EA045911B1 - АНТИТЕЛА К ПИРОГЛУТАМАТ-β-АМИЛОИДУ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents
АНТИТЕЛА К ПИРОГЛУТАМАТ-β-АМИЛОИДУ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Download PDFInfo
- Publication number
- EA045911B1 EA045911B1 EA202192606 EA045911B1 EA 045911 B1 EA045911 B1 EA 045911B1 EA 202192606 EA202192606 EA 202192606 EA 045911 B1 EA045911 B1 EA 045911B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- variable region
- chain variable
- antibody
- antigen
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 209
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 208
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 174
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 170
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 169
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 169
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 167
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 152
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 105
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 87
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 43
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 27
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 26
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 26
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 25
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 25
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 claims description 22
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 claims description 22
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 19
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 claims description 9
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 claims description 8
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 claims description 7
- 208000005145 Cerebral amyloid angiopathy Diseases 0.000 claims description 6
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 claims description 6
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 claims description 6
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 claims description 6
- 206010067889 Dementia with Lewy bodies Diseases 0.000 claims description 5
- 208000009829 Lewy Body Disease Diseases 0.000 claims description 5
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 claims description 4
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 claims description 4
- 201000008319 inclusion body myositis Diseases 0.000 claims description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000018282 ACys amyloidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007487 Familial Cerebral Amyloid Angiopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032849 Hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis Diseases 0.000 claims description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 claims description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 8
- 208000024667 ABeta amyloidosis, Dutch type Diseases 0.000 claims 1
- 208000036536 dutch type ABeta amyloidosis Diseases 0.000 claims 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 40
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 35
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 11
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 10
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 10
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 10
- 102000014303 Amyloid beta-Protein Precursor Human genes 0.000 description 9
- 108010079054 Amyloid beta-Protein Precursor Proteins 0.000 description 9
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 9
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 8
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 8
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 7
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 7
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 7
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 5
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 102220329755 rs373637566 Human genes 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000011296 nano differential scanning fluorimetry Methods 0.000 description 4
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010059245 Angiopathy Diseases 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 3
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710117290 Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000690301 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 2
- 101001047629 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2-30 Proteins 0.000 description 2
- 101001116548 Homo sapiens Protein CBFA2T1 Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 102100022952 Immunoglobulin kappa variable 2-30 Human genes 0.000 description 2
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000005888 antibody-dependent cellular phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- -1 devices Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000011984 electrochemiluminescence immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 229910001447 ferric ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 102000054751 human RUNX1T1 Human genes 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 2
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000002682 neurofibrillary tangle Anatomy 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 2
- 102220051014 rs141837529 Human genes 0.000 description 2
- 102220047535 rs587783040 Human genes 0.000 description 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 2
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 102220566030 5-hydroxytryptamine receptor 2B_N55S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 1
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 1
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 1
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 1
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027374 Mental impairment Diseases 0.000 description 1
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000577979 Peromyscus spicilegus Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 1
- 108010050254 Presenilins Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000006933 amyloid-beta aggregation Effects 0.000 description 1
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 1
- 230000003942 amyloidogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002882 anti-plaque Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 239000001055 blue pigment Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 102220349404 c.116G>C Human genes 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 210000004289 cerebral ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- WLNARFZDISHUGS-MIXBDBMTSA-N cholesteryl hemisuccinate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)CCC(O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 WLNARFZDISHUGS-MIXBDBMTSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011509 clonal analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002996 emotional effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019534 high fructose corn syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007919 intrasynovial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- DCYOBGZUOMKFPA-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);octadecacyanide Chemical compound [Fe+2].[Fe+2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] DCYOBGZUOMKFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 231100000863 loss of memory Toxicity 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000009061 membrane transport Effects 0.000 description 1
- 230000006386 memory function Effects 0.000 description 1
- 210000002418 meninge Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- NTGBUUXKGAZMSE-UHFFFAOYSA-N phenyl n-[4-[4-(4-methoxyphenyl)piperazin-1-yl]phenyl]carbamate Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1N1CCN(C=2C=CC(NC(=O)OC=3C=CC=CC=3)=CC=2)CC1 NTGBUUXKGAZMSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000276 potassium ferrocyanide Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 229960003351 prussian blue Drugs 0.000 description 1
- 239000013225 prussian blue Substances 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000003752 saphenous vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229920005573 silicon-containing polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Description
Область применения изобретения
Данное изобретение относится к области антител, направленных на бета-амилоидные (Αβ) пептиды, и к терапевтическим способам с использованием этих антител. В частности, антитела можно использовать для идентификации и лечения связанных с амилоидами расстройств.
Ссылка на перечень последовательностей, поданный в электронном виде
Данная заявка содержит перечень последовательностей, представленный в электронном виде через EFS-Web как перечень последовательностей в формате ASCII с именем файла JAB7013USPSP Sequence Listing, датой создания 11 марта 2019 г. и размером 76 кб. Перечень последовательностей, представленный посредством EFS-Web, является частью описания и полностью включен в настоящий документ путем ссылки.
Предпосылки создания изобретения
Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой дегенеративное расстройство мозга, клинически характеризуемое прогрессирующей потерей памяти, когнитивных функций, способности к рассуждению, принятию решений и эмоциональной устойчивости, что постепенно приводит к глубокому умственному нарушению и в конечном итоге смерти. Болезнь Альцгеймера представляет собой частую причину прогрессирующей умственной отсталости (деменции) у пожилых людей. Болезнь Альцгеймера наблюдалась во всем мире и представляет собой основную проблему общественного здравоохранения. В настоящее время только в США от этой болезни страдают более пяти миллионов человек. В настоящее время она неизлечима, и никакое лечение эффективно не предотвращает БА или не вызывает регресс симптомов или его течения.
В мозге пациентов с БА наблюдаются характерные повреждения, называемые амилоидными бляшками, амилоидной ангиопатией (амилоидными отложениями в кровеносных сосудах) и нейрофибриллярными клубками. Как правило, обнаруживают большие количества таких повреждений, в особенности амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков, в нескольких областях мозга важных для памяти и когнитивных функций. Амилоидные бляшки и амилоидная ангиопатия также характерны для мозга индивидуумов с трисомией 21 (синдром Дауна), болезнью диффузных телец Леви и наследственной церебральной геморрагией с амилоидозом голландского типа (HCHWA-D).
Основным компонентом амилоидных бляшек является множество бета-амилоидных (Ae) пептидов, которые образуются путем расщепления белка-предшественника β-амилоида (APP). Предполагается, что отложение пептидов Ae в головном мозге является ранней и необходимой ступенью в каскаде заболеваний, ведущих к БА. Идентификация мутаций в генах белка-предшественника амилоида и пресенилина, приводящих к изменению продукции Ae и вызывающих семейную форму БА с ранним началом, дает убедительные доказательства того, что измененный метаболизм амилоида является центральным событием в патогенном процессе, лежащем в основе заболевания.
Бета-амилоидные пептиды, имеющие пироглутамат в третьем остатке (3pE Ae), являются основными молекулами, депонированными в головном мозге пациентов с БА. 3pE Ae присутствует почти во всех диффузных и зрелых бляшках при БА, метаболически стабилен и может играть роль как в нуклеации бляшек, так и в стабилизации (Cynis et al., Molecular Neurodegeneration, 2016; 11:48). 3pE Ae в обнаружимых количествах в СМЖ или плазме не описан, что дает основания полагать, что целевой пептид является специфичным для патологии (DeMattos et al., Neuron, 2012; 76:1-13). Антитела, которые селективно связываются с 3pE Ae, могут быть полезны в иммунотерапии.
Изложение сущности изобретения
Согласно варианту осуществления и полному описанию, изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с e-амилоидом, имеющим пироглутамат в третьем остатке (3pE Ae), способам получения антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с 3pE Ae, способам анализа с использованием таких антител или их антигенсвязывающих фрагментов и применению антител или их антигенсвязывающих фрагментов по изобретению в производстве лекарственного препарата для лечения, задержки развития или регресса по меньшей мере одной патологии или симптома болезни Альцгеймера и других связанных с e-амилоидами заболеваний. Антитела по изобретению предпочтительно связывают пептид Ae, содержащий 3pE, по сравнению с пептидом Ae, который не содержит 3pE.
В частности, в данном документе описано выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), HCDR2, HCDR3, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), LCDR2 и LCDR3, имеющие полипептидные последовательности:
a. SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
b. SEQ ID NO: 1, 7, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
c. SEQ ID NO: 1, 7, 3, 8, 5, и 6, соответственно;
d. SEQ ID NO: 1, 2, 3, 8, 5 и 6, соответственно;
e. SEQ ID NO: 56, 57, 3, 8, 5, и 6, соответственно;
f. SEQ ID NO: 56, 57, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
- 1 045911
g. SEQ ID NO: 56, 58, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
h. SEQ ID NO: 56, 7, 3, 8, 5, и 6, соответственно;
i. SEQ ID NO: 1, 57, 3, 8, 5, и 6, соответственно;
j. SEQ ID NO: 56, 7, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
k. SEQ ID NO: 1, 57, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
l. SEQ ID NO: 1, 58, 3, 4, 5, и 6, соответственно; или
m. SEQ ID NO: 56, 2, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывает 3pE Ae, предпочтительно человеческий 3pE Ae.
В определенных вариантах осуществления выделенное моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19, 20 или 21, или вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 10, 12, 14, 18, 22, 53 или 55.
В определенных вариантах осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
a. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 22;
b. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 10;
c. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 12;
d. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 13, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;
e. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;
f. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;
g. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;
h. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 17, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 18;
i. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 18;
j. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 53; или
k. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 55.
В определенных вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является химерным. В определенных вариантах осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным.
В определенных вариантах осуществления выделенное моноклональное антитело содержит:
a. аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 37, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 38;
b. аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 39, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 38;
c. аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 37, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 52; или
d. аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 39, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 54.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы фрагментов, состоящей из Fv, F(ab'), F(ab')2 и scFv. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент избирательно связывается с пептидом 3pE Ae (например, Ae3pE-40 и Ae3pE-42) с небольшой перекрестной реактивностью или без перекрестной реактивности с другими пептидами Ae или белкомпредшественником β -амилоида (APP).
Также представлены выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по описанному в данному документе изобретению.
Также предложены векторы, содержащие выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению.
Также предложены клетки-хозяева, содержащие векторы, содержащие выделенные нуклеиновые
- 2 045911 кислоты, кодирующие моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению. Также предложены гибридомы, которые продуцируют выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению.
В определенных вариантах осуществления предложена фармацевтическая композиция, содержащая выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Также предложены способы лечения патологического состояния, связанного с образованием бляшек, содержащих бета-амилоидный белок, у нуждающегося в этом субъекта. Способы включают введение нуждающемуся в этом субъекту моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению. В определенных вариантах осуществления патологическое состояние представляет собой болезнь Альцгеймера. В определенных вариантах осуществления патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из деменции, связанной с трисомией 21 (синдром Дауна), болезни диффузных телец Леви, миозита с включениями, церебральной амилоидной ангиопатии и наследственной церебральной геморрагии с амилоидозом голландского типа (HCHWA-D).
Также предложены способы уменьшения бляшек, связанных с болезнью Альцгеймера, у нуждающегося в этом субъекта. Способы включают введение нуждающемуся в этом субъекту моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению.
Также предложены способы предотвращения активности нуклеации 3pE Ae у нуждающегося в этом субъекта. Способы включают введение нуждающемуся в этом субъекту моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению.
Также предложены способы получения моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению, при этом способы включают культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в условиях для получения моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
Также представлены способы получения фармацевтической композиции по изобретению. Способы включают объединение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению с фармацевтически приемлемым носителем для получения фармацевтической композиции.
Вариант осуществления включает наборы и устройства, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше.
Дополнительные объекты, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны для специалистов в данной области техники после ознакомления с представленным ниже подробным описанием предпочтительных вариантов осуществления.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлена сенсограмма (кинетика единичного цикла), полученная путем безмаркерного обнаружения методом поверхностного плазмонного резонанса аффинного взаимодействия BAMB31_2a (mIgG2a) с человеческим пептидом Ae (3pE-40). Серые кривые представляют собой данные с вычитанием двух эталонных сигналов, а черные кривые представляют аппроксимированные значения.
На фиг. 2 представлена сенсограмма (кинетика единичного цикла), полученная путем безмаркерного обнаружения методом поверхностного плазмонного резонанса аффинного взаимодействия mE8c mIgG2a с человеческим пептидом Ae(3pE-40). Серые кривые представляют собой данные с вычитанием двух эталонных сигналов, а черные кривые представляют аппроксимированные значения.
На фиг. 3A-3I показана реактивность в отношении бляшек по результатам иммуногистохимического анализа в фиксированной формалином и залитой парафином (FFPE) ткани головного мозга трансгенной мыши для BAMB674 и BAMB675 относительно молекулами HFA для сравнения. Показаны результаты для концентрации первичных антител, равной 0,05 мкг/мл. Стрелки указывают на области помеченных бляшек для BAMB674 и BAMB675. (A) BAMB674; (B) BAM675; (C) Антитело I; (D) Антитело II; (E) B12L; (F) CI-C7; (G) hE8L; (H) R17L; (I) R17.
На фиг. 4A-4B представлены графики, демонстрирующие селективность BAMB31_1, как показано при помощи обнаружения синтетических человеческих пептидов Ae методом сэндвич-ИФА. (A) Ae1-40 (B) AepE11-40.
На фиг. 5A-5F показана реактивность в отношении бляшек с помощью иммуногистохимии в фиксированной формалином и залитой парафином (FFPE) ткани головного мозга трансгенной мыши для (AB) BAMB246 (химера huIgG1), (C-D) BaMb674 и (E-F) BAMB675. На панели маленьких вставок показаны окрашенные части головного мозга и область увеличенного размера.
На фиг. 6A-6D показана реактивность в отношении бляшек с помощью иммуногистохимического анализа в криоконсервированной ткани головного мозга при БА с (A, C) 4G8 и (B, D) BAMB31_2a (mIgG2a) при двух различных увеличениях.
- 3 045911
На фиг. 7 представлен график, демонстрирующий концентрации антител в сыворотке в разные моменты времени после однократной внутрибрюшинной (в/б) дозы в 20 мг/кг трансгенным мышам.
На фиг. 8 представлен график, демонстрирующий микрогеморрагии после длительного лечения изотипическим контролем и антителами BAMB31_2a (mIgG2a) у мышей PDAPP путем оценки количества положительных по Перлсу клеток.
На фиг. 9 представлен график, демонстрирующий амилоидную нагрузку после хронического лечения изотипическим контролем и антителами BAMB31_2a (mIgG2a) в гиппокампе мышей PDAPP, измеренную методом иммуноанализа, обнаруживающего Ae1-x. Значения, обозначенные серым цветом, представляют собой точки данных ниже предела обнаружения для анализа.
На фиг. 10 представлена схема двухкомпартментной модели для фармакокинетического исследования BAMB674 и BAMB675 на обезьянах.
На фиг. 11 представлен график, демонстрирующий зависимость ФК от наблюдаемых данных для BAMB674 и BAMB675. Концентрации мкАт к HFA BAM31 в сыворотке после внутривенного (в/в) болюсного введения 25 мг/кг яванским макакам в качестве IgG1 дикого типа (ДТ в сыворотке) и изотипа +YTE IgG1 (YTE в сыворотке). Концентрации антител к Ae 3pE (3pE-AB) μмкг/мл показаны в логарифмической шкале по оси y в зависимости от времени в днях по оси X. Рассчитанный период полужизни (t1/2) для каждого мкАт показан в тексте вставки.
На фиг. 12 представлен график, демонстрирующий концентрации в головном мозге, наблюдаемые для BAMB674 и BAMB675. На 7-й день и 42-й день уровни мкАт HFA BAMB31 IgG1 дикого типа (ДТ в головном мозге) и изотипа +YTE IgG1 (YTE в головном мозге) в лизате головного мозга после в/в болюсного введения 25 мг/кг яванским макакам. Концентрации антител к Ae 3pE (3pE-AB) μмкг/мл показаны в логарифмической шкале по оси y в зависимости от времени в днях по оси X.
Подробное описание изобретения
В разделе Предпосылки создания изобретения и в тексте настоящей заявки приведены цитаты или описания различных публикаций, статей и патентов; причем каждая из этих ссылок полностью включена в настоящее описание путем ссылки. Описание документов, актов, материалов, устройств, изделий или т.п., которые были включены в настоящее описание, приведено в качестве контекста для изобретения. Такое описание не является допущением того, что любой из таких источников или все такие источники являются частью предшествующего уровня техники в отношении каких-либо описываемых или заявленных изобретений.
Необходимо понимать, что это изобретение не ограничивается конкретными способами, реагентами, соединениями, композициями или биологическими системами, которые могут варьироваться. Следует также иметь в виду, что применяемые в данном документе термины используются только в целях описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и не носят ограничительного характера.
Если не указано иное, все технические и научные термины в настоящем документе имеют общепринятое значение, понятное любому специалисту в области, к которой относится данное изобретение. В ином случае, определенные термины в настоящем документе имеют значения, установленные в настоящем описании.
Необходимо отметить, что в настоящем документе и в приложенной формуле изобретения форма единственного числа включает объекты и во множественном числе, если из контекста явно не следует иное.
Если не указано иное, термин по меньшей мере, предшествующий ряду элементов, следует понимать как относящийся к каждому элементу в этом ряду. Специалисты в данной области смогут определять или с помощью лишь стандартных экспериментов смогут устанавливать множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления изобретения, описанного в настоящем документе. Подразумевается, что такие эквиваленты включены в изобретение.
В настоящем документе термины содержит, содержащий, включает, включающий, имеет, имеющий, содержит или содержащий или любая другая их вариация подразумевают включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключение из него какого-либо другого целого числа или группы целых чисел, и они являются не исключающими или неограничивающими. Например, композиция, смесь, процесс, способ, изделие или устройство, которое содержит перечень элементов, не обязательно ограничивается только этими элементами, но может включать другие элементы, не перечисленные прямо или присущие такой композиции, смеси, процессу, способу, изделию или устройству. Кроме того, если в явной форме не указано иное, союз или относится к включающему или, а не к исключающему или. Например, условие A или B выполняется в любой одной из следующих ситуаций: A истинно (или присутствует), а B ложно (или отсутствует), A ложно (или отсутствует), а B истинно (или присутствует), и оба элемента A и B истинны (или присутствуют).
В настоящем документе соединительный термин и/или между множеством перечисляемых элементов следует понимать как включающий как отдельные, так и комбинированные варианты. Например, если два элемента соединены и/или, первый вариант относится к возможности применения первого
- 4 045911 элемента без второго. Второй вариант относится к возможности применения второго элемента без первого. Третий вариант относится к возможности применения первого и второго элементов вместе. Подразумевается, что любой из этих вариантов соответствует значению и, соответственно, удовлетворяет требованию термина и/или в контексте данного документа. Кроме того, подразумевается, что одновременное применение более одного из этих вариантов соответствует значению и, соответственно, удовлетворяет требованию термина и/или.
В настоящем документе термин состоять из или его варианты, такие как состоит из или состоящий из, используемые в описании и формуле изобретения, указывают на включение любого указанного целого числа или группы целых чисел, но при этом никакое дополнительное целое число или группа целых чисел не могут быть добавлены к указанному способу, структуре или композиции.
В настоящем документе термин состоять по существу из или варианты, такие как состоит по существу из или состоящий по существу из, используемые в описании и формуле изобретения, указывают на включение любого указанного целого числа или группы целых чисел, а также на необязательное включение любого перечисленного целого числа или группы целых чисел, которые существенно не изменяют основные или новые свойства указанного способа, структуры или композиции. См. M.P.E.P. § 2111.03.
Антитела.
В изобретении предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое особенно предпочтительно связывается с пептидом 3pE Ae по сравнению с пептидом Ae, который не содержит 3pE. Дополнительно предложены способы получения антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с пептидом 3pE Ae, и способы получения гибридом, которые продуцируют антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с пептидом 3pE Ae. Изобретение также включает способ лечения болезни Альцгеймера и других связанных с β-амилоидами заболеваний у индивидуума, способ устранения бляшек, связанных с болезнью Альцгеймера или другими связанными с β-амилоидами заболеваниями, и способ предотвращения активности нуклеации бляшек 3pE Ae. В изобретении также предложены наборы и устройства, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, для применения в описанных способах.
Согласно конкретному аспекту, данное изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), HCDR2, HCDR3 и определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), LCDR2 и LCDR3, имеющие полипептидные последовательности:
a. SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
b. SEQ ID NO: 1, 7, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
c. SEQ ID NO: 1, 7, 3, 8, 5, и 6, соответственно;
d. SEQ ID NO: 1, 2, 3, 8, 5 и 6, соответственно;
e. SEQ ID NO: 56, 57, 3, 8, 5, и 6, соответственно;
f. SEQ ID NO: 56, 57, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
g. SEQ ID NO: 56, 58, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
h. SEQ ID NO: 56, 7, 3, 8, 5, и 6, соответственно;
i. SEQ ID NO: 1, 57, 3, 8, 5, и 6, соответственно;
j. SEQ ID NO: 56, 7, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
k. SEQ ID NO: 1, 57, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
l. SEQ ID NO: 1, 58, 3, 4, 5, и 6, соответственно; или
m. SEQ ID NO: 56, 2, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывает 3pE Ae, предпочтительно человеческий 3pE Ae.
Согласно еще одному конкретному аспекту изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или антигенсвязывающему фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19, 20 или 21, или вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 10, 12, 14, 18, 22, 53 или 55.
Согласно еще одному конкретному аспекту данное изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту по изобретению, содержащему:
l. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 22;
m. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 10;
n. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 12;
- 5 045911
о. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 13, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;
p. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;
q. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;
r. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;
s. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 17, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 18;
t. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 18;
u. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 53; или
v. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 55.
В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которые имеют полипептидные последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 58, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 2, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 1, 58, 3, 4, 5 и 6, соответственно. В еще одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 22, 53 или 55. Предпочтительно, выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 21; и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 22, 53 или 55.
В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которые имеют полипептидные последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 58, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 2, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 1, 58, 3, 4, 5 и 6, соответственно. В другом варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98, или 99% идентична SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98, или 99% идентична SEQ ID NO: 14. Предпочтительно, выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 20; и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14.
В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которые имеют полипептидные последовательности SEQ ID NO: 1, 7, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 57, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 7, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 1, 57, 3, 8, 5 и 6, соответственно. В другом варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98, или 99% идентична SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98, или 99% идентична SEQ ID NO: 18. Предпочтительно, выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 19; и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 18.
В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которые имеют полипептидные последовательности SEQ ID NO: 1, 7, 3, 4, 5 и 6, соответственно,
- 6 045911 или SEQ ID NO: 56, 57, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 7, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 1, 57, 3, 8, 5 и 6, соответственно. В другом варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 17, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 18. Предпочтительно, выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 17; и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 18.
В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие полипептидные последовательности SEQ ID NO: 1, 7, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 57, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 7, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 1, 57, 3, 8, 5 и 6, соответственно. В другом варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98, или 99% идентична SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98, или 99% идентична SEQ ID NO: 14. Предпочтительно, выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 16; и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14.
В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие полипептидные последовательности SEQ ID NO: 1, 7, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 57, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 7, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 1, 57, 3, 8, 5 и 6, соответственно. В другом варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98, или 99% идентична SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98, или 99% идентична SEQ ID NO: 14. Предпочтительно, выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 15; и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14.
В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие полипептидные последовательности SEQ ID NO: 1, 7, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 57, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 7, 3, 4, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 1, 57, 3, 8, 5 и 6, соответственно. В другом варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98, или 99% идентична SEQ ID NO: 13, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98, или 99% идентична SEQ ID NO: 14. Предпочтительно, выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 13; и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14.
В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие полипептидные последовательности SEQ ID NO: 1, 7, 3, 8, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 57, 3, 8, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 7, 3, 8, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 1, 57, 3, 8, 5 и 6, соответственно. В другом варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98, или 99% идентична SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей
- 7 045911 мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98, или 99% идентична SEQ ID NO: 12. Предпочтительно, выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 11; и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 12.
В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие полипептидные последовательности SEQ ID NO: 1, 7, 3, 8, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 57, 3, 8, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 56, 7, 3, 8, 5 и 6, соответственно, или SEQ ID NO: 1, 57, 3, 8, 5 и 6, соответственно. В другом варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98, или 99% идентична SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98, или 99% идентична SEQ ID NO: 10. Предпочтительно, выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 9; и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 10.
В еще одном конкретном аспекте выделенное моноклональное антитело содержит:
a. аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 37, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 38;
b. аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 39, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 38;
c. аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 37, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 52; или
d. аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 39, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 55.
Согласно еще одному конкретному аспекту изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту по изобретению, причем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является химерным.
Согласно другому конкретному аспекту изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту по изобретению, причем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным.
Согласно другому конкретному аспекту изобретение относится к антигенсвязывающим фрагментам, причем антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы фрагментов, состоящей из f Fv, F(ab'), F(ab')2 и scFv. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент избирательно связывается с пептидом 3pE Ae (например, Ae3pE-40 и Ae3pE-42) с небольшой перекрестной реактивностью или без перекрестной реактивности с другими пептидами Ae или белком-предшественником β-амилоида (APP).
В другом общем аспекте данное изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению. Специалистам в данной области техники будет понятно, что кодирующая последовательность белка может быть изменена (например, путем замены, делеции, вставки и т.п.) без изменения аминокислотной последовательности белка. Соответственно, специалистам в данной области техники будет понятно, что последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие моноклональные антитела по изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты, можно изменять без изменения аминокислотных последовательностей белков.
В другом общем аспекте данное изобретение относится к вектору, содержащему выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению. Можно использовать любой вектор, известный специалистам в данной области техники с учетом данного описания, такой как плазмида, космида, фаговый вектор или вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой рекомбинантный экспрессионный вектор, такой как плазмида. Вектор может включать любой элемент для обеспечения стандартной функции экспрессионного вектора, например промотор, элемент для связывания с рибосомой, терминатор, энхансер, селективный маркер и точку начала репликации. Промотор может быть конститутивным, индуцируемым или репрессируемым промотором. Ряд экспрессионных векторов, способных доставлять нуклеиновые кислоты в клетку, известны в данной области и могут быть использованы в настоящем изобретении для получения в клетке антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Для генерации рекомбинантного экспрессионного вектора по вариантам осуществления изобретения можно использовать традиционные клональные методы или синтез искусственных генов.
В еще одном общем аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей выделенную
- 8 045911 нуклеиновую кислоту, кодирующую моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению. В контексте настоящего описания для рекомбинантной экспрессии антител или их антигенсвязывающих фрагментов настоящего описания можно применять любую клетку-хозяин, известную специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева представляют собой клетки E. coli TG1 или BL21 (для экспрессии, например, scFv или Fab-антитела), клетки CHO-DG44, или CHO-K1, или клетки HEK293 (для экспрессии, например, полноразмерного антитела IgG). В соответствии с конкретными вариантами осуществления рекомбинантный вектор экспрессии трансформируют в клетки-хозяева традиционными способами, такими как химическая трансфекция, тепловой шок или электропорация, где он стабильно интегрируется в геном клетки-хозяина так, что рекомбинантная нуклеиновая кислота эффективно экспрессируется.
В другом общем аспекте данное изобретение относится к способу получения моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению, включающему культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в условиях для получения моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из клетки или клеточной культуры (например, из супернатанта). Экспрессированные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты можно собирать из клеток и очищать в соответствии с общепринятыми методиками, известными в данной области техники и как описано в данном документе.
В настоящем изобретении предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с 3pE Ae. Термин антитело в данном документе означает белок иммуноглобулин, способный связываться с антигеном или его частью, в частности белок иммуноглобулин, способный специфически связываться с 3pE Ae. Связывание антитела с антигеном может быть измерено при помощи способов, известных специалистам в данной области техники, примером которых является применение инструмента BIAcore™. Считается, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела специфически связываются с антигеном, если константа диссоциации меньше или равна 1 мкМ, предпочтительно меньше или равна 100 нМ и наиболее предпочтительно меньше или равна 10 нМ.
Термин антигенсвязывающие фрагменты антител относится к фрагменту антитела, который может связываться с антигеном, с которым интактное антитело связывается и конкурирует с интактным антителом за связывание с антигеном. Антигенсвязывающие фрагменты содержат часть интактного антитела, которая обеспечивает связывание антигена (т.е. вариабельную область интактного антитела). Антигенсвязывающие фрагменты могут включать, но не ограничиваясь этим, фрагмент Fab, Fab', F(ab')2, Fv, стабилизированный дисульфидом фрагмент Fv (dsFv), (dsFv)2, биспецифический dsFv (dsFv-dsFv'), одноцепочечную молекулу антитела (например, scFV), диатело, минитело, нанотело, линейное антитело, однодоменное антитело (HDAB), верблюжье однодоменное антитело, полиспецифическое антитело, образованное из фрагментов антитела, и любой другой фрагмент антитела, который связывается с антигеном, но не содержит структуру полного антитела.
Антитела состоят из двух тяжелых цепей и двух легких цепей. Каждая тяжелая цепь имеет один вариабельный домен или область (VH), за которой следует константный домен или область (CH1), шарнирная область и еще два константных домена или области (CH2 и CH3). Каждая легкая цепь имеет один вариабельный домен или область (VL) и один константный домен или область (CL). Вариабельные домены или области тяжелой и легкой цепей образуют паратоп антитела (структуру, аналогичную замку), который специфичен для конкретного эпитопа (аналогично ключу), что позволяет паратопу и эпитопу с точностью связываться друг с другом. В вариабельном домене вариабельные петли β-цепей, по три на легкой и тяжелой цепях, отвечают за связывание с антигеном. Эти петли называют определяющими комплементарность областями (CDR, а именно CDR1, CDR2 и CDR3).
CDR определяют как определяющие комплементарность области антитела. Это гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела, которые главным образом отвечают за связывание с антигеном. В каждой из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей имеются три CDR (CDR1, CDR2 и CDR3). Определяющие комплементарность области вариабельных областей легкой цепи альтернативно упоминаются как LCDR1, LCDR2 и LCDR3, а определяющие комплементарность области вариабельной области тяжелой цепи альтернативно упоминаются как HCDR1, HCDR2 и HCDR3. CDR антитела могут быть определены несколькими способами. Например, CDR в вариабельной области можно идентифицировать в соответствии с определениями по Kabat, Chothia, IMGT и/или конформационным определениям или любым способом определения CDR, хорошо известным в данной области техники. CDR антитела можно идентифицировать как гипервариабельные области, первоначально определенные Kabat (Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.), структурные петлевые структуры, первоначально описанные Chothia (Chothia et al., Nature 342:877883 (1989)) или уникальной системой нумерации IMGT (Lefranc, The Immunologist 7:132-136 (1999); Lefranc, et al., Nucleic Acids Res. 27:209-212 (1999); Scaviner et al., Exp. Clin. Immunogenet. 16:234-240
- 9 045911 (1999); Lefranc, et al., Nucleic Acids Res. 43:D413-422 (2015)).
Термин выделенное при использовании в контексте антитела означает измененное при помощи воздействия человека из любого естественного состояния; то есть, если оно встречается в природе, оно было изменено или удалено из своей первоначальной среды, или и то, и другое. Например, природное антитело природного происхождения, естественно присутствующие в живом животном в его естественном состоянии, не является выделенным, а то же антитело, отделенное от сопутствующих материалов в его естественном состоянии, является выделенным, согласно термину, использующемуся в данном документе, например, термин выделенное антитело может относиться к антителу, которое по существу не содержит других антител, имеющих разные значения антигенной специфичности (т.е. выделенное антитело, которое специфически связывается с 3pE Ae, по существу не содержит антител, которые не связываются с 3pE Ae). Антитела могут встречаться в композиции, такой как реагент для иммуноанализа, которая не является природной композицией, и при этом остаются выделенными антителами в рамках данного термина, используемого в данном документе.
Способы получения антител включают модификацию хозяина желаемым иммуногеном. Подходящие хозяева включают, но не ограничиваясь этим, мышей, крыс, хомяков, морских свинок, кроликов, кур, ослов, лошадей, обезьян, шимпанзе, орангутанов, горилл, людей и любых видов, способных формировать зрелый иммунный ответ. Процедуры иммунизации хорошо известны в данной области техники и изложены во множестве трудов и публикаций, включая The Immunoassay Handbook, 2nd Edition, edited by David Wild (Nature Publishing Group, 2000).
Предпочтительно иммуноген, воплощающий существенные признаки настоящего изобретения, вводят субъекту-хозяину, например, животному или человеку, в комбинации с адъювантом. Подходящие адъюванты включают, но не ограничиваясь этим, адъювант Фрейнда, порошковый гидроксид алюминия (квасцы), гидроксид алюминия вместе с Bordetella pertussis и монофосфориллипид A-синтетический дикориномиколят трегалозы (MPL-TDM).
Как правило, иммуноген или комбинацию иммуногена и адъюванта вводят в организм-хозяин млекопитающего путем одной или множества подкожных или внутрибрюшинных инъекций. Предпочтительно программу иммунизации выполняют в течение по меньшей мере одной недели, а более предпочтительно в течение двух или более недель. Поликлональные антитела, полученные таким образом, могут быть выделены и очищены способами, хорошо известными в данной области техники.
Моноклональные антитела могут быть получены с помощью хорошо известных гибридомных способов, описанных в публикации Kohler и Milstein, например, Nature 256:495-497 (1975). Гибридомные способы, как правило, включают иммунизацию хозяина или лимфоцитов от хозяина, сбор лимфоцитов, секретирующих или обладающих потенциалом к секреции моноклональных антител, слияние лимфоцитов с иммортализованными клетками и отбор клеток, секретирующих желаемое моноклональное антитело.
Хозяин может быть иммунизирован для стимуляции лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, специфические к иммуногену. В альтернативном варианте осуществления лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Если необходимы человеческие клетки, можно использовать лимфоциты периферической крови, хотя предпочтительными являются клетки селезенки или лимфоциты из других источников, относящихся к млекопитающим.
Лимфоциты могут быть слиты с иммортализованной линией клеток с образованием клеток гибридомы, что можно упростить путем применения агента для слияния, например, полиэтиленгликоля. В качестве иллюстрации можно использовать мутантные клетки миеломы грызунов, коровы или человека, иммортализованные путем трансформации. Предпочтительными являются по существу чистые популяции клеток гибридомы, в отличие от неслитых иммортализованных клеток. Таким образом, после слияния клетки можно выращивать в подходящей среде, которая ингибирует рост или выживаемость неслитых, иммортализованных клеток, например, с помощью клеток мутантной миеломы, в которых отсутствует фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT). В таком случае в среду (среду HAT) можно добавлять гипоксантин, аминоптерин и тимидин для предотвращения роста HGPRTдефицитных клеток, одновременно допуская рост гибридом.
Предпочтительно иммортализованные клетки, которые обеспечивают эффективное слияние, можно выделять из смешанных популяций путем отбора в среде, такой как HAT, и поддерживать стабильную и высокоуровневую экспрессию антитела после слияния. Предпочтительные иммортализованные линии клеток включают линии клеток миеломы, доступные в Американской коллекции типовых культур, г. Манассас, штат Вирджиния.
Один аспект данного изобретения представляет собой способ получения линии клеток гибридомы, способной продуцировать моноклональное антитело, которое связывается с пептидами бета-амилоида. Такие способы широко известны специалистам в данной области техники и по существу включают: (i) выбор хозяина для продукции антител; (ii) инокулирование хозяина желаемым иммуногеном; (iii) слияние линии клеток из инокулированного хозяина с непрерывно делящейся клеткой с образованием слитой клетки, способной продуцировать моноклональное антитело, которое связывается с иммуногеном; и (iv)
- 10 045911 клонирование слитой клетки для получения линии клеток гибридомы.
Способ по данному изобретению включает получение линии клеток гибридомы, способной продуцировать моноклональное антитело, которое связывается с пептидом 3pE Ae. Гибридому можно получать путем иммунизации животного, от которого можно получать гибридомы, например, мыши Balb/c, путем начальных внутрибрюшинных инъекций желаемых иммуногенов, например, пептида Ae, имеющего пироглутамат, в адъюванте Фрейнда, и последующих бустерных инъекций, например каждые одну - две недели. Последующее слияние выделенной селезенки может быть выполнено с использованием любых методик, общеизвестных обычным специалистам в данной области техники, предпочтительно с использованием клеток SP2/0 с помощью модифицированной процедуры, описанной в публикации Kohler и Milstein (Eur. J. Immunol., 1976; 6:292-295). Гибридомы могут быть подвергнуты скринингу для определения тех, которые продуцируют антитела, специфичные к пептидам 3pE Ae. Скрининг можно проводить с помощью стандартного анализа, такого как ИФА или РИА. Один аспект изобретения представляет собой способ получения линии клеток гибридомы, которая продуцирует моноклональное антитело BAMB31_1 или его гуманизированную версию.
Моноклональные антитела также могут быть получены рекомбинантными способами, известными в данной области техники, например, как описано в патенте США № 4166452. ДНК, кодирующая моноклональные антитела, может быть выделена и секвенирована с использованием стандартных процедур, например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые специфически связываются с генами тяжелой и легкой цепей антител мыши, предпочтительно для зондирования ДНК, выделенной из линий клеток гибридомы моноклональных антител, секретирующих антитела, специфические к Ae, имеющим пироглутамат.
Также могут быть получены фрагменты антител, содержащие специфические сайты связывания для пептидов бета-амилоида. Такие фрагменты включают, но не ограничиваясь этим, фрагменты F(ab')2, которые могут быть получены путем расщепления пепсином молекулы антитела, и фрагменты Fab, которые могут быть получены путем уменьшения дисульфидных мостиков фрагментов F(ab')2. Альтернативно могут быть сконструированы библиотеки экспрессии Fab, позволяющие быстро и легко идентифицировать моноклональные фрагменты Fab с желаемой специфичностью (Huse et al., Science 256:1270-1281 (1989)). Фрагменты антител Fab, Fv и ScFv можно экспрессировать и секретировать из Escherichia coli, что позволяет продуцировать большие количества этих фрагментов. Альтернативно, фрагменты Fab'-SH можно непосредственно выделять из E. coli и химически связывать с образованием фрагментов F(ab')2 (Carter et al., BioTechnology 10:163-167 (1992)). Другие способы получения фрагментов антител известны специалистам в данной области техники. Также предусмотрены одноцепочечные фрагменты Fv (scFv) (см., например, патенты США № 5761894 и 5587458). Фрагменты Fv и sFv являются единственным соединением с интактными связывающими сайтами, которые не содержат константных областей; таким образом, они, вероятно, будут демонстрировать сниженное неспецифическое связывание. Фрагмент антитела также может представлять собой линейное антитело, например, как описано в патенте США № 5642870.
Таким образом, целью изобретения является обеспечение выделенных моноклональных антител, экспрессируемых вышеупомянутыми клетками гибридомы, причем антитела способны специфически распознавать 3pE Ae. Выделенные моноклональные антитела могут быть экспрессированы клетками гибридомы или рекомбинантно.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению предпочтительно селективно связывается с 3pE Ae с низкой перекрестной реактивностью или без нее в отношении другого Ae, не имеющего 3pE, или белка-предшественника β-амилоида (APP). В частности, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению селективно связывается с пептидами Ae 3pE-40 (SEQ ID NO: 40 или SEQ ID NO: 45) и Ae 3pE-42 (SEQ ID NO: 51) с низкой перекрестной реактивностью или без нее в отношении других не содержащих 3pE пептидов Ae или APP.
В табл. 1 представлены аминокислотные последовательности антитела по изобретению. CDR вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, как определено по Kabat, Chothia и IMGT, представлены в виде отдельных последовательностей.
- 11 045911
Таблица 1
Последовательности моноклональных антител к 3pE Αβ
| мкАт | Область | SEQ ID NO: | Последовательность |
| ВАМВ31_1 | Тяжелая цепь | ||
| VH | 9 | EIQLQQSGPELVKPGTSVKVSCKASGHVFTSYD MYWVKQSHGKSLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFK GKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCAY YRYAMDYWGQGTSVTVSS | |
| HCDR1 Kabat | 1 | SYDMY | |
| HCDR1 АЬМ | 56 | GHVFTSYDMY | |
| HCDR2 Kabat | 7 | YIDSDNGDTSYNQKFKG | |
| HCDR2 АЬМ | 57 | DSDNGDTS | |
| HCDR3 | 3 | YRYAMDY | |
| Легкая цепь | |||
| VL | 10 | DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSNGKT YLTWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSG AGTDFTLKIIRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGG TKLEIK | |
| LCDR1 | 8 | KSSQSLLDSNGKTYLT | |
| LCDR2 | 5 | LVSKLDS | |
| LCDR3 | 6 | WQGTHFPYT | |
| ВАМВ31_2а | Тяжелая цепь | 23 | EIQLQQSGPELVKPGTSVKVSCKASGHVFTSYDMY WVKQSHGKSLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFKGKAT LTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCAYYRYAM DYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSS VTLGCLVKG YFPEPVTLTWNS GS LS S G VHTFP A VL QSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSnCNVAHPASSTKV DKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIK DVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVE VHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGK |
- 12 045911
| EFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPP PEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKT ELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERN SYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK | |||
| VH | 9 | EIQLQQSGPELVKPGTSVKVSCKASGHVFTSYDMY WVKQSHGKSLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFKGKAT LTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCAYYRYAM DYWGQGTSVTVSS | |
| HCDR1 Kabat | 1 | SYDMY | |
| HCDR1 AbM | 56 | GHVFTSYDMY | |
| HCDR2 Kabat | 7 | YIDSDNGDTSYNQKFKG | |
| HCDR2 AbM | 57 | DSDNGDTS | |
| HCDR3 | 3 | YRYAMDY | |
| Легкая цепь | 24 | DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSNGKT YLTWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSG AGTDFTLKIIRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGG TKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNN FYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDST YSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKS FNRNEC | |
| VL | 10 | DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSNGKT YLTWLLQRPGQSPKRLIYLVS KLDS GVPDRFTGS G AGTDFTLKIIRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGG TKLEIK | |
| LCDR1 | 8 | KSSQSLLDSNGKTYLT | |
| LCDR2 | 5 | LVSKLDS | |
| LCDR3 | 6 | WQGTHFPYT | |
| BAMB246 | Тяжелая | 25 | EIQLQQSGPELVKPGTSVKVSCKASGHVFTSYDMY |
- 13 045911
| цепь | WVKQSHGKSLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFKGKAT LTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCAYYRYAM DYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | ||
| VH | 9 | EIQLQQSGPELVKPGTSVKVSCKASGHVFTSYDMY WVKQSHGKSLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFKGKAT LTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCAYYRYAM DYWGQGTSVTVSS | |
| HCDR1 Kabat | 1 | SYDMY | |
| HCDR1 AbM | 56 | GHVFTSYDMY | |
| HCDR2 Kabat | 7 | YIDSDNGDTSYNQKFKG | |
| HCDR2 AbM | 57 | YIDSDNGDTS | |
| HCDR3 | 3 | YRYAMDY | |
| Легкая цепь | 26 | DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSNGKT YLTWLLQRPGQSPKRLIYLVS KLDS GVPDRFTGS G AGTDFTLKIIRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGG TKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YS LS STLTLS KAD YEKHKVYACE VTHQGLS SPVTK SFNRGEC | |
| VL | 10 | DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSNGKT |
- 14 045911
| YLTWLLQRPGQSPKRLIYLVS KLDS GVPDRFTGS G AGTDFTLKIIRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGG TKLEIK | |||
| LCDR1 | 8 | KSSQSLLDSNGKTYLT | |
| LCDR2 | 5 | LVSKLDS | |
| LCDR3 | 6 | WQGTHFPYT | |
| BAMB611 | Тяжелая цепь | 27 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQGLEWMGYIDSDNGDTSYNQKFKGR VTMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRY AMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| VH | 11 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQGLEWMGYIDSDNGDTSYNQKFKGR VTMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRY AMD YWGQGTLVT VS S | |
| HCDR1 Kabat | 1 | SYDMY | |
| HCDR1 AbM | 56 | GHVFTSYDMY | |
| HCDR2 Kabat | 7 | YIDSDNGDTSYNQKFKG | |
| HCDR2 AbM | 57 | YIDSDNGDTS | |
| HCDR3 | 3 | YRYAMDY | |
- 15 045911
| Легкая цепь | 28 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSNGKT YLTWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIKRT YAAPS VFIFPPSDEQLKS GT AS VVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQS GNS QES VTEQDS KDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC | |
| VL | 12 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSNGKT YLTWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIK | |
| LCDR1 | 8 | KS S QS LLDS NGKT YLT | |
| LCDR2 | 5 | LVSKLDS | |
| LCDR3 | 6 | WQGTHFPYT | |
| BAMB612 | Тяжелая цепь | 29 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQSPGQGLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFKGRV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| VH | 13 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQSPGQGLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFKGRV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM DYWGQGTLVTVSS | |
| HCDR1 Kabat | 1 | SYDMY |
- 16 045911
| HCDR1 AbM | 56 | GHVFTSYDMY | |
| HCDR2 Kabat | 7 | YIDSDNGDTSYNQKFKG | |
| HCDR2 AbM | 57 | YIDSDNGDTS | |
| HCDR3 | 3 | YRYAMDY | |
| Легкая цепь | 30 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLT WLQQRPGQS PRRLIYLVS KLDS G VPDRFS GS GS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC | |
| VL | 14 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIK | |
| LCDR1 | 4 | KSSOSLLDSRAKTYLT | |
| LCDR2 | 5 | LVSKLDS | |
| LCDR3 | 6 | WQGTHFPYT | |
| BAMB613 | Тяжелая цепь | 31 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQGLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFKGKV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ |
- 17 045911
| PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | |||
| VH | 15 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQGLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFKGKV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM DYWGQGTLVTVSS | |
| HCDR1 Kabat | 1 | SYDMY | |
| HCDR1 AbM | 56 | GHVFTSYDMY | |
| HCDR2 Kabat | 7 | YIDSDNGDTSYNQKFKG | |
| HCDR2 AbM | 57 | YIDSDNGDTS | |
| HCDR3 | 3 | YRYAMDY | |
| Легкая цепь | 30 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC | |
| VL | 14 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIK | |
| LCDR1 | 4 | KSSOSLLDSRAKTYLT | |
| LCDR2 | 5 | LVSKLDS | |
| LCDR3 | 6 | WQGTHFPYT | |
| BAMB614 | Тяжелая цепь | 32 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQGLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFKGRV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM |
- 18 045911
| DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCS VMHEALHNH YTQKS LS LS PGK | |||
| VH | 16 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQGLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFKGRV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM DYWGQGTLVTVSS | |
| HCDR1 Kabat | 1 | SYDMY | |
| HCDR1 AbM | 56 | GHVFTSYDMY | |
| HCDR2 Kabat | 7 | YIDSDNGDTSYNQKFKG | |
| HCDR2 AbM | 57 | YIDSDNGDTS | |
| HCDR3 | 3 | YRYAMDY | |
| Легкая цепь | 30 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPAS1SCKSSQSLLDSRAKT YLTWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIKRT VAAPS VFIFPPSDEQLKS GT AS VVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC | |
| VL | 14 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT |
- 19 045911
| KLEIK | |||
| LCDR1 | 4 | KSSOSLLDSRAKTYLT | |
| LCDR2 | 5 | LVSKLDS | |
| LCDR3 | 6 | WQGTHFPYT | |
| BAMB630 | Тяжелая цепь | 33 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVKQAPGQSLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFKGKV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKD YFPEPVT VS WNS GALTS GVHTFPA VL QS S GLYS LS S V VT VPS S S LGTQT YICN VNHKPS NTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCS VMHEALHNH YTQKS LS LS PGK |
| VH | 17 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVKQAPGQSLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFKGKV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM DYWGQGTLVTVSS | |
| HCDR1 Kabat | 1 | SYDMY | |
| HCDR1 AbM | 56 | GHVFTSYDMY | |
| HCDR2 Kabat | 7 | YIDSDNGDTSYNQKFKG | |
| HCDR2 AbM | 57 | YIDSDNGDTS | |
| HCDR3 | 3 | YRYAMDY | |
| Легкая цепь | 34 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLLQRPGQSPRRLIYLVS KLDS GVPDRFS GSGS |
- 20 045911
| GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC | |||
| VL | 18 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLLQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIK | |
| LCDR1 | 4 | KSSOSLLDSRAKTYLT | |
| LCDR2 | 5 | LVSKLDS | |
| LCDR3 | 6 | WQGTHFPYT | |
| BAMB631 | Тяжелая цепь | 35 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQSLEWMGYIDSDNGDTSYNQKFKGR VTLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYA MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| VH | 19 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQSLEWMGYIDSDNGDTSYNQKFKGR VTLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYA MDYWGQGTLVTVSS | |
| HCDR1 Kabat | 1 | SYDMY | |
| HCDR1 AbM | 56 | GHVFTSYDMY |
- 21 045911
| HCDR2 Kabat | 7 | YIDSDNGDTSYNQKFKG | |
| HCDR2 AbM | 57 | YIDSDNGDTS | |
| HCDR3 | 3 | YRYAMDY | |
| Легкая цепь | 34 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLLQRPGQSPRRLIYLVS KLDS GVPDRFS GSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC | |
| VL | 18 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLLQRPGQSPRRLIYLVS KLDS GVPDRFS GSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIK | |
| LCDR1 | 4 | KSSOSLLDSRAKTYLT | |
| LCDR2 | 5 | LVSKLDS | |
| LCDR3 | 6 | WQGTHFPYT | |
| BAMB623 | Тяжелая цепь | 36 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQSLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFKGKA TMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYA MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
- 22 045911
| VH | 20 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQSLEWIGYIDSDNGDTSYNQKFKGKA TMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYA MD YWGQGTLVT VS S | |
| HCDR1 Kabat | 1 | SYDMY | |
| HCDR1 AbM | 56 | GHVFTSYDMY | |
| HCDR2 Kabat | 7 | YIDSDNGDTSYNQKFKG | |
| HCDR2 AbM | 57 | YIDSDNGDTS | |
| HCDR3 | 3 | YRYAMDY | |
| Легкая цепь | 30 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIKRT VAAPS VFIFPPSDEQLKS GT AS VVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC | |
| VL | 14 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLT WLQQRPGQS PRRLIYLVS KLDS G VPDRFS GS GS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLE1K | |
| LCDR1 | 4 | KSSOSLLDSRAKTYLT | |
| LCDR2 | 5 | LVSKLDS | |
| LCDR3 | 6 | WQGTHFPYT | |
| BAMB674 | Тяжелая цепь | 37 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQGLEWIGYIDSDSGDTSYNQKFKGRV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM D YWGQGTLVT VS S AS TKGPS VFPLAPS S KS TS GGT AALGCLVKD YFPEPVT VS WNS GALTS GVHTFPA VL |
- 23 045911
| QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCS VMHE ALHNH YTQKS LS LS PGK | |||
| VH | 21 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQGLEWIGYIDSDSGDTSYNQKFKGRV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM DYWGQGTLVTVSS | |
| HCDR1 Kabat | 1 | SYDMY | |
| HCDR1 AbM | 56 | GHVFTSYDMY | |
| HCDR2 Kabat | 2 | YIDSDSGDTSYNQKFKG | |
| HCDR2 AbM | 58 | YIDSDSGDTS | |
| HCDR3 | 3 | YRYAMDY | |
| Легкая цепь | 38 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLK1SR VE AED V G V Y YC WQGTHFP YTFGGGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQS GNS QES VTEQDS KDSTY SLS STLTLS KAD YEKHKVYACE VTHQGLS SP VTKSF NRGEC | |
| VL | 22 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIK | |
| LCDR1 | 4 | KSSOSLLDSRAKTYLT |
- 24 045911
| LCDR2 | 5 | LVSKLDS | |
| LCDR3 | 6 | WQGTHFPYT | |
| BAMB675 | Тяжелая цепь | 39 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQGLEWIGYIDSDSGDTSYNQKFKGRV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| VH | 21 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQGLEWIGYIDSDSGDTSYNQKFKGRV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM DYWGQGTLVTVSS | |
| HCDR1 Kabat | 1 | SYDMY | |
| HCDR1 AbM | 56 | GHVFTSYDMY | |
| HCDR2 Kabat | 2 | YIDSDSGDTSYNQKFKG | |
| HCDR2 AbM | 58 | YIDSDSGDTS | |
| HCDR3 | 3 | YRYAMDY | |
| Легкая цепь | 38 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIKRT VAAPS VFIFPPSDEQLKS GT AS VVCLLNNF |
- 25 045911
| YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC | |||
| VL | 22 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KLEIK | |
| LCDR1 | 4 | KSSOSLLDSRAKTYLT | |
| LCDR2 | 5 | LVSKLDS | |
| LCDR3 | 6 | WQGTHFPYT | |
| BAMB700 | Тяжелая цепь | 37 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQGLEW1GYIDSDSGDTSYNQKFKGRV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM D YWGQGTLVT VS S AS TKGPS VFPLAPS S KS TS GGT AALGCLVKD YFPEPVT VS WNS G ALTS G VHTFPA VL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| VH | 21 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQGLEWIGYIDSDSGDTSYNQKFKGRV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM DYWGQGTLVTVSS | |
| HCDR1 Kabat | 1 | SYDMY | |
| HCDR1 AbM | 56 | GHVFTSYDMY | |
| HCDR2 Kabat | 2 | YIDSDSGDTSYNQKFKG |
- 26 045911
| HCDR2 AbM | 58 | YIDSDSGDTS | |
| HCDR3 | 3 | YRYAMDY | |
| Легкая цепь | 52 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQS GNS QES VTEQDS KDSTY SLS STLTLS KAD YEKHKVYACE VTHQGLS SP VTKSF NRGEC | |
| VL | 53 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGT KLEIK | |
| LCDR1 | 4 | KSSOSLLDSRAKTYLT | |
| LCDR2 | 5 | LVSKLDS | |
| LCDR3 | 6 | WQGTHFPYT | |
| BAMB701 | Тяжелая цепь | 39 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQGLEWIGYIDSDSGDTSYNQKFKGRV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| VH | 21 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHVFTSYDM YWVRQAPGQGLEWIGYIDSDSGDTSYNQKFKGRV TLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAYYRYAM |
- 27 045911
| DYWGQGTLVTVSS | |||
| HCDR1 Kabat | 1 | SYDMY | |
| HCDR1 АЬМ | 56 | GHVFTSYDMY | |
| HCDR2 Kabat | 2 | YIDSDSGDTSYNQKFKG | |
| HCDR2 АЬМ | 58 | YIDSDSGDTS | |
| HCDR3 | 3 | YRYAMDY | |
| Легкая цепь | 54 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKTSRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQS GNS QES VTEQDS KDSTY SLS STLTLS KAD YEKHKVYACE VTHQGLS SP VTKSF NRGEC | |
| VL | 55 | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSRAKT YLTWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGT KVEIK | |
| LCDR1 | 4 | KSSOSLLDSRAKTYLT | |
| LCDR2 | 5 | LVSKLDS | |
| LCDR3 | 6 | WQGTHFPYT |
Термины идентичный или процент идентичности в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей (например, антител к 3pE Ae и полинуклеотидов, которые их кодируют, полипептидов 3pE Ae и полинуклеотидов 3pE Ae, которые их кодируют), относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми при сравнении и выравнивании для определения максимального соответствия, как измерено с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуального осмотра.
Для сравнения последовательностей, как правило, одна последовательность выступает в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают испытуемую последовательность. При использовании алгоритма сравнения последовательностей в компьютер вводят испытуемую и эталонную последовательности, при необходимости определяют координаты подпоследовательности и определяют параметры программы алгоритма последовательности. Впоследствии алгоритм сравнения последовательностей рассчитывает процентную идентичность последовательности для испытуемой(-ых) последовательности(-ей) по отношению к эталонной последовательности на основе заданных параметров программы.
Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма локальной гомологии по Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), с использованием алгоритма выравнивания областей гомологии по Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), с помощью способа поиска подобия по Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., г. Мэдисон, штат Висконсин, США) или путем визуального контроля (см. в основном Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, совместное предприятие компаний Greene Publishing Associates, Inc. и John Wiley & Sons, Inc., (Дополнение, 1995) (Ausubel)).
Примерами алгоритмов, приемлемых для определения процентной идентичности последовательности и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, описанные в работе Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 и Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 соответственно. Программное обеспечение для проведения BLAST-анализов общедоступно
- 28 045911 через Национальный центр биотехнологической информации. Данный алгоритм включает, во-первых, идентификацию пар высококачественных последовательностей (HSP) путем идентификации коротких слов длиной W в искомой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому положительному пороговому показателю T при совмещении со словом той же длины в последовательности базы данных. T называют пороговым показателем сходства соседних слов (Altschul с соавт. выше). Эти начальные совпадения соседних слов действуют как образец для инициации поиска, чтобы найти более длинные HSP с ними. Совпадения слов затем расширяются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока совокупный показатель выравнивания можно увеличивать.
Совокупные баллы вычисляются с использованием параметров М для нуклеотидных последовательностей (балл вознаграждения для пары совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за не совпадающие остатки; всегда <0). Для аминокислотных последовательностей матрицу подсчета балов используют для расчета совокупного балла. Расширение зачетов слов в каждом направлении прекращает, когда: совокупный балл выравнивания падает на величину X от его максимального достигнутого значения; совокупный балл стремится к нулю или ниже вследствие накопления одного или более отрицательных баллов выравнивания остатков; или в конце каждой последовательности. Параметры W, T и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) по умолчанию используют длину слова (W), равную 11, ожидание (E), равное 10, M=5, N=-4, а также сравнение обоих цепей. Для аминокислотных последовательностей в программе BLASTP по умолчанию используют длину слова (W), равную 3, ожидание (E), равное 10, и матрицу замен BLOSUM62 (см., Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).
В дополнение к проценту идентичности последовательности, алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства двух последовательностей (см., например, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Одно измерение сходства, проводимое алгоритмом BLAST, заключается в определении наименьшей суммарной вероятности (P(N)), которая указывает на вероятность, при которой совпадение двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей будет происходить случайным образом. Например, нуклеиновая кислота считается аналогичной эталонной последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении исследуемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет менее около 0,1, более предпочтительно менее около 0,01, а наиболее предпочтительно менее около 0,001.
Дополнительным показателем по существу идентичности двух нуклеотидных последовательностей или двух полипептидов является иммунологическое перекрестное реагирование полипептида, кодируемого первой нуклеиновой кислотой, с полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, полипептид, как правило, по существу идентичен второму полипептиду, например, когда два пептида отличаются только консервативными заменами. Другим признаком по существу идентичности двух последовательностей нуклеиновых кислот является гибридизация этих двух молекул друг с другом в строгих условиях.
Способы in vitro.
Следует понимать, что предполагается применение всех способов иммунологических анализов с использованием антител или их антигенсвязывающих фрагментов в соответствии с предпочтительными на данный момент вариантами осуществления, включая анализы, в которых антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связаны с твердыми фазами, и анализы, в которых антитела находятся в жидкой среде. Способы иммунологических анализов, которые можно использовать для обнаружения аналитов с использованием антител, воплощающих существенные признаки настоящего изобретения, включают, без ограничений, конкурентные (ограниченные реагентами) анализы, в которых меченый аналит (аналог аналита) и аналит в образце конкурируют за антитела, и иммунометрические анализы с одним сайтом, в которых антитело является меченным; и т.п.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно изобретению можно использовать в обычных иммунологических методах для обнаружения Ae3pE, где бы он ни возник, включая биологические образцы для мониторинга связанных с β-амилоидом заболеваний, и кондиционированные среды из культуры клеток для мониторинга внутриклеточного процессинга APP. Подходящие иммунологические методы хорошо известны специалистам в данной области техники и включают, например, ИФА, вестерн-блоттинг, конкурентный или сэндвич-иммуноанализ и т.п., а также хорошо известны, все они зависят от образования иммунного комплекса антиген-антитело, причем с целью анализа антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть помечены с возможностью обнаружения, например, радио-, ферментативными, люминесцентными или флуоресцентными метками, или они могут быть иммобилизованы на нерастворимых носителях. Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение иммуноанализов для определения или обнаружения Ae3pE или его фрагмента в образце, при этом способ включает приведение образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом с Ae3pE или его фрагментом согласно изобретению и определение
- 29 045911 того, образован ли иммунный комплекс между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и Αβ3ρΕ или его фрагментом. Эти способы могут быть выполнены либо на образцах ткани, либо на образцах жидкостей организма и по существу включают получение образца из организма субъекта; приведение указанного образца в контакт с эффективным для визуализации количеством меченного с возможностью обнаружения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению; и обнаружение метки для установления в образце присутствия Ae3pE или его фрагментов. Способы измерения с использованием антител или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению не имеют конкретных ограничений. Можно использовать любой способ измерения при условии, что количество антител, антигенов или комплексов антиген-антитело соответствует количеству антигенов, в частности, количество Ae3pE или его фрагментов в оцениваемых растворах определяют химическими или физическими средствами и рассчитывают на основании стандартных кривых, полученных с использованием стандартных растворов, содержащих антигены в известных количествах. Например, целесообразно использовать нефелометрию, конкурентные методы, иммунометрические методы и сэндвич-методы. Что касается чувствительности и специфичности, особенно предпочтительно использовать сэндвич-методы.
В сэндвич-методах исследуемые растворы взаимодействуют с нерастворимыми антителами, такими как нерастворимые антитела к Ae3pE (первая реакция), далее реагируют с мечеными вторичными антителами (вторая реакция); затем анализируют активность метящих агентов на нерастворимых носителях, посредством чего можно определить количество Ae3pE или его фрагментов в исследуемых растворах. Первую реакцию и вторую реакцию можно проводить одновременно или последовательно.
В способах измерения в качестве метящих агентов используют метящие вещества, радиоизотопы, ферменты, флуоресцентные вещества, светящиеся вещества и т.д. Примеры радиоизотопов включают 125I, 131I, 3H и 14C. Ферменты, как правило, обнаруживают путем конъюгации соответствующего субстрата, который, в свою очередь, катализирует обнаруживаемую реакцию. Их примеры включают, например, бета-галактозидазу, бета-глюкозидазу, щелочную фосфатазу, пероксидазу и малатдегидрогеназу, предпочтительно пероксидазу хрена. К светящимся веществам относятся, например, люминол, производные люминола, люциферин, экворин и люцифераза. Кроме того, системы авидинбиотин также можно использовать для мечения антител и иммуногенов по настоящему изобретению. Когда иммуногены или антитела нерастворимы, можно использовать либо физическую адсорбцию, либо химическое связывание, как правило, для инактивации или фиксации белков или ферментов. Примеры носителей включают нерастворимые полисахариды, такие как агароза, декстран и целлюлоза, синтетические смолы, такие как полистирол, полиакриламид и силиконовые полимеры, и стекло.
В дополнительном варианте осуществления для обнаружения или диагностики связанных с βамилоидами заболеваний биологический образец, включающий ткань, биологические жидкости организма, такие как спинномозговая жидкость (СМЖ), кровь, плазма крови, сыворотка, моча и т.п., содержит и приводится в контакт с подходящим количеством первого антитела для продуцирования иммунного комплекса. Контакт, как правило, включает добавление образца к твердой матрице, покрытой первым антителом. Комплекс, полученный в результате приведения образца в контакт с первым антителом, отделяют от образца при помощи элюирования. Однако можно использовать и другие способы извлечения. Выделенный комплекс приводят в контакт по меньшей мере с одним вторым антителом, направленным на антигенную детерминанту на антигене и способным связывать антиген в комплексе. Антигенная детерминанта, на которую направлено второе антитело, может быть той же детерминантой, на которую направлено первое антитело из-за полиэпитопной природы антигенного фрагмента. Либо первое, либо второе антитело могут быть выполнены с возможностью обнаружения с использованием любой из меток, описанных выше. В предпочтительном варианте осуществления второе антитело является обнаруживаемым. Присутствие обнаруживаемого антитела, связанного с комплексом, состоящим из антигена, связанного с первым и вторым антителами, можно легко обнаружить с помощью известных в данной области методик. Путем сравнения результатов, полученных для биологического образца, с результатами, полученными для контрольного образца, можно определить наличие или уровни измененного Ae3pE или его фрагментов.
Способы in vivo.
Аспекты изобретения относятся к способу предотвращения, снижения интенсивности, лечения и/или уменьшения отложения бета-амилоидов при связанных с бета-амилоидами патологических состояниях, включающему введение требующему этого субъекту антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, в терапевтически эффективном количестве. Дополнительные аспекты изобретения включают фармацевтическую композицию для предотвращения, снижения интенсивности, лечения и/или уменьшения амилоидных отложений при связанных с бетаамилоидами патологических состояниях, причем указанная фармацевтическая композиция содержит антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе. Способы по настоящему изобретению включают введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества одного или более антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе.
- 30 045911
В одном аспекте изобретение относится к способам предотвращения, снижения интенсивности, лечения и/или уменьшения отложения бета-амилоидов при патологических состояниях, характеризующихся образованием бляшек, содержащих бета-амилоидный белок, у людей, причем способ включает введение, предпочтительно периферически, нуждающемуся в таком лечении человеку терапевтически или профилактически эффективного количества антитела согласно изобретению или его иммунореактивного фрагмента, которое специфически связывается с Ae3pE человека. В еще одном аспекте изобретение относится к способам ингибирования образования амилоидных бляшек и/или способам устранения амилоидных бляшек у людей, причем способ включает введение нуждающемуся в таком ингибировании или очистке субъекту-человеку эффективного количества антитела согласно изобретению, причем антитело связывает пептид Ae3pE в головном мозге и индуцирует клиренс измененного Ae3pE в головном мозге. В дополнительных аспектах изобретение относится к таким гуманизированным антителам, включая их иммуноэффективные области, и к способам их получения.
Субъект, нуждающийся в этом, представляет собой человека, страдающего или предрасположенного к патологическому состоянию, характеризующемуся образованием бляшек, содержащих бета-амилоидный белок. В одном варианте осуществления патологическое состояние представляет собой болезнь Альцгеймера. В других вариантах осуществления патологическое состояние представляет собой деменцию, связанную с трисомией 21 (синдром Дауна), болезнь диффузных телец Леви, миозит с включениями, церебральную амилоидную ангиопатию и наследственную церебральную геморрагию с амилоидозом голландского типа (HCHWA-D).
Гуманизированное антитело представляет собой антитело отличного от человека вида, белковые последовательности которого были модифицированы для увеличения их сходства с вариантами антитела, продуцируемыми естественным образом у людей. Как правило, белковая последовательность гуманизированного антитела по существу идентична последовательности человеческого варианта, за исключением нечеловеческого происхождения некоторых или всех его определяющих комплементарность областей (CDR), которые отвечают за способность антитела связываться со своим целевым антигеном. Каркасные области вариабельных областей заменяют соответствующими человеческими каркасными областями, оставляя нечеловеческие CDR по существу интактными. В некоторых случаях гуманизированные антитела действительно имеют небольшое количество замен в одной или более нечеловеческих областях CDR для сохранения аффинности связывания и/или константы диссоциации нечеловеческого антитела.
Гуманизированное антитело также относится к антителу, содержащему человеческий каркас, по меньшей мере один CDR нечеловеческого антитела, в котором любая константная область по существу идентична человеческой константной области иммуноглобулина, т.е. по меньшей мере на около 85, 90%, предпочтительно по меньшей мере около 95% или на 98% идентична. Таким образом, все части гуманизированного антитела, за исключением одной или более CDR, по существу идентичны соответствующим частям последовательности человеческого иммуноглобулина. Например, гуманизированный иммуноглобулин, как правило, не будет включать химерное антитело с мышиной вариабельной областью/человеческой константной областью.
Гуманизированные антитела обладают по меньшей мере тремя потенциальными преимуществами по сравнению с нечеловеческими и химерными антителами для применения в лечении человека: 1) поскольку эффекторная часть является человеческой, она может лучше взаимодействовать с другими частями иммунной системы человека (например, активировать микроглию для устранения бляшек); 2) человеческая иммунная система не должна распознавать каркасную или C-область гуманизированного антитела как чужеродную, и, следовательно, образование антител на такое введенное антитело должен быть меньше, чем на полностью чужеродное нечеловеческое антитело или частично чужеродное химерное антитело; и 3) вводимые нечеловеческие антитела, по имеющимся данным, имеют период полужизни в кровотоке человека, который короче периода полужизни человеческих антител.
В способе лечения и предотвращения патологических состояний, характеризующихся образованием бляшек, содержащих бета-амилоидный белок, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты (включая иммунореактивные фрагменты) по изобретению вводят субъекту, подверженному риску развития или проявляющему связанные с бета-амилоидом симптомы или патологию, такую как клиническая или доклиническая стадия болезни Альцгеймера, деменция, связанная с синдромом Дауна, или клиническая или доклиническая стадия амилоидной ангиопатии, с использованием стандартных методик введения. Предпочтительно введение осуществляется периферически (т.е. без введения в центральную нервную систему) путем внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, легочного, трансдермального, внутримышечного, интраназального, буккального, сублингвального введения или с использованием суппозитория. Хотя антитела или их связывающие фрагменты можно вводить непосредственно в желудочковую систему, спинномозговую жидкость или паренхиму головного мозга, и способы доставки в эти области хорошо известны в данной области техники, нет необходимости использовать эти более сложные процедуры. Антитела или их связывающие фрагменты по изобретению эффективны при введении более простыми техниками, которые зависят от системы периферического
- 31 045911 кровообращения. Преимущества настоящего изобретения включают способность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента оказывать благоприятные эффекты, даже если они не представлены непосредственно в самой центральной нервной системе.
Фармацевтические композиции для введения выполнены с возможностью соответствия выбранному способу введения, и фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как диспергирующие агенты, буферы, поверхностно-активные вещества, консерванты, солюбилизирующие агенты, изотонические агенты, стабилизирующие агенты и т.п., в зависимости от ситуации. Издание Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, последнее издание, включенное в данный документ посредством ссылки, предоставляет сборник методах изготовления, которые обычно известны практикующим врачам.
Особенно полезно изменять характеристики растворимости антител по изобретению, что делает их более липофильными, например, путем их инкапсуляции в липосомы или блокирования полярных групп.
Предпочтительной является периферическая системная доставка путем внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции. Подходящие носители для таких инъекций являются простыми. Однако, кроме того, введение также может осуществляться через слизистые оболочки с помощью назальных аэрозолей или суппозиториев. Приемлемые составы для таких способов введения хорошо известны и, как правило, включают поверхностно-активные вещества, которые облегчают перенос через мембрану. Такие поверхностно-активные вещества часто получают из стероидов или они представляют собой катионные липиды, такие как Н-[1-(2.3-диолеоил)пропил-'Н.'Н.'Нтриметиламмонийхлорид (DOTMA), или различные соединения, такие как холестерин гемисукцинат, фосфатидилглицерины и т.п.
Концентрация гуманизированного антитела в составах от около 0,1 до около 15 или 20 мас.% выбрана преимущественно на основании объемов жидкости, значений вязкости и т.п. в соответствии с конкретным выбранным способом введения. Таким образом, типичная фармацевтическая композиция для инъекций может содержать 1 мл стерильной воды с фосфатно-солевым буфером и 1-100 мг гуманизированного антитела по настоящему изобретению. Состав может быть стерилизован путем фильтрации после изготовления или иным образом сделан микробиологически приемлемым. Типичная композиция для внутривенной инфузии может иметь объем до 250 мл жидкости, такой как стерильный раствор Рингера, и концентрацию антител 1-100 мг на мл или более.
Для введения антитела доза находится в диапазоне от около 0,0001 до 100 мг/кг, предпочтительно от 0,01 до 75 мг/кг массы тела хозяина. Например, дозы могут составлять 0,02, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 20, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 или 75 мг/кг массы тела хозяина. В вариантах осуществления доза находится в диапазоне 0,01-10 мг/кг, или в диапазоне 0,1-15 мг/кг, или в диапазоне 0,1-20 мг/кг, или в диапазоне 0,1-30 мг/кг, или в диапазоне 0,1-40 мг/кг, или в диапазоне 0,1-50 мг/кг, или в диапазоне 0,1-60 мг/кг, предпочтительно по меньшей мере 1 мг/кг, по меньшей мере 5 мг/кг, по меньшей мере 10 мг/кг, по меньшей мере 20 мг/кг, по меньшей мере 30 мг/кг, по меньшей мере 40 мг/кг, по меньшей мере 50 мг/кг или по меньшей мере 60 мг/кг. В предпочтительном примере дозы могут составлять около 10 кг/мг, около 20 кг/мг, около 30 кг/мг, около 40 мг/кг, около 50 мг/кг, около 60 мг/кг или около 70 мг/кг. В особенно предпочтительном примере антитело вводят внутрибрюшинно в диапазоне доз от около 0,3 мг/кг до около 60 мг/кг. В иллюстративной схеме лечения антитело вводят внутрибрюшинно в дозе около 10 кг/мг, около 20 кг/мг, около 30 кг/мг, около 40 мг/кг, около 50 мг/кг или около 60 мг/кг.
Используемый в данном документе термин около, когда он относится к измеряемому значению, такому как количество, означает колебания в пределах от ±20% до ±0,1%, предпочтительно ±15% или ±10%, более предпочтительно ±5%, даже более предпочтительно ±1% и еще более предпочтительно ±0,5%, ±0,1%. ±0,05% или ±0,01% от указанного значения, если такие колебания допустимы.
Иллюстративная схема лечения включает введение один раз каждые две недели или один раз в месяц или один раз каждые 3-6 месяцев. В некоторых способах два или более моноклональных антитела с разной специфичностью связывания вводятся одновременно, в этом случае доза каждого вводимого антитела находится в пределах указанных диапазонов. Антитело, как правило, вводят несколько раз. Интервалы между однократными дозами могут быть недельными, месячными или годовыми. Интервалы также могут быть нерегулярными, что определяется измерением концентраций антитела к Αβ в крови у субъекта. Альтернативно, антитело можно вводить в виде композиции с замедленным высвобождением, и в этом случае требуется менее частое введение. Дозировка и частота варьируются в зависимости от периода полужизни антитела у пациента. В целом, человеческие антитела демонстрируют самый длительный период полужизни, за которым следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и нечеловеческие антитела.
Доза и частота введения могут варьироваться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактическом применении относительно малую дозу вводят с относительно редкими интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые субъекты продолжают получать лечение в течение оставшейся части жизни. В терапевтических сферах
- 32 045911 применения может потребоваться относительно высокая доза с относительно короткими интервалами до тех пор, пока прогрессирование заболевания не будет уменьшено или прекращено, и предпочтительно до тех пор, пока у субъекта не будет наблюдаться частичное или полное снижение интенсивности симптомов заболевания. После этого можно применять профилактическую схему.
В некоторых способах дозу вводят для достижения концентрации антитела в плазме 1-1000 мкг/мл, а в некоторых способах - 25-300 мкг/мл. Альтернативно, антитело можно вводить в виде композиции с замедленным высвобождением, и в этом случае требуется менее частое введение. Дозировка и частота варьируются в зависимости от периода полужизни антитела у субъекта.
Лечение антителом по изобретению может представлять собой самостоятельное лечение. В альтернативном варианте осуществления лечение антителом по изобретению может представлять собой один компонент или фазу схемы комбинированной терапии, в которой один или более дополнительных терапевтических агентов также применяют для лечения субъекта.
При использовании в терапии in vivo антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению вводят индивидууму в терапевтически эффективных количествах, например, количествах, которые уменьшают, устраняют или предотвращают образование β-амилоидных бляшек или улучшают когнитивные функции у субъектов с БА или другими связанными с β-амилоидом заболеваниями. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты вводят субъекту в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение, например, в виде болюса или непрерывной инфузии в течение определенного периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрицереброспинальным, подкожным, внутрисуставным, интрасиновиальным, интратекальным, пероральным, местным путем или путем ингаляции. Агенты по изобретению можно необязательно вводить в комбинации с другими агентами, которые по меньшей мере частично эффективны для лечения амилоидогенного заболевания. В случае Альцгеймера и связанных с ним патологических состояний, в которых амилоидные отложения происходят в головном мозге, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению можно вводить в комбинации с другими агентами, повышающими прохождение агентов по изобретению через гематоэнцефалический барьер.
В одном варианте осуществления изобретения антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению связываются с 3pE Ae в отложениях в виде бляшек. При связывании с 3pE Ae в отложениях в виде бляшек антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут индуцировать удаление бляшек. Индукция удаления бляшек может быть обусловлена активацией микроглии вокруг бляшек и дестабилизацией бляшек путем удаления стабильной формы Ae. Более того, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могут предотвращать активность нуклеации бляшек 3pE Ae. Возможное обогащение бляшек 3pE Ae по сравнению с васкулярным амилоидом может увеличить терапевтическое окно безопасности для иммунотерапии.
Наборы и устройства.
В настоящем изобретении предложены наборы и устройства, которые можно использовать в вышеупомянутых способах. Наборы и устройства предпочтительно содержат антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с 3pE Ae. Кроме того, наборы могут содержать реагенты и инструкционные материалы. Инструкции могут быть напечатаны, например, на бумаге и/или предоставлены на электронно-считываемом носителе. Альтернативно инструкции могут быть предоставлены путем направления пользователя на веб-сайт, например, указанный производителем или дистрибьютором набора.
Реагенты, включенные в наборы, составляющие предмет настоящего изобретения, могут поставляться во всех контейнерах таким образом, что активность различных компонентов по существу сохраняется, в то время как сами по себе компоненты по существу не адсорбируются или не изменяются материалами контейнера.
В одном варианте осуществления набор или устройство содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, предпочтительно очищенное антитело, более предпочтительно моноклональное антитело, еще более предпочтительно выделенные моноклональные антитела, которые связываются с пептидами 3pE Ae. В вариантах осуществления антитела экспрессируются клетками гибридомы.
Варианты осуществления
Вариант осуществления 1 представляет собой выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), HCDR2, HCDR3, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), LCDR2 и LCDR3, имеющие полипептидные последовательности:
a. SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
b. SEQ ID NO: 1, 7, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
c. SEQ ID NO: 1, 7, 3, 8, 5, и 6, соответственно;
d. SEQ ID NO: 1, 2, 3, 8, 5 и 6, соответственно;
e. SEQ ID NO: 56, 57, 3, 8, 5, и 6, соответственно;
- 33 045911
f. SEQ ID NO: 56, 57, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
g. SEQ ID NO: 56, 58, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
h. SEQ ID NO: 56, 7, 3, 8, 5, и 6, соответственно;
i. SEQ ID NO: 1, 57, 3, 8, 5, и 6, соответственно;
j. SEQ ID NO: 56, 7, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
k. SEQ ID NO: 1, 57, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
l. SEQ ID NO: 1, 58, 3, 4, 5, и 6, соответственно; или
m. SEQ ID NO: 56, 2, 3, 4, 5, и 6, соответственно;
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывает 3pE Ae, предпочтительно человеческий 3pE Ae.
Вариант осуществления 2 представляет собой выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19, 20, или 21, или вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 10, 12, 14, 18, 22, 53, или 55.
Вариант осуществления 3 представляет собой выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, содержащее:
a. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 22;
b. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 10;
c. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 12;
d. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 13, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;
e. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;
f. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;
g. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;
h. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 17, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 18;
i. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 18;
j. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 53; или
k. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 55.
Вариант осуществления 4 представляет собой выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-3, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является химерным.
Вариант осуществления 5 представляет собой выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-4, причем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным.
Вариант осуществления 6 представляет собой выделенное моноклональное антитело, содержащее:
a. аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO:37, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 38;
b. аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO:39, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 38;
c. аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO:37, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 52; или
d. аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO:39, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 54.
Вариант осуществления 7 представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому одному из вариантов осуществления 1-6.
Вариант осуществления 8 представляет собой вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту по варианту осуществления 7.
- 34 045911
Вариант осуществления 9 представляет собой клетку-хозяина, содержащую вектор по варианту осуществления 8.
Вариант осуществления 10 представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-6 и фармацевтически приемлемый носитель.
Вариант осуществления 11 представляет собой способ лечения патологического состояния, связанного с образованием бляшек, содержащих бета-амилоидный белок, у нуждающегося в этом субъекта, причем способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 1-6 или фармацевтической композиции по варианту осуществления 10.
Вариант осуществления 12 представляет собой способ по варианту осуществления 11, в котором патологическое состояние представляет собой болезнь Альцгеймера.
Вариант осуществления 13 представляет собой способ по варианту осуществления 11, в котором патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из деменции, связанной с трисомией 21 (синдром Дауна), болезни диффузных телец Леви, миозита с включениями, церебральной амилоидной ангиопатии и наследственной церебральной геморрагии с амилоидозом голландского типа (HCHWA-D).
Вариант осуществления 14 представляет собой способ уменьшения бляшек, связанных с болезнью Альцгеймера, у нуждающегося в этом субъекта, причем способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 1-6 или фармацевтической композиции по варианту осуществления 10.
Вариант осуществления 15 представляет собой способ предотвращения активности нуклеации 3pE Ae у нуждающегося в этом субъекта, причем способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 1-6 или фармацевтической композиции по варианту осуществления 10.
Вариант осуществления 16 представляет собой способ получения моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 1-6, включающий культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в условиях для получения моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
Вариант осуществления 17 представляет собой способ получения фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому одному из вариантов осуществления 1-6, при этом способ включает стадии, в которых: комбинируют моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с фармацевтически приемлемым носителем для получения фармацевтической композиции.
Примеры
Изобретение можно лучше понять в свете приведенных ниже примеров, не имеющих ограничительного характера.
Пример 1. Получение моноклональных антител и процесс гуманизации.
Трех мышей линии Balb/c (Janvier Labs) примировали H2N-pEFRHDSGC-COOH (Eurogentec) (SEQ ID NO: 47) в полном адъюванте Фрейнда (Sigma; г. Сент-Луис, штат Миссури). Пептиды получали путем сочетания пептидов через COH-концевой цистеиновый остаток с активированным малеимидом альбумином бычьей сыворотки (Life Technologies; г. Карлсбад, штат Калифорния) с использованием доступных в продаже наборов, таких как набор Imject Maleimide Activated BSA (Pierce; г. Рокфорд, штат Иллинойс) в соответствии с инструкциями производителя. Мышей стимулировали каждые две недели 100 мкг или 200 мкг связанного с BSA пептида, сначала в полном, а затем неполном адъюванте Фрейнда (Sigma).
Получение гибридомы и антител: для слияния отбирали мышь с самым высоким сывороточным титром, в то время как селезенки других мышей выделяли и замораживали в жидком азоте. На 4-й день перед слиянием или экстракцией селезенки всех мышей внутрибрюшинно стимулировали 100 мкг H2NpEFRHDSGC-COOH (SEQ ID NO: 47), связанного с BSA (Merck; г. Кенильворт, штат Нью-Джерси) в солевом растворе. Клетки селезенки мыши сливали с клетками SP2/0 (ATCC; г. Манассас, штат Вирджиния) с помощью модифицированной процедуры, описанной в публикации Kohler и Milstein (Euro. J. Immunol., 1976; 292-295). Гибридомы высевали в 30 96-луночных планшетов и через 10 дней проводили прямой ИФА по 0,5 мкг/лунка несвязанного пептида Ae 3pE-40 (AnaSpec; г. Фримонт, штат Калифорния). Положительные клетки тестировали на перекрестную реактивность (отсутствие) с 0,5 мкг/мл нанесенного пептида Ae1-40 (AnaSpec) и сразу же субклонировали.
После слияния 17 клонов дали положительную реакцию в прямом анализе ИФА с человеческим синтетическим пептидом Ae3pE-40 (SEQ ID NO: 40) и замораживали в жидком азоте.
Все гибридомы выращивали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone, Европа), добавки HFCS (2%) (Roche; Брюссель, Бельгия), 2% HT (Sigma), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (50
- 35 045911 мг/мл). Все продукты были доступны в продаже и приобретены у компании Life Technologies. Клетки инкубировали в увлажненном воздушном инкубаторе с 8% CO2.
Прямой ИФА для селекции антител: ИФА для скрининга, используемый для обнаружения описанных выше антител Ae 3pE-40, представлял собой прямой ИФА с 0,5 мкг/мл свободного человеческого пептида Ae 3pE-40 (SEQ ID NO: 40), наносимого в течение ночи при 4°C на плоскодонные 96-луночные микротитрационные планшеты NUNC Maxisorp (Life Technologies) в 50 мкл/лунка покрывающего буфера (10 мМ Tris, 10 мМ NaCl и 10 мМ NaN3, pH 8,5).
На следующий день планшеты блокировали 75 мкл/лунка 0,1% казеина (Merck) в PBS в течение 60 мин при комнатной температуре для уменьшения неспецифического связывания. Затем добавляли 50 мкл супернатанта гибридомы и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. После промывки связанные моноклональные антитела определяли при помощи 50 мкл/лунка овечьего антитела к IgG мыши, конъюгированного с пероксидазой хрена (Amersham-Pharmacia Biotech; Литтл Чалфонт, Соединенное Королевство) в течение 1 ч при 37°C. Оба реагента разводили в растворе 0,1% казеина/PBS. Планшеты промывали и 50 мкл раствора 0,42 мМ 3,5,3',5'-тетраметилбензидина (Biorad), 0,003% (об./об.) H2O2 (Biorad) в 100 мМ лимонной кислоты (Biorad; г. Геркулес, штат Калифорния). В качестве субстрата добавляли 100 мМ гидрофосфата натрия (pH 4,3) (Biorad). Реакции позволяли протекать максимум 15 минут на шейкере для планшетов при комнатной температуре, после чего развитие окраски останавливали добавлением 50 мкл/лунка 2н. H2SO4 (Merck), и планшеты считывали на микропланшетном ридере при 450 нм (Thermomax, Molecular Devices). Перекрестную реактивность выбранных моноклональных антител с полноразмерным человеческим свободным Ae 1-40 исследовали методом прямого ИФА, идентичным скрининговому анализу.
Из 17 реактивных к Ae3pE-40 клонов отобрали BAMB31_1 для дополнительного определения характеристик на основании аффинности и селективности (ср. примеры 2 и 3). Было определено, что данное антитело имеет тяжелую цепь изотипа IgG1 и мышиную легкую каппа-цепь. Хотя мышиный Fc IgG1 имеет всего 70% идентичности последовательности и 76% сходства последовательности с мышиным Fc IgG2a, эти изотипы имеют разную активность и белковые профили. По сравнению с мышиным IgG2a, мышиный IgG1 имеет меньшую эффекторную функцию мышиного Fc и функцию комплемента из-за более слабого связывания с мышиными рецепторами FcyRI, FcyRIII и FcyRIV и мышиным C1q. Считается, что изотип является наиболее близким к активности человеческого IgG1, мышиный IgG2a связывается с мышиными рецепторами FcyRI, FcyRIII и FcyRIV, и мышиный C1q, тем самым обладая активностью комплемента, антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) и антителозависимого клеточного фагоцитоза (АЗКФ), которая может способствовать устранению бляшек Ae.
Последовательность тяжелой цепи BAMB31 изменяли с мышиного IgG1 на мышиный IgG2a для получения BAMB31_2a. Сохранение реактивности после клонирования V-области подтверждали методами ППР, описанными ниже.
Процесс гуманизации: исходное антитело BAMB31_2a (mIgG2a) гуманизировали с использованием процедуры, аналогичной Singh, et. al. (MAb 2015; 7(4): 778-91), за исключением CDR-H2, который определяли в соответствии с определением AbM (Martin, A.C., PNAS 86: 9268-9277, 1989) для этой работы. Вкратце, определяющие комплементарность области (CDR) идентифицировали в мышиных исходных последовательностях. Эти последовательности сравнивали с человеческими зародышевыми линиями и отбирали четыре человеческие тяжелые цепи зародышевой линии и два человеческих каркаса легкой цепи зародышевой линии, в которые были привиты мышиные CDR. Человеческие J-сегменты для VL и VH каждого исходного антитела были выбраны путем сравнения мышиных и человеческих последовательностей J-сегментов, чтобы максимизировать идентичность последовательностей. Молекулярная модель области Fv исходного мкАт была создана в MOE (CCG; г. Монреаль, Канада) с использованием параметров по умолчанию. Полученную модель исследовали графически для определения положений каркаса, которые потенциально важны для связывания и/или стабильности антитела. Были созданы библиотеки антител, в которых в дополнение к привитым CDR эти положения имеют человеческие/мышиные двоичные комбинации. В библиотеках каждую цепь с привитыми мышиными CDR соединяли с противоположной мышиной исходной цепью. Таким образом, только одна цепь была адаптирована к человеческому каркасу, а обратные мутации были определены на основании связывания антигена. Затем гуманизированные VH и VL объединяли с получением конечных антителкандидатов.
Клоны библиотеки экспрессировали в виде Fab в E. coli и тестировали на связывание с пептидом посредством ИФА и сигналов, сравниваемых с полностью молекулой мышиного исходного антитела. Для секвенирования отбирали сигналы молекул, демонстрирующие связывание с более 80% молекулы мышиного исходного антитела. Анализировали последовательности, отбирали человеческие адаптированные тяжелые цепи и человеческие адаптированные легкие цепи для объединения и экспрессировали в виде моноклональных человеческих антител IgG1. Все гуманизированные пары VH/VL каждого антитела экспрессировали, очищали и оценивали на предмет связывания антигена, риска
- 36 045911 иммуногенности Epivax in silico, числа остатков, обратно мутировавших в мышиную последовательность, и биофизических свойств.
Результаты: для сохранения связывания исходного белка необходимо было обратно мутировать некоторые остатки мышиной последовательности. Сохранение связывания, риск иммуногенности Epivax in silico и биофизические свойства не зависели от количества обратных мутаций к мышиным последовательностям, а от того, в каких положениях находились обратные мутации в мышиную последовательность. Репрезентативные результаты определения характеристик мкАт к HFA, полученные в данном анализе, показаны в табл. 2 и 3.
Таблица 2
Примеры результатов определения характеристик BAMB31 к HFA
| Образец Диапазо н: | Общее кол-во остатков, которые обратно мутировали в мышиную последовательность 0-7 | Комбинирован ная оценка по V-области Epivax от -53,46 до 13,62 | ЭХ (% мономер а) 84-99 | KD (М) от 1.17Е-11 до 1.52Е-09 | Tonse t(°C) 53,962,5 | Tml (°C) 60,769,1 | Tagg (°C) 61,770,6 |
| ВАМВ24 6 | Н/П | 5,25 | 96 | 1.39Е-11 | 60,7 | 67,4 | 69,4 |
| ВАМВ61 1 | 0 | -53,46 | 97 | 1.52Е-09 | 62,5 | 69,1 | 70,6 |
| ВАМВ61 2 | 4 | -20,77 | 98 | 1.17Е-11 | 62,1 | 66,7 | 67,6 |
| ВАМВ61 3 | 4 | -39,59 | 97 | 1.82Е-11 | 59,3 | 65,4 | 66,4 |
| ВАМВ61 4 | 3 | -39,77 | 98 | 1.60Е-11 | 61,8 | 66,6 | 67,6 |
| ВАМВ63 0 | 7 | -13,88 | 98 | 3.83Е-11 | 58,4 | 64,6 | 64,7 |
| ВАМВ63 1 | 4 | -14,31 | 97 | 1.80Е-11 | 58,8 | 64,4 | 65,0 |
| ВАМВ62 3 | 5 | -31,47 | 84 | 1.83Е-11 | 54,8 | 62,0 | 62,7 |
Исходная химера человеческого IgG1 BAMB246.
Значения за пределами желаемого диапазона выделены жирным шрифтом: Общее количество остатков, который обратно мутировали в мышиную последовательность >5; Баллы риска по Epivax для HC и LC >-10; Комбинированные баллы риска по Epivax >-20; Значения % мономера по ЭХ <95% kd (1/с) >>1.00E-04; Значения KD (M) >2.50E-11; Tonset (°C) <60; Tm1 (°C) <65; Tagg (°C) <65.
Снижение риска посттрансляционной модификации: исходное антитело и адаптированные к человеческому каркасу варианты содержали мотив с пострансляционной модификацией деамидированием NG в HCDR2. Для решения этой потенциальной проблемы были созданы отдельные библиотеки для остатков N и G с использованием вырожденных олигонуклеотидов. В результате были созданы новые последовательности, в которых случайным образом вводили все 20 аминокислот для каждого положения. Каждую библиотеку проверяли на предмет сохранения связывания. Для секвенирования были отобраны варианты антител, демонстрирующих связывание, подобное связыванию исходных мышиных антител.
Результаты: после секвенирования мутанты с заменами с N на S и с N на G имели сопоставимое связывание с исходным мутантом. Перспективные варианты к HFA были клонированы и экспрессированы как IgG1 дикого типа (BAMAB674) и IgG1 с точечными мутациями M37Y, S39T и T41E в области Fc (нумерация основана на последовательностях константной области тяжелой цепи Fc
- 37 045911
IgG1 в GenBank, номер доступа AEV43323), был обозначен как +YTE IgG1 (BAMB675). Известно, что такие мутации повышают аффинность к FcRn и увеличивают период полужизни в кровотоке (Properties of Human IgG1s Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn), Dall'Acqua WF., JBC, 2006). Характеристики BAMB674 и BAMB675 показаны в табл. 3.
Таблица 3 Характеристики BAMB674 и BAMB675
| Свойства | ВАМВ674 | ВАМВ675 |
| Изотип | IgGl ДТ | +YTE IgGl |
| FWHC | IGHV 1-46*03 | IGHV 1-46*03 |
| В положениях FW НС необходимы мышиные остатки | M48I, M70L | M48I, M70L |
| Уменьшение мотивов NG CDR2 НС | N55S | N55S |
| FWLC | IGKV2-30*01 | IGKV2-30*01 |
| В положении FW LC необходим мышиный остаток | V109L | V109L |
| Уменьшение мотивов NG CDR1 LC | NG—>RA | NG—>RA |
| KD (пМ) | 25,4 | 25,7 |
| Tonset | 62,9 °C | 57,7 °C |
| Tml | 67,3 °C | 64,1 °C |
| Tagg | 68,4 °C | 67,7 °C |
| % Мономера по ЭХ | 97 | 98 |
| Стабильность при высокой концентрации >2 недель | >100 мг/мл | >100 мг/мл |
Таблица 3a Т ермостабильность
| Образец | Tonset (°C), средн. знач. | Tml (°C), средн, знач. | Tagg (°C), средн, знач. | Tonset, станд. откл. | Tml, станд. откл. | Tagg, станд.откл. |
| Контрольное мкАт | 63,8 | 69,8 | 80,6 | 0,092 | 0,016 | 0,001 |
| ВАМВ700 | 61,4 | 67,4 | 70,5 | 0,228 | 0,178 | 0,168 |
| ВАМВ701 | 59,1 | 65,2 | 69,5 | 0,263 | 0,155 | 0,559 |
| ВАМВ674* | 62,9 | 67,3 | 68,4 | - | - | - |
* N=1.
Пример 2: Исследование термостабильности.
Для вариантов BAMB31 с адаптированным человеческим каркасом термостабильность оценивали с помощью нанодифференциальной сканирующей флуориметрии (NanoDSF) для измерения начала температуры плавления (Tonset), температуры первого фазового перехода плавления (Tm1) и температуры первоначального обнаружения агрегации (Tagg). Данные для некоторых вариантов приведены в табл. 2 (столбцы 6-8), табл. 3 (строки 10-12) и табл. 3a.
Материалы и способы: термостабильность образца определяют с помощью автоматического прибора Promeeus. Измерения проводят путем загрузки образца в 24-капиллярную матрицу из 384луночного планшета для образцов. Для каждого образца выполняют повторные измерения. Пользовательский интерфейс Promeeus NanoDSF (вкладка Melting Scan) используется для настройки экспериментальных параметров анализа. Термическое сканирование типичного образца IgG охватывает диапазон от 20 до 95°C со скоростью 1,0°С/мин. Типичная концентрация образцов находится в диапазоне от 0,3 до 1 мг/мл. Собственную флуоресценцию молекулы при 330 и 350 нм используют для отслеживания разворачивания во время линейного изменения температуры и регистрируют в виде изменения интенсивности флуоресценции в зависимости от времени. Это называется результатами термического сканирования (Tm). Параллельно с этим, используя технологию обратного отражения, прибор определяет начало агрегации (Tagg) в течение линейного изменения температуры. Таким образом, метод NanoDSF позволяет одновременно измерить конформационную и коллоидную
- 38 045911 стабильность перспективных кандидатов, которые часто отслеживают в качестве показателей долгосрочной стабильности образца в различных условиях.
Пример 3. Оценка риска иммуногенности Epivax in silico.
Для прогнозирования связывания ГКГС класса II использовали программное обеспечение EpiMatrix (EpiVax Inc.) для проведения in silico анализа V-областей мкАт к Ae 3pE. Программное обеспечение анализирует последовательные 9-меры аминокислот для идентификации потенциальных последовательностей связывания HLA класса II. База данных включает наиболее распространенные типы HLA, охватывающие приблизительно 95% человеческой популяции. Если рецептор HLA антигенпрезентирующей клетки связывает пептидный агретоп, тогда другая сторона этого пептида (эпитоп) может связывать эффекторные Т-клетки или регуляторные Т-клетки, что, в свою очередь, может привести к стимуляции или подавлению иммунного ответа против белка, несущего этот эпитоп. Программное обеспечение генерирует балл связывания агретопа, который может быть скорректирован с учетом спрогнозированного связывания регуляторных Т-клеток. Баллы нормализованы относительно размера белка и количества событий связывания, что дает выходные данные, указывающие на прогнозируемую иммуногенность белка.
Пример 4. Аналитическая характеристика очищенных мкАт.
Концентрацию белка для каждого очищенного мкАт определяли путем измерения оптической плотности при 280 нм на спектрофотометре NanoDrop1000 или многоканальном спектрофотометре Trinean DropSense96 и рассчитывали с использованием коэффициента экстинкции, основанного на аминокислотной последовательности.
ЭХ-ВЭЖХ очищенных антител выполняли, прогоняя образцы на колонке TOSOH TSKgel BioAssist G3SWxl в 0,2 M натрия фосфата, pH 6,8 при 1 мл/мин на Waters Alliance HPLC в течение 20 мин. Элюат контролировали по поглощению при 280 нм. Последовательности показаны в табл. 2 и 3.
Пример 5. Измерение кинетики связывания и аффинности.
Поверхностный плазмонный резонанс (ПИР) представляет собой метод безмаркерного обнаружения, используемый для исследования биомолекулярных взаимодействий. Контроль небольших изменений массы на поверхности сенсора, при этом данный прямой анализ связывания в реальном времени обеспечивает качественные и количественные данные о взаимодействии между биомолекулами; т.е. определение равновесных констант связывания (аффинность, KD) и кинетических констант скорости (ka/kd; скорость ассоциации комплекса ka и скорость диссоциации комплекса kd). Этот способ можно использовать в исследованиях взаимодействий белок-белок и белок-нуклеиновая кислота, а также взаимодействий между белками и малыми молекулами. В данном случае исследовали взаимодействия между 3pE-специфическими антителами и человеческими пептидами Ae3pE-40 (SEQ ID NO: 40) или Ae3pE-28 (SEQ ID NO: 42), человеческими пептидами Αβ1-40 (SEQ ID NO: 41) или Αβ1-28 (SEQ ID NO: 43) и пептидами Ae3pE-28 грызуна (SEQ ID NO: 45 и 46).
Материалы и способы.
ПНР: набор для захвата антител мыши от GE Healthcare использовали для исследования аффинности BAMB31_2a (mIgG2a) в отношении пептида Ae—3pE-40 (SEQ ID NO: 40). В качестве контрольных антител включали J&JPRD/Ae/pE3/1 mIgG2a (описанные в публикации патента США № 2018/0142011) и mE8c mIgG2a (описанные в US9944696 и US8679498). Иммобилизацию антимышиного антитела выполняли посредством сочетания с аминогруппой на сенсорном чипе CM5 в соответствии с протоколом производителя. Затем представляющее интерес антитело (1 мкг/мл) захватывали антимышиным антителом до уровня 300 RU с последующей инъекцией человеческого пептида Αβ 3pE40 (SEQ ID NO: 40) в различных концентрациях (3,125 нМ, 6,25 нМ, 12,5 нМ, 25 нМ и 50 нМ), разведенного в подвижном буфере (20 мМ фосфатного буфера с 2,7 мМ KCl, 137 мМ NaCl и 0,05% поверхностно-активного вещества P20 (Tween™ 20)). Поверхность регенерировали 10 мМ глицина гидрохлоридом при pH 1,7 в течение по меньшей мере 180 с и дополнительных 60 с. В качестве отрицательного контроля использовали человеческий пептид Αβ (1-40) (SEQ ID NO: 41).
Измерения аффинности проводили с помощью оптического биосенсора T200 (Biacore®). Кинетический анализ проводили в соответствии с моделью связывания с аппроксимацией 1:1 с помощью программного обеспечения Biacore T200 Evaluation Software (версия 2.0).
В некоторых случаях аффинность связывания и специфичность мкАт к Αβ 3pE измеряли методом ППР, выполняемого с использованием различных инструментов (Biacore T200, Biacore 8K или MASS-2 (Biacore, Inc.)) и поверхностей биосенсора, содержащего антитела к человеческому или мышиному иммуноглобулину. Антитела к человеческому или мышиному иммуноглобулину ковалентно связывали с поверхностью сенсорных чипов CM4 или CM5 (GE Healthcare), используя инструкции изготовителя по химии сочетания с аминогруппой. Представляющие интерес антитела захватывали сенсорным чипом, содержащим антитела к человеческому или мышиному иммуноглобулину, в концентрации 300-400 RU с последующей инжекцией пептидов или белков Αβ (примеры: человеческий Αβ 3pE-40 (SEQ ID NO: 40), Αβ 3pE-28 (SEQ ID NO: 42), рандомизированный Αβ 3pE-28 (SEQ ID NO: 44), Αβ 1-28 (SEQ ID NO: 43), мышиный Αβ 3pE-28 (SEQ ID NO: 46) или фибронектин) в различных концентрациях в буферном
- 39 045911 солевом растворе HEPES, содержащем 0,005% поверхностно-активного вещества P20 (Tween™ 20). Поверхность регенерировали путем 2 импульсных инжекций 30 мкл 10 мМ Gly pH 1,5 при 100 мкл/мин. Приведенные данные представляют собой разность сигнала ППР между проточной ячейкой, содержащей захваченное антитело и эталонной ячейкой, не содержащей захваченного антитела. Дополнительно погрешность, вносимую прибором в сигнал, устраняли, вычитая данные пустой инжекции из сигнала с вычтенным эталонным сигналом. Если применимо, данные анализировали, аппроксимируя фазы ассоциации и диссоциации при всех концентрациях (глобальная аппроксимация) моделью связывания 1:1, используя программное обеспечение Biaevaluation (Biacore, Inc.). В противном случае данные оценивали качественно на наличие/отсутствие связывания.
Иммуногистохимический анализ фиксированного формалином и залитого парафином головного мозга: для иммуногистохимического анализа после депарафинизации и повторной гидратации срезов проводили извлечение антигена посредством инкубации микропрепаратов головного мозга трансгенных мышей в течение 10 мин в муравьиной кислоте (70% в дистиллированной воде) и блокировали активность эндогенной пероксидазы с помощью 3% пероксида водорода (DAKO; г. Глоструп, Дания, S2023). Срезы инкубировали в течение 1 ч с BAMB674, BAMB675, hE8L, R17L, R17, CI-C7, B12L, антителом I или антителом II (последние семь антител были ранее описаны в US9944696B2 и US8679498B2) в различных концентрациях (рабочая концентрация: 2, 0,1-0,05-0,025 мкг/мл) в разбавителе антитела с компонентами снижения фоновой окраски (DAKO, S3022)). После интенсивной промывки меченное ПХ человеческое вторичное антитело (PI-3000, Vector labs; Бурлингейм, Калифорния - 1/500 в разбавителе антител (DAKO, S0809)) наносили на микропрепараты в течение 1 ч с последующим хромогенным мечением 3,3-диаминобензидином (DAB) (DAKO, K3468). Микропрепараты подвергали контрокрашиванию гематоксилином, дегидратировали и переводили в постоянный препарат путем заключения в Vectamount (H-5000, Vector Labs).
Результаты: кинетический анализ моноклонального антитела BAMB31_2a (mIgG2a) подтвердил аффинность связывания с пептидом Ae3pE-40 (SEQ ID NO: 40). При применении пептида Ae1-40 человека (SEQ ID NO: 41) в концентрациях до 50 нМ не было обнаружено связывания. Сенсограмма (кинетика единичного цикла), демонстрирующая связывание BAMB31_2a (mIgG2a) с пептидом Ae3pE40 человека (SEQ ID NO: 40), проиллюстрирована На фиг. 1. В качестве молекул для сравнения в одном и том же анализе оценивали J&JPRD/Ae/pE3/1 mIgG2a и mE8c mIgG2a (фиг. 2), а BAMB31 по сравнению с mE8c и J&JPRD/Ae/pE3/1 продемонстрировало более высокую аффинность. Равновесная константа связывания (аффинность, KD) и кинетические константы скорости (ka/kd) показаны в табл. 4.
Таблица 4
Кинетика J&JPRD/Ae/pE3/1, BAMB31 и mE8c mIgGa
| Образец | ka (1/М*с) | kd (1/с) | KD (пМ) | |
| J&JPRD/A3/pE3/l (mIgG2a) | Среднее | 1.12Е+05 | 9.37Е-05 | 853 |
| Станд. откл. | 1.48Е+04 | 1.53Е-05 | 201 | |
| ВАМВ31 (m!gG2a) | Среднее | 9.30Е+05 | 4.94Е-05 | 53 |
| Станд. откл. | 6.01Е+03 | 3.97Е-06 | 5 | |
| mE8c (m!gG2a) | Среднее | 3.36Е+05 | 3.20Е-05 | 96 |
| Станд. откл. | 1.05Е+04 | 7.27Е-06 | 25 |
Кинетический анализ мкАт к HFA BAMB31 (BAMB674 и BAMB675) при снижении риска деамидирования NG CDR2 HC показал сохраненную аффинность связывания с пептидом Ae3pE-28 (SEQ ID NO: 42) по сравнению с исходным антителом BAMB31_2a (mIgG2a) и исходным антителом BAMB246 (химера IgG1 человека). Равновесная константа связывания (аффинность, KD) и кинетические константы скорости (ka/kd) показаны в табл. 5.
По сравнению с ранее описанными гуманизированными 3pE-специфическими антителами hE8L, R17L, R17, CI-C7, B12L, антителом I и антителом II (ранее описанными в US 9944696 B2 и US 8679498 B2), аффинности данных молекул BAMB31 к HFA выше, как показано в табл. 5.
- 40 045911
Таблица 5
Кинетика связывания 3pE Αβ для молекул BAMB31 к HFA и mE8c к HFA
Образец N ka (1/М*с) kd (1/с) KD (пМ)
| ВАМВ675 ВАМВ674 | 9 9 | 3.24Е+06 3.27Е+06 | 8.24Е-05 8.32Е-05 | 25,7 25,4 |
| ВАМВ246 (человеческое химерное исходное | 9 | 3.53Е+06 | 4.42Е-05 | 12,6 |
| антитело) ВАМВЗ 1_2а (исходный | 1 | 2.89Е+06 | 7.97Е-05 | 27,5 |
| m!gG2a) Антитело I | 5 | 9.86Е+05 | 1.84Е-04 | 228,0 |
| Антитело II | 5 | 1.43Е+06 | 1.02Е-04 | 82,0 |
| B12L | 1 | 2.81Е+05 | 1.25Е-04 | 445,0 |
| С1-С7 | 2 | 1.46Е+05 | 2.63Е-04 | 1810 |
| hE8L | 2 | 5.07Е+05 | 6.36Е-05 | 127,0 |
| R17L | 2 | 3.21Е+05 | 3.31Е-04 | 1030 |
| R17 | 2 | 1.28Е+05 | 7.43Е-04 | 5800 |
| Человеческое химерное | 4 | 7.02Е+05 | < 6.44е-5 | <78,0 |
| шЕ8с Исходное mIgG2a mE8c | 4 | 7.25Е+05 | < 6.46е-5 | <89,0 |
Человеческие химерные антитела имеют мышиные вариабельные области в константной области IgG1 человека.
Таблица 5 a
Сравнение аффинности связывания
| Образец | ka (1/М*с) | kd (1/с) | KD(M) |
| ВАМВ700 | 2.88Е+06 | 9.86Е-06 | 3.42Е-11 |
| ВАМВ701 | 3.01Е+06 | 9.47Е-05 | 3.14Е-11 |
| ВАМВ674 | 3.39Е+06 | 1.36Е-04 | 4.01Е-11 |
| ВАМВ675 | 3.74Е+06 | 1.66Е-04 | 4.43Е-11 |
| Контрольное мкАт | 4.11Е+06 | 1.56Е-04 | 3.79Е-11 |
Диапазон концентраций HU-3pE-бета-амилоид от 0,6 до 4,5 нМ.
Более высокая аффинность, измеренная методом ППР, также приводила к улучшению связывания бляшек. Выполняли серию разведений первичных антител посредством иммуногистохимического анализа на срезах головного мозга трансгенной мыши. Все антитела давали видимое мечение бляшек в концентрации 2 мкг/мл, хотя и в разной степени. При концентрации 0,1 мкг/мл антитела CI-C7 и R17L не давали видимого мечения бляшек в соответствии с низкой аффинностью, измеренной методом ППР. При концентрации 0,05 мкг/мл BAMB674 и BAMB675 демонстрируют мечение бляшек, в то время как мечение бляшек в данной концентрации визуально отсутствует для молекул для сравнения (фиг. 3). При концентрации 0,025 мкг/мл видимое мечение бляшек (почти полностью) отсутствует для всех протестированных молекул.
В заключение можно отметить, что данные иммуногистохимического анализа подтверждают данные ППР, демонстрирующие более высокую аффинность BAMB674 и BAMB675 по сравнению с молекулами для сравнения.
BAMB246 (химера IgG1 человека) и существующие мкАт к HFA BAMB31 (BAMB674 и BAMB675) имели >3 логарифма селективности по отношению к высокогомологичному мышиному пептиду Ae 3pE28 (SEQ ID NO: 46) и >5 логарифмов селективности по отношению к фибронектину, пептиду Ae 1-28 (SEQID NO: 43) и пептиду Ae 3pE-28 с рандомизированными аминокислотами 3-9 (рандомизированный 3pE-28) (SEQ ID NO: 44). Результаты селективности и равновесная константа связывания (аффинность, KD) и кинетические константы скорости (ka и kd) для родственных пептидов и белка показаны в табл. 6.
- 41 045911
Таблица 6
Кинетика селективного связывания BAMB246 (химера IgG1 человека) и мкАт, к HFA с родственными мишенями
Образец Пептид/белок ka (1/М*с) kd (1/с) Kd (М) Кратность селективност и
| мышиный Αβ ЗрЕ-28 | 1.02Е+04 4.04Е-04 | 3.96Е-08 | 3143 | |
| BAMB24 | фибронектин | отсутствие связывания до 1,2 мкМ | >1.20Е- 06 | >95000 |
| 6 | человеческий Αβ 1 -28 | отсутствие связывания до 1,2 мкМ | >1.20Е- 06 | >95000 |
| Рандомизированный | отсутствие связывания до 1,2 | >1.20Е- | ||
| ЗрЕ-28 | мкМ | 06 | >95000 | |
| мышиный Αβ ЗрЕ-28 | 7.40Е+03 3.38Е-04 | 4.55Е-08 | 1791 | |
| BAMB67 | фибронектин | отсутствие связывания до 1,2 мкМ | >1.20Е- 06 | >47000 |
| 4 | человеческий Αβ 1-28 | отсутствие связывания до 1,2 мкМ | >1.20Е- 06 | >47000 |
| Рандомизированный | отсутствие связывания до 1,2 | >1.20Е- | ||
| ЗрЕ-28 | мкМ | 06 | >47000 | |
| мышиный Αβ ЗрЕ-28 | 4.68Е+03 З.ЗЗЕ-04 | 7.75Е-08 | 3014 | |
| BAMB67 | фибронектин | отсутствие связывания до 1,2 мкМ | >1.20Е- 06 | >46000 |
| 5 | человеческий Αβ 1-28 | отсутствие связывания до 1,2 мкМ | >1.20Е- 06 | >46000 |
| Рандомизированный | отсутствие связывания до 1,2 | >1.20Е- | ||
| ЗрЕ-28 | мкМ | 06 | >46000 |
Рандомизированный 3pE-28 представляет собой человеческий пептид Ae 3pE-28 с рандомизированными аминокислотами 3-9.
Кратность селективности определяли делением KD из таблицы 4 на KD из таблицы 3.
При KD>1.20E-06 (M) не было обнаружено связывания антигена до максимальной протестированной концентрации 1,2 μмкМ.
Аффинности связывания FcRn для антитела BAMB31 к HFA на IgG1 дикого типа (BAMB674) и изотипе +YTE IgG1 (BAMB675) показаны в табл. 7. Аффинность мкАт +YTE (BAMB675) к FcRn человека и яванского макака в ~3 раза выше по сравнению с IgG1 дикого типа (BAMB674), которое транслировалось в более длительный период полужизни антитела +YTE в исследовании фармакокинетики яванского макака (фиг. 11).
Таблица 7
Аффинности связывания FcRn в сравнении с мкАт дикого типа и +YTE IgG1 к HFA Образец FcRn KD (Μ)
| Контрольный IgGl | Человек | 4.43Е-07 |
| Контрольный IgGl | Яванский макак | 4.30Е-07 |
| ВАМВ674 | Человек | 3.49Е-07 |
| ВАМВ674 | Яванский макак | 2.68Е-07 |
| ВАМВ675 | Человек | 1.11Е-07 |
| ВАМВ675 | Яванский макак | 8.64Е-08 |
Значения KD (M) были усреднены по 5-6 независимым повторностям.
Пример 6. Сэндвич-ИФА для тестирования перекрестной реактивности.
Для выбранного моноклонального антитела к Ae3pE BAMB31 оценивали перекрестную реактивность с Ae3pE-40 грызуна (SEQ ID NO: 45) и человеческим Ae1-40 (SEQ ID NO: 41), Ae1-42 (SEQ ID NO: 48), Ae11pE-40 (SEQ ID NO: 49) и Ae11pE-42 (SEQ ID NO: 50) с использованием
- 42 045911 синтетических пептидов. Комбинацию BAMB31+JRF/cAe40/28-HRPO использовали для исследования перекрестной реактивности с Ae1-40 (SEQ ID NO: 41), Ae11pE-40 (SEQ ID NO: 49) и Ae3pE-40 грызуна (SEQ ID NO: 45), а комбинацию BAMB31+JRF/cAe42/26-HRPO использовали для исследования перекрестной реактивности с Ae1-42 (SEQ ID NO: 48) и Ae11pE-42 (SEQ ID NO: 50). Тестировали концентрации до 10000 пг/мл.
Материалы и способы: стандарты растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) (Sigma) в концентрации 0,1 мг/мл и хранили при -80°C. Для применения в ИФА пептиды дополнительно разводили в 0,1% казеине в PBS до 1 пг/мл. Планшеты с девяносто шестью лунками (планшеты Maxisorb для ИФА; NUNC) покрывали в течение ночи при 4°C моноклональными антителами BAMB31_1 в концентрации 1,5 мкг/мл в покрывающем буфере. На следующий день планшеты промывали и блокировали 0,1% казеином в PBS в течение 1-4 ч при комнатной температуре. Стандарты инкубировали в течение ночи при 4°C вместе с меченными HRPO вторичными антителами (JRF/cAe40/28-HRPO или JRF/cAe42/26HRPO). После инкубации в течение ночи планшеты промывали, а анализ проводили с помощью набора субстратов для EIA с перекисью и TMB (Biorad) в соответствии с рекомендациями производителя.
Результаты: было показано, что BAMB31 имеет селективное связывание с Ae3pE-40 (SEQ ID NO: 40) и Ae3pE-42 (SEQ ID NO: 51) и не имеет обнаруживаемой перекрестной реактивности с человеческим Ae1-40 (SEQ ID NO: 41), человеческим Ae1-42 (SEQ ID NO: 48), Ae3pE-40 грызуна (SEQ ID NO: 45) и человеческим AepE11-40 (SEQ ID NO: 49) и AepE11-42 (SEQ ID NO: 50) в концентрациях до 10 нг/мл (фиг. 4).
Пример 7. Иммуногистохимический анализ для исследования реактивности антитела к бляшкам в ткани головного мозга трансгенной мыши и человека с БА.
Реактивность антител к бляшкам исследовали как в фиксированной формалином и залитой парафином (FFPE), так и в криоконсервированной ткани головного мозга.
Материалы и способы.
Фиксированный формалином и залитый парафином головной мозг: для иммуногистохимического анализа после депарафинизации и повторной гидратации срезов проводили извлечение антигена посредством инкубации микропрепаратов головного мозга трансгенных мышей в течение 10 мин в муравьиной кислоте (70% в дистиллированной воде) и блокировали активность эндогенной пероксидазы с помощью 3% перекиси водорода (DAKO, г. Глоструп, Дания, S2023). Срезы инкубировали в течение 1 ч с BAMB246 (химера huIgG1), BAMB674 или BAMB675 (рабочая концентрация: 4 мкг/мл в разбавителе антитела с компонентами снижения фоновой окраски (DAKO, S3022)). После интенсивной промывки на микропрепараты наносили меченные ПХ античеловеческое вторичное антитело (PI-3000, Vector labs1/500 в разбавителе антител (DAKO, S0809)) в течение 1 ч с последующим хромогенным мечением 3,3диаминобензидином (DAB) (DAKO, K3468). Микропрепараты подвергали контрокрашиванию гематоксилином, дегидратировали и переводили в постоянный препарат путем заключения в Vectamount (H-5000, Vector Labs).
Криоконсервированный головной мозг: образцы головного мозга человека быстро замораживали, нарезали при помощи криостата (толщина 20 мкм) и хранили при -80°C перед использованием. Срезы сушили при комнатной температуре с последующей фиксацией формалином, блокированием эндогенной пероксидазы 3% пероксидом водорода (DAKO, г. Глоструп, Дания, S2023) и блокированием в течение 1 ч в PBS1x+0,3% Triton X-100 и 10% нормальной козьей сыворотке (DAKO, X0907). На срезы наносили первичное антитело pE3/16 (2 мкг/мл в разбавителе антитела с компонентами снижения фоновой окраски (DAKO, S3022)) на 1 ч. После интенсивной промывки микропрепараты инкубировали с конъюгированным с пероксидазой хрена антимышиным вторичным антителом (Envision, DAKO, K4000) с последующим мечением хромогенным DAB (DAKO, K3468). Микропрепараты подвергали контрокрашиванию гематоксилином, дегидратировали и заключали в органическую среду для заливки (Vectaarm, Vector labs). Визуализацию проводили с помощью прибора Hamamatsu Nanoscomer (Hamamatsu Photonics; г. Сизуока, Япония).
Результаты: реактивность BAMB264 (человеческая химера IgG1), а также BAMB674 и BAMB675 была продемонстрирована на FFPE ткани трансгенных мышей (фиг. 5A-5F). Более того, BAMB31_2a (mIgG2a) продемонстрировал значительное мечение бляшек в криоконсервированной ткани головного мозга при БА (фиг. 6). Значительную часть бляшек, обнаруженных при помощи антитела 4G8, также пометили BAMB31 в замороженных срезах человеческого головного мозга (фиг. 5A-5F).
Пример 8. Концентрации антител в сыворотке после введения трансгенным мышам.
Исследовали концентрации антител в сыворотке после лечения BAMB31 и молекулой для сравнения mE8c.
Материалы и способы: старые трансгенные мыши, экспрессирующие повышенные уровни человеческих пептидов Ae42 и Ae40, (возраст 22-23 месяца) получали одну внутрибрюшинную (в/б) инъекцию 20 мг/кг mE8c mIgG2a, BAMB31_2a (mIgG2a) или антитела изотипического контроля mIgG2a (n=5 на группу лечения). После введения антител цельную кровь собирали в промежуточные моменты времени (24 и 48 ч после введения) через большую подкожную вену и посредством прокола
- 43 045911 орбитального синуса при умерщвлении (4 день после введения) в пробирки для взятия образцов MICROVETTE® (100Z и 300Z, соответственно; Sarstedt; г. Нумштадт, Германия). Собранную цельную кровь инкубировали при комнатной температуре в течение 1-2 ч, а затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин при 4°C для выделения сыворотки из сгустка крови. Концентрации антител в сыворотке определяли с помощью аллотип-специфического иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого планшеты с плоским дном Nunc MaxiSorp™ (Thermo Scientific; г. Уолтем, штат Массачусетс, США) покрывали в течение ночи 1,5 мкг/мл мышиного моноклонального антитела к IgG2a(A) (BD Biosciences; г. Сан-Хосе, штат Калифорния) при комнатной температуре. Стандартные образцы антител mE8c mIgG2a, BAMB31_2a (mIgG2a) и mIgG2a изотипического контроля готовили по отдельности в концентрации 1 мкг/мл в блокирующем буфере (1% BSA в PBS+0,05% Tween-20) и дополнительно разбавляли до 0,1 нг/мл в блокирующем буфере. После промывки (PBS+0,05% Tween-20) образцы блокировали блокирующим буфером в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем стандарты и образцы предварительно разведенной сыворотки инкубировали в покрытых планшетах MAXISORP™ в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации образца планшеты промывали и инкубировали с аффинно очищенными конъюгированными с пероксидазой козьими анти-мышиными антителами IgG (специфичными к Fcy подкласса 2a) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали и проявляли путем добавления в лунки набора субстратов пероксидазы TMB для ИФА (1-стадийный, Pierce). Проявление цвета останавливали через 2 мин путем добавления 2 н. H2SO4 в лунки и считывания планшетов при 450 нм с использованием многорежимного планшетного ридера EnVision (Perkin Elmer).
Результаты: концентрации антител в сыворотке измеряли через 24 ч, 48 ч и 4 дня после внутрибрюшинной инъекции 20 мг/кг антитела. Средние концентрации антител в сыворотке были сопоставимыми через 24 ч для всех исследованных антител. Для BAMB31_2a и антитела изотипического контроля снижение концентрации антитела происходило постепенно с течением времени (примерно до 30% снижения на 4 день), в то время как для mE8c можно было наблюдать явно более сильное снижение с течением времени со снижением примерно на 97% на 4 день (фиг. 7).
В заключение было показано различие в фармакокинетических профилях после в/б инъекции BAMB31_2a и mE8c в мышиной модели с отложением бляшек, что указывает на более медленный клиренс после лечения антителом BAMB31_2a по сравнению с mE8c.
Пример 9: исследования эффективности длительного лечения на трансгенных мышиных моделях.
Эффективность снижения амилоидной нагрузки, а также влияние на микрогеморрагию после длительного лечения BAMB31_2a mIgG2a исследовали на модели трансгенных мышей.
Материалы и способы: трансгенным мышам PDAPP (V717F) (средний возраст 18,3 месяца в начале исследования) вводили еженедельно в/б дозы антител BAMB31_2a (mIgG2a) в дозе 30 мг/кг в течение 12 недель. В эксперимент включали контрольную группу, получающую инъекцию антитела изотипического контроля mIgG2a. Животных умерщвляли на 7-й день после конечной в/б инъекции (средний возраст 21,1 месяца в конце исследования). Мышам проводили перфузию PBS перед сбором тканей. Левое полушарие (фракция 1: гиппокамп, фракция 2: остальной мозг без гиппокампа/мозжечка/ствола мозга) подвергали криоконсервации для дальнейшего биохимического анализа, в то время как правое полушарие фиксировали в течение ночи в фиксаторе на основе формалина с последующей заливкой парафином и получением срезов (5 мкм) с помощью микротома.
Для оценки влияния на амилоидную нагрузку после длительного лечения проводили как биохимический, так и иммуногистохимический анализ. Для биохимического анализа мозги гомогенизировали в ледяном 5M гуанидин-HCl и 50 мМ буфера для экстракции трис/HCl (100 мг ткани/мл буфера для экстракции) с использованием пробирок Lysing Matrix Tallprep D (MP Bio). После гомогенизации образцы помещали во вращающееся устройство с функцией переворачивания на 3 ч при комнатной температуре. Перед проведением иммунологических анализов MSD полученные гомогенаты хранили при -80°C.
Стандарты из синтетического пептида Ae растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) (Sigma) в концентрации 0,1 мг/мл и хранили при -80°C. Для применения в иммунологических анализах MSD пептиды дополнительно разводили в 0,5M GuHCl+5 мМ трис-HCl - pH 8,0 (10-кратное разбавление буфера для экстракции в 0,1% казеине в PBS). Экстракты GuHCl размораживали и разбавляли 1:10 в ледяном растворе 0,1% казеина в PBS и центрифугировали при 20000 g в течение 20 мин при 4°C. Супернатант восстанавливали для применения в анализах сэндвич-MSD с дальнейшими разведениями образцов в 0,5M GuHCl+5 мМ трис-HCl - pH 8,0 (10-кратное разбавление буфера для экстракции в 0,1% казеине в PBS).
Стандартные 96-луночные планшеты Sector (Meso Scale Discovery; г. Роквилл, штат Мэриленд) на ночь наносили моноклональные антитела в концентрации 1,5 мкг/мл в PBS при температуре 4°C. На следующий день планшеты промывали и блокировали 0,1% казеином в PBS в течение 2 ч при комнатной температуре. Стандарты и образцы инкубировали в течение ночи при 4°C с меченным биотином вторичным антителом. После инкубации в течение ночи планшеты промывали и инкубировали со вторичным реагентом для выявления (меченным SULFO-TAG™ стрептавидином) в течение 2 ч при
- 44 045911 комнатной температуре. Планшеты промывали и добавляли 2x буфер для считывания T, после чего планшеты считывали в соответствии с рекомендациями производителя. Концентрации Ae определяли с использованием стандартной кривой с четырехпараметрической логистической моделью с весовой функцией 1/Y2
Комбинацию антител JRF/AβN/25+4G8-биотин использовали для исследования концентраций Ae1X в гомогенатах головного мозга.
Для иммуногистохимического анализа после депарафинизации и повторной гидратации срезов проводили извлечение антигена посредством инкубации микропрепаратов в течение 10 мин в муравьиной кислоте (70% в дистиллированной воде) и блокировали активность эндогенной пероксидазы с помощью 3% пероксида водорода (DAKO, г. Глоструп, Дания, S2023). Срезы инкубировали в течение ночи с биотинилированным антителом 4G8 (Biolegend; г. Сан-Диего, штат Калифорния), разведенным 1/2000 в разбавителе антител с компонентами снижения фоновой окраски (DAKO, S3022). После интенсивной промывки на микропрепараты наносили стрептавидин-ПХ (PK6100 Elite, Vector labs) в течение 30 мин с последующим хромогенным мечением 3,3-диаминобензидином (DAB) (DAKO, K3468). Микропрепараты подвергали контрокрашиванию гематоксилином, дегидратировали и переводили в постоянный препарат путем заключения в Vectamount (H-5000, Vector Labs). Изображения (20x) получали с помощью сканера NanoZoomer для микропрепаратов (Hamamatsu Photonics) и анализировали с помощью Matlab/Phaedra. Представляющие интерес области (ПИО) определяли вручную в соответствии с ALAS Franklin and Paxinos (Franklin KB, Paxinos G. Mouse brain in stereotaxic coordinates. Waltham: Academic Press; 1997) и для каждой ПИО рассчитывали процентную долю площади, меченной DAB, от общей площади.
Для оценки влияния на микрогеморрагию выполняли окрашивание по Перлсу. Вкратце, залитые парафином срезы ткани обрабатывали кислым раствором ферроцианида в соответствии с протоколом, описанным ниже. Ион трехвалентного железа (Fe3+), присутствующий в микрокровоизлияниях, соединяется с ферроцианидом, что приводит к образованию синего пигмента, называемого берлинской лазурью. После депарафинизации и повторной гидратации срезы инкубировали 30 мин в смеси 1/1 2% ферроцианида калия (Sigma-Aldrich) и 2% ледяной соляной кислоты (Sigma-Aldrich). После трехкратного промывки микропрепаратов в дистиллированной воде проводили контрокрашивание ядерным быстрым красным (Sigma-Aldrich) с последующим промыванием в дистиллированной воде, дегидратацией и заключением в монтирующую среду (Vectaarm, Vector Labs). Визуализацию проводили с помощью сканера для микропрепаратов NanoZoomer (Hamamatsu Photonics). Количество положительных по Перлсу клеток около мозговых оболочек подсчитывали вручную.
Результаты: в целом, наблюдали небольшое количество микрогеморрагий, наблюдаемых на исходном уровне, группах изотипического контроля и лечения BAMB31 (фиг. 8). Биохимический анализ показал снижение на 34% (p<0,0001) для BAMB31_2a по сравнению с антителом изотипического контроля для концентраций Ae1-x в гиппокампе (фиг. 9). Кроме того, иммуногистохимический анализ с антителом 4G8 показал снижение на 23% (p<0,0001) и 37% (p<0,001) по сравнению с антителом изотипического контроля для гиппокампа и коры, соответственно.
В заключение, эффективность снижения амилоидной нагрузки была продемонстрирована без увеличения частоты микрокровоизлияний после длительных внутрибрюшинных инъекций BAMB31 на мышиной модели с отложением бляшек, что указывает на благоприятное соотношение эффективности и токсичности после лечения антителом BAMB31.
Пример 10: фармакокинетика мкАт к HFA BAMB31.
Фармакокинетику мкАт к HFA BAMB31 как изотипа IgG1 дикого типа (BAMB674) и +YTE IgG1 (BAMB675) оценивали на яванских макаках для прямого сравнения свойств в периферическом кровообращении и в головном мозге.
Материалы и способы: в каждую группу вводили по три животных в дозе 25 мг/кг внутривенной (в/в) болюсной инъекции каждого мкАт и отбирали образцы сыворотки в течение 5-недельного периода. Трем дополнительным обезьянам вводили 25 мг/кг в/в болюсно каждого мкАт на 6-й неделе и отбирали ткань головного мозга в каждой группы на 7-й и 42-й день после введения. Всего образцы головного мозга собирали у трех яванских макак на 7 и 42 сутки для каждой молекулы.
Анализы воздействия лекарственного средства для BAMB674 и BAMB675 из сыворотки крови яванских макак in vivo и образцов ткани головного мозга были выполнены с использованием индивидуальных подходящих электрохемилюминесцентных иммуноанализов (ECLIA) с определением конечных точек на Sector Imager S600 от Meso Scale Discovery (MSD). Для каждого из соединений и матриц применяли один формат анализа, что приводило к получению четырех независимых способов измерения экспозиции. Формат описан ниже: соединения мкАт захватывали и обнаруживали с помощью мышиного мкАт, специфического к человеческому Fc (домен CH2). Для препарата ткани головного мозга получали гомогенат путем криопульверизации замороженной ткани и разбавления буферным раствором. Концентрацию белка в ткани проверяли и номинализовали с помощью анализа BCA с получением конечной концентрации белка, используемой в способе. Регрессию исходных данных
-
Claims (18)
- выполняли в программном обеспечении Watson LIMS с использованием логистической модели с 5 параметрами (автоматическая оценка) аппроксимации с взвешиванием стандартной кривой 1/Y2.Двухкомпартментная (центральный (VC) и тканевый (VT) компартменты) фармакокинетическая (ФК) модель с внутривенным (в/в) введением (введ.) в центральный компартмент, межкомпартментным клиренсом (Q) и линейным клиренсом (CL) использовалась для определения ФК характеристик BAMB674 и BAMB675 у яванских макаков. На фиг. 10 представлена схема модели.Результаты: вычисляли терминальный период полужизни для каждого антитела, как показано На фиг. 11, вместе с данными для яванских макаков и аппроксимацией 2-компартментной модели. Изотип +YTE IgG1 (BAMB675) показал ~1,6-кратное увеличение периода полужизни по сравнению с изотипом IgG1 дикого типа (BAMB674). Это связано с ~3 кратным повышением аффинности к FcRn изотипа +YTE (BAMB675) по сравнению с мкАт IgG1 дикого типа (BAMB674), приведенным в табл. 5.Уровни лизата головного мозга в разных областях и между мкАт на 7-й день одинаковы, но только YTE мкАт неизменно обнаруживается в областях головного мозга и животных на 42-й день. Результаты показаны На фиг. 12. Это согласуется с увеличением экспозиции +YTE мкАт в более поздние моменты времени.При описании настоящего изобретения и вариантов его осуществления для ясности используется конкретная терминология. Однако изобретение не ограничивается конкретной выбранной терминологией. Специалист в данной области техники признает, что могут быть использованы другие эквивалентные компоненты и другие способы, разработанные без отхода от общих понятий настоящего изобретения. Все ссылки, процитированные в любых местах настоящего описания, включены в настоящий документ путем ссылки, как если бы каждая из них включалась в настоящий документ индивидуально.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), HCDR2, HCDR3, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), LCDR2 и LCDR3, имеющие полипептидные последовательности:a) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6, соответственно;b) SEQ ID NO: 1, 7, 3, 4, 5 и 6, соответственно;c) SEQ ID NO: 1, 7, 3, 8, 5 и 6, соответственно;d) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 8, 5 и 6, соответственно;e) SEQ ID NO: 56, 57, 3, 8, 5 и 6, соответственно;f) SEQ ID NO: 56, 57, 3, 4, 5 и 6, соответственно;g) SEQ ID NO: 56, 58, 3, 4, 5 и 6, соответственно;h) SEQ ID NO: 56, 7, 3, 8, 5 и 6, соответственно;i) SEQ ID NO: 1, 57, 3, 8, 5 и 6, соответственно;j) SEQ ID NO: 56, 7, 3, 4, 5 и 6, соответственно;k) SEQ ID NO: 1, 57, 3, 4, 5 и 6, соответственно;l) SEQ ID NO: 1, 58, 3, 4, 5 и 6, соответственно; илиm) SEQ ID NO: 56, 2, 3, 4, 5 и 6, соответственно;где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывает 3рЕ Ab.
- 2. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19, 20, или 21, или вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 10, 12, 14, 18, 22, 53, или 55.
- 3. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащее:a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 22;b) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 10;c) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 12;d) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 13, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;e) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;f) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;- 46 045911g) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 20, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 14;h) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 17, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 18;i) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 18;j) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 53; илиk) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность SEQ ID NO: 55.
- 4. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является химерным.
- 5. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным.
- 6. Выделенное моноклональное антитело, содержащее:a) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 37, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 38;b) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 39, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 38;c) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 37, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 52; илиd) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 39, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 54.
- 7. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6.
- 8. Вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту по п.7.
- 9. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.8.
- 10. Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6 и фармацевтически приемлемый носитель.
- 11. Способ лечения патологического состояния, связанного с образованием бляшек, содержащих бета-амилоидный белок, у нуждающегося в этом субъекта, причем способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-6 или фармацевтической композиции по п.10.
- 12. Способ по п.11, в котором патологическое состояние представляет собой болезнь Альцгеймера.
- 13. Способ по п.11, в котором патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из деменции, связанной с трисомией 21 (синдром Дауна), болезни диффузных телец Леви, миозита с включениями, церебральной амилоидной ангиопатии и наследственной церебральной геморрагии с амилоидозом голландского типа (HCHWA-D -англ.: hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis of the Dutch-type).
- 14. Способ уменьшения бляшек, связанных с болезнью Альцгеймера, у нуждающегося в этом субъекта, причем способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-6 или фармацевтической композиции по п.10.
- 15. Способ предотвращения активности нуклеации бляшек 3рЕ Ав у нуждающегося в этом субъекта, причем способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-6 или фармацевтической композиции по п.10.
- 16. Способ получения моноклонального антитела по любому из пп.1-6 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-5, включающий культивирование клетки по п.9, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в условиях для получения моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
- 17. Способ получения фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, при этом способ включает комбинирование моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с фармацевтически приемлемым носителем для получения фармацевтической композиции.
- 18. Выделенное монокональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связывает 3рЕ Ав.-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/823,785 | 2019-03-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045911B1 true EA045911B1 (ru) | 2024-01-17 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11673943B2 (en) | Methods of binding amyloid beta protein having pyroglutamate at the third amino acid residue (3pE abeta) in vivo using anti-3pE abeta antibodies or antigen-binding fragments thereof | |
| KR102597462B1 (ko) | 항-phf-타우 항체 및 이의 용도 | |
| US11236155B2 (en) | Antibodies to pyroglutamate amyloid-β and uses thereof | |
| US10472415B2 (en) | Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use | |
| KR101981351B1 (ko) | 타우를 인식하는 포스포특이적 항체 | |
| KR101988672B1 (ko) | 타우를 인식하는 포스포특이적 항체 | |
| US20210038678A1 (en) | Methods and compositions for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions | |
| CN115697393A (zh) | 抗PHF-tau抗体及其用途 | |
| JP2023086132A (ja) | アミロイドベータに対する抗体 | |
| US20230051538A1 (en) | Conformation-specific epitopes in alpha-synuclein, antibodies thereto and methods related thereof | |
| EA045911B1 (ru) | АНТИТЕЛА К ПИРОГЛУТАМАТ-β-АМИЛОИДУ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | |
| EA047298B1 (ru) | Антитела к phf-тау и их применение |