ES2881765T3 - Un método para determinar el tamaño hidrodinámico de un objeto - Google Patents
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Abstract
Un método para determinar el tamaño hidrodinámico de un objeto (1), tal como un objeto de tamaño nanométrico (1), dicho método comprende las etapas de: - proporcionar una interfaz de fluido bidimensional (3), - enlazar dicho objeto a dicha interfaz de fluido (3) de esta manera se proporciona un objeto enlazado (1), de manera que el movimiento de dicho objeto enlazado se restringe en virtud de su enlace con dicha interfaz de fluido (3), - proporcionar una fuerza cortante hidrodinámica (4) que actúa sobre dicho objeto enlazado al inducir un flujo de fluido, - seguir el movimiento de dicho objeto enlazado, - determinar, a partir del movimiento seguido, dicho coeficiente de difusión del objeto y dicha velocidad del objeto en la dirección del flujo, en donde dicho movimiento del objeto (1) se analiza independientemente en las direcciones paralelas y perpendiculares al flujo inducido, - determinar dicha fuerza cortante hidrodinámica (4) que actúa sobre dicho objeto (1) a partir de una relación entre dicho coeficiente de difusión determinado y dicha velocidad determinada, y - determinar dicho tamaño hidrodinámico de dicho objeto enlazado a partir de una relación entre dicha fuerza cortante hidrodinámica determinada y la tasa de flujo de fluido.
Description
DESCRIPCIÓN
Un método para determinar el tamaño hidrodinámico de un objeto
Campo técnico
La presente descripción se relaciona a un método de acuerdo con la reivindicación 1 para determinar el tamaño hidrodinámico de un objeto, tal como un objeto de tamaño nanométrico. Además, la presente descripción se refiere al, sin embargo, no cae bajo el alcance de las reivindicaciones, uso de un sistema que comprende un contenedor, medios para proporcionar una interfaz de fluido dentro de dicho contenedor, medios que proporcionan y determinan una fuerza cortante hidrodinámica que actúa sobre un objeto enlazado a dicha interfaz de fluido, y medios para el seguimiento de un objeto enlazado a dicha interfaz de fluido, para determinar el tamaño hidrodinámico de un objeto tal como un objeto de tamaño nanométrico.
Antecedentes
Las necesidades de los consumidores y las tendencias industriales impulsan el desarrollo de la caracterización de los objetos en muchos campos diversos, tales como la investigación biológica, el diagnóstico médico, la tecnología de sensores y la impresión en 3D. Los objetos pueden ser partículas, la elección de cuales depende del campo técnico y de la aplicación seleccionados. Por ejemplo, los objetos pueden ser partículas de metal, partículas de cerámica, células, virus, conjuntos de lípidos, etc. El tamaño del objeto que se investiga puede variar e incluye objetos que tienen un tamaño en el rango de los micrómetros (es decir, hasta 100 pm) y/o en el rango de los nanómetros (es decir, hasta 500 nm).
Con frecuencia es conveniente clasificar los objetos con el fin de permitir un estudio y/o un uso adicional de dicho objeto. Para lograr esto, los objetos necesitan caracterizarse con respecto a los parámetros de relevancia para la aplicación que se investiga.
La caracterización del objeto puede basarse en diversas técnicas, tales como la intensidad de la fluorescencia y la dispersión de la luz. Por ejemplo, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) se ha usado exitosamente en la citometría de flujo, lo que permite investigaciones detalladas de la heterogeneidad de la población celular. Como consecuencia, la FACS tiene un tremendo impacto en diversos campos como la inmunología, la hematología, la farmacología o la investigación básica biológica, así como también en los diagnósticos médicos. Sin embargo, desafortunadamente, la tecnología de FACS se restringe a las células que tienen un tamaño en el rango de los micrómetros y los informes de clasificación basados en la FACS de objetos de tamaño de un solo nanómetro como virus, exosomas o liposomas son hasta ahora escasos. The Journal of extracellular vesicles, 4, 2015, artículo número 25530, Pospichalova y otros, describe los problemas típicos en la citometría de flujo y muestra que es extremadamente desafiante estudiar poblaciones completas de exosomas. Uno de los parámetros más importantes a determinar es el tamaño del objeto, ya que se enlaza a las propiedades físicas, químicas y/o biológicas del objeto. El tamaño puede medirse como el tamaño del núcleo o el tamaño hidrodinámico. Desafortunadamente, la determinación del tamaño del objeto es a menudo difícil o inconveniente. Esto es especialmente cierto para los objetos pequeños como los objetos en el rango de tamaño de nanómetros. Además de las señales disminuidas de los objetos diminutos, una razón importante por la que la determinación del tamaño del objeto para objetos pequeños es difícil es el requisito de altas tasas de flujo, como se explica a continuación en el contexto de la clasificación citométrica.
La clasificación citométrica requiere tasas de flujo que sean lo suficientemente grandes como para que el movimiento hidrodinámico (que se induce por el flujo) exceda el movimiento aleatorio/browniano del objeto, ya que, de cualquier otra manera, no sería posible controlar el movimiento dirigido del objeto requerido en la etapa de clasificación. Una medida del movimiento aleatorio viene dada por el coeficiente de difusión del objeto, D, que para los objetos esféricos sigue la llamada relación de Stokes-Einstein que conecta D con la constante de Boltzmann ks, la temperatura absoluta T, la viscosidad dinámica n y el radio hidrodinámico del objeto R:
D - * b - T (1) 6k ■q - R
La ecuación 1 (Ec.1), que es la ecuación de Stokes-Einstein para la difusión de objetos esféricos a través de un líquido con bajo número de Reynolds, muestra que el movimiento aleatorio aumenta con la disminución del tamaño del objeto R, lo que implica que la tasa de flujo debe aumentarse si uno tiene la intención de reducir el límite de tamaño inferior de los objetos clasificables. Una consecuencia directa de una mayor tasa de flujo es una disminución del tiempo de tránsito de los objetos a través del volumen de lectura/caracterización, lo que conduce a una reducción del tiempo de medición efectivo y, de esta manera, de la magnitud de las señales que se detectan. Estos efectos hacen que sea difícil para la citometría de flujo basada en la masa clasificar objetos que están más abajo de 0,5 pm,
que a menudo se cita como un límite de tamaño inferior para la clasificación de alta fidelidad de los objetos en los citómetros de flujo comerciales. Esta limitación tiene graves implicaciones prácticas, ya que una multitud de objetos nanoscópicos (es decir, objetos que tienen un tamaño de 1 a 100 nm) aparecen como mezclas heterogéneas. Por ejemplo, los virus, las vesículas extracelulares y los exosomas, así como también los liposomas naturales y sintéticos se beneficiarían enormemente de las capacidades de clasificación de un solo objeto, ya que a menudo son heterogéneos con respecto al tamaño, lo que complica el análisis de su función biológica (por ejemplo, los exosomas y los virus) o su aplicabilidad, por ejemplo, los liposomas que tienen como objetivo la administración de fármacos. El documento WO 03/093801 describe un enfoque de seguimiento de una sola partícula, que se conoce como análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). El tamaño del objeto se determina mediante la aplicación de la relación de Stokes-Einstein sobre el coeficiente de difusión de la masa, que se extrae de las trayectorias 3D (véase la reivindicación 14 del WO 03/093801).
El documento WO 2013/021185 describe una combinación de NTA con dispersión de luz dinámica, lo que extiende principalmente el rango de tamaños de partículas resolubles a la escala de |jm.
El documento US 2004/0169903 y US 2014/0333935 describen la determinación del tamaño de la partícula que mejora la precisión en la determinación de la posición mediante el uso de la microscopía de vídeo holográfica.
Todos los documentos anteriores se basan en la relación Stokes-Einstein y sus métodos comprenden la etapa de suspender los objetos en un fluido para que puedan moverse en tres dimensiones. Como se explica en la presente, esto hace que la medición del tamaño de los objetos pequeños sea difícil.
Langmuir, 2006, vol. 22, páginas 2384-2391 describe la atadura de vesículas unilaminares a una bicapa de fluido bidimensional soportada dentro de un canal microfluídico, seguido por la manipulación hidrodinámica o electroforética de la posición de la vesícula. No se menciona la clasificación y/o medición del tamaño hidrodinámico de las vesículas atadas.
Langmuir, vol. 30, No 31, 2014-08-12, páginas 9607-9615 comprende un artículo "Sizing of Metallic Nanoparticles Confined to a Microfluidic Film Applying Dark-Field Particle Tracking" por Christoph Haiden y otros. De acuerdo con el resumen, el artículo presenta el dimensionamiento basado en el movimiento browniano de submicras y nanopartículas individuales en muestras líquidas. La ventaja del enfoque es que las partículas pueden difundirse libremente en una película líquida delgada de 10 pm y, por lo tanto, siempre están dentro de la profundidad focal de un objetivo de apertura numérica baja. Las partículas se visualizan con microscopía de campo oscuro y los puntos resultantes, limitados por la difracción, se siguen en un amplio campo de visión de varios cientos de micrómetros. En consecuencia, se comprueba que se adquieren largas trayectorias en 2D, lo que conduce a un aumento significativo en la precisión del dimensionamiento de las partículas. Se determinaron los diámetros hidrodinámicos de las partículas de metal con tamaños nominales que van desde 70 a 200 nm en solución acuosa mediante un seguimiento de hasta 2 minutos, y se investigó si las características de difusión se influenciaron por la proximidad de los sustratos. Este no fue el caso, y los diámetros estimados estaban en buena concordancia con los valores obtenidos por microscopía electrónica, lo que valida por lo tanto el principio de dimensionamiento de las partículas. Además, se midió una mezcla de muestra para demostrar la distinción de tamaños de partículas cercanos y se realizó la conjugación de una proteína modelo (BSA) en la superficie de la nanopartícula. Se determinó un aumento promedio en el radio de 9 nm, que corresponde al tamaño de la proteína BSA.
Por lo tanto, permanece la necesidad de métodos alternativos para medir el tamaño del objeto.
Es un objetivo de la presente descripción proporcionar un método que satisfaga dicha necesidad.
Resumen
El objetivo que se menciona anteriormente se logra mediante un método de acuerdo con la reivindicación 1 para determinar el tamaño hidrodinámico de un objeto, tal como un objeto de tamaño nanométrico.
También se proporciona un sistema, sin embargo, no cae bajo el alcance de las reivindicaciones, para determinar el tamaño hidrodinámico de un objeto tal como un objeto de tamaño nanométrico que comprende o consiste en:
- un contenedor,
- medios para proporcionar una interfaz de fluido dentro de dicho contenedor,
- medios que proporcionan una fuerza cortante hidrodinámica que actúa sobre un objeto enlazado a dicha interfaz de fluido, y
- medios para el seguimiento de un objeto enlazado a dicha interfaz de fluido.
Descripción
De acuerdo con la presente descripción, se proporciona un método para determinar el tamaño hidrodinámico de un objeto, tal como un objeto de tamaño nanométrico, de acuerdo con la reivindicación 1.
También se proporciona un sistema, sin embargo, no cae bajo el alcance de las reivindicaciones, para determinar el tamaño hidrodinámico de un objeto tal como un objeto de tamaño nanométrico que comprende o consiste en:
- un contenedor,
- medios para proporcionar una interfaz de fluido dentro de dicho contenedor,
- medios que proporcionan una fuerza cortante hidrodinámica que actúa sobre un objeto enlazado a dicha interfaz de fluido, y
- medios para el seguimiento de un objeto enlazado a dicha interfaz de fluido.
El contenedor puede ser un contenedor para un canal microfluídico. El objeto puede ser como se describe en la presente. Por ejemplo, el objeto puede comprender o consistir en un metal, un material orgánico, un material inorgánico, un material biológico y cualquiera de sus combinaciones. El material biológico puede seleccionarse del grupo que consiste en una o más proteínas, virus, exosomas, conjuntos lipídicos, ácidos nucleicos, vesículas extracelulares y cualquiera de sus combinaciones.
También se proporciona el uso de un sistema, sin embargo, no cae bajo el alcance de las reivindicaciones, dicho sistema comprende o consiste en:
- un contenedor,
- medios para proporcionar una interfaz de fluido dentro de dicho contenedor,
- medios que proporcionan una fuerza cortante hidrodinámica que actúa sobre un objeto enlazado a dicha interfaz de fluido, y
- medios para el seguimiento de un objeto enlazado a dicha interfaz de fluido
para determinar el tamaño hidrodinámico de un objeto tal como un objeto de tamaño nanométrico. El contenedor puede ser un contenedor para un canal microfluídico.
Como resultado de enlazar el objeto a la interfaz de fluido, se restringirá el movimiento del objeto enlazado. El movimiento se restringe en un plano bidimensional. Este puede ser el caso cuando la interfaz de fluido es plana. Las dos dimensiones del plano bidimensional pueden extenderse en las direcciones x e y (x, y).
La presente descripción se basa en el hallazgo inesperado de que el tamaño de un objeto, tal como un tamaño hidrodinámico, se determina al enlazar un objeto a una interfaz de fluido, de esta manera se reduce el coeficiente de difusión y el movimiento aleatorio del objeto enlazado resultante. Por lo tanto, en contraste a enfoques como el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), la determinación del tamaño del objeto no puede basarse en un movimiento aleatorio y, por lo tanto, es impredecible cómo lograr la determinación del tamaño del objeto y/o la clasificación. En cambio, la presente descripción usa la determinación, es decir, mediante la medición y/o el cálculo, de la difusividad y velocidad del objeto enlazado para permitir la determinación de una fuerza cortante hidrodinámica y, en consecuencia, el tamaño hidrodinámico del objeto. La velocidad del objeto se induce por el flujo de un fluido, tal como un líquido. Como se explica en la presente, como el coeficiente de difusión y la velocidad del objeto enlazado dependen ambos de las propiedades móviles del (de los) enlazador(es), la movilidad del enlazador desaparece en el cálculo de la fuerza cortante hidrodinámica (que es proporcional a la relación entre la velocidad y el coeficiente de difusión).
Ventajosamente, las altas tasas de flujo requeridas en las mediciones convencionales que implican objetos que se mueven aleatoriamente en tres dimensiones se evitan en el método reivindicado y/o el uso no reivindicado de la presente descripción de esta manera se facilita el seguimiento de los objetos enlazados.
Se cree que el menor coeficiente de difusión de los objetos enlazados a una interfaz de fluido en comparación con los objetos que pueden moverse libremente en tres dimensiones se debe al hecho de que partes de los enlazadores que se incrustan en la interfaz de fluido experimentan una fricción mucho mayor dentro de la interfaz de fluido que la fricción que se experimenta por los objetos enlazados en un líquido que rodea dichos objetos. Por tanto, enlazar objetos a una interfaz de fluido resulta en una disminución del coeficiente de difusión en varios órdenes de magnitud más abajo de su valor de masa (Ec. 1, vide supra), que cumple un requisito necesario para impulsar la clasificación en la escala de nm. Por otra parte, la difusividad de los objetos enlazados a una interfaz de fluido no obedece a la
Ec. 1, sino que se determina por la difusividad de la interfaz de fluido y el número de enlazadores a la membrana. Por tanto, el tamaño del objeto enlazado no puede determinarse solamente a partir de su difusividad.
En el método descrito en la reivindicación 1 y/o el uso, que no cae bajo el alcance de las reivindicaciones, descrito en la presente, la fuerza hidrodinámica se proporciona al inducir un flujo. Alternativamente, sin embargo, no cae bajo el alcance de las reivindicaciones, la fuerza hidrodinámica puede proporcionarse de diversas otras formas. Por ejemplo, puede proporcionarse mediante medios electroforéticos, medios osmóticos, medios magnéticos, convección y cualquiera de sus combinaciones o en combinación con la forma reivindicada de inducir un flujo.
El método reivindicado y/o el uso no reivindicado descrito en la presente comprende una etapa de:
- determinar dicha fuerza cortante hidrodinámica que actúa sobre dicho objeto, lo que permite de esta manera la determinación de dicho tamaño hidrodinámico de dicho objeto enlazado. La determinación de dicha fuerza cortante hidrodinámica que actúa sobre dicho objeto implica la medición del coeficiente de difusión y la velocidad de dicho objeto. Por lo tanto, se proporciona un método reivindicado y/o un uso no reivindicado que comprende además una etapa de:
- determinar dicha fuerza cortante hidrodinámica que actúa sobre dicho objeto al medir y/o determinar el coeficiente de difusión y la velocidad de dicho objeto, lo que permite de esta manera la determinación de dicho tamaño hidrodinámico de dicho objeto enlazado.
El objeto descrito en la presente puede hacerse de cualquier material o cualquier combinación de materiales. Por ejemplo, los objetos pueden ser homogéneos, es decir, componerse de un solo material o de una sola mezcla de materiales. Sin embargo, el objeto también puede ser heterogéneo, es decir, componerse de varios materiales. Por ejemplo, el objeto puede tener un núcleo de un material y una envoltura de otro material.
Como ejemplo, el objeto puede comprender o componerse de un metal, un material orgánico, un material inorgánico, un material biológico o cualquiera de sus combinaciones. El metal puede ser cualquier metal, tal como el oro, el cobre, el magnesio, cualquiera de sus combinaciones y/o cualquier óxido, nitruro o carburo de los mismos. El material inorgánico puede ser una cerámica. La cerámica puede ser cualquier cerámica tal como una cerámica que comprende silicio, circonio, aluminio y/o cualquier óxido, nitruro o carburo de los mismos. El material biológico puede comprender o componerse de una o más proteínas, lípidos, virus, exosomas, liposomas y cualquiera de sus combinaciones.
El objeto a enlazar con la interfaz de fluido puede suspenderse o disolverse en un solvente. La elección del solvente dependerá del objeto. Por ejemplo, las partículas de metal pueden suspenderse en una solución acuosa. En un ejemplo adicional, un material biológico tal como un virus puede suspenderse o disolverse en un fluido corporal tal como la sangre o una solución fisiológica que se prepara artificialmente. Alternativamente, el objeto a enlazarse con la superficie de fluido puede añadirse puro, es decir, sin suspenderse o disolverse en un solvente.
Los objetos descritos en la presente pueden tener cualquier forma. Por ejemplo, los objetos pueden tener una forma sustancialmente esférica, una forma alargada o tener una forma sustancialmente irregular.
El tamaño del objeto al que se hace referencia en la presente puede ser el tamaño del núcleo del objeto o el tamaño hidrodinámico del objeto. En este documento, el tamaño hidrodinámico de un objeto tiene la intención de ser el tamaño del objeto, lo que incluye cualquier capa de solvatación. Además, el tamaño del objeto se refiere al mayor tamaño de la sección transversal del objeto. Como ejemplo, los objetos descritos en la presente pueden tener un tamaño o una distribución de tamaño en el rango de los micrómetros tal como de 0,5 micrómetros o menos. Alternativamente, los objetos pueden ser de tamaño nanométrico, es decir, tienen un tamaño en el rango de los nanómetros. En un ejemplo adicional, los objetos descritos en la presente pueden tener un tamaño o una distribución de tamaño en el rango de los nanómetros, tal como dentro del rango de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 400 nm.
En particular, la expresión "tamaño hidrodinámico" pretende significar el radio hidrodinámico del objeto que se calcula mediante el uso de la ecuación (1), de manera que se supone que un objeto que se calcula mediante el uso del método que se describe en la presente tiene una forma esférica con un radio que es equivalente a la mitad de la dimensión transversal máxima del objeto.
El objeto a enlazar con la interfaz de fluido puede ser de tamaño uniforme o no uniforme. Con frecuencia, el objeto es de tamaño no uniforme. Cuando el objeto es de tamaño no uniforme, puede presentar un rango de distribución de tamaño. Por ejemplo, el rango de distribución de tamaño puede variar de aproximadamente 1 nm a 500 nm, de 50 nm a 250 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 400 nm.
Los objetos descritos en la presente pueden ser partículas tales como nanopartículas.
La interfaz de fluido descrita en la presente es bidimensional, es decir, puede extenderse en sustancialmente dos dimensiones tales como la longitud y el ancho o un plano (x, y). Una tercera dimensión, tal como el ancho, puede ser de magnitud insignificante en comparación con las sustancialmente dos dimensiones de la interfaz de fluido. Los ejemplos de una interfaz de fluido que puede usarse en el contexto de la presente descripción incluyen una película, una monocapa, una bicapa, una membrana celular, una interfaz aire- agua o una interfaz aceite-agua. La interfaz de fluido puede extenderse lateralmente en la escala de los micrómetros o de los milímetros, mientras que tiene un grosor de interfaz de sólo unos pocos nanómetros. La bicapa puede ser una bicapa lipídica tal como una bicapa lipídica soportada (SLB). La bicapa lipídica soportada puede asociarse con un soporte tal como una pared.
Enlazar el objeto a la interfaz de fluido puede tener lugar mediante el uso de una estrategia de enlace como se describe en la técnica. Por ejemplo, el enlace puede tener lugar como se describe en Journal of Physical Chemistry B, 109 (19), 9773-9779 o como se describe en Langmuir, 22 (13), 5682-5689. Adecuadamente, el enlace debe tener lugar teniendo en cuenta que el objeto enlazado debe mantener una movilidad que haga posible inducir un movimiento dirigido de dichos objetos por un flujo que rodee dichos objetos. Se prevé usar cualquier tipo de enlace a un lípido (por ejemplo, colesterol) o molécula anfifílica (por ejemplo, péptidos o proteínas) que se asocia a una membrana lipídica para enlazar el objeto a la membrana.
La interfaz de fluido puede comprenderse dentro de un recipiente tal como un canal microfluídico, es decir, un canal que está en el rango de unos micrómetros. El canal microfluídico puede tener un ancho de 100 micrómetros o menos. La interfaz de fluido puede ubicarse en una pared, tal como una pared interior, de dicho canal microfluídico. La pared puede ser una pared inferior. La interfaz de fluido también puede comprenderse dentro o ubicarse en una superficie macroscópica tal como un capilar cilíndrico. La interfaz de fluido puede ubicarse en una pared interior de un capilar cilíndrico. Además, la interfaz de fluido puede ubicarse en una superficie celular. La interfaz de fluido puede disponerse para permitir el movimiento de dicha interfaz de fluido en relación con dicha pared. Alternativamente, la interfaz de fluido puede unirse a dicha pared de manera que se evite sustancialmente el movimiento de dicha interfaz de fluido en relación con dicha pared.
Una vez que se induce un flujo en el canal microfluídico, el flujo puede inducirse a lo largo de una de las dimensiones del plano bidimensional lo que restringe el movimiento del objeto enlazado descrito en la presente, tal como la dirección x o y de dicho plano bidimensional.
El método reivindicado y/o el uso no reivindicado de la presente descripción permite el seguimiento del objeto enlazado a la interfaz de fluido. Dado que el enlace resulta en una disminución considerable de la difusión del objeto enlazado, el seguimiento puede tener lugar en tiempo real, es decir, el instrumento de detección operará de manera que permita la detección y el análisis de forma sustancialmente simultánea. Por lo tanto, el método reivindicado y/o el uso no reivindicado de la presente descripción permite el seguimiento del objeto enlazado a la interfaz de fluido en tiempo real. Esto puede ser particularmente útil cuando el método reivindicado y/o el uso no reivindicado descrito en la presente se usa para la clasificación de objetos tales como objetos de tamaño nanométrico.
El instrumento de detección puede ser un microscopio que es capaz de analizar el mismo número de fotogramas como que es capaz de escribir por unidad de tiempo. Esto es así porque, de cualquier otra manera, los objetos seguidos habrán pasado tarde o temprano por el campo de visión del microscopio antes de que sus propiedades se determinen por el análisis, lo que hace imposible una clasificación en base a sus propiedades. La detección también puede basarse en imágenes microscópicas (por ejemplo, imágenes de fluorescencia o dispersión). El seguimiento de partículas individuales (SPT) puede usarse para extraer las propiedades del objeto de interés (por ejemplo, la movilidad, la fluorescencia y/o las imágenes de dispersión).
Como ejemplo, el seguimiento del método reivindicado y/o el uso no reivindicado de la presente descripción puede ser el SPT. El SPT puede realizarse en tiempo real como se describe en la presente. En este documento, el término "movilidad" (|j) tiene la intención de ser la relación entre la velocidad de deriva terminal del objeto vd y una fuerza aplicada F, es decir j = vd/F.
El método reivindicado y/o el uso no reivindicado de la presente descripción pueden usarse en combinación con un método adicional para detectar el objeto enlazado. El método adicional puede implicar una o más técnicas que se seleccionan del grupo que consiste en fluorescencia, índice de refracción e intensidad de dispersión.
Adicionalmente, el método reivindicado y/o el uso no reivindicado de la presente descripción pueden implicar y/o usarse para la clasificación de los objetos enlazados. Por lo tanto, el método descrito en la presente puede ser un método para la clasificación de objetos. La clasificación puede basarse en el tamaño, tal como el tamaño hidrodinámico del objeto y/o en una o más técnicas en el método adicional descrito en la presente.
Por ejemplo, el método o uso para la clasificación puede basarse en la medición del tamaño hidrodinámico del objeto en combinación con la fluorescencia y/o la intensidad de dispersión del objeto. En este caso, la clasificación puede realizarse de forma análoga a los clasificadores de citometría de flujo convencionales y presentará la ventaja de ser aplicable a objetos en el rango de tamaño de nanómetros.
En un ejemplo adicional, el método reivindicado y/o el uso no reivindicado para la clasificación descrito en la presente puede basarse en la fluorescencia o la intensidad de dispersión del objeto frente al tamaño hidrodinámico. Esto tiene la ventaja de que el tamaño hidrodinámico puede determinarse independientemente de la intensidad de fluorescencia o la dispersión. Por tanto, es posible clasificar objetos con tamaño de nanómetros en base a su densidad de intensidad de fluorescencia, que se obtiene al dividir la intensidad de fluorescencia medida por la superficie o el volumen del objeto, respectivamente, en dependencia de la distribución espacial de los fluoróforos. Por tanto, la clasificación en base a la densidad de intensidad de fluorescencia permite clasificar objetos en base a la concentración de los fluoróforos, por ejemplo, para los exosomas que se etiquetan con marcadores de proteínas de membrana (como CD63) o marcadores de ADN/ARN. De manera similar, la clasificación en base a la densidad de intensidad de dispersión permite clasificar objetos con tamaño de nanómetros en base a su densidad de contraste óptico (y, por lo tanto, en base a su índice de refracción). Este es un beneficio significativo, ya que la clasificación en base a las concentraciones de proteínas o los índices de refracción es inaccesible para los citómetros de flujo convencionales.
En otro ejemplo más, el método reivindicado y/o el uso no reivindicado para la clasificación descrita en la presente puede basarse en la difusividad y la movilidad del objeto enlazado. Por ejemplo, las proteínas transmembrana presentes en bicapas lipídicas soportadas (SLB) planas pueden identificarse al unir a ellas nanopartículas de oro funcionalizadas con anticuerpos, lo que permite mover proteínas transmembrana de interés a una región definida por el usuario de la SLB mediante la aplicación de una fuerza cortante en las nanopartículas de oro. Las nanopartículas de oro unidas específicamente a las proteínas transmembrana pueden entonces presentar un coeficiente de difusión que difiere del de las nanopartículas de oro que se unen de forma no específica a lípidos individuales. Por tanto, las nanopartículas de oro unidas específicamente se distinguen de las nanopartículas de oro que se unen de forma no específica en base a sus diferentes coeficientes de difusión y la clasificación en base a la difusividad/movilidad del objeto permite purificar aún más la proteína transmembrana al clasificar solo las nanopartículas de oro unidas específicamente. Como la difusividad a menudo depende también del estado de agregación de la proteína transmembrana, uno también puede prever clasificar las proteínas transmembrana en base a su estado de agregación mediante el uso del método reivindicado y/o el uso no reivindicado descrito en la presente.
El recipiente, tal como un canal microfluídico descrito en la presente, puede disponerse para proporcionar la clasificación de los objetos enlazados. Por ejemplo, el recipiente, tal como un canal microfluídico, puede comprender dos o más canales de salida en los que pueden introducirse los objetos clasificados. Un interruptor puede presentarse para facilitar la clasificación a través de los canales de salida.
Se apreciará que el método reivindicado y/o el uso no reivindicado de la presente descripción pueden aplicarse en muchos campos técnicos diversos y/o para diversos fines. El método reivindicado y/o el uso no reivindicado de la presente descripción puede usarse para propósitos de investigación, como una herramienta de investigación, en aplicaciones médicas tales como los diagnósticos, la purificación de partículas biológicas como los virus, las vesículas extracelulares, los ácidos nucleicos, las proteínas, otras nanopartículas biológicas, etc.
Las consideraciones teóricas que subyacen a la presente descripción se describen a continuación en el contexto de objetos en el rango de los nanómetros enlazados a una interfaz bidimensional (2D).
Consideraciones teóricas
Enlazar objetos de tamaño de nm con las interfaces de fluido (Figura 1) puede usarse para producir coeficientes de difusión que son mucho más pequeños que el valor de masa correspondiente (Ec. 1), lo que permite ralentizar su movimiento. Dado que esto aumenta el tiempo de observación, esta medición detallada de las propiedades del objeto (por ejemplo, la dispersión o la intensidad de la fluorescencia) y la manipulación de la posición del objeto (por ejemplo, al controlar el flujo dentro del canal) de esta manera se simplificarían significativamente. Sin embargo, esta reducción en el coeficiente de difusión se provoca por el hecho de que el movimiento se limita ahora por la fricción que actúa sobre las partes del enlazador que se incrusta en la interfaz de fluido y no por la fricción que actúa sobre el objeto en sí. Esto hace imposible aplicar directamente la relación de Stokes-Einstein, Ec. 1, para extraer el tamaño hidrodinámico del coeficiente de difusión, como se hace, por ejemplo, en enfoques como el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) de la difusión en masa de objetos a nanoescala. En los párrafos siguientes se mostrará que esta aparente deficiencia (implicada en el enlace de los objetos de tamaño de nm) puede eludirse, si uno se da cuenta de que es posible analizar el movimiento del objeto de forma independiente en direcciones paralelas y perpendiculares al flujo. Esto permite determinar simultáneamente el coeficiente de difusión del objeto y la velocidad del movimiento dirigido que se induce por el flujo. Como esta última depende tanto del coeficiente de difusión del objeto como de la fuerza cortante hidrodinámica Fiante que actúa sobre el objeto, la Fiante y, por lo tanto, el tamaño hidrodinámico del objeto puede extraerse directamente.
Para seguir este breve razonamiento, considere una fuerza cortante hidrodinámica aplicada Fiante que mueve un objeto enlazado en la dirección del flujo, lo que genera una trayectoria que es una superposición de un movimiento aleatorio y dirigido (véase, por ejemplo, la Figura 2). El movimiento aleatorio puede caracterizarse por el coeficiente de difusión Denlace del objeto enlazado, mientras que el movimiento dirigido puede cuantificarse por la velocidad promedio del objeto vx en la dirección del flujo (que se denota como eje x en lo siguiente, véase la Figura 2). La
relación de Einstein-Smoluchowski conecta el movimiento dirigido y aleatorio ya que relaciona la movilidad del objeto b, definida por
con el coeficiente de difusión Denlace a través de
Esta relación puede derivarse del teorema de la fluctuación-disipación, que establece que aquellas fuerzas, que causan fluctuaciones aleatorias en el estado de equilibrio (aquí las fuerzas aleatorias generadas por los lípidos difusores que interactúan con el enlazador), también crean una disipación/fricción si el sistema está sujeto a una fuerza no aleatoria (aquí la fuerza cortante que crea un movimiento dirigido de partículas). Al combinar las ecuaciones 2 y 3 se produce
Como vx y Denlace pueden extraerse independientemente de las trayectorias, la fuerza cortante hidrodinámica que actúa sobre el objeto de tamaño de nm puede calcularse directamente. O, en otras palabras, como Vx y Denlace dependen ambos de las propiedades móviles de los enlazadores, cualquier propiedad del enlazador desaparece en la identificación que produce la Ec. 4. En consecuencia, la fuerza cortante hidrodinámica que actúa sobre el objeto seguido, que aumenta con la tasa de flujo, pero también con el tamaño hidrodinámico, puede determinarse directamente de Vx y Denlace mediante el uso de la Ec. 4. Nótese que estas ecuaciones se tienen siempre que el coeficiente de difusión del objeto enlazado esté dominado por el coeficiente de difusión del enlazador en sí, lo que se cumple para los enlazadores típicos (coeficiente de difusión más abajo de 1 pm2/s) dado que los radios hidrodinámicos R del objeto de libre difusión están más abajo de alrededor de 200 nm (véase la Ec. 1).
La altura del canal de los canales microfluídicos comunes suele ser mucho mayor que el tamaño hidrodinámico de interés en este enfoque, que para bajos números de Reynolds permite aproximar el perfil de flujo parabólico por (z) = v0-(z+).) (5) Con A que denota la longitud de deslizamiento del flujo, que es del orden de 10 nm para los flujos por encima de las SLB, y vo que denota el gradiente de la velocidad en la SLB. Un análisis de escala muestra que la fuerza de arrastre que actúa sobre una partícula esférica en dicho flujo escala con el producto de la velocidad del flujo en z = R (el medio del objeto) por el radio hidrodinámico R, lo que permite escribir la fuerza de arrastre como
ft™ .(R) = A r\ - R ■ vM0 (R) = A r¡-v0 • R ■ (R + A ) , (6) con A que denota un prefactor que da cuenta del perfil de flujo no homogéneo alrededor del objeto. Lo más conveniente es determinar tanto (un priori) parámetros desconocidos A como A por mediciones de calibración mediante el uso de partículas de tamaño bien definido. Nótese que ni A ni A dependen de las propiedades del objeto, lo que permite relacionar la fuerza cortante que se mide mediante el uso de la Ec. 6 con el tamaño hidrodinámico R una vez que A y A se han determinado mediante el uso de mediciones de calibración.
Definiciones
El seguimiento de partículas individuales (SPT) es la observación del movimiento de partículas individuales dentro de un medio. Las coordenadas (x, y, z) a lo largo de una serie de etapas de tiempo hace referencia a una trayectoria. La trayectoria puede analizarse para identificar los modos de movimiento o las heterogeneidades en el movimiento, tal como obstáculos o regiones de transporte rápido (por ejemplo, debido al transporte activo o al flujo), en el caso del movimiento aleatorio el análisis de la trayectoria puede proporcionar un coeficiente de difusión.
Un objeto de tamaño nanométrico pretende significar un objeto en el rango de tamaño de nanómetros, tal como un objeto que tiene un área de sección transversal más grande en el rango de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 400 nm.
Eq significa ecuación.
fN significa femtonewton (10 -15 N).
LMS significa mínimo cuadrado medio.
DOPE significa 1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina.
1D significa unidimensional.
2D significa bidimensional.
|j significa micro.
nm significa nanómetro.
CD63 es una proteína que en humanos se codifica por el gen CD63.
POPC es el compuesto químico 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina.
SLB POPC es una bicapa lipídica soportada hecha de POPC.
TEM significa microscopía electrónica de transmisión.
DLS significa dispersión de luz dinámica.
ADN significa ácido desoxirribonucleico.
ARN significa ácido ribonucleico.
RAM significa memoria de acceso aleatorio.
CPU significa unidad central de procesamiento.
SUV significa pequeña vesícula unilaminar.
TIRF significa fluorescencia de reflexión interna total.
GB significa gigabyte.
NTA significa análisis de seguimiento de nanopartículas.
fps significa fotogramas por segundo.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un esquema para la determinación de tamaño hidrodinámico de objetos individuales de tamaño de nanómetro. Los objetos (1) se enlazan (2) a una interfaz de fluido (3) y se mueven mediante una fuerza hidrodinámica (4), que se genera, por ejemplo, mediante la aplicación de un flujo cortante (5).
La Figura 2 muestra las trayectorias de nanopartículas de oro individuales que se enlazan a una SLB y se sujetan a un flujo hidrodinámico.
La Figura 3 muestra una trayectoria representativa de una sola nanopartícula de oro. El movimiento predominantemente dirigido en la dirección del flujo se usa para determinar la velocidad Vx (que se induce por la aplicación de la fuerza cortante hidrodinámica), mientras que los coeficientes de difusión iD se extraen de los movimientos aleatorios en ambas direcciones.
La Figura 4a muestra una comparación de los coeficientes de difusión 1D, Dx y Dy de las nanopartículas de oro, que se extrajeron mediante el uso del método de descomposición que se muestra en la Figura 3.
La Figura 4b muestra un histograma de la relación Dx/Dy (barras), cuyas desviaciones del valor esperado 1 pueden explicarse por la resolución de la medición (línea continua).
La Figura 5a, la Figura 5b y la Figura 5c muestran la velocidad Vx para nanopartículas de oro frente al coeficiente de difusión de nanopartículas D para diferentes tasas de flujo.
La Figura 5d muestra la velocidad Vx (después de la normalización por la tasa de flujo) para nanopartículas de oro frente al coeficiente de difusión de las nanopartículas D, que colapsa todos los puntos de datos de la Figura 5a a 5c en una sola curva maestra.
La Figura 6a muestra un histograma de la fuerza hidrodinámica para 3 lotes de nanopartículas de oro que difieren en sus distribuciones de tamaño.
La Figura 6b muestra la dependencia del radio hidrodinámico de la fuerza hidrodinámica normalizada para los 3 lotes de calibración que se muestran en la Figura 6a.
La Figura 7a y la Figura 7b muestran una comparación de las distribuciones de tamaño de un lote de nanopartículas de oro que se extrajo mediante el uso de microscopía electrónica (a) o mediante el uso de su movimiento 2D bajo flujo (b).
La Figura 7c y la Figura 7d muestran una comparación de las distribuciones de tamaño de otro lote de nanopartículas de oro que se extrajo mediante el uso de microscopía electrónica (c) o mediante el uso de su movimiento 2D bajo flujo (d).
La Figura 8a muestra la distribución de tamaño de una muestra de SUV que se extrajo del movimiento 2D bajo flujo. La Figura 8b muestra la distribución de tamaño de la misma muestra de SUV (como en la Figura 8a) que se extrajo mediante el uso de NTA.
La Figura 9 compara las distribuciones de tamaño de una muestra de SUV que se extrajo mediante el uso de DLS (1) o el movimiento 2D bajo flujo (2).
La Figura 10 muestra un diagrama de flujo del análisis del SPT en tiempo real.
La Figura 11 muestra una demostración del análisis de seguimiento en tiempo real.
La Figura 12 muestra un esquema para la determinación del tamaño y la clasificación de objetos individuales de tamaño nanométrico.
La descripción se ilustra con los siguientes ejemplos no limitativos.
SECCIÓN DE EJEMPLOS
Ejemplo 1. Demostración de la determinación del tamaño 2D de objetos de tamaño de nm
Como una implementación potencial de la extracción de tamaño basada en el SPT 2D, se formó una SLB POPC dentro de un canal microfluídico, seguido por el enlace de objetos de tamaño de nm a la SLB. Estos objetos tenían un tamaño bien definido (que se determina mediante el uso, por ejemplo, de análisis de TEM) y se usaron para las mediciones de calibración, o se mostraron con una amplia distribución de tamaño (por ejemplo, vesículas), que se determinó por el nuevo enfoque (mediante el uso del s Pt 2D bajo flujo) y se comparó con el resultado de enfoques establecidos como la DLS y el NTA. En la Figura 1 se muestra una vista esquemática de la configuración.
En un primer conjunto de experimentos, se usaron nanopartículas de oro (cuyas distribuciones de tamaño se determinaron mediante el uso de microscopía electrónica). La superficie de las nanopartículas de oro se funcionalizó mediante el uso de estreptavidina, lo que permitió enlazar las nanopartículas de oro a los lípidos conjugados con biotina en la SLB. La Figura 2 muestra las trayectorias típicas de las nanopartículas de oro (diámetro hidrodinámico de 60 nm). La tasa de flujo se ajustó de manera que el movimiento en la dirección del flujo (que se denota como eje x, véase la Figura 2) fuera dominado por un movimiento dirigido. La Figura 3a muestra una trayectoria representativa de una sola nanopartícula de oro (diámetro hidrodinámico de 60 nm) y su descomposición en sus componentes x e y, es decir, en componentes paralelos y perpendiculares a la dirección del flujo (Figura 3b-c). Mientras que el movimiento a lo largo del eje y, parece ser puramente aleatorio (Figura 3c), como indican las fluctuaciones no dirigidas de la posición y que no muestran una tendencia obvia de movimiento, se observó un aumento predominantemente lineal de la posición x (Figura 3b), que indica la presencia de un movimiento dirigido a lo largo de la dirección del flujo. Sin embargo, a este movimiento dirigido se superponen las fluctuaciones, lo que provoca pequeñas perturbaciones por un aumento lineal perfecto de la posición x a lo largo del tiempo.
Para investigar si este análisis intuitivo tiene un análisis más estricto, los desplazamientos a lo largo de las coordenadas x o y de esta trayectoria se trazaron en las Figuras 3d y e, para los puntos de datos que se separan por 2 fotogramas: Ax(i) = x(i + 2) - x(i) y Ay(i) = y(i + 2) - y(i) con i que denota el número de fotograma. Para una difusión pura 1D, es decir, en ausencia de movimiento dirigido, se espera que el valor promedio de esta diferencia de coordenadas sea cero, lo que se observa para Ay (Figura 3e, línea continua delgada). Además, la varianza de Ay es equivalente al desplazamiento medio al cuadrado que se observa en la dirección y, y es, por lo tanto, igual a 2 • Dy • At (con At que denota el tiempo de retraso entre 2 fotogramas):
var( 
Por tanto, calcular la varianza de Ay permite extraer directamente el coeficiente de difusión en la dirección y. Lo mismo ocurre para la dirección x con una diferencia: debido al movimiento dirigido, el valor promedio de Ax viene dado ahora, en teoría, por
y por lo tanto no es cero (como se observa para Ax; Figura 3d, línea continua delgada). Sin embargo, como la varianza es invariante al desplazar todos los puntos de datos mediante un desplazamiento constante (que cambia solo el valor promedio), la varianza de Ax sigue siendo proporcional al coeficiente de difusión en la dirección x, a pesar del valor promedio que no es cero:
Por tanto, los coeficientes de difusión en las direcciones x e y pueden extraerse independientemente al calcular la varianza de Ax y Ay, mientras que tomar el valor promedio de Ax da una forma conveniente de extraer Vx de la trayectoria (véase la Figura 3d, e).
Como la SLB es un medio isotrópico 2D, se espera que Dx y Dy sean iguales. Esto se prueba en la Figura 4, que compara los valores que se extraen para Dx y Dy por cada nanopartícula de oro seguida y muestra que ambos coeficientes de difusión son idénticos dentro del error experimental (líneas discontinuas en la Figura 4a y línea continua en la Figura 4b). Esto demuestra que el procedimiento de extracción de datos desacopla exitosamente el movimiento dirigido y aleatorio de las partículas y permite calcular el coeficiente de difusión Denlace 2D como promedio aritmético de Dx y Dy.
De las Ecuaciones 2, 3 y 6 se espera que la velocidad observada Vx escale linealmente con la tasa de flujo vo (del líquido que pasa por el canal) y el coeficiente de difusión Denlace, que generalmente se observa en el experimento (Figura 5). Por tanto, después de normalizar la velocidad extraída Vx por la tasa de flujo que se aplica vo (Figura 5d), todos los puntos de datos colapsan en una sola curva maestra lineal (línea continua en la Figura 5d). Nótese que las fluctuaciones (ruido) en la Figura 5 disminuyen con el aumento de la tasa de flujo, lo que se atribuye al hecho de que las tasas de flujo más altas inducen mayores desplazamientos de partículas entre fotogramas consecutivos, lo que a su vez aumenta la relación señal/ruido en la medición de vx.
Como tanto la velocidad en la dirección del flujo, vx, así como también el coeficiente de difusión Denlace pueden determinarse, la aplicación de la Ec. 4 permite extraer directamente la fuerza hidrodinámica que actúa sobre cada nanopartícula seguida. La Figura 6a muestra histogramas de la fuerza hidrodinámica normalizada medida para nanopartículas de oro de 60 nm, 100 nm y 210 nm, que presentan picos a 1,60 fN/(jL/min) para las de 60 nm, a 4,05 fN/(|jL/min) para las de 100 nm, y a 10,83 fN/(jL/min) para las de 210 nm. Estas mediciones permiten determinar los parámetros de calibración A y A de la Ec. 6 y, por tanto, calibrar el canal microfluídico para la determinación de distribuciones de tamaño (Figura 6b, líneas). Esto se demuestra en la Figura 7, que compara las distribuciones de tamaño determinadas hidrodinámicamente (que se obtienen mediante la aplicación de la Ec. 6 a las fuerzas cortantes hidrodinámicas que se observan) con la que se obtiene mediante imágenes de microscopía electrónica de las muestras de nanopartículas de oro. Ambos métodos producen esencialmente las mismas distribuciones si se toma en cuenta un desplazamiento de 5 nm, que se provoca por una corona de PEG que se forma en la superficie de la nanopartícula (y que no es resoluble en las imágenes de la TEM). Además, las distribuciones de tamaño determinadas hidrodinámicamente se extrajeron mediante el uso de longitudes de deslizamiento de 24,4 nm (barras en las Figuras 7b y 7d; motivadas por el ajuste LMS ponderado en la Figura 6b) y 64,5 nm (líneas discontinuas en las figuras 7b y 7d; motivadas por el ajuste del LMS en la Figura 6b), que muestra que los cambios en la longitud de deslizamiento tienen sólo un pequeño efecto en la extracción de tamaño para un diámetro hidrodinámico más abajo de 100 nm.
Como aplicación potencial, se determinó la distribución del tamaño de los liposomas mediante el uso de un nuevo enfoque. Los liposomas (que se etiquetan con fluorescencia mediante la incorporación de DOPE conjugado con lisamina rodamina) se enlazaron a la SLB mediante el uso de ataduras de ADN equipadas con colesterol como se describe recientemente en el Journal of Physical Chemistry B, 109 (19), 9773-9779 y ChemPhysChem, 11 (5), 1011 1017. Las Figuras 8 y 9 comparan las distribuciones de tamaño determinadas hidrodinámicamente de los liposomas (Figura 8a y curva 2 en la Figura 9) con las distribuciones de tamaño derivadas mediante el uso de NTA (Figura 8b) o la DLS (curva 1 en la Figura 9), lo que indica una buena concordancia de los enfoques complementarios. Esta comparación también muestra que los liposomas con radios hidrodinámicos < 25 nm, que prácticamente no se resuelven en la distribución de tamaño del NTA (Figura 8b), se resuelven bien en la distribución de tamaño
determinada hidrodinámicamente (Figura 8a). La existencia de esta fracción se confirma mediante la medición de la DLS (Figura 9).
Ejemplo 2. Demostración de análisis de seguimiento en tiempo real
La clasificación requiere obviamente que el análisis de seguimiento completo se realice en tiempo real, es decir, el análisis de seguimiento debe ser capaz de analizar el mismo número de fotogramas que el microscopio es capaz de escribir por unidad de tiempo. Esto es así porque, de cualquier otra manera, los objetos seguidos habrán pasado tarde o temprano por el campo de visión del microscopio antes de que sus propiedades se determinen por el análisis, lo que hace imposible una clasificación en base a sus propiedades.
Con el fin de no afectar el rendimiento de adquisición del software usado para registrar y almacenar los datos de las imágenes, se decidió dividir todo el análisis de seguimiento en distintas tareas, que se distribuyen entre los nodos disponibles de la CPU. Esto asegura que cada tarea de análisis no consuma más recursos de la CPU que la cantidad correspondiente a un solo nodo, lo que evita la interferencia en el uso de la CPU (durante el curso del análisis de datos) entre los nodos que alojan el software de grabación de imágenes y el de análisis de seguimiento, respectivamente. O, en otras palabras, los aumentos en el consumo de la CPU durante el análisis de seguimiento no pueden transmitirse a el software de grabación, lo que provocaría un efecto negativo en la tasa de adquisición de imágenes.
El análisis de seguimiento se dividió en 5 tareas distintas (Figura 9): 1. La selección: detección y localización (con precisión de píxeles) de objetos dentro de las imágenes, 2. El enlace de objetos detectados entre fotogramas adyacentes para construir las pistas, 3. El refinamiento de la localización de los objetos detectados con precisión de subpíxeles en base a un algoritmo de centroide, 4. Sí es de interés: la extracción de la dispersión integrada o la intensidad de fluorescencia de los objetos detectados, y 5. El entrelazamiento de todos estos flujos de datos distintos en un análisis de seguimiento completo, que se usa entonces para dirigir el flujo a través del canal microfluídico. La arquitectura de análisis permite dividir aún más las colas de análisis de datos (de esta manera aumenta el rendimiento total del análisis) al ejecutar múltiples copias de estas tareas fundamentales, cada una de las cuales analiza distintas pilas de datos. Esto hace que la ampliación de la arquitectura sea fácil, si el ordenador de alojamiento ofrece suficientes nodos y tasas de transferencia de datos. Adicionalmente, es posible clasificar incluso aquellos objetos, cuyas coordenadas de seguimiento se han refinado solo parcialmente pero que ya ofrecen una precisión suficientemente alta en la determinación de las propiedades de interés, tan pronto como sus datos de enlace estén disponibles.
El rendimiento del análisis de seguimiento de partículas en tiempo real se probó en liposomas que se enlazaban a una SLB como se describe anteriormente. Un solo ordenador se usó para controlar el microscopio de TIRF, grabar las películas de SPT y para analizar las películas grabadas, lo que permite probar si el uso de la CPU permanece dentro de los límites que se asignan, es decir, para asegurar que un uso elevado de la CPU de los nodos de análisis no se transmite a través de los nodos que controlan el microscopio de TIRF. El ordenador se equipó con una CPU Intel i7-3930K de 3,2 GHz que suministraba 12 nodos virtuales (6 núcleos físicos hiperprocesables que se pueden dividir en 2 nodos virtuales distintos cada uno) con 32 GB de RAM.
Para películas de SPT que contienen 1280 x 1024 píxeles y menos de 100 objetos de seguimiento, la implementación actual alcanza el siguiente rendimiento de datos por nodo: la selección 30 fps, el enlace 15 fps, el refinamiento 12 fps. El uso de 1 nodo de selección, 2 nodos de enlace y 2 nodos de refinamiento aseguran un rendimiento de datos constante de 20 fps, sin afectar la tasa de adquisición de los nodos que controlan el microscopio (Figura 10). Para ir más allá del límite de 25 fps, que a menudo hace referencia a las imágenes en tiempo real, es necesario dividir los flujos de datos una vez más, es decir, utilizar 1 nodo de selección, 3 nodos de enlace y 3 nodos de refinamiento, que requieren 4 núcleos físicos de la CPU o reducir el número de objetos de seguimiento.
Ejemplo 3. Clasificación de objetos de tamaño de nm enlazados a una interfaz de fluido
La presente descripción permite la clasificación de objetos de tamaño de nm mediante el uso del siguiente procedimiento:
1. Los objetos se enlazan a una interfaz de fluido (por ejemplo, que se ubica en una pared de un canal microfluídico; 1 en la Figura 12), mientras que su movimiento se sigue en tiempo real mediante el uso del SPT (por ejemplo, mediante el uso de imágenes microscópicas, 2 en la Figura 12, en relación con el análisis de datos en tiempo real, 3 en la Figura 12). Las implementaciones ilustrativas de esta etapa se describen en las secciones "Ejemplo 1" y "Ejemplo 2".
2. El análisis del SPT permite extraer las propiedades del objeto de interés, por ejemplo, el contraste del índice de refracción y la intensidad de dispersión o fluorescencia de cada objeto seguido. En la literatura se han descrito procedimientos de análisis adecuados. Además de estos procedimientos que se establecen, el enfoque de análisis que se introduce en la sección "Consideraciones teóricas", permite derivar el tamaño hidrodinámico de
los objetos después de enlazarlos con una interfaz de fluido. Esto permite la clasificación de objetos de tamaño de nm en base a su tamaño hidrodinámico, lo que es de especial interés para la clasificación, por ejemplo, exosomas, cuando se combina con la identificación paralela de niveles de expresión de proteínas o ADN o ARN incorporado (por ejemplo, al medir la intensidad de fluorescencia de un cierto marcador en relación con el tamaño hidrodinámico del exosoma).
3. Finalmente, si un objeto que cumple un criterio de clasificación dado alcanza el área de clasificación del canal microfluídico, el flujo entre los 2 canales de salida (4a y 4b en la Figura 12) se conmuta mediante un sistema de válvulas que se controla por ordenador (5 en la Figura 12), lo que inicia el proceso de clasificación real. Una vez que el objeto se movió exitosamente al "canal de salida de clasificación", las válvulas se conmutan de nuevo y se restablece el flujo original.
Referencias
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The Journal of Physical Chemistry B, 109 (19), páginas 9773-9779
ChemPhysChem, 11 (5), páginas 1011-1017
Claims (12)
1. Un método para determinar el tamaño hidrodinámico de un objeto (1), tal como un objeto de tamaño nanométrico (1), dicho método comprende las etapas de:
- proporcionar una interfaz de fluido bidimensional (3),
- enlazar dicho objeto a dicha interfaz de fluido (3) de esta manera se proporciona un objeto enlazado (1), de manera que el movimiento de dicho objeto enlazado se restringe en virtud de su enlace con dicha interfaz de fluido (3),
- proporcionar una fuerza cortante hidrodinámica (4) que actúa sobre dicho objeto enlazado al inducir un flujo de fluido,
- seguir el movimiento de dicho objeto enlazado,
- determinar, a partir del movimiento seguido, dicho coeficiente de difusión del objeto y dicha velocidad del objeto en la dirección del flujo, en donde dicho movimiento del objeto (1) se analiza independientemente en las direcciones paralelas y perpendiculares al flujo inducido,
- determinar dicha fuerza cortante hidrodinámica (4) que actúa sobre dicho objeto (1) a partir de una relación entre dicho coeficiente de difusión determinado y dicha velocidad determinada, y
- determinar dicho tamaño hidrodinámico de dicho objeto enlazado a partir de una relación entre dicha fuerza cortante hidrodinámica determinada y la tasa de flujo de fluido.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho objeto (1) es un objeto de tamaño nanométrico (1) que tiene una dimensión de sección transversal máxima dentro del rango de 1 nm a 500 nm, de 50 a 250 nm, de 200 a 400 nm o de 200 a 300 nm.
3. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el objeto (1) comprende o consiste en un metal, un material orgánico, un material inorgánico, un material biológico y cualquiera de sus combinaciones.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el material biológico se selecciona del grupo que consiste de proteínas, virus, exosomas, conjuntos de lípidos, ácidos nucleicos, vesículas extracelulares y cualquiera de sus combinaciones.
5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho método implica la clasificación de una pluralidad de dichos objetos de acuerdo con su tamaño hidrodinámico.
6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho seguimiento se lleva a cabo en tiempo real.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha interfaz de fluido (3) se comprende dentro de un canal microfluídico o un capilar.
8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la interfaz de fluido (3) es una película, una monocapa, una bicapa, una membrana celular, una interfaz aire-agua o una interfaz aceite-agua.
9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la interfaz de fluido (3) es una bicapa lipídica soportada.
10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha interfaz de fluido (3) se ubica en una pared, tal como una pared inferior de un canal microfluídico o una pared interior de un capilar.
11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho método comprende la etapa de detectar dicho objeto (1).
12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha etapa de detección de dicho objeto (1) implica la medición de la fluorescencia, el índice de refracción y/o la intensidad de dispersión de dicho objeto (1).
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