KR102001724B1 - 나노입자 어셈블리 구조체 및 이를 이용한 면역 분석 방법 - Google Patents

나노입자 어셈블리 구조체 및 이를 이용한 면역 분석 방법 Download PDF

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Abstract

나노입자 어셈블리 구조체 및 이를 이용한 면역 분석 방법이 제공된다. 상기 나노입자 어셈블리 구조체는, 복수 개의 제1 나노입자가 모여 이루어진 제1 어셈블리 입자를 포함하는 제1 나노입자 어셈블리 구조체를 포함하고, 상기 제1 어셈블리 입자는 자성을 갖는다. 본 발명의 실시예들에 따른 면역 분석 방법은, 완충 용액에 피분석물, 자성을 갖는 제1 나노입자 어셈블리 구조체, 및 발광성을 갖는 제2 나노입자 어셈블리 구조체를 제공하는 단계 및 상기 완충 용액에 자력을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 제1 나노입자 어셈블리 구조체는, 복수 개의 제1 나노입자가 모여 이루어진 제1 어셈블리 입자, 및 상기 제1 어셈블리 입자에 연결된 제1 항체를 포함하고, 상기 제2 나노입자 어셈블리 구조체는, 복수 개의 제2 나노입자가 모여 이루어진 제2 어셈블리 입자, 및 상기 제2 어셈블리 입자에 연결된 제2 항체를 포함하며, 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 상기 피분석물과 결합할 수 있다.

Description

나노입자 어셈블리 구조체 및 이를 이용한 면역 분석 방법{NANOPARTICLE ASSEMBLY STRUCTURE AND IMMUNOASSAY METHOD USING THE SAME}
본 발명은 나노입자 어셈블리 구조체 및 이를 이용한 면역분석법에 관한 것이다.
최근 나노기술의 진보에 따라 다양한 면역 분석법이 개발되어 제안되고 있다. 그러나 부최적 재현성(suboptimal reproductibility), 기질의 불균일 신호, 멀티플렉스 검출 능력의 결여, 주문 설계된 장치에 대한 필요성 등과 같은 다양한 기술적 어려움과 한계가 여전히 존재한다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 면역 분석을 용이하게 하는 나노입자 어셈블리 구조체를 제공한다.
본 발명은 상기 나노입자 어셈블리 구조체를 이용한 면역 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적들은 다음의 상세한 설명과 첨부한 도면으로부터 명확해 질 것이다.
본 발명의 실시예들에 따른 나노입자 어셈블리 구조체는, 복수 개의 제1 나노입자가 모여 이루어진 제1 어셈블리 입자를 포함하는 제1 나노입자 어셈블리 구조체를 포함하고, 상기 제1 어셈블리 입자는 자성을 갖는다.
상기 제1 나노입자는 산화철 나노입자를 포함할 수 있다. 상기 제1 나노입자 어셈블리 구조체는 상기 제1 어셈블리 입자에 연결된 제1 항체를 더 포함할 수 있다.
상기 나노입자 어셈블리 구조체는, 복수 개의 제2 나노입자가 모여 이루어진 제2 어셈블리 입자를 포함하는 제2 나노입자 어셈블리 구조체를 더 포함할 수 있고, 상기 제2 어셈블리 입자는 발광성을 갖는다.
상기 제2 나노입자 어셈블리 구조체는 상기 제2 어셈블리 입자에 연결된 제2 항체를 더 포함할 수 있다.
상기 제1 어셈블리 입자 및 상기 제2 어셈블리 입자 중에서 적어도 어느 하나는 스트렙타비딘을 포함할 수 있고, 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체 중에서 적어도 어느 하나는 비오틴을 포함할 수 있으며, 상기 제1 나노입자 어셈블리 구조체 및 상기 제2 나노입자 어셈블리 구조체 중에서 적어도 어느 하나는 스트렙타비딘-비오틴 결합을 포함할 수 있다.
상기 제2 나노입자는 ZnS:Mn 나노입자 및 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 중에서 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 제2 나노입자 어셈블리 구조체는, 상기 ZnS:Mn 나노입자에 연결된 제2 항체와 상기 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자에 연결된 제3 항체를 더 포함할 수 있다. 상기 제2 항체와 상기 제3 항체는 서로 다를 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 면역 분석 방법은, 완충 용액에 피분석물, 자성을 갖는 제1 나노입자 어셈블리 구조체, 및 발광성을 갖는 제2 나노입자 어셈블리 구조체를 제공하는 단계; 및 상기 완충 용액에 자력을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 제1 나노입자 어셈블리 구조체는, 복수 개의 제1 나노입자가 모여 이루어진 제1 어셈블리 입자, 및 상기 제1 어셈블리 입자에 연결된 제1 항체를 포함하고, 상기 제2 나노입자 어셈블리 구조체는, 복수 개의 제2 나노입자가 모여 이루어진 제2 어셈블리 입자, 및 상기 제2 어셈블리 입자에 연결된 제2 항체를 포함하며, 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 상기 피분석물과 결합할 수 있다.
상기 제1 나노입자는 산화철 나노입자를 포함하고, 상기 제2 나노입자는 ZnS:Mn 나노입자 및 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 중에서 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 면역 분석 방법은, 상기 완충 용액에 발광성을 갖는 제3 나노입자 어셈블리 구조체를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 제3 나노입자 어셈블리 구조체는, 복수 개의 제3 나노입자가 모여 이루어진 제3 어셈블리 입자, 및 상기 제3 어셈블리 입자에 연결된 제3 항체를 포함하고, 상기 제3 항체는 상기 피분석물과 결합할 수 있다. 상기 제1 나노입자는 산화철 나노입자를 포함하고, 상기 제2 나노입자는 ZnS:Mn 나노입자를 포함하며, 상기 제3 나노입자는 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자를 포함할 수 있다.
상기 제1 어셈블리 입자 및 상기 제2 어셈블리 입자 중에서 적어도 어느 하나는 스트렙타비딘을 포함할 수 있고, 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체 중에서 적어도 어느 하나는 비오틴을 포함할 수 있으며, 상기 제1 나노입자 어셈블리 구조체 및 상기 제2 나노입자 어셈블리 구조체 중에서 적어도 어느 하나는 스트렙타비딘-비오틴 결합을 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 나노입자 어셈블리 구조체를 이용하여 면역 분석을 용이하게 수행할 수 있다. 상기 나노입자 어셈블리 구조체는 나노입자의 고유 성질과 나노입자들의 상호작용으로부터 발생하는 물리적 및 화학적 특성을 이용하여 종래의 면역 분석 방법의 한계를 극복할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 산화철 나노입자의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 2는 도 1의 산화철 나노입자의 크기 분포를 나타낸다.
도 3은 도 1의 산화철 나노입자의 자기 히스테리시스 루프를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 ZnS:Mn 나노입자의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 5는 도 4의 ZnS:Mn 나노입자의 크기 분포를 나타낸다.
도 6은 도 4의 ZnS:Mn 나노입자의 흡광 스펙트럼(청색)과 광루미네선스 스펙트럼(적색)을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 어셈블리 구조체의 형성 과정을 개략적으로 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 어셈블리 구조체의 PAA 코팅에 따른 제타 포텐셜 변화를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 산화철 나노입자 어셈블리 구조체의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 10은 도 9의 산화철 나노입자 어셈블리 구조체의 크기 분포를 나타낸다.
도 11은 도 9의 산화철 나노입자 어셈블리 구조체의 자기 히스테리시스 루프를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 13은 도 12의 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 크기 분포를 나타낸다.
도 14는 도 12의 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 표준화된 일광자 PLE 스펙트럼(청색)과 광루미네선스 스펙트럼(적색)을 나타낸다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 산화철 나노입자 어셈블리 구조체의 스트렙타비딘과 항체의 결합 후 유체역학적 직경 변화를 나타낸다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 항체 결합 후 유체역학적 직경 변화를 나타낸다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역분석법을 설명하기 위한 도면이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 PL 강도를 나타낸다.
도 19는 도 18의 저농도 영역을 확대하여 나타낸다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 산화철 나노입자 어셈블리 구조체와 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체를 이용하여 획득한 CRP 농도에 대한 광루미네선스를 나타낸다.
도 21은 타겟 단백질에 결합된 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체와 산화철 나노입자 어셈블리 구조체의 자기 분리 후에 획득한 콜로이드 나노입자 어셈블리 구조체의 TEM 이미지이다.
도 22는 면역분석의 검출한계를 나타낸다.
도 23은 산화철 나노입자 어셈블리 구조체와 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 사용양을 다르게 하여 획득한 CRP 농도에 대한 광루미네선스를 나타낸다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역분석법 및 ELISA를 이용하여 측정된 인간 혈청 샘플 내 CRP 농도의 상관 관계를 나타낸다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 26은 도 25의 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자의 크기 분포를 나타낸다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 28은 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체의 크기 분포를 나타낸다.
도 29는 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자와 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체의 광루미네선스를 비교하여 나타낸다.
도 30은 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체와 산화철 나노입자 어셈블리 구조체를 이용하여 획득한 EpCAM에 대한 광루미네선스를 나타낸다.
도 31은 다양한 농도의 CRP 존재 하에서 다양한 농도의 EpCAM에 대하여 획득한 광루미네선스를 나타낸다.
도 32는 다양한 농도의 EpCAM 존재 하에서 다양한 농도의 CRP에 대하여 획득한 광루미네선스를 나타낸다.
이하, 실시예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예들을 통해 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서, 이하의 실시예들에 의하여 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
본 명세서에서 제1, 제2 등의 용어가 다양한 요소들(elements)을 기술하기 위해서 사용되었지만, 상기 요소들이 이 같은 용어들에 의해서 한정되어서는 안 된다. 이러한 용어들은 단지 상기 요소들을 서로 구별시키기 위해서 사용되었을 뿐이다. 또, 어떤 요소가 다른 요소 위에 있다고 언급되는 경우에 그것은 다른 요소 위에 직접 형성될 수 있거나 또는 그들 사이에 제3의 요소가 개재될 수도 있다는 것을 의미한다.
도면들에서 요소의 크기, 또는 요소들 사이의 상대적인 크기는 본 발명에 대한 더욱 명확한 이해를 위해서 다소 과장되게 도시될 수 있다. 또, 도면들에 도시된 요소의 형상이 제조 공정상의 변이 등에 의해서 다소 변경될 수 있을 것이다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 실시예들은 특별한 언급이 없는 한 도면에 도시된 형상으로 한정되어서는 안 되며, 어느 정도의 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 용어인 ZnS:Mn 나노입자는 Mn이 도핑된 ZnS 나노입자를 의미하고, Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자는 Cd1 - xZnxS가 코어이고, ZnS이 쉘인 코어/쉘 나노입자를 의미하며, Cd1 - xZnxS/ZnS에서 x는 0과 1 사이의 실수를 나타낸다. 어셈블리 입자는 나노입자들이 모여서 입자 형태로 형성된 것을 의미하고, 나노입자 어셈블리 구조체는 어셈블리 입자를 포함하는 구조체를 의미한다. 예를 들어, 산화철 어셈블리 입자는 산화철 나노입자들이 모여 입자 형태로 형성된 것이고, 산화철 나노입자 어셈블리 구조체는 상기 산화철 어셈블리 입자를 포함하는 구조체이다. IONA는 산화철 나노입자 어셈블리 구조체를 의미하고, MZSNA는 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체를 의미하며, CZSNA는 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 어셈블리 구조체는, 제1 나노입자 어셈블리 구조체 및 제2 나노입자 어셈블리 구조체를 포함할 수 있다.
상기 제1 나노입자 어셈블리 구조체는, 복수 개의 제1 나노입자가 모여 이루어진 제1 어셈블리 입자, 및 상기 제1 어셈블리 입자에 연결된 제1 항체를 포함할 수 있고, 상기 제1 어셈블리 입자는 자성을 가질 수 있다. 상기 제1 나노입자는 산화철 나노입자를 포함할 수 있다.
상기 제2 나노입자 어셈블리 구조체는, 복수 개의 제2 나노입자가 모여 이루어진 제2 어셈블리 입자, 및 상기 제2 어셈블리 입자에 연결된 제2 항체를 포함할 수 있고, 상기 제2 어셈블리 입자는 발광성을 가질 수 있다. 상기 제2 나노입자는 ZnS:Mn 나노입자를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 나노입자 어셈블리 구조체는, 제3 나노입자 어셈블리 구조체를 더 포함할 수 있다. 상기 제3 나노입자 어셈블리 구조체는, 복수 개의 제3 나노입자가 모여 이루어진 제3 어셈블리 입자, 및 상기 제3 어셈블리 입자에 연결된 제3 항체를 포함할 수 있고, 상기 제3 어셈블리 입자는 발광성을 가질 수 있다. 상기 제3 나노입자는 Cd1-xZnxS/ZnS 나노입자를 포함할 수 있다.
상기 제1 어셈블리 입자, 상기 제2 어셈블리 입자, 및/또는 상기 제3 어셈블리 입자는 스트렙타비딘을 포함할 수 있고, 상기 제1 항체, 상기 제2 항체, 및/또는 상기 제3 항체는 비오틴을 포함할 수 있으며, 상기 항체는 상기 스트렙타비딘과 상기 비오틴의 결합에 의해 상기 어셈블리 입자에 연결될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 면역 분석 방법은, 완충 용액에 피분석물, 자성을 갖는 제1 나노입자 어셈블리 구조체, 및 발광성을 갖는 제2 나노입자 어셈블리 구조체를 제공하는 단계; 및 상기 완충 용액에 자력을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 제1 나노입자 어셈블리 구조체는, 복수 개의 제1 나노입자가 모여 이루어진 제1 어셈블리 입자, 및 상기 제1 어셈블리 입자에 연결된 제1 항체를 포함하고, 상기 제2 나노입자 어셈블리 구조체는, 복수 개의 제2 나노입자가 모여 이루어진 제2 어셈블리 입자, 및 상기 제2 어셈블리 입자에 연결된 제2 항체를 포함하며, 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 상기 피분석물과 결합할 수 있다.
상기 면역 분석 방법은, 상기 완충 용액에 발광성을 갖는 제3 나노입자 어셈블리 구조체를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 제3 나노입자 어셈블리 구조체는, 복수 개의 제3 나노입자가 모여 이루어진 제3 어셈블리 입자, 및 상기 제3 어셈블리 입자에 연결된 제3 항체를 포함하고, 상기 제3 항체는 상기 피분석물과 결합할 수 있다.
상기 제1 나노입자는 산화철 나노입자를 포함하고, 상기 제2 나노입자는 ZnS:Mn 나노입자를 포함하며, 상기 제3 나노입자는 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자를 포함할 수 있다.
상기 제1 어셈블리 입자는 스트렙타비딘을 포함하고, 상기 제1 항체는 비오틴을 포함하며, 상기 제1 항체는 상기 스트렙타비딘과 상기 비오틴의 결합에 의해 상기 제1 나노입자에 연결될 수 있다.
[ 실시예 ]
산화철 나노입자, ZnS:Mn 나노입자, 및 Cd 1 - x Zn x S / ZnS 나노입자의 합성
올레산 철(Iron oleate)(1.8g) 및 올레산(oleic acid)(0.28g)을 1-옥타데센(octadecene)(10g)에 첨가하여 혼합 용액을 형성한다. 상기 혼합 용액을 320℃로 가열하고, 이 온도에서 30분 동안 유지한다. 상기 혼합 용액을 실온으로 냉각하고 에탄올로 세정한다. 상기 혼합 용액을 원심분하여 산화철 나노입자를 획득한다.
염화 아연(0.4g) 및 염화 망간(20mg)을 디벤질아민(dibenzylamine)(55g)에 용해시켜 혼합 용액을 형성한다. 황(0.6g)을 첨가한 후 상기 혼합 용액을 260℃로 가열하고 이 온도에서 15분 동안 유지한다. 상기 혼합 용액을 150℃로 냉각하고, 디벤질아민(5g)에 용해된 염화 아연(0.4g)을 첨가한다. 상기 혼합 용액을 260℃로 가열하고 이 온도에서 15분 동안 유지한다. 상기 혼합 용액을 냉각한 후 1-프로판올을 첨가하여 반응 혼합물을 세정한다. 상기 혼합 용액을 원심분리하여 ZnS:Mn 나노입자를 획득한다.
산화카드뮴(0.13g), 아세트산 아연(1.8g), 및 올레산(6.3g)을 1-옥타데센(11.8g)과 혼합시켜 혼합 용액을 형성한다. 상기 혼합 용액을 320℃로 가열하고, 1-옥타데센(1.9g)에 용해된 황(48mg)을 첨가한다. 10분 후에, 트리부틸포스핀(tributylphosphine)(2.4g)에 용해된 황(256mg)을 첨가한다. 상기 혼합 용액을 320℃에서 30분 동안 유지한다. 상기 혼합 용액을 실온으로 냉각시키고 에탄올로 세정한다. 상기 혼합 용액을 원심분리하여 Cd1-xZnxS/ZnS 나노입자를 획득한다.
산화철 나노입자 어셈블리 구조체, ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체, 및 Cd 1-x Zn x S/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체의 합성
콜로이드 나노입자 어셈블리 구조체는 오일-인-워터 마이크로에멀젼 시스템(oil-in-water microemulsion system)에서 자기 조립 공정에 의해 형성된다.
산화철 나노입자 어셈블리 구조체의 합성을 위해, 클로로포름(4.5g) 내 산화철 나노입자(150mg)(iron oxide nanoparticles in chloroform)를 탈이온수(10g) 내 브롬화 도데실트리메틸암모늄(150mg)(dodecyltrimethylammonium bromide in deionized water)에 첨가하여 혼합 용액을 형성한다. 상기 혼합 용액을 실온에서 하룻밤 동안 젓는다. 상기 혼합 용액에 에틸렌 글리콜(11.1g) 내 폴리아크릴산(0.9g)(poly(acrylic acid) in ethylene glycol)을 첨가하고 잘 혼합시킨다. 상기 혼합 용액을 탈이온수로 세정한 후 원심분리하여 산화철 나노입자 어셈블리 구조체를 획득한다.
ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체와 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체도 위와 같은 방법으로 획득한다.
산화철 나노입자 어셈블리 구조체, ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체, 및 Cd 1-x Zn x S/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체에 항체 결합
2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 완충 용액(100㎕) 내 EDC(1mg) 및 NHS(1mg)(EDC and NHS in 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid buffer)를 탈이온수(500㎕) 내 산화철 나노입자 어셈블리 구조체(1mg [Fe])(IONAs in deionized water)에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이트한다. 이 혼합 용액을 원심분리하여 산화철 나노입자 어셈블리 구조체를 분리시킨다. PBS(1㎖) 내 스트렙타비딘(100㎍)(Streptavidin in phosphate-buffered saline)을 상기 산화철 나노입자 어셈블리 구조체에 첨가하고, 1시간 동안 반응시킨다. 상기 스트렙타비딘-결합 산화철 나노입자 어셈블리 구조체를 희석 완충 용액(예를 들어, 0.1% 소혈청알부민과 0.05% 트윈 20을 포함하는 붕산염 완충 용액)으로 세정하고 원심분리한 후 희석 완충 용액(500㎕)에서 비오틴이 부착된 CRP 항체 또는 EpCAM 항체와 혼합하고, 2시간 동안 반응시킨다. 스트렙타비딘-비오틴 결합에 의해 산화철 나노입자 어셈블리 구조체에 항체가 결합되고, 항체-결합 산화철 나노입자 어셈블리 구조체가 형성된다. 상기 항체-결합 산화철 나노입자 어셈블리 구조체를 세정하고 원심분리한 후 희석 완충 용액(500㎕)에 분산시킨다.
위와 같은 EDC/NHS 활성화가 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체(1mg [Zn])에 수행된다. ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체는 원심분리에 의해 분리되고, 희석 완충 용액(500㎕)에서 CRP 항체와 혼합되고 항체-결합 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체가 형성된다. 비오틴이 부착되지 않은 항체는 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체에 직접 결합된다. 이와 같은 방법으로 항체-결합 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체가 형성된다.
제조된 항체-결합 나노입자 어셈블리 구조체는 4℃에서 보관된다.
콜로이드 나노입자 어셈블리 구조체를 이용한 면역분석법
샘플 CRP 용액(100㎕)을 희석 완충 용액(100㎕)에서 CRP 항체-결합 산화철 나노입자 어셈블리 구조체(80ng [Fe]) 및 CRP 항체-결합 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체(80ng [Zn])에 첨가하여 반응시킨다. 상기 혼합 용액 100㎕를 자석이 배치된 96-웰 플레이트에 제공하고, 30분 동안 인큐베이트한다. 상기 플레이트를 플레이트 판독 장비에 로딩하고 340±30nm 여기 및 579±12nm 방출 필터를 이용하여 PL 강도를 측정한다. 획득한 PL 강도를 제로-피분석물(zero-analyte)의 PL 강도에 대하여 표준화한다.
EpCAM 항체-결합 산화철 나노입자 어셈블리(20㎍ [Fe]) 및 EpCAM 항체-결합 Cd1-xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리(20㎍ [Cd+Zn])를 이용하는 것을 제외하고 CRP 분석과 동일하게 EpCAM 분석을 수행한다. 355±20nm 여기 및 460±12nm 방출 필터를 이용하여 PL 강도를 측정한다. 획득한 PL 강도를 제로-피분석물(zero-analyte)의 PL 강도에 대하여 표준화한다.
항체-결합 산화철 나노입자 어셈블리 구조체, 항체-결합 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체, 및 항체-결합 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리를 포함하는 혼합 용액으로 두플렉스 분석(Duplex assay)을 수행한다. 나머지 절차는 싱글플렉스(singleplex) 분석과 같다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 산화철 나노입자의 TEM 이미지를 나타내고, 도 2는 도 1의 산화철 나노입자의 크기 분포를 나타내며, 도 3은 도 1의 산화철 나노입자의 자기 히스테리시스 루프를 나타낸다.
도 1 내지 도 3을 참조하면, 산화철 나노입자는 올레산철(iron oleate)의 열 분해에 의해 합성될 수 있다. 산화철 나노입자는 약 18nm의 평균 크기의 구 형상을 갖고, 크기 분포가 좁다. 300K에서 측정된 산화철 나노입자의 자기(자화) 거동은 히스테리시스 루프(hysteresis loop)를 보이지 않으며, 실온에서 산화철 나노입자는 초상자성 성질을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 ZnS:Mn 나노입자의 TEM 이미지를 나타내고, 도 5는 도 4의 ZnS:Mn 나노입자의 크기 분포를 나타내며, 도 6은 도 4의 ZnS:Mn 나노입자의 흡광 스펙트럼(청색)과 광루미네선스 스펙트럼(적색)을 나타낸다.
도 4 내지 도 6을 참조하면, ZnS:Mn 나노입자는 디벤질아민에서 염화아연과 염화망간을 황과 반응시키는 것에 의해 형성될 수 있다. ZnS:Mn 나노입자는 약 4.8nm의 평균 크기를 갖는 구형에 가까운 형상을 가질 수 있다. ZnS:Ms 나노입자의 UV-Vis 흡광 및 광루미네선스(PL) 스펙트럼에 따르면, Mn2 +이온의 4T1에서 6A1 전이에서 유래된 575nm에서의 강한 방출 피크를 통해 고품질의 ZnS:Mn 나노입자가 합성되었음을 확인할 수 있다. ICP-AES(inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy)에 의해 결정되는 Mn 도핑 수준은 1%이고, ZnS:Mn 나노입자의 PL 양자 수율(QY)은 약 40%이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 어셈블리 구조체의 형성 과정을 개략적으로 나타낸다.
도 7을 참조하면, 산화철 나노입자 어셈블리 구조체와 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체는 오일-인-워터 마이크로에멀젼 시스템(oil-in-water microemulsion system)을 이용하여 산화철 나노입자와 ZnS:Mn 나노입자의 자기 조립(self-assembly)으로부터 형성된다.
클로로포름 내 분산된 나노입자들은 DTAB(dodecyltrimethylammonium bromide)의 존재 하에 탈이온수와 혼합되고, 자기 조립된 나노입자들은 상기 클로로포름 증발 후 콜로이드 어셈블리 입자를 형성한다. 양전하로 충전된 콜로이드 어셈블리 입자는 정전 상호작용에 의해 음전하로 충전된 고분자 전해질인 PAA(poly(acrylic acid))로 코팅된다. 산화철 어셈블리 입자와 ZnS:Mn 어셈블리 입자 표면의 PAA 코팅은 추가적인 기능화를 위해 유용한 카르복실산 작용기를 제공한다.
도면에 도시되지 않았지만, 산화철 나노입자 어셈블리 구조체는 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)와 NHS(N-hydroxysuccinimide) 커플링 반응을 통해 스트렙타비딘으로 기능화되고, 비오틴이 부착된 항체(biotinylated antibodies)는 고친화성 스트렙타비딘-비오틴(streptavidin-biotin) 결합을 통해 산화철 나노입자 어셈블리 구조체에 고정화된다. 비오틴이 부착되지 않은 항체는 EDC/NHS 커플링을 이용하여 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 표면에 직접 부착된다. 항체의 결합(conjugation)은 유체역학적 직경을 증가시킨다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자 어셈블리 구조체의 PAA 코팅에 따른 제타 포텐셜 변화를 나타낸다.
도 8을 참조하면, 상기 나노입자 어셈블리 구조체의 제타 포텐셜은 초기 양전하 충전이 PAA 코팅 후 음으로 바뀌는 것으로 나타난다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 산화철 나노입자 어셈블리 구조체의 TEM 이미지를 나타내고, 도 10은 도 9의 산화철 나노입자 어셈블리 구조체의 크기 분포를 나타내며, 도 11은 도 9의 산화철 나노입자 어셈블리 구조체의 자기 히스테리시스 루프를 나타낸다.
도 9 내지 도 11을 참조하면, 산화철 나노입자 어셈블리 구조체는 평균 크기 약 190nm의 다면체 형상을 갖는다. 산화철 나노입자들은 산화철 나노입자 어셈블리 구조체 내 인조 원자처럼 거동하고, 고차의 초격자 구조를 형성한다. 산화철 나노입자의 클로즈 패킹(close-packing)을 고려하면, 하나의 산화철 나노입자 어셈블리 구조체는 약 700개의 산화철 나노입자들을 포함한다. DLS(dynamic light scatter) 분석에서 측정된 산화철 나노입자 어셈블리 구조체의 크기는 TEM에 의해 측정된 크기보다 조금 더 큰 약 200nm의 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter)을 나타낸다.
상기 산화철 나노입자 어셈블리 구조체는 실온에서 초상자성 거동을 보인다. 상기 산화철 나노입자 어셈블리 구조체는 개별적인 산화철 나노입자에 비하여 훨씬 더 큰 부피를 가지며, 더 큰 자력을 발생시킬 수 있다. 또, 상기 산화철 나노입자 어셈블리 구조체의 더 큰 표면적은 표면 반응 및 자기 분리(magnetic separation)를 포함하는 어플리케이션에 장점을 갖는다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 TEM 이미지를 나타내고, 도 13은 도 12의 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 크기 분포를 나타내며, 도 14는 도 12의 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 표준화된 일광자 PLE 스펙트럼(청색)과 광루미네선스 스펙트럼(적색)을 나타낸다.
도 12 내지 도 14를 참조하면, ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체는, ZnS:Mn 나노입자들이 산화철 나노입자들로 대신하는 것을 제외하고 산화철 나노입자 어셈블리 구조체와 유사하게 형성된다. 상기 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체는 평균 크기 약 320nm의 구 형상을 가지며, ZnS:Mn 나노입자들의 비구형과 덜 균일한 크기로 인해 산화철 나노입자 어셈블리 구조체에서 관측된 초격자 구조가 결여된다. 하나의 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체(ZnS:Mn 어셈블리 입자)는 약 십만개의 ZnS:Mn 나노입자를 포함한다. DLS에 의해 측정된 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 유체역학적 직경은 약 390nm이다. 상기 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체는 큰 스토크스 시프트(Stokes shift)때문에 PL 스펙트럼에서 레드 시프트를 보이지 않는 반면, PL QY는 9%로 감소한다. 감소된 PL QY에도 불구하고, 상기 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체는 포함된 많은 나노입자들때문에 개별적인 ZnS:Mn 나노입자보다 훨씬 더 밝다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 산화철 나노입자 어셈블리 구조체의 스트렙타비딘과 항체의 결합 후 유체역학적 직경 변화를 나타내고, 도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 항체 결합 후 유체역학적 직경 변화를 나타낸다.
도 15 및 도 16을 참조하면, 산화철 나노입자 어셈블리 구조체는 스트렙타비딘과 항체의 결합 후 유체역학적 직경이 커지고, ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체도 항체 결합 후 유체역학적 직경이 커지는 것으로 나타난다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역분석법을 설명하기 위한 도면이다.
도 17을 참조하면, 본 발명의 실시예들에 따른 면역분석법은 제1 나노입자 어셈블리 구조체, 제2 나노입자 어셈블리 구조체, 항원 등을 한번에 반응시키고, 반응 후 항원과 결합하지 않은 제2 나노입자 어셈블리 구조체의 PL 신호만 자성분리를 통해 선택적으로 측정할 수 있기 때문에 반응에 참여하지 않고 남아있는 물질에 대한 세정을 요하지 않는다(wash-free).
먼저, 샘플 용액이 항체-결합 산화철 나노입자 어셈블리 구조체와 항체-결합 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 혼합 용액에 첨가된다. 상기 산화철 나노입자 어셈블리 구조체의 항체와 상기 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 항체는 타겟 단백질의 다른 에피토프(epitopes)에 선택적으로 결합하기 때문에, 상기 타겟 단백질이 상기 산화철 나노입자 어셈블리 구조체와 상기 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체 사이에 위치하는 샌드위치 구조가 형성된다.
타겟 단밸질과 결합된 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체는 자기 분리(magnetic isolation)에 의해 산화철 나노입자 어셈블리 구조체와 함께 분리된 후에, 잔존하는 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리의 PL 강도가 측정되고 양적 분석에 사용된다. ZnS:Mn 나노입자보다 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체가 더 밝기 때문에 PL 강도에서 검출할 수 있는 변화에 요구되는 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 수가 크게 감소하고, 분석의 민감도가 증가한다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 PL 강도를 나타내고, 도 19는 도 18의 저농도 영역을 확대하여 나타낸다.
도 18 및 도 19를 참조하면, 작은 수의 타겟 단백질 분자들의 신뢰성 있는 검출을 위해 단지 수백개의 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체가 필요하다. 유사한 수의 개별적인 ZnS:Mn 나노입자가 면역 분석에 사용되면 전체 PL 강도는 검출을 위해 충분히 강하지 않을 것이다. 반대로, ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체만큼의 PL 강도를 획득하기 위해 훨씬 더 많은 수의 ZnS:Mn 나노입자가 사용되면, 작은 양의 타겟 단백질에 의해 유도되는 PL 감소가 강한 배경 PL 신호 때문에 검출되지 않을 수 있다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 산화철 나노입자 어셈블리 구조체와 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체를 이용하여 획득한 CRP 농도에 대한 광루미네선스를 나타낸다.
도 20을 참조하면, 염증 바이오마커로 널리 사용되는 CRP(C-reactive protein)를 타겟 단백질로 사용하여 콜로이드 나노입자 어셈블리 구초체의 면역 분석 성능을 평가하였다. CRP 농도가 증가함에 따라 기울기가 음으로 나타나고, 동적 범위는 약 10 ~ 1000pg/ml로 나타난다.
도 21은 타겟 단백질에 결합된 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체와 산화철 나노입자 어셈블리 구조체의 자기 분리 후에 획득한 콜로이드 나노입자 어셈블리 구조체의 TEM 이미지이다.
도 21을 참조하면, 1000pg/ml CRP와 반응한 후에 획득한 자기 고립 콜로이드 나노입자 어셈블리 구조체에서, 산화철 나노입자 어셈블리 구조체 사이에 묻힌 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 존재를 확인할 수 있다.
과잉의 산화철 나노입자 어셈블리 구조체가 그보다 적은 수의 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체와 함께 사용되었기 때문에 각각의 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체는 여러 개의 산화철 나노입자 어셈블리 구조체에 의해 둘러싸인다.
PL 강도의 감소는 타겟 단백질과 결합된 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체 대 총 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 비율에 비례하기 때문에, 더 작은 양의 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체를 이용하는 것이 민감도를 높이는데 바람직하다. 다만, 측정 노이즈로 인해 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 양을 한계값(threshold) 아래로 감소시켜서는 안된다.
도 22는 면역 분석의 검출한계를 나타낸다.
도 22를 참조하면, 본 발명의 실시예들에 따른 면역 분석에서는, 같은 양의 항체를 사용할 때, ELISA(9.1pg/ml)의 검출 한계보다 더 낮은 0.7pg/ml의 검출 한계가 달성되고, 항체의 사용량이 10분의 1로 감소될 수 있다. 상기 검출 한계는 제로-피분석물 컨트롤(블랭크 샘플)의 PL 강도에서 제로-피분석물(블랭크 샘플)의 PL 강도 표준편차의 3배만큼 낮은 값의 PL 강도에 해당하는 농도로 정의된다.
도 23은 산화철 나노입자 어셈블리 구조체와 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 사용양을 다르게 하여 획득한 CRP 농도에 대한 광루미네선스를 나타낸다. 청색 그래프는 산화철 나노입자 어셈블리 구조체와 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체 내 철과 아연의 양이 각각 160ng인 경우를 나타내고, 적색 그래프는 철과 아연의 양이 각각 1280ng인 경우를 나타낸다.
도 23을 참조하면, 콜로이드 나노입자 어셈블리 구조체를 이용한 면역 분석법의 또 다른 특징은 산화철 나노입자 어셈블리 구조체와 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 양을 조절하는 것에 의해 동적 범위를 조정할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 산화철 나노입자 어셈블리 구조체 및 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체의 양을 8배 증가시키는 것에 의해, 8배 더 높은 CRP 농도를 커버하는 표준 곡선을 획득할 수 있다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역분석법 및 ELISA를 이용하여 측정된 인간 혈청 샘플 내 CRP 농도의 상관 관계를 나타낸다.
도 24를 참조하면, 콜로이드 나노입자 어셈블리 구조체를 이용한 면역 분석법은 인간 혈청과 CRP-spiked PBS 샘플에 대하여 ELISA와 좋은 상관관계를 나타낸다. 또, 상기 면역 분석법은 분석간 및 분석내 계수 변이(inter- and intra-assay coefficients of variation)가 5% 이하로 재현성을 갖는다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자의 TEM 이미지를 나타내고, 도 26은 도 25의 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자의 크기 분포를 나타낸다. 도 25 및 도 26을 참조하면, Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자는 약 6.8nm의 평균 크기를 갖는다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체의 TEM 이미지를 나타내고, 도 28은 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체의 크기 분포를 나타낸다.
도 27 및 도 28을 참조하면, Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체는 약 6.8nm 크기의 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자를 사용한 것을 제외하고 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리와 같은 방법으로 제조될 수 있다. TEM 분석에 의해 측정된 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체의 크기는 약 350nm이고, 유체역학적 직경은 약 440nm이다.
도 29는 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자와 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체의 광루미네선스를 비교하여 나타낸다.
도 29를 참조하면, Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자는 450nm에서 PL QY 60%를 갖는 방출 피크를 보이는 반면, Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체의 방출 피크는 자기 흡수 때문에 458nm로 레드 시프트되고 PL QY는 4%로 감소한다.
도 30은 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체와 산화철 나노입자 어셈블리 구조체를 이용하여 획득한 EpCAM에 대한 광루미네선스를 나타낸다.
도 30을 참조하면, Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체와 산화철 나노입자 어셈블리 구조체를 다양한 암에 발현되는 진단 바이오마커인 상피 세포 부착 분자(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM )에 대하여 매칭되는 항체쌍을 갖도록 기능화한 후에, 약 1 ~ 100ng/ml를 커버하는 표준 곡선이 획득된다. Cd1 -xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체와 ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체는 PL 스펙트럼에서 오버랩되지 않으므로 두 콜로이드 나노입자 어셈블리 구조체는 두플렉스 분석(duplex assay)에서 동시에 사용될 수 있다.
도 31은 다양한 농도의 CRP 존재 하에서 다양한 농도의 EpCAM에 대하여 획득한 광루미네선스를 나타내고, 도 32는 다양한 농도의 EpCAM 존재 하에서 다양한 농도의 CRP에 대하여 획득한 광루미네선스를 나타낸다.
도 31 및 도 32를 참조하면, 다양한 농도의 CRP(0, 16, 125, 및 1000 pg/ml)와 EpCAM (0, 2, 15, 및 120ng/ml)의 조합을 평가하였다. PL 강도는 다른 형태의 타겟 단백질이나 콜로이드 나노입자 어셈블리 구조체의 공존에 의해 영향을 받지 않는다. 콜로이드 나노입자 어셈블리 구조체를 이용한 면역 분석법의 조정가능한 동적 범위는 멀티플렉스 분석에서 장점을 가질 수 있다. 콜로이드 나노입자 어셈블리 구조체의 양을 조정하는 것에 의해 개별 피분석물의 동적 범위가 쉽게 조절될 수 있는 반면, 2차원 고체 기판을 사용하는 종래의 면역 분석법은 항체의 양과 그 동적 범위를 변경하기가 어렵다. 즉, 콜로이드 나노입자 어셈블리 구조체를 이용한 무세정(wash-free) 면역 분석법은 고감도, 고특정성, 및 우수한 재현성을 갖는 멀티플렉스 검출을 가능하게 한다. 조정가능한 동적범위와 신호 증폭이 없는 무세정 절차는 추가적인 장점을 제공한다. 상기 콜로이드 나노입자 어셈블리 면역분석법은 사용되는 방법과 시약을 일반화할 수 있어 단백질 유전 정보나 질병 진단에 유용하다.
위 실시예들에서 산화철 나노입자 어셈블리 구조체는 스트렙타비딘-비오틴(streptavidin-biotin) 결합을 포함하고, ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체 및 Cd1-xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체는 스트렙타비딘-비오틴(streptavidin-biotin) 결합을 포함하지 않고 어셈블리 입자와 항체의 직접 결합을 포함하는 것으로 기재되어 있으나 이에 한정되지 않는다. 산화철 나노입자 어셈블리 구조체가 어셈블리 입자와 항체의 직접 결합을 포함할 수도 있고, ZnS:Mn 나노입자 어셈블리 구조체 및 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 어셈블리 구조체가 스트렙타비딘-비오틴(streptavidin-biotin) 결합을 포함할 수도 있다.
이제까지 본 발명에 대한 구체적인 실시예들을 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

  1. 제1 나노입자 어셈블리 구조체 및 제2 나노입자 어셈블리 구조체를 포함하고,
    상기 제1 나노입자 어셈블리 구조체는,
    복수 개의 제1 나노입자가 모여 이루어진 제1 어셈블리 입자, 및
    상기 제1 어셈블리 입자에 연결된 제1 항체를 포함하고,
    상기 제2 나노입자 어셈블리 구조체는,
    복수 개의 제2 나노입자가 모여 이루어진 제2 어셈블리 입자, 및
    상기 제2 어셈블리 입자에 연결된 제2 항체를 포함하며,
    상기 제1 어셈블리 입자는 자성을 갖고, 상기 제2 어셈블리 입자는 발광성을 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자 어셈블리 구조체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 나노입자는 산화철 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 어셈블리 구조체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 어셈블리 입자는 상기 복수 개의 제1 나노입자의 자기 조립에 의해 형성되고,
    상기 제2 어셈블리 입자는 상기 복수 개의 제2 나노입자의 자기 조립에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 나노입자 어셈블리 구조체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 타겟 단백질의 다른 에피토프(epitopes)에 선택적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 나노입자 어셈블리 구조체.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 제1 나노입자 어셈블리 구조체 및 상기 제2 나노입자 어셈블리 구조체는 상기 타겟 단백질과의 결합에 의해 서로 연결되는 것을 특징으로 하는 나노입자 어셈블리 구조체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 어셈블리 입자 및 상기 제2 어셈블리 입자 중에서 적어도 어느 하나는 스트렙타비딘을 포함하고,
    상기 제1 항체 및 상기 제2 항체 중에서 적어도 어느 하나는 비오틴을 포함하며,
    상기 제1 나노입자 어셈블리 구조체 및 상기 제2 나노입자 어셈블리 구조체 중에서 적어도 어느 하나는 스트렙타비딘-비오틴 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 어셈블리 구조체.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 제2 나노입자는 ZnS:Mn 나노입자 및 Cd1-xZnxS/ZnS 나노입자 중에서 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 어셈블리 구조체.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 제2 나노입자 어셈블리 구조체는,
    상기 ZnS:Mn 나노입자에 연결된 제2 항체와 상기 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자에 연결된 제3 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 어셈블리 구조체.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 제2 항체와 상기 제3 항체는 서로 다른 것을 특징으로 하는 나노입자 어셈블리 구조체.
  10. 완충 용액에 타겟 단백질을 포함하는 피분석물, 자성을 갖는 제1 나노입자 어셈블리 구조체, 및 발광성을 갖는 제2 나노입자 어셈블리 구조체를 제공하는 단계; 및
    상기 완충 용액에 자력을 제공하는 단계를 포함하고,
    상기 제1 나노입자 어셈블리 구조체는,
    복수 개의 제1 나노입자가 모여 이루어진 제1 어셈블리 입자, 및
    상기 제1 어셈블리 입자에 연결된 제1 항체를 포함하고,
    상기 제2 나노입자 어셈블리 구조체는,
    복수 개의 제2 나노입자가 모여 이루어진 제2 어셈블리 입자, 및
    상기 제2 어셈블리 입자에 연결된 제2 항체를 포함하며,
    상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 상기 타겟 단백질과 결합하는 것을 특징으로 하는 면역 분석 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 제1 나노입자는 산화철 나노입자를 포함하고,
    상기 제2 나노입자는 ZnS:Mn 나노입자 및 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자 중에서 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 분석 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 완충 용액에 발광성을 갖는 제3 나노입자 어셈블리 구조체를 제공하는 단계를 더 포함하고,
    상기 제3 나노입자 어셈블리 구조체는,
    복수 개의 제3 나노입자가 모여 이루어진 제3 어셈블리 입자, 및
    상기 제3 어셈블리 입자에 연결된 제3 항체를 포함하며,
    상기 제3 항체는 상기 피분석물과 결합하고,
    상기 제1 나노입자는 산화철 나노입자를 포함하고,
    상기 제2 나노입자는 ZnS:Mn 나노입자를 포함하며,
    상기 제3 나노입자는 Cd1 - xZnxS/ZnS 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 분석 방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 제1 어셈블리 입자 및 상기 제2 어셈블리 입자 중에서 적어도 어느 하나는 스트렙타비딘을 포함하고,
    상기 제1 항체 및 상기 제2 항체 중에서 적어도 어느 하나는 비오틴을 포함하며,
    상기 제1 나노입자 어셈블리 구조체 및 상기 제2 나노입자 어셈블리 구조체 중에서 적어도 어느 하나는 스트렙타비딘-비오틴 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 분석 방법.
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