CN114507524A - 一种量子点荧光编码聚乳酸微球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种量子点荧光编码聚乳酸微球及其制备方法和应用,并基于此构建了液相悬浮生物芯片体系,通过试纸条免疫分析快速判断生物活性,最后应用于肿瘤标志物的免疫检测。该体系以新型聚乳酸荧光微球为载体,以水相CdTe QDs为信号物的三明治夹心型免疫传感器。该免疫检测体系包括新型聚乳酸荧光微球包被的肿瘤标志物捕获抗体、水相CdTe QDs标记的肿瘤标记抗体、以及通过抗原‑抗体间相互作用与两者分别相连的肿瘤标志物抗原。本发明具有反应快速、重复性好以及操作简便、高通量、多指标联合检测、高敏感性检测肿瘤标志物的特点。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测领域,尤其涉及一种量子点荧光编码聚乳酸微球及其制备方法和应用,以及其在肿瘤标记物免疫检测上的应用。
背景技术
液相悬浮式生物芯片技术是以悬浮微球作为液相反应的载体,以快速高通量的流式细胞术作为分析手段进行快速高通量的多元检测。聚合物荧光编码微球作为液相悬浮生物芯片技术的核心,聚合物的选取直接决定所构建的生物悬浮芯片体系是否能有高效的检测性能。目前,所用的聚合物大多都是聚苯乙烯、聚苯乙烯-马来酸酐等难以降解的高分子聚合物。虽然其在免疫检测可以有效进行,但难以更加长远,以及在以后的体内检测受限。与这些聚合物不同,聚乳酸具有良好的生物相容性、光泽度、透明性、手感和耐热性。
聚合物荧光微球制备方法有溶胀法、层层自组装法、聚合法和乳化法、微通道辅助乳化法、溶胶-凝胶法等方法,大都具有一定的局限性。相较于他们,SPG膜乳化-溶剂挥发法具有产率高、重复性好、制备简单、粒径均一分散等众多优点。但目前利用聚乳酸制备微球的工艺有许多不足,如稳定性差、微球活性差、难以快速制备、聚乳酸微球的应用少等众多问题。
发明内容
发明目的:针对现有技术的不足与缺陷,本发明提供一种聚乳酸荧光微球及其制备方法和应用,并用免疫层析试纸条进行新型聚合物荧光微球的生物活性检测,再用于高灵敏度检测肿瘤标记物CA125、CA199、CA724、CEA,能够检测肿瘤标记物的最低检测限低至0.132ng/mL。
技术方案:本发明提供了一种量子点荧光编码聚乳酸微球,所述量子点荧光编码聚乳酸微球先通过马来酸酐、过氧化苯甲酰对聚乳酸进行接枝改性反应制得聚乳酸-马来酸酐聚合物,然后通过SPG膜乳化法制备即得。
其中,所述SPG膜乳化法具体包括如下步骤:将制备的聚乳酸-马来酸酐聚合物溶解于三氯甲烷中,再加入油性ZnS/CdSe QDs,超声分散均匀,制成分散相溶液,与分散相溶液互不相溶的溶液作为连续相溶液;将分散相溶液、连续相溶液转移至SPG膜乳化器中,调节SPG膜乳化器的磁力搅拌器转速使连续相溶液通过SPG膜乳化器膜孔流动,调节外加氮气压力,气压稳定后将分散相溶液通过SPG膜孔压入到连续相溶液中,得到粒径均一的微乳液滴;微乳液滴经过固化、溶剂挥发制得新型聚乳酸荧光微球。
其中,所述油性ZnS/CdSe QDs波长为510-530nm;SPG膜膜孔直径为5.1μm;所述磁力搅拌器的转速为300-400rpm;所述外加氮气的压力为0.008-0.012MPa;所述氮气气压的稳定时间为0-2min,所述微乳液滴类型为水包油型O/W;所述溶剂挥发固化时间是10-12h。
本发明内容还包括所述的量子点荧光编码聚乳酸微球的制备方法,包括以下步骤:
1)聚乳酸-马来酸酐聚合物的制备;
2)量子点荧光编码聚乳酸微球的制备。
其中,步骤1)中聚乳酸-马来酸酐聚合物的制备步骤如下:将聚乳酸、马来酸酐、过氧化苯甲酰溶解于二氯甲烷中得到溶液,再将溶液干燥得到白色固体混合物;后将干燥所得的白色固体混合物在烘箱中反应,反应结束后得到淡黄色固体混合物;通过用三氯甲烷溶解产物与乙醚沉淀多次进行纯化,离心,最后将固体混合物真空干燥即得。
本发明内容还包括一种荧光免疫分析试纸,所述荧光免疫分析试纸包括权利要求1所述的量子点荧光编码聚乳酸微球。
其中,所述荧光免疫分析试纸包括但不仅限于IgG。
本发明内容还包括一种生物芯片体系,所述生物芯片体系包括包被有特异性抗体的量子点荧光编码聚乳酸微球、水相CdTe QDs标记的肿瘤标记抗体以及通过抗原-抗体间相互作用与两者分别相连的肿瘤标志物抗原。
其中,所述肿瘤标记抗体包括但不仅限于选用CA125、CA199、CA724、CEA中的一种或几种对应的抗体,肿瘤标志物抗原包括但不仅限于选用CA125、CA199、CA724、CEA中的一种或几种。
本发明内容还包括所述生物芯片体系的构建方法,包括以下步骤:
1)聚乳酸-马来酸酐聚合物的制备;
2)量子点荧光编码聚乳酸微球的制备;
3)量子点荧光编码聚乳酸微球表面包被特异性抗体;
4)将抗原溶液加入步骤3)中室温环境中避光孵育,得到X-Ag;
5)将水相CdTe QDs标记的肿瘤标记抗体加入到X-Ag中构建得到三明治夹心免疫结构。
本发明内容还包括所述的量子点荧光编码聚乳酸微球、所述的荧光免疫分析试纸、所述的生物芯片体系在制备诊断或检测肿瘤方面的试剂或试剂盒中的应用。
本发明的聚合物荧光微球,为以聚乳酸为基底与马来酸酐接枝反应而得的,CdSe/ZnS QDs纳米颗粒溶解到聚合物微球中自组装形成聚合物荧光微球。后将该微球应用于构建以水性CdTe QDs为标记物的液相悬浮式生物芯片体系,该体系以聚乳酸-马来酸酐荧光微球为载体,肿瘤标记物及其抗原抗体为基础,构建三明治型夹心免疫传感器结构。
其中,本发明还包括采用荧光试纸条层析法快速判断聚乳酸-马来酸酐是否与IgG抗体相连,具体包括下述步骤:采用黑色底板、样品垫、NC膜、吸水垫组合,底板上的NC膜的一端粘贴吸水垫,NC膜与吸水垫之间相互重叠1mm~2mm,在NC膜的另一端粘贴样品垫;将连接有IgG的聚乳酸-马来酸酐荧光微球滴于NC膜中间部分,取活化处理的水相CdTeQDs滴在样品垫上,由于吸收垫的虹吸作用,量子点沿着NC膜移动,通过在紫外灯下看NC膜处是否有明显的颜色变化,来判断出聚乳酸-马来酸酐是否与IgG抗体连接上。
其中,可以通过选用CA125、CA199、CA724、CEA这四种肿瘤标志物用于免疫检测实验,将聚乳酸-马来酸酐微球羧基化后进行表面探针抗体包被,同时将捕获抗体与水性CdTeQDs进行孵育反应,后将两者在室温避光振荡反应,以构建夹心免疫结构。
其中,本发明所用的聚乳酸的分子量为110000,所述的接枝反应温度为110℃,所述反应时间为18小时。
其中,本发明所用的水相CdTe QDs的波长为660nm;所述的聚乳酸-马来酸酐微球经活化后进行的。
其中,本发明所用的聚乳酸-马来酸酐微球羧基化是在0.1mol//LHCL下水解所得;所述的孵育反应在室温进行;所述振荡反应频率在1100rpm。
综上,本发明将聚乳酸、马来酸酐、过氧化甲苯酰溶于二氯甲烷中,干燥后于烘箱反应得聚乳酸-马来酸酐共聚物;再将新聚合物与CdSe/ZnS QDs纳米颗粒溶于三氯甲烷中,作为分散相溶液,与分散相不互溶的溶液作为连续相溶液,将分散相溶液、连续相溶液转移至SPG膜乳化器中,调节SPG膜乳化器的磁力搅拌器转速使连续相溶液通过SPG膜乳化器膜孔流动,调节外加氮气压力,气压稳定后将分散相溶液通过SPG膜孔压入到连续相溶液中,得到粒径均一的微乳液滴;微乳液滴经过固化、溶剂挥发制得新型聚乳酸荧光微球;利用荧光试纸条层析法快速判断新型聚乳酸微球是否具有生活活性,并应用于肿瘤标记物CA125、CA199、CA724、CEA的免疫检测分析。本发明提出的这种微球具有良好的生物相容性、稳定性、生物活性,在肿瘤标记物免疫检测中有高灵敏、高通量、快速等特点。该制备方法具备成本低廉、操作简单、制备快速、性能优异等优势,可制备粒径可控、均一的聚合物微球,易于实现工业化批量生产。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有以下显著优点:
(1)聚合物荧光微球制备流程简单,更易于实现批量化生产。通过SPG膜乳化器形成的大量小液滴只需要通过搅拌挥发溶剂即可得到直接使用得聚合物微球。在挥发过程中,分散相中的三氯甲烷随着时间一点点挥发,微球慢慢由大变小固化成为结构稳定的聚合物微球。
(2)聚合物荧光微球荧光稳定性较强。传统的聚合物荧光微球内部纳米颗粒的荧光强度会随着时间、温度、PH变化有较大的变动,限制了其广泛应用。本发明的聚合物微球中内部纳米颗粒由于溶剂大部分挥发,它们可以更加稳定地存在于聚合物微球内部,在外界环境变化时也能保持良好的荧光稳定性,大大提高了微球性能,扩展了其应用范围。
(3)聚合物荧光微球具有一定的生物活性。聚乳酸-马来酸酐荧光微球通过试纸条荧光免疫分析具有较好的生物活性,在肿瘤标记物免疫检测应用中有较大优势。所构建的液相生物悬浮芯片体系,与传统的固态生物芯片体系相比,具有高通量、高灵敏度、多组分、快速、操作简单,可重复性高等诸多优势。有益于其在免疫分析检测领域的广泛应用,拥有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的聚乳酸聚合物反应机理及制备过程;
图2为本发明的聚乳酸聚合物性能测试图;图2a为制备前后的实物图;图2b为PLA与PLA-MA的zeta电位图;图2c为PLA-MA的碳谱图;图2d为PLA-MA的热重分析图;
图3为本发明中采用SPG膜乳化结合溶剂挥发法制备聚乳酸荧光微球的过程示意图;
图4为本发明的聚乳酸荧光微球的光学显微镜图与SEM图;
图5为本发明的聚乳酸荧光微球的荧光稳定性测试图;
图6为本发明中的聚乳酸荧光微球的试纸条荧光免疫层析实验图;
图7为本发明的聚乳酸荧光微球的免疫分析检测示意图;
图8为本发明的聚乳酸荧光微球构建液相悬浮生物芯片应用于肿瘤标记物的检测标准曲线图;
图9为本发明的聚乳酸荧光微球构建液相悬浮生物芯片应用于肿瘤标记物的多组分检测标准曲线图。
图10为本发明的SPG膜乳化法与微乳液法制备PLA-MA微球的形貌图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案进行进一步说明。
本发明首先制备了聚乳酸聚合物,其次利用SPG膜乳化法结合溶剂挥发法制备了粒径均一的聚乳酸-马来酸酐荧光微球,通过试纸条荧光免疫分析检测其生物活性,最后应用于肿瘤标记物CA125、CA199、CA724、CEA的免疫检测分析。
主要试剂和耗材如下:聚乳酸(Mv=110000)、马来酸酐、过氧化苯甲酰、二氯甲烷、三氯甲烷、浓盐酸(HCl)、十二烷基磺酸钠(SDS)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、牛血清白蛋白(BSA)、油性ZnS/CdSe QDs(波长为525nm)、MG-20型外压式膜乳化器、SPG膜(孔径=5.1μm)、烘箱、磁力搅拌器均为市面上常规购买得到;肿瘤标记物(CA125、CA199、CA724、CEA)及其匹配的标记抗体和包被抗体均由江苏省疾病预防控制中心提供;羊抗鼠多克隆抗体IgG、样品垫、NC膜、吸水垫、聚氯乙烯(PVC)基板购买自上海杰一生物科技有限公司。离心管、移液枪及枪头、直尺、签字笔及紫外灯。
实施例1
1.1、聚乳酸聚合物(PLA-MA)的制备
将5g聚乳酸(Mw=110000)、0.5g马来酸酐、0.01g过氧化苯甲酰溶解于50mL的二氯甲烷中,再将溶液放置在真空干燥箱中室温干燥24h,以达到各个反应物充分融合在一起;后将干燥所得的白色固体混合物在烘箱中110℃反应18h,反应结束后得到淡黄色固体混合物;通过用三氯甲烷溶解产物与乙醚沉淀多次进行纯化,在10000rpm转速下离心3分钟,反复3次;最后将固体混合物真空40℃干燥10h,室温保存备用,为后续制备聚合物荧光微球奠定基础。
1.2、聚乳酸聚合物性能测试
将所制备的聚合物进行zeta电位测试,悬浮于5%SDS溶液中,测试结果图如图2(b),表明新制备的聚合物比聚乳酸的羧基含量大幅增加,从而增强聚合物的生物活性。通过红外光谱、热重分析(图2(c)(d))再次验证聚乳酸的接枝反应是成功的,大大增加了聚乳酸的活性。
实施例2
聚乳酸荧光微球的制备及其羧基化,如图3所示。
聚乳酸-马来酸酐荧光微球是通过SPG膜乳化法结合溶剂挥发法制备的。如图3所示,将4mL含有6.25%的实施例1制备的聚乳酸聚合物与10mg油性ZnS/CdSe QDs(波长为525nm)的三氯甲烷溶液倒入储液罐中,待压力稳定在0.008MPa时,打开连通储液罐的阀门,储液罐中的分散相在0.008MPa作用下透过SPG膜上的均一微孔在另一侧膜表面形成液滴,液滴迅速被烧杯中连续相所含表面活性剂SDS包裹。其中连续相是含有0.5wt%SDS的水溶液。通过连续的挤出过程,越来越多均一粒径分散相液滴分散并被乳化剂SDS包裹而稳定在连续相中,从而得到均一的O/W型乳液。紧接着将所得乳液室温搅拌过夜,以促进乳液液滴内三氯甲烷的挥发。随着溶剂三氯甲烷的挥发,乳液滴内部的PLA-MA(实施例1所制备的)液滴表面开始向液滴内部逐渐固化。离心洗涤去除表面活性剂,用纯水和无水乙醇各冼涤多次,之后将PLA-MA微球真空60℃干燥备用。取10mg的PLA-MA微球分散于pH=1的HCl溶液中,经12h磁力搅拌后,用体积比为1∶1的去离子水和乙醇的混合溶液离心洗涤微球若干次并干燥,即得到表面羧基官能化的PLA-MA荧光微球。其形貌如图4所示,由图可看出其大小均匀,直径为5μm、分散性好,且球体表面光滑,为聚乳酸-马来酸酐荧光微球在后续免疫分析检测尊定了基础。
实施例3
本实施例对聚乳酸-马来酸酐荧光微球的荧光稳定性进行评估如图5所示,步骤如下:
将实施例2所制备的聚乳酸-马来酸酐荧光微球在不同的温度下放置24小时,由图5(a)所示,在4~50℃范围内放置24h后微球信号基本不受影响,而在70℃、90℃处理24h后其荧光性能下降20%~40%,这说明PLA-MA量子点荧光微球具有较好的温度稳定性,能基本满足作为免疫检测载体所需温度条件;
将实施例2获得的聚乳酸-马来酸酐荧光微球,分散在不同pH的溶剂中(pH分别为1、3、5、7、9、11、13),测其荧光强度,荧光强度对比如图5(b)所示,由图可看出,在pH值从1到13的PBS水溶液中悬浮24小时后,微球在pH=1~9的较宽范围内荧光稳定性很好,只是在pH=11和13的强碱环境下荧光强度下降严重,这能是因为强碱环境下PLA-MA聚合物发生强烈的水解而使得微球部分溶解,导致微球内部的量子点与外界的水发生接触而发生淬灭。但这种强碱环境在实际应用中并不常见,属于较为极端的情况。这说明PLA-MA量子点编码荧光微球具有较好的pH稳定性,能基本满足作为免疫检测载体所需的pH值条件。
将实施例2获得的聚乳酸-马来酸酐荧光微球室温避光放置三周,如图5(c)所示,含有不同波长CdSe/ZnS量子点微球的荧光在长达21天的时间内在室温无需避光保存的条件下荧光强度均基本稳定。
因此,经膜乳化-乳液溶剂挥法制备的PLA-MA量子点复合微球具有优异的荧光稳定性和环境抗性,能满足绝大多数的免疫检测的应用需求。
实施例4
本实施例利用试纸条荧光免疫分析对聚乳酸-马来酸酐荧光微球进行简单快速判断是否可以用于免疫分析检测。步骤如下:
为进一步验证所制备的PLA-MA微球是否可以应用在夹心免疫分析检测中,我们提出利用荧光试纸条层析法进行快速判断。免疫层析试纸条的原理是特异的抗体先固定于NC膜的某一区带,当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品后,由于毛细管作用,样品将沿着该膜向前移动,当移动到固定有抗体的区域时,样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合,通过显色的方式,从而实现特异性的免疫诊断。如图6(a)所示,我们先把与IgG孵育一段时间的PLA-MA微球滴在NC膜中间一块区域,后取经过活化处理的水相红色CdTe量子点滴在样品垫上,再由于吸收垫的虹吸作用,红色量子点沿着NC膜移动,当移动到滴有微球区域时,由于IgG抗体与活性物质的强连接特性,则微球会通过显示肉眼可见的红色,从而让我们快速判断出PLA-MA是否与IgG抗体连接上。根据图6(b)的结果所示,2号试纸条的微球区域明显变红,而1、3号试纸条未发生颜色变化,说明我们所制备的PLA-MA微球可以连接上IgG抗体,从而说明了PLA-MA存在较多羧基,进而验证了PLA-MA具备应用于后续免疫检测的生物活性。基于此,我们还做了PLA微球(PLA微球是通过实施例2中把聚合物换成PLA制备而来的)荧光试纸条层析法快速判断实验,结果如图6(c)所示。通过对比图6(b)与图6(c)可发现,2号试纸条红色明显比5号试纸条的更亮,这可以说明改进过的PLA微球(PLA-MA微球)比PLA微球羧基含量大幅度提高,生物活性也大大提高。其中1、2、4、6号试纸条为空白对照实验,1、4号试纸条为活性封闭量子点流向含有IgG的微球,3、6号试纸条为活化量子点流向不含有IgG的活化微球。
实施例5
本实施例对聚乳酸-马来酸酐荧光微球应用于肿瘤标记物的免疫分析检测,构建液相悬浮生物芯片体系。步骤如下:
如图7所示,首先,取5mg PLA-MA微球加入20微升分别含有70mg/mL EDC和70mg/mLS-NHS的溶液中室温避光活化微球,使得微球表面羧基活化形成活性酯基酯;将活化后的微球充分分散悬浮于PBS缓冲液内,加10μg相应捕获抗体,室温避光振荡孵育3小时以包被X-Ab1(X=CA125、CA199、CA724、CEA);再向包被好抗体的微球加入500μL分析液室温避光反应30分钟以封闭微球表面的活性酯基,每次操作之后都洗涤离心多次。其次,取10μL含有10mg/mL的EDC溶液加入到500μL水相CdTe QDs(波长为660nm,浓度为2mg/mL)内,再向其加入100μL的X-Ab2(X=CA125、CA199、CA724、CEA)于室温避光反应3h;反应结束后,再加入10mg BSA室温避光振荡以封闭量子点表面未反应完的活性位点,记为X-Ab2-CdTe QDs(X=CA125、CA199、CA724、CEA)。然后,配制含有不同浓度的肿瘤标志物抗原的缓冲溶液(0、0.001、0.01、0.1、1、10、100和1000,浓度为KU/L或ng/mL),将包被有特异性抗体的PLA-MA微球加入到96孔板的微孔中,然后将抗原溶液以每孔150μL的量分别加入到有对应编码微球的96孔板的微孔中,于室温环境中避光1100rpm孵育1h,洗涤离心多次以除去未反应的抗原,记为X-Ag(X=CA125、CA199、CA724、CEA)。紧接着,向含有X-Ag的96孔板的各微孔加入100μLX-Ab2-CdTe QDs于室温避光反应1小时以构建三明治夹心免疫结构,然后洗涤离心多次。最后,将表面带有夹心免疫结构的荧光PLA-MA量子点微球重悬于200μL分析液中,转移到流式细胞仪管中进行流式检测分析。
表1符号说明
实施例6
本实施例对聚乳酸-马来酸酐荧光微球对肿瘤标记物进行免疫检测的标准曲线如图8所示。
本实施例对实施例5中所构建的液相生物芯片体系对肿瘤标记物CA125、CA199、CA724、CEA进行免疫分析检测,以样品内的抗原浓度为横坐标,以流式细胞仪所读取的10000个相应编码微球在FL4通道内所检测的归一化后的荧光强度的平均值(MeanFluorescent Intensity,简称MFI)为纵坐标,并按四参数logistic拟合模型作出标准曲线,如图8所示,即建立了分别针对CA125、CA199、CA724、CEA的免疫检测标准曲线(图中误差条error bar显示的是多次实验所得标准差),如图8所示。
选用三个不同量(2.5μg、5μg和10μg)作为CA125、CA199、CA724、CEA的一抗投料量进行了单因子免疫检测实验。由于样品内目标抗原浓度越高,微球表面探针捕捉到的目标抗原数量也越多,所以能够连接上的定量标记物荧光报告分子水相RQDs数量也越多。根据图8的各个标记物的免疫检测标准曲线,对于CA125、CA724的单因子免疫检测实验(图8(a)、(d)),可以看出三条标准曲线基本重合,但通过其中区域放大图考察曲线拐点不难发现检测灵敏度随着投料量的增大而提高,这是因为投料量提升也即包被量的增大对背景荧光影响不大但对检测信号强度有明显提升,从而使其信噪比提升。所以我们后续实验中选择10μg作为CA125、CA724检测时的探针投料量。针对CA199、CEA的单因子免疫检测实验(如图8(b)(c)),可以明显看出,2.5μg探针包被量对应的检测曲线灵敏度最差,而投料量5μg和10μg对应的标准曲线基本重合,说明两种投料量在检测效果上基本无差别。基于节约成本的原则,我们后续实验中选择5μg作为CA199、CEA检测时的探针投料量。通过这些单因子检测标准曲线可以估算这些单因子免疫检测系统的灵敏度。以上单因子检测曲线的最低检测限(LOD值)如下表2,进一步表明通过对标准曲线的观察所选定的探针投料量均符合检测灵敏度更高的原则。在最佳一抗投料量下,CA125的检测限为1.62KU L-1,CA199的检测限为0.923KUL-1,CA724的检测限为1.06KU L-1,CEA的检测限为0.138ng mL-1,表明PLA-MA荧光微球对肿瘤标志物的检测性能优异。另外,这些单因子免疫检测的结果也表明了基于微球的肿瘤标志物检测系统的成功建立,且具备较高的灵敏度。
表2四种肿瘤标志物单因子检测灵敏度与探针包被量的关系
实施例7
本实施例对基于实施例5所构建的聚乳酸-马来酸酐荧光微球对肿瘤标记物的液相生物芯片体系进行多组分免疫检测如图9所示。
选用CA125、CA199、CA724、CEA的最佳一抗投料量10μg、5μg、10μg、5μg进行多元混合免疫检测。液相悬浮式生物芯片多元化检测的基本原理是通过利用表面带有不同捕获抗体探针的编码微球各自特异性地捕捉相应的目标抗原分子,并利用微球编码进行分别定量分析。多元混合免疫检测是加入多种带有相应特异性探针抗体的荧光编码微球同时检测样品中多种目标抗原分子,以考察液相悬浮式生物芯片在多元检测中的效果。其具体实验步骤与单因子免疫检测类似,区别在于将所有目标分子对应的抗原溶液、分别包被特异性探针的编码微球、生物素化的检测抗体溶液集中到一个孔中进行反应,而样品内各目标抗原的浓度梯度、相应的表面包被特异性抗体的各种荧光编码微球的数量、相应的生物素化检测抗体的含量均分别与各自单因子检测时相同。将含有10μg、5μg、10μg、5μg的CA125、CA199、CA724、CEA的一抗加入到一管中进行孵育反应3小时,洗涤离心(6000rpm,3min);再加入100μLCA125、CA199、CA724、CEA的抗原进行室温孵育反应1小时,洗涤离心(6000rpm,3min);最后加入100μLCA125、CA199、CA724、CEA的二抗进行孵育反应3小时,洗涤离心(6000rpm,3min)。将反应完的溶液送至流式细胞仪进行检测,读取数据绘制成图9的曲线图。
从图9的多元混合免疫检测曲线,可以看出各标志物的多因子免疫检测标准曲线的线性趋势与其单因子免疫检测标准曲线相似,且在极低浓度(接近0ng/mL或0KU/L时)的MFI信号接近于零,说明在多因子检测体系中背景噪声并未明显增大,说明体系中交叉反应不明显。这说明我们自制液相悬浮式生物芯片在肿瘤标志物多因子免疫检测上具有良好的效果。
实施例8
本实施例将用SPG膜乳化法制备微球与微乳液法制备微球的对比,如图10所示。
配置4mL含7%PLA-MA、50μL量子点(CdSe/ZnS)的三氯甲烷溶液为分散相,以含0.5wt.%十二烷基硫酸钠的200mL蒸馏水为连续相。首先,选择400rpm为连续相搅拌速度以提供合适的剪切力,使得液滴在粒径达到某一临界值时即从膜表面脱离而进入连续相;再调节压力,待压力稳定在0.008MPa后,打开连通储液罐的阀门,储液罐中的分散相在一定氮气压力作用下透过SPG膜上的均一微孔在另一侧膜表面形成液滴,液滴迅速被烧杯中连续相所含表面活性剂SDS包裹。通过连续的挤出过程,越来越多均一粒径分散相液滴分散并被乳化剂SDS包裹而稳定在连续相中,从而最终得到均一的O/W型乳液。如图10(a)。微乳液溶剂挥发法是先将纳米颗粒CdSe/ZnS和聚合物PLA-MA在分散相溶剂中混合均匀,而后采用搅拌、超声等乳化方式使分散相在含表面活性剂的连续相中形成乳液滴,最后乳液滴中的分散相溶剂挥发而固化成复合微球,如图10(b)所示。从图可以看出,两种方法制备出来的微球差异性较大,SPG膜乳化法制备的微球均一性良好,小球粒径均一,而微乳液法制备的微球分散性较差。
Claims (10)
1.一种量子点荧光编码聚乳酸微球,其特征在于,所述量子点荧光编码聚乳酸微球先通过马来酸酐、过氧化苯甲酰对聚乳酸进行接枝改性反应制得聚乳酸-马来酸酐聚合物,然后通过SPG膜乳化法制备即得。
2.根据权利要求1所述的量子点荧光编码聚乳酸微球,其特征在于,所述SPG膜乳化法具体包括如下步骤:将制备的聚乳酸-马来酸酐聚合物溶解于三氯甲烷中,再加入油性ZnS/CdSe QDs,超声分散均匀,制成分散相溶液,与分散相溶液互不相溶的溶液作为连续相溶液;将分散相溶液、连续相溶液转移至SPG膜乳化器中,调节SPG膜乳化器的磁力搅拌器转速使连续相溶液通过SPG膜乳化器膜孔流动,调节外加氮气压力,气压稳定后将分散相溶液通过SPG膜孔压入到连续相溶液中,得到粒径均一的微乳液滴;微乳液滴经过固化、溶剂挥发制得新型聚乳酸荧光微球。
3.根据权利要求2所述的量子点荧光编码聚乳酸微球,其特征在于,所述油性ZnS/CdSeQDs波长为510-530nm;SPG膜膜孔直径为5.1μm;所述磁力搅拌器的转速为300-400 rpm;所述外加氮气的压力为0.008-0.012MPa;所述氮气气压的稳定时间为0-2 min,所述微乳液滴类型为水包油型O/W;所述溶剂挥发固化时间是10-12h。
4.权利要求1-3任一项所述的量子点荧光编码聚乳酸微球的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)聚乳酸-马来酸酐聚合物的制备;
2)量子点荧光编码聚乳酸微球的制备。
5.根据权利要求4所述的量子点荧光编码聚乳酸微球的制备方法,其特征在于,步骤1)中聚乳酸-马来酸酐聚合物的制备步骤如下:将聚乳酸、马来酸酐、过氧化苯甲酰溶解于二氯甲烷中得到溶液,再将溶液干燥得到白色固体混合物;后将干燥所得的白色固体混合物在烘箱中反应,反应结束后得到淡黄色固体混合物;通过用三氯甲烷溶解产物与乙醚沉淀多次进行纯化,离心,最后将固体混合物真空干燥即得。
6.一种荧光免疫分析试纸,其特征在于,所述荧光免疫分析试纸包括权利要求1所述的量子点荧光编码聚乳酸微球。
7.一种生物芯片体系,其特征在于,所述生物芯片体系包括包被有特异性抗体的权利要求1所述的量子点荧光编码聚乳酸微球、水相CdTe QDs标记的肿瘤标记抗体以及通过抗原-抗体间相互作用与两者分别相连的肿瘤标志物抗原。
8.根据权利要求7所述的生物芯片体系,其特征在于,所述肿瘤标记抗体选用CA125、CA199、CA724、CEA中的一种或几种对应的抗体,所述肿瘤标志物抗原选用CA125、CA199、CA724、CEA中的一种或几种。
9.权利要求7或8所述的生物芯片体系的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)聚乳酸-马来酸酐聚合物的制备;
2)量子点荧光编码聚乳酸微球的制备;
3)量子点荧光编码聚乳酸微球表面包被特异性抗体;
4)将抗原溶液加入步骤3)中室温环境中避光孵育,得到X-Ag;
5)将水相CdTe QDs标记的肿瘤标记抗体加入到X-Ag中构建得到三明治夹心免疫结构。
10.权利要求1-3任一项所述的量子点荧光编码聚乳酸微球、权利要求6所述的荧光免疫分析试纸、权利要求7-8任一项所述的生物芯片体系在制备诊断或检测肿瘤方面的试剂或试剂盒中的应用。
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