CN110988356A - C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种C‑反应蛋白快速定量免疫层析试纸及其制备方法，该定量检测CRP胶体金免疫层析方法是利用羧基化胶体金与特异性抗体共价结合的标记技术及免疫层析技术，层析膜位置同时设置三条检测线及一条质控线，通过对四条检测线显色情况进行计算，实现对检测样本中CRP的精准定量。

Description

C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸及其制备方法
技术领域
本发明涉及检测技术领域，涉及C-反应蛋白(CRP)快速定量免疫层析试纸及其制备方法，以及更具体地涉及一种定量检测C-反应蛋白的胶体金免疫层析方法及其检测试纸。
背景技术
C-反应蛋白(C-reactive protein CRP)是一种典型的急性时相蛋白，因最早发现其和肺炎球菌的C多糖发生沉淀反应而得名。在结构上，CRP的相对分子量为11.5万-14万，是由5个相同的多肽链亚单位以非共价键结合，形成对称的环状五球体，中间环绕一孔型结构，其凹面含有配体结合位点，每个亚单位有206个氨基酸残基。
CRP正常情况下含量极微量，在急性创伤和感染时其血浓度急剧升高。在健康人群中，新生儿血清中CRP＜2mg/L，儿童和成年人血清中CRP≤10mg/L。而在人体发生炎症疾病或者组织发生溃烂或坏死时的四到八小时内，CRP值急剧升高可达到约20至500毫克/升，且随着组织结构和功能的恢复，CRP含量也恢复正常值。因此CRP在血液中的水平，可用于评价感染，组织损伤和炎症性疾病的严重性，进程，愈后和治疗效果。
超敏C反应蛋白(hypersensitive-CRP，hs-CRP)还可作为心血管疾病的重要指标，其水平可预测将来心肌梗塞及中风的危险性。健康人超敏CRP的参考范围基本为0.58-1.13mg/L。CRP含量大于2.1mg/L的较CRP≤1.0mg/L的人，将来发生心肌梗塞的危险性是后者的2.9倍，发生缺血性中风的危险性是后者的1.9倍。超敏CRP和血脂的联合测定，较其他危险因子更能预示发生心，脑血管疾病的危险性。
目前，临床实验室测定CRP的常规方法主要有胶乳凝集试验和免疫比浊法(如散射、透射比浊法，并且已实现了自动化)以及放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和发光法。但是现有方法存在需要专业化仪器设备，专业实验室操作，操作复杂耗时长，所需样品量大等问题，无法满足当今高新科技的发展和医学科学的进步对即时检测技术(POCT)的要求。
免疫层析法(Lateral flow immunoassay，LFIA)是目前常用的快速检测方法之一。免疫层析是一种快速免疫分析技术，有效结合了层析法和免疫检测法的优点。免疫层析法具有操作简单、检测快速、结果易观察、样品需要量少、成本低、携带和保存方便等优点，此外，试纸条检测无需仪器或仅需简单仪器，且操作人员不需技术培训，非常适合现场检测及大规模筛查检测之用，目前已广泛应用于医学检测、食品安全检测、农牧业等多个领域中，具有良好的应用前景。
CN106370861B公开了一种C反应蛋白唾液检测试纸条，包括反应膜和金标垫，所述反应膜为硝酸纤维膜，其具有分别包被C反应蛋白单克隆抗体的检测线和羊抗鼠IgG的质控线；所述金标垫是包被有胶体金标记的C反应蛋白单克隆抗体的聚酯膜。
CN103217532A公开了一种C-反应蛋白检测试纸条，包括底板(7)以及贴附在底板(7)上的样品区(6)、金标记CRP单克隆抗体I区(5)、硝酸纤维素膜(2)和吸水垫(1)；所述样品区(6)、所述金标记CRP单克隆抗体I区(5)、所述硝酸纤维素膜(2)和所述吸水垫(1)在液体流动方向上顺序排列；所述硝酸纤维素膜(2)上设有在液体流动方向上顺序排列的第一单克隆抗体线(9)、第二单克隆抗体线(8)、第三单克隆抗体线(4)以及质控线(3)；所述第一单克隆抗体线(9)包含5μg CRP单克隆抗体II，所述第二单克隆抗体线(8)包含15μg CRP单克隆抗体II，所述第三单克隆抗体线(4)包含5μg CRP单克隆抗体II；所述CRP单克隆抗体I的抗原表位与所述CRP单克隆抗体II的抗原表位不同。
CN109270274A公开了一种可定量检测末梢血中C反应蛋白含量的试纸条，其包括样品垫、量子垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和衬板，其特征在于：所述的量子垫上包被有碳量子点标记的C反应蛋白抗体，所述的硝酸纤维素膜上自所述的样品垫所在侧向着所述的吸水纸所在侧依次设置有检测线和质控线，所述的检测线上包被有识别C反应蛋白的单克隆抗体，所述的质控线上包被有羊抗鼠IgG。
CN108333374A公开了C-反应蛋白、血清淀粉样蛋白A免疫层析定量联合检测试纸条及其制备方法，包括卡壳、底板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述试纸条由样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接粘贴在底板上构成。荧光标记物结合垫含有链霉亲和素标记荧光蛋白和生物素标记的C-反应蛋白单克隆抗体、生物素标记的血清淀粉样蛋白A单克隆抗体；硝酸纤维膜上有检测线和质控线。
CN202814988U公开了一种全量程超敏C反应蛋白胶体金检测试纸条，在其底衬上依次相互搭接的是第一样品垫、第二样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其特征在于所述的硝酸纤维素膜上设有第一检测线、第二检测线和质控线。
CN102023211A公开了一种全程定量检测C反应蛋白的免疫层析试纸条，所述试纸条由样品垫(1)、标记垫(2)、包被膜(3)、吸水纸(4)顺次搭接粘贴在底板上构成，其特征在于，所述标记垫(2)上包被有荧光胶乳微粒标记的CRP单克隆抗体和荧光胶乳微粒标记的兔IgG；所述包被膜(3)包括检测区(5)和质控区(6)，所述检测区(5)包被有与所述荧光胶乳微粒标记的CRP单克隆抗体处于不同表位的另一种CRP单克隆抗体。
“5种C反应蛋白快速检测系统检测性能比较”，蒋玲丽等，检验医学，2016年04期，评价了目前常用的5种C反应蛋白(CRP)快速检测系统的分析性能。方法对5种CRP快速检测系统(Uppergold U2金标斑点法定量读数仪、NEPHSTAR特定蛋白分析仪、ABX MicrosCRP200全自动血液分析仪、i-CHROMA Reader免疫荧光分析仪和Quik Read 101型检测系统，均使用原厂配套试剂；以A、B、C、D、E随机顺序代表)进行不精密度即变异系数(CV)]、准确度、线性、抗干扰能力性能评价，对参考区间进行验证，并以Dade Behring BN Pro Spec全自动血浆蛋白分析系统(简称DADE系统)作为参照系统进行比较。
然而，上述传统胶体金大多利用物理吸附原理标记，其存在明显的工艺稳定性差从而导致定量不精准、灵敏度差的问题。本领域需要一种定量精准、灵敏度高的定量检测C-反应蛋白的检测试纸以及定量检测C-反应蛋白的胶体金免疫层析方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明人通过深入系统研究和联合开发，完成了一种新的基于胶体金免疫层析技术的C-反应蛋白定量测试试纸与测试盒，利用羧基化胶体金与特异性抗体共价结合的标记技术及免疫层析技术，通过对检测区域4条检测线显色情况进行综合计算，实现对检测样本中CRP的精准定量。与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、灵敏度高、定量准确、线性范围宽的明显优势，不仅可以满足常规CRP的定量测定，还较其他免疫层析法提高了灵敏度，可以显著实现超敏CRP的检测。
更具体而言，本发明利用共价结合原理对胶体金溶液进行修饰，较传统胶体金利用物理吸附原理标记工艺更加稳定，并且比其他同类型检测试剂灵敏度高，试纸检测灵敏度可达0.001mg/L。此外，检测线2、3的加入扩大了检测线性范围，弥补了目前市面产品限行范围窄的缺点；检测线1的加入可准确区分HOOK的前带效应及后代效应，通过对四条检测线灰度值的综合计算，使检测样本中CRP的定量更加精准。
因此，在本发明的一方面，提供了一种C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸，该试纸包括：从左至右方向即沿层析方向依次粘贴于底板上的样品垫、滤血垫、标记垫、层析膜和吸收垫。
优选地，所述样品垫中包含封闭剂(封闭溶液)。更优选地，所述封闭剂包含0.2-0.35w％的聚乙烯醇(PVA；优选地，80％水解，平均分子量9,000-10,000)，0.5w％的BSA，0.1w％的FSG，0.5w％的Hammaten级酪蛋白，0.5v％吐温20和0.01w％的NaN3。所述封闭剂的溶液为去离子水或纯净水。
该样品垫可以通过下面方法制得：将不包含封闭剂的样品垫浸入所述封闭剂中0.5-3分钟，然后将样品垫在45℃-60℃下风干5-10分钟，然后在低于5.0％RH(相对湿度)下放置过夜，在组装成试纸之前，将其在相对湿度5.0％以下存放备用。
通过向样品垫添加所述封闭剂，可以有效地消除膜的封闭，与尝试直接阻塞膜相比，此方法可能更容易且成本效益更高。外源蛋白质，特别是在去污剂存在的情况下，所述封闭剂的使用可以在试纸长时间使用过程或保存过程中从检测器颗粒中置换出抗体或抗原。另外所述封闭剂对CRP检测特别具有针对性，其可以在CRP检测中使检测程序中的背景噪音最小化。与常规的BSA封闭剂相比，可以使背景噪音降低40-60％。
所述样品垫的材质优选为纤维素滤纸。纤维素滤可以装载多种封闭剂、检测剂、脱模剂，pH和离子强度调节剂以及粘度增强剂。
优选地，所述标记垫上固定有抗体修饰的羧基化胶体金溶液。
更优选地，所述抗体修饰的羧基化胶体金溶液通过以下方法得到：利用共价结合作用将C-反应蛋白的特异性抗体连接到羧基化胶体金，制得抗体修饰的羧基化胶体金溶液。
更优选地，所述抗体是CRP单克隆抗体。
优选地，层析膜上分别设有三条检测线和一条质控线。
优选地，所述三条检测线和一条质控线的排列顺序是：沿层析方向，依次为第一检测线、第二检测线、第三检测线和质控线。
更优选地，所述质控线固定有能与质控分子特异性结合的生物分子，检测线1、2、3固定有可与C-反应蛋白抗原-羧基化胶体金偶联C-反应蛋白特异性抗体结合物反应的特异性抗体或特异性抗体抗原混合物；
在本发明的另一方面，提供了所述试纸的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)利用共价结合作用将C-反应蛋白的特异性抗体连接到羧基化胶体金上，得到抗体修饰的羧基化胶体金溶液；
(2)将步骤(1)得到的抗体修饰的羧基化胶体金溶液固定在标记垫上，并且在层析膜上分别设有三条检测线和一条质控线；
(3)将样品垫、滤血垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成胶体金免疫层析试纸条。
更具体地，该方法包括以下步骤：
(1)利用共价结合作用将C-反应蛋白的特异性抗体连接到羧基化胶体金上，得到抗体修饰的羧基化胶体金溶液；
(2)将步骤1得到的抗体修饰的羧基化胶体金溶液固定在标记垫上，在层析膜上分别设有三条检测线和一条质控线，其中质控线固定有能与质控分子特异性结合的生物分子，检测线1、2、3固定有可与C-反应蛋白抗原-羧基化胶体金偶联C-反应蛋白特异性抗体结合物反应的的特异性抗体或特异性抗体抗原混合物；
(3)以样品垫、滤血垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成(即组装成)胶体金免疫层析试纸条。
优选地，步骤(1)中的抗体修饰的羧基化胶体金溶液是CRP单克隆抗体修饰的胶体金溶液。
更优选地，该CRP单克隆抗体修饰的胶体金溶液通过以下方法制得：将羧基化胶体金溶液与CRP单克隆抗体混合，并在N-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺盐酸盐作用下室温反应，加入羟胺水溶液终止反应，离心清洗后得到CRP单克隆抗体修饰的胶体金溶液。
更进一步优选地，该CRP单克隆抗体修饰的胶体金溶液通过以下方法制得：将40nm羧基化胶体金溶液与3-5mg/ml的CRP单克隆抗体混合，并在新鲜配制的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，优选10mg/mL)和碳化二亚胺盐酸盐(EDC，优选5mg/mL)溶液(优选水溶液)作用下室温反应2h，加入1mol/L羟胺水溶液终止反应，离心清洗后得到CRP单克隆抗体修饰的胶体金溶液。
特别优选地，所述碳化二亚胺盐酸盐为下式(1)所示的碳化二亚胺盐酸盐：
Figure BDA0002300307270000071
研究发现，对于定量检测C-反应蛋白的检测试纸，与生理相关的细胞相互作用对于这种生物材料的功能至关重要。N-羟基琥珀酰亚胺和式(1)所示碳化二亚胺盐酸盐的组合使用一方面可以显著提高生物相容性，另一方面可以有效地减轻在测量单独样本时可能发生的任何潜在伪像的可能性。
使用EDC和NHS进行配合来修饰时，可以显著提高免疫测定的分析性能和成本效益。
另外地或替代地，所述NHS可以用下式(2)所示的双功能酰亚胺替代(优选等重量浓度替代，如优选10mg/mL)：
Figure BDA0002300307270000072
当使用该双功能酰亚胺时，由于具有多个交联位点，可以有效地进行交联，具有更高的交联能力和容量，提供了化学上更灵活的平台，可用于生产多种交联，并且由于链长，可以进行更大范围的侧链位置采样反应。
该式(2)所示化合物可以通过下面方法制备：将N-羟基琥珀酰亚胺与下式(3)所示化合物按照1:3.5-1:4的摩尔比加入到DMF和CHCl3的混合溶液中(二者体积比为1:2-2:1)，然后加入AlPO4-42分子筛，在室温下搅拌10-18h，然后进行结晶纯化，即得式(2)所示化合物
Figure BDA0002300307270000081
所述式(3)所示化合物可以通过常规方法合成或市售获得。
所述制备方法简便，收率高(例如可以为90％或更高)，纯度高(纯度可高于99.2％)，合成成本低，适合批量合成。
在本发明的一个优选实施方式中，所述标记垫通过以下方法制备：将CRP单克隆抗体修饰的胶体金溶液喷涂于标记垫上，并加入牛血清白蛋白、蔗糖以及PEG20K这些表面活性剂，室温晾干后密封保存。
更优选地，所述标记垫通过以下方法制备：将CRP单克隆抗体修饰的胶体金溶液以8ul/cm速度喷涂于标记垫上，并加入牛血清白蛋白(0.1-1wt.％)、蔗糖(5-10wt.％)以及PEG20K表面活性剂(0.05-2wt.％)，室温晾干后密封保存。
在本发明的一个优选实施方式中，所述层析膜通过以下方法制备及通过以下方法进行包被：用pH为7-8的磷酸盐缓冲液将质控线包被抗体羊抗鼠稀释至0.5-1mg/ml浓度，将检测线2、3包被抗体CRP多克隆抗体2分别稀释至0.1-0.3mg/ml和0.3-0.9mg/ml，检测线1包被抗体为CRP多克隆抗体2与CRP抗原以体积比1-3:3-1混合制得的溶液，终浓度为0.3-0.5mg/ml；将配制好的各溶液装入相应的管路中，连接好划膜机上各部件，然后包被于层析膜上，之后将包被好的层析膜室温下避光干燥晾干。
更优选地，所述层析膜通过以下方法制备及通过以下方法进行包被：用10mMpH7.4磷酸盐缓冲液将质控线包被抗体羊抗鼠稀释至0.5-1mg/ml浓度，将检测线2、3包被抗体CRP多克隆抗体2分别稀释至0.1-0.3mg/ml和0.3-0.9mg/ml，检测线1包被抗体为CRP多克隆抗体2与CRP抗原以体积比1-3:3-1(V/V)混合制得的溶液，终浓度为0.3-0.5mg/ml.将配制好的各溶液装入相应的管路中，连接好划膜机上各部件，以1ul/cm速度包被于层析膜上，之后将包被好的层析膜室温下避光干燥晾干。
优选地，所述试纸条通过以下方法构建或组装：将各组分用切割机切割成以下大小：吸收垫：18mm×300mm、层析膜：25mm×300mm、标记垫：8mm×300mm、滤血垫：6mm×300mm、样品垫：13mm×300mm、依次粘贴在透明底板上，用数控高速斩切机切成3mm宽的测试条，干燥避光保存。
在本发明的又一方面，提供了使用上述试纸定量检测C-反应蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(1)使用试纸条进行免疫层析；和(2)在试纸条免疫层析后，将其放入检测仪读取相应数值，对样本中C-反应蛋白进行定量检测。
更具体地，使用上述试纸定量检测C-反应蛋白的方法包括以下步骤：
(1)标准曲线的绘制
将CRP抗原标准品将CRP标品稀释至下列浓度：0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，3.0，5.0，10mg/L；然后吸取70ul不同浓度标准品溶液，分别滴加于制备好的CRP定量层析试纸条样品垫中部，层析反应10分钟；置于免疫层析分析仪中进行检测，并绘制相应的标准曲线；
(2)精密性检测
选取三份不同浓度样本，按照上述检测办法，每个浓度检测10次，根据检测结果，计算批内CV％值；按照本发明方法制备三批检测试纸，选取三份不同浓度样本，分别检测10次，计算批间CV％值；
(3)干扰实验
将血红蛋白、胆红素、甘油三酯分别配制成10mmol/ml、1umol/ml、20mg/ml浓度，分别滴加于本发明方法制得的测试条上，确保层析后结果表明干扰物质对试剂条无影响；
(4)样本检测
对样品进行检测，层析结束后，置于免疫层析分析仪中，依据标准曲线分析该样品中CRP的含量，读取检测结果；同时选取市面在售同类型试剂盒进行对比检测，进行结果对比分析；
(5)输出检测报告并对结果进行分析。
在本发明的C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸及其检测方法中，通过使用本发明的试纸，检测线2、3的加入扩大了检测线性范围，且通过对四条检测线灰度值的综合计算，使检测样本中CRP的定量更加精准。
如图1所示，箭头所示方向为层析方向，将样品垫、滤血垫、标记垫、层析膜、吸收垫从左至右依次粘贴于底板上，试纸条层析反应后，通过层析膜上的检测线3、检测线2、、检测线1、质控线灰度计算获得样品中CRP含量。
综上，本发明提供了一种快速免疫分析技术和试纸，有效结合了层析法和免疫检测法的优点，具有操作简单、检测快速、结果易观察、样品需要量少、成本低、携带和保存方便等优点利用羧基化胶体金与特异性抗体共价结合的标记技术及免疫层析技术，通过对检测区域4条检测线显色情况进行综合计算，实现对检测样本中CRP的精准定量。不仅可以满足常规CRP的定量测定，还较其他免疫层析法提高了灵敏度，可以实现超敏CRP的检测。
附图说明
下面利用附图来对本发明进行进一步的说明，但是附图中的实施例不构成对本发明的任何限制。
图1是根据本发明的C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸的剖面结构示意图；
图2是根据本发明的C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸的平面结构示意图，其中：1是检测线1；2是检测线2；3是检测线3；4是质控线；5是样品垫；6是标记垫；7是滤血垫；8是层析膜；9是吸收垫。
具体实施方式
为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
通过下面方法进行C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸的制备以及用其进行检测的方法。
1.C反应蛋白快速定量免疫层析试纸制作主要包括以下步骤：
步骤1：C-反应蛋白特异性抗体与羧基化胶体金共价结合反应
将40nm羧基化胶体金溶液与3-5mg/ml的CRP单克隆抗体混合，并在新鲜配制的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，10mg/mL)和碳化二亚胺盐酸盐(EDC，5mg/mL)作用下室温反应2h，加入1mol/L羟胺水溶液终止反应，离心清洗后得到CRP单克隆抗体修饰的胶体金溶液。
步骤2：标记垫的制备
将CRP单克隆抗体修饰的胶体金溶液以8ul/cm速度喷涂于标记垫上，并加入牛血清白蛋白(0.1-1％)、蔗糖(5-10％)以及PEG20K等表面活性剂(0.05-2％)，室温晾干后密封保存。
步骤3：层析膜的包被
用10mM pH7.4磷酸盐缓冲液将质控线包被抗体羊抗鼠稀释至0.5-1mg/ml浓度，将检测线2、3包被抗体CRP多克隆抗体2分别稀释至0.1-0.3mg/ml和0.3-0.9mg/ml，检测线1包被抗体为CRP多克隆抗体2与CRP抗原以体积比1-3:3-1(V/V)混合制得的溶液，终浓度为0.3-0.5mg/ml.将配制好的各溶液装入相应的管路中，连接好划膜机上各部件，以1ul/cm速度包被于层析膜上。将包被好的层析膜室温下避光干燥晾干。
步骤4：试纸条组装
将各组分用切割机切割成以下大小：吸收垫：18mm×300mm、层析膜：25mm×300mm、标记垫：8mm×300mm、滤血垫：6mm×300mm、样品垫：13mm×300mm、依次粘贴在透明底板上，用数控高速斩切机切成3mm宽的测试条，干燥避光保存。
2.试纸的评价
2.1标准曲线的绘制
将CRP抗原标准品将CRP标品稀释至下列浓度：0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，3.0，5.0，10mg/L；
吸取70ul不同浓度标准品溶液，分别滴加于制备好的CRP定量层析试纸条样品垫中部，层析反应10分钟；置于免疫层析分析仪中进行检测，并绘制相应的标准曲线；
2.2精密性检测
选取三份不同浓度样本，按照上述检测办法，每个浓度检测10次，根据检测结果，计算批内CV％值；按照本发明方法制备三批检测试纸，选取三份不同浓度样本，分别检测10次，计算批间CV％值；
2.3干扰实验
将血红蛋白、胆红素、甘油三酯分别配制成10mmol/ml、1umol/ml、20mg/ml浓度，分别滴加于本发明方法制得的测试条上，层析后结果表明，干扰物质对试剂条无影响；
2.4样本检测
对样品进行检测，层析结束后，置于免疫层析分析仪中，依据标准曲线分析该样品中CRP的含量，读取检测结果；同时选取市面在售同类型试剂盒上海凯创C反应蛋白(CRP)检测试剂盒(胶体金法)进行对比检测，进行结果对比分析；
2.5输出检测报告。
2.6结果分析
Figure BDA0002300307270000131
实验结果分析：本实验方法试剂盒最低检测限为0.001mg/L，检测线性范围0.001-10mg/L，批内及批间CV％均小于10％，血红蛋白、胆红素、甘油三酯等干扰物质对试纸条性能无影响；本发明产品检出限明显高于在售同类型产品，且定量更为准确，较同类型产品优势明显。
本书面描述使用实例来公开本发明，包括最佳模式，且还使本领域技术人员能够制造和使用本发明。本发明的可授予专利的范围由权利要求书限定，且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这种其它实例具有不异于权利要求书的字面语言的结构元素，或者如果这种其它实例包括与权利要求书的字面语言无实质性差异的等效结构元素，则这种其它实例意图处于权利要求书的范围之内。在不会造成不一致的程度下，通过参考将本文中参考的所有引用之处并入本文中。

Claims (10)

1.一种C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸，其中该试纸包括：从左至右方向即沿层析方向依次粘贴于底板上的样品垫、滤血垫、标记垫、层析膜和吸收垫。
2.根据权利要求1所述的C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸，其中所述标记垫上固定有抗体修饰的羧基化胶体金溶液。
3.根据权利要求2所述的C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸，其中所述抗体修饰的羧基化胶体金溶液通过以下方法得到：利用共价结合作用将C-反应蛋白的特异性抗体连接到羧基化胶体金，制得抗体修饰的羧基化胶体金溶液。
4.根据权利要求3所述的C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸，其中所述抗体是CRP单克隆抗体。
5.根据前述权利要求中任一项所述的C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸，其中所述层析膜上设有三条检测线和一条质控线。
6.根据权利要求5所述的C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸，其中所述三条检测线和一条质控线的排列顺序是：沿层析方向，依次为第三检测线、第二检测线、第一检测线和质控线。
7.一种制备根据前述权利要求1-6中任一项所述C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸的方法，该方法包括以下步骤：
(1)利用共价结合作用将C-反应蛋白的特异性抗体连接到羧基化胶体金上，得到抗体修饰的羧基化胶体金溶液；
(2)将步骤(1)得到的抗体修饰的羧基化胶体金溶液固定在标记垫上，并且在层析膜上设有三条检测线和一条质控线；
(3)将样品垫、滤血垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成胶体金免疫层析试纸条。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗体修饰的羧基化胶体金溶液通过以下方法进行制备：利用共价结合作用将C-反应蛋白的特异性抗体连接到羧基化胶体金，制得抗体修饰的羧基化胶体金溶液。
9.根据权利要求9所述的方法，所述抗体是CRP单克隆抗体。
10.使用根据权利要求1-6任一项所述的C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸或者7-9任一项所述方法制备的C-反应蛋白快速定量免疫层析试纸来定量检测C-反应蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(1)使用试纸条进行免疫层析；和(2)在试纸条免疫层析后，将其放入检测仪读取相应数值，对样本中C-反应蛋白进行定量检测。
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