CN107132359B - 胃蛋白酶原ⅰ和胃蛋白酶原ⅱ检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种试剂盒及检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的方法。所述试剂盒包括:第一包被膜;和第二包被膜,所述第一包被膜的一端与所述第二包被膜的一端相连,所述第一包被膜中的至少一块区域包被有荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅰ抗体和荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅱ抗体,所述第二包被膜包含分离的第一区域、第二区域和第三区域,形成所述荧光微球的材料包括:聚苯乙烯‑甲基丙烯酸甲酯共聚物。利用本发明的试剂盒和方法具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、可实现客观化测定等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地,本发明涉及胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的检测方法及其试剂盒。更具体地,本发明涉及试剂盒、试剂盒在检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ中的用途以及利用试剂盒检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的方法。
背景技术
胃蛋白酶原(PG)是胃蛋白酶的前体,依据其生化性质和免疫原性将其分成两个亚群。1-5组分的免疫原性相同称为PGⅠ,主要由胃腺的主细胞和黏液颈细胞分泌,组分6-7称为PGⅡ,由胃体的胃底黏膜的泌酸腺的主细胞分泌,泌酸腺的黏液颈细胞、贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液细胞以及十二指肠上段的Brunner腺也能产生PGⅡ,前列腺和胰腺也产生少量PGⅡ。正常情况下约1%的PG进入血循环,进入的量十分稳定,因此血清PGⅠ、Ⅱ反映胃黏膜腺体和细胞的数量,也间接反应胃黏膜不同部位的分泌功能。当胃黏膜发生病理变化时,血清PG含量也随之改变,联合测定血清胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的比值被称为胃黏膜的“血清学活检”。
目前常见的血清胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的检测方法主要有:乳胶增强免疫比浊法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫分析法、胶体金免疫层析法等。乳胶增强免疫比浊法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫分析法,操作过程复杂,需要大量仪器与设备及专业人员操作,检测时间较长,检测灵敏度高。胶体金免疫层析法操作简单,但灵敏度不高,无法精确定量。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。
为此,在本发明的一方面,本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例,所述试剂盒包括:第一包被膜;和第二包被膜,所述第一包被膜的一端与所述第二包被膜的一端相连,所述第一包被膜中的至少一块区域包被有荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅰ抗体和荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅱ抗体,所述第二包被膜包含分离的第一区域、第二区域和第三区域,所述第一区域和所述第二区域比所述第三区域靠近所述第一包被膜,所述第一区域包被有抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体,所述第二区域包被有抗胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体,所述第三区域包被有抗抗体,所述抗抗体特异性结合所述胃蛋白酶原Ⅰ抗体和所述胃蛋白酶原Ⅱ抗体,形成所述荧光微球的材料包括:聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物。
传统的荧光微球材料,多为单一的苯乙烯聚合物,存在合成条件较难控制、包覆物的荧光产率低、微球粒径不均一、亲水性差等缺点。而采用苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物所制备的荧光微球能获得较高的荧光产率,粒径更均一,亲水性好,用于生物标记效果更佳。
需要说明的是,本发明对于第一包被膜中的包被有荧光微球标记胃蛋白酶原Ⅰ抗体和有荧光微球标记胃蛋白酶原Ⅱ抗体的区域的大小不作限制,可以是整个第一包被膜,也可以是第一包被膜的一部分,在本发明的一个实施例中,第一包被膜被称为样品垫。同样的,对第二包被膜中的分离的第一区域、第二区域和第三区域各自的大小也不作特别限制,只要这三个区域任两个或任三个之间没有连接或重叠的区域即可。另外,第一区域和第二区域中的哪个更靠近第一包被膜也不作限制。
在本发明的一个实施例中,如图1所示,试剂盒的第一包被膜和第二包被膜都是长方形的,第一包被膜的一条宽边(“宽边”即为边长较短的一边)和第二包被膜的一条宽边(“宽边”即为边长较短的一边)相粘,第一包被膜中的包被有荧光微球标记胃蛋白酶原Ⅰ抗体的区域为长约2cm、宽约3mm的长方形,第二包被膜中的第一区域、第二区域和第三区域都为线状,第一区域内包被有抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体的区域被称为检测线1或T1线,第二区域内包被有抗胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体的区域被称为检测线2或T2线,第三区域内包被有抗抗体的区域被称为质控线或C线,三个区域所在的线状平面都平行于两包被膜的粘结边,线状第一、第二或第三区域的宽度大约为0.5~1mm、长为所在膜的宽。
本发明的试剂盒利用第一包被膜和第二包被膜分别包被有能特异性结合同一种抗原的荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅰ抗体(胃蛋白酶原Ⅱ抗体)和抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体(抗胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体),加入待测样品后利用膜层析,在第二包被膜上形成双抗体夹心复合物,基于检测复合物中的胃蛋白酶原Ⅰ抗体(胃蛋白酶原Ⅱ抗体)上带的荧光微球标记的荧光强度及对应的比值-浓度标准曲线来确定样品中所含抗原的浓度。本发明的试剂盒能够明显的提高检测的特异性,缩短检测所需时间。通过荧光微球标记胃蛋白酶原Ⅰ抗体及胃蛋白酶原Ⅱ抗体,能够明显的提高检测灵敏度。
根据本发明的一个实施例,所述材料进一步包括下列至少之一:量子点;以及稀土络合物。发明人经过大量实验发现,量子点和/或稀土络合物在紫外光源激发下所发射的荧光寿命长,不易漂白,荧光强度能够有效地定量检测。根据本发明的优选实施例,所述量子点为CdSe/ZnS,所述稀土络合物为Eu(TTA)3Phen。
根据本发明的一个实施例,所述荧光微球具有功能化表面。由此,能够使得抗体结合到荧光微球上。
根据本发明的一个实施例,所述荧光微球是通过下列方式获得的:将苯乙烯和甲基丙烯酸甲脂按照1:1的质量比进行混合,再向所得到的混合物中加入1体积%稀土络合物Eu(TTA)3Phen或者0.5体积%CdSe/ZnS量子点,超声混匀,得到a液;将0.05体积%羧基化聚乙烯醇和0.05体积%碳酸氢钠溶于水,得到b液;将所述a液加入所述b液中,超声15分钟后,向所得到的混合液中通入氮气30分钟,同时进行搅拌,再加热到80℃,并向所述混合液中加入0.01~0.1体积%过硫酸钾,反应12小时,以便得到所述荧光微球。由此,能够获得具有功能化表面的荧光微球,且利用该荧光微球能够有效地提高检测灵敏度和准确性。
根据本发明的一个实施例,所述荧光微球的粒径为50~500nm,优选100~250nm。由此,用于侧向层析检测时,具有较高灵敏度及均一性,并能有效的定量检测。
根据本发明的一个实施例,所述第二包被膜的另一端连接有吸水垫。吸水垫可为强吸水物质,由此在检测液态样品时能够给予定向作用力,使液态样品从第一包被膜定向层析至第二包被膜。
根据本发明的一个实施例,所述第一包被膜、所述第二包被膜和所述吸水垫固定在同一固相基质上。固相基质主要为在使用包被膜时有个承载,方便操作,固相基质的类型不作特别限定,可以为不会与待测样品发生反应或者不影响抗原抗体结合的惰性材料,比如纸板、塑料板等。
根据本发明的一个实施例,所述第一包被膜为玻璃纤维素膜,所述第二包被膜为硝酸纤维素膜(NC膜)。玻璃纤维膜呈化学惰性,不含粘合剂,采用100%硼硅酸玻璃纤维制造而成,其上包被有荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅰ抗体和胃蛋白酶原Ⅱ抗体,利于胃蛋白酶原Ⅰ抗体和胃蛋白酶原Ⅱ抗体与待测样品中的目标抗原发生特异性结合。而NC膜本身是已经添加了表面活性剂来改善亲水能力,而且已经存在有一定的缓冲系统,具有毛细纤维结构,能吸附比同等纤维素滤纸更多的水分,流速快,耐高温,利于其上包被的抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体和抗胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体分别与前述的带荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅰ抗体-抗原和带荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅱ抗体-抗原发生特异性结合反应,激发荧光。
根据本发明的一个实施例,所述胃蛋白酶原Ⅰ抗体和胃蛋白酶原Ⅱ抗体分别与所述荧光微球通过肽键共价结合。
根据本发明的一个实施例,胃蛋白酶原Ⅰ抗体和抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体都可以特异性结合抗原胃蛋白酶原Ⅰ,而且较佳地,两种抗体能与胃蛋白酶原Ⅰ的不同表面决定簇特异性结合,胃蛋白酶原Ⅱ抗体和抗胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体都可以特异性结合抗原胃蛋白酶原Ⅱ,而且较佳地,两种抗体能与胃蛋白酶原Ⅱ的不同表面决定簇特异性结合,这样利于胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ检测的准确进行。本发明的试剂盒是基于对荧光微球标记、抗原和抗体特性的研究,通过选择适合的荧光微球标记与特异性的抗体进行定向共价化学偶联,获得荧光微球标记抗体分析,并通过优化双抗体夹心免疫反应的各种条件,制备得到上述能够用于检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒。
根据本发明的一个实施例,所述抗抗体为羊抗鼠IgG抗体,其能够与胃蛋白酶原Ⅰ抗体和胃蛋白酶原Ⅱ抗体特异性结合,即与多余的带荧光微球标记胃蛋白酶原Ⅰ抗体和带荧光微球标记胃蛋白酶原Ⅱ抗体结合形成免疫复合物,激发荧光,得以能够定性和定量检测该免疫复合物。
根据本发明的一个实施例,图2和图3分别给出了试剂盒的两种结构,即检测同一样品中两种抗原(与胃蛋白酶原Ⅰ抗体特异性结合的抗原和与胃蛋白酶原Ⅱ抗体特异性结合的抗原)(如图2)以及分别检测样品中的某一抗原,例如样品1中检测第一抗原(与胃蛋白酶原Ⅰ抗体特异性结合的抗原),样品2中检测第二抗原(与胃蛋白酶原Ⅱ抗体特异性结合的抗原)(如图3)。
在本发明的另一方面,本发明提出了一种前面所描述的试剂盒在检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ中的用途。前面针对试剂盒所描述的优点和技术特征,仍适用于该试剂盒的用途,在此不再赘述。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种利用前面所描述的试剂盒检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的方法,根据本发明的实施例,所述方法包括:将待测样本加到所述包被有带荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅰ抗体和带荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅱ抗体的区域;检测所述第一区域、第二区域和第三区域的荧光强度,获得第一区域荧光强度、第二区域荧光强度和第三区域荧光强度;基于第一比值及其对应的比值-浓度标准曲线,确定所述待测样本中的胃蛋白酶原Ⅰ浓度,基于第二比值及其对应的比值-浓度标准曲线,确定所述待测样本中的胃蛋白酶原Ⅱ浓度,其中,所述第一比值=第一区域荧光强度/第三区域荧光强度,所述第二比值=第二区域荧光强度/第三区域荧光强度。
第一包被膜中的包被有带荧光微球标记胃蛋白酶原Ⅰ抗体和带荧光微球标记胃蛋白酶原Ⅱ抗体的区域为与待测样本中的目标抗原(若待测样本中存在抗原)结合的区域,在本发明的一个实施例中,将该区域称为加样端。基于比值与浓度标准曲线公式,定量测定待测样本中的胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ浓度。在本发明的一个实施例中,通过手持仪器检测荧光强度,获得第一区域荧光强度和第二区域荧光强度分别与第三区域荧光强度的比值,将两个比值分别代入对应的检测值-浓度标准曲线中,从而能够客观得到检测结果。利用本发明的试剂盒及检测方法,能够实现对胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ进行快速和高灵敏测定,具有灵敏度高、特异性强、快速、简便,可实现客观化测定的优点。利用本发明的这一试剂盒和方法检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ,对胃蛋白酶原Ⅰ的灵敏度达0.5ng/mL,对胃蛋白酶原Ⅱ的灵敏度达0.5ng/mL。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了根据本发明一个实施例的试剂盒结构示意图;
图2显示了根据本发明另一个实施例的试剂盒的结构示意图;
图3显示了根据本发明又一个实施例的试剂盒的结构示意图;以及
图4显示了根据本发明一个实施例的检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的检测值与浓度标准曲线图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
根据本发明的实施方式,提供了以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。另外,本发明中的术语“包被”为免疫领域的术语,包含吸附、固定之意。
以下将第一区域称为测试区1或T1线,将第二区域称为测试区2或T2线,将第三区域称为质控区或C线,将第一包被膜称为样品垫,将第二包被膜称为包被膜。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的待标记胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ抗体是购自昆明云大单抗中心的编号为P1-12、P2-14抗胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的单克隆抗体。
下述实施例中的胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ包被抗体是购自昆明云大单抗中心的编号为P1-13、P2-15抗胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的单克隆抗体。
下述实施例中用于制作样品垫的玻璃纤维膜购自Millipore公司、商品目录号为GF-CP20300。
下述实施例中用于制作吸水垫的吸水纸购自Millipore公司、商品目录号为CF-SP22300。
下述实施例中用于制作包被膜的硝酸纤维素膜购自Millipore公司、商品目录号为Hi-Flow Plus HF135。
下述实施例中的pH为7.4的0.02M PBS缓冲液按照如下方法配制:称取2.3gNa2HPO4、0.524g NaH2PO4.H2O、8.77g NaCl溶于纯水,用纯水定容至1L,调pH至7.4,得到pH为7.4的0.02M PBS缓冲液。
下述实施例中的膜处理缓冲液按照如下方法配制:将Tween-20、BSA、蔗糖溶于上述pH为7.4的0.02M PBS缓冲液使Tween-20的质量百分含量为0.2%、BSA的质量百分含量为1%、蔗糖的质量百分含量为2%,调pH至7.4,得到膜处理缓冲液。
下述实施例中的50mM pH为8.5的硼砂缓冲液按照如下方法配制:称取1.9gNa2B4O7.10H2O溶于100ml纯水,调pH至8.5得到50mM pH为8.5的硼砂缓冲液。
下述实施例中的样品处理液按照如下方法配制:将Tween-20溶于上述pH为7.4的0.02M PBS缓冲液使Tween-20的质量百分含量为0.2%,调pH至7.4,得到样品处理液。
检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ试剂盒的一般制备方法包括以下步骤:
(一)荧光微球标记探针的制备
(二)测试区T线和C线处抗体的包被
采用喷膜仪器,于包被膜测试区的T1线处喷涂抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体,于包被膜测试区的T2线处喷涂抗胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体,于C线处喷涂羊抗鼠IgG抗体。
(三)样品垫处标记探针的包被
采用喷涂仪器,于样品垫特定位置处喷涂荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体和胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体混合物。该特定位置为样品垫上的一块区域,该区域即作为后续的“加样端”。
(四)试剂盒的组装成型
按照试剂盒的结构图示意图3,于塑料支撑背板中间粘贴作为测试区的包被膜,于包被膜的T1或T2线端粘贴样品垫,C1和C2线端粘贴吸水垫。采用试纸分切机,将其分切为一定宽带的纸条,并装入夹片,用装有干燥剂的铝箔袋进行包装。
(五)抗原-抗体荧光免疫复合物的形成
于上述组装成型的反应板的加样端处加入待测样品,样品中的胃蛋白酶原Ⅰ与荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅰ单克隆标记抗体结合后层析到T1线处喷涂的抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体,在T1线处形成包被抗体-抗原-荧光微球标记抗体免疫复合物,多余的荧光微球标记胃蛋白酶原Ⅰ抗体则在C1线处与羊抗鼠IgG形成的荧光标记免疫复合物;样品中的胃蛋白酶原Ⅱ与荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体结合后层析到T2线处喷涂的抗胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体,在T2线处形成包被抗体-抗原-荧光微球标记抗体免疫复合物,多余的荧光微球标记胃蛋白酶原Ⅱ抗体则在C2线处与羊抗鼠IgG形成的荧光标记免疫复合物。
(六)荧光标记免疫复合物荧光强度检测
用荧光检测仪测定T1线处和T2线处,C1线处和C2线处荧光强度,通过荧光强度与标准浓度曲线方程计算得到定量结果,C线测定结果则作为该测定方法的质控内标。
所述的荧光标记免疫复合物的荧光强度,是指在T1线、T2线和C1线、C2线处分别滞留下的结合荧光微球的数量用荧光检测仪测定后所得到的数值。通过双抗体夹心免疫反应的条件,经大量测定不同标准浓度样本绘制标准浓度曲线,并得到标准浓度曲线方程,以此标准浓度曲线方程来计算检测样本的浓度。C线测定结果则作为该测定方法的质控内标。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ试剂盒的制备
(一)荧光微球标记胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ标记抗体的制备
将苯乙烯和甲基丙烯酸甲脂按1:1比例混合,加入1%稀土络合物Eu(TTA)3Phen或者0.5%CdSe/ZnS量子点,超声混匀,得到a液。将0.05%羧基化聚乙烯醇和0.05%碳酸氢钠溶于水,得到b液。将a液加入b液超声15分钟后,通氮气30分钟搅拌除氧,然后加热到80度。加入0.01-0.1%过硫酸钾反应12小时,得到聚合物荧光微球,经过滤、离心和去离子水清洗,得到纯化的功能化荧光微球。
取10mg的上述羧基修饰的荧光微球用MES缓冲液(0.1M、pH4.7)洗涤并离心后,用1ml MES缓冲液(0.1M、pH4.7)重悬,加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)至终浓度为5mM、加入NHS(N-羟基丁二酰亚胺)至终浓度为10mM,室温避光,反应半小时得到活化后羧基修饰的荧光微球。
用50mM pH8.5的硼砂缓冲液洗涤该活化后羧基修饰的荧光微球,分别取0.37mg上述待标记胃蛋白酶原Ⅰ抗体和胃蛋白酶原Ⅱ抗体和5mg上述活化后羧基修饰的荧光微球混合到50mM pH8.5的硼砂缓冲液中充分混匀。室温避光下反应2小时,让抗体和荧光微球形成稳定的肽键共价结合得到荧光微球与胃蛋白酶原Ⅰ抗体和胃蛋白酶原Ⅱ抗体的偶联物。反应结束后,加入终浓度为1%(质量百分含量)的BSA溶液对荧光微球与胃蛋白酶原Ⅰ抗体和胃蛋白酶原Ⅱ抗体的偶联物上剩余活性羧基位点进行封闭,室温避光反应0.5小时。完成后,用pH7.4的0.02M PBS缓冲液洗涤、重悬得到5mg/ml荧光微球标记胃蛋白酶原Ⅰ抗体和胃蛋白酶原Ⅱ抗体液体,4℃保存待用。
(二)检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ试剂盒的制备
以胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ包被抗体,羊抗鼠IgG抗体制备包被膜,具体方法如下:
采用pH7.4的0.02M PBS缓冲液,将羊抗鼠IgG抗体(长沙博优生物科技有限公司,ABGAM-0500)配制为浓度1mg/ml溶液,将胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ包被抗体(昆明云大单抗中心的编号为P1-13、P2-15)的浓度分别配制为浓度2mg/ml溶液,选用BioDot的XYZ3050喷膜系统将羊抗鼠IgG抗体喷至包被膜(硝酸纤维素膜)的质控线(C1线、C2线)位置,将胃蛋白酶原Ⅰ包被抗体喷至检测线(T1线)位置,将胃蛋白酶原Ⅱ包被抗体喷至检测线(T2线)位置,于相对湿度为10%以下的干燥车间进行抽湿4小时后干燥待用,得到具有检测线和质控线的包被膜。
用上述膜处理缓冲液浸泡玻璃纤维纸半小时,浸泡的温度为37℃,于同样的抽湿条件进行抽湿4小时后,用上述膜处理缓冲液分别稀释步骤(一)所得荧光微球标记胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ抗体液体至荧光微球标记胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ抗体含量为0.05mg/ml后,采用BioDot的XYZ3050喷膜系统将其分别喷涂至上述处理过的玻璃纤维素膜上制备形成样品垫,于同样的抽湿条件进行干燥。在10万级洁净和干燥的车间中把上述干燥好的具有检测线和质控线的包被膜、上述样品垫、吸水垫、背板按图3所示进行搭配组装后,采用BioDot的CM4000裁切系统将贴好的纸板裁切为4mm/条的宽度,装入检测用夹片待用。
实施例2检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ试剂盒的评估
(一)检测灵敏度
以胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ抗原为待测样品来测定实施例1的检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ侧向层析检测试剂的灵敏度。
同时将胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ抗原用含5%小牛血清的pH为7.4的0.02MPBS缓冲液分别配制成系列浓度(0、0.5、1、5、10、50、100、500ng/mL),分别加入由实施例1得到的检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ侧向层析检测试剂的加样端中,并采用荧光检测仪检测荧光强度。检测步骤:检测前先将待检测样品恢复室温(25℃),用精确移液器取待检测样品60μl垂直缓慢滴入实施例1得到的检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ侧向层析检测试剂的加样端,10分钟后用荧光检测仪进行测试。
其检测结果如下表1所示。从检测结果中可以得出实施例1的检测胃蛋白酶原Ⅰ抗原的灵敏度为0.5ng/mL,检测胃蛋白酶原Ⅱ抗原的灵敏度为0.5ng/mL。根据检测值与浓度所作校准曲线,检测胃蛋白酶原Ⅰ抗原的相关系数R2=0.9994,线性范围为0-500ng/mL;检测胃蛋白酶原Ⅱ抗原的相关系数R2=0.9983,线性范围为0-500ng/mL。胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ侧向层析检测试剂检测值与浓度曲线图如图4所示。
表1胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ不同样品浓度的试剂盒检测值
(二)精密性检测
分别选取3份不同浓度的胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ抗原样本,按照本发明所述的方法重复测量10次,根据10次的结果计算批内平均偏差CV%值。按照本发明所述的方法制备的3批侧向层析检测试剂,分别选取3份不同浓度的样本,分别重复测量10次,根据结果计算批间平均偏差CV%值。其检测结果如下表2所示。结果表明本发明方法的精密性较高。
表2批内批间差测定
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种试剂盒,其特征在于,包括:
第一包被膜;和
第二包被膜,所述第一包被膜的一端与所述第二包被膜的一端相连,
所述第一包被膜中的至少一块区域包被有荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅰ抗体和荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅱ抗体,
所述第二包被膜包含分离的第一区域、第二区域和第三区域,所述第一区域和所述第二区域比所述第三区域靠近所述第一包被膜,
所述第一区域包被有抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体,
所述第二区域包被有抗胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体,
所述第三区域包被有抗抗体,所述抗抗体特异性结合所述胃蛋白酶原Ⅰ抗体和所述胃蛋白酶原Ⅱ抗体,
形成所述荧光微球的材料包括:
聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物;以及
稀土络合物,所述稀土络合物为Eu(TTA)3Phen。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述荧光微球具有功能化表面。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述荧光微球是通过下列方式获得的:
将苯乙烯和甲基丙烯酸甲脂按照1:1的质量比进行混合,再向所得到的混合物中加入1体积%稀土络合物Eu(TTA)3Phen,超声混匀,得到a液;
将0.05体积%羧基化聚乙烯醇和0.05体积%碳酸氢钠溶于水,得到b液;
将所述a液加入所述b液中,超声15分钟后,向所得到的混合液中通入氮气30分钟,同时进行搅拌,再加热到80℃,并向所述混合液中加入0.01~0.1体积%过硫酸钾,反应12小时,以便得到所述荧光微球。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述荧光微球的粒径为50~500nm。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述荧光微球的粒径为100~250nm。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述第二包被膜的另一端连接有吸水垫,
任选地,所述第一包被膜、所述第二包被膜和所述吸水垫固定在同一固相基质上,
任选地,所述第一包被膜为玻璃纤维素膜,所述第二包被膜为硝酸纤维素膜。
7.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述胃蛋白酶原Ⅰ抗体和胃蛋白酶原Ⅱ抗体分别与所述荧光微球通过肽键共价结合。
8.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述抗抗体为羊抗鼠IgG抗体。
9.权利要求1~8任一项所述试剂盒在非诊断目的检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ中的用途。
10.一种利用权利要求1~8任一项所述试剂盒非诊断目的检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的方法,其特征在于,包括:
将待测样本加到所述包被有荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅰ抗体和荧光微球标记的胃蛋白酶原Ⅱ抗体的区域;
检测所述第一区域、第二区域和第三区域的荧光强度,获得第一区域荧光强度、第二区域荧光强度和第三区域荧光强度;
基于第一比值及其对应的比值-浓度标准曲线,确定所述待测样本中的胃蛋白酶原Ⅰ浓度,
基于第二比值及其对应的比值-浓度标准曲线,确定所述待测样本中的胃蛋白酶原Ⅱ浓度,
其中,
所述第一比值=第一区域荧光强度/第三区域荧光强度,
所述第二比值=第二区域荧光强度/第三区域荧光强度。
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