KR20020028799A - 당단백질 측정을 위한 면역학적 분석법 및 장치 - Google Patents

당단백질 측정을 위한 면역학적 분석법 및 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표시용 담체 현탁액 및 상기 표시용 담체 표면에 고정화된 항원 또는 항체를 포함하는 당단백질 측정용 시약; 및 기저부 플레이트 및 전기 기저부 플레이트 위에 위치한 구성부분(시료를 넣는 물 흡수 패드, 다공성 섬유막, 표시용 담체 섬유 블록 및 적어도 하나 이상의 고정화 물질로 구성된)을 포함하는 시험용 스트립(strip)을 포함하여, 증가된 당쇄화 최종산물(AGE, advanced glycosylation end product)과 같은 당단백질의 측정을 위한 면역학적 분석법, 시약 및 장치를 제공한다. 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체의 면역반응은 응집현상 또는 수반되는 흡광도 혹은 색깔의 변화에 기초하여 측정될 수 있으며, 따라서, 의사가 합병증의 발생 및 진행을 막도록 당뇨병 환자의 AGE 존재유무를 알 수 있다.

Description

당단백질 측정을 위한 면역학적 분석법 및 장치{Immunological analytical method and device for the determination of glycosylated protein}
본 발명은 응집현상 또는 수반되는 흡광도 혹은 색깔의 변화에 의해, 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체의 면역반응을 측정하는 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체 측정용 면역학적 분석법, 시약 및 장치를 제공한다.
오늘날, 당뇨병의 병리학적 발생기전은 자세하게 알려져 있다. 예를 들어, 고혈당증 상황에서는, 단백질(예를 들어, 알부민)이 당쇄화되어 당단백질(예를 들어, 증가된 당쇄화 최종산물, Advanced Glycosylated End Products(AGEs))로 되고, 이것은 특히 당뇨병 환자의 비정상적인 세포파괴를 유발하는 것이 알려져 있다. 더 나아가서, 당뇨병 환자의 혈당 수준을 약물로서 효과적으로 제어할 수 있는 반면, 초기 예측을 통한 합병증의 효과적인 제어는 아직도 불가능하다. 따라서, 의사가 초기 단계에서 환자의 합병증 발생을 막거나, 합병증의 진행을 차단할 수 있도록, 당뇨병 환자의 AGE 존재 유무를 결정하는 접근법 및 물질 개발에 많은 노력이 행해졌다. 당뇨병의 AGE를 결정하는 특정 접근법 및 시약 가운데서, 가장 특이적이고 민감한 것은 면역학적 분석기술에 의한 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체, 예를 들어 AGE, 를 측정하는 방법을 포함한다. 그러나, 현재로서는, 이용할 만한 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체를 측정할 수 있는 면역학적 분석 기술이 없다.
상기 관점에서 본 출원의 발명자들은 맹렬하게 연구해 왔으며 마침내, 응집현상 또는 수반되는 흡광도 혹은 색깔의 변화에 의해, 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체의 면역반응을 측정하는 것을 포함하는 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체 측정용 면역학적 분석 기술 또는 장치를 개발하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 면역학적 분석 기술에 의해 응집현상 또는 수반되는 흡광도 혹은 색깔의 변화에 기초하여, 시료내에 당단백질 항원 또는 항체의 존재유무를 측정하는 방법을 포함하는, 당단백질 항체(항원)로 당단백질 항원(항체)을 측정하는 면역학적 분석 기술을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항-당단백질 항체 및 당단백질 항원(예를 들어, AGE 항원) 사이의 면역학적 복합체 형성에 기인한 응집현상에 기초하여, 시료내에 당단백질 항원 또는 항체의 존재유무를 측정할 수 있는, 당단백질 항체(항원)로 당단백질 항원(항체)을 측정하는 면역학적 분석 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항-당단백질 항체 및 당단백질 항원(예를 들어, AGE 항원) 사이의 면역학적 복합체 형성에 기인한 흡광도 변화에 기초하여, 시료내에 당단백질 항원 또는 항체의 존재유무를 측정할 수 있는, 당단백질 항체(항원)로 당단백질 항원(항체)을 측정하는 면역학적 분석 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 기저부 플레이트 위에서 기준선에 대하여 항-당단백질 항체 및 당단백질 항원(예를 들어, AGE 항원) 사이의 면역학적 복합체 형성에 기인한 색깔 변화에 기초하여, 시료내에 당단백질 항원 또는 항체의 존재유무를 측정할 수 있는, 당단백질 항체(항원)로 당단백질 항원(항체)을 측정하는 면역학적 분석 시험용 스트립(strip)을 제공하는 것이다.
본 발명의 측면, 목적 및 장점은 하기 기술된 바를 정독함으로써 명백해 질 것이다.
도 1은 본 발명의 면역학적 크로마토그래피 시험용 스트립의 3차원적 구조도이다.
도 2는 도 1에 개시된 면역학적 크로마토그래피 시험용 스트립을 수용하는데 사용되는 방수 박스(box)장치의 3차원적 윤곽도이다.
도 3은 본 발명에 의한 시험용 스트립을 수용하는, 도 2에 개시된 방수 박스 장치의 전체 분해도이다.
기호설명:
10 시험용 스트립(test strip)
11 물 흡수 패드(pad)
12 표시용 담체 섬유 블록(displaying carrier fiber block)
13 다공성 섬유막(porous fiber membrane)
14 판독 영역(reading zone)
15 기준 영역(reference zone)
16 흡수 패드
17 기저부 플레이트(base plate)
18 시험용 스트립 10의 전방부
19 시험용 스트립 10의 후방부
20 방수용 박스 장치
21 시료 주입구
22 판독영역의 주입구
상기 기술되었듯이, 본 발명은 몇 개의 면역학적 분석 기술에 의해 시료내에 AGE같은 당단백질의 존재유무를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 사용된 항체는 정제된 항원(예를 들어, AGE 항원)으로 토끼나 염소에서 면역학적으로 얻은 것이거나 쥐에 감작시켜 하이브리도마(hybridoma)로서 얻은 것들(예를 들어, 단일 항체)이다.
면역학적 분석 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 후지카와 등(참조: Fujikawa H., and Igarashi, H., Appl. Envir. Microbiol., 54/10, 2345-2348, 1998)은 스태필로코커스(Staphylococcus)의 A~E 장관독소(enterotoxin)를 검출하기 위해 고밀도 라텍스(latex) 입자로부터 형성된 유상액(emulsion) 응집시약을 개시하였다. 드랑 등(참조: Delanghe, J. R., Chapele, J. P., and Vanderschueren, S. C., Clin. Chem., 36/9, 1675-1678, 1990)은 미오글로빈(myoglobin)을 검출하기 위한 비색분석법(colorimetric method)을 제안하였다. WO 88/08534에는 HCG 및 LH를 검출하기 위한 매개체로서 면역학적 크로마토그래피 막을 포함하는 면역학적 분석 장치가 개시되어 있다. 미합중국특허 제 5,236,652호에는 비단백질 항원을 검출하기 위한 면역학적 크로마토그래피 기술이 개시되어 있다.
상기 언급된 기술 중의 어느 것도 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체를 검출하는 면역학적 분석 기술이나 장치에 대한 암시를 주지 않는다.
본 발명의 한 측면은 하기사항을 포함하는 면역학적 응집(agglutination) 기술에 기초하여, 시료내에 당단백질 항원 또는 항체의 존재유무(예를 들어, AGE)를 측정하는 방법을 포함하는, 당단백질 항체(항원)로 당단백질 항원(항체)을 측정하는 면역학적 분석 시약을 제공하는 것이다:
표시용 담체 유상액(displaying carrier emulsion) 및 전기 표시용 담체의 표면에 고정화된 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체는; 전기 유상액 시약을 시험하고자 하는 시료에 노출시킨 후, 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체의 존재유무를 수반되는 응집현상에 기초하여 결정할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 하나 또는 그 이상의 당단백질 항체가 유상액 내의 전기 표시용 담체 위에 고정화되고, 담체의 빈 공간을 완전히 채우기 위해 블로킹 단백질(blocking protein)이 사용된다. 주어진 양의 당단백질 항원(예를 들어, AGE 항원)을 포함하는 시료를 하나 또는 그 이상의 고정화된 항체를 포함하는 표시용 담체 유상액과 섞어서 반응 플레이트에서 반응시켰을때,"표시용담체-항체(displaying carrier-antibody)", "다중항체-AGE-항체(multiple antibodies-AGEs-antibody)" 또는 "다중항체-표시용담체....등등(multiple antibodies-displaying carrier...etc)"로서 면역학적 복합체(complex)가 형성된다. 전기 반응들은 3 내지 5분 내에 양성반응으로서 보이는 응집현상으로 나타난다. 반면, 시료내에 AGE항원이 없다면, 하나 또는 그 이상의 고정화된 항체를 포함하는 표시용 담체 유상액과 섞은 후, 어떠한 응집반응도 나타나지 않으며, 이것은 음성반응으로서 간주된다.
본 발명에 사용된 표시용 담체는 0.01-60μm의 입자크기를 갖는 미세한 착색입자이다. 전기 입자는 라텍스 미립자(latex micro-particle), 염색물질 미립자(dye micro-particle), 리포조옴(liposome), 콜로이드 금 입자(colloidal gold particle), 탄소 미립자(carbon black micro-particle) 등이다.
여기 사용된 "항체(antibody)"라는 용어는 상기-언급된 하나 또는 그 이상의 항-당단백질 항체를 언급한다. 하나 또는 다양한 구조를 갖는 당단백질 항원을 고정화시켜서 시료내에 당단백질 항원에 대한 항체의 존재유무를 측정하는데 사용될 수 있다; 만약, 응집현상이 없으면, 음성반응이고 응집현상이 있으면 양성반응을 의미한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 하기사항을 포함하는 면역학적 비탁분석(turbidimetric technique) 기술에 기초하여, 시료내에 당단백질 항원 또는 항체의 존재유무(예를 들어, AGE 항원 또는 그것의 항체)를 측정하는 방법을 포함하는, 당단백질 항체(항원)로 당단백질 항원(항체)을 측정하는 면역학적 분석 시약을제공한다:
상기 언급된 당단백질 항원 또는 항체를 윗표면에 고정화시킨 표시용 담체 현탁액(displaying carrier suspension); 및 흡광도 측정 장치; 전기 시약을 시험하고자 하는 시료에 노출시킨 후, 당단백질 항원 또는 항체의 존재유무는 수반되는 흡광도의 변화에 기초하여 측정될 수 있다.
하나의 구체적인 실시태양에서, 하나 또는 그 이상의 당단백질 항체가 유상액내의 전기 표시용 담체 위에 고정화되고, 담체의 빈 공간을 완전히 채우기 위해 블로킹 단백질(blocking protein)이 사용된다. 음성 기준 혈청(negative serum standard), 약한 양성 기준혈청 및 미지의 시험용 시료를 각각 준비한다. 3개의 비색분석 튜브 A1, A2 및 A3에 하나 또는 그 이상의 고정화된 항체를 포함하는 표시용 담체 유상액 250μl를 각각 넣는다. 그 다음 비색분석 튜브 A1에 음성기준혈청 20μl를 넣는다; 비색분석 튜브 A2에 약한 양성기준혈청 20μl를 넣는다; 비색분석 튜브 A3에 미지의 시험용 시료 20μl를 넣는다. 각각 넣은 즉시, 340nm에서 혼탁도(turbidity) 또는 흡광도를 측정하여 각각의 OD(optical density)값을 기록한다. 시료를 넣은 후 240초 후에, 각각의 OD값을 다시 기록한다. 두 번째 OD값으로부터 첫번째 OD 값을 뺀 차이가 면역학적 반응의 OD값이다. 이렇게 얻은 3개의 OD값 차이를 비교하여 미지 시료의 OD값 차이가 약한 양성 기준혈청의 값보다 클 때, 양성 반응으로 간주될 수 있다. 반면, 미지 시료의 OD값 차이가 약한 양성 기준혈청의 값보다 작을 때, 음성 반응으로 간주될 수 있다. 더 나아가서, 일련의 기지농도의 표준용액을 제조함으로써, 예를 들어, 0, 1, 2, 4, 8, 16 units/ml, 시료내의 농도를 전기 표준용액을 사용하여 얻은 표준곡선으로부터 계산할 수 있다.
여기 사용된 표시용 담체는 미세한 입자 또는 효소이다. 전기 입자는 라텍스 미립자(latex micro-particle), 리포조옴(liposome), 폴리에틸렌 글리콜 미립자, NAD 미립자, 탄소 미립자(carbon micro-particle), 염색물질 미립자(dye micro-particle), 효소, NADH 미립자 등의 0.001-20μm의 입자크기 및 260nm 내지 840nm의 분광학적 범위를 갖는다.
여기 사용된 "항체(antibody)"라는 용어는 상기-언급된 하나 또는 그 이상의 항-당단백질 항체를 언급한다. 하나 또는 다양한 구조를 갖는 당단백질 항원을 고정화시켜서 시료내에 당단백질 항원에 대한 항체의 존재유무를 측정하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 같은 실험결과를 얻기 위하여 길항작용(competitive method)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 방법으로 수행할 때, 추가적으로, 기지 농도의 당단백질 항원 또는 항체를 각각의 시료와 함께 사용하고, 양성 표준용액 및 음성 표준용액은 각각 고정화된 항체 또는 항원을 가지는 표시용 담체 유상액과 반응시켜, 상기와 비슷한 결과를 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 면역학적 크로마토그래피 기술에 기초하여, 시료내에 당단백질 항원 또는 항체의 존재유무(예를 들어, AGE 항원 또는 그것의 항체)를 측정하는 방법을 포함하는, 당단백질 항체(항원)로 당단백질 항원(항체)을 측정하는 면역학적 분석 시험용 스트립(strip)을 제공한다.
도 1을 참조하여, 면역학적 크로마토그래피 시험용 스트립 (10)은 기저부 플레이트 (17)위에 붙은 다공성 섬유막 (13)을 포함한다. 시료를 넣는 물 흡수패드(pad) (11)은 시험용 스트립 (10)의 최전방부에 배치되며 다공성 섬유막 (13)과 겹친다. 표시용 담체 섬유 블록 (12)는 물 흡수 패드 (11)의 바로 밑에 그리고 다공성 섬유막 (13)의 위에 서로 겹치도록 위치한다. 표시용 담체 섬유 블록(12)는 파란색의 표시용 담체로 담지되어(impregnated) 있으며, 그 위에 항원 또는 항체를 가지고 있다.
예를 들어, 기저부 플레이트 위에서 항-당단백질 항체 및 당단백질 항원(예를 들어, AGE 항원) 사이의 면역학적 복합체 형성에 기인한 기준 라인(reference line)에 대하여 색깔이 변화한다. 판독 영역(reading zone) (14)는 점 또는 선일수 있으며, 그 위에 고정화된 항원 또는 항체를 가지며 다공성 섬유막 (13)의 한 섹션에 위치해 있다. 판독 영역 (14)의 전방부는 표시용 담체 섬유 블록 (12)와 접하며, 반면 판독 영역의 후방부로부터 적당한 거리에 기준영역(reference zone) (15)가 위치하고, 전기 기준영역 또한 점 또는 선일수 있으며, 그 위에 고정화된 항원 또는 항체를 가지며 다공성 섬유막 (13)의 한 섹션에 위치해 있다.
기준영역 15는 흡수 패드 (16)과 후방부에서 접한다. 상기 언급된 다공성 섬유막 (13)을 구성하는데 사용되는 물질은 나일론 섬유막, 셀룰로오스 니트레이트(cellulose nitrate) 필름, 폴리에스테르 섬유막, 셀룰로오스 섬유막 또는 합성 섬유막 (synthetic fiber membrane) 등이 있다.
도 2를 참조하여, 면역학적 시험용 스트립 (10)을 수용하는데 사용되는 방수용 박스 장치 (20)은 시료 주입구 (21) 및 반응 영역 (22)의 주입구로 구성되어 있다.
도 3은 시험용 스트립 (10)을 수용하는 방수용 박스 장치 (20)의 3차원적 그림이다. 여기서, 시료를 넣는 물 흡수 패드 (11)은 시료 주입구 (21)의 바로 밑에 위치해 있으며, 서로 접촉하고 있다. 시료 주입구 (21)의 면적은 물 흡수 패드 (11)의 면적보다 작아야 한다. 판독 영역 (14) 및 기준 영역 (15)는 반응 영역 (22)의 주입구 내에 위치해 있으나 그것들을 직접 보기 위해 서로 접촉하고 있지는 않는다. 흡수 패드 (16)은 박스 장치 (20)의 후방부에 위치한다. 상기 언급되었듯이, 표시용 담체 섬유막 (12) 위의 파란 색 표시용 담체는 그 위에 고정화된 항원 또는 항체를 가지므로, 표시용 담체 섬유막 (12) 위의 파란 색 표시용 담체를 시료와 접촉시키자 마자, 이 표시용 담체는 다공성 섬유막 (13) 및 흡수 패드 (16) 쪽 방향으로 시험용 스트립 (10) 위에서 자유롭게 이동할 것이다. 기저부 플레이트 (17)의 아래 쪽은 박스 장치 (20)의 안쪽 밑바닥과 연결되어 있으며 위쪽은 다공성 섬유막 (13)과 연결되어 있다. 다공성 섬유막 (13)에는 판독 영역 (14) 및 기준영역 (15)가 있으며, 블로킹 단백질로 빈공간을 채우고 있다.
액체 시료가 시료 주입구 (21)로 주입되었을때, 시험용 시료는 즉각 표시용 담체 섬유 블록 (12)의 파란 색 표시용 담체 내에 고정화된 항원 또는 항체와 반응하고 흡수 패드 (16) 쪽으로 파란색 표시용 담체와 함께 이동한다. 만약, 시료내에 AGE 항원과 같은 당단백질 항원이 존재하면, 그것은 즉각 파란 색 표시용 담체에 고정화된 하나 또는 그 이상의 항체와 반응하여 당단백질 항체의 모든 에피톱(epitope)을 점령할 것이다. 파란색 표시용 담체 위에 고정화된 당단백질 항체의 결합 부위는 시료내의 당단백질 항원과 결합하여 점령되기 때문에, 판독 영역 (14) 위에 고정화된 하나 또는 그 이상의 당단백질 항원과 결합하지 않을 것이고, 그 결과 모든 파란 색 표시용 담체는 판독 영역 (14)를 통과하여 이 영역에서 파란 색 선이 보이지 않게 된다. 파란색 표시용 담체는 기준 영역 (15)위에 고정화된 항체 또는 항원(예를 들어, 항-쥐 IgG 항체)과 결합하여 파란색 선을 나타낼 때까지 이동할 것이다. 따라서, 판독 영역 (14)의 파란 색 선은 양성 반응을 의미하며, 기준영역 (15)의 파란 색 선은 무시할 수 있는 양성반응 또는 음성반응을 의미한다. 반면, 시험용 시료에 목표 분석물질이 없다면, 당단백질에 대한 하나 또는 그 이상의 항체는 판독영역 (14)위에 고정화된 당단백질 항원(예를 들어, AGE 항원)과 반응하여 파란 색 선을 형성할 것이고, 반면, 파란색 표시용 담체의 일부는 기준영역 (15)와 결합할 것이다, 즉, 길항작용(competition reaction)이다. 따라서, 판독 영역의 파란 색은 음성 반응이다. 흡수 패드 (16)은 모세관 현상이 유지되도록 끝 쪽으로 이동하는 모든 액체를 흡수하기 위해 사용된다.
선택적으로, 상기 언급된 경우에서, 판독 영역 (14) 위의 고정화된 당단백질 항원을 하나 또는 그 이상의 항-당단백질 항체로 대체함으로써 샌드위치 법을 실행할 수 있다.
본 발명에 사용된 다공성 섬유막은 0.1-60μm의 구멍 크기를 갖는다. 여기 사용된 표시용 담체는 미세한 착색입자, 형광물질 또는 효소이다. 전기 입자는 0.01-20μm의 입자 크기를 가지며, 라텍스 미립자, 염색물질 미립자, 리포조옴, 콜로이드 금 미립자, 탄소 미립자(carbon black particle), 중합 미립자(polymeric microparticle) 등이다. 표시용 담체가 미세한 착색입자일 때는, 결과를 직접 읽을 수 있으며, 직접적인 표시용 담체로 간주된다. 표시용 담체가 효소일 때는 결과는 오직 발색시약으로 발색시킨 후 읽을 수 있으며, 이러한 표시용 담체를 간접적 표시용 담체로 간주한다.
본 발명의 기저부 플레이트는 방수성 플라스틱 플레이트 또는 방수용 종이이다. 본 발명의 시료를 넣는 물 흡수 패드 및 흡수 패드를 구축하는데 사용된 물질은 특별히 제한되지는 않으나, 매우 높은 물 흡수성을 가질수록 더욱 좋다. 표시용 담체 섬유 블록은 비수용성 섬유성 물질이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 당단백질 항체의 생산
당단백질 항체는 AGE 항원같은 정제된 항원을 토끼나 염소에 직접 감작시킴으로써 폴리클론 항체로 제조되거나, 생쥐를 감작시켜 하이브리도마(hybridoma)를 만들고 조작하여 모노클론 항체로 제조된다.
실시예 2: 당단백질 항원의 응집반응
약 0.8 μm의 입자크기를 가지는 폴리스티렌 비드(bead) 또는 다른 착색 미립자를 표시용 담체 미립자로서 사용하였고, 3%의 농도로 희석하였다. 실시예 1에서 얻은 AGE 항체를 2mg/ml의 농도로 인산 완충액에 희석하였다. 표시용 담체 현탁액 및 항체 용액 10ml을 각각 유리 튜브에 넣고 잘 섞어서 8시간동안 방치하였다. 그 후, 1g의 BSA(Bovine Serum Albumin)를 튜브에 첨가하여 잘 섞은 후 8시간 동안 방치하였다. 12000rpm에서 30분간 원심분리 후, 상등액을 버리고 한 번 더 반복하였다. 2% BSA 용액을 총 20ml이 되도록 첨가하였다. 혼합물을 소니케이션(sonication)하여 원하는 표시용 담체 현탁액이 되도록 균질한 현탁액으로 만들었다.
음성 기준혈청 3가지 용액을 각각 AGE 항원을 0, 1, 2unit/ml의 함량을 갖도록 제조하였다. 약한 양성 기준혈청을 5 unit/ml의 AGE 항원 함량을 갖도록 제조하였다. 강한 양성 기준혈청을 16 unit/ml의 AGE 항원 함량을 갖도록 제조하였다. 마지막으로, 미지의 시료를 제조하였다.
상기 제조된 각 혈청 용액 10μl를 시료를 넣은 시험장치에 각각 넣었다. 각각의 장치에 50μl의 표시용 담체 현탁액을 넣고 3 내지 5분 후에 결과를 판독하였다.
결과:
표시용 담체 현탁액의 응집
음성 기준혈청 0 unit/ml -
음성 기준혈청 1 unit/ml -
음성 기준혈청 2.5 unit/ml -
약한 양성 기준혈청 5 unit/ml +
강한 양성 기준혈청 16 unit/ml +
미지시료 +
응집반응은 AGE 항원 시험에 대해 양성반응을 의미하며, 비응집반응은 AGE항원 시험에 대해 음성반응을 의미한다. 최소양성반응 한도를 5unit/ml로 잡으면, 미지 시료의 양성 반응은 이 시료의 AGE항원 농도가 5unit/ml 이상인 것을 암시한다.
실시예 3: 당단백질의 면역학적 비탁분석
표시용 담체 미립자 0.2g을 1리터의 증류수에 첨가하여 현탁액을 제조하였다. 표시용 담체는 0.3μm의 입자 크기를 가지는 흰색 폴리스티렌 비드였다. 선택적으로, 다른 파장에서 색깔을 나타내는 미립자도 사용될 수 있다. 이 현탁액에 30mg의 항-AGE 항체를 첨가하여 잘 혼합하고 18시간동안 방치하였다. 그 다음, 4g의 BSA를 넣고 잘 혼합한 후 18시간동안 방치하였다. 혼합물을 12000rpm에서 30분동안 원심분리하고 상등액을 버렸다. 이 과정을 3번 반복하였다. 2% BSA 용액을 총 1리터가 되도록 첨가하였다. 혼합믈을 원하는 표시용 담체 현탁액이 되도록 소니케이션 하여 균질하게 만들었다.
각각 0,1,2,4,8,16 unit/ml의 AGE 항원 함량을 가지는 6개의 표준 혈청용액을 제조하였다. 미지 시료를 제조하였다.
250μl의 표시용 담체 현탁액을 각각의 비색(colorimetric) 튜브에 넣었다. 상기 제조된 20μl의 표준혈청용액을 각각의 비색 튜브에 첨가하였다. 20μl의 미지시료를 또 다른 비색 튜브에 첨가하였다.
비색계를 340nm 파장에서 영점 조정하였다. 각각의 표준혈청 용액 및 미지시료 20μl를 첨가하였을 때, 각각의 비색 튜브의 OD값을 측정하였으며, 그 후 240 초후에 다시 한 번 측정하였다. 두 번째 OD 값에서 첫 번째 OD 값을 뺀 OD 값의 차이를 계산하였다.
양성 반응을 5unit/ml 이상으로 제한되도록 정하고, 각각의 표준혈청용액으로부터 얻은 반응 OD값을 표준곡선으로 그렸다. 시료의 AGE 항원 농도는 전기 표준곡선으로부터 계산할 수 있으며 결과는 9unit/ml, 양성반응이었다.
결과:
0초에서의 OD값 240초에서의 OD값 반응 OD 값 unit
표준혈청 A 0.86 0.85 0.01 0
표준혈청 B 0.92 0.87 0.05 1
표준혈청 C 0.98 0.82 0.16 2
표준혈청 D 1.02 0.83 0.19 4
표준혈청 E 0.94 0.69 0.25 8
표준혈청 F 0.99 0.69 0.3 16
미지시료 G 1.07 0.81 0.26 9
본 실시예에 의하면, 0 unit/ml의 농도를 가지는 음성 혈청용액 및 5unit/ml의 농도를 가지는 양성혈청용액을 정성적 분석을 수행하는데 사용할 수 있다. 미지 시료의 반응 OD값이 양성혈청용액 5unit/ml의 반응 OD값보다 더 높을 때, 양성반응이라고 간주한다. 그렇지 않으면, 음성반응으로 간주한다.
실시예 4: 면역학적 시험용 스트립을 이용한 당단백질 분석
약 0.3 μm의 입자크기를 가지는 폴리스티렌 비드(bead) 또는 다른 착색 미립자를 표시용 담체 미립자로서 사용한 3% 파란 색 표시용 담체 미립자 현탁액을 제조하였다. AGE 항체를 2mg/ml의 농도로 인산 완충액에 희석하였다. 표시용 담체 현탁액 및 항체 용액 10ml을 각각 유리 튜브에 넣고 잘 섞어서 8시간동안 방치하였다. 그 후, 1g의 BSA(Bovine Serum Albumin)를 튜브에 첨가하여 잘 섞은 후 8시간 동안 방치하였다. 12000rpm에서 30분간 원심분리 후, 상등액을 버리고 두 번 더 반복하였다. 2% BSA, 10% 수크로오스 용액을 총 20ml이 되도록 첨가하였다. 혼합물을 소니케이션(sonication)하여 원하는 표시용 담체 현탁액이 되도록 균질한 현탁액으로 만들었다.
0.4 x 4.5cm 크기의 표시용 담체 섬유 블록을 상기 제조된 10% 수크로오스를 포함하는 표시용 담체 현탁액으로 담지(impregnated)하고, 제거하고 실온에서 건조시켰다. 건조 후, 전기 표시용 담체 섬유 블록을 2시간 동안 동결건조기에서 건조시키고 방습제를 포함한 밀봉 백에 넣어서 4℃에서 보관하였다.
표시용 담체 현탁액의 미리 결정된 양을 물 흡수 패드 또는 다공성 섬유막의 전방부 위에 첨가하였다; 그러나, 후자의 경우는 대량 생산을 위해 바람직하지 않다.
15 x 4.5cm 크기의 셀룰로오스 니트레이트 필름 조각의 1.8cm 부분의 밴드에 항-AGE 항체를 스프레이 식으로 코팅하고 고정화시키고, 판독 영역(reading zone)이라고 명명하였다. 그 다음, 항-토끼 IgG 항체를 포함하는 용액을 3.4cm 밴드에 스프레이 식으로 코팅하고 고정화시키고 기준 라인(reference line)이라고 명명하였다. 그 후, 셀룰로오스 니트레이트 필름을 적어도 2시간 동안 5% BSA를 포함하는 인산 완충액으로 담지하였다. 셀룰로오스 니트레이트 필름을 제거하여, 깨끗한 물로 세척하고 실온에서 건조시켰다. 그 후, 2cm 위치로부터 시작해서 필름을 플라스틱 기저부 플레이트에 붙이고 완전히 플레이트를 덮었다. 이렇게 처리된 필름을 2시간동안 동결건조하고 방습제를 포함한 밀봉백에 넣어서 4℃에서 보관하였다.
15 x 3cm 크기의 물 흡수 패드를 제조하였다. 물흡수 패드를 제조하기 위한 재료는 특별히 제한되지는 않으나, 더 높은 물 흡수성을 가질수록 더 좋다. 그리고 치수는 다양하게 변한다.
담체 섬유 블록을 그것이 셀룰로오스 니트레이트 필름과 겹치도록 다공성 섬유막 전방부 및 기저부 플레이트 사이에 끼웠다. 그 다음, 시료를 넣는 흡수 패드를 그것이 담체 섬유 블록과 겹치도록 담체 섬유 블록 및 기저부 플레이트 위에 붙였다. 마지막으로, 흡수 패드를 다공성 섬유막의 후방부 및 기저부 플레이트 끝 위쪽으로 붙였다. 적어도, 흡수 패드의 부분은 섬유막과 겹치도록 하였다. 0.5cm의 폭을 가지는 시험용 스트립을 잘라내어 최종 산물로 하였다.
최종 시험용 스트립을 방수용 박스 장치의 시료 주입구가 시료를 넣는 물흡수 패드 바로 위에 위치하여 서로 접촉하도록 방수용 박스 장치에 장착하였다. 시료 주입구의 면적은 시료를 넣는 물흡수 패드의 면적보다 넓으면 안 된다. 시험용 스트립의 판독 영역 및 기준 영역은 박스 장치의 반응 영역내에 보이는 위치에 있어야 한다.
시료를 넣는 물흡수 패드는 판독 영역 앞에 위치한다. 표시용 담체 섬유 블록은 셀룰로오스 니트레이트 및 시료를 위한 물흡수 패드와 서로 겹친다. 기준 라인은 판독영역의 뒤이며, 물흡수 패드는 기준 라인의 뒤이다. 시료를 첨가하고 5분 후에, 결과는 반응 영역을 통해 육안으로 직접적으로 판독된다.
150μl의 음성혈청시료를 시료 주입구에 주입하고 파란 색 표시용 담체가 반응 라인(판독 영역 및 기준 라인) 쪽으로 모세관 현상에 의해 이동하여 마지막으로 물흡수 패드에 도달하였다. 음성 시료는 AGE 항원을 포함하지 않았기 때문에, 파란 색 표시용 담체에 고정화된 항-AGE 항체는 판독영역에 고정화된 항-AGE 항체와 결합하지 않아서 푸른 색 선이 형성되지 않았다. 파란 색 표시용 담체는 기준 라인에 고정화된 항-토끼 IgG 항체와 결합하여 파란 색 선을 형성하였고, 이것은 음성 반응임을 의마하였다. 흡수 패드는 모세관 현상이 계속 일어나도록 거기까지 이동한 모든 액체를 흡수한다.
150μl의 양성혈청시료를 시료 주입구에 주입하였을 때, 파란 색 표시용 담체에 고정화된 항-AGE 항체는 파란색 표시용 담체가 판독 영역에 도달하기 전에 혈청 시료내의 AGE 항원과 결합할 것이다. 파란 색 표시용 담체가 판독 영역에 도달하였을 때, 판독 영역에 고정화된 항-AGE 항체는 다시 AGE 항원과 결합하여 푸른 색 선을 형성하였다. 남은 파란 색 표시용 담체는 판독 영역을 통과하여 기준 라인 위에 결합하여 샌드위치 양성 반응임을 나타내었다.
선택적으로, 최종 시험용 스트립의 전방부를 일정시간동안 시료와 접촉시킴으로써, 상기 기술된 것과 비슷한 실험결과를 얻을 수 있다.
상기 기술된 것처럼, 샌드위치 방법 외에도, 상기 실험은 길항작용에 의해 수행될 수 있다. 실시예 4에 의하면, 길항작용은 판독 영역에 고정화된 물질, 예를 들어 AGE 단백질 항원을 대체함으로써 달성될 수 있다.
결론적으로, 본 발명에 의한 시약 및 방법으로 시험함으로써, 의사가 초기 단계에서 합병증의 발생 및 진행을 막도록 당뇨병 환자의 AGE 존재유무를 알 수 있다.

Claims (47)

  1. 하기 (1), (2)를 포함하는 당단백질 측정용 시약:
    (1) 표시용 담체 현탁액; 및
    (2) 전기 표시용 담체 현탁액에 고정화된 친화성 물질;
    여기서, 시료를 전기 시약에 노출시킨 후, 전기 시료 내의 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체의 존재유무는 응집(agglutination) 현상의 발생 유무에 기초하여 측정된다.
  2. 제 1항에 있어서,
    전기 표시용 담체는 착색된 미립자(micro-particle)인 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  3. 제 1항에 있어서,
    전기 표시용 담체는 0.01 내지 60μm 범위의 입자크기를 갖는 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  4. 제 1항에 있어서,
    당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체를 측정하는데 유용한 당단백질 측정용 시약.
  5. 제 1항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 당단백질 항원인 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  6. 제 1항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 다양한 구조를 가지는 당단백질 항원인 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  7. 제 1항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 항-당단백질 항체인 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  8. 제 1항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 다중(multiple) 항-당단백질 항체인 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  9. 제 1항에 있어서,
    길항작용(competitive method)을 통하여 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체를 측정하는 당단백질 측정용 시약.
  10. 제 1항에 있어서,
    샌드위치 법을 통하여 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체를 측정하는 당단백질 측정용 시약.
  11. 하기 (1), (2)를 포함하는 당단백질 측정용 시약:
    (1) 표시용 담체 현탁액; 및
    (2) 전기 표시용 담체 현탁액에 고정화된 친화성 물질;
    여기서, 시료를 전기 시약에 노출시키고 흡광도를 측정한 후, 전기 시료 내의 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체의 존재유무는 흡광도의 변화 유무에 기초하여 측정된다.
  12. 제 11항에 있어서,
    전기 표시용 담체는 착색된 미립자(micro-particle) 또는 효소인 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  13. 제 11항에 있어서,
    전기 미립자는 라텍스(latex) 미립자, 리포조옴, 염색물질(dye) 미립자, 폴리에틸렌글리콜 미립자, NADH 미립자, NAD 미립자, 중합(polymeric) 미립자 및 탄소 미립자로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  14. 제 11항에 있어서,
    전기 표시용 담체의 흡광도는 260 내지 840nm 범위의 파장에서 측정되는 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  15. 제 11항에 있어서,
    전기 표시용 담체는 0.001 내지 20μm 범위의 입자크기를 갖는 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  16. 제 11항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 당단백질 항원인 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  17. 제 11항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 다양한 구조를 가지는 당단백질 항원인 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  18. 제 11항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 항-당단백질 항체인 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  19. 제 11항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 다중(multiple) 항-당단백질 항체인 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  20. 제 11항에 있어서,
    당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체를 측정하는데 유용한 당단백질 측정용 시약.
  21. 제 20항에 있어서,
    전기 측정 방법은 길항작용(competitive method)을 통하여 수행되는 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  22. 제 11항에 있어서,
    전기 측정 방법은 샌드위치법을 통하여 수행되는 것을 특징으로 하는 당단백질 측정용 시약.
  23. 하기 (1), (2)를 포함하는 시험용 스트립을 포함하는 당단백질 측정용 면역학적 크로마토그래피 분석 장치:
    (1) 기저부 플레이트; 및
    (2) 전기 기저부 플레이트 위에 위치하는 구성 부분;
    (여기서, 전기 구성부분은 하기 (a), (b), (c), (d)를 포함한다:
    (a) 후방부(rear end)가 다공성 섬유막의 전방부(front end)와 위-아래로 연결되고, 전기 시험용 스트립의 전방부에 위치하는 물-흡수 패드(pad);
    (b) 기저부 플레이트 위에 위치하고, 표시용 담체 섬유 블록(block) 뒤에 위치하여 그 위에서 판독 영역을 가지는 다공성 섬유막;
    (c) 시료를 넣는 물-흡수 패드의 후방부 및 전기 다공성 섬유막의 전방부 사이에 위치하고, 전기 두 부분과 겹치며, 고정화된 표시용 담체가 위에 장착되어 있는 표시용 담체 섬유 블록; 및
    (d) 전기 다공성 섬유막의 판독 영역 안에 배치된 적어도 하나 이상의 고정화 물질;)
    여기서, 상기 언급된 부분이 구축된 시험용 스트립을 가지고, 일정시간동안 물흡수 패드 위로 시험용 시료를 첨가한 후, 전기 시험용 시료 내의 당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체의 존재유무는 판독 영역 위에서 반응 색깔 발생 유무에 기초하여 측정된다.
  24. 제 23항에 있어서,
    전기 다공성 섬유막의 물질은 나일론 섬유막, 셀룰로오스 니트레이트(cellulose nitrate) 필름, 폴리에스테르 섬유막, 셀룰로오스 섬유막 또는 중합체 섬유막(polymeric fiber membrane)인 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  25. 제 23항에 있어서,
    전기 다공성 섬유막의 구멍 크기는 0.1 내지 60μm 범위에 있는 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  26. 제 23항에 있어서,
    전기 표시용 담체는 착색된 미립자, 효소 또는 형광물질인 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  27. 제 23항에 있어서,
    전기 미립자는 라텍스 미립자, 염색물질 미립자, 금 유상액(emulsion) 미립자, 탄소 미립자(carbon black micro-particle), 금속 미립자, 리포조옴, 중합 미립자로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  28. 제 23항에 있어서,
    전기 표시용 담체는 0.01 내지 20μm 범위의 입자크기를 갖는 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  29. 제 23항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 하나의 구조를 가지는 당단백질 항원인 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  30. 제 23항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 다양한 구조를 가지는 당단백질 항원인 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  31. 제 23항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 항-당단백질 항체인 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  32. 제 23항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 다중(multiple) 항-당단백질 항체인 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  33. 제 23항에 있어서,
    전기 고정화 물질은 하나의 구조를 가지는 당단백질 항원인 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  34. 제 23항에 있어서,
    전기 고정화 물질은 다양한 구조를 가지는 당단백질 항원인 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  35. 제 23항에 있어서,
    전기 고정화 물질은 항-당단백질 항체인 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  36. 제 23항에 있어서,
    전기 고정화 물질은 다중(multiple) 항-당단백질 항체인 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  37. 제 23항에 있어서,
    당단백질 항원 또는 항-당단백질 항체를 측정하는데 유용한 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  38. 제 23항에 있어서,
    전기 표시용 담체는 직접적 표시용 담체인 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  39. 제 23항에 있어서,
    전기 표시용 담체는 간접적 표시용 담체인 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  40. 제 23항에 있어서,
    고정화된 항원 또는 항체를 가지고, 전기 다공성 섬유막의 판독영역으로부터 적당한 거리에 위치한 기준 영역(reference zone)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  41. 제 23항에 있어서,
    광학적 방법을 통하여 결과를 측정하거나 정량적으로 분석하는데 유용한 면역학적 크로마토그래피 분석 장치.
  42. 하기 각 단계를 포함하는 당단백질 측정방법:
    (1) 위에 친화성 물질이 고정화되어 있는 표시용 담체를 포함하는 현탁액을 사용하는 단계;
    (2) 전기 현탁액과 시험용 시료를 섞는 단계; 및
    (3) 당단백질 또는 항체의 존재유무를 전기 현탁액 내의 응집현상 발생에 기초하여 결정하는 단계.
  43. 제 42항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 항-당단백질 항체인 것을 특징으로 하는 당단백질 측정방법.
  44. 제 42항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 당단백질 항원인 것을 특징으로 하는 당단백질 측정방법.
  45. 하기 각 단계를 포함하는 당단백질 측정방법:
    (1) 위에 친화성 물질이 고정화되어 있는 표시용 담체를 포함하는 현탁액을 사용하는 단계;
    (2) 서로 다른 비색분석(colorimetric) 튜브에 각각 양성 표준용액(standard solution), 음성 표준용액 및 시험용 시료를 전기 표시용 담체 현탁액의 적당한 양과 섞는 단계;
    (3) 각각의 흡광도 변화를 적당한 흡광도 측정장치에서 측정하는 단계; 및
    (4) 비탁분석법(turbidimetric method)을 통해 결과를 결정하는 단계.
  46. 제 45항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 항-당단백질 항체인 것을 특징으로 하는 당단백질 측정방법.
  47. 제 45항에 있어서,
    전기 친화성 물질은 당단백질 항원인 것을 특징으로 하는 당단백질 측정방법.
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