることが好ましく、１：５０〜１：１０の範囲で反応させることがより好ましい。
この溶解ないしは含有させておく前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物の量により、得られる積層構造のシリカナノ粒子中の前記機能性分子の含有量を制御できる。
本発明の製造方法の前記工程（ａ）において、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物の前記アンモニア水含有溶媒中に含有させる量は、前記テトラアルコキシシランとの混合モル比率として、１：１００〜１：５の範囲で反応させることが好ましく、１：５０〜１：１０の範囲で反応させることがより好ましい。
この溶解ないしは含有させておく前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物の量により、得られる積層構造のシリカナノ粒子中の前記機能性分子の含有量を制御できる。
前記アンモニア水含有溶媒において、水と混合させる前記親水性溶媒としては、エタノール、メタノール等が挙げられるが、エタノールが好ましい。前記水と前記親水性溶媒との体積比が１：２０〜１：３の混合溶媒であることが好ましく、１：６〜１：４の混合溶媒であることがより好ましい。
本発明の製造方法で用いられるアンモニア水含有溶媒に含有させるアンモニア水の濃度は、目的の積層構造のシリカナノ粒子の平均粒径を制御する観点から、１〜２８質量％であることが好ましく、２〜１４質量％であることがより好ましい。
本発明の製造方法で用いられるアンモニア水含有溶媒に含有させるアンモニア水の濃度は、目的の積層構造のシリカナノ粒子の平均粒径を制御する観点から、１〜２８質量％であることが好ましく、２〜１４質量％であることがより好ましい。
前記アンモニアの含有量（アンモニア濃度）が高いほどシリカ粒子の核形成頻度、シリカ粒子の成長速度共に高くなるが、そのアンモニア濃度依存性はシリカ粒子の成長速度の方が高い。したがって、このアンモニア濃度依存性の違い（差）によりアンモニアの濃度を調節することで目的の積層構造の前記シリカナノ粒子及び前記コアとなる前記シリカ粒子の平均粒径を調整することができる。
前記工程（ａ）における前記コアとなる前記シリカ粒子の形成の温度条件としては特に制限はないが、高温で合成を行うとシリカへの機能性分子の取り込み効率を高めることができる。したがって、機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は３５〜６０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、反応時間を長くするとシリカへの機能性分子の取り込み効率を高めることができる。したがって、機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は４〜４８時間反応させることが好ましい。
前記工程（ａ）における前記コアとなる前記シリカ粒子の形成の温度条件としては特に制限はないが、高温で合成を行うとシリカへの機能性分子の取り込み効率を高めることができる。したがって、機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は３５〜６０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、反応時間を長くするとシリカへの機能性分子の取り込み効率を高めることができる。したがって、機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は４〜４８時間反応させることが好ましい。
前記機能性分子として蛍光色素分子を用いる場合、前記工程（ｂ）において、後述するＦＲＥＴによる自己消光を防止するためには１０ｎｍ以上の厚みの色素分子を多く含まないシェル層を形成させることが望ましい。前記テトラアルコキシシランと比べて反応速度の遅い色素結合ＡＰＳをシリカ粒子に取り込む場合、前記コアとなるシリカ粒子の表面近傍に色素分子が偏在することになり、ここで前記工程（ｂ）を施すとさらに含有された前記テトラアルコキシシランが色素を多く含まない前記シリカの層を形成することになる。さらに時間をかけると新たに形成された層の表面近傍にも色素が多く取り込まれることになるが、前記コアの表面に偏在する色素からは１０ｎｍ以上隔たれていることになり、ＦＲＥＴによる自己消光を効果的に防止することができる。
１０ｎｍ以上の層を形成させるために前記アンモニア水含有溶媒にさらに含有させる前記テトラアルコキシシランの量は、その時点で形成されているシリカ粒子の粒径によって異なる。例えば平均粒径３０ｎｍのシリカ粒子に１０ｎｍの層を形成させるためには、前記工程（ａ）において使用した前記テトラアルコキシシラン１００質量部に対して１００〜１２０質量部が好ましく、平均粒径１００ｎｍのシリカ粒子に１０ｎｍの層を形成させるためには、前記工程（ａ）において使用した前記テトラアルコキシシラン１００質量部に対して３０〜３６質量部が好ましい。
前記工程（ｂ）における前記シリカ層の形成温度条件としては特に制限はないが、前記工程（ａ）の場合と同様機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は３５〜６０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、前記工程（ａ）の場合と同様機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は４〜４８時間反応させることが好ましい。
前記工程（ｂ）における前記シリカ層の形成温度条件としては特に制限はないが、前記工程（ａ）の場合と同様機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は３５〜６０℃の温度条件下で行うことが好ましい。反応時間としては特に制限はないが、前記工程（ａ）の場合と同様機能性分子の取り込み効率を高くしたい場合は４〜４８時間反応させることが好ましい。
本発明の製造方法によれば、球状、もしくは、球状に近いシリカナノ粒子が製造できる。球状に近いシリカナノ粒子とは、具体的には長径と短径の比が１．２以下の形状である。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収する手法がある。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収する手法がある。
次に、本発明の積層構造のシリカナノ粒子について説明する。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述した本発明の製造方法により製造することができる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前記工程（ａ）により得られた前記機能性分子含有シリカ粒子をコアとし、前記シリカ粒子の表面上を１層又は２層以上のシリカの層がシロキサン結合により包囲してなる積層構造のシリカナノ粒子であることを特徴とする。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子において、前記シリカの層数としては、１〜６層であることが好ましい。
前述のように、前記工程（ａ）により得られたコアとなる前記シリカ粒子を調製する場合、テトラアルコキシシランの方が前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物よりも反応速度が速い。そのため、合成初期にはテトラアルコキシシランが反応して形成されるシリカに含有される前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分の比率が低く、逆に合成後期には前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分の比率が高くなる。結果として、前記コアとなる前記シリカ粒子の内部においては、前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分が表面近傍ないしは表面に高濃度に偏在することになる。前記工程（ｂ）により前記シリカの層を形成する場合においても同様に、前記シリカの層の外側に前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分が高濃度に偏在することになる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述した本発明の製造方法により製造することができる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前記工程（ａ）により得られた前記機能性分子含有シリカ粒子をコアとし、前記シリカ粒子の表面上を１層又は２層以上のシリカの層がシロキサン結合により包囲してなる積層構造のシリカナノ粒子であることを特徴とする。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子において、前記シリカの層数としては、１〜６層であることが好ましい。
前述のように、前記工程（ａ）により得られたコアとなる前記シリカ粒子を調製する場合、テトラアルコキシシランの方が前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物よりも反応速度が速い。そのため、合成初期にはテトラアルコキシシランが反応して形成されるシリカに含有される前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分の比率が低く、逆に合成後期には前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分の比率が高くなる。結果として、前記コアとなる前記シリカ粒子の内部においては、前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分が表面近傍ないしは表面に高濃度に偏在することになる。前記工程（ｂ）により前記シリカの層を形成する場合においても同様に、前記シリカの層の外側に前記機能性分子結合オルガノシロキサン成分が高濃度に偏在することになる。
前記機能性分子として蛍光色素分子を用いる場合であって、前記工程（ｂ）でシリカの層を２層以上形成する場合、あるシリカ層における前記蛍光色素分子成分が高濃度に偏在する部分と、それに隣接するシリカ層における前記蛍光色素分子成分が高濃度に偏在する部分との距離が近すぎるとＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｔ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ；蛍光共鳴エネルギー遷移）が生じ、前記蛍光色素分子成分間で自己消光を起こして蛍光強度が低下してしまう（例えば、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂ ７３，２４５３０２（２００６）参照。）。
そこで、本発明の積層構造のシリカナノ粒子において、前記シリカの層の厚みは、前記ＦＲＥＴによる自己消光を防止する観点から、７ｎｍ以上が好ましく、１０ｎｍ以上がより好ましく、１０〜２０ｎｍがさらに好ましい。
ただし、前記シリカの層が厚くなるとシリカ粒子の重量が増大し、それによりコロイド重量あたりの蛍光強度が減少することになる。そのため、コロイド重量あたりの蛍光強度を高くするには前記ＦＲＥＴによる自己消光が抑制される範囲で前記シリカの層を極力薄くすることが好ましい。
そこで、本発明の積層構造のシリカナノ粒子において、前記シリカの層の厚みは、前記ＦＲＥＴによる自己消光を防止する観点から、７ｎｍ以上が好ましく、１０ｎｍ以上がより好ましく、１０〜２０ｎｍがさらに好ましい。
ただし、前記シリカの層が厚くなるとシリカ粒子の重量が増大し、それによりコロイド重量あたりの蛍光強度が減少することになる。そのため、コロイド重量あたりの蛍光強度を高くするには前記ＦＲＥＴによる自己消光が抑制される範囲で前記シリカの層を極力薄くすることが好ましい。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法における前記アンモニア水含有溶媒中のアンモニアの含有量を制御すること、並びに前記工程（ｂ）を１回又は２回以上繰り返すことで制御することにより粒径が揃ったｎｍサイズの所望の平均粒径とすることができる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から直接各粒子（少なくとも１００個）の長径と短径を測定し、その平均値を計算して求めたものである。
本発明により得られたシリカナノ粒子の粒度分布の変動係数（以下ＣＶということもある。）は、１５％以下が好ましく、１０％以下がより好ましい。ここで、前記変動係数は、粒度の分布の標準偏差を平均粒径で割った値をいう。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法における前記アンモニア水含有溶媒中のアンモニアの含有量を制御すること、並びに前記工程（ｂ）を１回又は２回以上繰り返すことで制御することにより２０〜１００ｎｍの範囲にある平均粒径とした場合、変動係数は１５％以下とすることができる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から直接各粒子（少なくとも１００個）の長径と短径を測定し、その平均値を計算して求めたものである。
本発明により得られたシリカナノ粒子の粒度分布の変動係数（以下ＣＶということもある。）は、１５％以下が好ましく、１０％以下がより好ましい。ここで、前記変動係数は、粒度の分布の標準偏差を平均粒径で割った値をいう。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法における前記アンモニア水含有溶媒中のアンモニアの含有量を制御すること、並びに前記工程（ｂ）を１回又は２回以上繰り返すことで制御することにより２０〜１００ｎｍの範囲にある平均粒径とした場合、変動係数は１５％以下とすることができる。
また、本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、１００〜５００ｎｍの範囲にある平均粒径とした場合、変動係数は１０％以下とすることができる。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とはＣＶ１５％以下の粒子群をいう。
前述の通り、例えばＡＰＳなどのオルガノアルコキシシランと結合させてテトラアルコキシシランと共に反応させることで、前記機能性分子をシリカ粒子に取り込むことができる。ただしその取り込み効率は結合させる機能性分子の種類によって異なり、例えば蛍光色素であるカルボキシフルオレセイン色素をＡＰＳと結合させたオルガノアルコキシシラン化合物は取り込み効率が低い。取り込み効率の低い機能性物質をシリカ粒子に十分取り込ませるためには合成の際に多くのオルガノアルコキシシラン化合物を投入する必要があり、その場合投入した大部分のオルガノアルコキシシラン化合物が取り込まれずに廃棄されることになるため、コスト増大の要因となる。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とはＣＶ１５％以下の粒子群をいう。
前述の通り、例えばＡＰＳなどのオルガノアルコキシシランと結合させてテトラアルコキシシランと共に反応させることで、前記機能性分子をシリカ粒子に取り込むことができる。ただしその取り込み効率は結合させる機能性分子の種類によって異なり、例えば蛍光色素であるカルボキシフルオレセイン色素をＡＰＳと結合させたオルガノアルコキシシラン化合物は取り込み効率が低い。取り込み効率の低い機能性物質をシリカ粒子に十分取り込ませるためには合成の際に多くのオルガノアルコキシシラン化合物を投入する必要があり、その場合投入した大部分のオルガノアルコキシシラン化合物が取り込まれずに廃棄されることになるため、コスト増大の要因となる。
これに対して、本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述のように、本発明の製造方法において、前記工程（ｂ）を１回又は２回以上繰り返すことにより、前記機能性分子を高い効率で取り込むことができる。前記機能性分子のシリカ粒子への取り込み効率の低さは、その反応速度の遅さに起因している。反応速度の遅いオルガノアルコキシシラン化合物はテトラアルコキシシランによってシリカ粒子が合成された後で粒子表面に徐々に結合していくが、その密度が高くなると取り込まれにくくなり、ついにはオルガノアルコキシシラン化合物の取り込まれる量と脱離する量が同じになって平衡状態に達し、オルガノアルコキシシラン化合物はそれ以上取り込まれなくなる。この状態で前記工程（ｂ）を施せばシリカ粒子の表面に新たなシリカの層が形成され、その表面にも同様にオルガノアルコキシシラン化合物が高密度に結合することで、一粒子あたりのオルガノアルコキシシラン化合物の結合量を増大させることができる。
一般的には前記機能性分子の取り込み量は多いほど好ましいが、蛍光色素に関しては濃度消光による蛍光強度の低下があるため最適な取り込み量が存在する。その量は１ｍｌあたり３×１０１７分子程度であり、これは粒径１００ｎｍのシリカ粒子に換算すると約１３，０００分子に相当する。本発明の積層構造のシリカナノ粒子では、シリカ粒子への取り込み効率の低いカルボキシフルオレセイン色素分子でも少ない投入量でこのシリカ粒子内密度を達成することができる。
一般的には前記機能性分子の取り込み量は多いほど好ましいが、蛍光色素に関しては濃度消光による蛍光強度の低下があるため最適な取り込み量が存在する。その量は１ｍｌあたり３×１０１７分子程度であり、これは粒径１００ｎｍのシリカ粒子に換算すると約１３，０００分子に相当する。本発明の積層構造のシリカナノ粒子では、シリカ粒子への取り込み効率の低いカルボキシフルオレセイン色素分子でも少ない投入量でこのシリカ粒子内密度を達成することができる。
次に「シリカナノ粒子表面修飾」について説明する。
シリカは、一般に、化学的に不活性であると共に、その修飾が容易であることが知られている。本発明の積層構造のシリカナノ粒子もまた、容易に所望の物質を表面に結合させることが可能である。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、所望の標的生体分子を分子認識する物質を表面に結合もしくは吸着させることが好ましい。
前記積層構造のシリカナノ粒子が、前記機能性分子として蛍光色素分子もしくは吸光色素分子を含有する場合、検体（例えば、任意の細胞抽出液、溶菌液、培地・培養液、溶液、バッファー）中の標的生体分子（生理活性物質を含む。）を蛍光ないしは吸光色素標識付けすることができる。
前記積層構造のシリカナノ粒子を表面修飾する前記標的生体分子を分子認識する物質としては、抗体、抗原、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖、リガンド、受容体、化学物質等が挙げられる。
ここで、分子認識とは、（１）ＤＮＡ分子間又はＤＮＡ−ＲＮＡ分子間のハイブリダイゼーション、（２）抗原抗体反応、（３）酵素（受容体）−基質（リガンド）間の反応など、生体分子間の特異的相互作用をいう。
シリカは、一般に、化学的に不活性であると共に、その修飾が容易であることが知られている。本発明の積層構造のシリカナノ粒子もまた、容易に所望の物質を表面に結合させることが可能である。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、所望の標的生体分子を分子認識する物質を表面に結合もしくは吸着させることが好ましい。
前記積層構造のシリカナノ粒子が、前記機能性分子として蛍光色素分子もしくは吸光色素分子を含有する場合、検体（例えば、任意の細胞抽出液、溶菌液、培地・培養液、溶液、バッファー）中の標的生体分子（生理活性物質を含む。）を蛍光ないしは吸光色素標識付けすることができる。
前記積層構造のシリカナノ粒子を表面修飾する前記標的生体分子を分子認識する物質としては、抗体、抗原、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖、リガンド、受容体、化学物質等が挙げられる。
ここで、分子認識とは、（１）ＤＮＡ分子間又はＤＮＡ−ＲＮＡ分子間のハイブリダイゼーション、（２）抗原抗体反応、（３）酵素（受容体）−基質（リガンド）間の反応など、生体分子間の特異的相互作用をいう。
ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
また化学物質とは天然有機化合物に限らず、人工的に合成された生理活性を有する化合物や環境ホルモン等を含む。
すなわち、前記シリカナノ粒子を表面修飾した標的生体分子を分子認識する物質は、それ自体が受容体部位となって、例えば抗原−抗体反応、ビオチン−アビジン反応、塩基配列の相補性を利用したハイブリダイゼーションなどの特異的な分子認識を利用して、標的生体分子に特異的に結合することができる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子の表面への、前記生体分子による吸着等の表面修飾が、縮合剤ないしは架橋剤の存在下又は非存在下にて、前記積層構造のシリカナノ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより行われることが好ましい。
例えば、縮合剤等の非存在下、前記積層構造のシリカナノ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより、前記生体分子は、前記シリカナノ粒子の表面と吸着することができる。
また化学物質とは天然有機化合物に限らず、人工的に合成された生理活性を有する化合物や環境ホルモン等を含む。
すなわち、前記シリカナノ粒子を表面修飾した標的生体分子を分子認識する物質は、それ自体が受容体部位となって、例えば抗原−抗体反応、ビオチン−アビジン反応、塩基配列の相補性を利用したハイブリダイゼーションなどの特異的な分子認識を利用して、標的生体分子に特異的に結合することができる。
本発明の積層構造のシリカナノ粒子の表面への、前記生体分子による吸着等の表面修飾が、縮合剤ないしは架橋剤の存在下又は非存在下にて、前記積層構造のシリカナノ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより行われることが好ましい。
例えば、縮合剤等の非存在下、前記積層構造のシリカナノ粒子のコロイドと前記生体分子の溶液とを混合することにより、前記生体分子は、前記シリカナノ粒子の表面と吸着することができる。
前記縮合剤ないしは架橋剤を用いる場合の具体例としては、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等が挙げられる。
表面修飾に用いる前記縮合剤ないしは架橋剤の当量数、前記コロイドの分散媒、前記生体分子の溶液の溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については表面修飾が進行する限り特に制限はない。
前記表面修飾した後、前記積層構造のシリカナノ粒子と前記シリカナノ粒子に結合ないし吸着していない前記生体分子との分離は、遠心分離または限外ろ過によって可能である。
前記生体分子により前記シリカナノ粒子を表面修飾した後は、前述の非特異的吸着をさらに防止する観点から、ＰＥＧ、ＢＳＡなどの任意のブロッキング剤でブロッキング処理を施してもよい。
前記生体分子の表面修飾が出来たかどうかの確認は、混合液から遠心分離または限外ろ過で粒子を除去した溶液に含まれる前記生体分子を一般的なタンパク質定量法（例えば、ＵＶ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）で定量し、減少した前記生体分子の量を定量することで行うことができる。
表面修飾に用いる前記縮合剤ないしは架橋剤の当量数、前記コロイドの分散媒、前記生体分子の溶液の溶媒の種類・容量、及び反応温度等の反応条件については表面修飾が進行する限り特に制限はない。
前記表面修飾した後、前記積層構造のシリカナノ粒子と前記シリカナノ粒子に結合ないし吸着していない前記生体分子との分離は、遠心分離または限外ろ過によって可能である。
前記生体分子により前記シリカナノ粒子を表面修飾した後は、前述の非特異的吸着をさらに防止する観点から、ＰＥＧ、ＢＳＡなどの任意のブロッキング剤でブロッキング処理を施してもよい。
前記生体分子の表面修飾が出来たかどうかの確認は、混合液から遠心分離または限外ろ過で粒子を除去した溶液に含まれる前記生体分子を一般的なタンパク質定量法（例えば、ＵＶ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）で定量し、減少した前記生体分子の量を定量することで行うことができる。
次に、本発明の標識試薬について説明する。
本発明の標識試薬は、本発明の積層構造のシリカナノ粒子を用いてなる。前記積層構造のシリカナノ粒子を用いて、蛍光ないし吸光色素標識を付与することが好ましい。さらに前述のシリカナノ粒子の表面修飾により抗体やホルモンなどの標的生体分子を分子認識する物質でシリカ粒子表面を修飾し、光学特性を検出する装置又は目視によって前記標的生体分子が評価されるべき試料中に存在するか否か等の評価を可能にする標識試薬として利用することができる。
本発明の標識試薬の具体例としては、生体分子検出試薬、生体分子定量試薬、生体分子分離試薬、生体分子回収試薬または免疫染色用試薬が挙げられる。
前記標的生体分子を検出、定量、分離または回収する分析試薬とすることができる。また、前記標的生体分子との分子認識が、抗原−抗体反応である場合は、前記シリカナノ粒子を用いてなる免疫染色用試薬とすることができる。
本発明の標識試薬は、本発明の積層構造のシリカナノ粒子を用いてなる。前記積層構造のシリカナノ粒子を用いて、蛍光ないし吸光色素標識を付与することが好ましい。さらに前述のシリカナノ粒子の表面修飾により抗体やホルモンなどの標的生体分子を分子認識する物質でシリカ粒子表面を修飾し、光学特性を検出する装置又は目視によって前記標的生体分子が評価されるべき試料中に存在するか否か等の評価を可能にする標識試薬として利用することができる。
本発明の標識試薬の具体例としては、生体分子検出試薬、生体分子定量試薬、生体分子分離試薬、生体分子回収試薬または免疫染色用試薬が挙げられる。
前記標的生体分子を検出、定量、分離または回収する分析試薬とすることができる。また、前記標的生体分子との分子認識が、抗原−抗体反応である場合は、前記シリカナノ粒子を用いてなる免疫染色用試薬とすることができる。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１（本発明の積層構造のシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
１４質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈しアンモニア水含有溶媒１００ｍｌとし、その中に０．５体積％となる体積５００μｌのＴＥＯＳを、前記ＴＥＯＳと同体積のカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳのＤＭＦ溶液を、それぞれ、添加して室温（２５℃）にて撹拌した。
ここで、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物としての前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳは下記式で表され、前記カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステルとＡＰＳとを反応させたものを用いた。前記ＤＭＦ溶液は４０ｍＭの濃度に調整したものを用いた。
実施例１（本発明の積層構造のシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
１４質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈しアンモニア水含有溶媒１００ｍｌとし、その中に０．５体積％となる体積５００μｌのＴＥＯＳを、前記ＴＥＯＳと同体積のカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳのＤＭＦ溶液を、それぞれ、添加して室温（２５℃）にて撹拌した。
ここで、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物としての前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳは下記式で表され、前記カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステルとＡＰＳとを反応させたものを用いた。前記ＤＭＦ溶液は４０ｍＭの濃度に調整したものを用いた。
撹拌１時間ほどでシリカコロイドの生成はほぼ完了したが、蛍光強度を測定すると極めて弱く、前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳが粒子に取り込まれるにはなお２〜３時間を要した。
蛍光強度の測定の結果から、反応開始から４〜５時間経過すると前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳの取り込み速度が減少してきた。ここまでの操作を工程（ａ）とする。
前記工程（ａ）により得られたシェル層無しのシリカナノ粒子の蛍光強度を後述する図１において対照とした。
なお、前記シリカ粒子の蛍光強度の測定は、蛍光分光光度計ＦＰ−６５００（商品名、日本分光社製）を用いて、４９０ｎｍの励起光における５２０ｎｍの蛍光強度を測定した。
蛍光強度の測定の結果から、反応開始から４〜５時間経過すると前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳの取り込み速度が減少してきた。ここまでの操作を工程（ａ）とする。
前記工程（ａ）により得られたシェル層無しのシリカナノ粒子の蛍光強度を後述する図１において対照とした。
なお、前記シリカ粒子の蛍光強度の測定は、蛍光分光光度計ＦＰ−６５００（商品名、日本分光社製）を用いて、４９０ｎｍの励起光における５２０ｎｍの蛍光強度を測定した。
２．工程（ｂ）
工程（ａ）で得られたシリカ粒子に、前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳを取り込む余地の豊富なシリカを提供するため、ＴＥＯＳを追加投入し室温５時間反応させ、１層のシリカ層を有するシリカナノ粒子を得た。
ＴＥＯＳの追加投入量は、工程（ａ）における投入量の５０％分とした。
さらに、この工程（ｂ）のシェル形成操作を繰り返して積層構造とした粒子も調製した。すなわち、この工程（ｂ）をさらに１回繰り返して２層のシェル層を有するシリカナノ粒子、この工程（ｂ）をさらに２回繰り返して３層のシェル層を有するシリカナノ粒子を、それぞれ、調製した。２回目以降のＴＥＯＳの追加投入量も工程（ａ）における投入量の５０％分とした。
上記得られた各シリカナノ粒子を、それぞれ、洗浄し、平均粒径及び蛍光強度を測定した。
具体的な洗浄操作としては、反応終了後、遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物をエタノールに再分散させ、再度遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた。同様のエタノール洗浄操作をさらに１回繰り返し、未反応のＴＥＯＳ等を除去した。さらにエタノールの代わりに蒸留水を用いた以外は同様な洗浄操作を４回行い、遊離色素等を除去した。
工程（ａ）で得られたシリカ粒子に、前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳを取り込む余地の豊富なシリカを提供するため、ＴＥＯＳを追加投入し室温５時間反応させ、１層のシリカ層を有するシリカナノ粒子を得た。
ＴＥＯＳの追加投入量は、工程（ａ）における投入量の５０％分とした。
さらに、この工程（ｂ）のシェル形成操作を繰り返して積層構造とした粒子も調製した。すなわち、この工程（ｂ）をさらに１回繰り返して２層のシェル層を有するシリカナノ粒子、この工程（ｂ）をさらに２回繰り返して３層のシェル層を有するシリカナノ粒子を、それぞれ、調製した。２回目以降のＴＥＯＳの追加投入量も工程（ａ）における投入量の５０％分とした。
上記得られた各シリカナノ粒子を、それぞれ、洗浄し、平均粒径及び蛍光強度を測定した。
具体的な洗浄操作としては、反応終了後、遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去した。得られた沈殿物をエタノールに再分散させ、再度遠心分離（５０００×ｇ）を３０分行い、粒子を沈降させた。同様のエタノール洗浄操作をさらに１回繰り返し、未反応のＴＥＯＳ等を除去した。さらにエタノールの代わりに蒸留水を用いた以外は同様な洗浄操作を４回行い、遊離色素等を除去した。
３．平均粒径測定
上記得られた各シリカナノ粒子の平均粒径は、ＳＥＭ画像に写っている各粒子（１００個以上）の直径を測定し、その平均値として算出した。
前記工程（ａ）により得られた対照としてのシェル層無しのシリカナノ粒子の平均粒径は、変動係数９．０％の粒度分布で平均粒径１９０ｎｍであった。
前記工程（ｂ）により得られたシェル層を１層、２層、３層を有するシリカナノ粒子の平均粒径は、それぞれ、シェル層分だけ平均粒径が増加し、１９８ｎｍ（変動係数８．６％）、２０４ｎｍ（変動係数７．８％）、２０９ｎｍ（変動係数６．１％）であった。
４．蛍光強度測定
前記工程（ａ）により得られた対照としてのシェル層無しのシリカナノ粒子、前記工程（ｂ）により得られたシェル層を１層、２層、３層有するシリカナノ粒子、それぞれの蛍光強度を前述と同様な装置、測定条件で測定した。図１に得られた結果を示す。
上記得られた各シリカナノ粒子の平均粒径は、ＳＥＭ画像に写っている各粒子（１００個以上）の直径を測定し、その平均値として算出した。
前記工程（ａ）により得られた対照としてのシェル層無しのシリカナノ粒子の平均粒径は、変動係数９．０％の粒度分布で平均粒径１９０ｎｍであった。
前記工程（ｂ）により得られたシェル層を１層、２層、３層を有するシリカナノ粒子の平均粒径は、それぞれ、シェル層分だけ平均粒径が増加し、１９８ｎｍ（変動係数８．６％）、２０４ｎｍ（変動係数７．８％）、２０９ｎｍ（変動係数６．１％）であった。
４．蛍光強度測定
前記工程（ａ）により得られた対照としてのシェル層無しのシリカナノ粒子、前記工程（ｂ）により得られたシェル層を１層、２層、３層有するシリカナノ粒子、それぞれの蛍光強度を前述と同様な装置、測定条件で測定した。図１に得られた結果を示す。
図１は、０層（対照）、１層、２層、３層のシリカ層をそれぞれ形成してなるシリカナノ粒子の蛍光強度を示す図である。
図１において、一定量である工程（ａ）において添加したカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳの添加量で規格化（ノーマライズ）したシリカナノ粒子の蛍光強度（前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳ添加量当りの蛍光強度）、及び測定対象となったシリカコロイドの質量濃度で規格化した蛍光強度（シリカナノ粒子の質量当りの蛍光強度）の２通りで示した。いずれも単位はａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ（ａｕ：任意単位）として表した。以下同様である。
図１において、一定量である工程（ａ）において添加したカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳの添加量で規格化（ノーマライズ）したシリカナノ粒子の蛍光強度（前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳ添加量当りの蛍光強度）、及び測定対象となったシリカコロイドの質量濃度で規格化した蛍光強度（シリカナノ粒子の質量当りの蛍光強度）の２通りで示した。いずれも単位はａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ（ａｕ：任意単位）として表した。以下同様である。
図１から明らかなように、シリカナノ粒子の層数を１層、２層、３層と増加するごとに前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳ投入量当りのシリカナノ粒子の蛍光強度は直線的に増加している。これにより、前記工程（ｂ）を行うごとに、アンモニア水含有溶媒に残存するカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳが取り込まれていることがわかる。
一方、シリカナノ粒子の質量当りの蛍光強度については、シェルを１層形成（実施例）することでシェル無し（比較例）の場合より１３％増大し、シェルを２層形成（実施例）するとシェル無しの対照の場合より４３％増大した。しかしシェルを３層形成（実施例）すると、その増大量は２９％に低下した。これは、シェルを形成することによってシリカナノ粒子の質量が増大し、その結果蛍光強度の増大率がシリカコロイドの質量濃度の増大率を下回ったからである。このことから、２層のシェルを形成することが最も機能性分子の取り込み効率が高い結果となった。
しかし、シェル形成のために追加するＴＥＯＳの量を適宜減じることにより、シリカナノ粒子の質量の増加率を抑えられるため、上記結果よりもさらにシリカコロイドの質量濃度当りの蛍光強度、すなわち機能性分子の取り込み効率を高めることができる。
一方、シリカナノ粒子の質量当りの蛍光強度については、シェルを１層形成（実施例）することでシェル無し（比較例）の場合より１３％増大し、シェルを２層形成（実施例）するとシェル無しの対照の場合より４３％増大した。しかしシェルを３層形成（実施例）すると、その増大量は２９％に低下した。これは、シェルを形成することによってシリカナノ粒子の質量が増大し、その結果蛍光強度の増大率がシリカコロイドの質量濃度の増大率を下回ったからである。このことから、２層のシェルを形成することが最も機能性分子の取り込み効率が高い結果となった。
しかし、シェル形成のために追加するＴＥＯＳの量を適宜減じることにより、シリカナノ粒子の質量の増加率を抑えられるため、上記結果よりもさらにシリカコロイドの質量濃度当りの蛍光強度、すなわち機能性分子の取り込み効率を高めることができる。
実施例２（本発明の積層構造の吸光型シリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
色素を高濃度に含有する吸光型シリカコロイドを合成すべく、２質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈してアンモニア水含有溶媒１００ｍｌとし、その中に０．５体積％となる体積５００μｌのＴＥＯＳを前記ＴＥＯＳと同体積のカルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳのＤＭＦ溶液を、それぞれ、添加して室温にて撹拌した。
ここで、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物としての前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳは下記式で表され、前記５−カルボキシＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステルとＡＰＳとを反応させたものを用いた。前記ＤＭＦ溶液は４０ｍＭの濃度に調整したものを用いた。
１．工程（ａ）
色素を高濃度に含有する吸光型シリカコロイドを合成すべく、２質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈してアンモニア水含有溶媒１００ｍｌとし、その中に０．５体積％となる体積５００μｌのＴＥＯＳを前記ＴＥＯＳと同体積のカルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳのＤＭＦ溶液を、それぞれ、添加して室温にて撹拌した。
ここで、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物としての前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳは下記式で表され、前記５−カルボキシＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステルとＡＰＳとを反応させたものを用いた。前記ＤＭＦ溶液は４０ｍＭの濃度に調整したものを用いた。
室温下、撹拌３時間ほどでシリカ粒子のコロイドが生成したが、この場合前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳの投入量が多いため、シリカ粒子内部に取り込まれずに溶液中に残留する前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳの比率が高かった。
溶液中の遊離色素による蛍光強度の測定の結果から、反応開始から７〜８時間経過すると前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳの取り込み速度が減少し、反応終了とした。得られた粒子は、カルボキシＴＡＭＲＡ色素がシリカ粒子の表面近傍ないしは表面に偏在していた。
溶液中の遊離色素による蛍光強度の測定の結果から、反応開始から７〜８時間経過すると前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳの取り込み速度が減少し、反応終了とした。得られた粒子は、カルボキシＴＡＭＲＡ色素がシリカ粒子の表面近傍ないしは表面に偏在していた。
２．工程（ｂ）
実施例１の工程（ｂ）と同様な操作によりＴＥＯＳを追加投入し反応させ、反応終了後、実施例１と同様な洗浄操作を行った。その結果、１層のシリカ層を有するシリカナノ粒子を得た（平均粒径８７ｎｍ）。得られたシリカ粒子を実施例２のシリカナノ粒子とする。
溶液中に前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳが残存する状態で反応させ、シェルを形成しているので、シェル層の表面近傍ないしは表面にも多くの色素が結合していた。
実施例１の工程（ｂ）と同様な操作によりＴＥＯＳを追加投入し反応させ、反応終了後、実施例１と同様な洗浄操作を行った。その結果、１層のシリカ層を有するシリカナノ粒子を得た（平均粒径８７ｎｍ）。得られたシリカ粒子を実施例２のシリカナノ粒子とする。
溶液中に前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳが残存する状態で反応させ、シェルを形成しているので、シェル層の表面近傍ないしは表面にも多くの色素が結合していた。
実施例３
（積層構造のシリカナノ粒子のコロイドへの抗体の吸着）
遠心管に５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）を１ｍＬと、実施例２の積層構造のシリカナノ粒子のコロイド（１０ｍｇ／ｍＬ）９ｍＬを加えて軽く撹拌した。遠心管に抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅｓ／５００８， Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）１ｍＬ（６０μｇ／ｍＬ）を撹拌しながら加え、室温で１時間静置した。これに１質量％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を０．５５ｍＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１．１ｍＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２，０００×Ｇで１５分間遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。この分散液に保存用バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．２）， ０．０５％ ＰＥＧ２０，０００， １％ＢＳＡ， ０．１％ＮａＮ３）を２０ｍＬ加え、再度遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた（コロイドＡ）。
（積層構造のシリカナノ粒子のコロイドへの抗体の吸着）
遠心管に５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）を１ｍＬと、実施例２の積層構造のシリカナノ粒子のコロイド（１０ｍｇ／ｍＬ）９ｍＬを加えて軽く撹拌した。遠心管に抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅｓ／５００８， Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）１ｍＬ（６０μｇ／ｍＬ）を撹拌しながら加え、室温で１時間静置した。これに１質量％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を０．５５ｍＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１．１ｍＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２，０００×Ｇで１５分間遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。この分散液に保存用バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．２）， ０．０５％ ＰＥＧ２０，０００， １％ＢＳＡ， ０．１％ＮａＮ３）を２０ｍＬ加え、再度遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた（コロイドＡ）。
（分子認識試験）
続いて、前記抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子のコロイド（コロイドＡ）１００μｌを９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた。次に、抗ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）を用意した。図５は、分子認識試験に用いたストリップ１の平面図である。一方の末端２から約１５ｍｍの位置３にライン状に、前記溶液を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量（約１ｍｍ幅）で塗布したメンブレン４（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を５ｍｍ幅にカットし、ストリップ１（丈２５ｍｍ）とした。
前記ストリップ１の末端を前記９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子のコロイドに浸し、１時間放置した。
図２に示した、抗ＩｇＧ抗体がライン状に塗布された部分３が赤く発色したことを確認した。よって、前記抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子が形成されていることが確認された。また、本発明の積層構造のシリカナノ粒子が分析試薬として好適であることが分かる。
続いて、前記抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子のコロイド（コロイドＡ）１００μｌを９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた。次に、抗ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）を用意した。図５は、分子認識試験に用いたストリップ１の平面図である。一方の末端２から約１５ｍｍの位置３にライン状に、前記溶液を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量（約１ｍｍ幅）で塗布したメンブレン４（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を５ｍｍ幅にカットし、ストリップ１（丈２５ｍｍ）とした。
前記ストリップ１の末端を前記９６穴マイクロプレートのウェルの１つに入れた抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子のコロイドに浸し、１時間放置した。
図２に示した、抗ＩｇＧ抗体がライン状に塗布された部分３が赤く発色したことを確認した。よって、前記抗ｈＣＧ抗体を表面修飾した積層構造のシリカナノ粒子が形成されていることが確認された。また、本発明の積層構造のシリカナノ粒子が分析試薬として好適であることが分かる。
Claims (6)
- 次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とする積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
［（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させ、機能性分子を含有するシリカ粒子を調製する工程。］
［（ｂ）前記工程（ａ）により前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とにより前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程。］
［前記機能性分子は、蛍光色素分子、吸光色素分子、磁性分子、放射線標識分子、及びｐＨ感受性色素分子から選らばれる。］
- 前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が、３−アミノプロピルトリエトキシシランのアミノ基と機能性分子のカルボキシル基とをペプチド結合により連結させた化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
- 請求項１又は２に記載の製造方法によって得られた積層構造のシリカナノ粒子であって、蛍光色素分子、吸光色素分子、磁性分子、放射線標識分子、及びｐＨ感受性色素分子から選らばれる前記機能性分子を含有するシリカ粒子の表面上に、該機能性分子を含有するシリカの層を有することを特徴とするシリカナノ粒子。
- 平均粒径が２０〜１００ｎｍであり、かつ変動係数が１５％以下であることを特徴とする請求項３に記載の積層構造のシリカナノ粒子。
- 平均粒径が１００〜５００ｎｍであり、かつ変動係数が１０％以下であることを特徴とする請求項３に記載の積層構造のシリカナノ粒子。
- 請求項３〜５のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子を用いて調製される標識試薬。
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