KR100898624B1 - 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이를이용한 탄저균 포자의 검출 또는 분리방법 - Google Patents

탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이를이용한 탄저균 포자의 검출 또는 분리방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이를 이용한 탄저균 포자의 검출 또는 분리방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 탄저균(Bacillus anthracis) 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝하고, 상기 결합 펩타이드를 부착시킨 나노입자 복합체를 이용하여 신속하게 탄저균 포자를 검출할 수 있고, 상기 결합 펩타이드를 부착시킨 자성입자 복합체를 이용하여 신속하게 탄저균 포자를 분리할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 탄저균 포자를 신속하게 검출, 분리함으로써 병원성 균체의 진단 또는 분리에 유용하다.
탄저균, 결합 펩타이드, 진단, 나노입자, 분리, 자성입자

Description

탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이를 이용한 탄저균 포자의 검출 또는 분리방법{Peptides Specifically Binding to Bacillus anthracis Spore and Method for Detecting or Separating Using Thereof}
본 발명은 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이를 이용한 탄저균 포자의 검출 또는 분리방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 탄저균(Bacillus anthracis) 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝하고, 상기 결합 펩타이드를 부착시킨 나노입자 복합체를 이용하여 신속하게 탄저균 포자를 검출할 수 있고, 상기 결합 펩타이드를 부착시킨 자성입자 복합체를 이용하여 신속하게 탄저균 포자를 분리할 수 있는 방법에 관한 것이다.
탄저균(Bacillus anthracis)은 길이 4~8㎛, 너비 1~1.5㎛의 그람 양성 간균으로 병원균 중에서 가장 크고, 양쪽 끝이 직각으로 절단된 모양을 하고 있지만 가끔 연쇄상으로 연결된 것도 발견된다. 편모가 없고, 운동을 하지 않으며, 조건이 나쁘면 아포를 만들기도 한다. 포자(spore)는 공기 중에서는 24시간, 흙 속에서는 100년까지 살 수 있으며, 가열, 일광, 소독제 등에도 강한 저항성을 나타낸다.
포자를 형성하는 바실러스 속 세균인 탄저균에 의한 탄저병은 실제 사람에서 발병되는 경우는 적어, 이에 대한 연구가 활발하게 진행되지 않았다. 일반적으로 탄저(anthrax)는 탄저균의 감염에 의한 전염병으로, 가축뿐만 아니라 사람에서도 발병하는 인수공통 전염병이다 (Turnbull, et al., WHO/EMC/ZDI, 1998). 탄저균의 병원성은 주로 독소(exotoxin) 생성 능력과 협막(capsule) 형성에 의해 결정된다. 이러한 독소와 협막을 결정하는 유전자는 탄저균 내의 플라스미드인 pXO1(181,654bp) 및 pXO2(96,231bp)에 의해 암호화되어 있다 (Okinaka, et al ., J. Bacteriol., 181:6509~6515, 1999). 탄저균 독소는 폴리-D-글루탐산(poly-D-glutamic acid) 협막, 부종 독소(edema toxin) 및 치사 독소(lethal toxin) 등으로 구성되어 있다 (Uchida, et al ., J. Bacteriol., 175:5329~5338, 1993).
탄저병은 크게 호흡기 감염, 피부 감염, 장내 감염으로 발생하며, 이중 호흡기 감염에 의한 탄저병이 가장 치명적이다. 호흡기 감염에 의한 탄저병의 초기 증상은 발열, 호흡 곤란, 기침, 두통, 구토, 오한, 복통, 흉통 등으로 감기와 비슷하나, 감염 후 며칠 뒤에는 그 증상이 심각한 호흡 곤란과 쇼크로 진행된다. 피부 감염의 경우 약 20%, 장내 감염의 경우 25~60% 정도가 사망하게 되나, 호흡기 감염의 경우는 더욱 치명적이다.
호흡기 감염의 경우, 탄저균은 안정된 포자 형태로 호흡기를 통해 폐로 감염되고, 감염 후 폐의 대식세포 내에서 발아(germination)한다. 이후, 림프절로 이동하여 증식하고 혈액 내로 유입하게 되면 지속적으로 박테리아가 증식하고 독소를 생산하여 치명적인 증상을 유발하게 된다 (Maynard, et al ., Nat . Biotechnol., 20:597~601, 2002).
탄저균은 pXO1 플라스미드를 통해 탄저 독소를 생산하는데, 탄저 독소(anthrax toxin)로 총칭되는 독소 구성 단백질은 방어 항원(protective antigen, pag 유전자 산물, 83kDa), 부종 요소(edema factor, cya 유전자 산물, 89kDa), 치사 요소(lethal factor, lef 유전자 산물, 90kDa) 등이 있다. 이들 각각은 독성을 나타내지 않으나, 치사 요소는 방어 항원과 결합하여 치사 독소를 형성하고(Bragg and Robertson, Gene, 81:45~54, 1989), 부종 요소는 칼슘-칼모둘린(calcium-calmoduline) 의존성 아데닐 사이클아제(adenylate cyclase)의 한 종류인 방어항원과 결합하여 피부 수종을 일으키는 부종 독소를 형성한다 (Labruyere, et al., Biochemistry, 29:4922~4928, 1990; Xia and Storm, J. biol . Chem., 265:6517~6520, 1990).
또한, 방어 항원은 숙주세포막의 수용체에 결합하여 독성을 나타내는 것으로서, 방어항원의 162~175번째 아미노산 중 RKKR167 서열이 분해되어야 활성을 나타낸다. 상기 분해 산물 중 분자량이 큰 절편(63kDa)은 진핵세포 표면의 수용체에 결합한 후, 부종 요소와 치사 요소를 부착시켜 세포질 내로 이들 독소를 통과시킴으로써 독성을 나타낸다 (Singh, et al., J. biol. Chem., 264:19103~19107, 1994). 상기 탄저 독소들은 탄저의 감염 초기와 질병이 진행되는 과정 중에도 병인으로서 핵심 역할을 한다 (Pezard, et al., Infect. immun., 59:3472~3477, 1991). 탄저균 흡입에 의한 치사율은 약 100%에 가까우며, 감염된 지 이틀 내지 삼일 내에 사망하 게 된다.
탄저 진단은 탄저병 독소 생성 및 실험 동물의 병원성에 관한 특성(Parry, et al ., Wolfe Medical Atlas, 19, 1983), 생리생화학적 특성(Little and Knudson, Infect. Immun., 52:509~512, 1986), 및 혈청학적 특성(Graham, et al ., Eur . J. Clin. Microbiol., 3:210~212, 1984; Phillips and Ezzell, J. appl . Bacteriol., 66:419~432, 1989) 등의 방법을 이용하고 있다. 혈청학적 탄저 진단은 치사 요소보다 방어 항원에 대한 항체 검출에 대해 민감도가 높은 것으로 나타났고, 효소결합면역흡착검사법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)에 의한 방어 항원에 대한 항체를 검색하는 것보다, 웨스턴 블러팅 분석(Western blotting analysis)에 의하여 방어 항원에 대한 항체를 검사하는 것이 특이도가 높다고 보고되고 있다 (Harrison, et al ., J. Infect . Dis., 160:706~710, 1989; Shlyakhov, et al ., Bull . Soc . Pathol. Exot., 85:215~218, 1992).
그러나, 상기 방법의 경우 탄저 진단에 사용되는 방어 항원을 얻기 위해서는 탄저균을 배양하여야 하며 여러 정제 과정을 필요로 한다. 특히, 탄저균의 배양은 매우 위험하고, 배양 시설도 P-3급의 오염방지 시설과 같은 안전시설을 필요로 하며, 방어 항원(83kDa)과 분자량이 비슷한 부종 요소(89kDa) 및 치사 요소(90kDa)와 구분하기 어려워 순수하게 방어 항원을 정제하기 위해서는 많은 경비와 시간을 필요로 한다 (Leppla, Methods Enzymol., 165, 103~116, 1988).
또한, 대량의 방어 항원과 대응하는 새로운 물질을 얻기 위하여 여러 종류의 비병원성 숙주로부터 탄저균 방어 항원을 유전공학적 방법으로 발현벡터를 이용하 여 클로닝한 후, 형질전환하여 방어 항원을 생산하고자 하는 시도가 있었다 (Gupta, et al ., Protein Expr . Purif., 16:369~376, 1999; Sharama, et . al ., Protein Expr . Purif., 7:33~38, 1996; Miller, et . al ., Lett . Appl . Microbiol., 26:56~50, 1998). 그러나, 상기 방법으로 수득되는 방어 항원의 양은 매우 적고 (Gupta, et al ., Protein Expr . Purif., 16:369~376, 1999; Sharama, et . al ., Protein Expr . Purif., 7:33~38, 1996), 정제 과정시 방어 항원이 단백질 분해효소 등에 의하여 분해되는 것으로 보고된 바 있다.
현재 탄저균의 치료를 위해서 페니실린, 톡시사이클린, 플루로퀴놀론류(fluroquinolones) 등 몇 종의 항생제가 사용되고 있으나, 항생제 내성 균주에 의한 탄저병은 치료할 수 없고, 특히 생화학 테러나 생화학전의 경우 항생제 내성을 가진 균주를 사용할 가능성이 높기 때문에 이러한 경우에는 사용될 수 없다. 또한, 항생제는 독소의 작용을 억제할 수 없어 감염 후 초기에 투여되지 않으면 사망의 가능성이 매우 높다. 그러나, 탄저병의 초기 증상이 일반적인 감기의 증상과 비슷하여 초기 진단 및 치료가 어렵다는 문제점이 있다.
현재 탄저병의 예방을 위하여 방어 항원이 주성분인 백신이 미국과 영국에서 개발되어 사용 중이지만 그 안전성이 완전히 검증되지 않은 상태로, 실제 사용은 군인이나 탄저균에 노출될 가능성이 매우 높은 사람에게만 일부 허용되고 있다. 또한, 백신은 일반적으로 충분한 면역력을 획득하기 위해 최소 수개월의 기간이 필요하여 생화학 테러 등의 위급 상황에는 사실상 사용이 불가능하다. 따라서, 이러한 상황에 사용할 수 있는 항생제 이외의 치료 및 예방책의 개발이 매우 시급한 상황 이다.
따라서, 본 발명자는 탄저균을 신속, 정확하게 검출 또는 분리할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 탄저균 포자에 선택적으로 결합할 수 있는 펩타이드를 선정한 후, 상기 결합 펩타이드를 부착시킨 나노입자 복합체를 이용하여 탄저균 포자를 검출할 수 있고, 상기 결합 펩타이드를 부착시킨 자성입자 복합체를 이용하여 탄저균 포자를 신속하게 분리할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 탄저균 포자 결합 펩타이드-나노입자 복합체 및 이를 이용한 탄저균 포자의 검출방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 탄저균 포자 결합 펩타이드-자성입자 복합체 및 이를 이용한 탄저균 포자의 분리방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 바이오틴을 부착시키는 단계; 및 (b) 상기 바이오틴이 부착된 결합 펩타이드에 스트렙타비딘이 부착된 나노입자를 고정하여 결합 펩타이드-나노입자 복합체를 수득하는 단계를 포함하는 탄저균 포자 결합 펩타이드-나노입자 복합체의 제조방법을 제공한 다.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자는 양자점(quantum dot)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 나노입자가 결합된 탄저균 포자 결합 펩타이드-나노입자 복합체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 탄저균 포자 결합 펩타이드-나노입자 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 탄저균 포자의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 바이오틴을 부착시키는 단계; 및 (b) 상기 바이오틴이 부착된 결합 펩타이드에 스트렙타비딘이 부착된 자성입자를 고정하여 결합 펩타이드-자성입자 복합체를 수득하는 단계를 포함하는 탄저균 포자 결합 펩타이드-자성입자 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 자성입자가 결합된 탄저균 포자 결합 펩타이드-자성입자 복합체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 탄저균 포자 결합 펩타이드-자성입자 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 탄저균 포자의 분리방법을 제공한다.
본 발명은 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 상기 결합 펩타이드를 부착시킨 나노입자 복합체를 이용하여 탄저균 포자를 신속, 정확하게 검출할 수 있고, 상기 결합 펩타이드를 부착시킨 자성입자 복합체를 이용하여 탄저균 포자를 선택적으로 분리할 수 있는 방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따르면, 바이오테러의 대상물질인 탄저균 포자를 신속하게 검출, 분리함으로써 병원성 균체의 진단, 분리 및 테러 방지에 유용하다.
본 발명의 일 양태는 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 펩타이드 라이브러리로부터 신규 탄저균 포자 결합 펩타이드를 스크리닝하기 위하여 positional scanning-synthetic peptide combinatorial library(PS-SPCL)를 이용하였다.
PS-SPCL는 비드에 고정되지 않은 라이브러리 분자 용액을 얻을 수 있는 방법으로써, 펩타이드의 각 위치를 이미 알고 있는 아미노산으로 고정시키고, 나머지 위치는 시스테인(cysteine)을 제외한 19개의 아미노산 혼합물로 연결시킨다. 시스테인의 경우, 펩타이드끼리 이황화물결합(disulfide bond)을 형성할 수 있기 때문에 제외시킨다.
헥사머 PS-SPCL(Hexamer PS-SPCL)의 경우, O1XXXXX-NH2, XO2XXXX-NH2, XXO3XXX-NH2, XXXO4XX-NH2, XXXXO5X-NH2, XXXXXO6-NH2로 구성된다. 여기서, X는 19가지 아미노산이 동량으로 커플링된 경우를 말하며, 114개의 풀(pool)이 만들어지는데, 이를 테스트하여 헥사펩타이드(hexapeptide)의 각 위치에서 중요한 아미노산을 찾는다. 흔히 여러 펩타이드 서열들의 협조 결과(cooperative effect)도 나타나게 되므로, 각 위치에서 여러 개의 아미노산 후보가 나타나는 경우 이를 조합하여 이차 라이브러리(secondary library)를 만들어 다시 스크리닝하여 효과가 가장 높은 펩타이드 서열을 찾은 후, 순수 합성하여 활성을 재확인한다 (Houghten, et al ., J. Med . Chem., 42:3743~3778, 1999). PS-SPCL은 펩타이드가 수용액 중에 녹아 있으므로, in vitro나 in vivo에서 탐색이 가능하므로, 세포막에 존재하는 수용체에 적용할 수 있으며, 항체의 결합 모티프 규명 및 opipid나 TSH(thyroid stimulating hormone) 수용체 결합 펩타이드, 면역 조절 펩타이드 개발 등에 이용되고 있다.
본 발명의 다른 양태는 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 결합 펩타이드가 부착된 나노입자를 이용한 탄저균 포자의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 펩타이드 라이브러리로부터 탄저균 포자에 결합하는 신규 펩타이드를 스크리닝한 후, 상기 결합 펩타이드에 바이오틴을 부착시킨 다음, 스트렙타비딘이 부착되어 있는 나노입자(nanoparticle)를 고정하여 탄저균 포자에 특이적으로 반응하는 결합 펩타이드-나노입자 복합체를 제조함으로써 탄저균 포자와의 상호작용을 유도하여 형광에 의해 탄저균 포자를 쉽게 검출할 수 있다.
상기 탄저균 포자에 특이적으로 반응하는 결합 펩타이드-나노입자 복합체를 탄저균 스턴 포자와 반응시킨 후, 탄저균 스턴 포자와의 결합력을 측정한 결과, 서열번호 1 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 결합 펩타이드-나노입자 복합체가 탄저균 스턴 포자와 강하게 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 결합 펩타이드-나노입자 복합체를 탄저균 델타스턴 포자와 반응시킨 후, 결합력을 측정한 결과, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 결합 펩타이드-나노입자 복합체가 탄저균 델타스턴 포자와 강하게 결합하였다.
본 발명의 또 다른 양태는 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 결합 펩타이드가 부착된 자성입자를 이용한 탄저균 포자의 분리방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 펩타이드 라이브러리로부터 탄저균 포자에 결합하는 신규 펩타이드를 스크리닝한 후, 상기 결합 펩타이드에 바이오틴을 이용하여 기능화하였 고, 바이오틴은 스트렙타비딘과의 상호작용에 이용될 수 있으므로 스트렙타비딘이 부착되어 있는 자성입자(magnetic particle)를 고정하여 탄저균 포자에 특이적으로 반응하는 결합 펩타이드-자성입자 복합체를 제조함으로써 탄저균 포자와의 상호작용을 유도하여 자성에 의해 탄저균 포자를 신속하게 분리할 수 있다 (도 1).
본 발명의 일 실시예에서는 상기 결합 펩타이드-자성입자 복합체를 바실러스 세레우스 포자:탄저균 스턴 포자가 혼합되어 있는 혼합물에 넣은 후, 자성분리기를 이용하여 탄저균 스턴 포자만 분리하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 발명에서는 탄저균 포자 결합 펩타이드-입자 복합체에 사용될 수 있는 결합 펩타이드는 실시예에 국한되지 않고, 상기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 서열이 반복되는 형태 또는 일부 서열이 변형된 펩타이드를 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 이 분야에 통상적인 지식을 가진 자에게 있어서는 자명한 사실이다.
또한, 본 발명에 따른 결합 펩타이드를 다양한 검출방법에 이용함으로써 탄저균 포자를 검출 또는 분리할 수 있다는 것은 이 분야에 통상적인 지식을 가진 자에게 있어서는 자명하다 할 것이다.
실시예 1: 펩타이드 라이브러리로부터 신규 탄저균 포자 결합 펩타이드의 스크리닝
Positional scanning-synthetic peptide combinatorial library(PS-SPCL) 중 헥사펩타이드 라이브러리(hexapeptide library)의 각 펩타이드에 바이오틴-아민 링커(Pierce, 미국)를 상온에서 30분 동안 반응시켜 부착시킨 후, 스트렙타비딘이 부착된 양자점(quantum dot) 525(QDOT　525 streptavidin conjugate, harward, 미국)과 상온에서 30분 동안 반응시킨 다음, 세척버퍼(PBS, pH 7.4)로 3회 세척하여 결합되지 않은 펩타이드 및 링커를 제거하였다.
상기 제조된 결합 펩타이드-나노입자 복합체를 탄저균 스턴(Bacillus anthracis Sterne 34F2 (pXO1+, pXO2-), 한양대학교, 안산) 포자와 상온에서 30분 동안 반응시킨 후 탄저균 스턴 포자와의 결합력을 측정한 결과, 각 아미노산 서열 중 결합력이 강한 아미노산 서열(BaS-01, EWWWNW, 서열번호 1)을 확인할 수 있었다 (도 2).
상기 BaS-01 헥사펩타이드와 탄저균 스턴 포자와의 결합력을 측정한 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이, 기존에 알려진 탄저균 결합 펩타이드(Williams, et al., Appl . Environ . Microbiol., 69:6288~6293, 2003)인 BA1 펩타이드(12-mer, ATYPLPIRGGGC, 서열번호 2)보다 탄저균 스턴 포자에 대한 결합력이 약 80% 정도 증가하였고, ATYPL 서열이 두 차례 반복된 BABA 펩타이드(11-mer, ATYPLATYPLC, 서열번호 3)보다도 약 10% 정도 탄저균 스턴 포자에 대한 결합력이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기에서 제조된 결합 펩타이드-나노입자 복합체를 탄저균 델타스턴(Bacillus anthracis ΔSterne (pXO1-, pXO2-), 한양대학교, 안산) 포자와 상온에서 30분 동안 반응시켜 탄저균 델타스턴 포자와의 결합력을 측정한 결과, 각 아미노산 서열 중 결합력이 강한 아미노산 서열(DWDXXW, 서열번호 4)을 확인할 수 있었다. 이때, X는 아스파테이트(aspartate, D), 글루타메이트(glutamate, E), 히스티딘(histidine, H), 리신(lysine, K), 세린(serine, S) 등의 아미노산 중 하나를 나타낸다 (도 4).
상기 탄저균 델타스턴 포자와의 결합력이 강한 아미노산 서열 중 BaΔS-01(DWDHDW, 서열번호 5), BaΔS-02(DWDSEW, 서열번호 6) 및 BaΔS-03(DWDKDW, 서열번호 7)의 서열에 해당하는 6-mer 결합 펩타이드를 사용하여 탄저균 델타스턴 포자와의 결합력을 측정하였다. 그 결과, 탄저균 델타스턴 포자에 대한 결합력이 BaΔS-01 및 BaΔS-02의 경우 BABA 대조군과 유사하였고, BaΔS-03의 경우 BA1의 경우보다는 약 105% 높고, BABA의 경우보다는 약 20% 높았다 (도 5).
이를 통해 상기 제조된 결합 펩타이드-나노입자 복합체를 이용하여 탄저균 포자를 검출할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 2: 결합 펩타이드 및 자성입자를 이용한 탄저균 포자의 선택적 분리
바실러스 세레우스 KCTC 1092(Bacillus cereus KCTC 1092) 및 탄저균 스턴 34F2(B. anthracis Sterne 34F2(pXO1+, pXO2-), 한양대학교, 안산)를 포자 형성 유 도 배지에서 약 60시간 동안 진탕배양(30℃, 250rpm)한 후, 유로그라핀 밀도구배 방법으로 포자만을 분리하였다.
탄저균 포자 결합 펩타이드-자성입자 복합체를 제조하기 위하여, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 탄저균 포자에 결합하는 펩타이드를 바이오틴으로 기능화한 후, 스트렙타비딘이 부착되어 있는 자성입자를 반응 용액(PBS, pH 7.4)에서 약 30분 동안 반응시켜 결합 펩타이드-자성입자 복합체를 형성하였다.
상기 결합 펩타이드-자성입자 복합체를 바실러스 세레우스 포자:탄저균 스턴 포자가 1:1로 혼합된 혼합물에 혼합하였다. 상기 혼합물을 자성분리기를 이용하여 선택적으로 분리하고, 세척버퍼(PBS, pH 7.4)로 상온에서 세척한 후, 상등액 내의 포자와 함께 Mueller Hinton 한천 고체 배지에서 30℃, 약 24시간 동안 배양하여 용혈 활성(hemolytic activity)을 측정하였다.
그 결과, 바실러스 세레우스의 경우 용혈 활성에 의해 clear zone이 나타나는데 비하여, 탄저균 스턴에서는 clear zone이 나타나지 않았다 (도 6의 a).
또한, 상기에서 분리된 포자들을 주형으로 하여 PCR법에 의해 치사 요소 2(lethal factor 2, 약 400bp)의 증폭 여부를 확인하였다. PCR시 중합효소는 Taq 중합효소(베링거만하임)를 사용하였고, 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머를 사용하였다.
서열번호 8: 5'-AAGCTTTGAGCAAGTTCATTCAAAAGC-3'
서열번호 9: 5'-ATTGGAAAGTTTTCGGAGCA-3'
PCR 조건은 95℃에서 4분간 초기 변성을 수행하고, 변성은 94℃에서 50초, 어닐링은 50℃에서 50초, 연장반응은 72℃에서 1분으로 하여 총 25사이클을 수행하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 추가로 연장반응하였다.
그 결과, 치사 요소 2는 탄저균 스턴에서만 증폭되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6의 b). 이는 상기 결합 펩타이드-자성입자 복합체를 이용하여 탄저균 포자를 신속하고 선택적으로 분리할 수 있다는 것을 의미한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 결합 펩타이드를 이용한 탄저균 포자 분리 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 펩타이드 서열을 디자인하기 위하여 19개의 아미노산을 하나씩 부착시킨 헥사펩타이드와 탄저균 스턴(Bacillus anthracis Sterne) 포자와의 결합력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 BaS-01 헥사펩타이드와 탄저균 스턴 포자와의 결합력을 측정한 그래프이다.
도 4는 펩타이드 서열을 디자인하기 위하여 19개의 아미노산을 하나씩 부착시킨 헥사펩타이드와 탄저균 델타스턴(B. anthracis ΔSterne) 포자의 결합력을 확인한 결과이다.
도 5는 BaΔS-01~03 헥사펩타이드와 탄저균 델타스턴 포자와의 결합력을 확인한 그래프이다.
도 6은 자성에 의해 분리된 포자와 상등액을 구분한 후, 각 샘플의 용혈 활성을 측정한 것이다 (a: 왼쪽은 바실러스 세레우스의 용혈 활성에 의한 clear zone이고, 오른쪽은 탄저균 스턴의 배양 군집임; b: PCR법에 의해 치사 요소 2가 탄저균 스턴에서만 발현하는 것을 확인한 것).
<110> KAIST <120> PEPTIDES SPECIFICALLY BINDING TO BACILLUS ANTHRACIS SPORE AND METHOD FOR DETECTING OR SEPARATING USING THEREOF <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 1 Glu Trp Trp Trp Asn Trp 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 2 Ala Thr Tyr Pro Leu Pro Ile Arg Gly Gly Gly Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 3 Ala Thr Tyr Pro Leu Ala Thr Tyr Pro Leu Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 4 Asp Trp Asp Xaa Xaa Trp 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 5 Asp Trp Asp His Asp Trp 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 6 Asp Trp Asp Ser Glu Trp 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 7 Asp Trp Asp Lys Asp Trp 1 5 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aagctttgag caagttcatt caaaagc 27 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 attggaaagt tttcggagca 20

Claims (15)

  1. 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드.
  3. 다음 단계를 포함하는 탄저균 포자 결합 펩타이드-나노입자 복합체의 제조방법:
    (a) 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지고 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 바이오틴을 부착시키는 단계; 및
    (b) 상기 바이오틴이 부착된 결합 펩타이드에 스트렙타비딘이 부착된 나노입자를 고정하여 결합 펩타이드-나노입자 복합체를 수득하는 단계.
  4. 제3항에 있어서, 상기 나노입자는 양자점(quantum dot)인 것을 특징으로 하 는 방법.
  5. 삭제
  6. 제3항에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 나노입자가 결합된 탄저균 포자 결합 펩타이드-나노입자 복합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 탄저균 포자 결합 펩타이드-나노입자 복합체.
  9. 제7항 또는 제8항의 탄저균 포자 결합 펩타이드-나노입자 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 탄저균 포자의 검출방법.
  10. 다음 단계를 포함하는 탄저균 포자 결합 펩타이드-자성입자 복합체의 제조방법:
    (a) 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지고 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 바이오틴을 부착시키는 단계; 및
    (b) 상기 바이오틴이 부착된 결합 펩타이드에 스트렙타비딘이 부착된 자성입자를 고정하여 결합 펩타이드-자성입자 복합체를 수득하는 단계.
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 탄저균 포자에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 자성입자가 결합된 탄저균 포자 결합 펩타이드-자성입자 복합체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 탄저균 포자 결합 펩타이드-자성입자 복합체.
  15. 제13항 또는 제14항의 탄저균 포자 결합 펩타이드-자성입자 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 탄저균 포자의 분리방법.
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