WO2021157475A1 - 蛍光シリカナノ粒子、および蛍光シリカナノ粒子の製造方法 - Google Patents

蛍光シリカナノ粒子、および蛍光シリカナノ粒子の製造方法 Download PDF

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千葉　隆人
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Definitions

  • the present invention relates to fluorescent silica nanoparticles and a method for producing fluorescent silica nanoparticles.
  • Molecular imaging is a technology that visualizes the movement of molecules in the living body, which could not be visualized so far.
  • analysis of biomolecules at the molecular level research on the dynamics of viruses and bacteria that cause diseases, drugs It is widely used for various purposes such as evaluation of the effect of virus on a living body.
  • fluorescence imaging using a fluorescent substance is widely used for detecting trace substances in a living body.
  • Patent Document 1 an organosiloxane compound to which a fluorescent dye molecule is bound is hydrolyzed together with tetraalkoxysilane to obtain a core of silica particles containing a fluorescent dye molecule, and tetraalkoxysilane is further added to form a core of silica particles. It discloses a method of forming a covering shell to obtain highly sensitive fluorescent nanoparticles.
  • the present inventors include fluorescent silica nanoparticles in which a fluorescent dye molecule having an alkoxysilyl group and an alkoxysilane are hydrolyzed and polycondensed, as described in Patent Document 1 above. Attempts were made to encapsulate more fluorescent dyes to obtain higher brightness fluorescent silica nanoparticles. However, even if many fluorescent dyes are included in the silica particles, high-intensity silica nanoparticles could not be obtained.
  • concentration quenching refers to a phenomenon in which the emission intensity (luminous efficiency) of a phosphor decreases as the concentration of emission center ions increases in the phosphor. As one of the causes, it is considered that the excitation energy moves between the emission center ions, and then a process occurs in which the excitation energy is consumed non-radiatively without emitting light.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide fluorescent silica nanoparticles having high brightness even if many fluorescent dyes are included in the silica particles. Another object of the present invention is to provide a method for producing the fluorescent silica nanoparticles.
  • the fluorescent silica nanoparticles according to the embodiment of the present invention are fluorescent silica nanoparticles containing the silica nanoparticles and the fluorescent dye contained in the silica nanoparticles, and the total volume of the fluorescent dye is the fluorescent silica nanoparticles. It is 5% or more with respect to the total volume, and the emission quantum yield of the fluorescent silica nanoparticles is 10% or more.
  • the method for producing fluorescent silica nanoparticles according to an embodiment of the present invention is the above-mentioned method for producing fluorescent silica nanoparticles, in which the molar ratio of the fluorescent dye to the alkoxysilane in a liquid containing a fluorescent dye, ammonia and water. Includes a step of continuously adding the alkoxysilane so that is in the range of 1 to 30.
  • the present invention it is possible to provide fluorescent silica nanoparticles having a large amount of fluorescent dye contained in silica particles and having high brightness.
  • the present invention can also provide a method for producing the fluorescent silica nanoparticles.
  • the fluorescent silica nanoparticles according to the embodiment of the present invention are fluorescent silica nanoparticles containing the silica nanoparticles and the fluorescent dye contained in the silica nanoparticles, and the total volume of the fluorescent dye is the amount of the fluorescent silica nanoparticles. It is 5% by volume or more with respect to the total volume, and the emission quantum yield of the fluorescent silica nanoparticles is 10% or more.
  • the fluorescent silica nanoparticles according to the present embodiment include silica nanoparticles as a base.
  • silica nanoparticles are not particularly limited as long as they can contain a fluorescent dye with a physical or chemical binding force.
  • Silica nanoparticles are, for example, a polymer obtained by hydrolyzing alkoxysilane and polycondensing it.
  • alkoxysilanes examples include tetraalkoxysilanes, trialkoxysilanes, dialkoxysilanes and the like. Of these, tetraalkoxysilanes or trialkoxysilanes are preferred, and tetraalkoxysilanes are even more preferred.
  • tetraalkoxysilanes examples include tetraethoxysilane (TEOS), tetramethoxysilane, tetrabutoxysilane, tetrapropoxysilane, tetraisopropoxysilane, tetrakis (2-ethylhexyloxy) silane and the like. Of these, tetraethoxysilane (TEOS) is particularly preferred.
  • TEOS tetraethoxysilane
  • trialkoxysilanes include triethoxy-3-aminopropylsilane, N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilane, allyltriethoxysilane, trimethoxyallylsilane, 3- (acrylicoxy) propyltri.
  • the fluorescent silica nanoparticles according to the present embodiment include a fluorescent dye encapsulated in the silica nanoparticles.
  • the fluorescent dye is not particularly limited as long as it can emit fluorescence.
  • fluorescent dyes include TAMRA, Rhodamine 6G, fluorescein, perylene, Alexa, cyanine, pyrene, solvent yellow and the like, or derivatives thereof.
  • the content of the fluorescent dye should be high in order to increase the brightness of the fluorescent silica nanoparticles.
  • the content of the fluorescent dye is preferably 5% by volume or more, more preferably 10% by volume or more, and further preferably 20% by volume or more with respect to the total volume of the fluorescent silica nanoparticles. It is more preferably 30% by volume or more, and even more preferably 40% by volume or more.
  • the content of the fluorescent dye is preferably 70% by volume or less with respect to the total volume of the fluorescent silica nanoparticles.
  • the fluorescent dye has an alkoxysilyl group.
  • the alkoxysilyl group and the alkoxysilane forming the silica nanoparticles can be bonded to facilitate inclusion of the fluorescent dye in the silica nanoparticles.
  • the fluorescent dye and the alkoxysilyl group may be bonded via, for example, an ester bond or a peptide bond.
  • the fluorescent dye having an alkoxysilyl group can be obtained, for example, by reacting a fluorescent dye having an NHS ester group with 3-aminopropyltriethoxysilane (APS).
  • fluorescent dyes having an NHS ester group include 5-carboxytamRA-NHS ester, 5-carboxyrodamine 6G-NHS ester, 5-carboxyfluorescein-NHS ester (manufactured by invokegen), Carboxyfluorescein-PEG12-NHS, Fluorescein- PEG6-NHSester, Fluorescein-PEG6-bis-NHSester, BDPFL-NHS ester, Cy3NHSester, monoSulfo-Cy3 NHSEster, Cy3.5NHSester, Cy5-NHSester, monoSulfo-Cy5NHSEster, diSulfo-Cy5 NHSEster, Cy5-PEG6-NHSester, Cy5.5NHSester, Cy7NHSester, Cy
  • the average particle size of the fluorescent silica nanoparticles is preferably 250 nm or less, more preferably 150 nm or less, and further preferably 100 nm. The following is more preferable.
  • the lower limit of the average particle size of the fluorescent silica nanoparticles is not particularly limited, it is preferably 5 nm or more, and more preferably 10 nm or more, for example.
  • the average particle size can be taken as the average value by measuring the major axis of each particle (100 or more) shown in the image taken by the scanning electron microscope.
  • the coefficient of variation of the particle size of fluorescent silica nanoparticles should be small. Since the coefficient of variation is small, the size of the particles becomes uniform, and fluorescence imaging can be performed with a constant brightness. From the above viewpoint, the coefficient of variation of the particle size of the fluorescent silica nanoparticles is preferably 20% or less, and more preferably 15% or less. The lower limit of the coefficient of variation is not particularly limited, but may be, for example, 1% or more.
  • the fluorescent silica nanoparticles according to the present embodiment have a relatively small C / Si, which is the ratio of the number of carbon atoms to silicon on the surface of the fluorescent silica nanoparticles.
  • C and Si represent the abundance of the fluorescent dye and silica, respectively, and the fact that C / Si is relatively small means that the fluorescent dye is not localized on the surface of the fluorescent silica nanoparticles. It is considered that the concentration quenching is suppressed and the emission quantum yield is increased by dispersing the fluorescent dye without being localized in this way.
  • C / Si when C / Si is high, it is considered that the fluorescent dye is localized on the surface of the fluorescent silica nanoparticles, which easily causes concentration quenching and lowers the emission quantum yield. From this point of view, it is preferable that the C / Si on the surface of the fluorescent silica nanoparticles is relatively low, but if the C / Si is too low, the amount of the fluorescent dye contained in the fluorescent silica nanoparticles is too small and the brightness becomes low. It is also desirable that it is expensive to some extent because it is possible.
  • the fluorescent silica nanoparticles according to the present embodiment have a C / Si ratio of 2 to 10 carbon atoms to silicon on the surface of the fluorescent silica nanoparticles measured by X-ray photoelectron spectroscopy. It is preferably 3 to 7, more preferably 4 to 5, and even more preferably 4 to 5.
  • the fluorescent silica nanoparticles contain as much as 5% by volume or more of the fluorescent dye with respect to the total volume of the fluorescent silica nanoparticles, and the emission quantum yield is as high as 10% or more.
  • the fluorescent silica nanoparticles according to the present embodiment are produced by the method for producing fluorescent silica nanoparticles according to the embodiment of the present invention, which will be described later. It is considered that this is because the presence (proximity between fluorescent dyes) is suppressed and the concentration quenching is suppressed.
  • the emission quantum yield is 10% or more as described above, but it is more preferably 15% or more, and further preferably 20% or more.
  • the upper limit of the emission quantum yield is not particularly limited, but can be, for example, 50% or less.
  • the fluorescent silica nanoparticles according to the present embodiment contain a large amount of fluorescent dyes, and high brightness can be obtained because concentration quenching is suppressed.
  • the brightness is preferably high from the viewpoint of being able to measure with high sensitivity.
  • the brightness of the fluorescent silica nanoparticles according to the present embodiment is preferably 80 or more, more preferably 150 or more, further preferably 300 or more, and preferably 500 or more. More preferred.
  • the upper limit of the brightness is not particularly limited, but can be, for example, 800 or less.
  • the method for producing fluorescent silica nanoparticles according to the present embodiment is not particularly limited.
  • the fluorescent silica nanoparticles according to the present embodiment can be produced by the production method described below.
  • continuous addition means that at least 80% or more of the total amount of alkoxysilane added to the reaction solution to which the fluorescent dye has been added in advance is added at a time interval of less than 30 minutes (a time interval of 30 minutes or more). It means to add with).
  • concentration quenching is suppressed and the emission quantum yield is 10 even though the total volume of the fluorescent dye is 5% by volume or more based on the total volume of the fluorescent silica nanoparticles and contains a large amount of fluorescent dye.
  • Fluorescent silica nanoparticles as high as% or more can be produced. The reason is not limited to this, but can be considered as follows.
  • the alkoxysilane and the fluorescent dye (having an alkoxylsilane group) are hydrolyzed and polycondensed faster than the alkoxysilane. Then, when alkoxysilane is continuously added to the solvent containing the fluorescent dye, ammonia, and water as described above, the fluorescent dye is hydrolyzed and the fast-reacting alkoxysilane is supplied, so that the fluorescent dyes are polycondensed with each other. It is thought that it may prevent them from approaching each other.
  • the fluorescent dye having an alkoxysilyl group is added to the solvent in the state where the tetraalkoxysilane is hydrolyzed and polycondensed to some extent, so that the fluorescent dye is tetraalkoxy. It is thought that it is easily localized in the silane, and as a result, the concentration is extinguished.
  • the addition time of alkoxysilane is preferably 72 hours or less, more preferably 50 hours or less, further preferably 1 hour or less, and 1 It is more preferably less than a minute.
  • the addition time is short, the average particle size of the fluorescent silica nanoparticles becomes small, the CV value of the average particle size decreases, and the variation in the particle size is suppressed.
  • the addition time means the time from the start of adding the alkoxysilane to the end of the addition of the entire amount.
  • the molar ratio of the fluorescent dye charged to the alkoxysilane should be large in order to have a sufficient inclusion amount of the fluorescent dye, but if it is too large, particles cannot be formed. From the above point of view.
  • the molar ratio (fluorescent dye / alkoxysilane) of the preparation is preferably 1 to 30, and more preferably 8 to 15.
  • NMP N- methylpyrrolidone
  • phenol was added in the presence of potassium carbonate (K 2 CO 3), and reacted for 6 hours at 80 ° C..
  • K 2 CO 3 potassium carbonate
  • 3-bromophenol was added and reacted at 120 ° C. for 16 hours.
  • the obtained compound was dissolved in dioxane, an aqueous sodium hydroxide solution was added, and the mixture was reacted at 60 ° C. for 2 hours (yield 73%).
  • the obtained compound was dissolved in tetrahydrofuran (THF), and 1 -(3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide were added and reacted at 40 ° C. for 4 hours (yield 76%). In this way, a derivative of the perylene dye was obtained.
  • the derivative of the perylene dye synthesized as described above was dissolved in dimethylformamide (DMF) so as to have a concentration of 20 mg / ml. Then, 3-aminopropyltriethoxysilane (APS) (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) is added so that the molar ratio of the derivative of the perylene dye is 1, and the mixture is reacted at room temperature for 1 hour to obtain the perylene dye. A triethoxysilyl group was added to the derivative to obtain perylene-APS.
  • DMF dimethylformamide
  • APS 3-aminopropyltriethoxysilane
  • the above reaction solution was centrifuged at 18000 G for 15 minutes in a cooling centrifuge (himac CR21N, manufactured by Koki Holdings Co., Ltd.), and after removing the supernatant, 13 ml of ethanol was added and ultrasonically irradiated to redisperse. Washing by centrifugation, removal of supernatant and redispersion in ethanol was repeated 3 times. In this way, the fluorescent silica nanoparticles of Example 1 were obtained.
  • Example 2 to 4 Fluorescent silica nanoparticles of Examples 2, 3 and 4, respectively, were obtained in the same manner as in Example 1 except that the molar ratios of the perylene dye and tetraethoxylane (perylene dye / tetraethoxysilane) were set to 15, 25 and 2.
  • Example 5 Fluorescent silica nanoparticles of Examples 5, 6 and 7, respectively, were obtained in the same manner as in Example 1 except that the addition time of tetraethoxysilane was 70 hours, 48 hours and 0.5 hours, respectively.
  • Comparative Example 2 164 ⁇ l, which is 70% of the total amount of tetraethoxysilane, was added in a batch, and the mixture was stirred at room temperature for 0.5 hours. After that, fluorescent silica nanoparticles of Comparative Example 2 were obtained in the same manner as in Comparative Example 1 except that 70 ⁇ l, which was 30% of the total amount of tetraethoxysilane, was added all at once.
  • Comparative Example 3 Fluorescent silica nanoparticles of Comparative Example 3 were obtained in the same manner as in Example 1 except that tetraethoxysilane was continuously added for 200 hours.
  • Example 4 The same procedure as in Example 1 was carried out except that the molar ratio of the perylene dye to tetraethoxysilane was changed to 50, but the amount of the perylene dye was too large to form particles.
  • Comparative Example 5 Fluorescent silica nanoparticles of Comparative Example 5 were obtained in the same manner as in Example 1 except that the molar ratio of the perylene dye and tetraethoxysilane was changed to 0.5.
  • Amount of pigment included To determine the amount of dye inclusion, measure the amount of Si and C elements according to the following procedure, calculate the element ratio of Si and C, and then convert the Si ratio to the molecular volume of SiO 2 and the C ratio to the molecular volume of the fluorescent dye for fluorescence. The total volume (%) of the fluorescent dye contained in the silica nanoparticles was calculated. At this time, each of density of SiO 2 and the fluorescent dye 2.2 g / cm 3, was 1.2 g / cm 3.
  • emission quantum yield The emission quantum yield is adjusted so that the absorbance (abs.) Is 0.2 to 0.4 at an excitation wavelength of 567 nm using an absolute PL quantum yield measuring device (Quantaurus-QY C11347-01, manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). Fluorescent nanoparticles were dispersed in ethanol for measurement. The measurement results are shown in Table 1 below.
  • the average particle size of each silica nanoparticle obtained as described above is the diameter of each particle (100 or more) shown in the image taken with a scanning electron microscope (S-4800, manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation). It was measured using software (manufactured by Asahi Kasei Engineering Co., Ltd., A-kun) and calculated as the average value. The coefficient of variation was also calculated from the measured diameter. The measurement results are shown in Table 1 below.
  • each fluorescent silica nanoparticles obtained as described above is such that the solid content concentration of the fluorescent nanoparticle dispersion is 0.028 mg / ml using a spectrofluorometer F-7000 (manufactured by Hitachi High-Tech Science).
  • F-7000 manufactured by Hitachi High-Tech Science.
  • the fluorescence intensity was diluted with ethanol, set to a photomal voltage of 400 V, and the fluorescence intensity at 610 nm in the excitation light of 567 nm was measured.
  • the measurement results are shown in Table 1 below.
  • (C / Si) C / Si which is the atomic ratio of carbon to silicon on the surface of fluorescent silica nanoparticles, has a solid content concentration of 0.
  • concentration was adjusted with ethanol so as to be 028 mg / ml, and 8 ⁇ l was dropped on the back surface of the aluminum foil wiped with ethanol in advance, and an naturally dried film was observed.
  • the measurement results are shown in Table 1 below.
  • TEOS which is more hydrolyzed and easily polycondensed, is continuously added to the solution containing the fluorescent dye, which is more hydrolyzed and less likely to be polycondensed. It is considered that this is because many of the fluorescent dyes are bound to each other and the fluorescent dyes are prevented from being close to each other. As a result, it is considered that the fluorescent silica nanoparticles of Examples 1 to 7 have a high emission quantum yield because the concentration quenching is suppressed while the fluorescent dye is contained in a high concentration. On the other hand, in Comparative Examples 1 and 2, since TEOS was added separately, it is considered that the bonds between the fluorescent dye and TEOS were less, the fluorescent dyes were more bound to each other, concentration quenching occurred, and the emission quantum yield was lowered.
  • Comparing Examples 1 to 7 with Comparative Example 4 the molar ratio of the fluorescent dye / TEOS is as high as 40 in Comparative Example 4. As a result, in Comparative Example 4, the amount of the fluorescent dye was too large to form particles.
  • the fluorescent silica nanoparticles according to the present embodiment have high brightness and are therefore useful for fluorescence imaging and the like.

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Abstract

本発明は、シリカ粒子中に多くの蛍光色素を内包させても高輝度である蛍光シリカナノ粒子を提供することに関する。本発明の蛍光シリカナノ粒子は、シリカナノ粒子と、前記シリカナノ粒子に内包された蛍光色素と、を含む蛍光シリカナノ粒子であって、前記蛍光色素の合計体積は、前記蛍光シリカナノ粒子の全体積に対して５％以上であり、前記蛍光シリカナノ粒子の発光量子収率は１０％以上である。

Description

蛍光シリカナノ粒子、および蛍光シリカナノ粒子の製造方法
　本発明は、蛍光シリカナノ粒子、および蛍光シリカナノ粒子の製造方法に関する。
　近年、臨床分野や基礎研究において、分子イメージング技術が高い注目を集めている。分子イメージングは、これまで可視化できなかった生体内での分子の動きを可視化する技術であり、例えば、生体分子の分子レベルでの解析、疾病の原因となるウイルスや細菌の動態についての研究、薬物が生体に与える作用等の評価など、様々な目的について広く用いられている。特にその優れた検出感度や操作性等から、生体中の微量物質の検出には、蛍光物質を用いて行う蛍光イメージングが広く用いられる。
　蛍光イメージングを用いた診断や研究においては、蛍光性の物質を標識試薬として検出したい生体物質に結合させ、所定の励起光を照射することによって標識試薬の蛍光を高感度に検出する手法が提案されている。このような蛍光イメージングにより得られる蛍光シグナルにより、生体分子相互作用の定量化、長期間におよぶ生体分子の動態観察、超高感度観察などを行うための特性をもつ蛍光標識材が求められている。
　たとえば、特許文献１は、蛍光色素分子が結合したオルガノシロキサン化合物をテトラアルコキシシランとともに加水分解して蛍光色素分子含有シリカ粒子のコアを得て、さらにテトラアルコキシシランを加えて、シリカ粒子のコアを覆うシェルを形成して、高感度の蛍光ナノ粒子を得る方法を開示している。
特開２００９－２２１０５９号公報
　本発明者らは、上記の特許文献１に記載されているような、アルコキシシリル基を有する蛍光色素分子と、アルコキシシランとが加水分解して重縮合してなる蛍光シリカナノ粒子において、シリカ粒子中により多くの蛍光色素を内包させてより高輝度の蛍光シリカナノ粒子を得ようと試みた。しかし、シリカ粒子中に多くの蛍光色素を内包させても高輝度のシリカナノ粒子を得ることができなかった。
　本発明者らは、高輝度のシリカナノ粒子を得ることができない理由を鋭意検討し、シリカ粒子中に多くの蛍光色素を内包させると濃度消光がおこり発光量子収率が下がるため高輝度のシリカナノ粒子を得ることができないと考えた。ここで濃度消光とは、蛍光体において発光中心イオンの濃度増加に伴い蛍光体の発光強度（発光効率）が低下する現象をいう。この原因の１つとして励起エネルギーが発光中心イオン間を移動し、その後、発光をともなわず無輻射的に消費される過程が生じることが考えられる。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、シリカ粒子中に多くの蛍光色素を内包させても高輝度である蛍光シリカナノ粒子を提供することを目的とする。また、本発明は、当該蛍光シリカナノ粒子の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明の一実施形態に係る蛍光シリカナノ粒子は、シリカナノ粒子と、前記シリカナノ粒子に内包された蛍光色素と、を含む蛍光シリカナノ粒子であって、前記蛍光色素の合計体積は、前記蛍光シリカナノ粒子の全体積に対して５％以上であり、前記蛍光シリカナノ粒子の発光量子収率は１０％以上である。
　また、本発明の一実施形態に係る蛍光シリカナノ粒子の製造方法は、上記の蛍光シリカナノ粒子の製造方法であって、蛍光色素、アンモニアおよび水を含有する液体に、アルコキシシランに対する蛍光色素のモル比が１～３０の範囲内となるようにアルコキシシランを連続添加する工程を含む。
　本発明によれば、シリカ粒子中に多くの蛍光色素を内包し、かつ高輝度である蛍光シリカナノ粒子を提供することができる。また、本発明は、当該蛍光シリカナノ粒子の製造方法を提供することができる。
　［蛍光シリカナノ粒子］
　本発明の実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子は、シリカナノ粒子と、前記シリカナノ粒子に内包された蛍光色素と、を含む蛍光シリカナノ粒子であって、前記蛍光色素の合計体積は、前記蛍光シリカナノ粒子の全体積に対して５体積％以上であり、前記蛍光シリカナノ粒子の発光量子収率は１０％以上である。
　（シリカナノ粒子）
　本実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子は、母体としてのシリカナノ粒子を含む。
　シリカナノ粒子は、特に限定されず、物理的または化学的な結合力で蛍光色素を内包することができればよい。シリカナノ粒子は、たとえば、アルコキシシランを加水分解し、重縮合して得られる重合物である。
　アルコキシシランの例には、テトラアルコキシシラン、トリアルコキシシラン、ジアルコキシシラン等が含まれる。これらの内、テトラアルコキシシランまたはトリアルコキシシランが好ましく、テトラアルコキシシランがさらに好ましい。
　テトラアルコキシシランの例には、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、テトラメトキシシラン、テトラブトキシシラン、テトラプロポキシシラン、テトライソプロポキシシラン、テトラキス(２－エチルヘキシルオキシ)シラン等が含まれる。これらの内、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）が特に好ましい。
　トリアルコキシシランの例には、トリエトキシ－３－アミノプロピルシラン、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－アミノプロピルトリメトキシシラン、アリルトリエトキシシラン、トリメトキシアリルシラン、３－（アクリルオキシ）プロピルトリメトキシシラン、Ｎ－（３－トリエトキシシリルプロピル）エチエンジアン、（１１－アジドウンデシル）トリメトキシシラン、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］ヘキサメチレンジアミン、ビス［３－（トリメトキシシリル）プロピル］アミン、エチレンビス（トリメトキシシラン）、５－（トリエトキシシリル）－２－ノルボルネン、ベンジルトリエトキシシラン含まれる。
　（蛍光色素）
　本実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子は、シリカナノ粒子に内包された蛍光色素を含む。
　蛍光色素は、特に制限されず、蛍光を発することができればよい。蛍光色素の例には、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、フルオレセイン、ペリレン、Alexa、シアニン、ピレン、ソルベントイエロー等、またはこれらの誘導体等が含まれる。
　蛍光色素の含有量は、蛍光シリカナノ粒子を高輝度にするためには多い方がよい。この観点から、蛍光色素の含有量は、蛍光シリカナノ粒子の全体積に対して５体積％以上であることが好ましく、１０体積％以上であることがさらに好ましく、２０体積％以上であることがさらに好ましく、３０体積％以上であることがさらに好ましく、４０体積％以上であることがさらに好ましい。
　一方、蛍光色素の含有量が多すぎると、アルコキシシランを加水分解し重縮合させてもシリカナノ粒子を形成することができなくなってしまう。この観点から、蛍光色素の含有量は、蛍光シリカナノ粒子の全体積に対して７０体積％以下であることが好ましい。
　また、蛍光色素はアルコキシシリル基を有していることが好ましい。蛍光色素がアルコキシシリル基を有していることで、当該アルコキシシリル基と、シリカナノ粒子を形成するアルコキシシランとが結合し、蛍光色素をシリカナノ粒子中に包含させやすくすることができる。
　蛍光色素とアルコキシシリル基とは、例えば、エステル結合、ペプチド結合などを介して結合していればよい。
　アルコキシシリル基を有している蛍光色素は、例えば、ＮＨＳエステル基を有する蛍光色素と、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）とを反応させて得ることができる。ＮＨＳエステル基を有する蛍光色素の例には、５－カルボキシＴＡＭＲＡ－ＮＨＳエステル、５－カルボキシローダミン６Ｇ－ＮＨＳエステル、５－カルボキシフルオレセイン－ＮＨＳエステル（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Carboxyfluorescein-PEG12-NHS、Fluorescein-PEG6-NHS ester、Fluorescein-PEG6-bis-NHS ester、BDP FL －ＮＨＳエステル、Cy3 NHS ester、monoSulfo-Cy3 NHS Ester、Cy3.5 NHS ester、Cy5-NHS ester、monoSulfo-Cy5 NHS Ester、diSulfo-Cy5 NHS Ester、Cy5-PEG6-NHS ester、Cy5.5 NHS ester、Cy7 NHS ester、Cy7.5 NHS ester、Sulfo-Cy3 NHS ester、Sulfo-Cy5 NHS ester、Sulfo-Cy7 NHS ester、solvent yellow98 NHS Ester等が含まれる。
　（平均粒子径および変動係数）
　また、蛍光シリカナノ粒子の平均粒子径は大きすぎると細胞間などの隙間に発現しているタンパク質の染色がしにくくなるので、２５０ｎｍ以下であることが好ましく、１５０ｎｍ以下であることがさらに好ましく、１００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。蛍光シリカナノ粒子の平均粒子径の下限は特に制限されないものの、例えば、５ｎｍ以上であることが好ましく、１０ｎｍ以上であることがさらに好ましい。なお、平均粒子径は走査型電子顕微鏡で撮影した画像に写っている各粒子（１００個以上）の長径を測定し、その平均値とすることができる。
　蛍光シリカナノ粒子の粒子径の変動係数は小さい方がよい。変動係数が小さいことにより粒子の大きさが揃うことになり、一定の輝度で蛍光イメージングをすることができる。蛍光シリカナノナノ粒子の粒子径の変動係数は、上記の観点から、２０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがさらに好ましい。変動係数の下限は特に制限されないものの、例えば１％以上とすることができる。
　（炭素とケイ素との原子数比）
　本実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子は、蛍光シリカナノ粒子の表面におけるケイ素に対する炭素の原子数の比であるＣ／Ｓｉが比較的小さい。ここでＣ、Ｓｉはそれぞれ蛍光色素、シリカの存在量を表しており、Ｃ／Ｓｉが比較的小さいということは、蛍光シリカナノ粒子の表面において蛍光色素が局在化していないことを表している。このように蛍光色素が局在化せずに分散することにより、濃度消光が抑制され、発光量子収率が高くなると考えられる。逆に、Ｃ／Ｓｉが高いということは、蛍光シリカナノ粒子の表面に蛍光色素が局在化しており、これにより濃度消光が起こりやすく発光量子収率が低くなると考えられる。この観点から、蛍光シリカナノ粒子の表面におけるＣ／Ｓｉは比較的低いことが好ましいが、Ｃ／Ｓｉが低すぎると、蛍光シリカナノ粒子中に包含される蛍光色素の量が少なすぎて輝度が低くなると考えられるためある程度高いことも望まれる。
　上記の観点から、本実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子は、Ｘ線光電子分光法により測定される蛍光シリカナノ粒子の表面におけるケイ素に対する炭素の原子数の比であるＣ／Ｓｉが２～１０であることが好ましく、３～７であることがさらに好ましく、４～５であることがさらに好ましい。
　（発光量子収率）
　蛍光シリカナノ粒子は、上記のように蛍光シリカナノ粒子の全体積に対して５体積％以上と多くの蛍光色素を含み、かつ発光量子収率は１０％以上と高い。これは本実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子は、後述する本発明の実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子の製造方法によって製造されることにより、多くの蛍光色素を内包しつつも、蛍光色素の局在化（蛍光色素同士の近接）が抑制され、濃度消光が抑制されるからであると考えられる。
　本実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子では、上記のように発光量子収率は１０％以上であるが、１５％以上であることがさらに好ましく、２０％以上であることがさらに好ましい。発光量子収率の上限は特に制限されないものの、例えば５０％以下とすることができる。
　（輝度）
　本実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子は、多くの蛍光色素を含みつつ、濃度消光が抑制されるために高い輝度が得られる。輝度は、高感度に測定できるという観点から高い方が好ましい。具体的には、本実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子の輝度は、８０以上であることが好ましく、１５０以上であることがさらに好ましく、３００以上であることがさらに好ましく、５００以上であることがさらに好ましい。輝度の上限は特に制限されないものの、例えば、８００以下とすることができる。
　本実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子の製造方法は、特に限定されない。たとえば、本実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子は、次に説明する製造方法により製造されうる。
　［蛍光シリカナノ粒子の製造方法］
　本実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子の製造方法は、蛍光色素、アンモニアおよび水を含有する液体に、アルコキシシランに対する蛍光色素のモル比が１～３０の範囲内となるようにアルコキシシランを連続添加する工程を含む。
　ここで連続添加とは、予め蛍光色素を先に添加しておいた反応液に少なくともアルコキシシランの全添加量の８０％以上を、３０分未満の時間間隔（３０分以上の時間間隔をあけることなく）で添加することをいう。
　上記の製造方法によれば、蛍光色素の合計体積が蛍光シリカナノ粒子の全体積に対して５体積％以上と多くの蛍光色素を含むにも拘わらず濃度消光が抑制され、発光量子収率が１０％以上と高い蛍光シリカナノ粒子を製造することができる。その理由は、これに限定されるわけではないが、以下のように考えられる。
　まず、前提としてアルコキシシランと（アルコキシルシラン基を有する）蛍光色素では、アルコキシシランの方が加水分解して重縮合するのが速いと考えられる。そして、上記のように蛍光色素とアンモニアと水とを含有する溶媒にアルコキシシランを連続添加すると、蛍光色素が加水分解されるとともに反応が速いアルコキシシランが供給されるので蛍光色素同士が重縮合して近接するのを妨げるのではないかと考えられる。逆にテトラアルコキシシランが先に溶媒中にあると、ある程度加水分解され重縮合したテトラアルコキシシランがある状態の溶媒中にアルコキシシリル基を有する蛍光色素を添加することになるので蛍光色素がテトラアルコキシシラン中で局在化しやすく、その結果濃度消光してしまうと考えられる。
　本実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子の製造方法は、アルコキシシランの添加時間が７２時間以下であることが好ましく、５０時間以下であることがさらに好ましく、１時間以下であることがさらに好ましく、１分以下であることがさらに好ましい。添加時間が短いことで蛍光シリカナノ粒子の平均粒子径が小さくなり、平均粒子径のＣＶ値が低下して粒子径のバラツキが抑えられる。
　なお、ここで添加時間とは、アルコキシシランを添加し始めてから全量を添加し終えるまでの時間をいう。
　また、アルコキシシランに対する蛍光色素の仕込みのモル比（蛍光色素／アルコキシシラン）は、蛍光色素の内包量を十分とするために大きい方がよいが、大きすぎると粒子を形成することができなくなる。上記観点から。当該仕込みのモル比（蛍光色素／アルコキシシラン）は、１～３０であることが好ましく、８～１５であることがさらに好ましい。
　以下、本実施の形態に係る発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本実施の形態に係る発明はこれらの実施例により限定されない。
　［蛍光シリカナノ粒子の調製］
　（実施例１）
　〈蛍光色素の調製〉
　ペリレン色素の誘導体を以下に示す合成手順に従って作製した。１，６，７，１２－テトラクロロペリレンテトラカルボン酸二無水物（富士フイルム和光純薬社製、製品番号Ｗ０１ＣＯＢＱＡ－７２９４）にプロピオン酸を加え、溶媒中で３時間還流させて反応させた（収率８０％）。次に、得られた化合物をＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解し、フェノールを加え、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）の存在下、８０℃で６時間反応させた。次に、３－ブロモフェノールを加え１２０℃で１６時間反応させた。
　次に、得られた化合物を１、４－ジオキサンに溶解し、４－ピナコールボランフェニル酢酸エチルを加え、ビス(ジベンジリデンアセトン)パラジウム（ｐｄ（ｄｂａ）２）およびリン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）の存在下、１００℃で２時間反応させた。（収率２０％）。
　次に、得られた化合物をジオキサンに溶解し水酸化ナトリウム水溶液を加え、６０℃で２時間反応させた（収率７３％）次に、得られた化合物をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、１－（３―ジメチルアミノプロピル）－３―エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミドを加え４０℃で４時間反応させた（収率７６％）。このようにして、ペリレン色素の誘導体を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上記のようにして合成したペリレン色素の誘導体を２０ｍｇ／ｍｌとなるようにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。その後、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）（東京化成工業株式会社製）と、ペリレン色素の誘導体とのモル比が１となるように加え、室温で１時間反応させることにより、ペリレン色素の誘導体にトリエトキシシリル基を付加し、ペリレン－ＡＰＳとした。
　〈蛍光シリカナノ粒子の合成〉
　エタノール（９９．５、富士フイルム和光純薬株式会社製）１０８４４μl、水９０９μl、アンモニア水（２８％、富士フイルム和光純薬株式会社製）２６６μlを混合した溶液にペリレン－ＡＰＳを７４７μl加え、予めマイクロシリンジポンプ（ＳＰＳ－１、アズワン株式会社製）に入れておいたエタノールで１０％に希釈したテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ、東京化成工業株式会社製）２３４μlを５秒間で加え、室温で４８時間攪拌した。このとき全量は１３ｍｌであり、ペリレン色素とテトラエトキシシランとのモル比（ペリレン色素／テトラエトキシシラン）は１０とした。
　上記の反応液を冷却遠心機（ｈｉｍａｃ　ＣＲ２１Ｎ、工機ホールディングス株式会社製）にて１８０００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、エタノールを１３ｍｌ加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去およびエタノールへの再分散による洗浄を３回繰り返した。このようにして実施例１の蛍光シリカナノ粒子を得た。
　（実施例２～４）
　ペリレン色素とテトラエトキシラン（ペリレン色素／テトラエトキシシラン）のモル比を１５、２５、２とした以外は実施例１と同様にして実施例２、３、４の蛍光シリカナノ粒子をそれぞれ得た。
　（実施例５～７）
　テトラエトキシシランの添加時間を７０時間、４８時間、０．５時間とした以外は実施例１と同様にして実施例５、６、７の蛍光シリカナノ粒子をそれぞれ得た。
　（比較例１）
　エタノール（９９．５、富士フイルム和光純薬株式会社製）１０８４４μl、水９０９μl、アンモニア水（２８％、富士フイルム和光純薬株式会社製）２６６μlを混合した溶液にペリレン－ＡＰＳを７４７μl加え、テトラエトキシシランを全量の７０％である１６４μlを一括で加え、室温で３時間撹拌した。その後に、更にテトラエトキシシランを全量の３０％である７０μlを一括で加え、室温で４８時間攪拌した。このとき全量は１３ｍｌであり、ペリレン色素とテトラエトキシシランとのモル比（ペリレン色素／テトラエトキシシラン）は１０である。
　上記の反応液について、実施例１と同様に遠心分離および洗浄を行い比較例１の蛍光シリカナノ粒子を得た。
　（比較例２）
　テトラエトキシシランの全量の７０％である１６４μlを一括で加え、室温で０．５時間撹拌した。その後に、テトラエトキシシランの全量の３０％である７０μlを一括で加えた以外は比較例１と同様にして比較例２の蛍光シリカナノ粒子を得た。
　（比較例３）
　テトラエトキシシランを２００時間で連続添加した以外は実施例１と同様にして比較例３の蛍光シリカナノ粒子を得た。
　（比較例４）
　ペリレン色素とテトラエトキシシランとのモル比を５０に変更した以外は実施例１と同様にしたが、ペリレン色素の量が多すぎて、粒子が形成されなかった。
　（比較例５）
　ペリレン色素とテトラエトキシシランとのモル比を０．５に変更した以外は実施例１と同様にして比較例５の蛍光シリカナノ粒子を得た。
　［評価］
　上記のようにして得た蛍光シリカナノ粒子を以下のように評価した。
　（色素内包量）
　色素内包量は下記の手順でＳｉとＣの元素量を測定し、ＳｉとＣの元素比を算出した後にＳｉ比からＳｉＯ２の分子体積、Ｃ比から蛍光色素の分子体積に換算して蛍光シリカナノ粒子中に含まれる蛍光色素の合計体積（％）を算出した。このとき、ＳｉＯ２と蛍光色素の密度はそれぞれ２．２ｇ／ｃｍ３、１．２ｇ／ｃｍ３とした。
　〈Ｓｉの定量〉
　各蛍光シリカナノ粒子に硫酸を加えて灰化させた後、４ホウ酸リチウムを加えてビードを作成した。波長分差型蛍光Ｘ線分析装置（株式会社リガク製　ＺＳＸ　ＰｒｉｍｕｓＩＶ）で検量線法にてＳｉの定量を実施した。
　〈Ｃの定量〉
　各蛍光シリカナノ粒子を錫箔で包み、ＣＨＮ元素分析装置（エレメンター社製　ｖａｒｉｏ　ＥＬ　ｃｕｂｅ）でＣの定量を実施した。
　測定結果を下記の表１に示す。
　（発光量子収率）
　発光量子収率は、絶対ＰＬ量子収率測定装置（浜松ホトニクス社製、Quantaurus-QY C11347-01）を用いて、励起波長５６７ｎｍで吸光度（ａｂｓ.）が０．２～０．４となるように蛍光ナノ粒子をエタノールに分散させて測定した。測定結果を下記の表１に示す。
　（平均粒子径および変動係数（ＣＶ値））
　上記のようにして得た各シリカナノ粒子の平均粒子径は、走査電子顕微鏡（日立ハイテクノロジーズ社製、Ｓ－４８００）で撮影した画像に写っている各粒子（１００個以上）の直径を画像解析ソフト（旭化成エンジニアリング社製、Ａ像くん）を用いて測定し、その平均値として算出した。測定した直径から変動係数も算出した。測定結果を下記の表１に示す。
　（輝度）
　上記のようにして得た各蛍光シリカナノ粒子の輝度は、分光蛍光光度計Ｆ－７０００（日立ハイテクサイエンス社製）を用いて、蛍光ナノ粒子分散液の固形分濃度が０．０２８ｍｇ／ｍｌとなるようにエタノールで希釈し、ホトマル電圧４００Ｖに設定し、５６７ｎｍの励起光における６１０ｎｍの蛍光強度を測定することで行った。測定結果を下記の表１に示す。
　（Ｃ／Ｓｉ）
　蛍光シリカナノ粒子の表面における炭素とケイ素の原子比であるＣ／Ｓｉは、Ｘ線光電子分光法（アルバック・ファイ社製、Quantera SXM）を用いて、蛍光ナノ粒子分散液の固形分濃度が０．０２８ｍｇ／ｍｌとなるようにエタノールで調整し、予めエタノールでふき取ったアルミ箔裏面に８μｌ滴下させ自然乾燥した膜を観察した。測定結果を下記の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例１～７と比較例１、２とを比べると、実施例１～７では蛍光色素が入っている溶液にＴＥＯＳを連続添加したのに対し、比較例１、２では分割添加した。これにより実施例１～７では発光量子収率がいずれも１０％以上と高かったのに対して比較例１、２では５％、４％と低かった。また、実施例１～７ではＣ／Ｓｉが２～１０の範囲内であるのに対して比較例１、２では１２と高かった。
　これは実施例１～７では、より加水分解して重縮合しにくい蛍光色素が入っている溶液中に、より加水分解して重縮合しやすいＴＥＯＳが連続添加され、蛍光色素とＴＥＯＳとがより多く結合し、蛍光色素同士が結合して近接することが妨げられたためと考えられる。これにより実施例１～７の蛍光シリカナノ粒子では蛍光色素が高濃度に内包されつつも濃度消光が抑制され発光量子収率が高いと考えられる。一方、比較例１、２ではＴＥＯＳを分割添加したため、蛍光色素とＴＥＯＳとの結合がより少なく、蛍光色素同士がより多く結合し、濃度消光が起こり発光量子収率が低くなったと考えられる。
　実施例１～７と比較例３とを比べると、実施例１～７ではＴＥＯＳの添加時間を５秒～７０時間にしたのに対し、比較例３では２００時間とした。これにより実施例１～７では色素内包量がいずれも１０体積％以上と高かったことに対し、比較例３では２と低かった。これは実施例１～７ではより加水分解して重縮合しにくい蛍光色素が入っている溶液中に、より加水分解して重縮合しやすいＴＥＯＳが連続添加され、蛍光色素とＴＥＯＳとがより多く結合したのに対し、比較例３ではＴＥＯＳの添加時間が長すぎるため蛍光色素同士の結合が増え、ＴＥＯＳとの結合が不足したためであると考えられる。
　実施例１～７と比較例４とを比べると、比較例４では蛍光色素／ＴＥＯＳのモル比が４０と高い。これにより比較例４では蛍光色素の量が多すぎて粒子を形成することができなかった。
　実施例１、５、６、７のそれぞれを比べると、いずれも蛍光色素／ＴＥＯＳの１０であるが、実施例５、６、７、１の順にＴＥＯＳの連続添加時間が短くなっている。これによりこの順に、蛍光ナノ粒子の粒径がより小さくなり、変動係数（ＣＶ値）がより低くなった。
　本出願は、２０２０年２月３日出願の特願２０２０－０１６１４５に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
　本実施の形態に係る蛍光シリカナノ粒子は、高輝度であるため蛍光イメージングなどに有用である。

Claims (7)

  1. 　シリカナノ粒子と、
    　前記シリカナノ粒子に内包された蛍光色素と、
    　を含む蛍光シリカナノ粒子であって、
    　前記蛍光色素の合計体積は、前記蛍光シリカナノ粒子の全体積に対して５％以上であり、
    　前記蛍光シリカナノ粒子の発光量子収率は１０％以上である、
    　蛍光シリカナノ粒子。
  2. 　Ｘ線光電子分光法により測定される前記蛍光シリカナノ粒子の表面におけるケイ素に対する炭素の原子数の比（Ｃ／Ｓｉ）が２～１０である、請求項１に記載の蛍光シリカナノ粒子。
  3. 　前記蛍光シリカナノ粒子の粒子径の変動係数が２０％以下である、請求項１または２に記載の蛍光シリカナノ粒子。
  4. 　前記蛍光シリカナノ粒子の平均粒子径が５～２５０ｎｍである、請求項１～３のいずれか一項に記載の蛍光シリカナノ粒子。
  5. 　請求項１に記載の蛍光シリカナノ粒子の製造方法であって、
    　蛍光色素、アンモニアおよび水を含有する液体に、アルコキシシランに対する蛍光色素のモル比が１～３０の範囲内となるようにアルコキシシランを連続添加する工程を含む、
    　蛍光シリカナノ粒子の製造方法。
  6. 　前記アルコキシシランの連続添加時間が７２時間以下である、請求項５に記載の蛍光シリカナノ粒子の製造方法。
  7. 　前記アルコキシシランの連続添加時間が１時間以下である、請求項５に記載の蛍光シリカナノ粒子の製造方法。
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