CN108431579B - 用于确定对象的流体动力学尺寸的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种用于确定诸如纳米尺寸对象的对象的流体动力学尺寸的方法，所述方法包括以下步骤：‑提供流体界面；‑将所述对象连结到所述流体界面，从而提供连结的对象，由此，所述连结的对象的移动由于连结到所述流体界面而受到限制；‑提供并确定作用在所述连结的对象上的流体动力学剪切力；‑跟踪所述连结的对象的移动；以及‑使用爱因斯坦‑斯莫鲁霍夫斯基关系计算对象的流体动力学尺寸。
Description
技术领域
本公开涉及一种用于确定对象(诸如纳米尺寸对象)的流体动力学尺寸的方法。而且，本公开涉及用于确定对象(诸如纳米尺寸对象)的流体动力学尺寸的系统的用途，该系统包括：容器；用于在所述容器内提供流体界面的装置；提供并确定作用在连结到所述流体界面的对象上的流体动力学剪切力的装置；以及用于跟踪连结到所述流体界面的对象的装置。
背景技术
消费者的需求和行业趋势促进许多不同领域(诸如生物研究、医学诊断、传感器技术以及3D打印)中的对象表征的发展。对象可以是其选择取决于所选技术领域和应用的颗粒。例如，对象可以是金属颗粒、陶瓷颗粒、细胞、病毒、脂质组合体(lipid assemblies)等。接受研究的对象的尺寸可能变化，并且包括具有在微米范围(即，高达100μm)内和/或纳米范围(即，高达500nm)内的尺寸的对象。
经常需要对对象进行分选以便能够进一步研究和/或使用所述对象。为了实现这一点，需要相对于用于被研究的应用的相关参数来表征对象。
对象表征可以基于各种技术，诸如荧光强度和光散射。例如，荧光活化细胞分选(FACS)已经成功用于细胞种群异质性的流式细胞计数启用的详细研究中。因此，FACS已经对各种领域(像免疫学、血液学、药物学或生物基础研究以及医学诊断)具有极大影响。然而，不幸的是，FACS技术限于具有在微米范围内的尺寸的细胞，并且迄今为止还缺乏像病毒、外来体或脂质体的单纳米尺寸对象的基于FACS的分选的报告。
Pospichalova等人的The Journal of extracellular vesicles(2015年4月，文章号25530)公开了流式细胞计数中的典型问题并表明研究整个外来体种群极具挑战性。
因为对象尺寸与对象的物理、化学和/或生物特性相关联，所以要确定的一个最重要的参数就是对象尺寸。该尺寸可以作为核心尺寸或流体动力学尺寸来测量。不幸的是，对象尺寸确定经常是困难或不便的。这对于小对象(诸如在纳米尺寸范围内的对象)尤其如此。
除了来自微小对象的减弱信号之外，针对小对象的对象尺寸确定困难的一个重要原因是如下文在细胞计数分选的背景下说明的对高流速的要求。
细胞计数分选要求足以使(由流动引起的)流体动力学移动超过对象的随机/布朗(Brownian)运动的流速，因为否则将无法控制在分选步骤中所需的对象的定向移动。针对随机运动的测量由对象的扩散系数D给出，该扩散系数D针对球形对象遵循所谓的斯托克斯-爱因斯坦关系(Stokes-Einstein-relation)，该关系将D与波尔兹曼(Boltzmann)常数kB、绝对温度T、动态粘滞度η以及对象的流体动力学半径R相关联：
方程式1(Eq.1)是用于球形对象扩散穿过具有低雷诺(Reynolds)数的液体的斯托克斯-爱因斯坦方程式，其表明随机运动随着对象尺寸R的减小而增大，这暗示如果想要降低可分选对象的尺寸下限则必须增大流速。更高流速的直接结果是对象穿过读出/表征体积的通过时间的减少，这导致有效测量时间的减少，从而导致所检测的信号的幅度减小。这些影响使得对于基于体积的流式细胞计数难以对在0.5μm以下的对象进行分选，0.5μm经常被引用为商用流式细胞计数器中对对象进行高保真度分选的尺寸下限。因为大量纳米级对象(即具有1-100nm尺寸的对象)表现为非均质混合物，所以该限制具有重要的实际意义。例如，因为病毒、细胞外囊泡(extracellular vesicles)和外来体以及天然和合成脂质体相对于尺寸经常是非均质的，这使得它们的生物功能(例如，外来体和病毒)或适用性(例如，目的在于靶向药物传送的脂质体)的分析复杂，所以它们将极大受益于单对象分选能力。
WO 03/093801公开了一种被称为纳米颗粒跟踪分析(NTA)的单颗粒跟踪方法。对象尺寸通过对从3D轨迹提取的体积扩散系数应用斯托克斯-爱因斯坦关系来确定(参见WO03/093801的权力要求14)。
WO 2013/021185描述了NTA与动态光散射的组合，该组合主要将可溶解颗粒尺寸的范围扩大到μm级。
US 2004/0169903和US 2014/0333935描述了通过使用全息视频显微镜增强位置确定的精度的颗粒尺寸确定。
上述文献全部依赖斯托克斯-爱因斯坦关系，并且它们的方法包括以下步骤：使对象悬浮在流体中，使得它们可以三维地移动。如本文所说明的，这使得小对象的尺寸测量困难。
Langmuir，2006年，第22卷，第2384-2391页公开了将单层囊泡束缚在微流体通道内的受支持的二维流体双层上，随后对囊泡位置进行流体动力学或电泳操纵。没有提及被束缚囊泡的流体动力学尺寸的分选和/或测量。
因此，仍然需要用于测量对象尺寸的另选方法。
本公开的目的是提供一种满足所述需要的方法。
发明内容
以上所提及的目的由一种用于确定对象(诸如纳米尺寸对象)的流体动力学尺寸的方法来实现，所述方法包括以下步骤：
-提供流体界面；
-将所述对象连结到所述流体界面，从而提供连结的对象，由此，所述连结的对象的移动由于连结到所述流体界面而受到限制；
-提供作用在所述连结的对象上的流体动力学剪切力并确定其大小；以及
-跟踪所述连结的对象的移动。
还提供了一种用于确定对象(诸如纳米尺寸对象)的流体动力学尺寸的系统，该系统包括以下组件或由以下组件构成：
-容器；
-用于在所述容器内提供流体界面的装置；
-提供作用在与所述流体界面相连结的对象上的流体动力学剪切力的装置；以及
-用于跟踪与所述流体界面相连结的对象的装置。
描述
根据本公开，提供了一种用于确定对象(诸如纳米尺寸对象)的流体动力学尺寸的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供流体界面；
-将所述对象连结到所述流体界面，从而提供连结的对象，由此，所述连结的对象的移动由于连结到所述流体界面而受到限制；
-提供作用在所述连结的对象上的流体动力学剪切力并确定其大小；以及
-跟踪所述连结的对象的移动。
还提供了一种用于确定对象(诸如纳米尺寸对象)的流体动力学尺寸的系统，该系统包括以下组件或由以下组件构成：
-容器；
-用于在所述容器内提供流体界面的装置；
-提供作用在与所述流体界面相连结的对象上的流体动力学剪切力的装置；以及
-用于跟踪与所述流体界面相连结的对象的装置。
容器可以是用于微流通道的容器。对象可以如本文所描述的。例如，对象可以包括金属、有机材料、无机材料、生物材料及其任何组合或由它们构成。生物材料可以从由一个或更多个蛋白质、病毒、外来体、脂质组合体、核酸、细胞外囊泡及其任何组合构成的组选择。
还提供了用于确定对象(诸如纳米尺寸对象)的流体动力学尺寸的系统的用途，该系统包括以下组件或由以下组件构成：
-容器；
-用于在所述容器内提供流体界面的装置；
-提供作用在与所述流体界面相连结的对象上的流体动力学剪切力的装置；以及
-用于跟踪与所述流体界面相连结的对象的装置。
容器可以是用于微流通道的容器。
作为将对象连结到流体界面的结果，所连结的对象的移动将受到限制。例如，移动可以被限制在二维平面中。当流体界面是平面的时候可能是这种情况。二维平面的两个维度可以沿x和y方向(x,y)延伸。
本公开基于以下意想不到的发现：对象的尺寸(诸如流体动力学尺寸)可以通过将对象连结到流体界面来确定，从而减小所得到的连结的对象的扩散系数和随机运动。因此，与像纳米颗粒跟踪分析(NTA)的方法相比，对象尺寸确定无法基于随机运动，并因此，如何完成对象尺寸确定和/或分选不可预测。相反，本公开使用连结的对象的扩散性和速度(即，通过测量和/或计算)的确定使得能够确定流体动力学剪切力，并因此使得能够确定对象的流体动力学尺寸。对象的速度可以由流体(诸如液体)的流动而引起。如本文所说明的，因为连结的对象的扩散系数和速度这二者都取决于连结物的移动特性，所以连结物移动性不参与流体动力学剪切力(该剪切力与对象的速度和扩散系数的比成比例)的计算。
有利地，在本公开的方法和/或使用中避免了涉及三维地随机移动的对象的传统测量中所需的高流速，从而促进了对连结的对象的跟踪。
与流体界面相连结的对象与可以三维地自由移动的对象相比更低的扩散系数被认为是由于以下事实：连结物嵌在流体界面中的部分在流体界面内经受相比连结的对象在围绕所述对象的液体中所经受的摩擦远远更高的摩擦。因此，将对象连结到流体界面导致扩散系数被降低比其体积值低几个数量级(方程式1，见上)，这满足将分选推至nm级所需的一个要求。另一方面，与流体界面相连结的对象的扩散性不遵守方程式1，而是由流体界面的扩散性和与膜的连结物的数量来确定。因此，所连结的对象的尺寸无法单独根据它们的扩散性来确定。
在本文所描述的方法和/或使用中，可以以各种方式来提供流体动力学力。例如，其可以由电泳装置、渗透装置、磁装置、对流、通过引起流动以及它们的任何组合来提供。
本文所描述的方法和/或使用还可以包括以下步骤：
-确定作用在所述对象上的所述流体动力学剪切力，从而允许确定所述连结的对象的所述流体动力学尺寸。作用在所述对象上的所述流体动力学剪切力的确定可以涉及对所述对象的扩散系数和速度的测量。因此，提供了还包括以下步骤的方法和/或使用：
-通过测量和/或确定所述对象的扩散系数和速度确定作用在所述对象上的所述流体动力学剪切力，从而允许确定所述连结的对象的所述流体动力学尺寸。
本文所描述的对象可以由任何材料或材料的任何组合来制成。例如，对象可以是均质的，即，由单一材料或单一材料混合物构成。然而，对象也可以是非均质的，即，由多种材料构成。例如，对象可以具有一种材料的核心和另一种材料的鞘。
作为示例，对象可以包括金属、有机材料、无机材料、生物材料或它们的任何组合或由它们构成。金属可以是任何金属，诸如金、铜、镁、其任何组合和/或其任何氧化物、氮化物或碳化物。无机材料可以是陶瓷。陶瓷可以是任何陶瓷，诸如包括硅、锆、铝和/或其任何氧化物、氮化物或碳化物的陶瓷。生物材料可以包括一个或更多个蛋白质、脂质、病毒、外来体、脂质体及它们的任何组合或由它们构成。
要与流体界面相连结的对象可以悬浮或溶解在溶剂中。溶剂的选择将取决于对象。例如，金属颗粒可以悬浮在水溶液中。在另外的示例中，诸如病毒的生物材料可以悬浮或溶解在体液(诸如血液或人工制备的生理溶液)中。另选地，要与流体界面相连结的对象可以被未经稀释地添加，即，不悬浮或溶解在溶剂中。
本文所描述的对象可以具有任何形状。例如，对象可以具有基本上球形、细长形状或具有基本上不规则的形状。
本文所提及的对象尺寸可以是对象的核心尺寸或对象的流体动力学尺寸。在该文献中，对象的流体动力学尺寸意思是包括任何溶解层的对象的尺寸。而且，对象尺寸是指对象的最大横截面尺寸。作为示例，本文所描述的对象可以具有在微米范围内的尺寸或尺寸分布，诸如0.5微米或更小。另选地，对象可以是纳米尺寸的，即，它们具有在纳米范围内的尺寸。在另外的示例中，本文所描述的对象可以具有在纳米范围(诸如从大约1nm至大约500nm、从大约50nm至大约250nm、从大约200nm至大约400nm的范围)内的尺寸或尺寸分布。
尤其是，表述“流体动力学尺寸”旨在意指使用方程式(1)计算出的对象的流体动力学半径，由此，使用本文所描述的方法计算出的对象被假定为具有半径等于该对象的最大横向维度一半的球形。
要与流体界面相连结的对象在尺寸上可以是均匀的或非均匀的。通常，对象在尺寸上是非均匀的。当对象在尺寸上非均匀时，其可能表现出尺寸分布范围。例如，尺寸分布范围可以从大约1nm至500nm、从50nm至250nm、从大约200nm至大约400nm变化。
本文所描述的对象可以是诸如纳米颗粒的颗粒。
本文所描述的流体界面可以是基本上平面或基本上弯曲的。例如，流体界面可以是二维的，即，其可以沿基本上两个维度(诸如长度和阔度)或在(x,y)平面中延伸。第三维度(诸如宽度)可以具有与流体界面的基本上两个维度相比可忽略的大小。可以用于本公开的背景下的流体界面的示例包括膜、单分子层、双分子层、细胞膜、气水界面或油水界面。流体界面可以在具有仅几纳米的界面厚度的同时以微米级或毫米级侧向延伸。双分子层可以是脂质双分子层，诸如支撑脂质双分子层(SLB)。支撑脂质双分子层可以与支撑体(诸如壁)相关联。
对象与流体界面的连结可以使用如本领域中描述的连结策略来发生。例如，连结可以如在Journal of Physical Chemistry B，109(19)，9773-9779中描述的或如在Langmuir，22(13)，5682-5689中描述的来发生。合适地，连结应牢记连结的对象应维持移动性地发生，该移动性使得能够由围绕所述对象的流动引起所述对象的定向运动。设想使用与关联到脂质膜的脂质(例如，胆固醇)或两亲分子(例如，肽或蛋白质)的任何类型的连结来将对象连结到膜。
流体界面可以被包括在脉管(诸如微流通道，即，在微米范围内的通道)内。微流通道可以具有100微米或更小的宽度。流体界面可以位于所述微流通道的壁(诸如内壁)上。壁可以是底壁。流体界面还可以被包括在宏观表面(诸如圆柱形毛细管)内或位于其上。流体界面可以位于圆柱形毛细管的内壁上。而且，流体界面可以位于细胞表面上。流体界面可以被布置成允许所述流体界面相对于所述壁的移动。另选地，流体界面可以附接到所述壁，使得基本上防止所述流体界面相对于所述壁的移动。
在引起微流通道中的流动时，可以沿着二维平面的维度中的一个(诸如所述二维平面的x或y方向)引起流动，从而限制本文所描述的连结的对象的移动。
本公开的方法和/或使用允许跟踪连结到流体界面的对象。因为连结导致连结的对象的扩散的显著降低，所以跟踪可以实时发生，即，检测仪器将以允许基本上同时的检测和分析的方式操作。因此，本公开的方法和/或使用允许实时跟踪连结到流体界面的对象。这在本文所描述的方法和/或使用用于对诸如纳米尺寸的对象进行分选时可以是尤其有用的。
检测仪器可以是能够分析与它每时间单位能够写入的相同数量的帧的显微镜。这是因为否则所跟踪的对象迟早将在通过分析确定它们的特性之前就穿过显微镜的视场，这使得基于它们的特性的分选无法实现。检测还可以基于显微成像(例如，荧光或散射成像)。单颗粒跟踪(SPT)可以用于提取感兴趣的对象特性(例如，移动性、荧光和/或散射成像)。作为示例，本公开的方法和/或使用的跟踪可以是SPT。SPT可以如本文所描述的实时执行。在该文献中，术语“移动性”(μ)意思是对象的最后漂移速度vd与所施加力F的比，即，μ＝vd/F。
本公开的方法和/或使用可以与用于检测连结的对象的另外的方法结合使用。另外的方法可以涉及从由荧光、折射率以及散射强度构成的组选择的一个或更多个技术。
另外，本公开的方法和/或使用可以涉及和/或用于对连结的对象进行分选。因此，本文所描述的方法可以是用于分选对象的方法。分选可以基于诸如对象的流体动力学尺寸的尺寸和/或在本文所描述的另外的方法中的一个或更多个技术。
例如，用于分选的方法或使用可以基于对象的流体动力学尺寸的测量结合对象的荧光和/或散射强度。在这种情况下，分选可以与传统流式细胞计数分选器类似地来执行，并且将呈现适用于在纳米尺寸范围内的对象的优点。
在另外的示例中，本文所描述的用于分选的方法和/或使用可以基于对象的荧光或散射强度对流体动力学尺寸。这具有以下优点：可以独立于荧光或散射强度来确定流体动力学尺寸。因此，能够基于纳米尺寸对象的荧光强度密度来分选对象，该密度通过使所测量的荧光强度根据荧光分子的空间分布分别除以对象的表面积或体积来获得。因此，基于荧光强度密度的分选允许基于荧光分子的浓度来分选对象，例如针对用膜蛋白质标志物(像CD63)或DNA/RNA标志物标记的外来体。类似地，基于散射强度密度的分选允许基于纳米尺寸对象的光学对比密度(并因此基于对象的折射率)来分选对象。这是显著的益处，因为基于蛋白质浓度或折射率的分选是使用传统流式细胞计数器无法获得的。
在又一个示例中，本文所描述的用于分选的方法和/或使用可以基于连结的对象的扩散性和移动性。例如，存在于平面支撑脂质双分子层(SLB)中的跨膜蛋白可以通过将抗体功能化的金纳米颗粒结合到它们来识别，这允许通过在金纳米颗粒上施加剪切力来使感兴趣的跨膜蛋白移动至SLB的用户限定区域。特异性结合到跨膜蛋白的金纳米颗粒然后可以表现出与非特异性结合到单脂质的金纳米颗粒的扩散系数不同的扩散系数。因此，特异性结合的金纳米颗粒可以基于它们不同的扩散系数与非特异性结合的金纳米颗粒区分开，并且基于对象的扩散性/移动性的分选允许通过仅分选出特异性结合的金纳米颗粒来进一步纯化跨膜蛋白。因为扩散性常常还取决于跨膜蛋白的聚集状态，所以还可以设想使用本文所描述的方法和/或使用基于跨膜蛋白质的聚集状态来分选跨膜蛋白。
诸如本文所描述的微流通道的脉管可以被布置成提供对连结的对象的分选。例如，诸如微流通道的脉管可以包括已分选的对象可以送入其中的两个或更多个输出通道。可以存在开关，以促进穿过输出通道的分选。
应理解，本公开的方法和/或使用可以应用于许多不同技术领域中和/或应用于各种目的。本公开的方法和/或使用可以在医学应用(诸如诊断)、生物颗粒(诸如病毒、细胞外囊泡、核酸、蛋白质、其他生物纳米颗粒等)的纯化中作为研究工具用于研究目的。
下面在连结到二维(2D)界面的纳米范围内的对象的背景下概述了作为本公开基础的理论思考。
理论思考
nm尺寸对象到流体界面的连结(图1)可以用于产生远远小于对应体积值的扩散系数(方程式1)，这允许使它们的移动减速。因为这增加观测时间，所以从而将显著简化对象特性(例如，散射或荧光强度)的该详细测量和对象位置的操纵(例如，通过控制通道内的流动)。然而，扩散系数的该减小由于以下事实而引起：移动现在受作用在连结者嵌在流体界面中的部分上的摩擦限制，而不受作用在对象本身上的摩擦限制。这使得不能如在例如像纳米级对象的体积扩散的纳米颗粒跟踪分析(NTA)的方法中进行的直接应用斯托克斯-爱因斯坦关系(方程式1)来从扩散系数提取流体动力学尺寸。在下面的段落中将示出：如果认识到能够沿与流动平行和垂直的方向独立分析对象的移动，则可以规避(连结nm尺寸对象时涉及的)该明显的缺点。这允许同时确定对象的扩散系数和流动引起的定向移动的速度。因为定向移动的速度取决于对象的扩散系数和作用在对象上的流体动力学剪切力Fshear二者，所以可以直接提取Fshear并因此可以直接提取对象的流体动力学尺寸。
为了遵循该简要推理，考虑使连结的对象沿流动的方向移动所施加的流体动力学剪切力Fshear，这生成是随机移动和定向移动的叠加的轨迹(例如，参见图2)。随机移动可以由连结的对象的扩散系数Dlink来表征，而定向移动可以由对象沿流动方向(在下文中被表示为x轴，参见图2)的平均速度vx来量化。爱因斯坦-斯莫鲁霍夫斯基关系(Einstein-Smoluchowski relation)连接定向移动和随机移动，因为其通过
b＝Dlink/kB·T (3)
使由
b＝vx/Fshear (2)
限定的对象的移动性b与扩散系数Dlink相关。
该关系可以从波动耗散定理(fluctuation-dissipation-theorem)来导出，该定理陈述了在平衡态下引起随机波动的那些力(这里是由与连结物互相作用的扩散脂质生成的随机力)在系统经受非随机力(这里是产生定向颗粒移动的剪切力)时还产生耗散/摩擦。将方程式2和方程式3结合产生
Fshear＝kB·T·vx/Dlink。 (4)
因为vx和Dlink可以从轨迹独立提取，所以可以直接计算出作用在nm尺寸对象上的流体动力学剪切力。或者换言之，因为vx和Dlink都取决于连结物的移动特性，所以任何连结物特性不参与产生方程式4的识别。因此，随着流速而且随着流体动力学尺寸增大的、作用在被跟踪对象上的流体动力学剪切力可以使用方程式4根据vx和Dlink直接确定。注意，只要连结的对象的扩散系数受连结物本身的扩散系数支配，这些方程式就保持，假定自由扩散的对象的流体动力学半径R低于大约200nm，对于典型连结物(低于1μm2/s的扩散系数)就满足该条件(参见方程式1)。
公共微流通道的通道高度在该方法中通常远远大于感兴趣的流体动力学尺寸，该通道高度对于低雷诺数允许通过以下方程式来近似抛物线流动分布
vfluid(z)＝v0·(z+λ) (5)
其中，λ表示流动的滑移长度，其对于SLB上的流动处于10nm量级，并且v0表示SLB处的速度的梯度。缩放分析表明在这种流动中作用在球形颗粒上的拖曳力随着在z＝R(对象的中间)处的流速与流体动力学半径R的乘积缩放，这允许将拖曳力写为
Fshear(R)＝A·η·R·vfluid(R)＝A·η·v0·R·(R+λ) (6)
其中，A表示用于说明对象周围的非均质流动分布的前因子。通过使用明确限定尺寸的颗粒的校准测量来确定(先验)未知参数A和λ这两者是最方便的。注意，A和λ都不取决于对象特性，这允许一旦已经使用校准测量确定了A和λ，则使使用方程式6测量的剪切力与流体动力学尺寸R相关。
定义
单颗粒跟踪(SPT)是对介质内的独立颗粒的运动的观察。一系列时间步上的坐标(x,y,z)被称为轨迹。可以对轨迹进行分析以识别运动的模式或运动中的异质性(诸如障碍物或(例如，由于主动运输或流动而产生的)快速运输的区域),在随机运动的情况下，轨迹分析可以提供扩散系数。
纳米尺寸对象旨在意指在纳米尺寸范围内的对象，诸如具有在大约200nm到大约400nm范围内的最大横截面积的对象。
Eq代表方程式。
fN代表毫微微牛顿(10-15N)。
LMS代表最小均方。
DOPE代表1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷酰乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)。
1D代表一维的。
2D代表二维的。
μ代表微。
nm代表纳米。
CD63是在人类中由CD63基因编码的蛋白质。
POPC是化合物1-十六酰-2-油酰-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。
POPC SLB是由POPC制成的支撑脂质双分子层。
TEM代表透射电子显微镜检查。
DLS代表动态光散射。
DNA代表脱氧核糖核酸。
RNA代表核糖核酸。
RAM代表随机存取存储器。
CPU代表中央处理单元。
SUV代表小单层囊泡。
TIRF代表全内反射荧光。
GB代表千兆字节。
NTA代表纳米颗粒跟踪分析。
fps代表每秒的帧。
附图说明
图1示出了针对单个纳米尺寸对象的流体动力学尺寸确定的框架。对象(1)连结(2)到流体界面(3)，并且通过流体动力学力(4)移动，该流体动力学力例如通过施加剪切流(5)来生成。
图2示出了连结到SLB并且经受流体动力学流动的单金纳米颗粒的轨迹。
图3示出了单金纳米颗粒的代表轨迹。沿流动方向的显著定向移动用于确定(通过施加流体动力学剪切力引起的)速度vx，而1D扩散系数从沿两个方向的随机移动来提取。
图4中的a示出了使用图3所示的分解方法提取的金纳米颗粒的1D扩散系数Dx和Dy的比较。
图4中的b示出了比Dx/Dy的直方图(条)，其相对于期望值1的偏差可以通过测量分辨率(实线)来说明。
图5中的a、b以及c示出了金纳米颗粒的速度vx对不同流速的纳米颗粒扩散系数D。
图5中的d示出了金纳米颗粒的速度vx(在通过流速归一化之后)对纳米颗粒扩散系数D，其将来自图5中的a至c的所有数据点折叠到单个主曲线上。
图6中的a示出了针对在尺寸分布上不同的3个金纳米颗粒批次的流体动力学力的直方图。
图6中的b示出了流体动力学半径对针对图6中的a所示的3个校准批次归一化的流体动力学力的依赖性。
图7中的a和b示出了使用电子显微镜检查(a)或使用它们在流动下的2D移动(b)提取的金纳米颗粒批次的尺寸分布的比较。
图7中的c和d示出了使用电子显微镜检查(c)或使用它们在流动下的2D移动(d)提取的另一个金纳米颗粒批的尺寸分布的比较。
图8中的a示出了如从流动下的2D移动提取的SUV样本的尺寸分布。
图8中的b示出了与使用NTA提取的SUV样本相同的SUV样本(如图8中的a中)的尺寸分布。
图9比较如使用DLS(1)或流动下的2D移动(2)提取的SUV样本的尺寸分布。
图10示出了实时SPT分析的流程图。
图11示出了实时跟踪分析的演示。
图12示出了用于单个纳米尺寸对象的尺寸确定和分选的框架。
本公开通过以下非限制性示例来说明。
示例部分
示例1.nm尺寸对象的2D尺寸确定的演示
作为基于2D SPT的尺寸提取的潜在实现，在微流通道内形成POPC SLB，随后将nm尺寸对象连结到SLB。这些对象具有(使用例如TEM分析确定的)明确限定的尺寸并且用于校准测量，或者显示广尺寸分布(例如，囊泡)，该分布通过新型方法(使用流动下的2D SPT)来确定并与所建立的方法(像DLS和NTA)的结果进行比较。图1中给出了设置的示意图。
在第一组实验中，使用金纳米颗粒(其尺寸分布使用电子显微镜检查来确定)。金纳米颗粒的表面使用链霉亲和素功能化，这允许将金纳米颗粒连结到SLB中的生物素共轭脂质。图2示出了金纳米颗粒(流体动力学直径60nm)的典型轨迹。流速被调节成使得在流动方向(被表示为x轴，参见图2)上的移动受定向运动控制。图3中的a给出了单金纳米颗粒(流体动力学直径60nm)的代表轨迹及其到其x分量和y分量(即，到与流动方向平行和垂直的分量)的分解(图3中的b至c)。虽然沿着y轴的移动看起来是纯随机的(图3中的c)，但如由未显示明显移动趋势的y位置的非定向波动所指示的，观察x位置的显著线性增加(图3中的b)，其指示存在沿着流动方向的定向移动。然而，该定向移动被波动叠覆，这引起来自x位置随着时间的完美线性增加的微小干扰。
为了研究这种直观分析是否保持更严格的分析，图3中的d和e中针对被隔开2帧的数据点绘制了沿着该轨迹的x或y坐标的位移：Δx(i)＝x(i+2)-x(i)以及Δy(i)＝y(i+2)-y(i)，其中i表示帧数。对于纯1D扩散(即，当不存在定向移动时)，期望该坐标差的平均值为零，这针对Δy进行观察(图3中的e，细实线)。此外，Δy的方差等于沿y方向观察的均方差位移，并因此等于2·Dy·Δt(其中Δt表示2帧之间的滞后时间)：
var(Δy)＝＜(Δy-＜Δy＞)2＞＝＜Δy2＞＝2·Dy·Δt。 (7)
因此，计算Δy的方差允许沿y方向直接提取扩散系数。这对于具有一个差值的x方向同样适用：由于定向移动，Δx的平均值现在理论上由以下方程式给出
＜Δx＞＝vx·Δt (8)
并因此是非零的(如针对Δx观察到的；图3中的d，细实线)。然而，因为方差在使所有数据点移位恒定偏移(该偏移仅改变平均值)时不变，所以Δx的方差仍然与x方向上的扩散系数成比例，而不管非零平均值如何：
var(Δx)＝＜(Δx-＜Δx＞)2＞＝2·Dx·Δt。 (9)
因此，可以通过计算Δx和Δy的方差独立提取x方向和y方向上的扩散系数，同时对Δx取平均值给出从轨迹提取vx的便利方式(参见图3中的d和e)。
因为SLB是2D各向同性介质，所以期望Dx和Dy应相等。这在图4中进行了测试，图4将针对各被跟踪的金纳米颗粒的Dx和Dy提取的值进行比较，并且示出了两个扩散系数在实验误差内相同(图4中的a中的虚线和图4中的b中的实线)。这演示了数据提取过程使定向颗粒移动和随机颗粒移动成功分离，并且允许将2D扩散系数Dlink计算为Dx和Dy的算术平均值。
根据方程式2、方程式3以及方程式6，期望所观察的速度vx随着(穿过通道的液体的)流速v0和通常在实验中观察的扩散系数Dlink线性缩放(图5)。因此，在通过所应用的流速v0归一化所提取的速度vx(图5中的d)之后，所有数据点折叠到单个线性主曲线(图5中的d中的实线)上。注意，图5中的波动(噪声)随着流速的增加而减小，这归因于以下事实：更高的流速引起连续帧之间的更大颗粒位移，这转而增大vx测量中的信噪比。
因为可以确定流动方向上的速度vx以及扩散系数Dlink二者，所以方程式4的应用允许直接提取作用在各被跟踪纳米颗粒上的流体动力学力。图6中的a示出了针对60nm、100nm以及210nm金纳米颗粒测量的归一化流体动力学力的直方图，呈现了针对60nm金纳米颗粒在1.60fN/(μL/min)、针对100nm金纳米颗粒在4.05fN/(μL/min)以及针对210nm金纳米颗粒在10.83fN/(μL/min)处的峰值。这些测量允许确定方程式6的校准参数A和λ，并因此允许校准用于确定尺寸分布的微流通道(图6中的b，线)。这在图7中进行了演示，图7将(如通过将方程式6应用于所观察的流体动力学剪切力获得的)流体动力学确定的尺寸分布与由金纳米颗粒样本的电子显微成像获得的尺寸分布进行比较。两种方法在将由于在纳米颗粒表面上形成(并且在TEM图像中无法解决)的PEG电晕引起的5nm的移位考虑在内时产生基本上相同的分布。而且，流体动力学确定的尺寸分布使用24.4nm的滑移长度(图7中的b和d中的条；由图6中的b中的加权LMS拟合激发)和64.5nm的滑移长度(图7中的b和d中的虚线；由图6中的b中的LMS拟合来激发)来提取，这表明滑移长度的变化对100nm以下的流体动力学直径的尺寸提取仅具有较小的影响。
作为潜在应用，脂质体的尺寸分布使用新型方法来确定。(由丽丝胺若丹明(lissamine rhodamine)共轭的DOPE的嵌入荧光标记的)脂质体使用如最近在The Journalof Physical Chemistry B，109(19)，9773-9779以及ChemPhysChem,11(5)，1011-1017中描述的胆固醇装配的DNA系链连结到SLB。图8和图9将流体动力学确定的脂质体的尺寸分布(图8中的a和图9中的曲线2)与使用NTA(图8中的b)或DLS(图9中的曲线1)导出的尺寸分布进行比较，这指示互补方法的良好一致。该比较还表明在NTC尺寸分布(图8中的b)中实际上不溶解的、具有<25nm的流体动力学半径的脂质体在流体动力学确定的尺寸分布(图8中的a)中被良好地溶解。该部分的存在由DLS测量来确认(图9)。
示例2.实时跟踪分析的演示
分选明显需要实时进行全跟踪分析，即，跟踪分析必须能够分析显微镜每时间单位能够写入的相同数量帧。这是因为否则所跟踪的对象迟早将在通过分析确定它们的特性之前穿过显微镜的视场，这使得基于它们的特性的分选无法实现。
为了不影响用于记录和存储成像数据的软件的获取性能，决定将整个跟踪分析分成分布在CPU的可用节点间的不同任务。这确保各分析任务不消耗相比与单个节点对应的数量多的CPU资源，这避免了CPU使用中(在数据分析的过程期间)在分别托管图像记录和跟踪分析软件的节点之间的串扰。或换言之，跟踪分析期间的CPU消耗的增加无法馈通到记录软件，这将导致对图像获取速率的负面影响。
跟踪分析被分成5个不同的任务(图9)：1.挑选：图像内的对象的检测和定位(以像素精度)；2.相邻帧之间所检测的对象的连结，以建立跟踪；3.基于质心算法以子像素精度细化所检测的对象的定位；4.如果感兴趣，则提取所检测的对象的整体散射或荧光强度；以及5.将所有这些不同的数据流交织成一个完整的跟踪分析，然后用它来控制通过微流体通道的流动。分析架构允许通过运行这些基础任务的多个副本(各副本分析不同的数据堆)进一步分割数据分析队列(从而增大总分析吞吐量)。这在主机提供足够的节点和数据转移速率时可以轻松扩展架构。另外，一旦对象的连结数据可用，则甚至可以分选跟踪坐标仅部分细化但在确定感兴趣特性时已经提供足够高精度的这些对象。
对连结到如上所述的SLB的脂质体测试实时颗粒跟踪分析的性能。使用单个计算机来控制TIRF显微镜，记录SPT影片并分析所记录的影片，从而可以测试CPU使用率是否保持在指定限制内，即，确保分析节点的高CPU使用率不会馈通到控制TIRF显微镜的节点。计算机装配有3.2GHz Intel i7-3930K CPU，该CPU向12个虚拟节点(分别可以分成2个不同的虚拟节点的6个可超线程(hyperthreadable)物理内核)供应32GB RAM。
对于包含1280×1024个像素和少于100个可跟踪对象的SPT影片，当前实现达到以下每节点数据吞吐量：挑选30fps、连结15fps、细化12fps。使用1个挑选节点、2个连结节点以及2个细化节点确保20fps的恒定数据吞吐量，而不影响控制显微镜的节点的获取速率(图10)。为了推动超过经常被称为实时成像的25fps的极限，必须再次分割数据流，即，使用1个挑选节点、3个连结节点以及3个细化节点(这需要4个物理CPU内核)或减少被跟踪对象的数量。
示例3.连结到流体界面的nm尺寸对象的分选
本公开使得能够使用以下过程来对nm尺寸对象进行分选：
1.对象连结到流体界面(例如，位于微流通道的壁处；图12中的1)，同时使用SPT(例如，使用显微成像，图12中的2，关于实时数据分析(图12中的3))实时跟踪对象的运动。“示例1”和“示例2”部分中公开了该步骤的示例性实现。
2.SPT分析允许提取感兴趣的对象特性，例如折射率对比以及各被跟踪对象的散射或荧光强度。文献中已经描述了合适的分析过程。除了这些已建立的过程之外，在“理论思考”部分中引入的分析方法还允许在连结到流体界面之后导出对象的流体动力学尺寸。这使得能够基于nm尺寸对象的流体动力学尺寸分选这些对象，当(例如，通过测量特定标志物相对于流体动力学外来体尺寸的荧光强度)与蛋白质表达水平或所并入的DNA或RNA的并行识别结合时，这对于例如外来体的分选尤其感兴趣。
3.最后，如果满足给定分选准则的对象到达微流通道的分选区域，则由计算机控制的阀系统(图12中的5)切换2个输出通道(图12中的4a和4b)之间的流动，从而发起实际分选过程。一旦对象成功移动到“分选输出信道”中，则阀被切换回，并且恢复原始流动。
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Claims (23)
1.一种用于确定对象的流体动力学尺寸的方法，所述方法包括以下步骤：
- 提供流体界面，所述流体界面是二维的，
- 将所述对象连结到所述流体界面，从而提供连结的对象，由此，所述连结的对象的移动由于连结到所述流体界面而受到限制，
- 通过引起流体流动提供作用在所述连结的对象上的流体动力学剪切力，
- 通过沿与所述流动平行和/或垂直的方向独立分析所述连结的对象的所述移动确定作用在所述连结的对象上的所述流体动力学剪切力，
- 通过跟踪所述连结的对象的所述移动确定所述连结的对象的扩散系数和速度，以及
- 基于所述扩散系数和所述速度确定所述连结的对象的所述流体动力学尺寸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述对象是纳米尺寸对象。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流体动力学剪切力由电泳装置、渗透装置、磁装置、对流和/或通过引起流动以及它们的任何组合来提供。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述对象是具有在从1 nm至500 nm的范围内的最大横截面尺寸的纳米尺寸对象。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述对象是具有在从50 nm至250 nm的范围内的最大横截面尺寸的纳米尺寸对象。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述对象是具有在从200 nm至400 nm的范围内的最大横截面尺寸的纳米尺寸对象。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述对象是具有在从200 nm至300 nm的范围内的最大横截面尺寸的纳米尺寸对象。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述对象包括有机材料、无机材料、生物材料或它们的任何组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述对象由有机材料、无机材料、生物材料或它们的任何组合构成。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述无机材料是金属。
11.根据权利要求8所述的方法，其中，所述生物材料从由蛋白质、病毒、外来体、脂质组合体、核酸、细胞外囊泡以及它们的任何组合构成的组中选择。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法涉及根据多个所述对象的流体动力学尺寸来对这些对象进行分选。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，实时执行所述跟踪。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流体界面是平面的或弯曲的。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流体界面被包括在微流通道内。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述微流通道是毛细管。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流体界面是膜、单分子层、双分子层、细胞膜、气水界面或油水界面。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流体界面是支撑脂质双分子层。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流体界面位于壁上。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述壁是微流通道的底壁。
21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述壁是毛细管的内壁。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括检测所述对象的步骤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，检测所述对象的所述步骤涉及测量所述对象的荧光、折射率和/或散射强度。
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