CN102908961A - 功能性纳米颗粒复合非交联微球及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末及其制备方法和应用，所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末包含功能性纳米颗粒复合非交联微球，所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球包含功能性纳米颗粒和聚合物，平均粒径为0.1-20μm，粒径分布变异系数≤9.1%。所述的制备方法是膜乳化技术和溶剂挥发法的结合。本发明还涉及基于上述复合非交联微球粉末的生物检测探针及该探针的应用。本发明的优点是：本发明可制备得到粒径均一的功能性纳米复合非交联微球粉末，制得的功能性纳米复合非交联微球属于微米级且粒径变异系数小、单分散性好、性能优良，在生物检测、生物医药等领域具备广阔的应用前景。

Description

功能性纳米颗粒复合非交联微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微纳米材料制备与应用领域，具体地说，是功能性纳米颗粒复合非交联微球及其制备方法和应用。 

背景技术

功能性纳米颗粒复合微球是指通过某种方法将功能性纳米颗粒与微球结合在一起所得到的一种功能性复合微球。现阶段通过各种途径制备的纳米颗粒具备各种特殊的光、电、磁及生物学等特性，因此在与微球结合后往往会将这些特性赋予到微球本身。而微球也为这些纳米颗粒提供了支承载体和有效保护。同时，微球自身的化学和物理性能如光敏感性、pH响应性、温度敏感性、吸附特性以及表面活性官能团也为纳米颗粒在各种复杂领域的应用提供可能。具备不同特殊功能的纳米颗粒复合微球在生物医药、工业催化、化工合成、电子信息、建筑材料等领域具有巨大的应用潜力。 

现有技术中制备功能性纳米颗粒复合微球的制备方法主要有以下几种： 

原位聚合法：即事先合成载体微球，之后以微球作为微型反应器，在其内部或表面原位合成各种功能性颗粒。但此方法由于受到微球自身条件影响，其所制备出的功能性颗粒种类及性能会受到一定限制。

溶胀渗透法：即事先合成具备孔结构的交联微球，之后微球在良溶剂中被溶胀，表面微孔得到扩张。此时加入功能性颗粒，在浓度差或疏水作用下微球通过孔结构渗透进微球并吸附在微球内壁。当外部溶剂去除后，微球收缩，从而将功能性颗粒包埋进入微球。此种方法简单易行，但要求微球的表面具有可供功能性渗透进入的微孔。而由于这种微孔结构的存在，会令包埋进的功能性颗粒容易重新泄漏出来，且不能为包埋在内的功能性颗粒提供足够保护以减少外界影响，因而此方法制备的复合微球内的纳米颗粒的性能稳定性欠佳。 

组装模板法：即以功能性颗粒或微球为核心模板，通过静电作用、疏水作用、络合作用和氢键作用，将功能性颗粒和构成微球的材料依次结合在核心上。这种方法可以精确控制复合微球的粒径和纳米颗粒数量，但制备步骤较为复杂。且制备过程中反应环境对部分功能性颗粒的性能有一定影响。 

聚合法：即在利用乳液聚合、悬浮聚合、分散聚合或本体聚合在制备微球的同时引入功能性颗粒。功能性颗粒分散在可聚合单体中，随着聚合的进行，功能性颗粒被包埋在逐渐形成的微球结构之内。此种方法优点是制备简单、产率较高。但是此种方法仍然面临以下问题：制备微米级复合微球时粒度分布较宽，功能性颗粒性能易受聚合反应环境的影响，功能性颗粒与形成的微球结构可能存在相分离。 

现阶段，通过各种方法制备的功能性纳米颗粒复合聚合物微球已被应用于各个领域：Ugelstad研究小组通过原位聚合法在苯乙烯微球中制备了磁性纳米粒子，其具备较高的磁含量已被广泛应用于癌症检测及治疗领域。Nie研究小组通过采用溶胀渗透法将半导体纳米颗粒量子点包埋进多孔微球，利用微球表面羧基官能团将DNA链段连接在微球表面作为探针，进行了DNA特异性检测。Ahjeong Son小组采用模板自组装法，在磁性微球表面通过酰胺键包覆量子点壳层从而形成具备光磁双重特性复合微球，并应用于核酸检测。Yong Zhang研究小组，利用微乳液聚合法制备了复合有上转换发光稀土纳米颗粒的微球。这种微球在红外激发下具备特殊荧光性能的复合微球，其在医学成像领域具有广阔的应用前景。 

经对现有技术的文献搜索发现，中国专利申请号：200410073449.7，名称为“一种高分子/无机物复合微球的制备方法”的发明，提出首先将活性预聚物吸附在无机颗粒表面，之后引发聚合形成无机颗粒复合微球的方法，中国专利申请号200810019950.3，名称为“纳米微米复合微球制备方法”的发明，提出通过化学方法将纳米颗粒键合到微球表面制得纳米颗粒复合微球的方法，中国专利申请号：201010593883.3，名称为“制备有机/无机复合微球的制备方法”的发明，采用先溶胀聚合物微球，后将溶胀溶剂加热挥发的方法制备了无机纳米颗粒复合聚合物微球。但以上制备复合微球所采用方法的原理仍基于上面所述的各种传统制备无机纳米颗粒复合微球的方法，存在其固有系统缺陷，无法制备得到粒径为微米级、均一可控、分散性好的功能性纳米颗粒复合微球。 

膜乳化技术是制备均一粒径的单分散乳液最简单有效的方法，它是通过无机膜微孔将分散相在外加压力的作用下，压入连续相中形成乳状液，通过控制分散压力和膜孔径，实现乳状液滴的单分散性。通过膜乳化法可以制备O／W、W／O型单重乳状液，或在单重乳状液的基础上经过二次乳化形成多重乳状液，再经过某些物化反应将液滴转换为固相，例如非水溶性液滴通过溶剂蒸发可以转化为高分子微球。通过膜乳化技术制备的单分散高分子微球有许多独特的特点：小的尺寸和体积，均一的粒径且粒径分布可控，大的比表面积，优良的孔隙率，各功能团体的分布具有理想表面密度，稳定的分散性等。 

包德才等使用PS（聚苯乙烯）二氯甲烷溶液作为分散相，含有十二烷基硫酸钠（SDS）的水溶液为连续相，在外加压力作用下，将分散相通过SPG膜微孔分散到连续相中，制备出呈单分散的O／W型乳状液。然后利用液中干燥法，将膜乳化法制备的O／W型乳状液迅速转移至40℃的恒温槽中，低速搅拌4-6 h。随着分散相溶剂二氯甲烷不断向连续相扩散并逐渐挥发除去，PS逐渐析出，最终固化成Ps微球。采用膜乳化-液中干燥法所制备的PS微球经扫描电子显微镜观测发现其表面光滑，球形度好，粒径呈很好的单分散性。 

Gasparini等采用膜乳化技术制备了一种可生物降解的单分散药物载体微球—聚乳酸／乙醇酸共聚物（PLGA）微球。 

中国期刊《功能高分子学报》2011年3月Vol.24 No.1刊出的文章“膜乳化-溶剂挥发法制备表面羧基功能化苯乙烯-马来酸酐共聚物微球”，以苯乙烯-马来酸酐共聚物（PSMA）为原料，利用膜乳化-溶剂挥发法，成功制备了表面光滑、尺寸均一的表面羧基功能化聚合物微球。 

但是目前还未见利用膜乳化技术成功制备功能性纳米颗粒复合非交联微球的相关报道。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末。 

本发明的再一的目的是，提供一种功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末的制备方法。 

本发明的另一的目的是，提供一种功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末的用途。 

本发明的第四个目的是，提供一种基于功能性纳米颗粒复合非交联微球的生物检测探针。 

本发明的第五个目的是，提供一种基于功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末的生物检测探针的用途。 

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是： 

一种功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末，它包含功能性纳米颗粒复合非交联微球，所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球包含功能性纳米颗粒和聚合物，平均粒径为0.1-20μm，粒径分布变异系数≤9.1%。

所述的功能性纳米颗粒是下列中的一种或几种：量子点、磁性纳米颗粒、荧光纳米颗粒、金属纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒或半导体纳米颗粒。 

所述的量子点是下列中的一种或几种：CdS、HgS、CdSe、CdTe、ZnSe、HgSe、ZnTe、ZnO、PbSe、HgTe、CaAs、InP、InCaAs、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdS/ZnS、Cd/Ag 2S、CdS/Cd(OH)₂、CdTe/ZnS、CdTe/CdS、CdSe/ZnSe、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CuSe、CdSeTe、CdSeTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS，以及掺杂量子点CdS:Mn、CdS:Mn、CdS:Cu、ZnS:Cu、CdS:Tb、ZnS:Tb。 

所述的聚合物是下列中的一种或几种：聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚酰胺、聚丙烯腈、聚碳酸酯、聚己内酯、聚氨酯、聚乳酸、壳聚糖、白蛋白、胶原、聚苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙酯、聚苯乙烯-丙烯酸共聚物、聚苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物或聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物。 

所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球经表面改性连有官能团。 

所述的表面改性是下列中的一种或几种：水解、化学接枝或磺化。 

所述的官能团是下列中的一种或几种：羧基、氨基、磺酸根基、硝基、羟、氯基或酯基。 

所述的官能团上还连接有以下连接物中的一种或几种：N-羟基琥珀酰亚胺、生物素、亲和素或抗生蛋白链菌素。 

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是： 

一种如上任一所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

a）制备分散相，所述的分散相包括功能性纳米颗粒和聚合物溶液；

b）制备连续相，所述的连续相包括去离子水及溶于水的稳定剂和/或乳化剂；

c）利用膜乳化装置在气体压力作用下挤压分散相通过多孔膜以液滴形式进入到连续相中，在连续相剪切力作用下得到液滴粒径均一的单分散乳液；

d）通过溶剂蒸发法获得功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末。

所述的步骤a）中聚合物溶液为有机溶剂中溶解有聚合物的溶液。 

所述的有机溶剂是疏水性有机溶剂。 

所述的疏水性有机溶剂选自下列中的一种或几种：甲苯、二甲苯、对氯甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、石油醚、正己烷或环己烷。 

所述的聚合物溶液的浓度是0.5-2 g/mL。 

所述的步骤a）中功能性纳米颗粒的浓度是0.5-1 nM/L。 

所述的步骤b）中稳定剂和/或乳化剂选自下列中的一种或几种：十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇或吐温20。 

所述的步骤c）中多孔膜是SPG多孔膜、陶瓷多孔膜或MPG多孔膜。 

所述的多孔膜的孔径是0.5-5 μm。 

所述的步骤c）中气体压力的大小是15-30 KPa。 

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是： 

如上任一所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末在检测样品中一种或多种目标物中的应用。

所述目标物是蛋白质及其片段、核酸等生物大分子或化合物。 

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是： 

一种基于功能性纳米颗粒复合非交联微球的生物检测探针，所述的生物检测探针包含如上任一所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末，所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球的表面偶联有探针分子。

所述的探针分子选自下列中的一种或几种：蛋白质、蛋白质片段或核酸。 

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是： 

如上所述的生物检测探针在检测样品中一种或多种目标物中的应用。

所述目标物是蛋白质及其片段、核酸等生物大分子或化合物。 

本发明优点在于： 

本发明通过膜乳化技术结合溶剂挥发法制备得到功能性纳米复合非交联微球粉末，该方法产量高，且制得的功能性纳米复合非交联微球粒径粒径属于微米级、均一可控、变异系数小（≤9.1%），单分散性好，性能优良，在生物检测和生物医药领域具备广阔的应用前景，例如：

（1）基于本发明的功能性纳米复合非交联微球的生物检测探针较现有探针使用更方便，检测结果更加准确可靠，对含有目标物的样品可同时实现定性和定量分析；

（2）传统方法制备的功能性纳米颗粒复合微球很难得到粒径大小和粒径分布可控的微球，而微球粒径的大小和分布是影响药物释放、药物性能及安全性的关键因素，因此，本发明的功能性纳米颗粒复合非交联微球可作为优良的药物载体，具备化学稳定性高、无毒的优点。

但是本发明的功能性纳米复合非交联微球的应用不仅限于此，其还可应用于工业催化、化工合成、电子信息、建筑材料等领域。 

附图说明

附图1是实施例2的复合非交联微球扫描电镜照片。 

附图2是实施例7的复合非交联微球荧光显微镜照片。 

附图3是实施例7的生物检测探针检测乙肝病毒表面抗原HBsAg结果。 

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。 

以下实施例中使用的膜乳化装置为压力式膜乳化装置, 购自日本 SPG technology 公司；MPG膜购自日本Ise Chemical公司，为适用于压力式膜乳化装置的亲水膜；PG膜购自日本SPG technology公司，为适用于压力式膜乳化装置的亲水膜；陶瓷膜购自德国Membraflow公司，为适用于压力式膜乳化装置的亲水膜。 

下述实施例中，平均粒径的计算方法是：随机将200个微球的粒径取平均值，平均粒径记为D_av。粒径分布变异系数CV的计算方法是： 

，其中D_i是第i个微球的粒径，D_av是微球的平均粒径。

复合微球表面羧基的EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺）活化、探针分子的连接、抗原(HBsAg)的异硫氰酸荧光素标记等操作均为临床免疫检测诊断的基本操作，具体可参照《临床免疫学检验实验指导》，作者：吕世静，出版社：中国医药科学出版社。 

实施例1  复合非交联微球粉末的制备（一）

将聚苯乙烯-丙烯酸共聚物和金纳米颗粒溶于甲苯中，聚苯乙烯-丙烯酸共聚物浓度为1 g/mL，金纳米颗粒浓度为1 nM/L，以之作为分散相。采用孔径为0.5μm的MPG多孔膜，利用压力为30 KPa的氮气将分散相挤压过膜，进入含有乳化剂SDS浓度为1 wt.%的水连续相，连续相的流速是0.35 m/s，得到液滴粒径均一的水包油乳液。于25 ℃和350 rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发。待溶液中甲苯完全挥发后，对得到的金纳米颗粒复合微球悬浮液进行离心收集。之后经去离子水离心洗涤3次，无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到表面带有羧基的金纳米颗粒复合微球的固体粉末。经扫描电镜观察，所制备的金纳米颗粒复合微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为2.0 μm，粒径分布变异系数CV为9.1%左右。

实施例2  复合非交联微球粉末的制备（二）

将聚苯乙烯-马来酸酐共聚物和发射波长为528 nm的CdSe/CdS量子点溶于甲苯中，聚合物浓度为1 g/mL，量子点浓度为1 nM/L，以之作为分散相。采用孔径为5 μm的SPG多孔膜，利用压力为15 KPa的氮气将分散相挤压过膜，进入含有乳化剂SDS浓度为1 wt.%的水连续相，连续相的流速是0.35 m/s，得到液滴粒径均一的水包油乳液。于25 ℃和350 rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发。待溶液中甲苯完全挥发后，对得到的量子点标记荧光微球悬浮液进行离心收集。之后经去离子水离心洗涤3次，无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到量子点复合微球的固体粉末。

将0.1 g量子点复合荧光微球分散在15mL 0.01 mol/L的盐酸中制成悬浮液，磁力搅拌8 h，待聚合物上的酸酐官能团水解为羧基后，提取出部分悬浮液，用体积比1/1去离子水洗涤（直至水解微球的悬浮液pH稳定在6.2左右），之后冷冻干燥，得到表面羧基功能化的量子点复合荧光微球。 

经扫描电镜观察，所制备的量子点复合荧光微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为6.5 μm，粒径分布变异系数CV为8.7%左右，单分散性较好，见附图1。 

实施例3  复合非交联微球粉末的制备（三）

将聚苯乙烯和Fe₃O₄磁性纳米颗粒溶于氯仿中，聚苯乙烯浓度为0.5 g/mL，Fe₃O₄磁性纳米颗粒浓度为1 nM/L，以之作为分散相。采用孔径为4 μm的SPG多孔膜，利用压力为21 KPa的氮气将分散相挤压过膜，进入含有0.5 wt.% 乳化剂SDS 和0.5 wt.% 稳定剂PVA的水连续相，连续相的流速是0.40 m/s，得到液滴粒径均一的水包油乳液。于25 ℃和350 rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发。待溶液中氯仿完全挥发后，对得到的微球悬浮液用磁力进行分离收集。并用去离子水离心洗涤3次，无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到Fe₃O₄纳米颗粒复合磁性微球的固体粉末。经扫描电镜观察，制备的Fe₃O₄纳米颗粒复合磁性微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为4.2 μm，粒径分布变异系数CV为7.9%左右，单分散性较好。

实施例4  复合非交联微球粉末的制备（四）

将聚甲基丙烯酸和银纳米颗粒溶于二氯甲烷中，聚甲基丙烯酸浓度为2g/mL，银纳米颗粒浓度为0.5 nM/L，以之作为分散相。采用孔径为1 μm的SPG多孔膜，利用压力为32 KPa的氮气将分散相挤压过膜，进入含有0.9 wt.% 乳化剂SDS 和0.1 wt.% 稳定剂吐温-20的水连续相，连续相的流速是0.35 m/s，得到液滴粒径均一的水包油乳液。于25 ℃和350 rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发。待溶液中二氯甲烷完全挥发后，对得到的银纳米颗粒复合微球悬浮液进行离心收集。之后经去离子水离心洗涤3次，无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到银纳米颗粒复合微球的固体粉末。经扫描电镜观察，制备的银纳米颗粒复合微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为1.1 μm，粒径分布变异系数CV为7.2%左右，单分散性较好。

实施例5  复合非交联微球粉末的制备（五）

将聚甲基丙烯酸甲酯和TiO₂纳米颗粒溶于氯仿中，聚甲基丙烯酸甲酯浓度为0.5 g/mL，TiO₂纳米颗粒浓度为0.5 nM/L，以之作为分散相。采用孔径为4 μm的SPG多孔膜，利用压力为21 KPa的氮气将分散相挤压过膜，进入含有0.1 wt.% 乳化剂SDS 和1 wt.% 稳定剂PVA的水连续相，连续相的流速是0.38 m/s，得到液滴粒径均一的水包油乳液。于25 ℃和350 rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发。待溶液中氯仿完全挥发后，对得到的TiO₂纳米颗粒复合微球悬浮液进行离心收集。之后经去离子水离心洗涤3次，无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到TiO₂纳米颗粒复合微球的固体粉末。经扫描电镜观察，制备的TiO₂纳米颗粒复合微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为5.2 μm，粒径分布变异系数CV为7.7%左右，单分散性较好。

实施例6  复合非交联微球粉末的制备（六）

将聚苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物和发射波长为550 nm的CdSe/CdS/ZnS量子点和金纳米颗粒溶于二甲苯中，聚苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物浓度为1.5 g/mL，量子点浓度为0.5 nM/L，金纳米颗粒浓度为0.2 nM/L，以之作为分散相。采用孔径为5 μm的陶瓷多孔膜，利用压力为18 KPa的氮气将分散相挤压过膜，进入0.5 wt.% 乳化剂SDS 和0.5 wt.% 稳定剂PVA的水连续相，连续相的流速是0.35 m/s，得到液滴粒径均一的水包油乳液。于25 ℃和350 rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发。待溶液中二甲苯完全挥发后，对得到的量子点/金纳米颗粒复合微球悬浮液进行离心分离收集。并用去离子水离心洗涤3次，无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到表面带有羧基的量子点/金纳米颗粒复合微球的固体粉末。经扫描电镜观察，制备的的量子点/金纳米颗粒复合微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为6.2 μm，粒径分布变异系数CV为9.1%左右，单分散性较好。

实施例7  复合非交联微球粉末的制备（七）

将聚苯乙烯-丙烯酸共聚物和发射波长为680 nm的CdSeTe量子点和Fe₃O₄磁性纳米颗粒溶于甲苯中，聚苯乙烯-丙烯酸共聚物浓度为2 g/mL，量子点浓度为1 nM/L，Fe₃O₄磁性纳米颗粒浓度为1 nM/L，以之作为分散相。采用孔径为5μm的SPG多孔膜，利用压力为20 KPa的氮气将分散相挤压过膜，进入含有乳化剂SDS浓度为1 wt.%的水连续相，连续相的流速是0.40 m/s，得到液滴粒径均一的水包油乳液。于25 ℃和350 rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发。待溶液中甲苯完全挥发后，对得到的量子点标记荧光微球悬浮液用磁力进行分离收集。并用去离子水离心洗涤3次，无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到表面带有羧基的量子点/Fe₃O₄复合荧光磁性微球的固体粉末。经荧光显微镜观察和电镜扫描观察，制备的量子点/Fe₃O₄复合荧光磁性微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为6.3μm，粒径分布变异系数CV为9%左右，单分散性较好，见附图2。

实施例8  复合非交联微球粉末的制备（八）

将聚苯乙烯-马来酸酐共聚物和激发波长为580 nm的NaYF₄稀土纳米颗粒溶于甲苯中，聚苯乙烯-马来酸酐共聚物浓度为2 g/mL，NaYF₄稀土纳米颗粒浓度为1 nM/L，以之作为分散相。采用孔径为3 μm的SPG多孔膜，利用压力为20 KPa的氮气将分散相挤压过膜，进入含有乳化剂SDS浓度为1 wt.%的水连续相，连续相的流速是0.40 m/s，得到液滴粒径均一的水包油乳液。于25 ℃和350rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发。待溶液中甲苯完全挥发后，对得到的稀土纳米颗粒复合荧光微球悬浮液进行离心收集。之后经去离子水离心洗涤3次，无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到稀土纳米颗粒复合荧光微球的固体粉末。

将0.1 g稀土纳米颗粒复合荧光微球分散在15mL 0.01 mol/L的盐酸中制成悬浮液，磁力搅拌8 h，待聚合物上的酸酐官能团水解为羧基后，提取出部分悬浮液，用体积比1/1去离子水洗涤（直至水解微球的悬浮液pH稳定在6.2左右），之后冷冻干燥，得到表面羧基功能化的稀土纳米颗粒复合荧光微球。 

经扫描电镜观察，制备的稀土纳米颗粒复合荧光微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为5.8 μm，粒径分布变异系数CV为8.9%左右，单分散性较好。 

实施例9  复合非交联微球粉末的制备（九）

配制两种分散相：第一种将聚苯乙烯-马来酸酐共聚物和激发波长为528 nm的CdSe/CdS量子点溶于甲苯中，聚苯乙烯-马来酸酐共聚浓度为1 g/mL，量子点浓度为1 nM/L；第二种将聚苯乙烯-马来酸酐共聚物和激发波长为680 nm的CdSeTe量子点溶于甲苯中，聚苯乙烯-马来酸酐共聚浓度为1 g/mL，量子点浓度为1 nM/L。之后采用孔径为5 μm的SPG多孔膜，利用压力为15 KPa的氮气分别将两种分散相挤压过膜，各自进入含有乳化剂SDS浓度为1 wt.%的水连续相，连续相的流速是0.37 m/s，从而得到两种液滴粒径均一的水包油乳液。两种乳液各自于25 ℃和350 rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发。待溶液中甲苯完全挥发后，对得到的量子点标记荧光微球悬浮液进行离心收集。之后经去离子水离心洗涤3次，无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到发射波长分别在528 nm和680 nm的两种量子点标记复合微球的固体粉末。

之后将不同发射波长的0.1 g量子点复合荧光微球分别分散在15mL 0.01 mol/L的盐酸中制成悬浮液，磁力搅拌8 h，待聚合物上的酸酐官能团水解为羧基后，提取出部分悬浮液，用体积比1/1去离子水洗涤（直至水解微球的悬浮液pH稳定在6.2左右），冷冻干燥，得到表面羧基功能化的量子点复合微球。 

经扫描电镜观察，制备的两种量子点复合微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为6.5-6.6 μm，粒径分布变异系数CV为8.7%-8.8%左右，单分散性较好。 

实施例10  复合非交联微球粉末的制备（十）

将聚苯乙烯-马来酸酐共聚物和发射波长为528 nm的CdSe/CdS量子点溶于甲苯中，聚合物浓度为1 g/mL，量子点浓度为1 nM/L，以之作为分散相。采用孔径为16 μm的SPG多孔膜，利用压力为8 KPa的氮气将分散相挤压过膜，进入含有乳化剂SDS浓度为1 wt.%的水连续相，连续相的流速是0.35 m/s，得到液滴粒径均一的水包油乳液。于25 ℃和350 rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发。待溶液中甲苯完全挥发后，对得到的量子点标记荧光微球悬浮液进行离心收集。之后经去离子水离心洗涤3次，无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到量子点复合微球的固体粉末。

将0.1 g量子点复合荧光微球分散在15mL 0.01 mol/L的盐酸中制成悬浮液，磁力搅拌8 h，待聚合物上的酸酐官能团水解为羧基后，提取出部分悬浮液，用体积比1/1去离子水洗涤（直至水解微球的悬浮液pH稳定在6.2左右），之后冷冻干燥，得到表面羧基功能化的量子点复合荧光微球。 

经扫描电镜观察，所制备的量子点复合荧光微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为20 μm，粒径分布变异系数CV为8.2%左右，单分散性较好。 

实施例11  复合非交联微球粉末的制备（十一）

将聚甲基丙烯酸和银纳米颗粒溶于二氯甲烷中，聚甲基丙烯酸浓度为2g/mL，银纳米颗粒浓度为0.5 nM/L，以之作为分散相。采用孔径为0.1 μm的SPG多孔膜，利用压力为45 KPa的氮气将分散相挤压过膜，进入含有0.9 wt.% 乳化剂SDS 和0.1 wt.% 稳定剂吐温-20的水连续相，连续相的流速是0.35 m/s，得到液滴粒径均一的水包油乳液。于25 ℃和350 rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发。待溶液中二氯甲烷完全挥发后，对得到的银纳米颗粒复合微球悬浮液进行离心收集。之后经去离子水离心洗涤3次，无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到银纳米颗粒复合微球的固体粉末。经扫描电镜观察，制备的银纳米颗粒复合微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为0.1 μm，粒径分布变异系数CV为7.4%左右，单分散性较好。

实施例12  基于功能性纳米颗粒复合非交联微球的生物检测探针（一）

    将实施例7所制备的量子点/Fe₃O₄复合微球的表面羧基在EDC活化下，连接上N-羟基琥珀酰亚胺，然后再连接乙肝病毒表面抗体(HBsAb)作为探针分子。量子点复合荧光微球在表面连接HBsAb后形成特异性检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的生物检测探针。将这种生物检测探针投入到含有乙肝病毒表面抗原(HBsAg)中的样品中反应后，再将探针上连接的目标物即乙肝病毒表面抗原(HBsAg)用异硫氰酸荧光素标记。最后反应后的生物检测探针在激光激发下发出荧光信号，通过微球内部量子点荧光信号和探针分子上所连接的目标物的标记荧光信号强度对样品内的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)进行定性与定量分析。检测结果见附图3，从图中可以看出，当检测的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的浓度为0-500 ng/ml时，其荧光标记强度（即异硫氰酸荧光素标记的强度）随着抗原(HBsAg)浓度的增加而增加，呈现正比关系。

实施例13  基于功能性纳米颗粒复合非交联微球的生物检测探针（二）

    将实施例8所制备的稀土纳米颗粒复合微球在EDC活化下，连接上序列为5′-TCA AGG CTC AGT TCG AAT GCA CCA TA-3′的DNA链段作为探针分子，形成特异性检测DNA的生物检测探针。将这种生物检测探针投入到含有5′-TAT GGT GCA TTC GAA CTG AGC CTT GA-3′的DNA链段的样品中反应后，再将探针上所连接的目标物，即序列为5′-TAT GGT GCA TTC GAA CTG AGC CTT GA-3′的DNA链段用Cascade蓝标记。最后经处理过的稀土纳米颗粒复合微球在红外激光激发下发出荧光信号，通过微球内部稀土纳米颗粒荧光信号和探针分子上所连接的目标物的标记荧光信号对5′-TAT GGT GCA TTC GAA CTG AGC CTT GA-3′的DNA链段进行定性与定量分析。

实施例14  基于功能性纳米颗粒复合非交联微球的生物检测探针（三）

    将实施例9所制备的量子点复合微球的表面羧基在EDC活化下，连接上N-羟基琥珀酰亚胺。然后，528 nm量子点复合微球进一步连接乙肝病毒表面抗原(HBsAg)作为检测探针分子。528 nm量子点复合微球在表面连接抗原(HbsAg)后形成特异性检测乙肝病毒表面抗体(HBsAb)的生物检测探针。690 nm量子点复合微球连接乙肝病毒e抗原(HBeAg)作为检测探针分子。690 nm量子点复合微球在表面连接抗原(HbeAg)后形成特异性检测乙肝病毒e抗体(HBeAb)的生物检测探针。将这两种生物检测探针一起投入到同时含有乙肝病毒表面抗体(HbsAb)和乙肝病毒e抗体(HBeAb)中的样品中反应后，将探针上连接的目标物再用藻红蛋白标记。反应后的生物检测探针在激光激发下发出荧光信号，微球内部量子点荧光在528 nm的为HBsAb检测结果，微球内部量子点荧光在680 nm的为HBeAb检测结果，再通过探针分子上所连接的目标物的标记荧光强度对样品内HBsAb和HBeAb各自进行定量分析。

针对上述实施例1-12，需要说明的是，上述实施例并非穷举，所属技术领域的技术人员应当知道，所述的功能性纳米颗粒还可以是半导体纳米颗粒；所述的功能性纳米颗粒还可以是以下量子点：CdS、HgS、CdSe、CdTe、ZnSe、HgSe、ZnTe、ZnO、PbSe、HgTe、CaAs、InP、InCaAs、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdS/ZnS、Cd/Ag 2S、CdS/Cd(OH)₂、CdTe/ZnS、CdTe/CdS、CdSe/ZnSe、CdS/HgS、CdS/HgS /CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CuSe、CdSeTe/CdS/ZnS，以及掺杂量子点CdS:Mn、CdS:Mn、CdS:Cu、ZnS:Cu、CdS:Tb、ZnS:Tb；所使用的聚合物还可选自：聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸乙酯、聚酰胺、聚丙烯腈、聚碳酸酯、聚己内酯、聚氨酯、聚乳酸、壳聚糖、白蛋白、胶原、聚乙酸乙酯或聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物；制得的复合非交联微球表面改性的方法还可以是化学接枝或磺化；经表面改性还可连接有以下官能团中的一种或几种：氨基、磺酸根基、硝基、羟、氯基或酯基，并可通过官能团连接以下连接物：生物素、亲和素或抗生蛋白链菌素。 

本发明的基于功能性纳米颗粒复合非交联微球的生物检测探针可用于检测样品中一种或多种目标物，如用于疾病诊断中检测细胞因子、过敏原和自身免疫反应、HLA分型、SNP检测、肿瘤特异抗原定量检测、多重微生物定量检测等；或用于基础研究中如基因分型、蛋白表达分型、酶-底物分析、核酸研究等；还可运用到食品安全、农兽药残留多重定量检测和司法鉴定等领域。 

具体地，采用本发明的基于复合交联微球的生物检测探针检测样品中一种或多种目标物的方法是： 

（1）将本发明的生物检测探针中的一种或多种组合投入到含有目标物的样品中，探针分子与目标物特异性成键；

（2）对连接在生物检测探针上的目标物进一步用荧光物质进行荧光标记；

（3）利用仪器对生物探针检测结果进行分析。

步骤（1）中所述的目标物包括蛋白质、蛋白质片段或核酸；步骤（2）中所述的荧光物质包括：异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）、碘化丙啶（PI）、化青素（CY5）、叶绿素蛋白（preCP）、藻红蛋白-德克萨斯红、Cascade蓝及表面改性量子点；步骤（3）中，利用仪器对生物探针检测结果进行分析指的是利用仪器，通过对微球内部纳米颗粒性能的测定来对检测样品中的目标物进行定性分析，同时通过对生物检测探针上所连接的目标物标记荧光强度来对检测样品中的目标物进行定量分析；用于检测的常用仪器包括：流式细胞仪、Luminex悬浮式阵列检测系统（美国Luminex公司）、荧光分光光度计、激光共聚焦显微镜、荧光显微镜、震动样品磁强计。 

对生物探针检测结果进行分析进一步包括：利用本发明的复合交联微球内部纳米颗粒性能的测定来对检测样品中的目标物进行定性分析；通过生物检测探针上所连接的目标物标记荧光的强度来对检测样品中的目标物进行定量分析，其中生物检测探针上所连接的目标物标记荧光的强度与检测样品中的目标物浓度成正比关系。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。 

Claims (22)

1.一种功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末，它包含功能性纳米颗粒复合非交联微球，其特征在于，所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球包含功能性纳米颗粒和聚合物，平均粒径为0.1-20μm，粒径分布变异系数≤9.1%。

2.根据权利要求1所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末，其特征在于，所述的功能性纳米颗粒是下列中的一种或几种：量子点、磁性纳米颗粒、荧光纳米颗粒、金属纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒或半导体纳米颗粒。

3.根据权利要求2所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末，其特征在于，所述的量子点是下列中的一种或几种：CdS、HgS、CdSe、CdTe、ZnSe、HgSe、ZnTe、ZnO、PbSe、HgTe、CaAs、InP、InCaAs、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdS/ZnS、Cd/Ag 2S、CdS/Cd(OH)₂、CdTe/ZnS、CdTe/CdS、CdSe/ZnSe、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CuSe、CdSeTe、CdSeTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS，以及掺杂量子点CdS:Mn、CdS:Mn、CdS:Cu、ZnS:Cu、CdS:Tb、ZnS:Tb。

4.根据权利要求1所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末，其特征在于，所述的聚合物是下列中的一种或几种：聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚酰胺、聚丙烯腈、聚碳酸酯、聚己内酯、聚氨酯、聚乳酸、壳聚糖、白蛋白、胶原、聚苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙酯、聚苯乙烯-丙烯酸共聚物、聚苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物或聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物。

5.根据权利要求1所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末，其特征在于，所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球经表面改性连有官能团。

6.根据权利要求5所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末，其特征在于，所述的表面改性是下列中的一种或几种：水解、化学接枝或磺化。

7.根据权利要求5所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末，其特征在于，所述的官能团是下列中的一种或几种：羧基、氨基、磺酸根基、硝基、羟、氯基或酯基。

8.根据权利要求5所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末，其特征在于，所述的官能团上还连接有以下连接物中的一种或几种：N-羟基琥珀酰亚胺、生物素、亲和素或抗生蛋白链菌素。

9.一种权利要求1-8任一所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：

a）制备分散相，所述的分散相包括功能性纳米颗粒和聚合物溶液；

b）制备连续相，所述的连续相包括去离子水及溶于水的稳定剂和/或乳化剂；

c）利用膜乳化装置在气体压力作用下挤压分散相通过多孔膜以液滴形式进入到连续相中，在连续相剪切力作用下得到液滴粒径均一的单分散乳液；

d）通过溶剂蒸发法获得功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤a）中聚合物溶液为有机溶剂中溶解有聚合物的溶液。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂是疏水性有机溶剂。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的疏水性有机溶剂选自下列中的一种或几种：甲苯、二甲苯、对氯甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、石油醚、正己烷或环己烷。

13.根据权利要求9-12任一所述的制备方法，其特征在于，所述的聚合物溶液的浓度是0.5-2 g/mL。

14.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤a）中功能性纳米颗粒的浓度是0.5-1 nM/L。

15.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤b）中稳定剂和/或乳化剂选自下列中的一种或几种：十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇或吐温20。

16.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤c）中多孔膜是SPG多孔膜、陶瓷多孔膜或MPG多孔膜。

17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述的多孔膜的孔径是0.5-5 μm。

18.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤c）中气体压力的大小是15-30 KPa。

19.权利要求1-8任一所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末在检测样品中一种或多种目标物中的应用。

20.一种基于功能性纳米颗粒复合非交联微球的生物检测探针，其特征在于，所述的生物检测探针包含权利要求1-8任一所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球粉末，所述的功能性纳米颗粒复合非交联微球的表面偶联有探针分子。

21.根据权利要求20所述的生物检测探针，其特征在于，所述的探针分子选自下列中的一种或几种：蛋白质、蛋白质片段或核酸。

22.权利要求20或21所述的生物检测探针在检测样品中一种或多种目标物中的应用。

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