KR20100102100A

KR20100102100A - 박테리아에서의 쿼럼 센싱의 항체 매개성 파괴

Info

Publication number: KR20100102100A
Application number: KR1020107011438A
Authority: KR
Inventors: 김 디 잔다; 군나 에프 카우프만; 정욱 박
Original assignee: 더 스크립스 리서치 인스티튜트
Priority date: 2007-10-25
Filing date: 2008-10-24
Publication date: 2010-09-20
Also published as: EP2211889A4; EP2211889A2; CA2975568A1; AU2008317331B2; KR101557173B1; US20170043020A1; ES2603061T3; AU2008317331A1; EP2211889B1; CN104211775A; US9394371B2; CN101835484B; US20100291093A1; WO2009055054A3; JP2014221774A; JP2018021021A; JP2011500814A; CN101835484A; EP2842565B1; CA2703133A1

Abstract

본 발명은, 그램 양성 박테리아의 쿼럼 센싱을 억제하고, 그램 양성 박테리아 감염 또는 이와 관련된 질병 상태의 발생을 예방하는 데 사용될 수 있는 면역원성 분자 물질, 초분자 조립체 및 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 그램 양성 박테리아의 쿼럼 센싱을 억제하는 방법 및 그램 양성 박테리아 감염 또는 이와 관련된 질병 상태의 발생을 예방하는 방법을 제공한다.

Description

박테리아에서의 쿼럼 센싱의 항체 매개성 파괴{ANTIBODY-MEDIATED DISRUPTION OF QUORUM SENSING IN BACTERIA}

[정부의 자금 지원]

본 발명은 미국 국립 보건원의 보조금 번호 AI055778 하에 미국 정부의 지원을 받아 수행되었다. 미국 정부는 본 발명에 특정한 권리를 갖는다.

[발명의 배경]

박테리아 감염은, 병을 유발하는 다수의 변종들이 이들을 구제하기 위해 사용되는 일련의 항생제에 대한 내성을 발달시킴에 따라 점점 더 치명적이 되고 있다. 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)는 피부 감염 및 식중독에서부터 생명 위협적인 병원성 감염에 이르는 다양한 질병 또는 병증을 초래하는 병원(원내) 감염의 일반적 원인균이다. 당펩티드 항생제(가장 대표적인 예로 반코마이신)에 대한 에스. 아우레우스 분리주의 내성 증가는 오늘날의 집중 치료실에 있어서 주된 근심거리이다. 따라서, 박테리아 감염을 퇴치하기 위한 대안적인 방법이 시급히 요구되고 있다.

본 발명은 쿼럼 센싱(quorum sensing)의 약화를 위한 면역약물 요법적 방법의 발견에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 쿼럼 센싱을 억제할 수 있고, 농양 형성 마우스 모델의 생체 내에서 박테리아 병원성을 저해할 수 있으며, 치사적인 박테리아 항원공격에 대해 보호를 제공할 수 있는 합리적으로 설계된 합텐에 대해 생성된 단일클론 항체의 발견을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명은, 거대분자 담체에, 경우에 따라 링커 부분을 통해 공유 결합된 하나 이상의 합텐을 포함하는 면역원성 분자 물질(immunogenic molecular entity)을 제공하는데, 상기 합텐은 환형 펩티드 또는 그 유사체를 포함하며, 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체는 거대환 고리를 포함하고, 약 4개∼약 19개의 아미노산 잔기를 포함하며, 하기 화학식 I로 표시되는 구조를 갖는다:

상기 식에서, 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이고; X¹은 각각의 카보닐기에 의해 R에 공유 결합되는 아미노산 잔기이며; X^a+2는 내부 아미노산으로서, 그 각각의 탄소 원자는 R에 공유 결합되고; R은 X¹과 X^a+2를 공유 결합시켜 거대환 고리를 형성하는 거대환 형성 부분이며, 여기서 R은 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 카바미드, 세미카바자이드 또는 다른 아미드 대용 기(amide-surrogate group), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고; a는 1∼약 9이고; b는 1∼약 8이며; 파상선이 횡단하는 결합은, 경우에 따라 링커 부분을 통해, 상기 거대분자 담체에 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체의 N-말단 아미노산 잔기가 부착하는 지점을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 상기 면역원성 분자 물질은, a가 2∼8이고, R이 X^a+2를 X¹ 카보닐기에 공유 결합시키는 알킬옥시 또는 알카릴옥시, 알킬티오, 또는 알킬아미노 기를 포함하며, 이로써 각각 에스테르, 티오에스테르 또는 아미드 결합을 형성하여 각각 락톤, 티오락톤 또는 락탐 거대환 고리를 형성하는 것인, 상기에 표시된 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 면역원성 분자 물질은, R이 -CH₂O-, -CH₂CH₂O-, -CH₂CH(CH₃)O-, -CH₂-페닐-O-, -CH₂S-, -CH₂CH₂S- 또는 -(CH₂)_nNH-(여기서, n은 1∼약 4임)를 포함하는, 상기에 표시된 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 면역원성 분자 물질은, a가 2∼8이고, R이 하나 이상의 아미드, 우레아 또는 세미카바자이드기, 또는 하나 이상의 아미드 대용 결합을 포함하는, 상기에 표시된 구조를 갖는다.

일부 실시형태에서, R은 하기 화학식 (IIa) 또는 화학식 (IIb)로 표시된다:

상기 식에서, n은 1∼약 4이고, R¹은 천연 아미노산 또는 그 유사체의 측쇄이며, 파상선이 횡단하는 결합은 부착 지점을 나타내고, 여기서 (i)로 표시되는 부착 지점은 X¹의 카보닐기에 결합하고, (ii)로 표시되는 부착 지점은 X^a+2의 알파-탄소에 결합한다.

일부 실시형태에서, R은 하기 화학식 (IIa)로 표시된다:

일부 실시형태에서, R은 하기 화학식 (IIb)로 표시된다:

일부 실시형태에서, 상기 면역원성 분자 물질은, X¹ 및 X²가 소수성 아미노산 잔기이고, 일부 실시형태에서, X¹ 및 X²가 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판, 또는 이들의 유사체로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 독립적으로 선택되는, 상기에 표시된 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, X¹ 및 X²는 각각 메티오닌, 루신, 페닐알라닌, 타이로신, 알라닌, 이소루신 또는 트립토판이다.

일부 실시형태에서, 상기 면역원성 분자 물질의 환형 펩티드 또는 유사체는 아미노산 서열 YST(X^a+2)DFIM(서열 번호 92), YST(X^a+2)YFIM(서열 번호 93), IN(X^a+2)DFLL(서열 번호 94), GVNA(X^a+2)SSLF(서열 번호 95), GVNP(X^a+2)GGWF(서열 번호 96), KAKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 97), KTKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 98), GANP(X^a+2)OLYY(서열 번호 99), GANP(X^a+2)ALYY(서열 번호 100), GYST(X^a+2)SYYF(서열 번호 101), GYRT(X^a+2)NTYF(서열 번호 102), YNP(X^a+2)VGYF(서열 번호 103), GGKV(X^a+2)SAYF(서열 번호 104), SVKP(X^a+2)TGFA(서열 번호 105), DSV(X^a+2)ASYF(서열 번호 106), KYNP(X^a+2)SNYL(서열 번호 107), KYNP(X^a+2)ASYL(서열 번호 108), KYNP(X^a+2)ANYL(서열 번호 109), RIPT(X^a+2)TGFF(서열 번호 110), DI(X^a+2)NAYF(서열 번호 111), DM(X^a+2)NGYF(서열 번호 112), KYNP(X^a+2)LGFL(서열 번호 113), KYYP(X^a+2)FGYF(서열 번호 114), GARP(X^a+2)GGFF(서열 번호 115), GAKP(X^a+2)GGFF(서열 번호 116), YSP(X^a+2)TNFF(서열 번호 117), YSP(X^a+2)TNF(서열 번호 118) 또는 QN(X^a+2)PNIFGQWM(서열 번호 119)[여기서, 각각의 서열의 마지막 아미노산 잔기는 X¹이고, (X^a+2)는 X¹의 카보닐기가 R을 통해 공유 결합되는 내부 아미노산임]을 갖는다.

일부 실시형태에서, 상기 거대분자 담체는 단백질, 중합체 또는 나노입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 중합체는 덴드리머이다. 일부 실시형태에서, 상기 덴드리머는 MAP 덴드리머이다. 일부 실시형태에서, 상기 거대분자 담체는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA), 토끼 혈청 알부민(RSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 콘콜레파스 콘콜레파스 헤모시아닌(Concholepas concholepas hemocyanin: CCH), 콜레라 독소 B 서브유닛, 이. 콜라이(E. coli) 불안정 독소 B 서브유닛, 디프테리아 변성독소, 파상풍 변성독소, 파상풍 독소 C 단편, 재조합 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 세포외 단백질(exoprotein) A, CRM197(교차 반응성 물질), 양이온화 소 혈청 알부민(cBSA), 타이로글로불린(Tg), 아비딘, 소 타이로글로불린(BTG), 소 G 글로불린, 소 면역글로불린 G(BIgG), 콘알부민(CONA), 콜로이드 금, 에데스틴, 파라리토데스 캄트샤티카 헤모시아닌(Paralithodes camtschatica haemocyanin: HC), 헬릭스 프로마티아 헤모시아닌(helix promatia haemocyanin: HPH), 대두 쿠니츠 트립신 억제제(soybean kunitz trypsin inhibitor: KTI), 리물러스 폴리페무스 헤모시아닌(Limulus polyphemus haemocyanin: LPH), 난알부민(OA), Pam3Cys-Th(리포펩티드/Th 세포 에피토프), 폴리라이신, 돼지 타이로글로불린(PTG), 정제 단백질 유도체(PPD), 대두 트립신 억제제(STI) 또는 해바라기 글로불린(SFG)으로 구성된 군에서 선택된다.

일부 실시형태에서, 상기 환형 펩티드 유사체는 환형 펩티드 유사체의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기 또는 환형 펩티드 유사체의 N-말단 시스테인 또는 호모시스테인 잔기의 티올기를 통해 상기 거대분자 담체에 공유 결합된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 분자 물질은 거대분자 담체에 환형 펩티드 유사체를 공유 결합시키는 링커 부분을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 환형 펩티드 유사체는 환형 펩티드 유사체의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기를 통해, 또는 환형 펩티드 유사체의 N-말단 시스테인 또는 호모시스테인 잔기의 티올기를 통해 상기 링커 부분에 결합되며, 상기 링커 부분은 상기 거대분자 담체에 공유 결합된다. 일부 실시형태에서, 상기 링커 부분은 MBS, 설포-MBS, SMCC 또는 설포-SMCC의 반응에 의해 생성된 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 링커 부분은 아디프산 디하이드라지드(ADH), 스페이서 펩티드, 하이드록시메틸 헤미숙시네이트 또는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 분자 물질은 하기 구조를 갖는다:

서열 번호 3 (YSTSDFIM, 보호기를 포함하지 않음),

서열 번호 4 (GVNASSSLY, 보호기를 포함하지 않음),

서열 번호 2 (INSDFLL, 보호기를 포함하지 않음), 또는

서열 번호 1 (YSTSYFLM, 보호기를 포함하지 않음)

여기서, CPL은 시스테인 티올기에 공유 결합된 임의적인 링커를 갖는 거대분자 담체이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 분자 물질을 포함하는 초분자 조립체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 초분자 조립체는 리포솜, 비로솜, 박테리오파지, 바이러스 입자 또는 중합체 나노입자 전달 시스템을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 YST(X^a+2)DFIM(서열 번호 92), YST(X^a+2)YFIM(서열 번호 93), IN(X^a+2)DFLL(서열 번호 94), GVNA(X^a+2)SSLF(서열 번호 95), GVNP(X^a+2)GGWF(서열 번호 96), KAKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 97), KTKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 98), GANP(X^a+2)OLYY(서열 번호 99), GANP(X^a+2)ALYY(서열 번호 100), GYST(X^a+2)SYYF(서열 번호 101), GYRT(X^a+2)NTYF(서열 번호 102), YNP(X^a+2)VGYF(서열 번호 103), GGKV(X^a+2)SAYF(서열 번호 104), SVKP(X^a+2)TGFA(서열 번호 105), DSV(X^a+2)ASYF(서열 번호 106), KYNP(X^a+2)SNYL(서열 번호 107), KYNP(X^a+2)ASYL(서열 번호 108), KYNP(X^a+2)ANYL(서열 번호 109), RIPT(X^a+2)TGFF(서열 번호 110), DI(X^a+2)NAYF(서열 번호 111), DM(X^a+2)NGYF(서열 번호 112), KYNP(X^a+2)LGFL(서열 번호 113), KYYP(X^a+2)FGYF(서열 번호 114), GARP(X^a+2)GGFF(서열 번호 115), GAKP(X^a+2)GGFF(서열 번호 116), YSP(X^a+2)TNFF(서열 번호 117), YSP(X^a+2)TNF(서열 번호 118) 또는 QN(X^a+2)PNIFGQWM(서열 번호 119)[여기서, 각각의 서열의 마지막 아미노산 잔기는 X¹이고, (X^a+2)는 X¹의 카보닐기가 R을 통해 공유 결합되는 내부 아미노산이며, 여기서 R은 X¹의 카보닐기에 공유 결합되는 X^a+2의 측쇄 부분이고, R은 -CH₂O-, -CH₂CH₂O-, -CH₂CH(CH₃)O-, -CH₂-페닐-O-, -CH₂S-, -CH₂CH₂S- 또는 -(CH₂)_nNH-(여기서, n은 1∼약 4임)을 포함함]을 가지는 환형 펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 그램 양성 박테리아의 환형 펩티드 신호전달 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

일부 실시형태에서, 상기 항체는 서열 YSTCDFIM(서열 번호 120); GVNACSSLF(서열 번호 121); INCDFLL(서열 번호 122); YSTCYFIM(서열 번호 123); GVNPCGGWF(서열 번호 124); KAKTCTVLY(서열 번호 125); KTKTCTVLY(서열 번호 126); GANPCOLYY(서열 번호 127); GANPCALYY(서열 번호 128); GYSTCSYYF(서열 번호 129); GYRTCNTYF(서열 번호 130); YNPCVGYF(서열 번호 131); GGKVCSAYF(서열 번호 132); SVKPCTGFA(서열 번호 133); DSVCASYF(서열 번호 134); KYNPCSNYL(서열 번호 135); KYNPCASYL(서열 번호 136); KYNPCANYL(서열 번호 137); RIPTSTGFF(서열 번호 138); DICNAYF(서열 번호 139); DMCNGYF(서열 번호 140); KYNPCLGFL(서열 번호 141); KYYPCFGYF(서열 번호 142); VGARPCGGFF(서열 번호 143); GAKPCGGFF(서열 번호 144); YSPCTNFF(서열 번호 145); 또는 QNSPNIFGQWM(서열 번호 146)[여기서, 밑줄 친 잔기의 알파-카보닐기는 각각 진하게 표시된 내부 시스테인 또는 세린 잔기의 설프하이드릴 또는 하이드록실 기와 티오락톤 또는 락톤 결합을 형성함]을 가지는 환형 펩티드 신호전달 분자와 특이적으로 결합한다.

일부 실시형태에서, 상기 항체는 중화 항체, 예를 들어, 교차 중화 항체이다. 일부 실시형태에서, 이것은 단일쇄 가변 단편(scFv), Fab 또는 F(ab')₂ 단편이다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 서열 번호 35∼53 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 서열 번호 19∼26 및 147∼154 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 서열 번호 147∼154 중 어느 하나의 아미노산 서열과 공유 결합된 서열 번호 19∼26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 쥐과 동물, 소 또는 인간 항체이다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 AP4-24H11이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 1종 이상의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 서열 YSTCDFIM(서열 번호 120), GVNACSSLF(서열 번호 121), INCDFLL(서열 번호 122) 및 YSTCYFIM(서열 번호 123)[여기서, 밑줄 친 잔기의 알파-카보닐기는 진하게 표시된 내부 시스테인 잔기의 설프하이드릴기와 티오락톤 결합을 형성함]을 가지는 2∼4종의 환형 펩티드 신호전달 분자와 특이적으로 결합하는 2∼4종의 항체를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 1종 이상의 면역원성 분자 물질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 면역원성 분자 물질은 서열 YST(X^a+2)DFIM(서열 번호 92), YST(X^a+2)YFIM(서열 번호 93), IN(X^a+2)DFLL(서열 번호 94), GVNA(X^a+2)SSLF(서열 번호 95), GVNP(X^a+2)GGWF(서열 번호 96), KAKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 97), KTKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 98), GANP(X^a+2)OLYY(서열 번호 99), GANP(X^a+2)ALYY(서열 번호 100), GYST(X^a+2)SYYF(서열 번호 101), GYRT(X^a+2)NTYF(서열 번호 102), YNP(X^a+2)VGYF(서열 번호 103), GGKV(X^a+2)SAYF(서열 번호 104), SVKP(X^a+2)TGFA(서열 번호 105), DSV(X^a+2)ASYF(서열 번호 106), KYNP(X^a+2)SNYL(서열 번호 107), KYNP(X^a+2)ASYL(서열 번호 108), KYNP(X^a+2)ANYL(서열 번호 109), RIPT(X^a+2)TGFF(서열 번호 110), DI(X^a+2)NAYF(서열 번호 111), DM(X^a+2)NGYF(서열 번호 112), KYNP(X^a+2)LGFL(서열 번호 113), KYYP(X^a+2)FGYF(서열 번호 114), GARP(X^a+2)GGFF(서열 번호 115), GAKP(X^a+2)GGFF(서열 번호 116), YSP(X^a+2)TNFF(서열 번호 117), YSP(X^a+2)TNF(서열 번호 118) 또는 QN(X^a+2)PNIFGQWM(서열 번호 119)[여기서, 각각의 서열의 마지막 아미노산 잔기는 X¹이고, (X^a+2)는 X¹의 카보닐기가 R을 통해 공유 결합되는 내부 아미노산이며, R은 -CH₂O-, -CH₂CH₂O-, -CH₂CH(CH₃)O-, -CH₂-페닐-O-, -CH₂S-, -CH₂CH₂S- 또는 -(CH₂)_nNH-(여기서, n은 1∼약 4임)을 포함함]을 가지는 환형 펩티드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 조성물은 2∼4종의 면역원성 분자 물질을 포함하며, 이 물질의 환형 펩티드는 서열 YST(X^a+2)DFIM(서열 번호 92), YST(X^a+2)YFIM(서열 번호 93), IN(X^a+2)DFLL(서열 번호 94), GVNA(X^a+2)SSLF(서열 번호 95), GVNP(X^a+2)GGWF(서열 번호 96), KAKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 97), KTKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 98), GANP(X^a+2)OLYY(서열 번호 99), GANP(X^a+2)ALYY(서열 번호 100), GYST(X^a+2)SYYF(서열 번호 101), GYRT(X^a+2)NTYF(서열 번호 102), YNP(X^a+2)VGYF(서열 번호 103), GGKV(X^a+2)SAYF(서열 번호 104), SVKP(X^a+2)TGFA(서열 번호 105), DSV(X^a+2)ASYF(서열 번호 106), KYNP(X^a+2)SNYL(서열 번호 107), KYNP(X^a+2)ASYL(서열 번호 108), KYNP(X^a+2)ANYL(서열 번호 109), RIPT(X^a+2)TGFF(서열 번호 110), DI(X^a+2)NAYF(서열 번호 111), DM(X^a+2)NGYF(서열 번호 112), KYNP(X^a+2)LGFL(서열 번호 113), KYYP(X^a+2)FGYF(서열 번호 114), GARP(X^a+2)GGFF(서열 번호 115), GAKP(X^a+2)GGFF(서열 번호 116), YSP(X^a+2)TNFF(서열 번호 117), YSP(X^a+2)TNF(서열 번호 118) 또는 QN(X^a+2)PNIFGQWM(서열 번호 119)[여기서, 각각의 서열의 마지막 아미노산 잔기는 X¹이고, (X^a+2)는 X¹의 카보닐기가 R을 통해 공유 결합되는 내부 아미노산이며, 여기서 R은 -CH₂O-, -CH₂CH₂O-, -CH₂CH(CH₃)O-, -CH₂-페닐-O-, -CH₂S-, -CH₂CH₂S- 또는 -(CH₂)_nNH-(여기서, n은 1∼약 4임)를 포함함]을 갖는다.

일부 실시형태에서, 상기 조성물은 4종의 면역원성 분자 물질을 포함하며, 이 물질의 환형 펩티드는 서열 YSTCDFIM(서열 번호 120), GVNACSSLF(서열 번호 121), INCDFLL(서열 번호 122) 및 YSTCYFIM(서열 번호 123)[여기서, 밑줄 친 잔기의 알파-카보닐기는 진하게 표시된 내부 시스테인 잔기의 설프하이드릴기와 티오락톤 결합을 형성함]을 갖는다.

일부 실시형태에서, 상기 조성물은 1종 이상의 추가적인 면역원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 1종 이상의 추가적인 면역원은 B형 간염(hepatitis B), 헤모필러스 인플루엔자 b형(Haemophilus influenzae type b) 박테리아, 디프테리아, 홍역, 볼거리, 백일해, 소아마비, 풍진, 파상풍, 결핵, 수두 또는 이들의 임의의 조합에 대한 면역 반응을 유발한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 분자 물질, 초분자 조립체, 항체 또는 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 제조 물품을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 면역 반응을 유발하는 데 유효한 양으로 본 발명의 면역원성 분자 물질 또는 초분자 조립체를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유발하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 포유동물은 염소, 토끼, 양, 돼지, 마우스, 래트, 기니 피그, 햄스터, 소, 말, 원숭이 또는 인간이다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 정맥내, 복강내, 피하, 피내 또는 근육내 주사에 의해 상기 포유동물에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 포유동물로부터 생체 시료를 얻는 단계를 추가로 포함하며, 상기 생체 시료는 상기 면역원성 분자 물질의 환형 펩티드 및/또는 환형 펩티드 신호전달 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 포유동물로부터 항체 생산 세포를 단리하는 단계 및 상기 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합하여 상기 면역원성 분자 물질의 환형 펩티드 및/또는 환형 펩티드 신호전달 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 포유동물은 그램 양성 박테리아에 감수성이 있거나 그램 양성 박테리아와 관련된 질병 상태에 감수성이 있다. 일부 실시형태에서, 상기 그램 양성 박테리아는 스타필로코커스(Staphylococcus), 예컨대 에스. 아우레우스(S. aureus) 또는 에스. 에피더미디스(S. epidermidis)이다. 일부 실시형태에서, 상기 포유동물은 인간이다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 특정 시간 간격으로 상기 면역원성 물질을 포함하는 조성물을 하나 이상의 추가 용량으로 상기 포유동물에게 투여하는 것을 더 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 포유동물에서 쿼럼 센싱을 억제하는 데 유효한 양으로 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 쿼럼 센싱을 억제하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 포유동물에서 면역 반응을 유발하고 쿼럼 센싱을 억제하는 데 유효한 양으로 본 발명의 면역원성 분자 물질 또는 초분자 조립체를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 쿼럼 센싱을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 포유동물은 인간이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 그램 양성 박테리아에 의한 포유동물의 감염을 예방 또는 치료하는 데 유효한 양으로 본 발명의 면역원성 분자 물질, 초분자 조립체 또는 항체를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 그램 양성 박테리아에 의한 포유동물의 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 포유동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역원성 분자 물질, 초분자 조립체 또는 항체는 정맥내, 복강내, 피하, 피내 또는 근육내 주사에 의해 상기 포유동물에게 투여된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 거대분자 담체에 공유 결합된 신호전달 분자의 환형 펩티드 유사체를 포함하는 면역원성 분자 물질을 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리와 접촉시키는 단계 및 면역원성 분자 물질과 특이적으로 결합하는 재조합 면역글로불린을 상기 환형 펩티드 신호전달 분자와 특이적으로 결합하는 항체로서 확인하는 단계를 포함하는, 환형 펩티드 신호전달 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 확인하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 카테터 표면을 비롯한 표면을 본 발명의 항체로 코팅하는 단계를 포함하는 생물막(biofilm) 형성을 예방하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체를 코딩하는 서열을 가지는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산은 서열 번호 54∼91, 27∼34 및 155∼181 중 어느 하나의 서열을 갖는다. 본원에서 사용될 때 "핵산"이란 용어는 데옥시리보핵산(DNA)의 중합체뿐만 아니라 리보핵산(RNA)의 중합체도 의미한다. 이 용어는 선형 분자뿐만 아니라 공유적으로 폐환된 환형 분자도 포함한다. 이 용어는 단일 가닥 분자뿐만 아니라 이중 가닥 분자도 포함한다.

핵산 분자와 관련하여 본원에서 사용될 때의 "단리된"이란 용어는, 핵산 분자가 관련없는 핵산 서열, 또는 본 발명의 핵산이 유래된 유기체의 자연 발생 게놈에서 그 5' 말단과 3' 말단의 측면에 위치하는, 그러한 다른 유전자의 발현에 관여하는 서열을 포함하지 않음을 의미한다. 따라서, 본 발명의 "단리된 핵산"은 임의의 자연 발생 핵산의 구조 또는 3개보다 많은 별개의 유전자에 걸쳐있는 자연 발생 게놈 핵산의 임의의 단편의 구조와 상이한 구조를 갖는다. 따라서, "단리된 핵산 분자"란 표현은, 예를 들어 (1) 자연 발생 게놈 DNA 분자의 일부의 서열을 가지지만, 이것이 자연 발생하는 유기체의 게놈에서 그 분자의 해당 부분 측면에 위치하는 양쪽의 코딩 서열이 측면에 없는 DNA 분자; (2) 형성된 분자가 임의의 자연 발생 벡터 또는 게놈 DNA와 동일하지 않도록 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA로 또는 벡터로 도입된 핵산; (3) cDNA, 게놈 단편, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 생성된 단편 또는 제한 단편 등의 독립된 분자; 및 (4) 하이브리드 유전자, 즉, 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 일부인 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이 정의로부터, (1) DNA 분자, (2) 형질감염된 세포 및 (3) 세포 클론(예를 들어, 이것이 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리 등의 DNA 라이브러리에서 발생할 때)의 혼합물 중에 존재하는 핵산은 명시적으로 배제한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체를 코딩하는 핵산을 가지는 발현 벡터를 제공한다.

일부 실시형태에서, 상기 항체를 코딩하는 핵산은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 상기 발현 조절 서열은 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 상기 프로모터는 파지, 바이러스, 박테리아 또는 포유동물 프로모터이다.

본원에서 사용될 때 "발현 벡터"란 용어는 이것이 연결된 다른 핵산 분자를 수송할 수 있고/있거나 이 분자의 발현을 허용할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 이 발현의 생성물을 메신저 리보스 핵산(mRNA) 전사체라 부른다. 따라서, 발현 벡터는 전사체를 생성하도록 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있는 적절한 발현 조절 서열을 포함한다. 따라서, "발현 조절 서열"이란 어구는 전사 액티베이터 단백질 등의 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 RNA 전사체를 생성하도록 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 또 다른 핵산 서열의 전사를 지시하기에 충분한 핵산 서열을 의미한다. "작동 가능하게 연결된"이란 표현은, 핵산과 발현 조절 서열이, 전사 액티베이터 단백질 등의 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 발현 조절 서열이 핵산을 발현을 지시할 수 있도록 위치하는 것을 의미한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기에 기재된 항체를 코딩하는 핵산 또는 상기에 기재된 벡터를 가지는 세포를 제공한다. 상기 세포는 박테리아 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 후술하는 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.

도 1은 에스. 아우레우스에 의해 사용되는 자체 유도 펩티드(AIP)의 구조를 예시한다. 이 올리고펩티드는 번역후 고리화되어 보존된 ^(*)Cys의 티올 부분과 C-말단 잔기의 카복실기 사이에 티오에스테르 결합을 형성한다(서열 번호 120∼123).
도 2a∼2k는 합성된 AIP의 ESI-MS 스펙트럼 및 HPLC 크로마토그램이다: AIP-1(순수한 티오락톤)(a 및 b); AIP-2(순수한 티오락톤)(c 및 d); AIP-3(순수한 티오락톤)(e 및 f); AIP-4(순수한 티오락톤)(g 및 h); AIP-IV(순수한 락톤)(i 및 j). HPLC는, 20%의 B를 3분 동안, 그 후 30분 내에 50%의 B로 증가시키는 구배를 이용하여, C18 컬럼에서 수행하였으며, 214 nm에서의 UV 흡광도로 모니터링하였다. B는 HPLC 등급수에서 전개되는 아세토니트릴이다. 도 2k: AP4-BSA 접합체의 MALDI-TOF 분석.
도 3a 및 3b는 RN4850에서의 세포외 단백질의 분비를 예시하는 데이터이다. (a) RN4850에서의 세포외 단백질 분비 분석. 표시된 바와 같은 선택된 mAb(200 ㎍/mL) 존재 하에 37℃에서 20∼24 시간 동안 배양한 후, 세포를 13,000 rpm으로 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 10% SDS-PAGE로 분석하였다. 겔을 GelCode® Blue Stain Reagent(미국 일리노이주 록포드 소재의 Pierce 제품)를 사용하여 염색하였다. 실선 화살표는 AP4-24H11에 의해 유발된 세포외 단백질 수준의 잠재적 차이를 가르킨다. (b) 에스. 아우레우스 성장 배지의 상청액의 용혈 활성. 앞서 조제한 상청액(150 ㎕)을 양 혈액 한천 플레이트에 점적하였다. 이 플레이트를 37℃에서 24 시간 동안 항온처리하고, 실온에서 24 시간 동안 더 유지하였다.
도 4a∼4e는 AP4-24H11에 의한 에스. 아우레우스에서의 쿼럼 센싱 신호전달 억제를 예시하는 결과이다. (a) 에스. 아우레우스(RN4850 및 Wood 46)에서의 α-헤모라이신 및 단백질 A의 웨스턴 블롯 분석. 에스. 아우레우스 배양물 상청액은 실시예에 기재된 바와 같이 조제하였다. (b) AP4-24H11 존재/부재 하에 20∼24 시간 동안 항온처리한 후의 RN4850, NRS168 및 Wood 46의 상대 OD₆₀₀(%). (c) RN4850에서의 정적 생물막 형성의 분석. (d) 리얼타임 PCR 분석. 선택된 mRNA의 양을 AP4-24H11 존재 또는 부재 하에 배양한 RN4850에서 측정하였다. 상대 정량은 보정인자(calibrator)로서 gyrA를 사용하여 수행하였다. 2회 이상의 독립된 실험을 각각의 실험에 대해 이중으로 수행하였다. 배수 변화의 실제수: rnaIII (-77±48), eta (-8.1±1), hla (-5.2±3.1), spa (+5.7±3.6), sarA (-2.1±0.6) 및 saeR (+1.4±0.4). (d) 에스. 아우레우스에서의 AIP-4에 의한 AP4-24H11 매개 QS 억제. AP4-24H11(약 1.3 μM)을 CYPG 배지에서 천연 AIP-4(2.5 μM)와 함께 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. 밤새 배양한 에스. 아우레우스 세포를 상기 배지에 희석시켜서(OD₆₀₀ 약 0.03), 정적 조건 하에 37℃에서 20∼24 시간 동안 배양하였다. 상청액을 조제하여 분석하였다. 실험 절차의 상세 사항에 대해서는 실시예를 참조할 수 있다.
도 5a 및 5b는 에스. 아우레우스에 의해 유도된 PARP 절단의 AP4-24H11에 의한 억제를 예시하는 데이터이다. 에스. 아우레우스 RN4850(a) 및 Wood 46(b)로부터 얻은 상청액으로 처리한 후의 Jurkat 세포에서의 PARP 절단. 인간 Jurkat 백혈병 T 세포를 10% 열 불활성화 우태 혈청, 10 mM _(L)-글루타민 및 50 mg/mL의 스트렙토마이신 및 페니실린(GIBCO, Invitrogen Corp.)이 보충된 RPMI에서 유지하였다. 에스. 아우레우스 상청액을 실시예에 기재된 바와 같이 조제하고, RN4850의 상청액을 Amicon Ultra-4(5,000 NMWL) 원심분리 필터 디바이스(미국 매사추세츠주 빌러리카 소재의 MILLIPORE 제품)를 사용하여 최초 부피의 1/3로 추가로 농축시켰다. 포화 상태(confluent)의 세포를 새로운 배지(0.5 mL) 중에서 24웰 플레이트에 분배하고 6 시간 동안 항온처리한 후 에스. 아우레우스 상청액을 첨가하였다. 표시된 양의 에스. 아우레우스 상청액과 함께 4 시간 동안 항온처리한 후, 세포 추출물을 조제하고 항PARP 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅으로 분석하였다.
도 6a 및 6b는 마우스 모델에서의 에스. 아우레우스에 의해 유도된 농양 형성의 AP4-24H11에 의한 억제를 보여주는 결과이다. (a) 에스. 아우레우스(1×10⁷) + PBS(윗쪽 패널); 에스. 아우레우스(1×10⁷) + AP4-24H11(0.6 mg)(아랫쪽 패널). (b) 에스. 아우레우스(1×10⁸) + 대조군 mAb(0.6 mg)(윗쪽 패널); 에스. 아우레우스(1×10⁸) + AP4-24H11(0.6 mg)(아랫쪽 패널).
도 7a∼7d는 마우스 모델에서의 에스. 아우레우스에 의해 유도된 농양 형성의 AP4-24H11에 의한 억제를 보여주는 결과이다. SKH1 정상 흉선의 무모 마우스(6∼8 주령)에게 에스. 아우레우스(1×10⁸ 박테리아), 충전 부피 4 ㎕의 Cytodex 비드, DPBS, mAb AP4-24H11 또는 대조군 IgG(0.06 mg 또는 0.6 mg)를 함유하는 주사액 200 ㎕를 옆구리에 피내 주사하였다. 추가의 대조군 동물은 Cytodex 비드 또는 비드들과 항체를 함유하는 주사액 200 ㎕를 피내 주사로 투여받았다. 주사한 후, 마우스를 4∼7일의 기간 동안 매일 3회 이상 모니터링하였다. 모니터링 기간 종료 후, 마우스를 안락사시키고, 세균학적 분석 및 조직학적 분석을 위해 조직을 적출하였다. (a) 에스. 아우레우스 + PBS; (b) 에스. 아우레우스 + AP4-24H11 (0.06 mg); (c) 에스. 아우레우스 + AP4-24H11 (0.6 mg); (d) Cytodex + AP4-24H11 (0.6 mg).
도 8은 에스. 아우레우스 감염에 대해 AP4-24H11로 수동 면역화한 마우스로부터 얻은 생존 데이터를 예시한다. mAb AP4-24H11 또는 대조군 IgG로 전처리하고 2 시간 후 에스. 아우레우스를 주사(3×10⁸ i.p.)한 마우스의 생존 데이터. 괄호 안의 숫자는 생존 개체수/군당 개체수를 나타낸다. 로그 순위 통계량, p = 0.001; 각 군당 n = 6.
도 9는 arg 그룹 I 균주에서의 α-헤모라이신 발현의 항AP1 단일클론 항체에 의한 억제를 보여주는 결과이다.
도 10a 및 10b는 항AIP1 mAb의 생화학적 평가 결과이다. a. 항AIP1 mAb(0.2 mg/mL) 존재 하에서의 agr I 에스. 아우레우스 RN6390B에서의 α-헤모라이신 발현. 1: AP1-2C2; 2: AP1-9A9; 3: AP1-9F9; 4: AP1-15B4;

: 대조군 mAb;

: 항체 없음. b. 항AIP1 mAb 존재 하에서의 에스. 아우레우스 RN6390B의 저적 생물막 형성.
도 11은 인간 항AIP4 scFv 4-20 항체 존재 하에서 배양한 에스. 아우레우스 RN4850의 배양물 상청액의 α-헤모라이신 발현에 대한 웨스턴 분석의 결과이다.
도 12는, mAb AP1-15B4의 의한, 치사적 MRSA USA300 항원공격으로부터의 마우스의 보호를 입증하는 실험의 결과이다. 에스. 아우레우스를 주사(1∼3×10⁸ i.p.)한 지 2 시간 후, 마우스를 AP1-15B4(1 mg) 또는 대조군 IgG(1 mg)로 처리하였다. 괄호 안의 숫자는 군당 생존 개체를 나타낸다, p = 0.02; 각 군당 n = 6.

본 발명은 스타필로코커스 아우레우스 AP-4 신호전달 펩티드에 특이적인 항체가 마우스에서 쿼럼 센싱을 차단할 수 있고 스타필로코커스 감염을 예방할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 쿼럼 센싱을 통해 독성 인자의 발현을 조절하는 그램 양성 박테리아에 의해 생성된 천연 환형 신호전달 펩티드에 대해 면역 반응 생성을 유발하는 데 사용될 수 있는 면역원성 분자 물질을 제공한다. 상기 면역원성 분자 물질은 거대분자 담체에, 경우에 따라 링커 부분을 통해 공유 결합되는 하나 이상의 합텐을 포함하고, 상기 링커 부분은 상기 합텐 및 상기 거대분자 담체에 공유 결합되며, 상기 합텐은 환형 펩티드 또는 그 유사체를 포함하고, 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체는 거대환 고리를 포함하며, 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체는 본 발명의 설명 부분에 정의된 것과 같은 약 4∼약 19개의 아미노산 잔기를 포함한다.

본 발명은 또한 환형 펩티드 신호전달 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 상기 항체는 포유동물에서 쿼럼 센싱을 억제하는 데 사용될 수 있는 중화 항체이다. 또한, 본 발명은 면역원성 분자 물질 또는 중화 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 추가적인 실시형태는 포유동물에서 환형 펩티드 신호전달 분자에 대한 면역 반응을 유발하는 방법 및 포유동물에서 박테리아 쿼럼 센싱을 억제하는 방법을 포함한다.

본 발명의 면역원성 분자 물질은 거대분자 담체에, 경우에 따라 링커 부분을 통해 공유 결합되는 환형 펩티드 또는 그 유사체로 이루어진다. 상기 면역원성 분자 물질은 또한 바이러스 입자와 같은 초분자 조립체에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역원성 분자 물질은 이 분자 물질이 투여된 동물로부터 면역 반응을 유발할 수 있다. 상기 동물은, 예를 들어, 염소, 돼지, 토끼, 마우스, 래트, 말 또는 인간과 같은 임의의 포유동물일 수 있다.

정의

본원에서 사용될 때, "면역원성"이란 용어는 척추 동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 영장류 또는 인간을 비롯한 포유동물에서 면역 반응을 생성하기 위한 분자 물질의 적합성을 의미한다. 분자 물질은, 이 분자 물질에 의해 항원공격된 동물에 의해 항체가 생성되도록 면역 반응을 생성하기 위해 충분한 분자 크기를 가지고 필요한 다른 분자적 특성을 보유할 경우 면역원성이라 한다. 당업계에는 단백질 등의 분자 물질이 약 10 kDa 이상의 분자량을 가져야 면역원성이 있다는 것이 잘 알려져 있다.

"분자 물질"이란 용어는 각각 화학 구조 또는 화학 구조의 조립체에 의해 정의되는 분자 또는 분자 조립체를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 분자 물질은 담체 단백질 또는 다른 면역원성 적격 중합체, 예컨대 경우에 따라 링커 부분에 의해 합텐에 공유 결합된 덴드리머일 수 있다. "초분자 조립체"는, 면역원성 분자 물질을 포함하는 바이러스 감염성 입자와 같은 면역원성 분자 물질을 비롯한 상이한 거대분자의 조립체일 수 있다. 초분자 조립체는 또한 그 외부 표면 상에 면역원성 분자 물질의 합텐 부분을 디스플레이하는 비로솜일 수 있다.

본원에서 사용될 때, "합텐"은, 예를 들어 동물에서 면역 반응을 자극하기에, 자체로는 분자 크기 또는 중량이 불충분한 분자 부분 또는 단편이다. 그러나 합텐이 담체에 결합될 경우 이 합텐에 특이적으로 결합하는 항체가 생성될 수 있다.

본원에서 사용될 때, "환형 펩티드 또는 그 유사체"는 적어도 부분적으로 복수의 아미노산 잔기로 형성되는 유기 구조체 또는 선형 올리고머 형태로 공유 결합되는 유사한 단위를 말하며, 상기 선형 사슬은 추가로 내부적으로 고리화되어 거대환 고리를 형성한다. 상기 선형 올리고머 형태는 단량체 단위를 포함하고, 각각의 단량체 단위는 아미노산 잔기로 이루어져 선형의 형태로 결합되나, 선형 사슬의 카복시 말단 아미노산 잔기가 내부 아미노산 잔기의 측쇄에 공유 결합하는 것에 의해 형성된 루프가 추가적으로 형성된다. 예를 들어, 도 1을 참조할 수 있다.

"아미노산 잔기"란 용어는, 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 올리고머 사슬로, 예를 들어 천연 펩티드로 공유 결합되어 있는 아미노산 또는 그 유사체를 의미한다. 아미노산 잔기는 또한, 아미노산 잔기의 아미노기 또는 카복실산기와, 각각 올리고머의 인접한 아미노산 잔기의 카복실산기 또는 아미노기 사이의 아미드 결합 형성에 의한 "무수 아미노산 단위"로서 알려져 있다. 아미노산 또는 아미노산 유사체의 아미노기와 카복실산기 둘 다 올리고머에서 인접한 아미노산 잔기와 함께 아미드 또는 아미드 유사 결합으로 결합될 수 있다. 그러나, 본원에서 언급되는 환형 펩티드 또는 그 유사체는 천연 아미노산 잔기로만 이루어질 필요는 없다.

본원에서 사용될 때의 용어 환형 펩티드는, 번역후 변형 없이 DNA로 코딩될 수 있는, 리보솜 아미노산 잔기, 즉, 약 20개의 L-α-아미노산으로 이루어질 수 있는 한편, 이것은 이러한 천연 아미노산의 거울상이성체의 D-아미노산 형태뿐만 아니라 약 20개의 리보솜 아미노산의 것 이외의 측쇄를 갖는 아미노산과 같은 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 환형 펩티드는 또한 β-아미노산 또는 γ-아미노산과 같이 α-아미노산 이외의 유형의 아미노산, 또는 카복실산기와 아미노기가 다수의 원자에 의해 분리되는 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 환형 펩티드 또는 유사체는, 알킬 아미노기 및 카복실산기가 다양한 길이의 폴리에틸렌글리콜(PEG) 사슬 또는 단순한 알킬렌 사슬에 의해 분리된 아미노산을 포함할 수 있다. 이들 모두 본원에서의 의미에 포함되는 "아미노산 잔기"로 간주된다. 따라서, 본 발명의 환형 펩티드 또는 그 유사체는 유전자에 의해 코딩된 아미노산, 자연적으로 발생된, 유전자에 의해 코딩된 것이 아닌 아미노산 또는 합성 아미노산으로 이루어질 수 있다. 20개의 유전자 코딩 L-아미노산 및 비코딩 아미노산의 몇몇 예에 대해 본원에서 사용되는 아미노산 표시법을 하기 표 1에 기재하였다:

환형 펩티드 또는 그 유사체의 구조는, 아미노산 구성과는 관계없이, 거대환 고리를 포함한다. 이 용어가 본원에서 사용될 때, 환형 펩티드 또는 그 유사체는 사슬 내에 위치하는, 즉, "내부" 아미노산 잔기인 아미노산 잔기의 측쇄에 공유 결합된 C-말단 아미노산 잔기를 포함하는 거대환 고리를 포함한다. 따라서, "환형 펩티드 또는 그 유사체"를 포함하는 "면역원성 분자 물질"은 "올가미"형 루프 형태를 갖는 분자로 개념화될 수 있으며, 상기 올가미 루프는 올가미의 꼬리가 거대분자 담체에 결합되어 있긴 하지만 자유롭다. 후술하는 바와 같이, 올가미의 꼬리는 링커 부분에 의해 거대분자 담체에 결합될 수도 있고 직접 결합될 수도 있다.

본원에서 사용될 때 환형 펩티드 또는 그 유사체는 또한 아미노산 잔기를 포함하지 않는 분자 분절을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 분절과 같은 스페이서 분절이 상기 환형 펩티드 또는 유사체에 포함될 수 있다. 상기 스페이서 분절은, 일반적으로 올가미형 루프의 꼬리에 위치하며, 거대분자 담체의 표면으로부터 합텐을 분리된 상태로 유지하는 역할을 하여 항체에 대한 접근성을 증가시킬 수 있다.

상기 루프는, C-말단 아미노산의 카보닐기, 즉, 아미노산의 카복실기의 카보닐기와 내부 아미노산의 탄소 원자 사이에 개재하는, 본원에서 "거대분자 부분"으로 언급되고 화학식 (I)에서 "R"로 표시되는, 공유 결합된 원자 세트에 의해 완성된다.

본원에서 사용될 때의 "거대환 형성 부분"이란 용어는, C-말단 아미노산 잔기의 카복시 말단 카보닐기와 내부 아미노산 잔기의 원자(예컨대, 알파-탄소) 사이에 가교를 형성하는, 탄소, 질소, 산소, 황 및 수소를 포함할 수 있는 공유 결합된 원자의 기를 말한다. 거대환 형성 부분은 아미드 결합을 포함할 수 있으며; 예를 들어 상기 부분은 카복실산기를 포함하고, 내부 아미노산 잔기의 측쇄의 아미노기에 아미드 결합에 의해 공유 결합될 수 있으며, 또한, C-말단 아미노산 잔기의 카복실산기의 카보닐기에 아미드 결합에 의해 공유 결합될 수 있는 아미노기를 포함할 수 있는 기일 수 있다. 화학식 (I)에서 "R"로 표시되는 거대환 형성 부분은 또한 에스테르, 티오에스테르, 에테르, 티오에테르, 카보닐, 올레핀 또는 탄화수소 기와 같은 다른 유형의 기를 포함할 수 있다. 상기 거대환 형성 부분은 임의의 아미드 대용 기, 또는 예를 들어, 본원에서 그 전문을 참조 인용하는 문헌["Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins," volume 7, by Arno F. Spatola, (1983) Marcel Dekker, New York/Basel]에 기재된 것과 같은 그러한 몇몇 기를 포함할 수 있다. 아미드 대용 기는 케톤, 아민, 에테르, 티오에테르, 설폰, 설폭시드, 설폰아미드, 설포네이트, 아릴, 헤테로아릴, 알킬, 알케닐, 하이드라진, 아미딘, 구아니딘, 우레아, 티오우레아, 세미카바자이드, 보로네이트, 포스포네이트 등을 포함할 수 있다.

본원에서 사용될 때의 "거대환 고리"란 용어는 전적으로 공유 결합된 원자로 이루어진 고리를 의미하며, 상기 고리 크기는 약 9개보다 많은 원자의 크기이다. 거대환 고리는 최대 20개의 원자, 또는 30개의 원자, 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 상기 거대환 고리는 탄소-탄소 결합뿐만 아니라, 탄소-질소, 탄소-산소, 탄소-황, 질소-질소 및 1보다 큰 원자가를 갖는 원자를 포함하는 다른 공유 결합을 포함할 수 있다. 본 발명의 환형 펩티드 또는 그 유사체에서, 상기 거대환 고리는 3개 이상 약 10개 이하의 아미노산 잔기 중 일부 원자뿐만 아니라, 거대환 고리 구조를 완성하는 상기에 기재된 거대환 형성 부분을 포함한다.

본원에서 사용될 때의 "거대분자 담체"란 용어는 조성물에 의해 항원공격된 유기체에 의한 면역 반응의 생성을 유발하기에 충분한 크기(여기에 결합된 합텐과 함께)의 거대분자 물질을 의미한다. 일반적으로, 합텐은, 항원공격된 유기체에 의해 부착된 합텐에 대해 면역 반응을 유발하고 그에 대한 항체의 형성을 유발하기 위해, 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌에 결합된다. 따라서, 상기 거대분자 담체는 단백질, 특히 합텐의 제시를 위한 우수한 담체로서 알려진 단백질(즉, 생성된 항체의 대부분이 그 항원성 구조에 담체 단백질이 아니라 합텐을 가지고 있음)일 수 있다. 그러나, 본 발명의 거대분자 담체는 단백질 이외의 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 거대분자 담체는, 합텐의 면역계로의 제시를 위한, J. Tam 등(예를 들어, 문헌[Posnett, D., McGrath, H., and Tam, J. P. "A novel method for producing anti-peptide antibodies" J. Biol. Chem. 263, 1719-1725 (1988)] 및 문헌[Tam, J. P. "Synthetic peptide vaccine design: synthesis and properties of a high-density multiple antigenic peptide system" PNAS USA 85, 5409-5413 (1988)] 참조, 이들 문헌은 본원에서 그 전체를 참조 인용함)에 의해 개발된 것과 같은 다중 항원 펩티드(Multiple Antigen Peptide: MAP) 덴드리머와 같은 덴드리머를 포함할 수 있다. 라이신과 같은 다작능성 단량체의 성형(星型) 중합에 의해 형성될 수 있는 이러한 덴드리머는 합텐이 결합될 수 있는 구형 거대분자의 표면 상에 복수의 작용기를 제시한다.

또한, 상기 거대분자 물질은 바이러스 입자와 같은 거대분자의 초분자 조립체의 일부일 수 있다. 예를 들어, 파지 표면이 환형 펩티드 또는 유사체의 공유 결합에 적합화된 파지 디스플레이 시스템이 사용될 수 있다. 또는, 거대분자 담체는 비로솜, 즉, 막 관통 단백질이 매립되어 있고 합텐이 부착되는 거대분자 담체로서의 역할을 하는 인지질로 이루어진 미셀 구조를 포함할 수 있다.

본원에서 사용될 때의 "링커 부분"이란 용어는 환형 펩티드 또는 그 유사체와 거대분자 담체 사이에 도입되는 분자 분절을 말한다. 상기 합텐은 환형 펩티드 또는 유사체의 N-말단을 담체에 이 둘 간의 반응에 의해 연결시키는 역할을 할 수 있는 이작용성 제제로서 도입되는 링커 부분을 포함할 수 있다. 일부 경우, 환형 펩티드 또는 그 유사체는 단백질과 같은 거대분자 담체에 직접 결합될 수 있다. 예를 들어, 환형 펩티드의 N-말단 아미노기를, EDC(에틸 디메틸아미노프로필 카보디이미드)와 같은 탈수 제제의 사용에 의해, 단백질, 예를 들어 아스파르테이트 또는 글루타메이트와 같은 산성 측쇄를 보유하는 단백질 아미노산의 카복실산기에 직접 결합시켜 임의의 개재 링커 부분 없이 직접 아미드 결합을 형성할 수 있다. 그러나, 당업계에 잘 알려져 있는 것과 같은 이작용성 제제로 구성되는 링커 제제가 동일한 기능을 수행할 수 있다. 본 발명의 면역원성 분자 물질에 도입될 경우 이 링커 제제의 원자는 본원에서 사용되는 것과 같은 용어 "링커 부분"을 형성한다.

다수의 유형의 링커 제제가 당업자에게 알려져 있다. 예로는 본 발명의 환형 펩티드 또는 그 유사체의 N-말단 시스테인 또는 호모시스테인 잔기와 반응할 수 있는 티올기, 예를 들어 N-알킬말레이미드 유도체와 반응하는 데 적합한 제1 작용기를 갖는 제제를 포함한다. 상기 링커는 또한 거대분자 담체의 표면 상에 존재하는 기, 예를 들어 단백질의 아미노산 측쇄의 카복실레이트기 또는 아미노기와 반응하는데 적합한 제2의 작용기를 갖는다. 예를 들어, 아실기의 N-하이드록시숙신이미드 에스테르는 단백질 표면 라이신 잔기와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있다. 상기 링커 제제의 2개의 작용기는 일반적으로 개재하는 원자를 통해 공유 결합되어, 두 말단에서의 반응이 링커 부분을 통해 서로 반응성 분자를 공유 결합시키는 역할을 한다. 링커 화학의 예는 미국 61105 일리노이주 록포드 포스트 오피스 박스 117 소재의 Pierce의 카탈로그에서 찾아볼 수 있으며, 이는 웹사이트 http://piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=0203에서 볼 수 있고, 이 정보는 본원에서 참조 인용한다. 반응하여 링커 부분을 형성할 수 있는 링커 제제의 몇 가지 예는 MBS, 설포-MBS, SMCC 또는 설포-SMCC뿐만 아니라 당업계에 잘 알려져 있는 것들을 포함한다.

"쿼럼 센싱"이란 용어는 특정 박테리아 종이 그 자신의 집단 수준을 탐지하여, 특정 집단 수준에 도달될 때 독성 인자의 분비와 같은 특정 형질의 발현을 개시 또는 증폭시키는 현상을 말한다.

"면역원"이란 용어는 능동 백신의 활성 성분을 말하며, 폴리펩티드, 본원에 기재된 담체에 연결된 합텐 또는 면역원에 노출되거나 면역원과 접촉한 포유동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 거대분자 물질 또는 조립체일 수 있다.

본 발명의 면역원성 분자 물질

본 발명은, 거대분자 담체에, 경우에 따라 링커 부분을 통해 공유 결합된 하나 이상의 합텐을 포함하는 면역원성 분자 물질을 제공하는데, 상기 합텐은 환형 펩티드 또는 그 유사체를 포함하며, 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체는 거대환 고리를 포함하고, 약 4개∼약 19개의 아미노산 잔기를 포함하며, 하기 화학식 I로 표시되는 구조를 갖는다:

상기 식에서, 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이고; X¹은 각각의 카보닐기에 의해 R에 공유 결합되는 아미노산 잔기이며; X^a+2는 내부 아미노산으로서, 그 각각의 탄소 원자는 R에 공유 결합되고; R은 X¹과 X^a+2를 공유 결합시켜 거대환 고리를 형성하는 거대환 형성 부분이며, 여기서 R은 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 카바미드, 세미카바자이드 또는 다른 아미드 대용 기, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고; a는 1∼약 9이고; b는 1∼약 8이며; 파상선이 횡단하는 결합은, 경우에 따라 링커 부분을 통해, 상기 거대분자 담체에 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체의 N-말단 아미노산 잔기가 부착하는 지점을 나타낸다.

일 실시형태에서, 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체는, a가 2∼8이고, 또는 대안으로 a가 2∼4일 수 있고, R이 X^a+2를 X¹ 카보닐기에 공유 결합시키는 알킬옥시 또는 알카릴옥시, 알킬티오, 또는 알킬아미노 기를 포함하며, 이로써 각각 에스테르, 티오에스테르 또는 아미드 결합을 형성하여 각각 락톤, 티오락톤 또는 락탐 거대환 고리를 형성할 수 있는 것인, 화학식 (I)의 구조를 포함한다.

더 구체적으로, 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체는, R이 -CH₂O-, -CH₂CH₂O-, -CH₂CH(CH₃)O-, -CH₂-페닐-O-, -CH₂S-, -CH₂CH₂S- 또는 -(CH₂)_nNH-(여기서, n은 1∼약 4임)를 포함하는, 화학식 (I)의 구조를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체는, 카복시 말단 카보닐기가 각각 세린, 호모세린, 트레오닌 또는 타이로신 잔기의 측쇄에 결합하여 락톤 고리를 형성하거나, 또는 각각 시스테인 또는 호모시스테인 잔기의 측쇄에 결합하여 티오락톤을 형성하거나, 또는 디아미노프로프로피오네이트(n=1), 디아미노부티레이트(n=2), 오르니틴(n=3) 또는 라이신(n=4) 잔기의 측쇄에 결합하여 락탐을 형성하는, 거대환 고리를 포함하는 것으로 표시될 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체는, a가 2∼8이고, 또는 대안으로 a가 2∼4일 수 있고, 거대환 형성 기 R이 하나 이상의 아미드, 우레아 또는 세미카바자이드 기, 또는 하나 이상의 아미드 대용 결합을 포함하는, 화학식 (I)의 구조를 포함한다. 예를 들어, R은 하기 화학식 (IIa) 또는 화학식 (IIb)로 표시될 수 있다:

상기 식에서, n은 1∼약 4이고, R¹은 천연 아미노산 또는 그 유사체의 측쇄이며, 파상선이 횡단하는 결합은 부착 지점을 나타내고, 여기서 (i)로 표시되는 부착 지점은 X¹의 카보닐기에 결합하고, (ii)로 표시되는 부착 지점은 X^a+2의 알파-탄소에 결합한다. 천연 아미노산의 측쇄는 리보솜 아미노산 또는 그 유사체 중 어느 것의 측쇄일 수 있다. 따라서, R¹로 표시되는 측쇄는 알라닌, 페닐알라닌, 히스티딘, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 트립토판 등의 리보솜 아미노산의 측쇄일 수 있다. 대안으로, 상기 측쇄는 이러한 천연 측쇄와 유사한 구조일 수 있으며, 예를 들어 알라닌 메틸기 대신에 에틸기, 페닐알라닌 벤질기 대신에 펜에틸기 등일 수 있다. 본원에서 사용될 때의 아미노산 잔기 또는 아미노산 측쇄의 유사체란 용어는, 천연 구조와 동일하지는 않지만, 측쇄의 기본적인 물리적 특성을 변화시키지 않는 치환기의 추가 또는 짧은 알킬기의 추가에 있어서만 상이한 화학 구조를 말한다. 예를 들어, 알라닌의 유사체는, 잔기의 크기, 이온성 및 소수성이 치환에 의해 크게 변화되지 않기 때문에, 트리플루오로알라닌과 같은 알라닌의 불화 유도체를 포함한다.

화학식 (IIa)의 비한정적인 예는 다음과 같다:

상기 R¹ 기는 메티오닌 측쇄에 해당하는 것으로 이해된다. 따라서, R은 메티오닌 측쇄를 보유하는 하기 화학식 (IIb)의 기일 수 있다:

본 발명에 따른 또 다른 실시형태에서, 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체는 소수성 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 화학식 (I)의 X¹ 및 X²는 소수성 아미노산 잔기이다. 더 구체적으로, X¹ 및 X²는 독립적으로 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판, 또는 그 유사체로 구성된 아미노산 잔기의 군에서 선택될 수 있다. 더욱 더 구체적으로, X¹ 및 X²는 각각 독립적으로 메티오닌, 루신, 페닐알라닌, 타이로신, 알라닌, 이소루신 또는 트립토판일 수 있다.

추가적인 실시형태에서, 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체는 서열 YST(X^a+2)DFIM(서열 번호 92), YST(X^a+2)YFIM(서열 번호 93), IN(X^a+2)DFLL(서열 번호 94), GVNA(X^a+2)SSLF(서열 번호 95), GVNP(X^a+2)GGWF(서열 번호 96), KAKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 97), KTKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 98), GANP(X^a+2)OLYY(서열 번호 99), GANP(X^a+2)ALYY(서열 번호 100), GYST(X^a+2)SYYF(서열 번호 101), GYRT(X^a+2)NTYF(서열 번호 102), YNP(X^a+2)VGYF(서열 번호 103), GGKV(X^a+2)SAYF(서열 번호 104), SVKP(X^a+2)TGFA(서열 번호 105), DSV(X^a+2)ASYF(서열 번호 106), KYNP(X^a+2)SNYL(서열 번호 107), KYNP(X^a+2)ASYL(서열 번호 108), KYNP(X^a+2)ANYL(서열 번호 109), RIPT(X^a+2)TGFF(서열 번호 110), DI(X^a+2)NAYF(서열 번호 111), DM(X^a+2)NGYF(서열 번호 112), KYNP(X^a+2)LGFL(서열 번호 113), KYYP(X^a+2)FGYF(서열 번호 114), GARP(X^a+2)GGFF(서열 번호 115), GAKP(X^a+2)GGFF(서열 번호 116), YSP(X^a+2)TNFF(서열 번호 117), YSP(X^a+2)TNF(서열 번호 118) 또는 QN(X^a+2)PNIFGQWM(서열 번호 119)[여기서, 각각의 서열의 마지막 아미노산 잔기는 X¹이고, (X^a+2)는 X¹의 카보닐기가 R을 통해 공유 결합되는 내부 아미노산 잔기임]을 포함할 수 있다.

일 실시형태에서, 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체는 하기 표에 기재된 바와 같이 천연 환형 펩티드 신호전달 분자에 대해 결정된 서열 중 어느 것을 모방할 수 있다:

상기 합텐의 환형 펩티드 및 그 유사체는 표준 고상 합성 기법을 이용하여 선형의 형태로 합성할 수 있으며, 이때 X¹ 카보닐기가 직접 또는 더 복잡한 거대환 형성 부분(예컨대 화학식 (IIa) 및 (IIb)의 기)을 통해 결합되는 내부 아미노산 잔기의 측쇄는, 이 아미노산 잔기 측쇄의 선택적 탈차단이 이루어질 수 있도록 적절히 차단된다. 그 후, 선택적으로 탈차단된 측쇄를 C-말단 카복실기와 직접 반응시켜, C-말단 카보닐에 측쇄(여기서, 상기 측쇄는 화학식 (I)의 R 기로 표시됨)를 결합시키거나, 또는 더 복잡한 거대환 형성 부분과 반응시켜 그 결과 거대환 고리를 형성할 수 있다. 합성예는 이하에 제시한다.

합텐이 공유 결합 또는 커플링되는 거대분자 담체는 합텐-담체 복합체로 항원공격된 동물에서 면역 반응을 자극하기에 충분한 크기, 분자량 및 조성을 갖는다. 환형 펩티드 또는 환형 펩티드 유사체를 비롯한 합텐은 거대분자 담체에 직접 커플링될 수 있다. 예를 들어, 카복실산과 같은 담체의 작용기와 환형 펩티드 또는 유사체의 작용기(예컨대, N-말단 아미노기) 사이에, 경우에 따라 N-하이드록시숙신이미드와 함께 아미드 형성 반응제, 예컨대 EDC(에틸 디메틸아미노프로필 카보디이미드)를 사용하여 공유 결합을 형성할 수 있다. 대안으로, 환형 펩티드의 N-말단 아미노산 잔기는 카복실 작용기를 가질 수 있으며, 예를 들어, N-말단 잔기는 아스파테이트 또는 글루타메이트 잔기일 수 있다. 이 경우, 동일한 화학 합성법을 이용하여, 이것을 담체 상의 아미노기에 직접 커플링할 수 있다. 상기 아미노기는, 예를 들어, 단백질 표면 상의 라이신 잔기의 측쇄에 존재할 수 있다. 또는, 펩티드 카복실레이트가 커플링할 수 있는 아미노기가 MAP 구조와 같은 합성 덴드리머의 표면 상에 존재할 수 있다. 환형 펩티드 또는 그 유사체를 거대분자 담체에 직접 커플링하기 위한 다른 방법도 당업자에게 명백할 것이다.

상기 거대분자 담체는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 거대분자 담체는 단백질일 수 있으며, 이같은 적절한 담체 단백질의 비한정적인 예로는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA), 토끼 혈청 알부민(RSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 콘콜레파스 콘콜레파스 헤모시아닌(CCH), 콜레라 독소 B 서브유닛, 이. 콜라이 불안정 독소 B 서브유닛, 디프테리아 변성독소, 파상풍 변성독소, 파상풍 독소 C 단편, 재조합 슈도모나스 에어루기노사 세포외 단백질 A, CRM197(교차 반응성 물질), 양이온화 소 혈청 알부민(cBSA), 타이로글로불린(Tg), 아비딘, 소 타이로글로불린(BTG), 소 G 글로불린, 소 면역글로불린 G(BIgG), 콘알부민(CONA), 콜로이드 금, 에데스틴, 파라리토데스 캄트샤티카 헤모시아닌(HC), 헬릭스 프로마티아 헤모시아닌(HPH), 대두 쿠니츠 트립신 억제제(KTI), 리물러스 폴리페무스 헤모시아닌(LPH), 난알부민(OA), Pam3Cys-Th(리포펩티드/Th 세포 에피토프), 폴리라이신, 돼지 타이로글로불린(PTG), 정제 단백질 유도체(PPD), 대두 트립신 억제제(STI) 또는 해바라기 글로불린(SFG)을 들 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 상기 면역원성 분자 물질은 비한정적으로 상기에 예시된 폴리펩티드 등의 폴리펩티드에 공유 결합된 합텐을 포함한다.

상기 거대분자 담체는 합텐의 공유 결합을 위해 적합화된 선형 중합체와 같은 중합체일 수 있거나, 또는 예를 들어 덴드리머와 같은 합성 담체의 또 다른 유형일 수 있다. 2개보다 많은 반응기를 갖는 단량체의 성상 중합에 의해 제조된 덴드리머가, 합성 환형 펩티드 또는 그 유사체를 당업자에게 공지된 화학법을 이용하여 커플링할 수 있는 작용기를 제공하도록 적합화될 수 있다. 예를 들어, 그 표면 상에 복수의 아미노기를 제공하는 MAP 덴드리머를 본 발명의 환형 펩티드의 N-말단 아미노산 잔기의 측쇄 카복실기에 커플링할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sakarellos-Daitsiotis et al., Current Topics in Medicinal Chemistry 6:1715-35 (2006)]; 문헌[Saupe et al., Expert Opin. Drug.Deliv. 3:345-354 (2006)]; 문헌[McDermott et al., Immunology and Cell Biology 76: 256-62 (1998)]; 및 문헌[Shahiwala et al., Recent Patents on Drug Delivery & Formulation 1:1-9 (2007)] 참조.

또 다른 실시형태에서, 상기 면역원성 분자 물질은 상기 환형 펩티드 또는 유사체와 상기 거대분자 담체 사이에 위치하는 링커 부분을 포함할 수 있다. 링커 부분은 항체가 특이성을 나타내길 원하는 합텐의 도메인(들), 즉, 환형 펩티드 또는 유사체를 상기 거대분자 담체의 표면으로부터 물리적으로 분리하는 데 사용될 수 있다. 링커 부분은 당업계에 잘 알려진 바와 같이 링커 반응제, 예컨대 MBS(m-말레이미도벤조일 N-하이드록시숙신이미드 에스테르), 설포-MBS(m-말레이미도벤조일 N-하이드록시-2-설포숙신이미드 에스테르), SMCC(숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트), 설포-SMCC(2-설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트)로부터 유도될 수 있다. 링커 반응제와 환형 펩티드와의 반응 및 담체와의 반응에 의하면 이들 둘 다에 링커 부분이 커플링된다. 예를 들어, 상기에 언급된 링커 반응제는, 말레이미드기에 대한 티올기의 첨가를 통해, 또, N-하이드록시 에스테르기에 의한 담체 아미노기의 아실화에 의해, 환형 펩티드의 티올 함유 N-말단 아미노산 잔기와 거대분자 담체의 아미노기를 커플링하는 데 적합하다. 다른 링커 반응제도 상이한 기를 사용하여 상이한 방식으로 반응시키는 데 적합하다. 다른 유형의 구조도 링커 부분 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 링커 부분은 아디프산 디하이드라지드(ADH), 스페이서 펩티드, 하이드록시메틸 헤미숙시네이트 또는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 포함할 수 있다. 특정 환형 펩티드 N-말단 및 특정 거대분자 담체와 소정의 방식으로 반응하기에 적합한 링커 반응제를 선택하는 것은 통상적인 기술 범위 내에 있다.

상기 거대분자 담체와 공유 결합된 합텐은 초분자 조립체 내에 포함될 수 있다. 상기 초분자 조립체는 리포솜 또는 비로솜, 즉, 막 관통 단백질을 포함하는 미셀 구조일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Westerfeld & Zurbriggen, J. Peptide Sci. 11:707-712 (2005)] 및 문헌[Felnerova et al., Current Opinion in Biotechnologies 15:518-29 (2004)] 참조. 상기 초분자 조립체는 파지 디스플레이 시스템에서와 같은 바이러스 입자일 수 있으며, 이때 박테리오파지는 표면 작용기를 발현하도록 적합화된다.

다른 실시형태에서, 상기 거대분자 담체 및 공유 결합된 합텐이 면역원성을 위해 초분자 조립체 내에 포함될 필요는 없다.

본 발명의 면역원성 분자 물질의 구체적인 예를 이하에 예시를 위해 제시한다:

서열 번호 3 (YSTSDFIM, 보호기를 포함하지 않음),

서열 번호 4 (GVNASSSLY, 보호기를 포함하지 않음),

서열 번호 2 (INSDFLL, 보호기를 포함하지 않음), 또는

서열 번호 1 (YSTSYFLM, 보호기를 포함하지 않음).

여기서, CPL은 시스테인 티올기에 공유 결합된 임의적인 링커를 갖는 거대분자 담체이다. 이러한 예에서, 내부 세린 아미노산 잔기와 카복시 말단(메티오닌, 페닐알라닌 또는 루신 잔기임) 사이에 형성되는 락톤기를 포함한다는 것을 알 수 있다. 이러한 예 각각의 거대환 고리는 5개의 아미노산 잔기, 4개의 추가적인 천연 아미노산 잔기, PEG 기를 포함하는 합성 아미노산 잔기 및 거대분자 담체, 예를 들어 거대분자 폴리펩티드에 임의적인 링커기를 통해 결합되는 N-말단 시스테인 잔기를 포함한다. 이러한 조성물은 동물에 있어서 항체 형성을 유도하는 데 사용될 수 있는 구조를 예시하며, 여기서, 반응하여 형성된 항체 중 적어도 일부는 상기 합텐의 환형 펩티드 유사체에 특이적이다.

본 발명의 면역원성 분자 물질은 천연 환형 신호전달 펩티드에 특이적인 항체에 대한 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리(예를 들어, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 에스. 아우레우스 AIP IV 환형 신호전달 펩티드의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 본 발명의 면역원성 분자 물질은 AIP IV 환형 신호전달 펩티드와 특이적으로 결합하는 항체에 대한 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 환형 신호전달 펩티드와 특이적으로 결합하는 항체의 사용에 관해서는 이하에 설명한다.

본 발명의 면역원성 분자 물질은 또한 포유동물에서 선택된 환형 신호전달 펩티드에 대한 면역 반응을 유발하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 에스. 아우레우스 AIP IV 환형 신호전달 펩티드의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 본 발명의 면역원성 분자 물질은 포유동물에서 AIP-IV 환형 신호전달 펩티드에 대한 면역 반응을 유발하는 데 사용될 수 있다.

얻어진 포유동물은 환형 신호전달 펩티드에 특이적인 항체의 공급원이 될 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물의 혈액으로부터 AIP-IV에 대한 항체를 단리할 수 있다. 또한, 항체 생산 세로를 단리하여 이하에 설명하는 단일클론 항체의 생산을 위한 항체 생산 하이브리도마를 제조하는 데 사용할 수 있다.

본 발명의 면역원성 분자 물질은 또한, 포유동물에서 생성된 면역 반응이 쿼럼 센싱 및 독성 유전자의 발현에 있어서 특정 환형 신호전달 펩티드를 이용하는 그램 양성 박테리아에 의한 감염으로부터 포유동물을 보호할 수 있거나 감염과 관련된 질병 또는 병증의 발병으로부터 포유동물을 예방할 수 있다는 점에서 백신으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 에스. 아우레우스 AIP IV 환형 신호전달 펩티드의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 본 발명의 면역원성 분자 물질은, 에스. 아우레우스 독성과 관련된 질병, 병증 또는 합병증의 발병으로부터 포유동물을 보호할 수 있도록, AIP-IV 환형 신호전달 펩티드에 대한 면역 반응을 유발하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 면역원성 분자 물질의 사용에 관해서는 이하에서, 예를 들어 방법 및 실시예 섹션에서 추가로 설명한다.

본 발명의 항체

본 발명의 항체는 환형 신호전달 펩티드와 특이적으로 결합하는 항체이다. 본원에서 사용될 때, "환형 신호전달 펩티드"란 용어는 독성 유전자의 발현을 조절기 위해 쿼럼 센싱을 이용하는 그램 양성 박테리아에 의해 생산된 환형 펩티드를 말한다. 환형 신호전달 펩티드는 막 결합형 히스티딘 키나제 센서 분자에 결합하는 신호전달 분자로서, 이것은 상기 센서 분자에 결합한 후 세포내 반응 조절인자와 상호작용한다.

환형 신호전달 펩티드는 다양한 스타필로코커스 종 및 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)를 포함하나 이들에 한정되지 않는, 쿼럼 센싱을 이용하는 그램 양성 박테리아에 의해 생산된다. 환형 신호전달 펩티드 및 생산자 박테리아의 비한정적인 예를 하기 표에 제시하였다. 상기 신호전달 펩티드는 N-말단 테일과, 내부 아미노산(진하게 표시)의 측쇄 설프하이드릴 또는 하이드록실기와 "C-말단" 아미노산 잔기(밑줄 침)의 알파-카복실기와의 반응에 의해 형성되는 티오락톤 또는 락톤 함유 고리로 이루어진다.

따라서, 환형 신호전달 펩티드는 3∼11개의 아미노산으로 이루어진 고리와 1∼약 9개의 아미노산으로 이루어진 테일을 가질 수 있다. 상기 고리 구조는 "C-말단 아미노산 잔기, 즉, 상응하는 선형 펩티드의 카복시 말단 아미노산의 알파-카보닐기와 내부 세린 또는 시스테인 잔기, 특히 카복시 말단 아미노산의 4번째, 5번째, 6번째, 7번째, 8번째 또는 9번째 잔기의 측쇄 상의 알킬옥시 또는 알킬티오기 사이에 형성된다. 예를 들어, 에스. 아우레우스 AIP4 신호전달 분자는 아미노산 서열 YSTCYFIM(서열 번호 123)으로 이루어진 환형 티오락톤 펩티드 유사체이다. 상기 환형 티오락톤 고리 구조는 "C-말단 아미노산 잔기"인 메티오닌(M)의 알파-카복실기와 "C-말단" 메티오닌(M) 잔기의 5번째 아미노산인 시스테인 HAS의 설프하이드릴기 사이의 결합으로부터 형성된다.

따라서, 환형 신호전달 펩티드는 5개 아미노산의 고리, 예를 들어, 티오락톤 또는 락톤 고리와, 선형의 2∼5개 아미노산 테일을 가질 수 있다.

항체는 특정 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자 또는 이의 면역 활성 단편일 수 있다. 본 발명의 항체는 천연 환형 신호전달 펩티드와 특이적으로 결합하는 것, 또는 환형 신호전달 펩티드의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체를 포함하는 합텐이다. 본원에서 사용될 때, 본 발명의 항체와 관련하여 "특이적으로 결합하는"이란 표현은 본 발명의 항체가 환형 신호전달 펩티드 또는 상응하는 합텐에는 결합하나, 담체 단백질만을 포함하는 다른 관련없는 분자 또는 면역원성 분자 물질, 초분자 조립체, 또는 포유동물 유래의 생체 시료와 함께 존재할 수 있는 다른 관련없는 분자에는 실질적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 합텐이 에스. 아우레우스 AIP IV 환형 펩티드 신호전달 분자의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체인 본 발명의 면역원성 분자 물질에 특이적으로 결합하는 항체는 에스. 아우레우스 AIP IV 환형 펩티드에 결합하나 담체 단독 또는 관련없는 분자에는 실질적으로 결합하지 않는 것이다.

본 발명의 항체는 또한 중화 항체이다. 본원에서 사용될 때, 중화 항체란 용어는 환형 신호전달 펩티드에 결합하여, 이 환형 신호전달 펩티드가 그 막 회합형 수용체와 결합하는 것을 막는 항체를 말한다. "중화 항체"란 용어는 2 이상의 환형 신호전달 펩티드(예를 들어, 상이한 agr 그룹으로부터의 환형 신호전달 펩티드)에 결합하여 이것이 그 수용체와 결합하는 것을 막는 항체를 말한다. 항체가 중화 항체인지 여부는 본원에, 예를 들어 실시예 섹션에 기재된 방법을 비롯하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 결정할 수 있다.

본 발명의 항체는 다클론 또는 단일클론 항체일 수 있다. 다클론 항체는 포유동물을 본 발명의 면역원성 분자 물질로 면역화한 후, 예를 들어, 항체 역가를 측정하기 위한 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 및 항체 함유 IgG 분획을 얻기 위한 단백질 A 크로마토그래피를 비롯한 표준 기법을 이용하여 포유동물의 혈액으로부터 항체를 단리함으로써 얻을 수 있다.

단일클론 항체는 특정 항원성 에피토프와 특이적으로 결합하는 공통의 항원 결합 부위를 갖는 분자의 집합체이다. 단일클론 항체는, 본 발명의 면역원성 분자 물질로 면역화한 포유동물로부터 항체 생산 세포를 선별한 후 그 항체 생산 세포(예를 들어, B 세포)를 골수종과 융합하여 항체 생산 하이브리도마를 생성함으로써 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체는, 예를 들어 본 발명의 면역원성 분자 물질을 이용하여, 항체 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 재조합 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 문헌[Barbas, C.F., 3^rd, D.R. Burton, J.K. Scott, and G.J. Silverman, Phage Display - A Laboratory Manual. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Kontermann, R., Duebel, S., Antibody Engineering, 2001, Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag] 참조.

항체의 면역 활성 단편은 면역글로불린 분자의 생물학적 활성 단편, 예를 들어, 펩신과 같은 효소에 의한 항체의 절단에 의해 생성된 F(ab) 또는 F(ab')₂ 단편이다. 면역 활성 단편은 또한 중쇄 및 경쇄의 가변 단편이 연결됨으로 인해 얻어지는 단일쇄 가변 단편(scFv)일 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 쥐과 동물, 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 쥐과 동물 항체(쥐과 항체)는 전적으로 쥐과 공급원으로부터 유래된 항체, 예를 들어, 마우스 골수종 세포와 마우스 B 림프구 세포의 융합으로부터 생성된 쥐과 하이브리도마로부터 유래된 항체이다. 키메라 항체는 비인간 공급원(예를 들어, 쥐과 또는 영장류)으로부터 유래된 가변 영역과 인간 공급원으로부터 유래된 불변 영역을 갖는 항체이다. 인간화 항체는 항원 결합 영역, 예를 들어, 마우스 공급원으로부터 유래된 상보성 결정 영역과 인간 공급원으로부터 유래된 나머지 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. 완전 인간 항체는 인간 세포로부터 유래된 항체 또는 인간 항체 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 유래된 항체이다.

항체 생성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명의 다클론 항체는 적절한 포유동물을 본 발명의 면역원성 분자 물질로 면역화하여 제조할 수 있다. 상기 포유동물은, 예를 들어, 토끼, 염소 또는 마우스일 수 있다. 면역화 후 적절한 시점에, 상기 포유동물로부터, 예를 들어 상기 포유동물의 혈액 또는 다른 체액으로부터 항체 분자를 단리하여, 황산암모늄을 사용한 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 단백질 A를 이용한 친화성 크로마토그래피를 포함하나 이들에 한정되지 않는 표준 기법을 이용하여 추가로 정제할 수 있다. 또한, 상기 포유동물의 항체 생산 세포를 단리하여 본 발명의 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 제조하는 데 사용할 수 있다. 단일클론 항체 분비 하이브리도마 세포를 제조하는 기법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495-97 (1975)] 및 문헌[Kozbor et al. Immunol Today 4: 72 (1983)] 참조. 또한, 본 발명의 단일클론 항체는 당업계에 공지된 다른 방법, 예를 들어, 재조합 DNA 분자로부터의 발현, 또는 상기에 기재된 것과 같은 본 발명의 면역원성 분자 물질을 이용한 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리의 스크리닝을 이용하여 제조할 수 있다.

키메라 항체 및 인간화 단일클론 항체를 생성하는 방법 역시 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 재조합 DNA 기법을 수반하는 방법을 들 수 있다. 키메라 항체는 항체 분자의 비인간 가변 영역과 인간 불변 영역을 코딩하는 핵산으로부터의 발현에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6851 (1984)] 참조. 인간화 항체는 비인간 항원 결합 영역(상보성 결정 영역)과 인간 가변 영역(항원 결합 영역이 없는) 및 인간 불변 영역을 코딩하는 핵산으로부터의 발현에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature 321:522-24 (1986)]; 및 문헌[Verhoeven et al., Science 239:1534-36 (1988)] 참조. 완전 인간 항체는 인간 중쇄 및 경쇄 유전자만을 발현하는 조작된 트랜스제닉 마우스를 면역화하여 제조할 수 있다. 이 경우, 그 후, 통상적인 하이브리도마 기법을 이용하여 치료적으로 유용한 단일클론 항체를 얻을 수 있다. 예를 들어, 문헌[Lonberg & Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)] 참조. 항체의 설계 및 제조에 관련된 핵산 및 기법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Batra et al., Hybridoma 13:87-97 (1994)]; 문헌[Berdoz et al., PCR Methods Appl. 4: 256-64 (1995)]; 문헌[Boulianne et al. Nature 312:643-46 (1984)]; 문헌[Carson et al., Adv. Immunol. 38　:274-311 (1986)]; 문헌[Chiang et al., Biotechniques 7:360-66 (1989)]; 문헌[Cole et al., Mol. Cell. Biochem. 62:109-20 (1984)]; 문헌[Jones et al., Nature 321: 522-25 (1986)]; 문헌[Larrick et al., Biochem Biophys. Res. Commun. 160: 1250-56 (1989)]; 문헌[Morrison, Annu. Rev. Immunol. 10: 239-65 (1992)]; 문헌[Morrison et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81: 6851-55 (1984)]; 문헌[Orlandi et al., Pro. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-37 (1989)]; 문헌[Sandhu, Crit. Rev. Biotechnol. 12:437-62 (1992)]; 문헌[Gavilondo & Larrick, Biotechniques 29: 128-32 (2000)]; 문헌[Huston & George, Hum. Antibodies. 10: 127-42 (2001)]; 문헌[Kipriyanov & Le Gall, Mol. Biotechnol. 26: 39-60 (2004)] 참조.

본 발명의 단일클론 항체 및 단일쇄 가변 단편의 예를 이들의 코딩 뉴클레오티드 서열과 함께 하기 표에 기재하였다.

본 발명의 항체는 생체 시료 중의 환형 신호전달 펩티드의 존재를 검출하거나 그 양을 측정하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 포유동물이 그램 양성 박테리아에 감염되는 것을 예방하거나 포유동물이 그램 양성 박테리아에 의해 유발된 질병 또는 병증을 발병시키는 것을 예방하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물

본 발명의 면역원성 분자 물질, 상기 면역원성 분자 물질을 포함하는 초분자 조립체 또는 항체는 본원에서 본 발명의 "활성 물질(active agent)"에 해당하는 것으로 포유동물에게 투여하기 위해 약학 조성물로 혼입될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 활성 물질을 1종 이상(예를 들어, 1종 이상의 항체, 면역원성 분자 물질, 초분자 조립체 또는 이들의 조합) 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 다른 폴리펩티드 또는 항체 백신과 함께 본 발명의 1종 이상의 활성 물질을 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 1종 이상의 면역원성 분자 물질을 포함할 수 있으며, 상기 면역원성 분자 물질의 합텐은 에스. 아우레우스 AIP-I, AIP-II, AIP-III 또는 이들의 임의의 조합의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 면역원성 분자 물질 2종 이상의 조합을 포함할 수 있으며, 상기 면역원성 분자 물질은 각각 에스. 아우레우스 AIP 환형 펩티드 신호전달 분자의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체를 포함하는 합텐을 갖는다.

본 발명의 약학 조성물은 2종의 상이한 본 발명의 면역원성 분자 물질, 즉, (1) 에스. 아우레우스 AIP-I 환형 신호전달 펩티드의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제1 면역원성 분자 물질, 및 에스. 아우레우스 AIP-II, III 또는 IV의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제2 면역원성 분자 물질; (2) 에스. 아우레우스 AIP-II 환형 신호전달 펩티드의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제1 면역원성 분자 물질, 및 에스. 아우레우스 AIP-III 또는 IV의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제2 면역원성 분자 물질; 또는 (3) 에스. 아우레우스 AIP-III 환형 신호전달 펩티드의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제1 면역원성 분자 물질, 및 에스. 아우레우스 AIP-IV의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제2 면역원성 분자 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 3종의 상이한 본 발명의 면역원성 분자 물질, 예를 들어, (1) 에스. 아우레우스 AIP-I 환형 신호전달 펩티드의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제1 면역원성 분자 물질, 에스. 아우레우스 AIP-II의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제2 면역원성 분자 물질, 및 에스. 아우레우스 AIP-III의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제3 면역원성 분자 물질; (2) 에스. 아우레우스 AIP-I 환형 신호전달 펩티드의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제1 면역원성 분자 물질, 에스. 아우레우스 AIP-II의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제2 면역원성 분자 물질, 및 에스. 아우레우스 AIP-IV의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제3 면역원성 분자 물질; (3) 에스. 아우레우스 AIP-I 환형 신호전달 펩티드의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제1 면역원성 분자 물질, 에스. 아우레우스 AIP-III의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제2 면역원성 분자 물질, 및 에스. 아우레우스 AIP-IV의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제3 면역원성 분자 물질; (4) 에스. 아우레우스 AIP-II 환형 신호전달 펩티드의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제1 면역원성 분자 물질, 에스. 아우레우스 AIP-III의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제2 면역원성 분자 물질, 및 에스. 아우레우스 AIP-IV의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제3 면역원성 분자 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 또한 4종의 상이한 본 발명의 면역원성 분자 물질, 예를 들어, 에스. 아우레우스 AIP-I 환형 신호전달 펩티드의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제1 면역원성 분자 물질, 에스. 아우레우스 AIP-II의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제2 면역원성 분자 물질, 에스. 아우레우스 AIP-III의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제3 면역원성 분자 물질, 및 에스. 아우레우스 AIP-IV의 락톤, 락탐, 카바미드 또는 세미카바자이드 유사체에 해당하는 합텐을 갖는 제4 면역원성 분자 물질을 포함할 수 있다.

유사하게, 본 발명의 약학 조성물은 또한 1종 이상의 환형 펩티드 신호전달 분자에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 에스. 아우레우스 AIP-I, AIP-II, AIP-III 또는 AIP-IV 환형 신호전달 펩티드 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 2종 이상의 환형 신호전달 펩티드, 예를 들어, 에스. 아우레우스 AIP-I, AIP-II, AIP-III 또는 AIP-IV 환형 신호전달 펩티드 중 임의의 2종, 3종 또는 4종 모두의 환형 신호전달 펩티드에 특이적으로 결합하는 2종 이상의 항체를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 또한 1종 이상의 그램 양성 박테리아로부터 유래된 환형 신호전달 펩티드에 해당하는 합텐을 갖는 1종 이상의 면역원성 분자 물질뿐만 아니라, 쿼럼 센싱을 이용하는 1종 이상의 그램 양성 박테리아로부터 유래된 1종 이상의 환형 신호전달 펩티드에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 또한 B형 간염, 헤모필러스 인플루엔자 b형 박테리아, 디프테리아, 홍역, 볼거리, 백일해, 소아마비, 풍진, 파상풍, 결핵 및 수두 바이러스/박테리아를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다양한 감염원에 대한 1종 이상의 백신과 함께 본 발명의 활성 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상기한 것 이외에도 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용될 때, "약학적으로 허용되는 담체"란 표현은 포유동물에게 투여하기에 적합한 임의의 1종 이상의 용매, 분산매, 코팅, 항균제 또는 항진균제, 항산화제, 안정제, 등장화제, 보조제 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 약학적으로 허용되는 담체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 통상적인 담체가 본 발명 면역원성 분자 물질 또는 항체와 비상용성이거나, 본 발명 조성물의 투여 경로에 부적합하지 않는 한, 본 발명 조성물에 있어서의 그 사용이 고려된다.

본 발명의 약학 조성물은 선택된 투여 경로에 적합하도록 조제되어야 한다. 투여 경로의 예는 정맥내, 피내, 피하, 흡입, 경피, 경점막 및 직장 투여를 비롯한 임의의 비경구 투여 경로를 포함할 수 있다.

비경구, 피내 또는 피하 투여를 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 (1) 주사용수, 생리식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; (2) 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; (3) 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; (4) 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; (5) 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장성 조절을 위한 제제를 포함할 수 있다. pH는 염산 또는 수산화나트륨 등의 산 또는 염기를 사용하여 조절할 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 1회용 주사기 또는 다용량 바이알에 봉입할 수 있다.

주사에 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액 또는 수성 분산액과 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 조제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적절한 담체는 생리식염수, 정균수(bacteriostatic water) 또는 인산염 완충 식염수를 포함한다. 조성물은 멸균 상태여야 하고 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하며, 박테리아 및 진균 등의 미생물에 의한 오염으로부터 보존되어야 한다. 상기 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용하고, 분산의 경우 필요한 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 사용함으로써 얻을 수 있다. 미생물 작용의 예방은, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 사용하여 달성할 수 있다. 등장화제 또는 흡수 지연제(예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)와 같은 다른 성분들도 포함될 수 있다.

멸균 주사액은 필요한 양의 활성 물질을 필요에 따라 상기에 언급된 성분들 중 1종 또는 그 조합과 함께 적절한 용매에 혼입한 후 멸균 여과함으로써 조제할 수 있다. 분산액은 염기성 분산매와 상기에 기재한 필요한 다른 성분들을 포함하는 멸균 매체로 혼입하여 조제할 수 있다. 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전 멸균 여과 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 소정의 성분으로 이루어진 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.

경구 조성물은 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함할 수 있다. 이 조성물은 젤라틴 캡슐에 봉입되거나 정제로 압축될 수 있다. 치료제의 경구 투여를 위해서는 활성 화합물이 부형제와 함께 혼입되어 정제, 트로키제 또는 캡슐제의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 유체 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 약학적으로 적합한 결합제 및/또는 보조제가 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 상기 정제, 환제, 캡슐제, 트로키제 등은 유사한 성질을 갖는 하기 성분 또는 화합물 중 어느 것을 함유할 수 있다: 미세결정질 셀룰로스, 트래거캔스검 또는 젤라틴 등의 결합제; 전분 또는 락토스 등의 부형제; 알긴산 또는 옥수수 전분 등의 붕해제; 스테아르산마그네슘 등의 윤활제; 콜로이드성 이산화규소 등의 활택제; 수크로스 또는 사카린 등의 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료 등의 착향료.

흡입에 의한 투여의 경우, 상기 조성물이, 적절한 추진제, 예를 들어 이산화탄소 등의 기체를 포함하는 가압 용기 또는 디스펜서로부터 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 분사물의 형태로 전달될 수 있다.

경점막 또는 경피 투여의 경우, 장벽을 투과하기에 적절한 것으로 당업계에 알려진 침투제가 사용될 수 있다. 이러한 것으로는 경점막 투여를 위한 후시딘산 유도체, 담즙산염 및 계면활성제를 들 수 있으며, 경점막 투여는, 예를 들어 비강 스프레이를 사용하여 수행할 수 있다. 경피 투여의 경우, 본 발명의 활성 물질을 당업계에 일반적으로 알려져 있는 연고, 살브(salve), 젤 또는 크림으로 조제한다.

본 발명의 조성물은 신체로부터 빨리 제거되는 것을 방지하는 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어 임플란트 및 미세캡슐화 전달 시스템과 같은 제어 방출형 제제는, 본 발명의 활성 물질의 지속성 저속 방출과, 일부 경우, 이와 함께 면역촉진제의 방출을 가능하게 한다. 이러한 제제의 예로는 리포솜, 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체(EVAc)(문헌[Niemi et al., Laboratory Animal Science 35:609-612 (1985)] 참조] 및 분해성 중합체에 봉입된 본 발명의 활성 물질을 포함한다. 캡슐화에 적합한 생분해성 생체적합성 중합체로는 폴리(DL-락티드-코-글리콜리드)(문헌[Eldridge et al., Molecular Immunology 28: 287-294 (1991)] 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 중합체의 추가적인 예로는 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 들 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 당업자에게 명백하다. 바이러스 항원에 대한 단일클론 항체로 감염된 세포를 타겟팅한 것을 비롯한 리포솜 현탁액도 약학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

따라서, 면역 반응을 유발하기 위해 조제된 조성물은 면역보조제(adjuvant)뿐만 아니라 다른 담체 및 운반체도 포함할 수 있다. 면역보조제, 담체 및 운반체의 비한정적인 예로는 프로인트 불완전 보조제; 프로인트 완전 보조제; 알루미늄염(예를 들어, 황산칼륨, 인산알루미늄, 수산화알루미늄); 박테리아 리포폴리사카라이드; 합성 폴리뉴클레오티드(폴리 IC/폴리 AU); 몬타나이드(Montanide) ISA 보조제(프랑스 파리 소재의 Seppic 제품); 리비(Ribi) 보조제(미국 몬태나주 해밀턴 소재의 Ribi ImmunoChem Research, Inc. 제품); Hunter's TiterMax(미국 조지아주 노크로스 소재의 CytRx Corp. 제품); 니트로셀룰로스 흡착 단백질; 거부(Gerbu) 보조제(독일 가이베르크 소재의 Gerbu Biotechnik GmbH/미국 캘리포니아주 포웨이 소재의 C-C Biotech 제품); 사포닌; 뮤라밀 디- 및 트리펩티드; 모노포스포릴 지질 A; 보르데텔라 퍼투시스; 사이토카인; 박테리아 변성독소; 지방산; 생벡터; 미네랄 오일 에멀션; 생분해성 오일 에멀션(예를 들어, 땅콩유, 스쿠알렌 또는 스쿠알란을 함유하는 것); 비이온성 블록 공중합체 계면활성제; 리포솜 및 생분해성 중합체 미소구를 들 수 있다. 예를 들어, 문헌[Eldridge et al., Mol Immunol. 28:287-94 (1991)] 참조. 백산 전달 시스템의 추가적인 예는 문헌[Felnerova et al., Current Opinion in Biotechnology 15:518-29 (2004)]; 문헌[Saupe et al., Expert Opin. Drug Deliv. 3:345-54 (2006)]; 문헌[Sakarellos-Daitsiotis et al., Current Topics in Medicinal Chemistry 6:1715-1735 (2006)]; 문헌[Chen & Huang, Advances in Genetics 54:315-37 (2005)]; 문헌[Westerfeld and Zurbriggen, J. Peptide Sci 11:707-712 (2005)]; 문헌[Shahiwala et al., Recent Patents on Drug Delivery & Formulation 1:1-9 (2007)]; 및 문헌[McDermott et al., Immunology and Cell Biology 76:256-62 (1998)]에 기재되어 있으며, 이들 문헌의 내용은 본원에서 참조 인용된다.

조성물은 투여의 용이성 및 투여량 균일성을 위해 단위 제형(투여량 단위 형태)으로 조제될 수 있다. "단위 제형"이란 용어는 치료 대상 피험체에게 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위를 말하며, 각각의 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 단위 제형에 관한 세부사항은 활성 화학물의 고유 특성 및 얻고자 하는 특정 치료 효과에 따라 달라진다.

키트 및 제조 물품

본 발명의 활성 물질 또는 약학 조성물은 용기, 팩 또는 디스펜서에 그 사용 설명서와 함께 포함될 수 있다. 이러한 키트는 면역원성 분자 물질, 항체 또는 약학 조성물의 의도된 용도에 필요한 추가적인 반응제(reagent)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 진단 목적에 사용될 수 있으며, 이 경우 검출/가시화가 가능하도록 하는 1종 이상의 반응제가 키트에, 바람직하게는 본 발명 항체를 수용하는 용기가 아닌 별개의 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다. 키트 또는 제조 물품은 후술하는 바와 같은 진단, 예방 및/또는 치료 목적에 사용하기 위한 그 사용 설명서를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법

본 발명은 그램 양성 박테리아 감염과 관련된 질병 또는 병증에 감수성이 있거나 이러한 질병 또는 병증을 갖고 있는 포유동물을 확인하는 방법 및 그램 양성 박테리아에 의한 감염 또는 이와 관련된 질병 또는 병증을 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 포유동물에서 면역 반응을 유발하는 방법 및 포유동물에서 쿼럼 센싱을 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 포유동물은, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 기니 피그, 돼지, 소, 말, 양, 원숭이 및 인간을 비롯한 임의의 온혈 척추동물이다. 그램 양성 박테리아는 쿼럼 센싱에 있어서 신호전달 분자로서 환형 펩티드를 이용하는 임의의 박테리아이며, 예를 들어 엔테로코커스 패칼리스 및 스타필로코커스 종(예를 들어, 에스. 아우레우스, 에스. 에피더미디스, 에스. 아우리쿨라리스, 에스. 카피티스, 에스. 카프라, 에스. 카노수스, 에스. 알레타, 에스. 코니, 에스. 에피더미스, 에스. 인터미디어스, 에스. 루그두넨시스, 에스. 시뮬란스, 에스. 갈리나룸, 에스. 크실로수스 및 에스. 와네리를 포함함)일 수 있다. 이러한 박테리아에 의한 감염과 관련된 질병 또는 병증으로는, 예를 들어, 식중독, 독성 쇼크 증후군, 열상 피부 증후군, 수술 창상 감염, 요로 감염, 패혈증 및 폐렴을 들 수 있다.

진단 방법

본 발명의 진단 방법은 본 발명의 면역원성 분자 물질 또는 항체를 사용한 치료가 필요하거나 이 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 포유동물을 확인하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 면역원성 분자 물질 또는 항체를 사용한 치료가 필요하거나 이 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 포유동물은 그램 양성 박테리아 감염을 가지고 있거나 그램 양성 박테리아 감염 또는 이 감염과 관련된 질병 또는 병증에 감수성이 있는 포유동물이다. 이러한 포유동물을 확인하기 위해, 포유동물의 생체 시료를 얻을 수 있다. 이 생체 시료는 조직 시료, 세포 시료, 또는 혈액, 뇨 또는 림프액과 같은 체액 시료일 수 있다. 본 발명의 항체는 생체 시료가 환형 펩티드 신호전달 분자를 함유하는지를 결정하는 데 사용될 수 있는데, 상기 환형 펩티드 신호전달 분자는 그 존재가, 포유동물이 그램 양성 박테리아 감염을 가지고 있는지, 또는 그램 양성 박테리아 감염과 관련된 질병 또는 병증을 가지고 있거나 이에 감수성이 있는지를 나타낸다. 예를 들어, 에스. 아우레우스 AIP-IV 신호전달 펩티드에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 에스. 아우레우스 감염과 관련된 질병 또는 병증에 감수성이 있거나 이를 가지고 있는 것으로 의심되는 포유동물의 생체 시료 중의 에스. 아우레우스 AIP-IV의 존재를 검출하는 데 이용될 수 있다. 시료 중의 에스. 아우레우스 AIP-IV의 존재는 포유동물이 에스. 아우레우스 감염을 가지고 있거나, 에스. 아우레우스 감염과 관련된 질병 또는 병증에 대한 감수성이 있거나 이를 가지고 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 항체는 포유동물로부터 얻은 생체 시료 중의 환형 펩티드 신호전달 분자의 존재를 검출하고/하거나 그 양을 측정하기 위해 진단 목적으로 사용될 수 있다.

포유동물로부터 얻은 생체 시료 중의 환형 펩티드 신호전달 분자의 존재 또는 양은 적절히 표지된 본 발명의 항체를 사용한 경쟁 분석으로 검출할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 면역원성 분자 물질, 예를 들어 폴리펩티드와 같은 거대분자 담체에 연결된 합텐을 표면에 고정화할 수 있다. 포유동물로부터 얻은 생체 시료 존재 또는 부재 하에, 고정화된 면역원성 분자 물질에 대한 적절히 표지된 본 발명 항체의 결합을 측정한다. 생체 시료 존재 하에서 표면에 대한 표지된 항체의 결합이 감소된 것은 환형 펩티드 신호전달 분자가 존재함을 나타낸다. 상기 생체 시료는 관련없는 포유동물 세포가 제거된 부분 정제 또는 가공 시료일 수 있다. 상기 항체는, 알칼리 포스파타제, 아세틸콜린에스테라제, β-갈락토시다제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제 등의 효소; 스트렙타비딘, 바이오틴 또는 아비딘 등의 보결 분자단(prosthetic group); 단실 클로라이드, 디클로로트리아지닐아민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 피코에리스린, 로다민, 움벨리페론 등의 형광 기; 루미날 등의 발광 기; 에쿼린, 루시퍼라제 및 루시페린 등의 생물발광 기; 또는 ³H, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 등의 방사성 동위원소와 같은 검출 가능한 분자로 표지할 수 있다.

치료 방법

본 발명의 면역원성 분자 물질 또는 항체는 그램 양성 박테리아, 예를 들어, 쿼럼 센싱에 환형 펩티드 신호전달 분자를 이용하는 스타필로코커스 종에 의한 포유동물의 감염을 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 면역원성 분자 물질 또는 항체로부터 이익을 얻을 수 있는 포유동물은: (1) 그램 양성 박테리아에 의한 감염 위험이 있거나 감수성이 있는 포유동물, (2) 감염성 그램 양성 박테리아와 접촉한 포유동물, 또는 (3) 그램 양성 박테리아에 의해 감염된 포유동물을 포함한다. 그램 양성 박테리아 감염을 예방 또는 치료할 목적으로, 본 발명의 면역원성 분자 물질을 포유동물에게 투여하여 포유동물에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체를 투여하여 환형 신호전달 펩티드의 활성을 억제함으로써 박테리아 감염 또는 박테리아 감염과 관련된 질병 상태의 발생을 보조하는 독성 유전자 또는 독소의 생산을 예방할 수 있다.

본 발명의 면역원성 분자 물질 또는 항체를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 포유동물은, 환형 신호전달 펩티드의 존재 및/또는 양을 측정하는 상기에 기재된 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 포유동물로부터 얻은 시료(예를 들어, 혈액 배양물)를 배양함으로써 그램 양성 박테리아 감염의 존재를 검출하는 다른 방법도 이용될 수 있다. 본 발명의 면역원성 분자 물질 또는 항체를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 인간을 비롯한 포유동물은 면역계가 약화된 개체, 면역계가 저하된 개체, 수술을 받았거나 받을 예정인 개체, 고령이거나 중병을 앓고 있는 개체, 입원한 적이 있거나 의료 시술을 받은 적이 있는 개체일 수 있다. 본 발명의 면역원성 분자 물질 또는 항체를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 포유동물은 병원 감염 발생 위험이 있는 내원 환자, 또는 항생제 내성 박테리아, 예를 들어 메티실린 내성 에스. 아우레우스, 반코마이신 중간 감수성 에스. 아우레우스, 반코마이신 내성 에스. 아우레우스 및 뉴모코커스 뉴모니아(Pneumococcus pneumoniae)를 비롯한 다른 항생제 내성 장내구균에 감염된 것으로 알려지거나 노출된 적이 있는 포유동물일 수 있다.

본 발명의 항체 또는 면역원성 분자 물질은 감염 전, 감염 후이나 감염과 관련된 증상의 발현이 발현되기 전, 또는 증상의 발현 후에 추가적인 박테리아 증식을 막고 독성 유전자의 추가 발현을 막음으로써 질병의 발달 또는 그 진행을 저지하기 위해 투여될 수 있다. 본 발명의 면역원성 분자 물질은, 포유동물에게 투여될 때, 박테리아에 의해 생산된 환형 펩티드 신호전달 분자에 결합하여 이를 중화시킴으로써 박테리아 감염 또는 박테리아 감염과 관련된 질병 상태의 발생을 보조하는 독성 유전자 또는 독소의 생산을 방지하는 것에 의해 질병 또는 병증 또는 그 진행을 예방하는 항체의 생산을 유발한다. 또한, 본 발명의 중화 항체를 포유동물에게 투여할 수도 있다. 상기 중화 항체는 박테리아에 의해 생산된 환형 펩티드 신호전달 분자에 결합하여 이 분자가 세포 회합형 수용체에 결합하는 것을 방지할 수 있으며, 이렇게 할 때, 박테리아 감염 또는 박테리아 감염과 관련된 질병 상태의 발생을 보조하는 독성 유전자 또는 독소의 생산을 방지한다. 따라서, 본 발명의 면역원성 분자 물질을 포함하는 조성물은 생백신으로서 사용될 수 있는 한편, 본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 박테리아 감염 또는 박테리아 감염과 관련된 질병 또는 병증을 예방하기 위한 수동 백신으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 활성 물질은 본원에 기재된 임의의 경로를 통해 투여될 수 있다. 포유동물에게 투여되는 상기 면역원성 분자 물질 또는 초분자 조립체의 투여량은 환형 신호전달 펩티드에 대한 면역 반응을 유발하는 데 적절한 임의의 양일 수 있다. 포유동물에게 투여되는 상기 항체의 투여량은 환형 신호전달 펩티드의 활성을 중화시키는 데 적절한 임의의 양일 수 있다.

상기 투여량은 유효량 또는 유효량의 적정 분획일 수 있다. 투여량은 나이, 신체 조건, 체격, 체중, 치료 대상 병증, 병증의 중증도 및 임의의 병용 치료법을 비롯한 개개의 환자 파라미터에 따라 달라진다. 적정 투여량을 결정하는 인자는 당업자에게 공지되어 있으며, 통상적인 실험을 통해 결정할 수 있다. 예를 들어, 물리화학적, 독성학적 및 약력학적 특성은 화학, 약리학 및 독성학 분야에 공지된 수학적 모델링 기법을 이용하고 표준 화학적 및 생물학적 분석을 이용함으로써 측정할 수 있다. 치료적 유용성과 투여 계획은 이러한 기법의 결과로부터, 또, 적절한 약력학 및/또는 약동학적 모델의 이용을 통해 추정할 수 있다.

환자에게 투여되는 정확한 양은 주치가 결정할 사항이다. 본 발명의 면역원성 분자 물질 또는 항체는 포유동물 체중 kg당 약 0.05 mg∼약 2,000 mg, 바람직하게는 포유동물 체중 kg당 약 1 mg∼약 200 mg의 양으로 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 특정 제제가 작용 지속성이 길다면, 이것은 첫날 80∼4,000 mg의 초기 용량으로 투여하고, 그 후 후속되는 날들에는 20∼1,000 mg의 더 적은 용량을 투여하는 것이 유익할 수 있다. 환자는 의학적 이유, 생리학적 이유, 또는 실질적으로 임의의 다른 이유로 더 적은 용량 또는 허용할 수 있는 용량을 주장할 수도 있다. 1차 투여 후 특정 시간 간격으로 하나 이상의 추가 용량의 면역원성 분자 물질 또는 항체를 투여할 수도 있다.

본 발명의 항체 또는 면역원성 분자 물질을 사용하는 치료는 효과적인 중화 면역 반응을 유발하는 데 필요한 기간 동안 행해질 수 있다.

본 발명 항체의 생성 방법

본 발명의 면역원성 분자 물질 또는 초분자 조립체는 환형 신호전달 펩티드에 대한 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 면역원성 분자 물질 또는 초분자 조립체는 선택된 환형 신호전달 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 확인하기 위해 재조합 면역글로불린 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 방법 및 시약은, 예를 들어, 문헌[Barbas, C.F., 3^rd, D.R. Burton, J.K. Scott, and G.J. Silverman, Phage Display - A Laboratory Manual. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, and Kontermann, R., Duebel, S., Antibody Engineering, 2001, Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag]에 기재되어 있다.

본 발명의 면역원성 분자 물질 또는 초분자 조립체는 또한 포유동물에서 면역 반응을 유발하는 데 사용될 수 있으며, 이 포유동물로부터 다클론 또는 단일클론 항체를 얻을 수 있다. 본 발명의 면역원성 분자 물질 또는 초분자 조립체는, 예를 들어 염소, 양, 래트, 마우스 또는 토끼 등의 포유동물에게 투여될 수 있다. 다클론 항체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 포유동물의 혈액으로부터 단리할 수 있다. 단일클론 항체는 포유동물로부터 항체 생산 세포를 단리하여 항체 생산 하이브리도마를 생성함으로써 얻을 수 있다. 포유동물로부터 항체를 생산하고 수득하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Harlow, D. and D. Lane, Antibodies A laboratory manual. Cold spring harbor laboratory, New York (1988)] 및 문헌[Tramontano, A. and D. Schloeder, Production of antibodies that mimic enzyme catalytic activity. Methods Enzymol 178: p. 531-550 (1989)]을 참조할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 비한정적인 실시예를 통해 추가로 설명한다.

실시예

실시예 1 - 재료

RN4850은 Richard P. Novick 박사(뉴욕 대학 메디칼 센터의 Skirball 연구소)로부터 입수하였다. 정제된 단일클론 항체는 TSRI 항체 생산 핵심 시설(TSRI Antibody Production Core Facility)로부터 입수하였다. 임상 분리주 NRS168은 NIAID/NIH(N01-AI-95359)에 의해 지원되는 스타필로코커스 아우레우스(NARSA) 프로그램의 항생제 내성에 관한 네트워크를 통해 입수하였다.

실시예 2 - 천연 AIP 1∼4의 합성

모든 천연 생성물을 합성하는 데 하기 일반적 절차를 이용하였다. 표준 Boc 고상 펩티드 합성 프로토콜에 따라 DMF 중에 팽윤시킨 0.25 mmol의 MBHA 수지에서 뱃치 합성을 수행하였다. 4 mL의 DMF 중 S-트리틸-3-머캅토프로피온산(2 eq), HBTU(3.9 eq) 및 DIEA(0.5 mL)의 용액을 제조하여 예비 활성화를 위해 3분 동안 정치시켰다. 이 혼합물을 커플링을 위해 수지에 첨가하였으며, 커플링은 일반적으로 1 시간 내에 완료된다. 그 후, 이 수지를 DMF로 세척하고, TFA 중 5% TIS를 사용한 트리틸 탈보호를 실시하였다(2×10분). DMF로 세척한 후, 3분 동안의 예비 활성화와 함께, 4 eq의 Boc 아미노산, 3.9 eq의 HBTU 및 0.5 mL의 DIEA를 사용한 순차적 커플링 반응에 의해 펩티드 합성을 완료하였다. 합성이 완료되었을 때, 수지를 DMF, CH₂Cl₂, 마지막으로 에테르로 순차로 세척한 후, 데시케이터에 넣어 두었다.

절단: 스캐빈저로서 아니솔을 사용하여 수지를 5∼10 mL의 HF에 1 시간 동안 적용하였다. 얻어진 혼합물을 에테르로 세척하고 1:1의 물/아세토니트릴로 추출하였다. 이 용액을 냉동 및 동결 건조시키고, 얻어진 고체를 분취용 HPLC로 정제하였다. 순수한 분획을 합하여 냉동 및 동결 건조시켰다.

티오락톤화: 정제된 고체 선형 펩티드를 80% MOPS 완충액(100 mM, pH 7.0) 및 20% 아세토니트릴의 혼합물 중에 용해시켜 펩티드 농도가 1 mM 미만이 되게 함으로써 분자내 티오락톤화를 실시하였다. 반응은 ESI-MS로 모니터링하였고, 일반적으로 24∼48 시간 내에 완료되었다. 생성물은 분취용 HPLC로 정제하였다. 순수한 분획을 합하여 냉동 및 동결 건조시켰다. ESI-MS: m/z AIP-1에 대한 계산치, C₄₃H₆₀N₈O₁₃S₂ (M+H), 961.4; 실측치 961.8: m/z AIP-2에 대한 계산치, C₃₈H₅₈N₁₀O₁₂S (M+H), 879.4; 실측치, 879.6: m/z AIP-3에 대한 계산치, C₃₈H₅₈N₈O₁₀S (M+H), 819.4; 실측치, 819.7: m/z AIP-4에 대한 계산치, C₄₈H₆₄N₈O₁₂S₂, 1009.4; 실측치 1009.7. 도 2a∼2h 참조.

실시예 3 - AIP4 합텐 5 - AIP4 락톤 유사체의 합성

AIP4 합텐 5의 합성 반응식은 하기 반응식 1에 도시하였다. 선형 펩티드 YSTSYFLM(서열 번호 1, 보호기를 포함하지 않음)은 DIC/HOBt를 커플링제로 해서 표준 Fmoc 화학법을 이용하여 Fmoc-메티오닌 1을 미리 로딩한 2-클로로트리틸 수지에서 합성하였다. N-말단 펜던트 시스테인을 도입하여 담체 단백질에 접합시키고 짧은 가요성 링커를 합텐과 담체 단백질 사이에 스페이서로서 추가하였다. 클로로포름 중의 4% 트리플루오로아세트산을 사용하여 수지로부터 보호된 선형 펩티드를 유리시켰으며, 상기 용액은 또한 세린으로부터 트리틸 보호기를 선택적으로 제거하였다. EDC/4-DMAP를 이용하여 희석 조건 하에 분자내 락톤화를 수행하였고, 후속 측쇄 탈보호는 상기 AP4 합텐 5를 제공하였다. 합성 절차에 관한 상세사항은 이하에 기재하였다.

선형의 보호된 펩티드(3)의 합성

펩티드 합성을 위한 모든 N-α-Fmoc 보호 아미노산, 커플링제 및 수지는 EMD Biosciences, Inc.(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 구입하였다. 다른 모든 화학약품은 Sigma-Aldrich Corp.(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)으로부터 구입하였다. ESI-MS 분석은 API150EX(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 PE SCIEX 제품)를 사용하여 수행하였고, HITACHI L-7300 및 SHIMADZU SCL-10A를 각각 분석용 HPLC 실험 및 분취용 HPLC 실험에 사용하였다.

펩티드는 Fmoc-Met(1)가 사전 로딩된 2-클로로트리틸 수지 상에서 Fmoc SPPS로 합성하였다. Fmoc-Ser(Trt)-OH를 락톤화 위치에 도입하였다. 다른 모든 잔기는 묽은 TFA에서 안정하고 95% TFA에서 불안정한 측쇄 보호기를 갖는 것으로 선택하였다. Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산을 커플링함으로써 N-말단으로부터 두 번째에 짧은 가요성 링커를 도입하였다. N-말단 잔기는 궁극적으로 담체 단백질에의 접합에 사용하기 위한 Boc-Cys(Set)-OH였다.

특수 조건: DMF 중에서 팽윤시킨 1 mmol의 수지에서 1 시간 이상 동안 뱃치 합성을 수행하였다. 5 mL의 DMF 중 보호된 아미노산, DIC 및 HOBt(각각 4 당량)의 용액을 제조하여 예비 활성화를 위해 5분 동안 정치시킨 후, 0.5 mL의 sym-콜리딘을 첨가하였다. 이 혼합물을 커플링을 위해 수지에 첨가하였으며, 커플링은 일반적으로 1 시간 내에 완료된다. 그 후, 이 수지를 DMF로 세척하고, DMF 중 20%(v/v) 피페리딘을 사용한 Fmoc 탈보호를 실시하였다(2×7분). 그 후, 수지를 DMF로 세척한 후, 후속 커플링 반응을 수행하였다. 합성이 완료되었을 때, 수지를 DMF, CH₂Cl₂, 마지막으로 에테르로 순차로 세척한 후, 데시케이터에 넣어 두었다.

절단(및 트리틸 탈보호): 상기 수지를 클로로포름 중 4% TFA, 4% 트리이소프로필실란(TIS) 및 0.5% H₂O의 혼합물에 첨가하고 6 시간 동안 진탕시켰다. 이 혼합물을 여과하고 여액을 냉각 에테르에 적하하여 펩티드를 침전시켰다. 이 에테르 혼합물을 원심분리하고 상청액을 경사분리하였다. 그 후, 고체를 에테르에 현탁시켜 원심분리하고 상청액을 경사분리함으로써 펩티드를 에테르로 세척하였다(2×). 얻어진 고체를 데시케이터에 넣어 두었다.

정제: 완전 보호 펩티드(3)를 염화메틸렌에 용해시키고 염화메틸렌 중 5% 메탄올을 용리제로 사용하여 순상(normal phase) 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다.

B. (3)의 락톤화

보호된 선형 펩티드(3)를 1,2-디클로로에탄(무수 MgSO₄로 사전 건조시킴)에 용해시켜 최종 농도가 1.0 mM 미만이 되도록 하였다. 이 용액을 교반하고 80℃로 가열하여 각각 3 당량의 EDC 및 4-DMAP를 첨가하였으며; 각각 추가 당량의 EDC 및 4-DMAP를 24 시간째와 48 시간째 반응에 첨가하였다. HPLC로 반응을 모니터링하였다. 4일 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 200 mL의 0.2 M KHSO₄(수용액)로 2회 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 증발 건조시켰다. 고리화 펩티드(4)를 분취용 HPLC로 정제하였다. 분석용 HPLC 적분으로 측정시 수율은 30∼60% 범위이다.

C. (4)의 전체적 탈보호 및 디설파이드 탈보호

2% TIS를 함유하는 TFA에 고체의 정제된 펩티드를 용해시켜 1 시간 동안 교반하였다. 그 후, 이 혼합물을 증발 건조시켰다. 물을 첨가하고, 이 혼합물을 냉동 및 동결 건조시켰다. 그 후, 동결 건조된 고체를 트리스(2-카복시에틸)포스핀 클로라이드(TCEP)와 함께 H₂O에 용해시켰다. 이 혼합물을 1 시간 동안 교반하고, 정제를 위한 분취용 HPLC에 바로 주입하여 AP4 합텐(5)를 수득하였다. 수집된 순수한 분획을 합하여 냉동 및 동결 건조시켰다. ESI-MS: m/z C₅₇H₈₀N₁₀O₁₇S₂에 대한 계산치(M+H), 1241.5; 실측치, 1242.2. 도 2i & 2j 참조.

D. KLH/BSA에 대한 (5)의 접합

KLH/BSA에 대한 합텐(5)의 접합은 하기 반응식 2에 도시된 바와 같이 수행하였다. 이 절차의 상세사항은 이하에 기재하였다.

설포-SMCC의 부착. 상기 담체 단백질 5 mg을 0.9 mL의 PBS(pH 7.4)에 재현탁시켰다. 이 용액에 링커 설포-SMCC(설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트) 1 mg을 첨가하였다. 이 용액을 6∼8 시간 동안 교반하고, 단백질-링커 접합체를 4℃에서 PBS로 투석하여 정제하였다.

합텐(5)의 접합. PBS 중의 단백질-링커 접합체에 합텐(5) 2 mg을 함유하는 DMF 100 ㎕를 첨가하였다. 이 용액을 밤새 진탕시키고, 투석으로 단백질-합텐 접합체을 정제하였다. MALDI-TOF 분석에 의해 BSA 분자당 평균 약 6개의 합텐이 부착되었음을 확인하였다(BSA-AIP4 접합체의 분자량 = 75,581 달톤; BSA = 67,000 달톤; 및 합텐 = 1,461.15 달톤). 도 2k 참조.

실시예 4 - 합성 합텐으로서의 AP1, AP2, AP3 및 AP4 락톤 유사체 및 합텐-단백질 담체 접합체의 제조

면역화 및 면역 반응의 유발, 능동 백신 및 단일클론 항체의 제조를 위해, 상기에 기재된 AP4 합텐(5)의 제조에 대해 기재한 절차를 이용하여 AP1, AP2, AP3 및 AP4 락톤 유사체 형태의 합성 합텐 및 합텐-단백질 담체 접합체를 제조하였다. 제조 반응식은 다음과 같다.

실시예 5 - 합성 합텐으로서의 AP4 락탐, 카바미드 및 세미카바자이드 유사체의 제조

단백질 분해에 안정한 환형 락탐, 카바미드 및 세미카바자이드 AIP 펩티드 합텐은 염기 불안정 카이저(Kaiser) 옥심 수지 상에서 잘 알려진 펩티드 고리화 방법을 이용하여 제조한다. 문헌[DeGrado et al., J. Org. Chem. 1980, 45, 1295-1300]; 문헌[DeGrado et al., J. Org. Chem. 1982, 47, 3258-3261]; 문헌[Nakagawa et al., J. Org. Chem. 1983, 48, 678-685]; 문헌[Nakagawa et al., J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 7087-7092]; 문헌[Kaiser et al., Science 1989, 243, 187-192]을 참조할 수 있다. 이 합성법은 Boc에 기초한 고상 펩티드 합성에 기반한 것으로, 여기서 펩티드 고리화는 고체 지지체로부터의 고리화 펩티드의 절단과 동시에 일어난다. 문헌[Osapay et al., J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 6966-6973]; 문헌[Taylor et al., Biopolymers 2002, 66, 49-75]; 및 문헌[Li et al., Curr. Org. Chem. 2002, 6, 411-440]을 참조할 수 있다. 환형 카바미드 펩티드의 합성에는 문헌에 기재된 바와 같이 레트로-인버소 모티프(retro-inverso motif)가 요구된다[Chorev et al., Biopolymers 2005, 80, 67-84]. 필수 물질인 1-N-Boc-4-(메틸티오)부탄-1,2-디아민 구성 요소는 상업적으로 입수 가능한 Boc-메티오니놀로부터 합성하고, 그 후 선행 문헌에 따라 니트로페닐 카바메이트 프로토콜을 통해 펩티드 사슬에 커플링한다[Vince et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 853-856]. 하기 반응식은 AIP-4 펩티드의 단백질 분해에 안정한 환형 락탐, 카바미드 및 세미카바자이드 유사체의 합성을 개략적으로 도시한다. 이러한 합성 방법은 다른 환형 펩티드 합텐, 예를 들어 AIP-1, AIP-2, AIP-3뿐만 아니라 다른 스타필로코커스 쿼럼 센싱 펩티드의 제조에도 적용될 수 있다.

상기 환형 락탐 AIP4 합텐의 합성은 반응식 8에 요약하였다. 반응식 9 및 10은 각각 환형 카바미드 AIP4 합텐 및 환형 세미카바자이드 AIP4 합텐의 합성에 사용되는 중간체 1-N-Boc-4-(메틸티오)부탄-1,2-디아민 p-니트로페닐카바메이트 및 N-Fmoc-Met-하이드라지드 p-니트로페닐카바메이트의 합성을 개략적으로 도시한다. 카바미드 및 세미카바자이드 AIP4 합텐의 합성은 각각 반응식 11 및 12에 도시되어 있다.

실시예 6 - 에스. 아우레우스에서의 세포외 단백질의 분석

37℃에서 한천 플레이트에서 밤새 배양한 후, 에스. 아우레우스(RN4850 또는 Wood 46)의 단일 콜로니를 3 mL CYGP 배지에 접종하여 밤새 배양하였다(18 시간)(문헌[Novick, Methods Enzymol 204:587-636 (1991)] 참조). 밤새 배양한 세포를 새로운 CYGP 배지에서 OD₆₀₀ 약 0.03로 희석하고 5 mL 폴리스티렌 세포 함유 튜브에 분배하였으며, 이때 각각의 튜브는 0.5 mL의 희석된 세포와 적절한 항체(0.2 mg/mL)를 함유하였다. 진탕을 하거나 하지 않고 가습 인큐베이터에서 37℃로 20∼24 시간 동안 배양한 후, 시료를 마이크로원심분리 튜브(1.5 mL)에 옮겨서 13,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 Millex® GV 필터 유닛(0.22 ㎛; 아일랜드 소재 Millipore 제품)을 통해 여과하여 멸균하고 SDS-PAGE(10% Bis-Tris 겔, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen 제품)로 분석하였다. α-헤모라이신 및 단백질 A 발현을 확인하기 위해, HRP 접합 양 다클론 α-헤모라이신 항체(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재의 abcam Inc. 제품) 및 항단백질 A 마우스 단일클론 항체(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich 제품)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였으며, 쥐과 mAb SP2-6E11(Park and Janda, 미공개 데이터)를 대조군 항체로서 사용하였다. 용혈 활성을 테스트하기 위해, 에스. 아우레우스 상청액(75 ㎕×3)을 양 혈액 한천 플레이트에 도포하여 37℃에서 18 시간 동안 항온처리하고 실온에서 24 시간 동안 추가로 항온처리하였다.

실시예 7 - 정적 생물막 분석

생물막 분석은 약간의 수정을 가하여 문헌의 절차에 따라 수행하였다(문헌[O'Toole, Methods Enzymol 310:91-109 (1999)] 참조). 항체(0.2 mg/mL)를 포함하거나 포함하지 않고 0.2% 글루코스를 포함하는 트립신 대두 브로스(TSB) 배지 중의 에스. 아우레우스 세포(200 ㎕)를 폴리스티렌 96웰 플레이트에서 진탕시키지 않고 20∼24 시간 동안 배양한 후, 플레이트를 물에 침수시켜 세척하고 건조시켰다. 생물막을 염색하기 위해 크리스탈 바이올렛 용액(200 ㎕, aq. 0.1%)을 첨가한 뒤, 플레이트를 물로 격렬히 세척한 후 아세트산(250 ㎕, aq. 30%)을 첨가하여 남아있는 크리스탈 바이올렛을 용해시켰다. Spectramax 250(미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 Molecular Devices 제품)으로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 8 - 리얼 타임 PCR 분석

항체를 함유하는 새로운 CYGP 배지(1 mL)에 밤새 배양한 에스. 아우레우스 RN4850 세포를 OD₆₀₀ 약 0.03이 되도록 희석하고 진탕시키지 않은 채 37℃ 20∼24 시간 동안 배양하였다(OD₆₀₀ 약 2). 제조업자의 설명서에 따라 Rneasy® Mini Kit(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 QIAGEN Inc. 제품)를 사용하여 세포로부터 RNA를 단리하였다. 단리된 RNA는 Rnase 무함유 Dnase(QIAGENE Inc.)로 실온에서 30분 동안 처리하여 추가로 정제하였다. 제1 가닥 DNA는 RT-PCR을 위한 SuperScript^TM 퍼스트 스트랜드 합성 시스템(Invitrogen)을 이용하여 약 300 ng의 정제된 RNA로 합성하였다. RT-PCR 실험은 2개 이상의 독립된 시료를 사용하여 수행하였으며, 각각의 실험은 LightCycler® FastStart DNA Master^PLUS SYBR Green I(미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 Roche Applied Science 제품)를 사용하여 2중으로 실시하였다. PCR 조건에 Generic SYBR Green Protocol(Roche)을 이용하였고, 하우스키핑 GyrA 유전자를 참조물질로 이용하여 LightCycler® 2.0 시스템(Roche Applied Science)으로 상대적 정량 분석을 수행하였다. 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다:

실시예 9 - 마우스에서의 피부 감염 모델

모든 실험은 TSRI 지침 및 규정에 따라 수행하였다. 6∼8 주령의 SKH1 정상 흉선 무모 마우스를 찰스 리버 래보라토리즈(Charles River Laboratories)로부터 입수하여 실험에 사용하기 전 1주 동안 생물 안전 차폐 동물 사육장에서 사육하였다. 뇌심장 육수 한천(brain heart infusion agar)은 BBL(#211065)이었고, CYGP 브로스는 문헌[Novick, Methods Enzymol 204: 587-636 (1991)]에 기재된 바와 같이 1% 카사미노산(Fisher BP1424), 1% 효모 추출물(EMD 1.03753), 0.59% 염화나트륨, 0.5% 덱스트로스 및 60 mM β-글리세롤 2인산나트륨 염(Fluka 50020)를 함유하였다. 사이토덱스(Cytodex) 1 비드(GE Healthcare 17-0448-01)를 20℃에서 밤새 칼슘/마그네슘(Gibco) 무함유 둘베코 인산염 완충 식염수에 현탁시켰다(50 mL 중 1 g). 상청액을 경사 분리하고, 비드를 DPBS에 현탁시키고 1G 침강을 실시함으로써 3회 세척한 후 고압 증기 멸균하였다(121℃, 15 psi, 15분). 동결된 보존 용액(BHI + 20% 글리세롤)으로부터의 스타필로코커스 아우레우스 RN4850(AIP4)을 뇌심장 육수 한천 플레이트에서 35℃로 밤새 증식시켰다. 3개의 대표 콜로니를 합해서 2 mL CYGP 브로스에 접종하고, 진탕시키지 않은 채 밤새 항온처리한 후, 배양액 0.25 mL를 사용하여 CYGP 5 mL에 접종하고, 이어서 35℃에서 200 rpm으로 3 시간 동안 항온처리하였다. 배양액을 1,300×G로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라 버리고, 박테리아 펠릿을 칼슘/마그네슘 비함유 DPBS 1 mL에 현탁시켰다. SKH1에게 에스. 아우레우스(1×10⁷개 또는 1×10⁸개 박테리아), 충전 부피 4 ㎕의 Cytodex 비드, DPBS, 항AIP4 항체 또는 대조군 IgG(0.6 또는 0.06 mg)를 함유하는 주사액 200 ㎕를 옆구리에 피하 주사로 투여하였다. 추가의 대조군 동물에게 Cytodex 비드 또는 비드들과 항체를 함유하는 주사액 200 ㎕를 피내 주사로 투여하였다. 주사 후, 4∼7일의 기간 동안 매일 3회 이상씩 마우스를 모니터링하였다. 모니터링 기간 종료 후 마우스를 안락사시키고 세균학적 분석 및 조직학적 분석을 위해 조직을 적출하였다.

실시예 10 - AP4-24H11을 사용한 마우스의 수동 면역화

에스. 아우레우스 RN4850을 20% 글리세롤/BHI 배지에 넣어 -80℃에서 저장하고 해동시켜 BHI 한천 플레이트에서 밤새 배양하였으며, 3개의 별개의 콜로니를 샘플링하여 2 mL CYGP 배지에 접종하였다. 접종 배양액을 진탕시키지 않은 채 35℃에서 1 시간 동안 유지한 후, 200 rpm에서 3 시간 동안 진탕시켰다. 새로 배양한 접종 배양액의 분액을 50 mL 원추형 폴리프로필렌 튜브(1/20 희석)의 5 mL CYGP 배지로 옮긴 후 200 rpm, 35℃에서 3 시간 동안 진탕시켰다. 4℃, 3,000 rpm(1,300×G)에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠릿화하였다. 박테리아 펠릿을 칼슘 또는 마그네슘 비함유 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS^-)에 재현탁시키고, Petroff-Hausser 카운팅 챔버를 사용하여 수를 세었다. 최종 희석은, 3×10⁸개 박테리아가 0.5 mL로 복강내 투여되도록 DPBS^-로 행하였다. 생존율을 유지하기 위해, 적출 2 시간 이내에 박테리아를 투여하였다.

DPBS 중의 이소타입 일치 대조군 IgG인 Mab AP4-24H11(각각 1 mg) 또는 DPBS를 SKH1 마우스(6∼9 주령; 처리군당 6 마리 동물)에 복강 주사하고, 그로부터 2 시간 후 3×10⁸개 에스. 아우레우스를 포함하는 0.5 mL DPBS^-를 복강 주사로 투여하였다. 마우스를 주사 당일에 몇 차례 모니터링하고 이어지는 날들 동안 매일 2회씩 모니터링하여, 보행, 경계 태세, 취급에 대한 반응 및 1 cm 직경의 흉골하부 피부 부위를 이용하여 적외선 온도계(Raytek MiniTemp MT4)로 측정한 피부 온도를 관찰하였다. 꾸준히 30℃ 이하의 체온을 보이고, 또한, 취급에 대한 반응성 감소 및 약화된 두위 반사를 보이는 동물은 빈사 상태로 간주하여 안락사시켰다.

실시예 11 - 경쟁 ELISA 분석

AP4-BSA 접합체 및 각각의 mAb의 최적 농도를 측정하였다. 96웰 ELISA 플레이트를 각각 적정량의 AP4-BSA 접합체로 코팅하였다. 이 플레이트를 4% 탈지유로 차단하고 세척하고 소정의 최적 농도로 mAb를 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, 유리 항원, 즉, 천연 AIP 1∼4를 100 μM로부터 출발하여 일련의 농도로 웰에 첨가하였다. 이 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하고, 철저히 세척하고, 염소 항마우스-호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 접합체(미국 일리노이주 록포드 소재의 Pierce 제품)를 첨가하였다. RT에서 1 시간 동안 항온처리한 후, 플레이트를 다시 철저히 세척하고 HRP 기질(TMB 기질 키트; Pierce)을 첨가하고, 반응이 15분 동안 진행되게 한 후, 2 M H₂SO₄를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 판독하고 그 값을 GraFit(Erithacus Software Ltd)를 사용하여 플로팅하였다. 흡광도 값이 최고 흡광도의 50%인 유리 항원 농도를 항원에 대한 상기 항체의 K_d로 간주하였다.

실시예 12 - 항AP4 단일클론 항체의 생성

AIP-4의 보고된 구조 정보[Mayville et al., Proc. Natl. Ncad. Sci. U.S.A. 96:1218-1223 (1999)]에 기초하여, 마우스에서 항AIP-4 항체 면역 반응을 유발할 수 있도록 합텐 AP4-5를 디자인하여 합성하였다(반응식 1). 천연 티오락톤으로부터 락톤 함유 합텐으로의 화학적 전환의 원리는 락톤의 아미노 용해 안정성이 더 큰 것에 기초한 것이다. 이 전략은 합텐 접합체가 면역화 과정 및 후속 면역 반응에서 구조적으로 무결한 상태로 남도록 담보함으로써, 다른 QS 분자에 대해 이전에 밝혀진 것과 같은 알려지지 않은 화학적 특성과 생물학적 특성을 갖는 분해 생성물의 생성을 방지하였다. 이러한 치환은 또한 보존된 티오락톤과 펜던트 시스테인 디올 간의 가능한 분자내 티올 교환을 방지하였다. 따라서, Fmoc-세린(Trt)-OH가 천연 시스테인 잔기 대신에 4번 위치에 도입되었다.

합텐(5)를 이작용성 링커를 통해 담체 단백질 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 소 혈청 알부민(BSA)에 접합시켰다(반응식 2). 표준 프로토콜(문헌[Kaufmann et al., J. Am. Chem. Soc. 128:2802-03 (2006)] 참조)을 이용하여 Balb/c 마우스를 KLH 접합체로 면역화하였다. 전반적으로, 면역화에 의해 중간 정도의 역가(1,600∼3,200)가 얻어졌고, ELISA 분석에 기초하여, 20종의 단일클론 항체(mAb)를 선별하였다.

이 중에서, 3종의 AP4-mAb의 결합 친화력을 측정하였다. 하기 표에 기재된 이들의 결합 친화력은 경쟁 ELISA법을 이용하여 4종의 천연 AIP 전부에 대해 측정하였다.

모든 결합 상수는 2회 이상 측정하여 그 평균을 제시하였다. AP4-29E10이 AIP-4에 대해 더 큰 친화력을 보유하였지만, 단백질 제조 단계에서 직면하는 기술적 문제로 인하여 추가적인 생물학적 평가 대상으로 선택하지 않았다.

AP4-24H11은 AIP-4에 대한 강한 결합 친화력(K_d　AIP-4

90 nM)과 높은 특이성을 보유한 반면, 다른 AIP에 대해서는 교차 반응성을 거의 나타내지 않았다(K_d　AIP-1

5 μM, K_d　AIP-2

25 μM, K_d　AIP-3

25 μM). AP4-24H11이 AIP1과 AIP4를 구별하는 능력은, 이들 2개의 올리고펩티드가 AIP-1에서 아스파르트산 잔기, AIP-4에서 타이로신 부분을 갖는 5번 위치에서만 다르기 때문에 주목할 만하다. AP4-24H11을 추가적인 생물학적 평가를 위해 선택하였다.

실시예 13 - AP4-24H11은 에스. 아우레우스에서 독성 인자의 발현을 변경함

α-헤모라이신 및 단백질 A는 에스. 아우레우스에서의 2종의 주요 독성 인자로서, 이들 단백질의 발현은 AIP에 기초한 agr QS 시스템을 포함하는 에스. 아우레우스 신호전달 네트워크에 의해 엄격하게 조절된다. agr QS 시스템은 α-헤모라이신의 발현을 양성적으로 조절하는 한편, 단백질 A 생산은 QS 신호전달에 의해 하향 조절된다.

항AIP 항체가 에스. 아우레우스에서 QS 신호전달을 간섭할 수 있는지를 확인하기 위해, 항AIP-4 mAb AP4-24H11이 agr 그룹 IV 균주 RN4850 및 NRS168에서 α-헤모라이신 및 단백질 A의 발현을 조절할 수 있는지를 조사하였다. 도 3a의 결과는 AP4-24H11이 에스. 아우레우스 세포외 단백질의 분비 및/또는 발현에 영향을 주는지를 나타내며, 이들 단백질 중 일부는 또한 agr QS 회로(circuit)에 의해 조절될 수 있다. 도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, mAb AP4-24H11은 에스. 아우레우스에서 α-헤모라이신 발현을 성공적으로 감소시킬 수 있고, 도 3b에 도시된 바와 같이 AP4-24H11로 처리된 상청액을 함유한 혈액 한천 플레이트에서 용혈 활성이 관찰되지 않았다. 대조적으로, RN4850에서 단백질 A 발현은 mAb AP4-24H11에 의해 유의적으로 감소되었으며, 이것은 또한 agr QS 억제와 일관된 것이다.

AIP-1과 AIP-4 사이의 유일한 구조적 차이는 5번 위치이며, 이 데이터는, AP4-24H11이 중간 정도의 친화력(

5 μM)으로 AIP-1에 결합할 수 있음을 시사한다. 따라서, AP4-24H11이 agr 그룹 I 균주, 즉, Wood 46에서 QS 신호전달에 영향을 줄 수 있는지를 조사하였다. AP4-24H11은 Wood 46에서 RN4850에서처럼 효과적으로 α-헤모라이신 발현을 차단할 수 없었다. 그러나, AP4-24H11 존재 하에 증식한 Wood 46에서 α-헤모라이신 생산이 현저히 감소되었음이 명백하였다(도 4a). 이들 데이터는, 이것이 2종 이상의 상이한 agr 그룹의 에스. 아우레우스 QS 신호전달을 억제하는 교차 반응성 mAb를 생성할 수 있음을 시사한다.

독소 생산 및 전체 단백질 분비의 감소는 항체 매개성 증식 결함에 의해 유발될 수 있으며, 결과는, AP4-24H11 존재 하에 24 시간의 증식 기간 동안 에스. 아우레우스의 유의적인 증식 변화가 관찰되지 않았음을 보여준다(도 4b). 또한, AP4-24H11에 대한 관련없는 이소타입 대조군(κγ_2a)인 mAb SP2-6E11을 사용한 경우에도 식별할 수 있는 증식 효과가 관찰되지 않았다.

QS에 의해 조절되는 중요한 박테리아 독성 인자 중 하나는 생물막 형성이다. 에스. 아우레우스에서는, 생물막 형성이 agr QS 신호전달에 의해 음성적으로 조절되며, 이것은 agr QS 억제를 통해 에스. 아우레우스 독성을 조절함에 있어서의 문제 중 하나이다. 이전 연구와 일관되게, AP4-24H11 매개성 QS 억제는 RN4850에서 생물막 형성 증가를 초래하였다(도 4c). 생물막 형성 증가는 에스. 아우레우스의 만성 감염에 있어서는 심각한 문제를 부과하지만, 이것은 급성 감염에서는 덜 곤란한 문제이며, 따라서, mAb AP4-24H11은 그러한 에스. 아우레우스 감염을 억제하기 위한 효과적인 방법이 될 수 있다.

실시예 14 - AP4-24H11은 agr QS 시스템을 간섭함으로써 독성 인자의 발현을 변경함

AP4-24H11에 의한 agr QS 억제를 추가로 조사하기 위해, 독성 인자 발현에서 관찰된 변화가 실제로 agr QS 시스템에 의한 간섭에 의해 유발되는지, 즉, AP4-24H11의 존재가 agr 자체 유도의 즉각적 생성물 및 에스. 아우레우스에서의 주요 QS 이펙터인 rnaIII의 전사에 영향을 주는지를 평가하기 위한 리얼 타임 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 분석을 수행하였다. 예상한 대로, 정지 증식기 동안 RN4850에서의 rnaIII 전사 수준은 AP4-24H11에 의해 현저히(>50배) 감소하였다. 따라서, α-헤모라이신 및 단백질 A 발현의 변경은 AP4-24H11에 의한 AIP-4 매개성 QS 신호전달 간섭의 직접적 결과이다(도 4d). 그러나, 전체 세포외 단백질 발현에 있어서의 미묘한 차이(도 3 참조)가 AP4-24H11이 QS 신호전달을 효율적으로 차단하지 못한다는 것을 의미하는 것으로 잘못 해석될 수 있다. 그러나, RT-PCR 분석은 AP4-24H11이 에스. 아우레우스 RN4850에서 AIP4에 기초한 QS를 유의적으로 억제한다는 증거를 제공한다.

에스. 아우레우스에서 항체에 기초한 QS 간섭의 특이성을 분석하기 위해, 환경 스트레스에 대한 반응뿐만 아니라 에스. 아우레우스에서의 독성 인자 발현을 조절하는 2종의 추가적인 독성 조절인자, 즉, sarA(스타필로코커스 보조 조절인자) 및 saeR(스타필로코커스 보조 단백질 이펙터)의 전사 수준을 조사하였다. 중요한 점은, sarA 전사 또는 saeR 전사 어느 것에도 유의적인 변화(≤2배)가 관찰되지 않았다는 것이며, 이는 AP4-24H11이 단지 agr QS 시스템에 영향을 준다는 것을 암시한다(도 4d).

α-헤모라이신 및 단백질 A의 전사는 상기에 기재된 바와 같이 RT-PCR로 분석하였다. 언급된 바와 같이(상기 참조), 단백질 발현 수준에서 유의적인 변화가 관찰되었다. 전사 측면에서는, hla 유전자 및 spa 유전자가 각각 약 3∼5배 억제 및 증가되었으며, 이 역시, rnaIII가 이들 단백질의 전사뿐만 아니라 번역에도 영향을 준다는 것을 확인시켜 준다. 마지막으로, 엑소폴리아틴 A(eta) 전사도 관찰하였다. 엑소폴리아틴은 AIP-4를 이용하는 에스. 아우레우스 균주에 의해서만 생산되는 또 다른 agr QS 조절 독소이다. 이 데이터는, AP4-24H11은 또한 eta 전사를 약 10배 감소시켰음을 나타내었다(도 4d).

실시예 15 - 합성 AIP-4에 의한 AP4-24H11의 불활성화

AP4-24H11이 AIP-4에 대한 결합을 통해 agr QS를 억제하고 세포 성장 배지로부터 이것을 격리시키는지, 또는 AP4-24H11이 에스. 아우레우스에서 선형 펩티드 RNAIII 억제 펩티드(RAP)(이것은 다시 agr QS 네트워크에 영향을 줌)를 비롯한 다른 신호전달 시스템에 영향을 주는지를 확인하기 위해, 하기 실험을 수행하여, AIP-4의 외부 첨가가 AP4-24H11 존재 하에 에스. 아우레우스 RN4850에서 agr QS 신호전달 네트워크를 회복시킬 수 있는지를 확인하였다. 요약하면, AP4-24H11을 등몰량의 합성 AIP-4로 처리한 후 에스. 아우레우스 성장 배지에 첨가하여 AIP-4 펩티드에 의한 항체 결합 부위의 포화를 확실히 하였다. 도 4e에서 알 수 있는 바와 같이, 합성 AIP-4의 첨가는 AP4-24H11의 쿼럼 켄칭 효과를 효율적으로 감소시켰고, 그 결과, 에스. 아우레우스 RN4850에서 α-헤모라이신의 발현을 완전히 회복시켰다. 이러한 발견은, AP4-24H11이 에스. 아우레우스 성장 배지에서 AIP-4를 격리시켜, 에스. 아우레우스에서 엄격하게 AIP-4 의존적 방식으로 AIP 의존적 QS 신호전달을 억제한다는 것을 추가로 확인시킨다.

실시예 16 - AP4-24H11은 포유동물 세포에서 에스. 아우레우스 유발성 아폽토시스를 억제함

최근의 연구는, Jurkat T 세포를 에스. 아우레우스 배양물의 상청액과 항온처리하는 것이 아폽토시스를 유도하는 결과를 초래한다는 것을 입증하였다. Jurkat 세포를 AP4-24H11 존재 또는 부재 하에 배양한 에스. 아우레우스(RN4850 및 Wood 46) 배양물의 상청액으로 처리하였다. 상청액과 4 시간 동안 항온처리한 후, 아폽토시스 유도의 지표가 되는 생화학적 마커인 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP)의 절단을 Jurkat 세포 단백질 추출물에서 평가하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, AP4-24H11은 Jurkat 세포에서 RN4850 상청액(1%) 유발성 PARP 절단을 방지하였고, 또한, Wood 46 상청액의 효과를 부분적으로 억제하였다. 이 결과(도 4a 및 도 5)는 α-헤모라이신의 발현과 에스. 아우레우스 유발성 아폽토시스 사이의 양의 상관관계를 나타낸다.

실시예 17 - AP4-24H11은 마우스에서 에스. 아우레우스 유발성 피부 손상을 차단함

그 후, 쥐과 동물 피하 감염 모델을 이용하여 생체내에서 mAb AP4-24H11이 에스. 아우레우스 유발성 손상을 완화시키는 능력을 조사하였다. 새로 배양한 대수기 에스. 아우레우스 RN4850을 Cytodex 비드 및 표시된 경우, AP4-24H11 또는 대조군 IgG를 함유하는 PBS에 현탁시켰다. SKH1 무모 마우스의 옆구리에 박테리아 현탁액 또는 비이클 대조군을 피하 주사한 후 7일 동안 면밀히 모니터링하였다. 투여량은 10⁷개 또는 10⁸개 박테리아(콜로니 형성 유닛; cfu) 및 0.6 또는 0.06 mg AP4-24H11 또는 대조군 IgG였다. 10⁷ cfu를 투여받은 마우스는 최소한의 충혈/부종을 나타낸 후 7일 동안 한정된 경결을 나타내었다(도 6 참조). 그러나, 주사 후 6 시간이 지나자, 식염수 중에 현탁된 10⁸ cfu 또는 대조군 IgG를 투여받은 마우스는 주사 부위에 조기 출혈/발적을 보였고 옆구리를 따라 사선 패턴으로 수평으로 3∼5 mm, 수직으로 5∼10 mm 연장되었다(도 7a). 18 시간째 재조사하였을 때, 주사 부위 주변의 같은 영역이 약화되었고, 피부는 부스러지는 적갈색의 딱지로 변했다. 7일의 관찰 기간 동안, 딱딱해진 딱지는 주변의 비교적 정상으로 보이는 피부로부터 탈락되기 시작하였고, 정상/괴저성 접합부에서 소량의 화농성 삼출물이 관찰되었다. 이와는 달리, 0.6 mg의 AP4-24H11과 함께 10⁸개 박테리아를 투여받은 마우스에서는 피부 손상이 사라졌다(도 7c). 예상했던 바와 같이, 소량의 AP4-24H11(0.06 mg)은 보호 효과가 없었고(도 7b), 0.6 mg의 대조군 IgG와 함께 10⁸ cfu를 투여받은 마우스는 보호되지 않았다(도 6 참조). PBS/Cytodex 단독 또는 0.6 mg의 AP4-24H11을 함유하는 주사액을 투여받은 마우스는, 이따금 국소 경결을 보인 것을 제외하고는, 관찰 기간 동안 정상으로 유지되었다(도 7d). 에스. 아우레우스 RN4850과 함께 보호 용량의 0.6 mg의 AP4-24H11을 투여받은 동물은 7일의 관찰 기간 동안 어떠한 유의적인 병변도 발생시키지 않았다.

실시예 18 - AP4-24H11을 사용한 수동 면역화는 에스. 아우레우스 유발성 치사로부터 마우스를 보호함

에스. 아우레우스에 의한 치사적 항원공격에 대한 AP4-24H11을 이용한 수동 면역화 요법의 유효성을 평가하기 위해, SKH1 무모 마우스에게 AP4-24H11, 대조군 IgG 또는 비이클(DPBS) 1 ml를 복강 주사하고, 2 시간 후 3×10⁸개 에스. 아우레우스 RN4850을 함유하는 0.5 mL DPBS^-를 투여하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, AP4-24H11을 투여받은 마우스 전부(6/6)가 8일 간의 관찰 기간 동안 살아남았다. 이와는 달리, 24 시간을 넘어서자 DPBS로 처리한 대조군 마우스(1/6) 중 단 1 마리만 생존하였고 대조군 IgG로 처리한 마우스(0/6)는 모두 생존하지 못하였다. 이러한 데이터는, 급성 에스. 아우레우스 감염을 퇴치하기 위한 본 발명의 면역약물 요법의 유효성을 추가로 입증하였다.

실시예 19 - AP-1, AP-3 및 AP-4에 대한 단일클론 항체의 경쟁 ELISA 분석

AP-1, AP-3 및 AP-4 합텐 및 이들 합텐에 특이적인 단일클론 항체를 상기 실시예 4 및 12에 기재된 바와 같이 제조하였다.

경쟁 ELISA 분석의 경우, AP1-BSA, AP3-BSA 또는 AP4-BSA 접합체뿐만 아니라 각각의 mAb의 최적 농도를 결정하였다. 96웰 ELISA 플레이트를 각각 적정량의 AP1-BSA 접합체, AP3-BSA 접합체 또는 AP4-BSA 접합체로 코팅하였다. 이 플레이트를 4 v% 탈지유로 차단하고, 세척하고, 소정의 최적 농도로 mAb를 첨가하였다. 이 플레이트를 세척하고, 유리 항원, 즉, 천연 AIP 1∼4를 100 μM에서 시작하여 일련의 농도로 웰에 첨가하였다. 이 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하고, 철저히 세척하고, 염소 항마우스-호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 접합체(미국 일리노이주 록포드 소재의 Pierce 제품)를 첨가하였다. RT에서 1 시간 동안의 항온처리 기간 후, 플레이트를 다시 철저히 세척하고, HRP 기질(TMB 기질 키트; Pierce)을 첨가하고, 반응이 15분 동안 진행되게 한 후 2 M H₂SO₄를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 판독하고, GraFit(Erithacus Software Ltd)를 이용하여 값을 플로팅하였다. 흡광도 값이 최고 흡광도의 50%가 되는 유리 항원 농도를 그 항원에 대한 항체의 K_d로 간주하였다.

친화력 및 교차반응성 데이터를 하기 표에 기재하였다. 이러한 데이터는, 본원에 개시된 합텐 디자인 계획을 이용할 때, 합텐으로서의 천연 티오락톤 펩티드의 락톤 유사체에 대해 단일클론 항체(mAb)가 얻어졌음을 입증한다. mAb의 친화력은 저나노몰 내지 고나노몰 범위이며, 전부는 아니나 일부 mAb는 교차반응성을 나타내었고, 즉, 이 항체들은 그 본래의 합텐의 디자인의 기초가 되는 천연 AIP뿐만 아니라 다른 자연 발생 AIP 중 1종 또는 2종을 인식한다.

경쟁하는 모든 하이브리도마를 재테스트하여 그 평균을 기재하였다. AP4-29E10을 5개의 상이한 시점에 테스트하였으며, 변동성은 2 nM∼110 nM의 범위이나, 거의 약 24 nM 부근이었다.

선택된 단일클론 항체에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 결정하여 그 서열을 하기 표에 기재하였다.

실시예 20 - 다른 항AIP 항체의 평가

새로이 얻은 항AIP 항체, 예를 들어 항AP1 및 항AP3 항체 중 일부의 쿼럼 켄칭 능력을 평가하였다. 그룹 I 균주(RN6390B 및 Wood46)의경우, 경쟁 ELISA 분석에서 AIP-1에 대해 높은 친화력을 보인 2종의 단일클론 항체, 즉, AP1-2C2 및 AP1-15B4를 테스트하였다. 도 9는 항AP1 항체가 또한 독성 인자 발현에 있어서의 변화를 초래하는 그룹 I 균주의 쿼럼 센싱을 효율적으로 억제한다는 것을 보여준다. 또한, 그룹 III 균주 중 하나에 대한 항AP3 항체인 RN8465도 테스트하였다. RN8465에서의 낮은 세포외 발현으로 인해, 쿼럼 켄칭 효과를 정확히 측정하지 못하였다.

실시예 21 - 환형 펩티드에 기초한 백신의 치료 효과

환형 펩티드에 기초한 백신의 유효성을 평가하기 위해, 하기 실험을 수행하였다. 능동 백신접종 및 수동 백신접종 스케쥴은 다음과 같다:

능동 백신접종 스케쥴

초기 역가: -1일

초기 면역화: 0일 50∼200 ㎍의 단백질

1차 추가 접종 전 역가: 6일

1차 추가 접종: 7∼14일

(초기 면역화 후 1∼2주째) 50∼200 ㎍의 단백질

2차 추가 접종 전 역가: 20일

2차 추가 접종: 21∼28일

(1차 추가 접종 후 1∼2주째) 50∼200 ㎍의 단백질

항원공격 전 역가: X일(항원공격 1일 전)

항원공격: X일(2차 추가 접종 1주 후)

수동 백신접종 스케쥴

초기 역가: -1일

면역화: 0일 100∼1000 ㎍의 IgG/마우스

항원공격 전 역가: 1일

항원공격: 2일

상기 백신을 8∼12 주령, 25∼30 g의 수컷 Balb/c 래트에 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 주사에 의해 투여한다. 각 처리군에 20 마리의 동물을 포함시킨다.

상기 백신이 치사 시스템 항원공격으로부터 동물을 보호하는지를 확인하기 위해, 공지된 agr 그룹을 갖는 임의의 에스. 아우레우스 균주를 사용한다. 약 10⁸∼10⁹ C.F.U.의 박테리아를 복강내 주사로 투여한다. 체온 및 12 시간마다의 생존율을 측정한다. 10일 후의 사망 또는 생존은 연구 종료 시점을 나타낸다. 추가적인 세부사항은 상기에 기재하였다.

상기 백신이 패혈증으로부터 동물을 보호하는지를 확인하기 위해, 공지된 agr 그룹을 갖는 임의의 에스. 아우레우스 균주를 사용한다. 약 10⁷∼10⁸ C.F.U.의 박테리아를 정맥내 주사에 의해 투여한다. 이로써, 에스. 아우레우스는 혈류로 바로 투여되며 혈행 경로를 통해 신체에 퍼진다. 12 시간마다 체온과 생존율을 측정한다. 10일 후의 사망 또는 생존은 연구 종료 시점을 나타낸다.

상기 백신이 패혈성 관절염으로부터 동물을 보호하는지를 확인하기 위해, 에스. 아우레우스 균주 LS-1(agr 그룹 I에 속하는 마우스 적응 균주) 또는 관절염을 자발적으로 유발할 수 있는 공지된 agr 그룹을 갖는 임의의 균주를 사용한다. 약 10⁷∼10⁸ C.F.U.의 박테리아를 정맥내 주사에 의해 투여한다. 체온, 12 시간마다의 생존율, 관절 종창(점수 매김), 발적, 움직임 양상의 변화 및 이환율을 측정한다. 28일째의 사망 또는 생존은 연구 종료 시점을 나타낸다.

상기 백신이 신장 농양으로부터 동물을 보호하는지를 확인하기 위해, 임의의 공지된 agr 그룹의 에스. 아우레우스 균주를 사용한다. 약 10⁶∼10⁷ C.F.U.의 박테리아를 정맥내 주사에 의해 투여한다. 이 동물들을 활동도, 각성도 및 외피 상태에 기초하여 평가한다(정상, 약간 비정상, 매우 비정상에 대해 0∼2). 또한, 무균 상태에서 신장을 적출하여 조직학적으로 평가하고(농양 형성; 0 - 식별 가능한 농양 없음; 1 - 1 작은 농양; 2 - 몇 개의 농양; 및 3 - 심각한 신장 농양), 균질화한 신장으로부터 C.F.U. 카운트를 회수한다. 7일째의 사망 또는 생존은 연구 종료 시점을 나타낸다.

백신이 신장 농양 형성을 차단할 수 있는지를 확인하기 위해, 동일한 모델을 사용할 수 있으며, 이 경우, 일반적 행동 및 신장의 조직학적 평가에 기초한 신장 농양을 고려한다.

백신이 에스. 아우레우스 균주가 신체 전반에 퍼지는 것과 카테터에 집락화하는 것으로부터 동물을 보호하는지를 확인하기 위해, 이물(foreign body) 모델을 사용한다. 1개의 카테터를 마우스의 피하 공간에 이식한다. 24 시간 후, 임의의 공지된 agr 그룹의 에스. 아우레우스 균주 현탁액을 카테터 베드에 약 10⁶∼10⁸C.F.U.로 피하 주사에 의해 투여한다. 박테리아가 신체에 퍼져서 카테터에 집락화하는 능력을, 체온, 12 시간 마다의 생존율, 피하 농양 형성 및 다양한 시점에 카테터로부터 회수한 C.F.U. 카운트를 측정함으로써 평가한다. 7일째의 사망 또는 생존은 연구 종료 시점을 나타낸다. 대안으로, 집락화된 카테터를 이 모델에 사용할 수 있다.

백신이 유방염으로부터 동물을 보호하는지를 확인하기 위해, 젖이 분비되는 CD1 마우스에게 임의의 공지된 agr 그룹 유래의 약 10²∼10⁴C.F.U.의 에스. 아우레우스 균주를 유방내 주사에 의해 투여한다. 유선으로부터의 C.F.U. 카운트는 다양한 시점에 측정하고 유선당 C.F.U. 또는 유방 조직 그램당 C.F.U.로 표현한다. 유선 중에 존재하는 젖의 양과 생존율도 평가하며, 5일째의 사망 또는 생존은 연구 종료 시점을 나타낸다. 이것은 유선의 염증을 유도하는 미생물의 유방내 감염에 의해 유발되는 소 유방염의 확립된 모델이다. 에스. 아우레우스는 임상 유방염을 일으키나, 더 흔하게는 종래의 항균 요법에 의해 박멸하기 어렵고 만성적이 되는 경향이 있는 준임상 감염을 유발한다.

실시예 22 - AP4-KLH를 사용한 능동 백신접종은 치사적인 전신 에스. 아우레우스 항원공격으로부터 마우스를 보호함

면역보조제로서 비메틸화 사이토신-구아노신 디뉴클레오티드 모티프 함유 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG-ODN)를 함유하는 박테리아 DNA와 함께 면역접합체 100 ㎍을 마우스에 복강 주사하여 면역화한다[Chuang et al., J Leukoc Biol 71: 538-44 (2002)]. 초기 백신접종 후 7일 및 21일째 동물들에게 추가 면역화를 실시하였다. 감염 실험 전 모든 동물로부터 항AIP 4 항체 역가 분석을 위해 혈청 시료를 채취하였다.

3×10⁸개 에스. 아우레우스 RN4850[Park et al., Chem Biol 14: 1119-1127 (2007)]를 함유하는 0.5 mL의 PBS를 복강내 주사로 투여받은 SKH1 무모 마우스에 있어서의 백신접종의 보호 효과를 예시하는 결과를 하기 표에 요약하였다.

상기에 기재된 바와 같이, AP4-KLH 접합체를 투여받은 마우스 6 마리 중 4 마리가 8일의 관찰 기간을 지나 생존하였다. 이와는 달리, KLH 백신접종 대조군 마우스(1/6)는 단 1 마리, PBS 모방 면역화 마우스(2/6)는 2 마리만 관찰 기간을 지나 생존하였다.

항체 역가의 분석은, 접합체 및 면역화 프로토콜이 1:1,000 범위의 역가, 즉, 표준 ELISA 방법을 이용하여 테스트할 때 최고 신호 강도의 50%가 여전히 관찰되는 희석률로 면역 반응을 유발한다는 것을 밝혔다. 이 분석은 또한 면역화가 AIP1 및 AIP3에 대한 교차 반응성을 나타내면서 AIP4 특이적 면역 반응을 유발하였다는 것을 보여주었다(항AIP4 역가: 최대 1:6,400; 항AIP1 역가: 최대 1:6,400; 항AIP3 역가: 최대 1:3,200).

실시예 23 - 항AIP1 항체의 평가

그룹 I 에스. 아우레우스 균주 RN6390B에 대해 모든 항AIP1 mAb를 테스트하였다. 도 10b의 결과는 다수의 항AP1 항체가 그룹 I 에스. 아우레우스의 쿼럼 센싱을 효율적으로 억제하여 헤모라이신 발현에 있어서의 변화를 유도하였음을 보여준다. mAb AP1-15B4(#4)는 면역화 실험에서 매우 강력한 활성을 나타내었다.

에스. 아우레우스에서 agr QS 신호전달 억제에 반응하여 생물막 형성의 증가가 있다고 알려졌기 때문에, mAb AP1-15B4 존재 하에 에스. 아우레우스 균주 RN6390B에 의한 생물막 형성도 평가하였다. 도 10b의 결과는 mAb AP1-15B4 존재 하에서의 에스. 아우레우스 균주 RN6390B에 의한 생물막 형성 증가를 보여준다.

실시예 24 - 파지 디스플레이 기법을 이용한 인간 scFv 항체의 선별

인간 항AIP-1, AIP-3 및 항AIP-4 scFv 항체를 확인하기 위해, AP1-BSA, AP3-BSA 및 AP4-BSA 접합체를 사용하여, 문헌[Gao et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 99:12612-6 (2002)]에 기재된 방법을 이용하여 생성한 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하였다. 먼저, BSA 특이적 클론과 비특이적 결합 물질을 제거하기 위해, BSA에 대해 항체 디스플레이 파지 입자를 공제하였다. 패닝 4 회차 후, 선택된 클론을 DNA 시퀀싱과 BSA 및 AP1-BSA, AP3-BSA 및 AP4-BSA에 대한 ELISA로 분석하였다. scFv 항체의 아미노산 서열, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 코딩하는 DNA 서열 및 scFv 항체를 코딩하는 DNA 서열을 하기 표에 기재하였다.

실시예 25 - 항AIP4 인간 scFv인 AP4-4-20에 의한 RN4850에서의 헤모라이신 발현의 억제

항체-파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하여 얻은 20개의 클론 중에서 가장 강력한 클론 AP4-4-20을 이. 콜라이에서 scFv 항체로서 발현시켰다. 발현된 scFv 항체를 정제하고, 에스. 아우레우스 RN 4850에서의 헤모라이신 발현을 억제하는 그 능력에 대해 다음과 같이 평가하였다.

에스. 아우레우스 RN4850을 CYGP 배지에서 scFv AP4-4-20(2.7 μM) 존재 하에 24 시간 동안 항온처리하고, 에스. 아우레우스 배양물 상청액을 사용한 웨스턴 분석에 의해 α-헤모라이신 발현을 평가하였다. 결과를 도 11에 도시하였다. mAb AP4-24H-11(1.3 μM) 및 관련없는 scFv 항체 대조군(10 μM)을 각각 양성 대조군과 음성 대조군으로서 사용하였다. AIP-4 특이적 항체 4-20 및 AP4-24H11 존재 하에, 헤모라이신 분비의 분명한 감소를 검출할 수 있었으며, 이는 에스. 아우레우스에서의 AIP 의존적 QS 억제를 강하게 보여준다.

실시예 26 - 항AIP1 mAb AP1-15B4는 노출 후 요법에서 치사적 전신 MRSA USA300 항원공격으로부터 마우스를 보호함

본 발명의 수동 면역화 방법의 유효성을, 치사적 에스. 아우레우스 항원공격 마우스 모델에서 mAb AP1-15B4를 사용한 노출 후 시나리오로 입증하였다. agr I MRSA 균주인 1×10⁸개 이상의 에스. 아우레우스 USA300으로 감염시킨 지 2 시간 후 C57BL/6 마우스에 1 mg의 AP1-15B4(i.p.), 이소타입 대조군 IgG 또는 PBS를 투여하였다. 문헌[Diep et al., Lancet 2006, 367, (9512), 731-739] 참조. USA300은 실제로 가장 흔한 지역사회 획득성 감염 MRSA(CA-MRSA) 균주 중 하나로서 민간인과 군인에게 그 위협이 증가하고 있다. 문헌[Hageman et al., Diagn Microbiol Infect Dis 2008]; 문헌[James et al., Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 2008, 93, (1), F40-4]; 문헌[Tenover et al., J Clin Microbiol 2006, 44, (1), 108-18]; 문헌[Beilman et al., Surg Infect (Larchmt) 2005, 6, (1), 87-92] 참조. 도 12에 도시된 바와 같이, AP1-15B4를 투여받은 6 마리 마우스 중 4 마리는 48 시간의 관찰 기간을 거쳐 생존하였다. 이와는 달리, PBS 처리 대조군 마우스(2/6) 중 단 2 마리 및 대조군 IgG 처리 마우스(2/6) 중 2 마리만 24 시간보다 길게 생존하였다. 이러한 데이터는 에스. 아우레우스에서의 쿼럼 켄칭 방법을 위한 치료 윈도우가 실재한다는 것을 최초로 입증한다. 본 발명의 쿼럼 켄칭 항체가 환자 감염 후에 투여될 수 있음을 입증하였기 때문에, 이것은 또한 에스. 아우레우스 감염을 예방하기 위한 본 발명의 면역약물 치료 요법의 유효성을 확인시켜 준다.

본원에 인용되거나 언급된 모든 특허문헌 및 간행물은 본 발명이 속하는 분야의 당업자의 기술 수준을 나타내며, 이같은 인용된 특허문헌 또는 간행물 각각은 이것이 그 전체가 개별적으로 참고 문헌으로서 포함되거나 그 전체가 본원에 개시된 것과 같은 정도로 본원에 참조 인용된다. 출원인은 이러한 인용된 임의의 특허문헌 또는 간행물로부터 임의의 모든 소재 및 정보를 본 명세서에 실제적으로 포함시킬 권리를 확보한다.

본원에 기재된 특정 방법 및 조성물은 바람직한 실시형태를 대표하는 것이고 예시를 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다. 다른 대상물, 양태 및 실시형태도 본 명세서를 고려할 때 당업자에게 자명할 것이며, 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 사상에 포함된다. 당업자라면 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어남이 없이 본원에 개시된 본 발명에 다양한 치환 및 변경이 가해질 수 있음을 쉽게 알 것이다. 본원에 예시적으로 기술된 본 발명은 본원에서 필수적 요소인 것으로 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 한정 또는 한정들 없이도 적절히 실시될 수 있다. 본원에 예시적으로 기술된 방법 및 공정은 단계 순서를 달리하여 적절히 실시될 수 있으며, 이는 본원 또는 특허청구범위에 나타낸 단계의 순서에 반드시 한정되는 것은 아니다. 본원과 첨부된 특허청구범위에서 사용될 때, 단수의 표현은 명백히 다른 것을 나타내지 않는다면 복수의 대상물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "항체"라고 언급한 것은 이러한 항체 복수개(예를 들어, 항체의 용액 또는 일련의 항체 제제)를 포함하며, 그 밖의 것도 마찬가지이다. 어떠한 상황 하에서도 특허가 특정 실시예 또는 실시형태 또는 본원에 구체적으로 개시된 방법에 한정되는 것으로 해석될 수 없다. 어떠한 상황 하에서도, 특허상표청의 임의의 심사관 또는 어떤 다른 공무원 또는 고용인이 한 진술은, 그 진술이 구체적이지 않고, 출원인이 응답 서면을 통해 자격 부여 또는 지정을 명시적으로 하지 않았다면, 특허가 그러한 임의의 진술에 한정되는 것으로 해석될 수는 없다.

사용된 용어와 표현은 설명을 위해 사용된 것으로 한정을 의도한 것이 아니며, 이러한 용어 및 표현을 사용하는 것에 제시되고 기술된 특징의 임의의 균등예 또는 그 일부를 배제할 의도를 갖는 것은 아니나, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 수정이 가해질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시형태 및 선택적인 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 당업자가 본원에 개시된 개념의 수정 및 변경을 재분류할 수 있음이 이해될 것이며, 이러한 변경 및 수정은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되어야 한다.

본원에서는 본 발명을 광범위하고 개괄적으로 기술하였다. 일반적 개시사항에 속하는 더 좁은 종 및 아속 그룹핑 각각이 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이것은 본 발명의 일반적 설명을 포함하며, 이때 단서 또는 배제 한정은 속으로부터 임의의 주제를 배제하고, 배제된 소재는 본원에 구체적으로 인용되기도 하고 인용되지 않기도 하였다.

다른 실시형태도 하기 특허청구범위 내에 있다. 또한, 본 발명의 특징 또는 양태가 마쿠쉬 그룹에 의해 기재될 경우, 당업자라면 이것에 의해 본 발명이 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 서브그룹도 기재한 것임을 이해할 것이다.

Claims

거대분자 담체에, 경우에 따라 링커 부분을 통해 공유 결합된 하나 이상의 합텐을 포함하는 면역원성 분자 물질로서, 상기 합텐은 환형 펩티드 또는 그 유사체를 포함하며, 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체는 거대환 고리를 포함하고, 약 4개∼약 19개의 아미노산 잔기를 포함하며, 하기 화학식 I로 표시되는 구조를 갖는 것인 면역원성 분자 물질:

상기 식에서,
각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이고;
X¹은 각각의 카보닐기에 의해 R에 공유 결합되는 아미노산 잔기이며;
X^a+2는 내부 아미노산으로서, 그 각각의 탄소 원자는 R에 공유 결합되고;
R은 X¹과 X^a+2를 공유 결합시켜 거대환 고리를 형성하는 거대환 형성 부분이며, 여기서 R은 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 카바미드, 세미카바자이드 또는 다른 아미드 대용 기, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고;
a는 1∼약 9이고;
b는 1∼약 8이며;
파상선이 횡단하는 결합은, 경우에 따라 링커 부분을 통해, 상기 거대분자 담체에 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체의 N-말단 아미노산 잔기가 부착하는 지점을 나타낸다.
제1항에 있어서,
a 가 2∼8이고,
R이 X¹ 카보닐기에 X^a+2를 공유 결합시키는 알킬옥시 또는 알카릴옥시, 알킬티오, 또는 알킬아미노 기를 포함하며, 이로써 각각 에스테르, 티오에스테르 또는 아미드 결합을 제공하여 각각 락톤, 티오락톤 또는 락탐 거대환 고리를 형성하는 것인 면역원성 분자 물질.
제1항 또는 제2항에 있어서, R이 -CH₂O-, -CH₂CH₂O-, -CH₂CH(CH₃)O-, -CH₂-페닐-O-, -CH₂S-, -CH₂CH₂S- 또는 -(CH₂)_nNH-(여기서, n은 1∼약 4임)를 포함하는 것인 면역원성 분자 물질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, a가 2∼4인 면역원성 분자 물질.
제1항에 있어서, a가 2∼8이고, R이 하나 이상의 아미드, 우레아 또는 세미카바자이드 기, 또는 하나 이상의 아미드 대용 결합을 포함하는 것인 면역원성 분자 물질.
제1항 또는 제5항에 있어서, R이 하기 화학식 (IIa) 또는 화학식 (IIb)로 표시되는 것인 면역원성 분자 물질:

상기 식에서, n은 1∼약 4이고, R¹은 천연 아미노산 또는 그 유사체의 측쇄이며, 파상선이 횡단하는 결합은 부착 지점을 나타내고, 여기서 (i)로 표시되는 부착 지점은 X¹의 카보닐기에 결합하고, (ii)로 표시되는 부착 지점은 X^a+2의 알파-탄소에 결합한다.
제6항에 있어서, 화학식 (IIa)가

인 면역원성 분자 물질.
제6항에 있어서, 화학식 (IIb)가

인 면역원성 분자 물질.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, a가 2∼4인 면역원성 분자 물질.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, X¹ 및 X²가 소수성 아미노산 잔기인 면역원성 분자 물질.
제10항에 있어서, X¹ 및 X²가 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판, 또는 이들의 유사체로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 면역원성 분자 물질.
제11항에 있어서, X¹ 및 X²가 각각 독립적으로 메티오닌, 루신, 페닐알라닌, 타이로신, 알라닌, 이소루신 또는 트립토판인 면역원성 분자 물질.
제1항, 제2항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환형 펩티드 또는 그 유사체가 아미노산 서열 YST(X^a+2)DFIM(서열 번호 92), YST(X^a+2)YFIM(서열 번호 93), IN(X^a+2)DFLL(서열 번호 94), GVNA(X^a+2)SSLF(서열 번호 95), GVNP(X^a+2)GGWF(서열 번호 96), KAKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 97), KTKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 98), GANP(X^a+2)OLYY(서열 번호 99), GANP(X^a+2)ALYY(서열 번호 100), GYST(X^a+2)SYYF(서열 번호 101), GYRT(X^a+2)NTYF(서열 번호 102), YNP(X^a+2)VGYF(서열 번호 103), GGKV(X^a+2)SAYF(서열 번호 104), SVKP(X^a+2)TGFA(서열 번호 105), DSV(X^a+2)ASYF(서열 번호 106), KYNP(X^a+2)SNYL(서열 번호 107), KYNP(X^a+2)ASYL(서열 번호 108), KYNP(X^a+2)ANYL(서열 번호 109), RIPT(X^a+2)TGFF(서열 번호 110), DI(X^a+2)NAYF(서열 번호 111), DM(X^a+2)NGYF(서열 번호 112), KYNP(X^a+2)LGFL(서열 번호 113), KYYP(X^a+2)FGYF(서열 번호 114), GARP(X^a+2)GGFF(서열 번호 115), GAKP(X^a+2)GGFF(서열 번호 116), YSP(X^a+2)TNFF(서열 번호 117), YSP(X^a+2)TNF(서열 번호 118) 또는 QN(X^a+2)PNIFGQWM(서열 번호 119)[여기서, 각각의 서열의 마지막 아미노산 잔기는 X¹이고, (X^a+2)는 X¹의 카보닐기가 R을 통해 공유 결합되는 내부 아미노산임]을 포함하는 것인 면역원성 분자 물질.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 거대분자 담체가 단백질, 중합체 또는 나노입자를 포함하는 것인 면역원성 분자 물질.
제14항에 있어서, 상기 중합체가 덴드리머인 면역원성 분자 물질.
제15항에 있어서, 상기 덴드리머가 MAP 덴드리머인 면역원성 분자 물질.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 거대분자 담체가 단백질을 포함하는 것인 면역원성 분자 물질.
제17항에 있어서, 상기 단백질이 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA), 토끼 혈청 알부민(RSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 콘콜레파스 콘콜레파스 헤모시아닌(Concholepas concholepas hemocyanin: CCH), 콜레라 독소 B 서브유닛, 이. 콜라이(E. coli) 불안정 독소 B 서브유닛, 디프테리아 변성독소, 파상풍 변성독소, 파상풍 독소 C 단편, 재조합 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 세포외 단백질(exoprotein) A, CRM197(교차 반응성 물질), 양이온화 소 혈청 알부민(cBSA), 타이로글로불린(Tg), 아비딘, 소 타이로글로불린(BTG), 소 G 글로불린, 소 면역글로불린 G(BIgG), 콘알부민(CONA), 콜로이드 금, 에데스틴, 파라리토데스 캄트샤티카 헤모시아닌(Paralithodes camtschatica haemocyanin: HC), 헬릭스 프로마티아 헤모시아닌(helix promatia haemocyanin: HPH), 대두 쿠니츠 트립신 억제제(soybean kunitz trypsin inhibitor: KTI), 리물러스 폴리페무스 헤모시아닌(Limulus polyphemus haemocyanin: LPH), 난알부민(OA), Pam3Cys-Th(리포펩티드/Th 세포 에피토프), 폴리라이신, 돼지 타이로글로불린(PTG), 정제 단백질 유도체(PPD), 대두 트립신 억제제(STI) 또는 해바라기 글로불린(SFG)으로 구성된 군에서 선택되는 것인 면역원성 분자 물질.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환형 펩티드 유사체가 환형 펩티드 유사체의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기를 통해, 또는 환형 펩티드 유사체의 N-말단 시스테인 또는 호모시스테인 잔기의 티올기를 통해 상기 거대분자 담체에 공유 결합되는 것인 면역원성 분자 물질.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 거대분자 담체에 상기 환형 펩티드 유사체를 공유 결합시키는 링커 부분을 더 포함하는 면역원성 분자 물질.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 환형 펩티드 유사체가 환형 펩티드 유사체의 N-말단 아미노산 잔기의 아미노기를 통해, 또는 환형 펩티드 유사체의 N-말단 시스테인 또는 호모시스테인 잔기의 티올기를 통해 상기 링커 부분에 결합되며, 상기 링커 부분이 상기 거대분자 담체에 공유 결합되는 것인 면역원성 분자 물질.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 링커 부분이 MBS, 설포-MBS, SMCC, 또는 설포-SMCC의 반응에 의해 생성된 부분을 포함하는 것인 면역원성 분자 물질.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 부분이 아디프산 디하이드라지드(ADH), 스페이서 펩티드, 하이드록시메틸 헤미숙시네이트 또는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 포함하는 것인 면역원성 분자 물질.
제1항에 있어서, 하기 구조를 갖는 것인 면역원성 분자 물질:

서열 번호 3 (YSTSDFIM, 보호기를 포함하지 않음),

서열 번호 4 (GVNASSSLY, 보호기를 포함하지 않음),

서열 번호 2 (INSDFLL, 보호기를 포함하지 않음), 또는

서열 번호 1 (YSTSYFLM, 보호기를 포함하지 않음)
(여기서, CPL은 시스테인 티올기에 공유 결합된 임의적인 링커를 갖는 거대분자 담체이다).
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역원성 분자 물질을 포함하는 초분자 조립체.
제25항에 있어서, 리포솜, 비로솜, 박테리오파지, 바이러스 입자 또는 중합체 나노입자 전달 시스템을 포함하는 것인 초분자 조립체.
아미노산 서열 YST(X^a+2)DFIM(서열 번호 92), YST(X^a+2)YFIM(서열 번호 93), IN(X^a+2)DFLL(서열 번호 94), GVNA(X^a+2)SSLF(서열 번호 95), GVNP(X^a+2)GGWF(서열 번호 96), KAKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 97), KTKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 98), GANP(X^a+2)OLYY(서열 번호 99), GANP(X^a+2)ALYY(서열 번호 100), GYST(X^a+2)SYYF(서열 번호 101), GYRT(X^a+2)NTYF(서열 번호 102), YNP(X^a+2)VGYF(서열 번호 103), GGKV(X^a+2)SAYF(서열 번호 104), SVKP(X^a+2)TGFA(서열 번호 105), DSV(X^a+2)ASYF(서열 번호 106), KYNP(X^a+2)SNYL(서열 번호 107), KYNP(X^a+2)ASYL(서열 번호 108), KYNP(X^a+2)ANYL(서열 번호 109), RIPT(X^a+2)TGFF(서열 번호 110), DI(X^a+2)NAYF(서열 번호 111), DM(X^a+2)NGYF(서열 번호 112), KYNP(X^a+2)LGFL(서열 번호 113), KYYP(X^a+2)FGYF(서열 번호 114), GARP(X^a+2)GGFF(서열 번호 115), GAKP(X^a+2)GGFF(서열 번호 116), YSP(X^a+2)TNFF(서열 번호 117), YSP(X^a+2)TNF(서열 번호 118) 또는 QN(X^a+2)PNIFGQWM(서열 번호 119)[여기서, 각각의 서열의 마지막 아미노산 잔기는 X¹이고, (X^a+2)는 X¹의 카보닐기가 R을 통해 공유 결합되는 내부 아미노산이며, 여기서 R은 X¹의 카보닐기에 공유 결합된 X^a+2의 측쇄 부분이고, R은 -CH₂O-, -CH₂CH₂O-, -CH₂CH(CH₃)O-, -CH₂-페닐-O-, -CH₂S-, -CH₂CH₂S- 또는 -(CH₂)_nNH-(여기서, n은 1∼약 4임)을 포함함]을 가지는 환형 펩티드와 특이적으로 결합하는 항체.
그램 양성 박테리아의 환형 펩티드 신호전달 분자와 특이적으로 결합하는 항체.
제28항에 있어서, 상기 환형 펩티드 신호전달 분자가 서열 YSTCDFIM(서열 번호 120); GVNACSSLF(서열 번호 121); INCDFLL(서열 번호 122); YSTCYFIM(서열 번호 123); GVNPCGGWF(서열 번호 124); KAKTCTVLY(서열 번호 125); KTKTCTVLY(서열 번호 126); GANPCOLYY(서열 번호 127); GANPCALYY(서열 번호 128); GYSTCSYYF(서열 번호 129); GYRTCNTYF(서열 번호 130); YNPCVGYF(서열 번호 131); GGKVCSAYF(서열 번호 132); SVKPCTGFA(서열 번호 133); DSVCASYF(서열 번호 134); KYNPCSNYL(서열 번호 135); KYNPCASYL(서열 번호 136); KYNPCANYL(서열 번호 137); RIPTSTGFF(서열 번호 138); DICNAYF(서열 번호 139); DMCNGYF(서열 번호 140); KYNPCLGFL(서열 번호 141); KYYPCFGYF(서열 번호 142); VGARPCGGFF(서열 번호 143); GAKPCGGFF(서열 번호 144); YSPCTNFF(서열 번호 145); 또는 QNSPNIFGQWM(서열 번호 146)[여기서, 밑줄 친 잔기의 알파-카보닐기는 각각 진하게 표시된 내부 시스테인 또는 세린 잔기의 설프하이드릴 또는 하이드록실 기와 티오락톤 또는 락톤 결합을 형성함]을 가지는 것인 항체.
제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 중화 항체인 항체.
제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 교차 중화 항체인 항체.
제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체인 항체.
제32항에 있어서, 서열 번호 19∼26 중 하나의 아미노산 서열 및 서열 번호 147∼154 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
제33항에 있어서, AP4-24H11 또는 AP1-15B4인 항체.
제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, scFv, Fab 또는 F(ab')₂ 단편인 항체.
제35항에 있어서, 서열 번호 35∼53 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 쥐과 동물 항체, 소 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 항체.
제27항 내지 제37항 중 어느 한 항의 항체 1종 이상 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
제38항에 있어서, 서열 YSTCDFIM(서열 번호 120), GVNACSSLF(서열 번호 121), INCDFLL(서열 번호 122) 및 YSTCYFIM(서열 번호 123)[여기서, 밑줄 친 잔기의 알파-카보닐기는 진하게 표시된 내부 시스테인 잔기의 설프하이드릴기와 티오락톤 결합을 형성함]을 가지는 2∼4종의 환형 펩티드 신호전달 분자와 특이적으로 결합하는 2∼4종의 항체를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역원성 분자 물질 1종 이상 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
제40항에 있어서, 상기 면역원성 분자 물질이 서열 YST(X^a+2)DFIM(서열 번호 92), YST(X^a+2)YFIM(서열 번호 93), IN(X^a+2)DFLL(서열 번호 94), GVNA(X^a+2)SSLF(서열 번호 95), GVNP(X^a+2)GGWF(서열 번호 96), KAKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 97), KTKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 98), GANP(X^a+2)OLYY(서열 번호 99), GANP(X^a+2)ALYY(서열 번호 100), GYST(X^a+2)SYYF(서열 번호 101), GYRT(X^a+2)NTYF(서열 번호 102), YNP(X^a+2)VGYF(서열 번호 103), GGKV(X^a+2)SAYF(서열 번호 104), SVKP(X^a+2)TGFA(서열 번호 105), DSV(X^a+2)ASYF(서열 번호 106), KYNP(X^a+2)SNYL(서열 번호 107), KYNP(X^a+2)ASYL(서열 번호 108), KYNP(X^a+2)ANYL(서열 번호 109), RIPT(X^a+2)TGFF(서열 번호 110), DI(X^a+2)NAYF(서열 번호 111), DM(X^a+2)NGYF(서열 번호 112), KYNP(X^a+2)LGFL(서열 번호 113), KYYP(X^a+2)FGYF(서열 번호 114), GARP(X^a+2)GGFF(서열 번호 115), GAKP(X^a+2)GGFF(서열 번호 116), YSP(X^a+2)TNFF(서열 번호 117), YSP(X^a+2)TNF(서열 번호 118) 또는 QN(X^a+2)PNIFGQWM(서열 번호 119)[여기서, 각각의 서열의 마지막 아미노산 잔기는 X¹이고, (X^a+2)는 X¹의 카보닐기가 R을 통해 공유 결합되는 내부 아미노산이며, 여기서 R은 -CH₂O-, -CH₂CH₂O-, -CH₂CH(CH₃)O-, -CH₂-페닐-O-, -CH₂S-, -CH₂CH₂S- 또는 -(CH₂)_nNH-(여기서, n은 1∼약 4임)을 포함함]을 가지는 환형 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
제40항에 있어서, 2∼4종의 면역원성 분자 물질을 포함하며, 이 물질의 환형 펩티드가 서열 YST(X^a+2)DFIM(서열 번호 92), YST(X^a+2)YFIM(서열 번호 93), IN(X^a+2)DFLL(서열 번호 94), GVNA(X^a+2)SSLF(서열 번호 95), GVNP(X^a+2)GGWF(서열 번호 96), KAKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 97), KTKT(X^a+2)TVLY(서열 번호 98), GANP(X^a+2)OLYY(서열 번호 99), GANP(X^a+2)ALYY(서열 번호 100), GYST(X^a+2)SYYF(서열 번호 101), GYRT(X^a+2)NTYF(서열 번호 102), YNP(X^a+2)VGYF(서열 번호 103), GGKV(X^a+2)SAYF(서열 번호 104), SVKP(X^a+2)TGFA(서열 번호 105), DSV(X^a+2)ASYF(서열 번호 106), KYNP(X^a+2)SNYL(서열 번호 107), KYNP(X^a+2)ASYL(서열 번호 108), KYNP(X^a+2)ANYL(서열 번호 109), RIPT(X^a+2)TGFF(서열 번호 110), DI(X^a+2)NAYF(서열 번호 111), DM(X^a+2)NGYF(서열 번호 112), KYNP(X^a+2)LGFL(서열 번호 113), KYYP(X^a+2)FGYF(서열 번호 114), GARP(X^a+2)GGFF(서열 번호 115), GAKP(X^a+2)GGFF(서열 번호 116), YSP(X^a+2)TNFF(서열 번호 117), YSP(X^a+2)TNF(서열 번호 118) 또는 QN(X^a+2)PNIFGQWM(서열 번호 119)[여기서, 각각의 서열의 마지막 아미노산 잔기는 X¹이고, (X^a+2)는 X¹의 카보닐기가 R을 통해 공유 결합되는 내부 아미노산이며, 여기서 R은 -CH₂O-, -CH₂CH₂O-, -CH₂CH(CH₃)O-, -CH₂-페닐-O-, -CH₂S-, -CH₂CH₂S- 또는 -(CH₂)_nNH-(여기서, n은 1∼약 4임)를 포함함]을 가지는 것인 조성물.
제40항에 있어서, 4종의 면역원성 분자 물질을 포함하고, 이 물질의 환형 펩티드가 서열 YSTCDFIM(서열 번호 120), GVNACSSLF(서열 번호 121), INCDFLL(서열 번호 122) 및 YSTCYFIM(서열 번호 123)[여기서, 밑줄 친 잔기의 알파-카보닐기는 진하게 표시된 내부 시스테인 잔기의 설프하이드릴기와 티오락톤 결합을 형성함]을 가지는 것인 조성물.
제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 추가적인 면역원을 더 포함하는 조성물.
제44항에 있어서, 상기 1종 이상의 추가적인 면역원이 B형 간염, 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) b형 박테리아, 디프테리아, 홍역, 볼거리, 백일해, 소아마비, 풍진, 파상풍, 결핵, 수두, 또는 이들의 임의의 조합에 대한 면역 반응을 유발하는 것인 조성물.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역원성 분자 물질, 제25항 또는 제26항의 초분자 조립체, 제27항 내지 제37항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항의 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 제조 물품.
포유동물에서 면역 반응을 유발하는 데 유효한 양으로 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역원성 분자 물질, 또는 제25항 또는 제26항의 초분자 조립체를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제47항에 있어서, 상기 포유동물이 염소, 토끼, 양, 돼지, 마우스, 래트, 기니 피그, 햄스터, 소, 말, 원숭이 또는 인간인 방법.
제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 조성물을 정맥내, 복강내, 피하, 피내 또는 근육내 주사에 의해 상기 포유동물에게 투여하는 것인 방법.
제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물로부터 생체 시료를 얻는 단계를 더 포함하며, 상기 생체 시료는 상기 면역원성 분자 물질의 환형 펩티드 및/또는 환형 펩티드 신호전달 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인 방법.
제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물로부터 항체 생산 세포를 단리하는 단계 및 상기 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합하여 상기 면역원성 분자 물질의 환형 펩티드 및/또는 환형 펩티드 신호전달 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제47항에 있어서, 상기 포유동물이 그램 양성 박테리아에 의한 감염에 감수성이 있는 것인 방법.
제47항에 있어서, 상기 포유동물이 그램 양성 박테리아와 관련된 질병 상태에 감수성이 있는 것인 방법.
제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 그램 양성 박테리아가 스타필로코커스(Staphylococcus)인 방법.
제54항에 있어서, 스타필로코커스가 에스. 아우레우스(S. aureus) 또는 에스. 에피더미디스(S. epidermidis)인 방법.
제47항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
제47항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 투여 후 하나 이상의 특정 시간 간격으로 하나 이상의 추가 용량의 상기 조성물을 상기 포유동물에게 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
포유동물에서 쿼럼 센싱(quorum sensing)을 억제하는 데 유효한 양으로 제27항 내지 제37항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 쿼럼 센싱을 억제하는 방법.
포유동물에서 면역 반응을 유발하고 쿼럼 센싱을 억제하는 데 유효한 양으로 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역원성 분자 물질, 또는 제25항 또는 제26항의 초분자 조립체를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 쿼럼 센싱을 억제하는 방법.
그램 양성 박테리아에 의한 포유동물의 감염을 예방 또는 치료하는 데 유효한 양으로 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역원성 분자 물질, 제25항 또는 제26항의 초분자 조립체, 또는 제27항 내지 제37항 중 어느 한 항의 항체를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 그램 양성 박테리아에 의한 포유동물의 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 면역원성 분자 물질, 초분자 조립체 또는 항체를 정맥내, 복강내, 피하, 피내 또는 근육내 주사에 의해 상기 포유동물에게 투여하는 것인 방법.
제47항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 그램 양성 박테리아에 감염된 것인 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역원성 분자 물질을 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리와 접촉시키는 단계 및 상기 면역원성 분자 물질과 특이적으로 결합하는 재조합 면역글로불린을 환형 펩티드 신호전달 분자와 특이적으로 결합하는 항체로서 확인하는 단계를 포함하는, 환형 펩티드 신호전달 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 확인하는 방법.
제27항 또는 제28항의 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산.
제65항에 있어서, 그 서열이 서열 번호 54∼91, 27∼34 및 155∼181 중 어느 하나인 단리된 핵산.
제65항 또는 제66항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
제67항에 있어서, 상기 항체를 코딩하는 핵산이 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 것인 발현 벡터.
제68항에 있어서, 상기 발현 조절 서열이 프로모터인 발현 벡터.
제69항에 있어서, 상기 프로모터가 파지, 바이러스, 박테리아 또는 포유동물 프로모터인 발현 벡터.
제65항 또는 제66항의 핵산, 또는 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 포함하는 세포.
제71항에 있어서, 박테리아 또는 포유동물 세포인 세포.