JP6517156B2 - 抗トランスサイレチンヒト抗体 - Google Patents
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Description
(1)変異型TTRの産生レベルを抑制する
(2)変異型TTRを含むTTR四量体構造を安定化させる
(3)四量体から解離したTTRのアミロイド化を阻止する
(4)組織に沈着したTTRアミロイドを除去する
すなわち、本発明は、
(1)トランスサイレチン(以下、TTRと称する)の線維化を阻害する活性を持つヒト抗体;
(2)構造変化を起こしたTTRを特異的に認識する、(1)に記載のヒト抗体;
(3)TTRアミロイドと特異的に結合する、(1)又は(2)に記載のヒト抗体;
(4)2種類以上の変異TTRに由来するTTRアミロイドと結合する、(1)から(3)のいずれか一項に記載のヒト抗体;
(5)変異TTRが、D18G、V30M、E54K、L55P、Y114C、Y116SおよびV122Iからなる群から選択される変異を有するTTRである、(4)に記載のヒト抗体;
(6)TTRアミロイドの除去を促進する、(1)から(5)のいずれか一項に記載のヒト抗体;
(7)TTRアミロイドに対するマクロファージ貪食能を促進する、(1)から(6)のいずれか一項に記載のヒト抗体;
(8)エピトープがTTRの79位から89位を含む配列である、(1)から(7)のいずれか一項に記載のヒト抗体;
(9)エピトープがTTRの79位から89位である、(8)に記載のヒト抗体;
(10)TTRアミロイドーシスに対する治療効果及び/又は予防効果を有する、(1)から(9)のいずれか一項に記載のヒト抗体;
(11)TTRアミロイドーシスが家族性アミロイドポリニューロパチー(以下、FAPと称する)である、(10)に記載のヒト抗体;
(12)TTRアミロイドーシスが老人性全身性アミロイドーシス(以下、SSAと称する)である、(10)に記載のヒト抗体;
(13)ファージディスプレイ法により得られた抗体である、(1)から(12)のいずれか一項に記載の抗体;
(14)以下の(a)又は(b)のポリペプチドからなるH鎖の相補性決定領域と、(c)又は(d)のポリペプチドからなるL鎖の相補性決定領域とを含む、(1)から(13)のいずれか一項に記載のヒト抗体
(a)配列番号1〜3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号1〜3に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
(c)配列番号4〜6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(d)配列番号4〜6に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖の相補性決定領域となるポリペプチド;
(15)以下の(e)又は(f)のポリペプチドからなるH鎖の相補性決定領域と、(g)又は(h)のポリペプチドからなるL鎖の相補性決定領域とを含む、(1)から(13)のいずれか一項に記載のヒト抗体
(e)配列番号7〜9に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(f)配列番7〜9に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
(g)配列番号10〜12に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(h)配列番号10〜12に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖の相補性決定領域となるポリペプチド;
(16)以下の(i)または(j)のポリペプチドからなるH鎖可変領域と、(k)または(l)のポリペプチドからなるL鎖可変領域とを含む、(1)から(13)のいずれか一項に記載のヒト抗体
(i)配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(j)配列番号13に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖可変領域となるポリペプチド。
(k)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(l)配列番号14に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖可変領域となるポリペプチド;
(17)以下の(m)または(n)のポリペプチドからなるH鎖可変領域と、(o)または(p)のポリペプチドからなるL鎖可変領域とを含む、(1)から(13)のいずれか一項に記載のヒト抗体
(m)配列番号15に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(n)配列番号15に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖可変領域となるポリペプチド。
(o)配列番号16に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(p)配列番号16に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖可変領域となるポリペプチド;
(18)以下の(a)又は(b)のポリペプチドからなるH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片
(a)配列番号1〜3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号1〜3に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖の相補性決定領域となるポリペプチド;
(19)以下の(c)又は(d)のポリペプチドからなるL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片
(c)配列番号4〜6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(d)配列番号4〜6に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖の相補性決定領域となるポリペプチド;
(20)以下の(i)又は(j)のポリペプチドからなる、H鎖可変領域断片
(i)配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(j)配列番号13に示されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖可変領域となるポリペプチド;
(21)以下の(k)又は(l)のポリペプチドからなる、L鎖可変領域断片
(k)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(l)配列番号14に示されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖可変領域となるポリペプチド;
(22)以下の(e)又は(f)のポリペプチドからなるH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片
(e)配列番号7〜9に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(f)配列番号7〜9に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖の相補性決定領域となるポリペプチド;
(23)以下の(g)又は(h)のポリペプチドからなるL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片
(g)配列番号10〜12に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(h)配列番号10〜12に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖の相補性決定領域となるポリペプチド;
(24)以下の(m)又は(n)のポリペプチドからなる、H鎖可変領域断片
(m)配列番号15に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(n)配列番号15に示されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖可変領域となるポリペプチド;
(25)以下の(o)又は(p)のポリペプチドからなる、L鎖可変領域断片
(o)配列番号16に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(p)配列番号16に示されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖可変領域となるポリペプチド;
(26)(18)に記載のH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片または(20)に記載のH鎖可変領域断片と、(19)に記載のL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片または(21)に記載のL鎖可変領域断片とを連結してなる、TTRに対する抗体の1本鎖可変領域断片;
(27)(18)に記載のH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片または(20)に記載のH鎖可変領域断片、及び/又は、(19)に記載のL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片または(21)に記載のL鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、(1)から(13)に記載のヒト抗体又はその断片;
(28)(22)に記載のH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片または(24)に記載のH鎖可変領域断片と、(23)に記載のL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片または(25)に記載のL鎖可変領域断片とを連結してなる、TTRに対する抗体の1本鎖可変領域断片;
(29)(22)に記載のH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片または(24)に記載のH鎖可変領域断片、及び/又は、(23)に記載のL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片または(25)に記載のL鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、(1)から(13)のいずれか一項に記載のヒト抗体又はその断片;
(30)(1)から(29)のいずれか一項に記載の抗体又はその断片をコードする遺伝子;
(31)(30)に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター;
(32)(30)に記載の遺伝子、又は(31)に記載の発現ベクターが導入された形質転換体;
(33)(1)から(29)のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、TTRアミロイドを検出する器具;
(34)(1)から(29)のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、TTRアミロイドを検出する試薬;
(35)(1)から(29)のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、TTRアミロイドを除去するする担体;
(36)(1)から(29)のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、TTRアミロイドーシス診断薬;
(37)TTRアミロイドーシスがFAPである、(36)に記載の診断薬;
(38)TTRアミロイドーシスがSSAである、(36)に記載の診断薬;
(39)(1)から(29)のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、TTRの線維化阻害剤;
(40)(1)から(29)のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、TTRアミロイドーシスを予防及び/又は治療するための医薬組成物;
(41)TTRアミロイドーシスがFAPである、(40)に記載の医薬組成物;
(42)TTRアミロイドーシスがSSAである、(40)に記載の医薬組成物;
(43)デオキシコール酸Naの存在下で変異TTRと評価試料を反応させる工程を含む、TTRの線維化を阻害する活性を測定する方法;
(44)中性条件で線維化させる、(43)に記載の方法;
(45)デオキシコール酸Naの濃度が0.1%から1%である、(43)又は(44)に記載の方法;
(46)評価試料がTTRに対する抗体である、(43)から(45)のいずれか一項に記載の方法;
(47)変異TTRがV30M TTRである、(43)から(46)のいずれか一項に記載の方法;
に関する。
1.本発明のリコンビナントヒト抗体およびその断片
本発明では、構造変化したTTRと特異的に結合し、TTRの線維化を阻害するヒト抗体を取得するために、TTRのS112Iが構造変化して2量体で存在することに着目し、S112Iを抗体作製の抗原として選択し、ファージディスプレイ法でヒト抗体を作成した。ファージディスプレイ技術を利用した抗体作製技術としては、「Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Edited by Brian K. Kay et al」、「Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al」、「ANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl A. K. BORREBAECK」が例示される。本発明では、S112Iを酸処理によって線維化したものをパンニング用のプレートへ固相化した後、ファージライブラリーと反応させる。酸処理はS112Iが線維化する温度、時間、pHを適宜選択して構わない。線維化の有無はThioflavinT assayによって、確認しても構わない。例えば、S112IをpH3.0-pH4.4の条件下で37℃で16時間処理する方法が例示される。そして、プレートを洗浄して非結合ファージを除去した後、標的分子に結合したファージを回収し、大腸菌へ感染させる。大腸菌を培養後、ファージを回収し、再度プレートへ反応させる。そうした一連のパンニングサイクルを3−5回程度行った後に、S112Iとの反応性が優れるファージをELISA試験で選抜する。
(1)TTRの線維化を阻害する活性を持つヒト抗体。
(2)構造変化を起こしたTTRを特異的に認識し、かつ四量体の機能性TTRを認識しないヒト抗体。
(3)TTRアミロイドと特異的に結合するヒト抗体。
(4)TTRアミロイドの除去を促進するヒト抗体。
(5)TTRアミロイドに対するマクロファージ貪食能を促進するヒト抗体。
(6)TTRアミロイドーシスに対する治療効果及び/又は予防効果を有するヒト抗体。
(7)TTR78-89をエピトープとするヒト抗体。
上記の(1)から(7)の抗体は、(1)から(7)に記載される通り、一つの特徴を有してもよく、他の(1)から(7)に記載される特徴をあわせ持っていてもかまわない。
(8)以下の(a)又は(b)のポリペプチドからなるH鎖の相補性決定領域と、(c)又は(d)のポリペプチドからなるL鎖の相補性決定領域とを含む、ヒト抗体。
(a)配列番号1〜3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号1〜3に示されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
(c)配列番号4〜6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(d)配列番号4〜6に示されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
また、当該ヒト抗体は、(1)から(7)に記載される特徴を併せ持っていても構わない。
(9)以下の(e)又は(f)のポリペプチドからなるH鎖の相補性決定領域と、(g)又は(h)のポリペプチドからなるL鎖の相補性決定領域とを含む、ヒト抗体。
(e)配列番号7〜9に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(f)配列番7〜9に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
(g)配列番号10〜12に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(h)配列番号10〜12に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
また、当該ヒト抗体は、(1)から(7)に記載される特徴を併せ持っていても構わない。
(10)以下の(i)または(j)のポリペプチドからなるH鎖可変領域と、(k)または(l)のポリペプチドからなるL鎖可変領域とを含む、ヒト抗体。
(i)配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(j)配列番号13に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖可変領域となるポリペプチド。
(k)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(l)配列番号14に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖可変領域となるポリペプチド。
また、当該ヒト抗体は、(1)から(7)に記載される特徴を併せ持っていても構わない。
(11)以下の(m)または(n)のポリペプチドからなるH鎖可変領域と、(o)または(p)のポリペプチドからなるL鎖可変領域とを含む、ヒト抗体。
(m)配列番号15に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(n)配列番号15に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖可変領域となるポリペプチド。
(o)配列番号16に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(p)配列番号16に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖可変領域となるポリペプチド。
また、当該ヒト抗体は、(1)から(7)に記載される特徴を併せ持っていても構わない。
(12)以下の(a)又は(b)のポリペプチドからなるH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片。
(a)配列番号1〜3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号1〜3に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
(13)以下の(e)又は(f)のポリペプチドからなるH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片。
(e)配列番号7〜9に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(f)配列番号7〜9に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
(14)以下の(c)又は(d)のポリペプチドからなるL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片。
(c)配列番号4〜6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(d)配列番号4〜6に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
(15)以下の(g)又は(h)のポリペプチドからなるL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片。
(g)配列番号10〜12に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(h)配列番号10〜12に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
(16)以下の(i)又は(j)のポリペプチドからなる、H鎖可変領域断片。
(i)配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(j)配列番号13に示されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖可変領域となるポリペプチド。
(17)以下の(m)又は(n)のポリペプチドからなる、H鎖可変領域断片。
(m)配列番号15に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(n)配列番号15に示されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖可変領域となるポリペプチド。
(18)以下の(k)又は(l)のポリペプチドからなる、L鎖可変領域断片。
(k)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(l)配列番号14に示されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖可変領域となるポリペプチド。
(19)以下の(o)又は(p)のポリペプチドからなる、L鎖可変領域断片。
(o)配列番号16に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(p)配列番号16に示されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖可変領域となるポリペプチド。
(20)(12)に記載のH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片または(16)に記載のH鎖可変領域断片と、(14)に記載のL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片または(18)に記載のL鎖可変領域断片とを連結してなる、TTRに対する抗体の1本鎖可変領域断片。
(21)(13)に記載のH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片または(17)に記載のH鎖可変領域断片と、(15)に記載のL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片または(19)に記載のL鎖可変領域断片とを連結してなる、TTRに対する抗体の1本鎖可変領域断片。
(22)(12)に記載のH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片または(16)に記載のH鎖可変領域断片、及び/又は、(14)に記載のL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片または(18)に記載のL鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、ヒト抗体又はその断片。
(23)(13)に記載のH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片または(17)に記載のH鎖可変領域断片、及び/又は、(15)に記載のL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片または(19)に記載のL鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、ヒト抗体又はその断片。
本発明には、上記1の抗体またはその断片をコードする遺伝子が含まれる。例えば、下記の塩基配列をオープンリーディングフレーム(ORF)領域として有する遺伝子、およびその塩基配列の一部を改変した改変遺伝子などが含まれる。
(1)配列番号1〜3、及び/又は、配列番号4〜6を含む塩基配列
(2)配列番号7〜9、及び/又は、配列番号10〜12を含む塩基配列
(3)配列番号13、及び/又は、配列番号14を含む塩基配列
(4)配列番号15、及び/又は、配列番号16を含む塩基配列
本発明には、前記2の遺伝子、すなわち、上記1の抗体またはその断片をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターが含まれる。例えば、配列番号13又は14に示される塩基配列を有するcDNAが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
本発明のヒト抗体は、構造変化を起こしたTTR(例えば、TTRアミロイド)を特異的に認識し、TTRの線維化を阻害し、FAPに対する予防効果を発揮する。そのため、本発明は、TTRの構造変化を検出する器具、TTRアミロイドーシス(特にFAP)診断薬、TTRの線維化を阻害する薬剤、TTRアミロイドーシス(特にFAP)に対する予防及び/又は治療するための医薬組成物を含む。
Matsubaraらの方法(非特許文献13、非特許文献15)を参考に、組換えTTR精製品の調製を行った。S112I TTR(ヒトTTRの112番目のセリンをイソロイシン変えた変異体)発現ベクターpQE30-hTTR(S112I)-Hisを大腸菌株M15に形質転換し、20mLのLB / Ampicillin (50μg/mL) / Kanamycin (25μg/mL) で、37℃で培養した。O.D.600nm=0.5になった時点でIPTGを終濃度10mMになるように添加し、一晩培養した。培養液から菌体を遠心で回収し、BufferA(50mM PB + 0.3M NaCl + 10mM Imidazole + 20mM 2-Mercaptoethanol)に懸濁した。懸濁液を15分間ソニケーションし、更に遠心を行い、上清を回収した。上清をNi-NTA Agarose (QIAGEN)を用いてHis-tag精製を行い、組換えTTRの含まれた溶出画分を20mM NaHCO3に対して透析した。透析後の組換えTTRを、10mM PB (pH7.5)下でSuperdex75 (GE Healthcare)を用いてゲルろ過精製し、2量体TTR画分を組換えTTR S112I精製品とした。
ヒトTTR発現ベクターを構築するにあたり、ヒトTTR遺伝子のクローニングを行った。Human liver Marathon-Ready cDNA (Clontech)を鋳型に、成熟型TTRの5´末端又は3´末端に設定したプライマー(TTR-F2:配列番号17、およびTTR-R:配列番号18)、およびEx-Taq (Takara)を用いてPCRを行った。PCR産物をpCR2.1-TOPOにTAクローニングした後、シークエンス解析によってヒトTTR遺伝子の塩基配列を確認した。配列が正しいことを確認した後、TTR遺伝子が挿入されたpCR2.1-TOPOをBamHIおよびHindIII処理して、TTR遺伝子をコードする配列が含まれた領域を切り出した。切り出し配列をBamHIおよびHindIII処理したpQE-30 (QIAGEN)に導入し、野生型ヒトTTR発現ベクターを構築した。
実施例2で構築したヒトTTR発現ベクターを鋳型に、site-directed mutagenesis法を用いてアミノ酸の点変異導入を行った。アミノ酸の点変異導入は、D18G、V30M、E54K、L55P、Y114C、V122I、K76A、S77A、Y78A、W79A、K80A、A81S、L82A、G83A、I84A、S85A、P86A、F87A、H88A、E89A、H90A、A91A、E92A、およびV93Aの24種類についてそれぞれ実施した。上記24種類のTTR変異体をコードする配列をpQE-30にそれぞれ導入した。
実施例2および3で構築した野生型TTR、又はD18G、V30M、E54K、L55P、Y114C、Y116S、V122I TTR変異体を発現する発現ベクターを大腸菌株M15に形質転換し、実施例1に示す方法で、組換えTTR精製品の調製を行った。上記TTR変異体については、4量体TTR画分を組換えTTR精製品とした。
ヒトB細胞(例えばリンパ節や脾臓)由来のmRNAからヒトVHおよびVL cDNAを使用して調製されたscFvファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって、構造変化を起こしたヒトTTRに対する抗体を単離した。用いた抗体ライブラリーは1011種以上の多様な抗体分子を含む極めて優れたものである。
実施例4で調製したD18G、V30M、E54K、L55P、Y114C、Y116S、V122Iの7種類の変異TTR精製品、および野生型TTR精製品を、3 mg/mLになるように10mM PB (pH7.5)で希釈し、等量の200 mM 酢酸バッファー + 100 mM NaCl (pH3.0)と混合して1.5mg/mLの濃度になるように調製し、37℃恒温槽で一晩反応させることでTTR線維を調製した。反応後のTTRについては、ThioflavinT assayによって線維が形成されていることを確認した。
取得したscFvファージの抗原結合活性をELISA法で評価した。実施例5で作製したS112I TTR線維、および実施例6で作製したV30M TTR線維をPBS (SIGMA)で10μg/mLに希釈し、Maxisorp Plate (Nunc)に各ウェル当り50μL入れ、1時間室温でインキュベートすることによってTTRを固相化した。固相化したプレートに1%BSA-PBSを各ウェル当り300μL入れ、1時間室温でインキュベートすることによってプレートのブロッキングを行った。取得したscFvファージの培養上清をプレートの各ウェルに100μLずつ加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTでウェルを洗浄し、1%BSA-PBSで5000倍希釈した検出抗体anti-M13/HRP (GE Healthcare)をプレートの各ウェルに100μLずつ加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、TMB (SIGMA)をプレートの各ウェルに100μLずつ加えることによって発色させた。30分後に1N 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)で発色値(O.D.450nm/650nm)を測定した。
取得したscFv371およびscFv313のVH領域又はVL領域の塩基配列を確認した。両者のファージ中に含まれるDNA塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit (Applied Biosystems)を用いて決定した。
取得したscFv371およびscFv313のV領域の配列をマウスIgG1λ発現ベクターに導入し、マウス定常領域を持つこれらの抗体(以下キメラ371抗体およびキメラ313抗体)の発現を行った。実施例5で取得したscFv371およびscFv313ファージ中に含まれているプラスミドを鋳型として、以下の表に示す組み合わせでscFv371およびscFv313のVHおよびVLを含む領域をPCR法によって増幅した。プライマーの組合せと配列番号を表5に示した。
371M抗体のエピトープを更に詳しく解析するために、実施例3で構築したTTRアラニン置換変異体を用いて、371M抗体の反応性解析を行った。実施例3で構築したTTR変異体発現ベクターを大腸菌株M15に形質転換し、20mLのLB / Ampicillin (50μg/mL) / Kanamycin (25μg/mL) で、37℃で培養した。O.D.600nm=0.5になった時点でIPTGを終濃度1mMになるように添加し、一晩培養した。培養液を遠心し、沈殿画分をBugbuster (Merck)によって可溶化した。可溶化した菌体液を8-16%SDS-PAGEゲルに泳動し、ゲルからImmobilon-P (Millipore)へ転写した。転写した膜に2% Skimmilk-PBSTを加え、室温で1時間振とうすることで膜のブロッキングを行った。キメラ371M抗体を2% Skimmilk-PBSTで1μg/mLの濃度に希釈し、10mLを膜へ添加して室温で1時間振とうした。PBSTで洗浄し、検出抗体HRP標識anti-mouse IgG(H+L) (AMERICAN QUALEX INTERNATIONAL)を2%Skimmilk-PBSTで5000倍希釈した後に膜へ添加し、室温で1時間振とうした。PBSTで洗浄した後、Ez West Blue (ATTO)で発色させた。
371M抗体および313M抗体のTTR 4量体に対する反応性を解析するため、表面プラズモン共鳴法を用いた反応特異性解析を行った。Biacore2000 (GE Healthcare)を用い、Sensorchip CM5 (GE Healthcare)にWT TTR4量体、V30M TTR4量体、V30M TTR線維(実施例4,6で調製、いずれも組換え体)を1000RU程度固相化した。リガンドの固相化は10mM 酢酸バッファー (pH6.0)で行った。HBS-EP Bufferで10μg/mLに希釈したPolyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin (Dako)、キメラ371M抗体、キメラ313M抗体、陰性コントロール抗体を20μL/minで2分間泳動した。泳動後に解離を60分間行い、10 mM Gly-NaOH (pH9.0)で30秒間再生を行った。
371抗体および313抗体がFAP患者由来の血清に対して反応性を示すかどうかについて解析を行った。投与した抗体が患者血清中のヒトTTRを認識しないことが、FAP治療用の抗体として望ましい特性である。健常人の血清、及びV30M TTR変異を有するFAP患者由来の血清を2μg/mLで、実施例6と同様に酸処理を行った血清由来の野生型TTRの線維、及びFAP患者の腎臓から抽出したTTRアミロイドを約4μg/mLで、Maxisorp plate (Nunc)に各ウェル当り100μL添加し、抗原の固相化を行った。固相化したプレートに1%BSA-PBSを各ウェル当り300μL入れ、1時間室温でインキュベートすることによってプレートのブロッキングを行った。キメラ371抗体およびキメラ313抗体を1%BSA-PBSで段階希釈し、プレートの各ウェルに100μLずつ加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTでウェルを洗浄し、検出抗体anti-mouse IgG(H+L)/HRP (Zymed)をプレートの各ウェルに100 μLずつ加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、TMB (SIGMA)をプレートの各ウェルに100μLずつ加えることによって発色させた。30分後、1N 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)で発色値(O.D.450nm)を測定した。
V30M TTR保有FAP患者の心臓を採取し、ホルマリン固定を行った。固定した心臓組織をパラフィンブロックに包埋し、組織切片を作製した。組織切片を4μmの厚さにスライスしてスライドグラスに接着させた後、脱パラフィン処理を行った。PBSで洗浄した後、0.1% 過よう素酸二水和物に10分間浸透し、更にPBSで洗浄した。0.5% BSA-PBSで50倍希釈したRabbit serum (Dako)に室温で1時間浸漬し、ブロッキング処理を行った。PBSで洗浄した後、一次抗体としてキメラ371抗体/キメラ313抗体/キメラ371M抗体/キメラ313M抗体/陰性コントロール抗体をそれぞれ0.5%BSA-PBSで10μg/mLに希釈し、4℃で一晩浸漬した。二次抗体としてHRP標識Rabbit anti-mouse IgG (Dako)を0.5%BSA-PBSで100倍希釈し、室温で1時間浸漬した。PBSで洗浄し、DABを用いて発色させた。ヘマトキシリン染色もあわせて行った。陽性コントロールでは、一次抗体にPolyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin (Dako)を、二次抗体にHRP標識Goat anti-Rabbit IgG (Dako)を用いて同様な処理を行った。また、ホルマリン固定によりTTRが変性し、立体構造が変化してしまう可能性を考慮し、V30M TTR保有FAP患者の心臓の凍結組織切片についても、同様に免疫染色を行った。さらに、アミロイド線維の存在を確認するために、Congo red染色も行った。Congo redはアミロイド線維に定着して短波長シフトを起こすことが知られている。
実施例6で調製した7種類のTTR線維、および野生型TTR精製品を、1.5μgずつ8-16%SDS-PAGEで泳動し、Immobilon-P (Millipore)に転写した。転写した膜に2%Skimmilk-PBSTを加え、室温で1時間振とうすることで膜のブロッキングを行った。キメラ371M抗体またはキメラ313M抗体を2%Skimmilk-PBSTで1μg/mLの濃度に希釈し、10mLを膜へ添加して室温で1時間振とうした。PBSTで洗浄し、検出抗体anti-mouse IgG(H+L)を2% Skimmilk-PBSTで5000倍希釈し、室温で1時間振とうした。PBSTで洗浄した後、Ez West Blue (ATTO)で発色させた。
組換えV30M TTRを375μg/mLになるようにPBS(-)で希釈し、4種類の界面活性剤を終濃度が0.1%、0.01%、0.001%になるように混合した。使用する界面活性剤として、(1)塩化ベンザルコニウム(山善)、(2)デオキシコール酸ナトリウム(ナカライ)、(3)Zwittergent3-16 (Carbiochem)、(4)NP-40 (Wako)を用いた。37℃で4日間静置し、ThioflavinT assay(励起波長 440 nm, 蛍光波長 480 nm)によって蛍光強度を測定し、TTR線維化の程度を評価した。
V30M TTR精製品、および371抗体、313抗体、371M抗体、313M抗体、または陰性コントロール抗体のモル比が 10μM:0.01〜2μMになるように両者を混合し(TTR: 550μg/mL、抗体: 1.5〜300μg/mL)、PBS+0.1%デオキシコール酸ナトリウム環境下で37℃ 3日間静置した。静置後のサンプルを用いてThioflavinT assay(励起波長 440 nm, 蛍光波長 480 nm)を行い、蛍光強度を測定した。
マクロファージがTTR線維を貪食する際、371M抗体や313M抗体がその能力を促進するかどうかについて、マクロファージ貪食能試験を行った。本試験は、TTR患者組織内に沈着しているTTRをマクロファージが除去する過程を模倣しており、両抗体の添加によってマクロファージの貪食活性が促進されれば、両抗体はヒト組織内でTTR沈着の除去を促進する活性を有していると期待される。
3ヶ月齢のV30M Tgラット(非特許文献14、TTRのアミノ酸配列において30位をバリンからメチオニンに変異させたヒトTTRの遺伝子を導入したトランスジェニックラット)を用いて、キメラ371抗体、キメラ313抗体 各10mg/kg あるいはPBSを各群7または8匹ずつ、3〜9ヶ月齢の6ヶ月間に亘り、週1回ずつ26回投与した。投与後に剖検して大腸を採取し、ホルマリン固定を行った。固定した大腸組織をパラフィンブロックに包埋し、組織切片を作製した。組織切片を一次抗体にPolyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin (Dako)を、二次抗体にHRP標識Goat anti-Rabbit IgG (Dako)を用いて免疫染色し、大腸の筋層におけるTTR沈着の程度を数値化して群間での比較した。
Claims (40)
- 以下の(a)のポリペプチドからなるH鎖の相補性決定領域と、(c)のポリペプチドからなるL鎖の相補性決定領域、とを含む、または、以下の(e)のポリペプチドからなるH鎖の相補性決定領域と、(g)のポリペプチドからなるL鎖の相補性決定領域とを含む、トランスサイレチン(以下、TTRと称する)の線維化を阻害する活性を持つヒト抗体。
(a)配列番号1〜3に示されるCDR1−3のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(c)配列番号4〜6に示されるCDR1−3のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(e)配列番号7〜9に示されるCDR1−3のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(g)配列番号10〜12に示されるCDR1−3のアミノ酸配列からなるポリペプチド。 - 構造変化を起こしたTTRを特異的に認識する、請求項1に記載のヒト抗体。
- TTRアミロイドと特異的に結合する、請求項1又は請求項2に記載のヒト抗体。
- 2種類以上の変異TTRに由来するTTRアミロイドと結合する、請求項1から請求項3のいずれか一項に記載のヒト抗体。
- 変異TTRが、D18G、V30M、E54K、L55P、Y114C、Y116SおよびV122Iからなる群から選択される変異を有するTTRである、請求項4に記載のヒト抗体。
- TTRアミロイドの除去を促進する、請求項1から請求項5のいずれか一項に記載のヒト抗体。
- TTRアミロイドに対するマクロファージ貪食能を促進する、請求項1から請求項6のいずれか一項に記載のヒト抗体。
- エピトープがTTRの79位から89位を含む配列である、請求項1から請求項7いずれか一項に記載のヒト抗体。
- エピトープがTTRの79位から89位である、請求項8に記載のヒト抗体。
- TTRアミロイドーシスに対する治療効果及び/又は予防効果を有する、請求項1から請求項9のいずれか一項に記載のヒト抗体。
- TTRアミロイドーシスが家族性アミロイドポリニューロパチー(以下、FAPと称する)である、請求項10に記載のヒト抗体。
- TTRアミロイドーシスが老人性全身性アミロイドーシス(以下、SSAと称する)である、請求項10に記載のヒト抗体。
- ファージディスプレイ法により得られた抗体である、請求項1から請求項12のいずれか一項に記載のヒト抗体。
- 以下の(i)または(j)のポリペプチドからなるH鎖可変領域と、(k)または(l)のポリペプチドからなるL鎖可変領域とを含む、請求項1から請求項13のいずれか一項に記載のヒト抗体
(i)配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(j)配列番号13に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖可変領域となるポリペプチド。
(k)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(l)配列番号14に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖可変領域となるポリペプチド。 - 以下の(m)または(n)のポリペプチドからなるH鎖可変領域と、(o)または(p)のポリペプチドからなるL鎖可変領域とを含む、請求項1から請求項13のいずれか一項に記載のヒト抗体
(m)配列番号15に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(n)配列番号15に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖可変領域となるポリペプチド。
(o)配列番号16に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(p)配列番号16に示されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖可変領域となるポリペプチド。 - 以下の(a)のポリペプチドからなるH鎖の相補性決定領域を含む、請求項1から請求項13のいずれか一項に記載のヒト抗体のH鎖可変領域断片
(a)配列番号1〜3に示されるCDR1−3のアミノ酸配列からなるポリペプチド。 - 以下の(c)のポリペプチドからなるL鎖の相補性決定領域を含む、請求項1から請求項13のいずれか一項に記載のヒト抗体のL鎖可変領域断片
(c)配列番号4〜6に示されるCDR1−3のアミノ酸配列からなるポリペプチド。 - 以下の(i)又は(j)のポリペプチドからなる、請求項1から請求項13のいずれか一項に記載のヒト抗体のH鎖可変領域断片
(i)配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(j)配列番号13に示されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖可変領域となるポリペプチド。 - 以下の(k)又は(l)のポリペプチドからなる、請求項1から請求項13のいずれか一項に記載のヒト抗体のL鎖可変領域断片
(k)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(l)配列番号14に示されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖可変領域となるポリペプチド。 - 以下の(e)のポリペプチドからなる、請求項1から請求項13のいずれか一項に記載のヒト抗体のH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片
(e)配列番号7〜9に示されるCDR1−3のアミノ酸配列からなるポリペプチド。 - 以下の(g)のポリペプチドからなる、請求項1から請求項13のいずれか一項に記載のヒト抗体のL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片
(g)配列番号10〜12に示されるCDR1−3のアミノ酸配列からなるポリペプチド。 - 以下の(m)又は(n)のポリペプチドからなる、請求項1から請求項13のいずれか一項に記載のヒト抗体のH鎖可変領域断片
(m)配列番号15に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(n)配列番号15に示されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するH鎖可変領域となるポリペプチド。 - 以下の(o)又は(p)のポリペプチドからなる、請求項1から請求項13のいずれか一項に記載のヒト抗体のL鎖可変領域断片
(o)配列番号16に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(p)配列番号16に示されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、TTRに対するL鎖可変領域となるポリペプチド。 - 請求項16に記載のH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片または請求項18に記載のH鎖可変領域断片と、請求項17に記載のL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片または請求項19に記載のL鎖可変領域断片とを連結してなる、TTRに対する抗体の1本鎖可変領域断片。
- 請求項16に記載のH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片または請求項18に記載のH鎖可変領域断片、及び/又は、請求項17に記載のL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片または請求項19に記載のL鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、請求項1から請求項13に記載のヒト抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項21に記載のH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片または請求項23に記載のH鎖可変領域断片と、請求項22に記載のL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片または請求項24に記載のL鎖可変領域断片とを連結してなる、TTRに対する抗体の1本鎖可変領域断片。
- 請求項21に記載のH鎖の相補性決定領域を含むH鎖可変領域断片または請求項23に記載のH鎖可変領域断片、及び/又は、請求項22に記載のL鎖の相補性決定領域を含むL鎖可変領域断片または請求項24に記載のL鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、請求項1から請求項13のいずれか一項に記載のヒト抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1から請求項27のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする遺伝子。
- 請求項28に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
- 請求項28に記載の遺伝子、又は請求項29に記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
- 請求項1から請求項27のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、TTRアミロイドを検出する器具。
- 請求項1から請求項27のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、TTRアミロイドを検出する試薬。
- 請求項1から請求項27のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、TTRアミロイドを除去するする担体。
- 請求項1から請求項27のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、TTRアミロイドーシス診断薬。
- TTRアミロイドーシスがFAPである、請求項34に記載の診断薬。
- TTRアミロイドーシスがSSAである、請求項34に記載の診断薬。
- 請求項1から請求項27のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、TTRの線維化阻害剤。
- 請求項1から請求項27のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、TTRアミロイドーシスを予防及び/又は治療するための医薬組成物。
- TTRアミロイドーシスがFAPである、請求項38に記載の医薬組成物。
- TTRアミロイドーシスがSSAである、請求項38に記載の医薬組成物。
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