KR101988672B1

KR101988672B1 - 타우를 인식하는 포스포특이적 항체

Info

Publication number: KR101988672B1
Application number: KR1020137011715A
Authority: KR
Inventors: 안드레아 파이퍼; 안드레아스 무스; 프레드 반 로이벤; 마리아 필그렌; 오스카 아돌프슨
Original assignee: 에이씨 이뮨 에스.에이.; 카트호리이케 유니버시타이트 로이펜
Priority date: 2010-10-07
Filing date: 2011-10-07
Publication date: 2019-06-12
Also published as: MX338421B; CN103502272A; MX2013003800A; ECSP13012609A; BR112013008333B1; IL225568A; MY164376A; HK1216897A1; BR112013008333A2; RU2013120544A; JP2017113004A; US9304138B2; EP2625198A2; CR20130160A; EP2987807A3; SI2625198T1; KR20130115279A; CA2812865A1; US20120276009A1; AU2011311516B2

Abstract

본 발명은 신경원섬유 엉킴에 의해 유발되거나 또는 이와 연관된 질환 및 장애의 치료에서 치료 및 진단 용도를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인산화 병리학적 단백질 타우-이형태체를 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 항체, 및 알츠하이머병 (AD)을 포함하는 타우병증의 치료에서 치료 및 진단 용도를 위한 상기 항체가 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다.
[대표도]
도 1

Description

타우를 인식하는 포스포특이적 항체{PHOSPHOSPECIFIC ANTIBODIES RECOGNISING TAU}

본 발명은 신경원섬유 엉킴에 의해 유발되거나 또는 이와 연관된 질환 및 장애의 치료에서 치료 및 진단 용도를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인산화 병리학적 단백질 타우-이형태체를 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 항체, 및 알츠하이머병 (AD)을 포함하는 타우병증의 치료에서 치료 및 진단 용도를 위한 상기 항체가 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다.

신경원섬유 엉킴 및 신경망사 (NT)는 알츠하이머병 (AD)의 주요 신경병리학적 특징이다. 이들은 아스파라기닐 또는 아스파르틸 잔기 상에서의 인산화, 탈아미드화 및 이성질체화를 포함하는 번역후 변형이 일어난 미세관-연관 단백질 타우로 구성된다. 이들은 과인산화 단백질 타우 및 그의 이형태체의 응집에 의해 유발된다. AD는 이러한 병리상태를 다수의 신경변성 타우병증, 특히 특정 유형의 전두측두엽 치매 (FTD)와 공유한다.

단백질 타우는 그의 어셈블리 및 안정성을 촉진하기 위해 미세관 (MT)에 적극적으로 결합하는 유리된 가용성의 "자연적으로 비폴딩된" 단백질이다. MT는 뉴런의 세포골격 완전성에 매우 중요하고, 이에 의해 뉴런 회로의 적절한 형성 및 기능에 매우 중요하며, 이에 따라 학습 및 기억에 매우 중요하다. MT에 대한 타우의 결합은 주로 시험관내 및 비뉴런 세포에서 입증되는 바와 같이 동적 인산화 및 탈인산화에 의해 제어된다. 다수의 가능한 인산화 부위 (>80개)로 인해, 각각의 정확한 기여 및 해당 키나제의 일체성은 대체로 생체내에서 정의되어 있지 않다.

AD 뇌에서, 타우 병리상태는 이후에 발생하며, 이에 따라 아밀로이드 병리상태에 반응할 가능성이 있고, 이는 아밀로이드 캐스케이드 가설의 본질을 구성한다. 이는 AD 및 다운 증후군 환자에서의 연구를 기반으로 하여 이에 의해 지시되고, 조합된 아밀로이드 및 타우 병리상태를 갖는 트랜스제닉 마우스에서의 연구에 의해 확증된다 (문헌 [Lewis et al., 2001; Oddo et al., 2004; Ribe et al., 2005; Muyllaert et al., 2006; 2008; Terwel et al., 2008]).

인간 AD 환자에서 둘 다의 병리상태 뿐만 아니라 아밀로이드를 타우 병리상태에 연관시키는 메카니즘의 정확한 타이밍은 대체로 알려져 있지 않지만, GSK3 및 cdk5 상에서 또는 이에 의해 주요 "타우-키나제"로서 작용하는 뉴런 신호전달 경로의 활성화와 관련된 것으로 제안된다 (문헌 [Muyllaert et al., 2006, 2008]에 의해 검토됨).

타우병증은 AD에서 무해한 부작용이 아니지만 주요 병리학적 실행요인이라는 가설은 서로를 완전하게 확증하는 온전한 유전적, 병리학적 및 실험적 관찰을 기반으로 한다:

ㆍ 아밀로이드 단백질 전구체 (APP) 또는 프레세닐린에서 돌연변이로 인한 조기-발병 가족성 AD 사례에서, 불가피한 발병 요인은 아밀로이드 축적이지만, 변함없이 병리상태는 후기-발병 산발성 AD 사례에서와 동일한 부수적 타우병증을 포함한다;

ㆍ 아밀로이드에 대한 PIB-PET 영상화를 포함하고 다수의 "가양성": 높은 뇌 아밀로이드 부하를 갖는 인지적으로 정상인 개체를 확인하는 여러 임상 1&2상 연구에 의해 가장 최근에 예시된 바와 같이 인지 기능장애 및 치매의 중증도는 타우병증과 연관되지만, 아밀로이드 병리상태와는 연관되지 않는다;

ㆍ 가족성 FTD에서, 타우병증은 돌연변이 타우에 의해 야기되고, 아밀로이드 병리상태 없이 직접적으로 신경변성을 유발한다;

ㆍ 실험적 마우스 모델에서 아밀로이드 병리상태에 의해 유발된 인지 결핍은 단백질 타우의 부재에 의해 거의 완전하게 완화된다 (문헌 [Roberson et al., 2007]).

조합된 논의는 단백질 타우가 AD 및 관련 신경변성 타우병증에서의 인지 소멸에서 주요 수행자라는 가설을 지지한다.

AD의 주요 응급 치료는 신경-독성 또는 시냅스-독성일 것으로 의심되는 아밀로이드 펩티드 및 그의 응집체를 제거하기 위해 특정 mAb를 사용하는 수동 면역요법에 의한 것이다.

여기서 제안된 바와 같은 타우 병리상태를 표적화하는 면역요법은 시냅스 기능장애 및 신경변성을 유발하는 것으로 알려져 있거나 가정되는 병리학적 단백질 타우-이형태체에 대응할 것으로 예측된다. 유발된 아밀로이드 병리상태 및 과인산화 단백질 타우의 뉴런내 응집체는 경도 인지 손상 (MCI)으로부터 AD의 중증 치매로까지 이어지는 병리학적 사건의 인지 및 변성 케이케이드에서 상승작용적으로 작용하는 것으로 제안된다. 이에 따라 타우-지시된 의약의 아밀로이드-지시된 (또는 임의의 다른) 의약과의 조합은 현재의 단독-요법과는 대조적으로 AD의 바람직하고 실질적으로 보다 효능있는 치료를 구성할 것이다.

단백질 타우를 표적으로 하는 다른 치료 접근법이 부족하며, 주로 다음을 포함한다:

ㆍ 타우의 인산화를 병리학적 수준으로 증가시키는 것으로 여겨지는 키나제의 억제제

ㆍ 과인산화 단백질 타우의 세포질 응집을 차단하는 화합물.

이러한 접근법은 이들이 APP 및 아밀로이드의 대사를 변형시키기 위한 시도와 공유하는 문제인 특이성 및 효능의 다양한 결점을 가지며, 이들은 모두 타우에 대한 면역요법을 포함하여 추가의 치료 옵션에 대한 지속적인 조사의 중요성을 강조한다.

실질적으로 생체내에서 - 표적은 커녕 - 병리학적 타우 이형태체를 정의하기 위한 노력을 기울이지 않았다. Aβ42 II상 임상 시험에서, 엉킴 병리상태는 널리 고려되지도 훨씬 깊이 분석되지도 않은 것으로 나타났다 (문헌 [Nicoll et al., 2003; Masliah et al., 2005]). 다른 한편으로, 복합 AD-유사 병리상태를 갖는 전임상 마우스 모델에서 아밀로이드를 표적화하는 실험적 면역요법은 또한 타우 응집체가 지속되더라도 타우 병리상태에 대한 효과를 입증하였다 (문헌 [Oddo et al., 2004]).

면역요법에 의한 세포내 단백질 타우로의 접근의 실행가능성에 대해 약간의 의심이 제기되었다. 이는 타우병증 마우스 모델에서 가장 최근의 실험적 연구에 의해 반박되었다 (문헌 [Asuni et al., 2007]). 이들은 단백질 타우 유래된 포스포-펩티드로의 접종에 의한 엉킴 병리상태의 감소 및 기능 개선을 보여주었다. 이러한 데이터는 파킨슨병 (PD) 및 루이 소체 질환 모델에서 α-시누클레인을 표적화하는 면역요법 (문헌 [Masliah et al., 2005, 2011]) 및 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 모델에서 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (문헌 [Urushitiani et al., 2007])의 이전의 보고를 확증한다. 이러한 질환은 세포내 단백질이 아직 완전하게 이해되지 않은 메카니즘에 의해 시냅스 결핍 및 신경변성을 유발하는 예이다. 다른 한편으로, 박테리아에서 생산되어 이로부터 단리된 전장 재조합 단백질 타우는 사용된 아주반트, 즉 완전 프로인트 및 백일해 독소가 연구의 부정적인 결과에 기여할 수 있을지라도 백신으로 적합하지 않은 것으로 나타났다 (문헌 [Rosenmann et al., 2006]).

예를 들어 아밀로이드로서 AD에 전형적인 과인산화 단백질 타우의 뉴런내 응집체에 의해 유발되는 AD에서 신경변성 장애, 예컨대 아밀로이드 병리상태를 유발하는 것으로 공지된 - 또는 가정된 - 병리학적 단백질 이형태체에 대응하는 작용을 하는 수동 및/또는 능동 면역요법에 대한 충족되지 않은 요구가 존재한다.

이러한 충족되지 않은 요구는 타우 단백질의 주요 병리학적 포스포-에피토프를 인식하여 이에 결합하는 결합 단백질을 제공함으로써 본 발명의 범위 내에서 충족될 수 있다. 특히, 본 발명은 단백질 타우, 특히 AD를 포함하는 타우병증에서 시냅스- 및 신경-독성의 원인으로 여겨지는 응집된 타우 단백질 상의 선형 및 입체형태의 단순한 및 복잡한 포스포-에피토프에 대한 특이적 항체를 제공한다.

따라서, 본 발명은 한 실시양태에서 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 응집된 타우 단백질 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 특히 뇌에서 특히 적어도 10 nM, 특히 적어도 8 nM, 특히 적어도 5 nM, 특히 적어도 2 nM, 특히 적어도 1 nM, 특히 적어도 500 pM, 특히 적어도 400 pM, 특히 적어도 300 pM, 특히 적어도 200 pM, 특히 적어도 100 pM, 특히 적어도 50 pM의 해리 상수로 가용성 및 불용성 타우 단백질에 대해 높은 결합 친화도를 갖고, 가용성 및 불용성 타우 수준을 조절한다.

제2 실시양태에서, 본 발명은 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 10⁴ M^-1s^-1 이상, 특히 3 - 5 x 10⁴ M^-1s^-1 이상, 특히 10⁵ M^-1s^-1 이상; 특히 2 - 9 x 10⁵ M^-1s^-1 이상; 특히 10⁶ M^-1s^-1 이상, 특히 1 - 4 x 10⁶ M^-1s^-1 이상, 특히 10⁷ M^-1s^-1 이상의 회합률 상수를 갖는다.

제3 실시양태에서, 본 발명은 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 적어도 4 nM의 해리 상수 및 10⁵ M^-1s^-1 이상의 회합률 상수, 특히 적어도 3 nM의 해리 상수 및 10⁶ M^-1s^-1 이상의 회합률 상수, 특히 적어도 2 nM의 해리 상수 및 10⁴ M^-1s^-1 이상의 회합률 상수, 특히 적어도 1 nM의 해리 상수 및 10⁵ M^-1s^-1 이상의 회합률 상수, 특히 적어도 200 pM의 해리 상수 및 10⁵ M^-1s^-1 이상의 회합률 상수, 특히 적어도 100 pM의 해리 상수 및 10⁶ M^-1s^-1 이상의 회합률 상수로 높은 결합 친화도를 갖는다.

본 발명의 한 실시양태 (4)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 위치 18에 인산화 Tyr (Y18)을 포함하는 Tau aa 15-20, 위치 409에 인산화 Ser (pS409)을 포함하는 Tau aa 405-412, 위치 409에 인산화 Ser (pS409)을 포함하는 Tau aa 405-411; 및 위치 212에 인산화 Thr (pT212) 및 위치 214에 인산화 Ser (pS214)을 포함하는 Tau aa 208-218로 이루어진 군으로부터 선택된, 서열 67로 나타낸 바와 같은 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 상의 에피토프에 결합한다.

한 실시양태 (5)는 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 펩티드는 위치 18에 인산화 Tyr (Y18)을 갖는 Tau aa 15-20을 포함하는, 포유동물, 특히 인간 타우 단백질, 특히 서열 67로 나타낸 바와 같은 인간 타우 단백질 상의 에피토프에 결합한다.

한 실시양태 (6)는 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 펩티드는 위치 409에 인산화 Ser (pS409)을 갖는 Tau aa 405-412를 포함하는, 포유동물, 특히 인간 타우 단백질, 특히 서열 67로 나타낸 바와 같은 인간 타우 단백질 상의 에피토프에 결합한다.

한 실시양태 (7)는 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 펩티드는 위치 409에 인산화 Ser (pS409)을 갖는 Tau aa 405-411을 포함하는, 포유동물, 특히 인간 타우 단백질, 특히 서열 67로 나타낸 바와 같은 인간 타우 단백질 상의 에피토프에 결합한다.

한 실시양태 (8)는 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 펩티드는 위치 212에 인산화 Thr (pT212) 및 위치 214에 인산화 Ser (pS214)을 갖는 Tau aa 208-218을 포함하는, 포유동물, 특히 인간 타우 단백질, 특히 서열 67로 나타낸 바와 같은 인간 타우 단백질 상의 에피토프에 결합한다.

또 다른 실시양태 (9)에서, 본 발명은 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 특히 서열 내에 서열 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81, 93, 101, 106으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 70%, 특히 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 22, 25, 30, 33, 74, 82, 94, 102, 107로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 23, 26, 31, 34, 75, 83, 95, 103, 108로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 60%, 특히 적어도 70%, 특히 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 내에 서열 12, 15, 18, 70, 78, 89, 98로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 13, 16, 19, 71, 79, 90, 99, 115로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 14, 17, 20, 72, 80, 91, 100으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (10)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 22, 25, 30, 33, 74, 82로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 23, 26, 31, 34, 75, 83으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 12, 15, 18, 70, 78로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 13, 16, 19, 71, 79로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 14, 17, 20, 72, 80으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 항체 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (11)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 22, 25, 30, 33, 74, 82로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 23, 26, 31, 34, 75, 83으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 내에 서열 12, 15, 18, 70, 78로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 13, 16, 19, 71, 79로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 14, 17, 20, 72, 80으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (12)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 22, 25, 30, 33, 74, 82로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 23, 26, 31, 34, 75, 83으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제1 결합 도메인 (항체 도메인); 및/또는 서열 내에 서열 12, 15, 18, 70, 78로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 13, 16, 19, 71, 79로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 14, 17, 20, 72, 80으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (13)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 21, 24, 27, 28, 29, 32로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 22, 25, 30, 33으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 23, 26, 31, 34로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 내에 서열 12, 15, 18로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 13, 16, 19로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 14, 17, 20으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (14)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 21, 24, 27, 28, 29, 32로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 22, 25, 30, 33으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 23, 26, 31, 34로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 내에 서열 12, 15, 18로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 13, 16, 19로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 14, 17, 20으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (15)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81, 93, 101 또는 106으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 22, 25, 30, 33, 74, 82, 94, 102 또는 107로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 23, 26, 31, 34, 75, 83, 95, 103 또는 108로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제1 결합 도메인, 및/또는 서열 12, 15, 18, 70, 78, 89 또는 98로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 13, 16, 19, 71, 79, 90, 99 또는 115로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 14, 17, 20, 72, 80, 91 또는 100으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (16)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 21로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 76%, 특히 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 22로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95%, 특히 98%, 특히 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 23으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 66%, 특히 적어도 70%, 특히 적어도 75%, 특히 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제1 결합 도메인, 및/또는 서열 내에 서열 12로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95%, 특히 98%, 특히 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 13으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 88%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 14로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 66%, 특히 적어도 70%, 특히 적어도 75%, 특히 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (17)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 24, 또는 서열 27, 또는 서열 28로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 88%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 25로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95%, 특히 98%, 특히 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 26으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 66%, 특히 적어도 70%, 특히 적어도 75%, 특히 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 내에 서열 12로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95%, 특히 98%, 특히 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 13으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 88%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 14로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 66%, 특히 적어도 70%, 특히 적어도 75%, 특히 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (18)는 CDR1이 서열 27로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 88% 동일한 아미노산 서열을 갖는 제1 결합 도메인을 포함하는, 실시양태 (15)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태 (19)는 CDR1이 서열 28로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 88% 동일한 아미노산 서열을 갖는 제1 결합 도메인을 포함하는, 실시양태 (15)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태 (20)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 29로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 30으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 31로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95%, 특히 98%, 특히 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 내에 서열 15로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95%, 특히 98%, 특히 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 16으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 17로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 36%, 특히 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 특히 적어도 60%, 특히 적어도 70%, 특히 적어도 75%, 특히 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (21)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 32로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 33으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 34로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95%, 특히 98%, 특히 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 내에 서열 18로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95%, 특히 98%, 특히 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 19로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 20으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 63%, 특히 적어도 70%, 특히 적어도 75%, 특히 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (22)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 73으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 74로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 75로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 내에 서열 70으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95%, 특히 98%, 특히 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 71로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 72로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (23)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 81로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 82로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 83으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 내에 서열 78로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 79로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 80으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (24)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 93으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 94로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 95로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 상기 CDR 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 내에 서열 89로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 90으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 91로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 상기 CDR 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (25)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 101로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 102로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 103으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 상기 CDR 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 내에 서열 98로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 99로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 100으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 상기 CDR 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (26)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 내에 서열 106으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 107로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 108로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 상기 CDR 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 내에 서열 89로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 115로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 91로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3, 또는 상기 CDR 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서 (27)에서, 본 발명은 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 6, 7, 8, 9, 10, 11로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인, 및/또는 서열 1, 2, 3, 4, 5로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

한 실시양태 (28)에서, 본 발명은 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 6, 7, 8, 9, 10, 11로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인, 및/또는 서열 1, 2, 3, 4, 5로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 91% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (29)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 6, 7, 8, 9, 10, 11로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 (항체 도메인); 및/또는 서열 1, 2, 3, 4, 5로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 91% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태 (30)에서, 본 발명은 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 69, 77, 116/92, 97, 105로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 특히 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인, 및/또는 서열 68, 76, 88, 96, 104로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 80%, 특히 적어도 85%, 특히 적어도 86%, 특히 적어도 87%, 특히 적어도 88%, 특히 적어도 89%, 특히 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 특히 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (31)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 6 또는 서열 7로 나타낸 아미노산 서열, 또는 각각 그와 적어도 90% 및 94% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 1로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 91% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (32)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 8로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 2로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (33)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 9로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 3으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (34)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 10으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 4로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 89% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (35)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 11로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 5로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 87% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (36)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 69로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 68로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90%, 91%, 92% 또는 93% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (37)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 77로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 93%, 94% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 76으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 88%, 89%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (38)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 116, 92, 또는 118로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 93%, 94% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 88로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90%, 91%, 92% 또는 93% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (39)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 97로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 96으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 86%, 87%, 88% 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (40)는 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 서열 105로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인; 및/또는 서열 104로 나타낸 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 88%, 89%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태 (41)에서, 본 발명은 상기 제1 결합 도메인이 서열 21-34로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하고, 상기 제2 결합 도메인이 서열 12-20으로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하는, 실시양태 (22) - (24)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태 (42)는 제1 결합 도메인이 각각 서열 21-23 및 서열 24-26으로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하고, 상기 제2 결합 도메인이 서열 12-14로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하는, 실시양태 (31)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태 (43)는 상기 제1 결합 도메인이 서열 27, 25, 26으로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하고, 상기 제2 결합 도메인이 서열 12-14로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하는, 실시양태 (32)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태 (44)는 상기 제1 결합 도메인이 서열 28, 25 및 26으로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하고, 상기 제2 결합 도메인이 서열 12-14로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하는, 실시양태 (33)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태 (45)는 상기 제1 결합 도메인이 서열 29-31로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하고, 상기 제2 결합 도메인이 서열 15-17로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하는, 실시양태 (34)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태 (46)는 상기 제1 결합 도메인이 서열 32-34로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하고, 상기 제2 결합 도메인이 서열 18-20으로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하는, 실시양태 (35)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태 (47)는 상기 제1 결합 도메인이 서열 73-75로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하고, 상기 제2 결합 도메인이 서열 70-72로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하는, 실시양태 (27)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태 (48)는 상기 제1 결합 도메인이 서열 81-83으로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하고, 상기 제2 결합 도메인이 서열 78-80으로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하는, 실시양태 (27)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태 (49)는 상기 제1 결합 도메인이 서열 101-103으로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하고, 상기 제2 결합 도메인이 서열 98-100으로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하는, 실시양태 (27)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태 (50)는 상기 제1 결합 도메인이 서열 89, 115 및 91로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하고, 상기 제2 결합 도메인이 서열 106-108로 나타낸 바와 같은 CDR을 함유하는, 실시양태 (27)에 따른 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

또 다른 실시양태 (51)에서, 본 발명은 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 특히 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는

a. 서열 6으로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 1로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인; 또는

b. 서열 7로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 1로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인; 또는

c. 서열 8로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 2로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인; 또는

d. 서열 9로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 3으로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인; 또는

e. 서열 10으로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 4로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인; 또는

f. 서열 11로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 5로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인; 또는

g. 서열 69로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 68로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인; 또는

h. 서열 77로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 76으로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인; 또는

i. 서열 116으로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 88로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인; 또는

j. 서열 92로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 88로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인; 또는

k. 서열 97로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 6으로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인; 또는

l. 서열 105로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제1 결합 도메인 및/또는 서열 104로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 제2 결합 도메인

을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태 (52)에서, 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드는 항체, 특히 IgG2a, IgG2b 또는 IgG3 이소형의 항체, 특히 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체이다.

본 발명의 한 실시양태 (48)는 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

한 실시양태 (53)에서, 상기 폴리뉴클레오티드는

a. 서열 35-45, 서열 84-87, 서열 109-112 및 117로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;

b. 서열 35-45, 서열 84-87, 서열 109-112 및 117로 나타낸 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;

c. 서열 35-45, 서열 84-87, 서열 109-112 및 117로 나타낸 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;

d. 서열 35-45, 서열 84-87, 서열 109-112 및 117로 나타낸 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;

e. 서열 35-45, 서열 84-87, 서열 109-112 및 117로 나타낸 서열에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;

f. 서열 35-45, 서열 84-87, 서열 109-112 및 117로 나타낸 서열에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;

g. 상보적 가닥이 a) - f) 중 어느 하나의 핵산 분자에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열;

h. 유전자 코드의 축중성에 의해 a) - g)의 어느 하나에 정의된 뉴클레오티드 서열로부터 벗어난 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자

로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분자를 포함하며,

여기서 a) - h)의 어느 하나에 정의된 바와 같은 상기 핵산 분자는 위치 18에 인산화 Tyr (Y18)을 포함하는 Tau aa 15-20, 위치 409에 인산화 Ser (pS409)을 포함하는 Tau aa 405-412, 위치 409에 인산화 Ser (pS409)을 포함하는 Tau aa 405-411; 및 위치 212에 인산화 Thr (pT212) 및 위치 214에 인산화 Ser (pS214)을 포함하는 Tau aa 208-218, 위치 396에 인산화 Ser (pS396)을 포함하는 Tau aa 393-401, 위치 396에 인산화 Ser (pS396)을 포함하는 Tau aa 396-401, 위치 396에 인산화 Ser (pS396)을 포함하는 Tau aa 394-400, 위치 404에 인산화 Ser (pS404)을 포함하는 Tau aa 402-406, 및 위치 396에 인산화 Ser (pS396)을 포함하는 Tau aa 393-400으로 이루어진 군으로부터 선택된, 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편, 특히 서열 67로 나타낸 바와 같은 인간 타우 단백질 상의 포스포-에피토프를 인식하여 이에 특이적으로 결합하며, 한 실시양태에서 상기 결합 펩티드는 적어도 10 nM, 특히 적어도 8 nM, 특히 적어도 5 nM, 특히 적어도 2 nM, 특히 적어도 1 nM, 특히 적어도 500 pM, 특히 적어도 400 pM, 특히 적어도 300 pM, 특히 적어도 200 pM, 특히 적어도 100 pM, 특히 적어도 50 pM의 해리 상수로 높은 결합 친화도를 갖고/거나 10⁴ M^-1s^-1 이상, 특히 3 - 5 x 10⁴ M^-1s^-1 이상, 특히 10⁵ M^-1s^-1 이상; 특히 6 - 9 x 10⁵ M^-1s^-1 이상; 특히 10⁶ M^-1s^-1 이상, 특히 1 - 4 x 10⁶ M^-1s^-1 이상, 특히 10⁷ M^-1s^-1 이상의 회합률 상수를 갖지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는다.

본 발명의 다양한 실시양태 (54)에서, 포유동물, 특히 인간 타우 단백질, 특히 미세관-연관 단백질 타우, 특히 응집된 미세관-연관 및 과인산화 단백질 타우, 예컨대 신경원섬유 엉킴, 신경망사 및 이영양성 신경돌기에서 우세한 구조인 쌍을 이룬 나선형 필라멘트 (PHF)에 존재하는 것 상의 포스포-에피토프를 특이적으로 인식하여 이에 결합할 수 있지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 조합이 제공된다.

본 발명의 구체적 실시양태 (55)에서, 인간 타우 단백질은 서열 67로 나타낸 바와 같은 인간 타우 단백질이다.

따라서 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 및 항체는 증가된 수준의 가용성 타우 단백질 및/또는 가용성 인산화 타우 단백질을 함유하는 포유동물 또는 인간의 뇌, 특히 뇌 피질 및/또는 해마에서 전체 가용성 타우 단백질, 특히 가용성 인산화 타우 단백질의 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다 (56).

또한, 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 및 항체는 증가된 수준의 과인산화 타우 단백질을 함유하는 쌍을 이룬 나선형 필라멘트 (pTau PHF)를 함유하는 포유동물 또는 인간의 뇌, 특히 뇌 피질 및/또는 해마에서 상기 pTau 쌍을 이룬 나선형 필라멘트 (pTau PHF)의 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다 (57).

증가된 수준의 전체 가용성 타우 단백질 및/또는 가용성 인산화 타우 단백질 및/또는 pTau 쌍을 이룬 나선형 필라멘트 (pTau PHF)를 함유하는 포유동물 또는 인간에서 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태에 기여하는, 상기 포유동물 또는 인간의 뇌, 특히 뇌 피질 및/또는 해마에서 상기 타우 단백질 변이체의 수준의 감소는 이러한 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태와 연관된 증상의 개선 및/또는 완화로 이어질 수 있다 (58).

따라서 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 및 항체는 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태의 진행을 지연시키거나 정지시키기 위한 요법, 특히 인간 요법에 사용될 수 있다 (59).

상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 및 항체는 또한 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태와 연관된 증상, 예컨대 예를 들어 추론, 상황 판단, 기억 용량, 학습, 특정한 탐지 등을 포함하는 인지 기능의 손상 또는 손실을 개선 또는 완화하기 위한 요법, 특히 인간 요법에 사용될 수 있다 (60).

한 실시양태 (61)에서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한, 특히 타우-단백질-연관 질환 및 장애의 일군인 타우병증의 치료에 사용하기 위한, 또는 타우병증과 연관된 증상을 완화하기 위한 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 및 항체에 관한 것이다.

한 실시양태 (62)에서, 본 발명은 타우병증을 앓고 있는 포유동물에서 인지 기억 용량의 유지 또는 증가를 위한 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 및 항체에 관한 것이다.

본 발명의 구체적 실시양태 (63)에서, 각각 서열 25, 26, 27, 및 서열 21, 22, 23으로 주어진 바와 같은 항체 ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-3A8-Ab1, 및 ACI-36-3A8-Ab2의 경쇄 CDR 중 적어도 하나 또는 모두, 및/또는 서열 12, 13, 14로 주어진 바와 같은 항체 ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-3A8-Ab1, 및 ACI-36-3A8-Ab2의 중쇄 CDR 중 적어도 하나 또는 모두를 포함하는 결합 펩티드 및 항체는 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태와 연관된 증상, 예컨대 예를 들어 추론, 상황 판단, 기억, 학습, 특정한 탐지 등을 포함하는 인지 기능의 손상 또는 손실의 개선 또는 완화를 위한 요법, 특히 인간 요법에 사용된다.

본 발명의 또 다른 구체적 실시양태 (64)에서, 각각 서열 8 및 서열 6, 7로 주어진 바와 같은 항체 ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-3A8-Ab1, 및 ACI-36-3A8-Ab2의 경쇄, 및/또는 각각 서열 1 및 서열 2로 주어진 바와 같은 항체 ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab12, ACI-36-3A8-Ab1, 및 ACI-36-3A8-Ab2의 중쇄를 포함하는 항체는 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태와 연관된 증상, 예컨대 예를 들어 추론, 상황 판단, 기억, 학습, 특정한 탐지 등을 포함하는 인지 기능의 손상 또는 손실의 개선 또는 완화를 위한 요법, 특히 인간 요법에 사용된다.

본 발명의 또 다른 구체적 실시양태 (65)에서, 서열 29, 30, 31로 주어진 바와 같은 항체 ACI-33-6C10-Ab1 및 ACI-33-6C10-Ab2의 경쇄 CDR 중 적어도 하나 또는 모두, 및/또는 서열 15, 16, 17로 주어진 바와 같은 항체 ACI-33-6C10-Ab1 및 ACI-33-6C10-Ab2의 중쇄 CDR 중 적어도 하나 또는 모두를 포함하는 결합 펩티드 및 항체는 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태와 연관된 증상, 예컨대 예를 들어 추론, 상황 판단, 기억, 학습, 특정한 탐지 등을 포함하는 인지 기능의 손상 또는 손실의 개선 또는 완화를 위한 요법, 특히 인간 요법에 사용된다.

본 발명의 또 다른 구체적 실시양태 (66)에서, 서열 32, 33, 34로 주어진 바와 같은 항체 ACI-41-7C2-Ab1 및 ACI-41-7C2-Ab2의 경쇄 CDR 중 적어도 하나 또는 모두, 및/또는 서열 18, 19, 20으로 주어진 바와 같은 항체 ACI-41-7C2-Ab1 및 ACI-41-7C2-Ab2의 중쇄 CDR 중 적어도 하나 또는 모두를 포함하는 결합 펩티드 및 항체는 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태와 연관된 증상, 예컨대 예를 들어 추론, 상황 판단, 기억, 학습, 특정한 탐지 등을 포함하는 인지 기능의 손상 또는 손실의 개선 또는 완화를 위한 요법, 특히 인간 요법에 사용된다.

본 발명의 또 다른 구체적 실시양태 (67)에서, 서열 73-75, 81-83, 93-95, 101-103, 106-108로 주어진 바와 같은 항체 ACI-35-2A1-Ab1; ACI-35-2A1-Ab2; ACI-35-4A6-Ab1; ACI-35-4A6-Ab2; ACI-35-1D2-Ab1; ACI-35-2G5-Ab1의 경쇄 CDR 중 적어도 하나 또는 모두; 및/또는 서열 70-72, 78-80, 89-91, 98-100으로 주어진 바와 같은 항체 ACI-35-2A1-Ab1; ACI-35-2A1-Ab2; ACI-35-4A6-Ab1; ACI-35-4A6-Ab2; ACI-35-1D2-Ab1; ACI-35-2G5-Ab1의 중쇄 CDR 중 적어도 하나 또는 모두를 포함하는 결합 펩티드 및 항체는 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태와 연관된 증상, 예컨대 예를 들어 추론, 상황 판단, 기억, 학습, 특정한 탐지 등을 포함하는 인지 기능의 손상 또는 손실의 개선 또는 완화를 위한 요법, 특히 인간 요법에 사용된다.

본 발명의 또 다른 구체적 실시양태 (68)에서, 서열 106-108로 주어진 바와 같은 항체 ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3의 경쇄 CDR 중 적어도 하나 또는 모두 및/또는 서열 89, 115 및 91로 주어진 바와 같은 항체 ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3의 중쇄 CDR 중 적어도 하나 또는 모두를 포함하는 결합 펩티드 및 항체는 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태와 연관된 증상, 예컨대 예를 들어 추론, 상황 판단, 기억, 학습, 특정한 탐지 등을 포함하는 인지 기능의 손상 또는 손실의 개선 또는 완화를 위한 요법, 특히 인간 요법에 사용된다.

뇌 상에서의 타우 엉킴 및 pTau에 대한 상기 실시양태에 따른 펩티드 또는 항체의 결합은 실시예에 기재된 바와 같이 각각 선택된 뇌 절편의 단백질 면역반응성 시험의 적용 및 뇌 균질물의 웨스턴 블롯팅에 의해 결정될 수 있다.

또 다른 실시양태 (69)에서, 본 발명은 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 조합을 치료 유효량으로 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

한 실시양태 (70)에서, 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 제약 조성물, 또는 그의 조합은 신경변성 장애, 예컨대 타우병증을 포함하는 타우-단백질-연관 질환 또는 장애의 증상의 치료 또는 완화를 위한 요법, 특히 인간 요법에 사용된다.

상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드, 항체 및/또는 제약 조성물은 따라서 상기 결합 펩티드, 항체 및/또는 제약 조성물을 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태를 앓고 있는 동물, 특히 포유동물, 특별히 인간에게 투여하였을 때 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태의 진행을 지연시키거나 정지시키는데 사용될 수 있다 (71).

상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드, 항체 및/또는 제약 조성물은 또한 상기 결합 펩티드, 항체 및/또는 제약 조성물을 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태와 연관된 증상, 예컨대 예를 들어 추론, 상황 판단, 기억 용량, 학습, 특정한 탐지 등을 포함하는 인지 기능의 손상 또는 손실을 앓고 있는 동물, 특히 포유동물, 특별히 인간에게 투여하였을 때 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태와 연관된 증상, 예컨대 예를 들어 추론, 상황 판단, 기억 용량, 학습, 특정한 탐지 등을 포함하는 인지 기능의 손상 또는 손실을 개선 또는 완화하는데 사용될 수 있다 (72).

한 실시양태 (73)에서, 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약 조성물, 또는 그의 조합은 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 권투선수 치매, 다운 증후군, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커병, 봉입체 근염, 및 프리온 단백질 뇌 아밀로이드 혈관병증, 외상성 뇌 손상을 포함하나 이에 제한되지 않는 타우 및 아밀로이드 병리상태의 공존을 보여주는 질환 또는 장애, 및 괌의 근위축성 측삭 경화증/파킨슨증-치매 복합증, 신경원섬유 엉킴을 갖는 비-괌 운동 뉴런 질환, 은친화성 입자 치매, 피질기저 변성, 석회화를 갖는 미만성 신경원섬유 엉킴, 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두엽 치매, 할러보르덴-스파츠병, 다계통 위축, 니만-픽병, 유형 C, 담창구-교뇌-흑질 변성, 픽병, 진행성 피질하 교세포증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 엉킴 단독 치매, 뇌염후 파킨슨증, 근긴장성 이영양증을 포함하나 이에 제한되지 않는 특징적인 아밀로이드 병리상태를 나타내지 않는 추가의 질환 또는 장애를 포함하는 이종성 군의 신경변성 질환 또는 장애를 포함하는, 타우병증에서 우세한 뇌 병리상태인 신경원섬유 병볍의 형성에 의해 유발되거나 또는 이와 연관된 질환 및 장애의 치료에 사용된다.

한 실시양태 (74)에서, 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약 조성물, 또는 그의 조합은 알츠하이머병의 치료에 사용된다.

본 발명의 한 실시양태 (75)에서, 동물, 특히 포유동물 또는 인간에게 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약 조성물, 또는 그의 조합을 투여하는 것을 포함하는, 특히 상기 동물, 특히 상기 포유동물 또는 인간의 뇌, 특히 뇌 피질 및/또는 해마에서 가용성 및/또는 불용성 타우 수준을 조절하는 방법이 제공된다.

한 측면에서, 조절은 증가된 수준의 가용성 타우 단백질 및/또는 가용성 인산화 타우 단백질을 함유하는 동물, 특히 포유동물 또는 인간의 뇌, 특히 뇌 피질 및/또는 해마에서 가용성 타우 단백질, 특히 가용성 인산화 타우 단백질의 수준을 감소시키는 것과 관련이 있다.

본 발명의 한 실시양태 (76)에서, 증가된 수준의 불용성 타우 단백질, 특히 과인산화 타우 단백질을 함유하는 쌍을 이룬 나선형 필라멘트 (pTau PHF)를 함유하는 동물, 특히 포유동물 또는 인간에게 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약 조성물, 또는 그의 조합을 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물, 특히 상기 포유동물 또는 인간의 뇌, 특히 뇌 피질 및/또는 해마에서 불용성 타우 단백질, 특히 pTau 쌍을 이룬 나선형 필라멘트 (pTau PHF)의 수준을 감소시키는 방법이 제공된다.

한 실시양태 (77)에서, 본 발명은 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태를 앓고 있는 동물, 특히 포유동물 또는 인간에게 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약 조성물, 또는 그의 조합을 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물, 특히 상기 포유동물 또는 인간에서 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태의 진행을 지연시키거나 정지시키는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태 (78)에서, 본 발명은 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태와 연관된 증상, 예컨대 예를 들어 추론, 상황 판단, 기억 용량, 학습, 특정한 탐지 등을 포함하는 인지 기능의 손상 또는 손실을 앓고 있는 동물, 특히 포유동물 또는 인간에게 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약 조성물, 또는 그의 조합을 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물, 특히 상기 포유동물 또는 인간에서 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태와 연관된 증상, 예컨대 예를 들어 추론, 상황 판단, 기억 용량, 학습, 특정한 탐지 등을 포함하는 인지 기능의 손상 또는 손실을 개선 또는 완화하는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태 (79)에서, 본 발명은 타우병증을 앓고 있는 포유동물에서 인지 기억 용량을 유지 또는 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시양태 (80)에서, 신경변성 질환 또는 장애, 예컨대 타우병증을 포함하는 타우-단백질-연관 질환 또는 장애를 앓고 있는 동물, 특히 포유동물, 특별히 인간에게 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약 조성물, 또는 그의 조합을 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 질환 또는 장애, 예컨대 타우병증을 포함하는 타우-단백질-연관 질환 또는 장애의 치료 방법이 제공된다.

본 발명의 한 실시양태 (81)에서, 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 권투선수 치매, 다운 증후군, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커병, 봉입체 근염, 및 프리온 단백질 뇌 아밀로이드 혈관병증, 외상성 뇌 손상을 포함하나 이에 제한되지 않는 타우 및 아밀로이드 병리상태의 공존을 보여주는 질환 또는 장애, 및 괌의 근위축성 측삭 경화증/파킨슨증-치매 복합증, 신경원섬유 엉킴을 갖는 비-괌 운동 뉴런 질환, 은친화성 입자 치매, 피질기저 변성, 석회화를 갖는 미만성 신경원섬유 엉킴, 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두엽 치매, 할러보르덴-스파츠병, 다계통 위축, 니만-픽병, 유형 C, 담창구-교뇌-흑질 변성, 픽병, 진행성 피질하 교세포증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 엉킴 단독 치매, 뇌염후 파킨슨증, 근긴장성 이영양증을 포함하나 이에 제한되지 않는 특징적인 아밀로이드 병리상태를 나타내지 않는 추가의 질환 또는 장애를 포함하는 이종성 군의 신경변성 질환 또는 장애를 포함하는, 타우병증에서 우세한 뇌 병리상태인 신경원섬유 병볍의 형성에 의해 유발되거나 또는 이와 연관된 질환 및 장애를 앓고 있는 동물, 특히 포유동물, 특별히 인간에게 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 제약 조성물, 또는 그의 조합을 투여하는 것을 포함하는 상기 질환 및 장애의 치료 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시양태 (82)에서, 신경변성 장애, 예컨대 타우병증을 앓고 있는 동물, 특히 포유동물 또는 인간에게 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 제약 조성물, 또는 그의 조합을 투여하여 상기 동물, 특히 상기 포유동물 또는 인간에서 수동 면역 반응을 유발하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시양태 (83)에서,

a. 상기 실시양태 중 어느 한 항에 따른 결합 펩티드 또는 그의 단편, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분과 타우 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 신체 부위를 접촉시키며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체 또는 그의 단편은 타우 단백질의 에피토프에 결합하는 것인 단계;

b. 상기 결합 펩티드, 특히 상기 항체, 특히 상기 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분을 타우 단백질에 결합시켜 면역학적 복합체를 형성하는 단계;

c. 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계; 및

d. 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 부위에서의 타우 단백질의 존재 또는 부재와 연관시키는 단계를 포함하며,

샘플 또는 계내에서 타우 단백질의 에피토프에 대한 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 활성 단편, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분의 면역특이적 결합을 검출하는 것을 포함하는, 환자에서 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태를 진단하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시양태 (84)에서,

a. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 활성 단편, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분과 타우 항원을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 신체 부위를 접촉시키며, 여기서 펩티드 또는 그의 단편은 타우 단백질의 에피토프에 결합하는 것인 단계;

b. 상기 결합 펩티드, 특히 상기 항체, 특히 상기 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분을 타우 항원에 결합시켜 면역학적 복합체를 형성하는 단계;

c. 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계; 및

d. 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 부위에서의 타우 항원의 존재 또는 부재와 연관시키는 단계;

e. 상기 면역학적 복합체의 양을 정상 대조 값과 비교하는 단계를 포함하며,

여기서 정상 대조 값과 비교하여 상기 응집체의 양의 증가는 환자가 타우-단백질-연관 질환 또는 상태를 앓고 있거나 또는 발생할 위험이 있다는 것을 나타내는 것인,

샘플 또는 계내에서 타우 단백질의 에피토프에 대한 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 활성 단편, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분의 면역특이적 결합을 검출하는 것을 포함하는, 환자에서 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태에 대한 소인을 진단하는 방법이 제공된다.

본 발명의 한 실시양태 (85)에서,

a. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분과 타우 항원을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 신체 부위를 접촉시키며, 여기서 펩티드 또는 그의 단편은 타우 단백질의 에피토프에 결합하는 것인 단계;

c. 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계; 및

d. 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 부위에서의 타우 항원의 존재 또는 부재와 연관시키는 단계,

여기서 정상 대조 값과 비교하여 상기 응집체의 양의 증가는 환자가 여전히 최소 잔류 질환을 앓고 있다는 것을 나타내는 것인,

상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 제약 조성물로의 치료 후에 환자에서 최소 잔류 질환을 모니터링하는 방법이 제공된다.

한 실시양태 (86)에서,

c. 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계; 및

e. 치료의 개시 전후에 상기 면역학적 복합체의 양을 비교하는 단계를 포함하며,

여기서 상기 응집체의 양의 감소는 환자가 치료에 대해 반응할 높은 잠재성을 갖는다는 것을 나타내는 것인,

상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 제약 조성물로 치료되는 환자의 반응성을 예측하는 방법이 제공된다.

또 다른 실시양태 (87)에서, 본 발명은 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 활성 단편, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분을 포함하는, 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태의 검출 및 진단을 위한 시험 키트에 관한 것이다.

한 실시양태 (88)에서, 상기 시험 키트는 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 결합 펩티드 또는 그의 활성 단편, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분을 수용하는 용기, 및 타우 항원에 결합시켜 면역학적 복합체를 형성하고 면역학적 복합체의 형성을 검출하여 타우 항원 존재 또는 부재와 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 연관시키기 위한 목적을 위해 결합 펩티드 또는 항체를 사용하기 위한 설명서를 포함한다.

또 다른 실시양태 (89)에서, 본 발명은 위치 18에 인산화 Tyr (Y18)을 포함하는 서열 67로 나타낸 바와 같은 인간 타우 단백질의 Tau aa 15-20, 위치 409에 인산화 Ser (pS409)을 포함하는 Tau aa 405-412, 위치 409에 인산화 Ser (pS409)을 포함하는 Tau aa 405-411; 및 위치 212에 인산화 Thr (pT212) 및 위치 214에 인산화 Ser (pS214)을 포함하는 Tau aa 208-218로 이루어진 군으로부터 선택된 에피토프에 관한 것이다.

한 실시양태 (90)에서, 상기 에피토프는 위치 18에 인산화 Tyr (Y18)을 갖는 Tau aa 15-20으로 이루어진다.

한 실시양태 (91)에서, 상기 에피토프는 위치 409에 인산화 Ser (pS409)을 갖는 Tau aa 405-412로 이루어진다.

한 실시양태 (92)에서, 상기 에피토프는 위치 409에 인산화 Ser (pS409)을 갖는 Tau aa 405-411로 이루어진다.

또 다른 실시양태 (93)에서, 본 발명은 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 활성 단편, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분을 생산하는 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (94)에서, 본 발명은 2010년 8월 25일에 DSM ACC3079로서 기탁된 하이브리도마 세포주 6C10F9C12A11인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (95)에서, 본 발명은 2010년 8월 25일에 DSM ACC3081로서 기탁된 하이브리도마 세포주 6C10E5E9C12인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (96)에서, 본 발명은 2010년 8월 25일에 DSM ACC3080으로서 기탁된 하이브리도마 세포주 6H1A11C11인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (97)에서, 본 발명은 2010년 8월 25일에 DSM ACC3088로서 기탁된 하이브리도마 세포주 6H1G6E6인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (98)에서, 본 발명은 2010년 8월 25일에 DSM ACC3084로서 기탁된 하이브리도마 세포주 2B6A10C11인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (99)에서, 본 발명은 2010년 3월 10일에 DSM ACC3087로서 기탁된 하이브리도마 세포주 2B6G7A12인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (100)에서, 본 발명은 2010년 8월 25일에 DSM ACC3086으로서 기탁된 하이브리도마 세포주 3A8A12G7인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (101)에서, 본 발명은 2010년 8월 25일에 DSM ACC3085로서 기탁된 하이브리도마 세포주 3A8E12H8인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (102)에서, 본 발명은 2010년 8월 25일에 DSM ACC3082로서 기탁된 하이브리도마 세포주 7C2(1)F10C10D3인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (103)에서, 본 발명은 2010년 8월 25일에 DSM ACC3083으로서 기탁된 하이브리도마 세포주 7C2(2)B9F11D5인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (103a)에서, 본 발명은 2011년 8월 30일에 DSM ACC3136으로서 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-4A6-48인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (103b)에서, 본 발명은 2011년 8월 30일에 DSM ACC3137로서 기탁된 하이브리도마 세포주 A6-2G5-30인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (103c)에서, 본 발명은 2011년 8월 30일에 DSM ACC3138로서 기탁된 하이브리도마 세포주 A6-2G5-41인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (103d)에서, 본 발명은 2011년 8월 30일에 DSM ACC3139로서 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-2A1-18인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (103e)에서, 본 발명은 2011년 8월 30일에 DSM ACC3140으로서 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-2A1-40인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (103e)에서, 본 발명은 2011년 9월 6일에 DSM ACC3141로서 기탁된 하이브리도마 세포주 A6-1D2-12인 세포주에 관한 것이다.

한 실시양태 (104)에서, 본 발명은

a. 제1 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 54의 5'-프라이머 및 서열 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머 쌍; 및/또는

b. 제2 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 53 및 서열 54의 5'-프라이머 및 서열 47의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스

를 사용하여 2010년 8월 25일에 DSM ACC3079로서 기탁된 하이브리도마 세포주 6C10F9C12A11의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (105)에서, 본 발명은

a. 제1 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 48 및 서열 49의 5'-프라이머 및 서열 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스; 및/또는

를 사용하여 2010년 8월 25일에 DSM ACC3081로서 기탁된 하이브리도마 세포주 6C10E5E9C12의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (106)에서, 본 발명은

a. 제1 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 50의 5'-프라이머 및 서열 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머 쌍; 및/또는

b. 제2 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 46의 5'-프라이머 및 서열 47의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머 쌍

을 사용하여 2010년 8월 25일에 DSM ACC3080으로서 기탁된 하이브리도마 세포주 6H1A11C11의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (107)에서, 본 발명은

을 사용하여 2010년 8월 25일에 DSM ACC3088로서 기탁된 하이브리도마 세포주 6H1G6E6의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (108)에서, 본 발명은

b. 제2 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 46 및 서열 52의 5'-프라이머 및 서열 47의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스

를 사용하여 2010년 8월 25일에 DSM ACC3084로서 기탁된 하이브리도마 세포주 2B6A10C11의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (109)에서, 본 발명은

를 사용하여 2010년 8월 25일에 DSM ACC3087로서 기탁된 하이브리도마 세포주 2B6G7A12의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (110)에서, 본 발명은

a₁. 제1 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 48 및 서열 49의 5'-프라이머 및 서열 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스; 또는

a₂. 제1 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 50의 5'-프라이머 및 서열 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머 쌍; 및/또는

을 사용하여 2010년 8월 25일에 DSM ACC3086으로서 기탁된 하이브리도마 세포주 3A8A12G7의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (111)에서, 본 발명은

을 사용하여 2010년 8월 25일에 DSM ACC3085로서 기탁된 하이브리도마 세포주 3A8E12H8의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (112)에서, 본 발명은

a. 제1 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 49; 서열 56 및 서열 57의 5'-프라이머 및 서열 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스;

b. 제2 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 53 및 서열 55의 5'-프라이머 및 서열 47의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스

를 사용하여 2010년 8월 25일에 DSM ACC3082로서 기탁된 하이브리도마 세포주 7C2(1)F10C10D3의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (113)에서, 본 발명은

a. 제1 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 57의 5'-프라이머 및 서열 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 쌍;

를 사용하여 2010년 8월 25일에 DSM ACC3083으로서 기탁된 하이브리도마 세포주 7C2(2)B9F11D5의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (114)에서, 본 발명은

a. 제1 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 149의 5'-프라이머 및 서열 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머 쌍; 및/또는

b. 제2 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 120, 123, 124, 136, 137, 138, 139, 및 140으로 이루어진 군으로부터 선택된 5'-프라이머 및 서열 131, 134, 및 141-148로 이루어진 군으로부터 선택된 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스

를 사용하여 2011년 8월 30일에 DSM ACC3139로서 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-2A1-18의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (115)에서, 본 발명은

a. 제1 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 51 및 169-174로 이루어진 군으로부터 선택된 5'-프라이머 및 서열 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스; 및/또는

b. 제2 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 124, 127, 및 150-158로 이루어진 군으로부터 선택된 5'-프라이머 및 서열 130, 및 159-168로 이루어진 군으로부터 선택된 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스

를 사용하여 2011년 8월 30일에 DSM ACC3137로서 기탁된 하이브리도마 세포주 A6-2G5-30의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (116)에서, 본 발명은

a. 제1 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 178, 179 및 180으로 이루어진 군으로부터 선택된 5'-프라이머 및 서열 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스; 및/또는

b. 제2 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 121, 127, 139, 154, 155, 및 175로 이루어진 군으로부터 선택된 5'-프라이머 및 서열 128, 129, 147, 176, 및 177로 이루어진 군으로부터 선택된 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스

를 사용하여 2011년 8월 30일에 DSM ACC3140으로서 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-2A1-40의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (117)에서, 본 발명은

a. 제1 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 51 및 188-192로 이루어진 군으로부터 선택된 5'-프라이머 및 서열 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스; 및/또는

b. 제2 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 120, 124, 126, 181, 182 및 183으로 이루어진 군으로부터 선택된 5'-프라이머 및 서열 144, 145 및 184-187로 이루어진 군으로부터 선택된 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스

를 사용하여 2011년 8월 30일에 DSM ACC3138로서 기탁된 하이브리도마 세포주 A6-2G5-41의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (118)에서, 본 발명은

a. 제1 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 50 및 201-204로 이루어진 군으로부터 선택된 5'-프라이머 및 서열 51의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스; 및/또는

b. 제2 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 121, 137, 151 및 193-197로 이루어진 군으로부터 선택된 5'-프라이머 및 서열 131, 141, 144, 166, 198, 199 및 200으로 이루어진 군으로부터 선택된 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스

를 사용하여 2011년 8월 30일에 DSM ACC3136으로서 기탁된 하이브리도마 세포주 A4-4A6-48의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (119)에서, 본 발명은

a. 제1 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 209-214, 및 219-221로 이루어진 군으로부터 선택된 5'-프라이머 및 서열 215의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스; 및/또는

b. 제2 결합 도메인의 증폭을 위한 서열 216, 217 및 218로 이루어진 군으로부터 선택된 5'-프라이머 및 서열 208의 3'-프라이머를 포함하는 프라이머의 믹스

를 사용하여 2011년 9월 6일에 DSM ACC3141로서 기탁된 하이브리도마 세포주 A6-1D2-12의 DNA의 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 뉴클레오티드 단편 상에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 도메인을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이다.

한 실시양태 (120)에서, 상기 실시양태의 어느 하나에 따른 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 낙타류 항체, 디아바디 또는 변형 또는 조작된 항체일 수 있다.

한 실시양태 (121)에서, 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분은 중쇄 및/또는 경쇄, 특히 서열 1-5로 나타낸 바와 같은 중쇄 및/또는 서열 6-11로 나타낸 바와 같은 경쇄를 포함하는 단편, 특히 Fab 또는 F(ab')₂ 단편일 수 있다.

구체적 실시양태 (122)에서, 본 발명은 서열 1-5로 나타낸 바와 같은 중쇄에 관한 것이다.

또 다른 구체적 실시양태 (123)에서, 본 발명은 서열 6-11로 나타낸 바와 같은 경쇄에 관한 것이다.

한 실시양태 (124)에서, 본 발명은 상기 실시양태 중 어느 하나의 세포주를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계, 및 임의로 세포주 또는 배양 배지로부터 결합 펩티드 또는 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 상기 실시양태 중 어느 하나의 결합 펩티드 또는 항체를 생산하는 방법을 제공한다.

도면 및 서열의 간단한 설명
도면
도 1은 TAUPIR을 이용하는 biGT (Tau 바이제닉(bigenic)) 마우스로부터의 뇌 절편에서의 포스포-Tau에 대한 항체 결합을 보여준다.
도 2는 TAUPIR을 이용하는 AD 및 타우병증 환자로부터의 뇌 절편에서의 포스포-Tau에 대한 항체 결합을 ACI-36-3A8-Ab1 항체를 이용하여 보여준다.
도 3은 MSD를 이용하여 pTau 에피토프 pT231에 대한 1주 생체내 연구 후의 항-Tau 항체 처리의 효과를 보여준다.
도 4는 가용성 및 사르코실 불용성 (SinT) 타우 단백질 분획에 사용되는 뇌를 제조하는 방법을 보여주는 다이어그램을 보여준다.
도 5는 1개월 (도 5A, 5B, 5C, 5G, 5H, 5I) 또는 3개월 생체내 연구 (도 5D, 5E, 5F)에서 항-Tau 항체 처리 후의 pTau 에피토프 웨스턴 블롯 결과를 보여준다.
도 6은 biGT 바이제닉 마우스를 이용한 3개월 생체내 연구에서 항-Tau 항체 처리 후의 pTau 에피토프 웨스턴 블롯 결과를 보여준다.
도 7은 3개월 생체내 연구에서 ACI-36-2B6-Ab1에 의한 항-Tau 항체 처리 후의 IHC를 보여준다.
도 8은 3개월 생체내 연구에서 ACI-36-3A8-Ab1에 의한 항-Tau 항체 처리 후의 IHC를 보여준다.
도 9는 3개월 생체내 연구에서 ACI-36-2B6-Ab1에 의한 항-Tau 항체 처리 후의 모리스 수중 미로(Morris Water-Maze) 결과를 보여준다.
도 10은 3개월 생체내 연구에서 ACI-36-3A8-Ab1에 의한 항-Tau 항체 처리 후의 모리스 수중 미로 결과를 보여준다.
서열
서열 1은 하이브리도마 세포주 3A8A12G7에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 2는 하이브리도마 세포주 2B6A10C11에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-2B6-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 3은 하이브리도마 세포주 6H1A11C11 및 6H1G6E6 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-6H1-Ab1 및 ACI-36-6H1-Ab2의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 4는 하이브리도마 세포주 6C10E5E9C12 및 6C10F9C12A11 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-33-6C10-Ab2 및 ACI-33-6C10-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 5는 하이브리도마 세포주 7C2(1)F10C10D3 및 7C2(2)B9F11D5 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-41-7C2-Ab1 및 ACI-41-7C2-Ab2의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 6은 하이브리도마 세포주 3A8A12G7 및 3A8E12H8 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1_VK-AD 및 ACI-36-3A8-Ab2_VK-AD의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 7은 하이브리도마 세포주 3A8A12G7 및 3A8E12H8 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1_VK-G 및 ACI-36-3A8-Ab2_VK-G의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 8은 하이브리도마 세포주 2B6A10C11 및 2B6G7A12 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-2B6-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 9는 하이브리도마 세포주 6H1A11C11 및 6H1G6E6 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-6H1-Ab1 및 ACI-36-6H1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 10은 하이브리도마 세포주 6C10E5E9C12 및 6C10F9C12A11 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-33-6C10-Ab2 및 ACI-33-6C10-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 11은 하이브리도마 세포주 7C2(1)F10C10D3 및 7C2(2)B9F11D5 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-41-7C2-Ab1 및 ACI-41-7C2-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 12는 하이브리도마 세포주 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 및 6H1G6E6 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1, ACI-36-3A8-Ab2, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1-Ab1 및 ACI-36-6H1-Ab2의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 13은 하이브리도마 세포주 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 및 6H1G6E6 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1, ACI-36-3A8-Ab2, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1-Ab1 및 ACI-36-6H1-Ab2의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 14는 하이브리도마 세포주 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 및 6H1G6E6 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1, ACI-36-3A8-Ab2, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1-Ab1 및 ACI-36-6H1-Ab2의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 15는 하이브리도마 세포주 6C10E5E9C12 및 6C10F9C12A11 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-33-6C10-Ab2 및 ACI-33-6C10-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 16은 하이브리도마 세포주 6C10E5E9C12 및 6C10F9C12A11 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-33-6C10-Ab2 및 ACI-33-6C10-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 17은 하이브리도마 세포주 6C10E5E9C12 및 6C10F9C12A11 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-33-6C10-Ab2 및 ACI-33-6C10-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 18은 하이브리도마 세포주 7C2(1)F10C10D3 및 7C2(2)B9F11D5 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-41-7C2-Ab1 및 ACI-41-7C2-Ab2의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 19는 하이브리도마 세포주 7C2(1)F10C10D3 및 7C2(2)B9F11D5 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-41-7C2-Ab1 및 ACI-41-7C2-Ab2의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 20은 하이브리도마 세포주 7C2(1)F10C10D3 및 7C2(2)B9F11D5 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-41-7C2-Ab1 및 ACI-41-7C2-Ab2의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 21은 하이브리도마 세포주 3A8A12G7 및 3A8E12H8 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1_VK-AD 및 ACI-36-3A8-Ab2_VK-AD의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 22는 하이브리도마 세포주 3A8A12G7 및 3A8E12H8 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1_VK-AD 및 ACI-36-3A8-Ab2_VK-AD의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 23은 하이브리도마 세포주 3A8A12G7 및 3A8E12H8 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1_VK-AD 및 ACI-36-3A8-Ab2_VK-AD의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 24는 하이브리도마 세포주 3A8A12G7 및 3A8E12H8 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1_VK-G 및 ACI-36-3A8-Ab2_VK-G의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 25는 하이브리도마 세포주 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 및 6H1G6E6 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1_VK-G, ACI-36-3A8-Ab2_VK-G, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1-Ab1 및 ACI-36-6H1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 26은 하이브리도마 세포주 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 및 6H1G6E6 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1_VK-G, ACI-36-3A8-Ab2_VK-G, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1-Ab1 및 ACI-36-6H1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 27은 하이브리도마 세포주 2B6A10C11 및 2B6G7A12 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-2B6-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 28은 하이브리도마 세포주 6H1A11C11 및 6H1G6E6 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-6H1-Ab1 및 ACI-36-6H1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 29는 하이브리도마 세포주 6C10E5E9C12 및 6C10F9C12A11 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-33-6C10-Ab2 및 ACI-33-6C10-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 30은 하이브리도마 세포주 6C10E5E9C12 및 6C10F9C12A11 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-33-6C10-Ab2 및 ACI-33-6C10-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 31은 하이브리도마 세포주 6C10E5E9C12 및 6C10F9C12A11 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-33-6C10-Ab2 및 ACI-33-6C10-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 32는 하이브리도마 세포주 7C2(1)F10C10D3 및 7C2(2)B9F11D5 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-41-7C2-Ab1 및 ACI-41-7C2-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 33은 하이브리도마 세포주 7C2(1)F10C10D3 및 7C2(2)B9F11D5 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-41-7C2-Ab1 및 ACI-41-7C2-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 34는 하이브리도마 세포주 7C2(1)F10C10D3 및 7C2(2)B9F11D5 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-41-7C2-Ab1 및 ACI-41-7C2-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 35는 하이브리도마 세포주 3A8A12G7 및 3A8E12H8 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1 및 ACI-36-3A8-Ab2의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 36은 하이브리도마 세포주 2B6A10C11 및 2B6G7A12 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-2B6-Ab2의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 37은 하이브리도마 세포주 6H1A11C11 및 6H1G6E6 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-6H1-Ab1 및 ACI-36-6H1-Ab2의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 38은 하이브리도마 세포주 6C10E5E9C12 및 6C10F9C12A11 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-33-6C10-Ab2 및 ACI-33-6C10-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 39는 하이브리도마 세포주 7C2(1)F10C10D3 및 7C2(2)B9F11D5 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-41-7C2-Ab1 및 ACI-41-7C2-Ab2의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 40은 하이브리도마 세포주 3A8A12G7 및 3A8E12H8 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1 및 ACI-36-3A8-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 41은 하이브리도마 세포주 3A8A12G7 및 3A8E12H8 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-3A8-Ab1 및 ACI-36-3A8-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 42는 하이브리도마 세포주 2B6A10C11 및 2B6G7A12 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-2B6-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 43은 하이브리도마 세포주 6H1A11C11 및 6H1G6E6 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-36-6H1-Ab1 및 ACI-36-6H1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 44는 하이브리도마 세포주 6C10E5E9C12 및 6C10F9C12A11 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-33-6C10-Ab2 및 ACI-33-6C10-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 45는 하이브리도마 세포주 7C2(1)F10C10D3 및 7C2(2)B9F11D5 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-41-7C2-Ab1 및 ACI-41-7C2-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 46 - 57은 VH/VK 정방향 및 역방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 58은 Tau 379-408 [pS396, pS404]의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 59는 Tau 5-20 [pY18]의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 60은 Tau 206-221 [pT212, pS214]의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 61은 Tau 196-211 [pS202, pT205]의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 62는 Tau 393-408 [pS396, pS404]의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 63은 Tau 401-418 [pS404, pS409]의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 64는 Tau 200-216 [pS202+pT205 & pT212+pS214]의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 65는 Tau 407-418 [pS409]의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 66은 Tau 399-408 [pS404]의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 67은 또한 Tau40으로 지칭되는 인간 Tau의 가장 긴 이소형 (441aa)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 68은 하이브리도마 세포주 A4-4A6-18에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 69는 하이브리도마 세포주 A4-4A6-18에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 70은 모노클로날 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 71은 모노클로날 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 72는 모노클로날 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 73은 모노클로날 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 74는 모노클로날 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 75는 모노클로날 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 76은 하이브리도마 세포주 A6-1D2-12에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 77은 하이브리도마 세포주 A6-1D2-12에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 78은 모노클로날 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 79는 모노클로날 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 80은 모노클로날 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 81은 모노클로날 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 82는 모노클로날 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 83은 모노클로날 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 84는 하이브리도마 세포주 A4-4A6-18에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 85는 하이브리도마 세포주 A4-4A6-18에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-4A6-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 86은 하이브리도마 세포주 A6-1D2-12에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 87은 하이브리도마 세포주 A6-1D2-12에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-1D2-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 88은 하이브리도마 세포주 A4-2A1-18, A4-2A1-40 및 A4-4A6-48 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, 및 ACI-35-4A6-Ab2 각각의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 89는 모노클로날 항체 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35-4A6-Ab2, ACI-35-2G5-AB2 및 ACI-35-2G5-AB3 각각의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 90은 모노클로날 항체 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, 및 ACI-35-4A6-Ab2 각각의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 91은 모노클로날 항체 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35-4A6-Ab2, ACI-35-2G5-AB2 및 ACI-35-2G5-AB3 각각의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 92는 하이브리도마 세포주 A4-2A1-40에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-2A1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 나타낸다
서열 93은 모노클로날 항체 ACI-35-2A1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 94는 모노클로날 항체 ACI-35-2A1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 95는 모노클로날 항체 ACI-35-2A1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 96은 하이브리도마 세포주 A6-2G5-08에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 97은 하이브리도마 세포주 A6-2G5-08에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 98은 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 99는 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 100은 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 101은 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 102는 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 103은 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 104는 하이브리도마 세포주 A6-2G5-30 및 A6-2G5-41 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-AB2 및 ACI-35-2G5-AB3 각각의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 105는 하이브리도마 세포주 A6-2G5-30 및 A6-2G5-41 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-AB2 및 ACI-35-2G5-AB3 각각의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 106은 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-AB2 및 ACI-35-2G5-AB3 각각의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 107은 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-AB2 및 ACI-35-2G5-AB3 각각의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 108은 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-AB2 및 ACI-35-2G5-AB3 각각의 경쇄 가변 영역 (VK)의 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 109는 하이브리도마 세포주 A4-2A1-18, A4-2A1-40 및 A4-4A6-48 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, 및 ACI-35-4A6-Ab2 각각의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 110은 하이브리도마 세포주 A4-2A1-40에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-2A1-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 111은 하이브리도마 세포주 A6-2G5-08에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-AB1의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 112는 하이브리도마 세포주 A6-2G5-08에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-AB1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 113은 하이브리도마 세포주 A6-2G5-30 및 A6-2G5-41 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-AB2 및 ACI-35-2G5-AB3 각각의 중쇄 가변 영역 (VH)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 114는 하이브리도마 세포주 A6-2G5-30 및 A6-2G5-41 각각에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-AB2 및 ACI-35-2G5-AB3 각각의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 115는 모노클로날 항체 ACI-35-2G5-AB2 및 ACI-35-2G5-AB3의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 116은 하이브리도마 세포주 A4-2A1-18에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-2A1-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 117은 하이브리도마 세포주 A4-2A1-18에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-2A1-Ab1의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 118은 하이브리도마 세포주 A4-4A6-48에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-4A6-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 119는 하이브리도마 세포주 A4-4A6-48에 의해 생산된 모노클로날 항체 ACI-35-4A6-Ab2의 경쇄 가변 영역 (VK)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 120 - 221은 VH/VK 정방향 및 역방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

용어의 정의

본원에 사용된 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 교환가능하며, 펩티드 결합에 의해 연견된 아미노산으로 구성된 생체분자를 의미하는 것으로 정의된다.

용어 "펩티드" 또는 "결합 펩티드"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 알파 탄소가 하나의 아미노산의 알파 탄소의 카르복실 기와 또 다른 아미노산의 알파 탄소의 아미노 기 사이의 축합 반응에 의해 형성된 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산 (전형적으로 L-아미노산)의 쇄를 지칭한다. 쇄의 한쪽 말단 (즉, 아미노 말단)에서의 말단 아미노산은 유리 아미노 기를 갖는 반면에 쇄의 다른 쪽 말단 (즉, 카르복시 말단)에서의 말단 아미노산은 유리 카르복실 기를 갖는다. 이에 따라, 용어 "아미노 말단" (N-말단으로 약칭됨)은 펩티드의 아미노 말단에서의 아미노산 상의 유리 알파-아미노 기 또는 펩티드 내의 임의의 다른 위치에서의 아미노산의 알파-아미노 기 (펩티드 결합에 참여하는 경우에 이미노 기)를 지칭한다. 유사하게, 용어 "카르복시 말단" (C-말단으로 약칭됨)은 펩티드의 카르복시 말단에서의 아미노산 상의 유리 카르복실 기 또는 펩티드 내의 임의의 다른 위치에서의 아미노산의 카르복실 기를 지칭한다. 결합 펩티드는 본원에 정의된 바와 같은 항체, 예컨대 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 인간 또는 인간화 항체, 디아바디, 낙타류 항체 등 또는 그의 기능적 부분을 구성할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "그의 단편" 또는 "단편"은 본원에 정의된 펩티드와 본질적으로 동일한 (생물학적) 활성을 갖는 기능적 펩티드 단편 (예를 들어, 각각 표 1에 서열 59-66으로 나타낸 바와 같음)을 지칭하고, 즉 상기 단편은 여전히 유기체에서, 특히 동물, 특히 포유동물 또는 인간 내에서 타우병증, 또는 타우병증과 연관된 증상의 예방 또는 완화에 매우 효과적이며 이러한 예방 또는 완화를 가능하게 하는 매우 특이적인, 특히 입체형태 특이적인 면역 반응을 나타낼 수 있다. 특히, 상기 단편은 여전히 본원에 사용되고 정의된 바와 같은 타우 펩티드의 특정 병리학적 포스포-에피토프 또는 -에피토프를 함유한다.

전형적으로, 펩티드를 구성하는 아미노산은 아미노 말단에서 출발하여 펩티드의 카르복시 말단을 향하는 방향으로 증가하는 순서대로 넘버링된다. 따라서, 하나의 아미노산이 또 다른 것"에 따른다"고 언급되는 경우에 그 아미노산은 이전의 아미노산 보다 펩티드의 카르복시 말단에 보다 가까이 위치한다.

용어 "잔기"는 아미드 결합에 의해 펩티드에 혼입되는 아미노산을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 이에 따라, 아미노산은 자연 발생 아미노산일 수 있거나, 또는 달리 제한되지 않는 한 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 천연 아미노산의 공지된 유사체 (즉, 아미노산 모방체)를 포함할 수 있다. 또한, 아미드 결합 모방체는 당업자에게 널리 공지된 펩티드 백본 변형을 포함한다.

어구 "본질적으로 이루어지는"은 그 어구가 지칭하는 펩티드의 본질적인 특성을 실질적으로 변경하는 임의의 요소를 제외하도록 본원에서 사용된다. 따라서, "...로 본질적으로 이루어진" 펩티드의 기재는 그 펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하는 임의의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 제외한다.

또한, 당업자는 상기 언급된 바와 같이, 코딩된 서열 내의 단일 아미노산 또는 작은 백분율의 아미노산 (전형적으로 5% 미만, 보다 전형적으로 1% 미만)을 변경, 부가 또는 결실시키는 개별 치환, 결실 또는 부가가 상기 변경이 화학적으로 유사한 아미노산의 치환을 일으키는 경우에 보존적으로 변형된 변이라는 것을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 당업계에 널리 공지되어 있다. 하기 6개의 군은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:

1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T);

2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);

3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);

4) 아르기닌 (R), 리신 (K);

5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및

6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W).

어구 "단리된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 그의 천연 상태에서 발견되는 바와 같이 그와 정상적으로 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭한다. 따라서, 본원에 기재된 펩티드는 그의 계내 환경과 정상적으로 연관된 물질을 함유하지 않는다. 전형적으로, 본원에 기재된 단리된 면역원성 펩티드는 은 염색된 겔 상의 밴드 강도에 의해 측정된 바와 같이 적어도 약 80%, 통상적으로 적어도 약 90%, 바람직하게는 적어도 약 95% 순수하다.

단백질 순도 또는 동질성은 당업계에 널리 공지된 다수의 방법, 예컨대 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 이어 염색 시의 시각화에 의해 나타낼 수 있다. 특정 목적을 위해 고해상도가 필요할 것이며, HPLC 또는 정제를 위한 유사한 수단이 이용된다.

면역원성 펩티드의 길이가 상대적으로 짧은 경우에 (즉, 약 50개 아미노산 미만), 이들은 종종 표준 화학 펩티드 합성 기술을 이용하여 합성된다.

서열의 C-말단 아미노산이 불용성 지지체에 부착된 후에 서열 내의 나머지 아미노산이 순차적으로 부가되는 고체 상 합성이 본원에 기재된 면역원성 펩티드의 화학적 합성에 바람직한 방법이다. 고체 상 합성을 위한 기술이 당업자에게 공지되어 있다.

대안적으로, 본원에 기재된 면역원성 펩티드는 재조합 핵산 방법론을 이용하여 합성된다. 일반적으로, 이는 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 것, 발현 카세트 내의 핵산을 특정한 프로모터의 제어 하에 두는 것, 숙주에서 펩티드를 발현시키는 것, 발현된 펩티드 또는 폴리펩티드를 단리하는 것, 및 필요한 경우에 펩티드를 재생시키는 것을 포함한다. 이러한 절차를 통해 당업자를 안내하기에 충분한 기술은 문헌에서 찾아볼 수 있다.

재조합 펩티드는 발현되면 황산암모늄 침전, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 표준 절차에 따라 정제될 수 있다. 치료제로서 사용하기 위해 약 50% 내지 95% 동질성의 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하고, 80% 내지 95% 이상의 동질성이 가장 바람직하다.

당업자는 화학적 합성, 생물학적 발현 또는 정제 후에, 면역원성 펩티드가 구성성분 펩티드의 본래 입체형태와 실질적으로 상이한 입체형태를 보유할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이러한 경우에, 이는 종종 항증식성 펩티드를 변성 및 환원시킨 후에 펩티드를 바람직한 입체형태로 재폴딩시킬 필요가 있다. 단백질의 환원 및 변성 및 재폴딩의 유도 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

정제된 단백질의 항원성은 예를 들어 면역 혈청, 또는 단백질 자체에 대해 생산된 항혈청과의 반응을 입증함으로써 확인될 수 있다.

본원에 사용된 단수 형태의 용어는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 정의되고, 문맥상 부적절하지 않은 한 복수를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "검출하는" 또는 "검출된"은 생물학적 분자의 검출에 면역화학적 또는 조직학적 방법과 같은 공지의 기술을 이용하는 것을 의미하며, 조사되는 생체분자의 존재 또는 농도를 정성 또는 정량적으로 측정하는 것을 지칭한다.

"단리된"은 자연 발생하는 성분들 중 적어도 일부가 없는 생물학적 분자를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "항체", "항체들" 또는 "그의 기능적 부분"은 당업계에 인지된 용어이고, 공지된 항원, 특히 이뮤노글로불린 분자 및 이뮤노글로불린 분자의 면역학적 활성 부분 (즉, 항원에 면역특이적으로 결합하는 결합 부위를 함유하는 분자)에 결합하는 분자 또는 분자의 활성 단편을 지칭하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 이뮤노글로불린은 임의의 유형 (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY) 또는 클래스 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 이뮤노글로불린 분자일 수 있다.

"항체"는 본 발명의 범위 내에서 모노클로날 항체, 폴리클로날, 키메라, 단일 쇄, 이중특이적, 유인원화, 인간 및 인간화 항체, 낙타류 항체, 디아바디 뿐만 아니라 그의 기능적 부분 또는 활성 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 공지된 항원에 결합하는 분자의 활성 단편의 예는 Fab 이뮤노글로불린 발현 라이브러리의 생성물 및 상기 언급된 임의의 항체 및 단편의 에피토프-결합 단편을 포함하여 Fab 및 F(ab')₂ 단편을 포함한다. 이러한 활성 단편은 다수의 기술에 의해 본 발명의 항체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 정제된 모노클로날 항체는 펩신과 같은 효소로 절단되고, HPLC 겔 여과에 적용될 수 있다. 이어서, Fab 단편을 함유하는 적절한 분획은 막 여과 등에 의해 수집되고 농축될 수 있다. 항체의 활성 단편의 단리를 위한 일반적인 기술의 추가의 설명을 위해, 예를 들어 문헌 [Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, (1986)]을 참조한다.

"인간화 항체"는 비인간 공여자 이뮤노글로불린으로부터 유래된 CDR을 갖고, 분자의 나머지 이뮤노글로불린-유래된 부분은 하나 (또는 하나 이상)의 인간 이뮤노글로불린(들)으로부터 유래한 것인 조작된 항체의 한 유형을 지칭한다.

인간화 항체는 추가로 그의 프레임워크 영역 중 하나 이상이 인간 또는 영장류 아미노산을 갖는 가변 영역을 갖는 항체를 지칭할 수 있다. 또한, 프레임워크 지지 잔기는 결합 친화도를 보존하도록 변경될 수 있다. "인간화 항체"를 수득하기 위한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technoloy, 9:421 (1991)] 참조).

"인간화 항체"는 또한 큰 동물, 예컨대 예를 들어 토끼에서 친화도-성숙 인간유사 폴리클로날 항체의 생산을 가능하게 하는 신규 유전 공학 접근법에 의해 수득할 수 있다 (http://www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php).

용어 "완전 인간 항체" 또는 "인간" 항체는 인간 항체 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스 또는 인간 세포로부터 유래된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 그러나 인간 면역 시스템을 위해, "완전 인간", "인간" 및 "인간화" 항체 사이의 차이는 무시할만하거나 존재하지 않을 수 있으며, 이에 따라 이들 3가지 모두는 동일한 효능 및 안전성을 가질 수 있다.

용어 "모노클로날 항체"는 또한 당업계에 널리 인지되어 있고, 단일 클론으로부터 실험실에서 대량 생산되고 오직 하나의 항원을 인식하는 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 전형적으로 정상적으로 짧게 생존하는 항체-생산 B 세포를 빠른-성장 세포, 예컨대 암세포 (때때로 "불멸" 세포로 지칭됨)에 융합시켜 제조된다. 생성된 하이브리드 세포, 또는 하이브리도마는 빠르게 증식하여 대량의 항체를 생산하는 클론을 생성한다.

용어 "항원"은 유기체, 특히 동물, 보다 특히 인간을 포함하는 포유동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는 물질 또는 그의 단편을 지칭한다. 용어는 항원성 또는 항원 결정기를 담당하는 면역원 및 영역을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "가용성"은 수용액에 부분적으로 또는 완전하게 용해되는 것을 의미한다.

또한 본원에 사용된 용어 "면역원성"은 면역원성 작용제에 대해 지시된 항체, T-세포 및 다른 반응성 면역 세포의 생산을 도출하거나 증진시키고, 인간 또는 동물에서 면역 반응에 기여하는 물질을 지칭한다.

면역 반응은 치료할 장애를 경감 또는 완화하기 위해 투여된 본 발명의 면역원성 조성물에 대해 개체가 충분한 항체, T-세포 및 다른 반응성 면역 세포를 생산하는 경우에 일어난다.

용어 "하이브리도마"는 당업계에 인지되어 있고, 항체-생산 세포 및 불멸 세포, 예를 들어 다발성 골수종 세포의 융합에 의해 생산된 세포를 지칭하는 것으로 당업자에 의해 이해된다. 이 하이브리드 세포는 연속적으로 공급되는 항체를 생산할 수 있다. 융합 방법의 보다 상세한 설명을 위해 상기 "모노클로날 항체"의 정의 및 하기 실시예를 참조한다.

본원에 사용된 용어 "담체"는 항원 펩티드 또는 초분자 구축물이 이에 혼입될 수 있거나 또는 이와 회합될 수 있어, 항원 펩티드 또는 펩티드의 부분을 인간 또는 동물의 면역계에 제시하거나 노출시키는 구조물을 의미한다. 동물 또는 인간 요법에 적합하게 사용될 수 있는 임의의 입자, 예컨대 예를 들어 소포, 입자 또는 미립자체는 본 발명의 문맥 내에서 담체로서 사용될 수 있다.

용어 "담체"는 항원 펩티드를 포함하는 초분자 항원 구축물 조성물이 전달 메카니즘에 의해 원하는 부위로 수송될 수 있는 전달 방법을 추가로 포함한다. 이러한 전달 시스템의 한 예는 콜로이드성 금속, 예컨대 콜로이드성 금을 이용한다.

본 발명의 초분자 항원 구축물 조성물에 사용될 수 있는 담체 단백질은 말토스 결합 펩티드 "MBP"; 소 혈청 알부민 "BSA"; 키홀 림펫 헤모시아닌 "KLH"; 오브알부민; 플라젤린; 티로글로불린; 임의의 종의 혈청 알부민; 임의의 종의 감마 글로불린; 동계 세포; Ia 항원을 보유하는 동계 세포; 및 D- 및/또는 L-아미노산의 중합체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 용어 "치료 유효량" 또는 "제약 유효량"은 인간 또는 동물에게 투여되는 경우에 상기 인간 또는 동물에서 치료 효과를 나타내기에 충분한 결합 펩티드의 양을 지칭한다. 유효량은 통상적인 절차에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정된다.

"pTau PHF", "PHF" 및 "쌍을 이룬 나선형 필라멘트"는 본원에서 동의어로 사용되고, 전자 현미경검사 상에서 볼 수 있는 160 nm의 주기성으로 나선형으로 감긴 대략 10 nm 필라멘트의 쌍을 지칭한다. 폭은 10 내지 22 nm로 달라진다. PHF는 알츠하이머병 (AD)의 신경원섬유 엉킴 및 신경망사에서 우세한 구조이다. PHF는 또한 신경염성 플라크와 연관된 일부 이영양성 신경돌기 (모두는 아님)에서 볼 수 있다. PHF의 주요 성분은 과인산화 형태의 미세관-연관 단백질 타우이다. PHF는 디술피드-연결된 역평행 과인산화 타우 단백질로 구성된다. PHF 타우는 그의 C-말단 20개 아미노산 잔기가 말단절단된 것일 수 있다. PHF 형성의 기초가 되는 메카니즘은 불확실하지만, 타우의 과인산화는 이를 미세관으로부터 풀 수 있어 타우의 가용성 풀을 증가시킨다.

본 발명의 범위 내에서, 본 발명에 따른 항원 조성물에 대한 항체 유발된 반응이 주로 T-세포 비의존성이라는 것이 입증되었다. 이와 관련하여 누드 마우스 모델을 이용하였으며, 누드 마우스에게 백신을 접종하고, 항체 반응을 측정하여 면역화된 누드 마우스에서 본 발명에 따른 항원 조성물에 의해 유발된 Aβ-특이적 항체 반응을 평가하였다. 누드 마우스는 Foxn1nu 돌연변이를 보유하였고, 그 결과로서 적절한 흉선의 부족으로 인해 감소된 T-세포 기능을 갖는다.

본원에 사용된 "제약 유효량"은 치료할 질환, 장애 또는 상태의 증상 또는 이와 연관된 임의의 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키기에 적절한 제약 조성물 내의 활성 성분의 용량을 지칭한다.

본 발명은 타우 단백질의 주요 병리학적 포스포-에피토프를 인식하여 이에 결합하는 결합 펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 AD를 포함하는 타우병증에서 시냅스- 및 신경-독성의 원인인 것으로 여겨지는 단백질 타우 상의 선형 및 입체형태의 단순한 및 복잡한 포스포-에피토프에 대한 특정 항원을 제공한다.

따라서, 본 발명은 한 실시양태에서 포유동물, 특히 인간 타우 단백질 또는 그의 단편 상의 포스포-에피토프, 특히 병리학적 단백질 타우 이형태체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하지만, 한 실시양태에서 상응하는 비인산화 에피토프 및/또는 비-관련 에피토프에는 결합하지 않는, 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분에 관한 것이며, 여기서 상기 결합 펩티드 또는 항체는 적어도 10 nM, 특히 적어도 8 nM, 특히 적어도 5 nM, 특히 적어도 2 nM, 특히 적어도 1 nM, 특히 적어도 500 pM, 특히 적어도 400 pM, 특히 적어도 300 pM, 특히 적어도 200 pM, 특히 적어도 100 pM, 특히 적어도 50 pM의 해리 상수로 높은 결합 친화도를 갖는다.

본원에 사용된 "가용성 타우" 단백질은 둘 다 완전하게 용해된 타우 단백질/펩티드 단량체, 또는 타우-유사 펩티드/단백질, 또는 변형된 또는 말단절단된 타우 펩티드/단백질 또는 타우 펩티드/단백질 단량체의 다른 유도체, 및 타우 단백질 올리고머로 이루어진 단백질을 지칭한다. "가용성 타우"는 특히 신경원섬유 엉킴 (NFT)을 제외한다.

본원에 사용된 "불용성 타우"는 시험관내의 수성 매질 및 생체내의 포유동물 또는 인간 신체, 보다 특히 뇌 둘 다에서 불용성인 올리고머 또는 중합체 구조를 형성하는 타우 펩티드 또는 단백질, 또는 타우-유사 펩티드/단백질, 또는 변형된 또는 말단절단된 타우 펩티드/단백질 또는 타우 펩티드/단백질의 다른 유도체의 다수의 응집된 단량체, 특히 각각 포유동물 또는 인간 신체, 보다 특히 뇌에서 불용성인 타우 또는 변형된 또는 말단절단된 타우 펩티드/단백질 또는 그의 유도체의 다수의 응집된 단량체를 지칭한다. "불용성 타우"는 특히 신경원섬유 엉킴 (NFT)을 포함한다.

본원에 사용된 "단량체 타우" 또는 "타우 단량체"는 수성 매질 중에 응집된 복합체 없이 완전하게 용해된 타우 단백질을 지칭한다.

"응집된 타우", "올리고머 타우" 및 "타우 올리고머"는 시험관내의 수성 매질 및 생체내의 포유동물 또는 인간 신체, 보다 특히 뇌 둘 다에서 불용성 또는 가용성인 올리고머 또는 중합체 구조를 형성하는 타우 펩티드 또는 단백질, 또는 타우-유사 펩티드/단백질, 또는 변형된 또는 말단절단된 타우 펩티드/단백질 또는 타우 펩티드/단백질의 다른 유도체의 다수의 응집된 단량체, 특히 각각 포유동물 또는 인간 신체, 보다 특히 뇌에서 불용성 또는 가용성인 타우 또는 변형된 또는 말단절단된 타우 펩티드/단백질 또는 그의 유도체의 다수의 응집된 단량체를 지칭한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재되고 청구된 실시양태 중 어느 하나에 따른 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 부분, 또는 상기 결합 펩티드 또는 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 조합을 치료 유효량으로 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

적합한 제약 담체, 희석제 및/또는 부형제는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다.

본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함)는 생리학상 허용되는 제제로 제조될 수 있고, 공지된 기술을 이용하여 제약상 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 임의의 기능적 등가 결합 펩티드 또는 그의 기능적 부분을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 결합 펩티드, 특히 본 발명의 모노클로날 항체 (임의의 기능적 등가 항체 또는 그의 기능적 부분 포함)는 제약상 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제와 조합되어 치료 조성물을 형성한다. 적합한 제약 담체, 희석제 및/또는 부형제는 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다.

본 발명에 따른 제약 조성물의 제제화는 당업자에게 공지된 표준 방법론에 따라 달성될 수 있다.

본 발명의 조성물은 적합한 제약상 유효한 용량에서 고체, 액체 또는 에어로졸의 형태로 대상체에게 투여될 수 있다. 고체 조성물의 예는 환제, 크림, 및 이식가능한 투여량 단위를 포함한다. 환제는 경구로 투여될 수 있다. 치료 크림은 국소적으로 투여될 수 있다. 이식가능한 투여량 단위는 국부적으로, 예를 들어 종양 부위에 투여될 수 있거나, 또는 치료 조성물의 전신 방출을 위해 (예를 들어, 피하로) 이식될 수 있다. 액체 조성물의 예는 근육내, 피하, 정맥내, 동맥내 주사에 적합한 제제, 및 국소 및 안내 투여를 위한 제제를 포함한다. 에어로졸 제제의 예는 폐로의 투여를 위한 흡입기 제제를 포함한다.

조성물은 표준 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 국소, 경구, 직장, 비내, 피간, 복강내 또는 비경구 (예를 들어 정맥내, 피하 또는 근육내) 경로에 의해 투여될 수 있다.

또한, 조성물은 생분해성 중합체와 같은 지속 방출 매트릭스에 도입될 수 있으며, 이 중합체는 예를 들어 종양 부위의 전달이 요구되는 근접부에 이식된다. 방법은 단일 용량의 투여, 예정된 시간 간격의 반복 용량의 투여, 및 예정된 시간 기간 동안의 지속 투여를 포함한다.

본원에 사용된 지속 방출 매트릭스는 통상적으로 효소적 또는 산/염기 가수분해 또는 용해에 의해 분해가능한 중합체인 물질로 제조되는 매트릭스이다. 일단 신체에 삽입되면, 효소 및 체액이 매트릭스에 작용하게 된다. 지속 방출 매트릭스는 바람직하게는 생체적합성 물질, 예컨대 리포솜, 폴리락티드 (폴리락티드 산), 폴리글리콜리드 (글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드 (락트산과 글리콜산의 공중합체), 폴리무수물, 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 술페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘에 의해 선택된다. 바람직한 생분해성 매트릭스는 폴리락티드, 폴리글리콜리드 또는 폴리락티드 코-글리콜리드 (락트산과 글리콜산의 공중합체) 중 하나의 매트릭스이다.

조성물의 투여량이 예를 들어 치료할 상태, 사용되는 특정한 조성물, 및 다른 임상적 요인, 예컨대 환자의 체중, 크기, 성별 및 전반적 건강 상태, 신체 표면적, 투여될 특정한 화합물 또는 조성물, 동시에 투여되는 다른 약물, 및 투여 경로와 같은 다양한 요인에 따라 달라지게 될 것이라는 것이 당업자에게 널리 공지되어 있다.

본 발명에 따른 조성물은 생물학적 활성 물질 또는 화합물, 예컨대 예를 들어 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질, 예컨대 알츠하이머병과 관련된 아밀로이드 β 단백질과 연관된 질환 및 장애의 일군인 타우병증 및/또는 아밀로이드증의 의약에 사용되는 공지된 화합물을 포함하는 다른 조성물과 조합되어 투여될 수 있다.

다른 생물학적 활성 물질 또는 화합물은 본 발명에 따른 치료 백신과 동일하거나 유사한 메카니즘에 의해 또는 관련되지 않은 작용 메카니즘에 의해 또는 다수의 관련되고/거나 관련되지 않은 작용 메카니즘에 의해 그의 생물학적 효과를 나타낼 수 있다.

일반적으로, 다른 생물학적 활성 화합물은 중성자-전달 증진제, 정신요법 약물, 아세틸콜린 에스테라제 억제제, 칼슘-채널 차단제, 생원성 아민, 벤조디아제핀 진정제, 아세틸콜린 합성, 저장 또는 방출 증진제, 아세틸콜린 시냅스후 수용체 효능제, 모노아민 옥시다제-A 또는 -B 억제제, N-메틸-D-아스파르테이트 글루타메이트 수용체 길항제, 비스테로이드성 항염증 약물, 항산화제 및 세로토닌성 수용체 길항제를 포함할 수 있다.

특히, 생물학적 활성제 또는 화합물은 산화 스트레스에 대한 화합물, 항아폽토시스성 화합물, 금속 킬레이터, DNA 복구 억제제, 예컨대 피렌제핀 및 대사물, 3-아미노-1-프로판술폰산 (3APS), 1,3-프로판디술포네이트 (1,3PDS), 세크레타제 활성화제, [베타]- 및 7-세크레타제 억제제, 타우 단백질, 신경전달물질, /3-시트 파괴물질, 항염증 분자, "비정형 항정신병제", 예컨대 예를 들어 클로자핀, 지프라시돈, 리스페리돈, 아리피프라졸 또는 올란자핀 또는 콜린에스테라제 억제제 (ChEI), 예컨대 타크린, 리바스티그민, 도네페질 및/또는 갈란타민 및 다른 약물, 영양소 보충제, 예컨대 예를 들어 비타민 B 12, 시스테인, 아세틸콜린의 전구체, 레시틴, 콜린, 징코 빌로바, 아세틸-L-카르니틴, 이데베논, 프로펜토필린 또는 크산틴 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함), 및 임의로 제약상 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제 및 질환 치료를 위한 설명서와 함께 포함할 수 있다.

추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 니아신 또는 메만틴을 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함), 및 임의로 제약상 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 환각, 망상, 사고 장애 (두드러진 사고산란, 탈선, 사고이탈에 의해 나타남), 및 기이한 또는 무질서한 행동, 뿐만 아니라 무쾌감증, 무감각, 무관심, 및 사회적 위축을 포함하는 양성 및 음성 정신병 증상의 치료를 위한 "비정형 항정신병제", 예컨대 예를 들어 클로자핀, 지프라시돈, 리스페리돈, 아리피프라졸 또는 올란자핀을 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함), 및 임의로 제약상 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명에 따른 결합 펩티드 뿐만 아니라 조성물에 적합하게 사용될 수 있는 다른 화합물은 예를 들어 WO 2004/058258 (특히 페이지 16 및 17 참조)에 개시된 것, 예를 들어 치료 약물 표적 (페이지 36-39), 알칸술폰산 및 알칸올황산 (페이지 39-51), 콜린에스테라제 억제제 (페이지 51-56), NMDA 수용체 길항제 (페이지 56-58), 에스트로겐 (페이지 58-59), 비스테로이드성 항염증 약물 (페이지 60-61), 항산화제 (페이지 61-62), 퍼옥시솜 증식자-활성화 수용체 (PPAR) 효능제 (페이지 63-67), 콜레스테롤-저하제 (페이지 68-75); 아밀로이드 억제제 (페이지 75-77), 아밀로이드 형성 억제제 (페이지 77-78), 금속 킬레이터 (페이지 78-79), 항정신병제 및 항우울제 (페이지 80-82), 영양 보충제 (페이지 83-89) 및 뇌에서 생물학적 활성 물질의 유용성을 증가시키는 화합물 (페이지 89-93 참조) 및 전구약물 (페이지 93 및 94), 특히 상기 나타낸 페이지 상에 언급된 화합물이다 (상기 문헌은 본원에 참고로 포함됨).

단백질성 제약 활성 물질은 용량당 1 ng 내지 10 mg의 양으로 존재할 수 있다. 일반적으로, 투여 요법은 본 발명에 따른 항체의 0.1 μg 내지 10 mg 범위, 특히 1.0 μg 내지 1.0 mg 범위, 보다 특히 1.0 μg 내지 100 μg 범위 내에 있어야 하며, 이들 범위 내에 속하는 모든 개별 숫자가 또한 본 발명의 일부이다. 투여가 연속 주입을 통해 일어난다면 보다 적절한 투여량은 시간당 체중 킬로그램당 0.01 μg 내지 10 mg 단위의 범위일 수 있으며, 이들 범위 내에 속하는 모든 개별 숫자가 또한 본 발명의 일부이다.

투여는 일반적으로 비경구, 예를 들어 정맥내 투여일 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 수성 용매는 염수 및 완충 매질을 포함하는 물, 알콜/수용액, 에멀젼 또는 현탁액으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 비경구 비히클은 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거, 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제 (예컨대, 링거 덱스트로스 기반의 것) 및 기타를 포함한다. 보존제, 예컨대 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 불활성 기체 등이 또한 존재할 수도 있다.

제약 조성물은 단백질성 담체, 예컨대 예를 들어 특히 인간 기원의 혈청 알부민 또는 이뮤노글로불린을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물에 그의 의도된 용도에 따라 추가의 생물학적 활성제가 존재할 수 있다.

결합 표적이 뇌에 위치하는 경우에, 본 발명의 특정 실시양태는 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함)를 제공한다. 특정 신경변성 질환은 혈액-뇌 장벽 투과성의 증가와 연관되어, 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체, 또는 그의 활성 단편 포함)가 용이하게 뇌로 도입될 수 있다. 혈액-뇌 장벽이 무손상으로 유지되는 경우, 물리적 방법, 지질-기반 방법, 및 수용체 및 채널-기반 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 혈액-뇌 장벽을 가로질러 분자를 수송하기 위한 여러 당업계에 공지된 접근법이 존재한다.

본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체, 또는 그의 활성 단편 포함)를 혈액-뇌 장벽을 가로질러 수송하는 물리적 방법은 혈액-뇌 장벽의 완전한 우회, 또는 혈액-뇌 장벽에서의 개구부의 생성을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 우회 방법은 뇌로의 직접 주사 (예를 들어, 문헌 [Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)] 참조) 및 전달 장치의 뇌로의 이식 (예를 들어, 문헌 [Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003)]; 및 글리아델 웨이퍼스(Gliadel Wafers)(TM) 길드포드 파마슈티칼(Guildford Pharmaceutical) 참조)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 장벽에서의 개구부의 생성 방법은 초음파 (예를 들어, 미국 특허 공보 번호 2002/0038086 참조), 삽투압 (예를 들어, 고장성 만니콜의 투여에 의함) (문헌 [Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, VoIs 1 & 2, Plenum Press, N. Y. (1989)]), 예를 들어 브라디키닌 또는 투과제 A-7에 의한 투과 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206, 및 5,686,416 참조), 및 혈액-뇌 장벽에 걸친 뉴런의 결합 펩티드 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터로의 형질감염 (예를 들어, 미국 특허 공보 번호 2003/0083299 참조)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체, 또는 그의 활성 단편 포함)를 혈액-뇌 장벽을 가로질러 수송하는 지질-기반 방법은 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체, 또는 그의 활성 단편 포함)의 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피 상의 수용체에 결합하는 그의 활성 단편에 커플링된 리포솜으로의 캡슐화 (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 번호 20020025313 참조), 및 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체, 또는 그의 활성 단편 포함)의 저밀도 지단백질 입자 (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 번호 20040204354 참조) 또는 아포지단백질 E (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 번호 20040131692 참조)에서의 코팅을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체, 또는 그의 활성 단편 포함)를 혈액-뇌 장벽을 가로질러 수송하는 수용체 및 채널-기반 방법은 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위한 글루코코르티코이드 차단체의 사용 (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 번호 2002/0065259, 2003/0162695, 및 2005/0124533 참조); 칼륨 채널의 활성화 (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0089473 참조), ABC 약물 수송체의 억제 (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 번호 2003/0073713 참조); 트랜스페린을 사용한 항체의 코팅 및 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성의 조절 (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 번호 2003/0129186 참조), 및 항체의 양이온화 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,004,697 참조)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체, 또는 그의 활성 단편 포함), 또는 본 발명에 따른 제약 조성물의 단일 또는 반복 투여는 연장된 기간에 걸쳐 대상체에게 제공될 수 있다. 투여 지속 기간은 1주 내지 12개월까지 또는 이를 초과할 수 있다. 이 기간 동안 결합 펩티드, 항체 또는 제약 조성물은 1주에 1회, 2주, 3주, 4주에 1회 등, 또는 치료될 대상체의 필요에 따라 보다 높거나 또는 보다 낮은 빈도로 투여될 수 있다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 권투선수 치매, 다운 증후군, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커병, 봉입체 근염, 및 프리온 단백질 뇌 아밀로이드 혈관병증, 외상성 뇌 손상을 포함하나 이에 제한되지 않는 타우 및 아밀로이드 병리상태의 공존을 보여주는 질환 또는 장애, 및 괌의 근위축성 측삭 경화증/파킨슨증-치매 복합증, 신경원섬유 엉킴을 갖는 비-괌 운동 뉴런 질환, 은친화성 입자 치매, 피질기저 변성, 석회화를 갖는 미만성 신경원섬유 엉킴, 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두엽 치매, 할러보르덴-스파츠병, 다계통 위축, 니만-픽병, 유형 C, 담창구-교뇌-흑질 변성, 픽병, 진행성 피질하 교세포증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화성 범뇌염 엉킴 단독 치매, 뇌염후 파킨슨증, 근긴장성 이영양증을 포함하나 이에 제한되지 않는 특징적인 아밀로이드 병리상태를 나타내지 않는 추가의 질환 또는 장애를 포함하는 이종성 군의 신경변성 질환 또는 장애를 포함하는, 신경변성 질환 또는 장애, 예컨대 타우병증을 포함하는 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태의 검출 및 진단을 위한 방법 및 키트를 제공한다. 병리학적 이상은 타우병증에서 우세한 뇌 병리상태인 신경원섬유 병변의 형성에 의해 유발되거나 또는 이와 연관될 수 있다.

또한, 본 발명은 타우 및 아밀로이드 병리상태의 공존을 보여주는 질환 또는 장애를 포함하는 이종성 군의 신경변성 질환 또는 장애를 포함하는, 신경변성 질환 또는 장애, 예컨대 타우병증을 포함하는 타우-단백질-연관 질환, 장애 또는 상태에 대한 소인의 진단, 또는 환자에서 최소 잔류 질환의 모니터링, 또는 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함), 또는 본 발명에 따르고 본원에 기재된 바와 같은 조성물로의 치료에 대한 환자의 반응성의 예측을 위한 방법 및 키트를 제공한다. 이들 방법은 생물학적 샘플 또는 계내 조건에서 물질의 검출 또는 정량화에 통상적으로 사용되는 공지된 면역학적 방법을 포함한다.

타우 및 아밀로이드 병리상태의 공존을 보여주는 질환 또는 장애를 포함하는 이종성 군의 신경변성 질환 또는 장애를 포함하는, 신경변성 질환 또는 장애, 예컨대 타우병증을 포함하는 타우-단백질-연관 질환 또는 상태의 진단 또는 이러한 타우-단백질-연관 질환 또는 상태에 대한 소인의 진단은 이를 필요로 하는 대상체, 특히 포유동물, 보다 특히 인간에서 샘플 또는 계내에서의 본 발명의 결합 펩티드, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 활성 단편의 타우 단백질의 에피토프에 대한 면역특이적 결합을 검출함으로써 달성될 수 있고, 이는 타우 단백질의 에피토프에 결합하는 항체와 타우 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 신체 부위를 접촉시키는 것, 항체를 타우 단백질에 결합시켜 면역학적 복합체를 형성하는 것, 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 것 및 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 부위에서의 타우 단백질의 존재 또는 부재와 연관시키는 것, 임의로 면역학적 복합체의 양을 정상 대조 값과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 정상 대조 값과 비교하여 면역학적 복합체의 양의 증가는 대상체가 타우 단백질-연관 질환 또는 상태를 앓고 있거나 또는 발생할 위험이 있다는 것을 나타낸다.

본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함), 또는 본 발명에 따른 조성물로의 치료 후에 대상체, 특히 포유동물, 보다 특히 인간에서의 최소 잔류 질환의 모니터링은 샘플 또는 계내에서의 본 발명의 결합 펩티드, 특히 항체, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 활성 단편의 타우 단백질의 에피토프에 대한 면역특이적 결합을 검출함으로써 달성될 수 있고, 이는 타우 단백질의 에피토프에 결합하는 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함)와 타우 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 신체 부위를 접촉시키는 것, 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함)를 타우 단백질에 결합시켜 면역학적 복합체를 형성하는 것, 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 것 및 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 부위에서의 타우 단백질의 존재 또는 부재와 연관시키는 것, 임의로 상기 면역학적 복합체의 양을 정상 대조 값과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 정상 대조 값과 비교하여 상기 면역학적 복합체의 양의 증가는 대상체가 여전히 최소 잔류 질환을 앓고 있을 수 있다는 것을 나타낸다.

본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함), 또는 본 발명에 따른 조성물로의 치료에 대한 대상체, 특히 포유동물, 보다 특히 인간의 반응성의 예측은 샘플 또는 계내에서의 결합 펩티드, 특히 모노클로날 항체 또는 그의 활성 단편의 타우 단백질의 에피토프에 대한 면역특이적 결합을 검출함으로써 달성될 수 있고, 이는 타우 단백질의 에피토프에 결합하는 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함)와 타우 단백질을 함유하는 것을 의심되는 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 신체 부위를 접촉시키는 것, 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함)를 타우 단백질에 결합시켜 면역학적 복합체를 형성하는 것, 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 것 및 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 부위에서의 타우 단백질의 존재 또는 부재와 연관시키는 것, 임의로 치료의 개시 전후에 상기 면역학적 복합체의 양을 비교하는 것을 포함하며, 여기서 상기 면역학적 복합체의 양의 감소는 상기 환자가 치료에 반응할 높은 잠재성을 갖는다는 것을 나타낸다.

타우 및 아밀로이드 병리상태의 공존을 보여주는 질환 또는 장애를 포함하는 이종성 군의 신경변성 질환 또는 장애를 포함하는, 신경변성 질환 또는 장애, 예컨대 타우병증을 포함하는 타우 단백질-연관 질환 또는 상태의 진단, 이러한 타우 단백질-연관 질환 또는 상태에 대한 소인의 진단, 또는 환자에서 최소 잔류 질환의 모니터링, 또는 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함), 또는 본 발명에 따르고 본원에 기재된 바와 같은 조성물로의 치료에 대한 환자의 반응성의 예측에 사용될 수 있는 생물학적 샘플은 예를 들어 유체, 예컨대 혈청, 혈장, 타액, 위선 분비액, 점액, 뇌척수액, 림프 유체 등, 또는 유기체로부터 수득한 조직 또는 세포 샘플, 예컨대 신경, 뇌, 심장 또는 혈관 조직이다. 샘플에서 타우 단백질의 존재 또는 부재를 결정하기 위해, 당업자에게 공지된 임의의 면역검정, 예컨대 예를 들어 검출을 위한 이차 시약을 사용하는 간접적인 검출 방법을 이용하는 검정, ELISA 및 면역침전 및 응집 검정이 이용될 수 있다. 이들 검정의 상세한 설명은 예를 들어 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612], WO96/13590 (Maertens and Stuyver, Zrein et al. (1998)) 및 WO96/29605에 주어져 있다.

계내 진단을 위해, 본 발명에 따른 결합 펩티드 (본 발명의 항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함) 또는 그의 임의의 활성 및 기능적 부분을 당업계에 공지된 방법, 예컨대 예를 들어 정맥내, 비강내, 복강내, 뇌내, 동맥내 주사에 의해 진단될 유기체에 투여하여 본 발명에 따른 항체와 아밀로이드 단백질 상의 에피토프 영역 사이의 특이적 결합이 일어날 수 있도록 할 수 있다. 결합 펩티드/항원 복합체는 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체, 또는 그의 기능적 단편 포함)에 부착된 표지를 통해 또는 임의의 다른 당업계에 공지된 검출 방법을 통해 편리하게 검출될 수 있다.

진단 적용, 또는 타우 및 아밀로이드 병리상태의 공존을 보여주는 질환 또는 장애를 포함하는 이종성 군의 신경변성 질환 또는 장애를 포함하는, 신경변성 질환 또는 장애, 예컨대 타우병증을 포함하는 타우 단백질-연관 질환 또는 상태에 대한 소인의 진단, 또는 환자에서 최소 잔류 질환의 모니터링, 또는 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함), 또는 본 발명에 따르고 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 조성물로의 치료에 대한 환자의 반응성의 예측을 위한 적용에 사용되는 면역검정은 전형적으로 표지된 항원, 결합 펩티드, 또는 검출을 위한 이차 시약에 의존한다. 이들 단백질 또는 시약은 효소, 방사성동위원소, 및 형광, 발광 및 발색 물질 (유색 입자, 예컨대 콜로이드성 금 및 라텍스 비드를 포함하나 이에 제한되지 않음)을 포함하여 당업자에게 일반적으로 공지된 화합물로 표지될 수 있다. 이들 중에서, 방사성 표지는 거의 모든 유형의 검정에 가장 다양하게 이용될 수 있다. 효소-접합된 표지는 특히 방사능을 피해야 하거나 빠른 결과가 필요한 경우에 유용하다. 형광색소는 그의 사용에 고가의 장비가 필요하긴 하지만 매우 민감한 검출 방법을 제공한다. 이러한 검정에 유용한 결합 펩티드는 항체, 특히 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 및 친화도 정제된 폴리클로날 항체를 포함하여 본원의 특허청구범위에 개시된 것이다.

대안적으로, 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함)는 이뮤노글로불린에 대한 친화도를 갖는 표지된 물질, 예컨대 단백질 A 또는 G 또는 이차 항체와의 반응에 의해 간접적으로 표지될 수 있다. 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함)는 제2 물질과 접합되고, 항체에 접합된 제2 물질에 대한 친화도를 갖는 표지된 제3 물질로 검출될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 결합 펩티드 (항체, 특히 모노클로날 항체 및 그의 활성 단편 포함)는 비오틴에 접합될 수 있고, 결합 펩티드/비오틴 접합체는 표지된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 사용하여 검출될 수 있다. 유사하게, 결합 펩티드는 합텐에 접합될 수 있고, 결합 펩티드/합텐 접합체는 표지된 항-합텐 결합 펩티드를 사용하여 검출될 수 있다.

당업자는 본 발명에 따라 이용될 수 있는 상기 및 다른 적합한 표지를 알 것이다. 이들 표지의 결합 펩티드 또는 그의 단편에 대한 결합은 당업자에게 통상적으로 공지된 표준 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 전형적인 기술은 문헌 [Kennedy, J. H., et al., 1976 (Clin. Chim. Acta 70:1-31), 및 Schurs, A. H. W. M., et al. 1977 (Clin. Chim Acta 57:1-40)]에 기재되어 있다. 후자에 언급된 커플링 기술은 글루타르알데히드 방법, 퍼아이오데이트 방법, 디말레이미드 방법 등이며, 이들은 모두 본원에 참고로 포함된다.

최근 면역검정은 분석물의 존재를 검출하기 위한 이중 항체 방법을 이용하고, 여기서 항체는 검출가능한 표지로 표지된 이차 항체와의 반응성에 의해 간접적으로 표지된다. 이차 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체가 유래된 동물의 항체에 결합하는 것이다. 즉, 모노클로날 항체가 마우스 항체라면, 표지된 이차 항체는 항-마우스 항체이다. 본원에 기재된 검정에 사용될 항체의 경우에, 이 표지는 바람직하게는 항체-코팅된 비드, 특히 자기 비드이다. 본원에 기재된 면역검정에 사용될 항체의 경우에, 표지는 바람직하게는 검출가능한 분자, 예컨대 방사성, 형광 또는 전기화학발광 물질이다.

대안적인 이중 항체 시스템 (이들이 분석물의 존재의 빠른 결정에 적합하기 때문에 종종 빠른 포맷 시스템으로 지칭됨)이 또한 본 발명의 범위 내에서 이용될 수 있다. 시스템은 항체와 분석물 사이의 높은 친화도를 필요로 한다. 본 발명의 한 실시양태에 따라, 아밀로이드 단백질의 존재는 각각 아밀로이드 단백질에 특이적인 항체의 쌍을 이용하여 결정된다. 상기 쌍의 항체 중 하나는 본원에서 "검출기 항체"로 지칭되고, 상기 쌍의 항체 중 다른 하나는 본원에서 "포획 항체"로 지칭된다. 본 발명의 모노클로날 항체는 포획 항체 또는 검출기 항체로 사용될 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체는 또한 단일 검정에서 함께 포획 및 검출기 항체 둘 다로서 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 한 실시양태는 생물학적 유체의 샘플에서 아밀로이드 단백질을 검출하기 위한 이중 항체 샌드위치 방법을 이용한다. 이러한 방법에서, 분석물 (아밀로이드 단백질)은 검출기 항체와 포획 항체 사이에 끼우고, 포획 항체는 고체 지지체 상에 비가역적으로 고정화된다. 검출기 항체는 항체-분석물 샌드위치의 존재를 확인하고, 이에 따라 분석물의 존재를 확인하기 위해 검출가능한 표지를 함유할 것이다.

예식적인 고체 상 물질은 방사성면역검정 및 효소 면역검정의 분야에 널리 공지된 마이크로타이터 플레이트, 폴리스티렌의 시험 튜브, 자기, 플라스틱 또는 유리 비드 및 슬라이드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 고체 상에 항체를 커플링시키는 방법은 또한 당업자에게 널리 공지되어 있다. 보다 최근에, 다수의 다공성 물질, 예컨대 나일론, 니트로셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 유리 섬유 및 다른 다공성 중합체가 고체 지지체로서 사용되고 있다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 조성물을 포함하는 생물학적 샘플에서 타우 단백질을 검출하기 위한 진단 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 조성물 뿐만 아니라 또한 상기 정의된 바와 같은 검출 시약을 포함하는 후자의 진단 키트에 관한 것이다. 용어 "진단 키트"는 일반적으로 당업계에 공지된 임의의 진단 키트를 지칭한다. 보다 구체적으로, 후자의 용어는 문헌 [Zrein et al. (1998)]에 기재된 바와 같은 진단 키트를 지칭한다.

본 발명에 따른 결합 펩티드를 포함하는 타우 단백질-연관 질환 및 상태의 검출 및 진단을 위한 신규 이뮤노프로브 및 시험 키트를 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다. 이뮤노프로브의 경우에, 결합 펩티드는 적합한 리포터 분자, 예를 들어 효소 또는 방사성핵종에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 시험 키트는 본 발명에 따른 하나 이상의 결합 펩티드를 수용하는 용기, 및 타우 항원에 결합시켜 면역학적 복합체를 형성하고 면역학적 복합체의 형성을 검출하여 타우 단백질의 존재 또는 부재와 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 연관시키기 위한 목적으로 결합 펩티드를 사용하기 위한 설명서를 포함한다.

실시예

실시예 1: 하이브리도마 및 항체의 생성 및 스크리닝

이 연구의 목적은 항-Tau mAb (모노클로날 항체)의 생성 및 스크리닝이다. 하이브리도마는 타우 백신 면역화된 마우스 비장의 골수종 세포주와의 융합에 의해 생성되었다. 하이브리도마는 인산화 및 비인산화 전장 Tau 단백질 뿐만 아니라 백신 제조에 사용되는 인산화 및 비인산화 Tau 항원 펩티드에 대한 반응성에 대해 평가하였다. 하이브리도마 스크리닝은 또한 Tau 트랜스제닉 마우스 뇌 슬라이스 상에서의 면역화학을 이용하여 타우 엉킴에 대한 하이브리도마 상청액의 반응성에 대해 수행하였다.

1.1 방법

1.1.1 융합

ACI-33 (Tau5-20 [pY18])을 접종한 야생형 C57BL/6 마우스를 하이브리도마 생산에 이용하였다. 이 마우스에게 ACI-33 백신을 제0일에, 이어서 제4일에 다시 추가접종하고, 융합을 제7일에 수행하였다. 면역화된 마우스로부터의 173x10⁶개 (ACI-33) 비장세포를 SP2-O-Ag14 골수종 세포와 5개 비장세포/1개 골수종 세포의 비로 융합하였다.

ACI-35 (Tau393-408 [pS396, pS404])를 접종한 야생형 C57BL/6 마우스를 하이브리도마 생산에 이용하였다. 이 마우스에게 ACI-35 백신을 제0일에, 이어서 제4일에 다시 추가접종하고, 융합을 제일에 수행하였다. 면역화된 마우스로부터의 6 x10⁷개 (ACI-35) 비장세포를 2 x 10⁷개 SP2-O-Ag14 골수종 세포와 3개 비장세포/1개 골수종 세포의 비로 융합하였다.

ACI-36 (Tau401-418 [pS404/S409])을 접종한 야생형 C57BL/6 마우스를 하이브리도마 생산에 이용하였다. 마우스에게 ACI-36 백신을 제0일에, 이어서 제4일에 다시 추가접종하고, 융합을 제7일에 수행하였다. 면역화된 마우스로부터의 84x10⁶개 비장세포를 SP2-O-Ag14 골수종 세포와 5개 비장세포/1개 골수종 세포의 비로 융합하였다.

ACI-41 (Tau206-221 [pT212/pS214] 및 Tau196-211 [pS202/pT205]의 믹스)을 접종한 야생형 C57BL/6 마우스를 하이브리도마 생산에 이용하였다. 마우스에게 ACI-41 백신을 제0일에, 이어서 제4일에 다시 추가접종하고, 융합을 제8일에 수행하였다. 면역화된 마우스로부터의 162x106개 비장세포를 SP2-O-Ag14 골수종 세포와 5개 비장세포/1개 골수종 세포의 비로 융합하였다.

이들 4개의 융합체가 8x96 웰 플레이트에서 생성되었고, 클론을 플레이트 (1-8), 이어서 열 (A-G), 최종적으로 칼럼 (1-12)에 따라 명명하였다.

1.1.2 클론을 선택하기 위한 스크리닝 방법

8x96 웰 플레이트를 우선 IgG 발현에 대해 2회 스크리닝하였다. 이어서, 양성 발현 클론을 24 웰 플레이트에 옮기고, 성장하는 세포의 세포 상청액 (= 클론)을 Tau ELISA 스크린 및 면역조직화학 TAUPIR 스크린에서 시험하였다. ELISA 및/또는 TAUPIR에서의 양성 상청액을 T25 플라스크로 옮기고, 클론을 Tau ELISA 스크린 및 TAUPIR 스크린에서 IgG 발현에 대해 다시 스크리닝하였다.

1.1.3 IgG 스크린

Elisa 플레이트를 코팅 완충제 중 50 ul/웰의 항-마우스 IgG 항체 (CER 그룹(CER Groupe), 벨기에 마를루아)로 4℃에서 16시간 동안 코팅하였다. 플레이트를 PBS/트윈으로 세척한 후에 100 ul/웰의 차단 용액을 RT에서 1시간 동안 적용하였다. 50 ul의 희석되지 않은 하이브리도마 상청액을 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 세척 단계 후에, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 항-마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3의 믹스 (Ab 세로텍(Ab Serotec), 미국 노스캐롤라이나주 롤리)를 플레이트 상에 1시간 동안 RT에서 적용하였다. 최종 세척 후에, 검출을 TMB (3-3',5,5'-테트라메틸벤지딘) (HRP에 대한 포스파타제 기질)로 수행하고, 플레이트를 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 405 nm에서 판독하였다. 결과를 O.D. (광학 밀도)로 표현하였다.

1.1.4 하이브리도마 Tau ELISA 스크린

하이브리도마 ELISA 스크린을 pTau 펩티드 (ACI-33, T1.5: Tau5-20 [pY18]; ACI-35, T3.5: Tau393-408[pS396/pS404]; ACI-36, T4.5: Tau401-418 [pS404/S409]; ACI-41, T8.5: Tau206-221 [pT212/pS214] 및 T9.5: Tau196-211 [pS202/pT205] 폴리펩티드 래보러토리즈(PolyPeptide Laboratories), 덴마크 힐레뢰드), 상응하는 Tau 펩티드 (ACI-33, T1.6: Tau5-20; ACI-36, T4.6: Tau401-4; ACI-41, T8.6: Tau206-221 및 T9.6: Tau196-211, 폴리펩티드 래보러토리즈, 덴마크 힐레뢰드), 인산화 전장 (441aa) Tau 단백질 (pTau 단백질, 문헌 [Vandebroek et al., 2005]) 및 전장 (441aa) Tau 단백질 (Tau 단백질, 시그널켐(SignalChem), 캐나다 리치몬드) 상에서 수행하였다. 최종적으로 소 혈청 알부민 (BSA)을 음성 대조군으로 이용하였다.

플레이트를 10 μg/ml의 상응하는 Tau 펩티드 및 1 μg/ml의 상응하는 Tau 단백질로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 각각의 웰을 PBS-0.05% 트윈 20으로 세척하고, PBS-0.05% 트윈 20 중 1% BSA로 차단한 후에, 희석되지 않은 하이브리도마 상청액 또는 중간 음성 대조군을 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후에 플레이트를 알칼리성 포스파타제 (AP)-접합된 항-마우스 IgG 전체 항체 (잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories), 미국 펜실베니아주 발티모어)와 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세척 후에 플레이트를 pNPP (파라-니트로-페닐-포스페이트) (AP에 대한 포스파타제 기질)와 인큐베이션하고, 405 nm에서 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 판독하였다. 결과를 O.D. (광학 밀도)로 표현하였다.

1.1.5 하이브리도마 IHC 스크린: 트랜스제닉 마우스로부터의 뇌 절편에서 엉킴에 대한 항-Tau 항체의 결합 (TAUPIR)

TAUPIR 실험은 실시예 3.1.2로부터의 프로토콜에 따라 수행하였다.

1.1.6 T25 플라스크 IgG 스크린

Elisa 플레이트를 카르보네이트-비카르보네이트 코팅 완충제 pH 9.6 (시그마(Sigma), 스위스 부흐스) 중 5ug/ml의 항-마우스 IgG F(ab')2 단편 특이적 항체 (잭슨 래보러토리즈, 미국 펜실베니아주 발티모어)로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 플레이트를 세척한 후에, 희석되지 않은 하이브리도마 상청액, 양성 대조군 IgG1 항체 (6E10, 1ug/ml: 코밴스(Covance), 미국 캘리포니아주 에머리빌) 또는 음성 대조군 (배양 배지 단독)을 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 세척 단계 후에, 이차 AP-접합된 염소 항-마우스 IgG (서브클래스 1+2a+2b+3) Fcγ 단편 특이적 항체 (잭슨 래보러토리즈, 미국 펜실베니아주 발티모어)를 플레이트 상에서 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 최종 세척 후에, 검출을 pNPP (파라-니트로-페닐-포스페이트) (AP에 대한 포스파타제 기질)로 수행하고, 플레이트를 405 nm에서 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 판독하였다. 결과를 O.D. (광학 밀도)로 표현하였다.

1.2 결과

1.2.1 ACI-33 하이브리도마

융합으로부터 생성된 8x96 웰 플레이트로부터의 세포 상청액을 IgG의 생산에 대해 스크리닝하였다. 768개 웰 (8x96개 웰)에서, 시험된 277개 웰이 IgG 발현에 대해 양성이었고, 24 웰 플레이트로 옮겼다. 24 웰 플레이트에서, 79개의 클론이 성장하고 있었고, 이들 세포로부터의 상청액을 분석하였다. 양성 클론을 추가로 T25 플라스크에 옮기고, 상청액을 IgG 생산, ELISA 및 TAUPIR에 대해 스크리닝하였다 (표 2).

클론 6C10이 3가지 스크린에서 오직 하나 양성인 것이었고, 서브클로닝을 위해 선택하였다.

1.2.2 ACI-36 하이브리도마

융합으로부터 생성된 8x96 웰 플레이트로부터의 세포 상청액을 IgG의 생산에 대해 스크리닝하였다. 768개 웰 (8x96개 웰)에서, 시험된 333개 웰이 IgG 발현에 대해 양성이었고, 24 웰 플레이트로 옮겼다. 24 웰 플레이트에서, 75개의 클론이 성장하고 있었고, 이들 세포로부터의 상청액을 분석하였다. 양성 클론을 추가로 T25 플라스크에 옮기고, 상청액을 IgG 생산, ELISA 및 TAUPIR에 대해 스크리닝하였다 (표 3).

다음 단계를 위한 클론을 선택하기 위해, IgG/ELISA/TAUPIR 스크린에 대해 양성인 모든 상청액의 순위를 ELISA 및 TAUPIR 결과를 기반으로 정하였다. ELISA 및 TAUPIR 결과의 순위를 방법 부분에 설명된 바와 같이 정하였다. TAUPIR 염색은 5개의 처음 클론에서 거의 동일하였으며, 이는 ELISA 결과에 상응하였다. 4C12가 4C1과 동일한 플레이트에서 발견되었을 때 (2개의 클론이 동일 (동일한 에피토프를 인식)할 가능성이 증가함) 이를 폐기하였다. 선택된 가장 우수한 4개의 클론은 3A8, 2B6, 4C1 및 6H1이었다. 다른 6개 클론 (4C12, 2G1, 2F9, 7D6, 3B9, 4E12)은 백업으로 유지하였다.

ELISA 스크린 및 TAUPIR 스크린에서 양성을 나타내는 10개 클론의 순위를 정하여 가장 우수한 것을 선택하였다 (표 4). 회색으로 강조된 것이 가장 우수한 5개의 클론이다.

1.2.3 ACI-41 하이브리도마

융합으로부터 생성된 8x96 웰 플레이트로부터 세포 상청액을 IgG의 생산에 대해 스크리닝하였다. 768개 웰 (8x96개 웰)에서, 시험된 215개 웰이 IgG 발현에 대해 양성이었으며, 24 웰 플레이트로 옮겼다. 24 웰 플레이트에서, 81개 클론이 성장하고 있었으며, 이들 세포로부터의 상청액을 분석하였다. 양성 클론을 추가로 T25 플라스크에 옮기고, 상청액을 IgG 생산, ELISA 및 TAUPIR에 대해 스크리닝하였다 (표 5).

클론 5D10 및 7C2가 3가지 스크린에서 오직 양성인 것이었고, 서브클로닝을 위해 선택하였다. 클론 5D10이 오직 펩티드 T8.5에 결합하는 반면, 클론 7C2는 ACI-41 백신의 2개의 펩티드 (T8.5 및 T9.5)에 결합한다 (PCT 출원 PCT/EP2010/054418에서 도 10 참조).

5D10으로부터 발생한 서브클론 5D10A4가 pTau 펩티드에 특이적이였다.

1.3. 결론

생성된 항체는 pTau 펩티드에 대해 높은 특이성을 나타내었으며, 비인산화 펩티드에 대해서는 단지 미미하게 결합하였다.

4개의 융합체 (ACI-33, ACI-36, ACI-35 및 ACI-41)로부터, 총 16개의 클론을 DSMZ에 기탁하고 (표 1), 추가의 서브클로닝을 위해 선택하였다.

상기 언급된 양성 모클론을 96 웰 플레이트, 이어서 24 웰 플레이트 및 최종적으로 T25 플라스크에서 추가로 배양하였다. 각각의 단계에서, 하이브리도마 클론의 상청액을 ELISA, Taupir 및 웨스턴 블롯에 의해 스크리닝하였다.

실시예 2: 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 클로닝

하이브리도마 세포로부터의 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를 클로닝하고, DNA 서열 및 상보성 결정 영역 (CDR)의 위치 뿐만 아니라 항체 결합 특징을 결정하였다.

전체 RNA를 3 x 10⁶개 하이브리도마 세포 (1 바이알)로부터 퀴아젠(Qiagen) RNeasy 미니 키트 (Cat No: 74104)를 이용하여 제조하였다. RNA를 50mL 물에서 용리하고, 1.2% 아가로스 겔 상에서 확인하였다.

V_H 및 V_K cDNA를 역전사효소를 이용하여 IgG 및 카파 불변 영역 프라이머로 제조하였다. 제1 가닥 cDNA를 신호 서열 프라이머의 큰 세트를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 겔-여과하고, 벡터 pGem^® T Easy (프로메가(Promega))로 클로닝하였다. 수득한 V_H 및 V_K 클론을 예상되는 크기의 삽입체에 대해 스크리닝하였다. 선택된 클론의 DNA 서열을 자동화 DNA 서열분석에 의해 양쪽 방향으로 결정하였다. 서열에서 상보성 결정 영역 (CDR)의 위치를 다른 항체 서열을 참조하여 결정하였다 (문헌 [Kabat EA et al., 1991]).

실시예 3: 결합 연구 I

목적은 tau 리포솜 백신으로 면역화된 마우스로부터 유래된 서브클로닝된 하이브리도마로부터 생성된 항체의 포스포-Tau (pTau) 결합을 측정하는 것이었다. 이를 시험하기 위해, 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)을 이용하여 인산화 및 비인산화 전장 Tau 단백질 둘 다 뿐만 아니라 리포솜 백신 제조에 사용되는 인산화 및 비인산화 Tau 항원 펩티드에 대한 정제된 항체의 결합을 측정하였다.

스크리닝을 2가지 다른 방법에 의해 완료하였다. Tau 트랜스제닉 동물 (TAUPIR)로부터의 뇌 절편에 대한 면역조직화학 (IHC)을 일차 항체로서 항-tau 항체를 사용하여 수행하였다. 추가로, Tau 트랜스제닉 마우스로부터의 뇌 단백질 균질물에 대한 웨스턴 블롯 (WB)을 블롯팅 항체로서 항-tau 항체를 사용하여 수행하였다.

3.1 방법

3.1.1 포스포-Tau 결합 검정

항-포스포 Tau 항체 (마우스 IgG3 이소형)를 리포솜 tau 접종된 마우스로부터 생성하였다. 리포솜 백신은 포스포-Tau (pTau) 펩티드의 인산화 제제이다. 항-tau 항체를 생산하는 하이브리도마 서브클론을 모-클론으로부터의 제한 희석에 의해 선택하였다. 단일 이소형 클론의 존재를 나타내기 위해 이소타이핑을 수행하였다. 항체를 롤러-병에서 생산하고, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고, 멸균 0.22 μm 여과하고, 정량화하였다. Tau 및 pTau에 대한 항체의 결합을 시험하기 위해, ELISA 검정을 이용하였다. 간략하게, 눈크 맥시소르프(Nunc MaxiSorp) 96-웰 플레이트 (눈크, 덴마크 로스킬데)를 1 μg/mL의 전장 (441 aa) Tau 단백질 (시그널켐, 캐나다 리치몬드) 또는 인산화 전장 (441 aa) Tau 단백질 (문헌 [Vandebroek et al., 2005])로 코팅하였다. 추가로, 플레이트를 10 μg/mL의 Tau-유래 펩티드로 코팅하였다. 백신 제조에 사용되지 않은 Tau 및 pTau 서열에 대한 교차-반응성을 시험하기 위해, 플레이트를 10 μg/mL의 하기 펩티드로 코팅하였다: Tau5-20 (Y18 상에서 인산화 또는 비인산화됨), Tau393-408 (S396 및 S404 상에서 인산화 또는 비인산화됨), Tau401-418 (S404 및 S409 상에서 인산화 또는 비인산화됨), Tau206-221 (T212 및 S214 상에서 인산화 또는 비인산화됨) 및 Tau196-211 (S202 및 T205 상에서 인산화 또는 비인산화됨). 코팅을 포스페이트-완충 염수 (PBS) 중에서 밤새 4℃에서 수행하였다. 플레이트를 0.05% 트윈20/PBS로 완전하게 세척한 후에 0.05% 트윈20/PBS 중 1% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 1시간 동안 37℃에서 차단하였다. 이어서, 시험될 항체를 20 내지 0 μg/mL의 8 또는 16개 일련의 2배 희석액에 첨가하고, 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 이전에 기재된 바와 같에 세척하고, AP-접합된 항-마우스 IgG 이차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 잉글랜드 서포크)를 0.05% 트윈20/PBS 중1/6000 희석액으로 2시간 동안 37℃에서 첨가하였다. 세척 후에, 플레이트를 p-니트로페닐 포스페이트 이나트륨 6수화물 (pNPP; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 스위스 부흐스) 포스파타제 기질 용액과 인큐베이션하고, 2 또는 16시간 인큐베이션 후에 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 405 nm에서 판독하였다. 결과를 광학 밀도 (O.D.)로 표현하였다.

3.1.2 Tau 트랜스제닉 동물로부터의 뇌 절편에서 Tau 엉킴에 대한 항-Tau 항체의 결합 (TAUPIR)

사용된 뇌 슬라이스는 고령 (>18개월령)의 이중 트랜스제닉 biGT (P301L 돌연변이를 갖는 인간 Tau의 가장 긴 이소형 (441aa)을 함유하는, TPLH 마우스와 교배된 GSK-3β 트랜스제닉 마우스) 트랜스제닉 마우스로부터의 것이었다. 추가로, Tau 녹아웃 마우스 (TKO; 6개월령)로부터의 절편을 또한 사용하였다. 뇌 절편을 5분 동안 PBS에서 세척한 후에 PBS:MeOH (1:1) 중 1.5% H₂O₂에서 15분 동안 RT에서 인큐베이션하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하였다. 절편을 PBST (PBS/0.1% 트리톤X100)에서 3회 세척한 후에 이들을 PBST+10% FCS (태아 소 혈청) 차단 용액에서 30분 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 시험될 항-Tau 항체와의 인큐베이션을 PBST/10% FCS 중 지시된 희석 농도에서 밤새 4℃에서 수행하였다. 다음에 절편을 PBST에서 3회 세척한 후에 PBST/10% FCS에서 HRP-접합된 염소 항-마우스 (다코(Dako)로부터 구입함, 덴마크 글로스트럽) 이차 항체와 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 검출 전에, 절편을 PBST로 3회 세척하고, 50 mM 트리스/HCl pH7.6에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 절편을 디아미노벤지딘 (DAB: 10 ml의 50 mM 트리스.HCl + 3 ul H₂O₂ 30% 중 1 정제; MP 바이오메디칼스(MP Biomedicals), 미국 오하이오주 솔론)에서 3분 동안 인큐베이션하여 검출을 수행하였다. 절편을 PBST에서 3회 세척하여 반응을 중단시켰다. 이어서, 절편을 실란화 유리-플레이트 및 공기-건조된 가온 중의 플레이트로 50℃에서 2시간 동안 전달하였다. 마이어스(Mayers) 헤마톡실린 (플루카 케미(Fluka Chemie), 스위스 부흐스)와 1분 동안의 인큐베이션을 이용하여 대조염색을 수행한 후에, 흐르는 수돗물에서 4분 동안 세척 단계를 수행하였다. 절편을 50%, 70%, 90%, 및 100% (2회) 에탄올 조에서, 이어서 크실롤 (2회)에서 1분 동안 통과시켜 탈수시켰다. 최종적으로 절편을 유리 커버-슬립 아래에 DePeX (BDH 케미칼스 리미티드(BDH Chemicals Ltd.), 잉글랜드 풀)와 마운팅하였다.

추가로, 1/10 희석한 하이브리도마 상청액 (표 1에 나타낸 모든 ACI-35-유래 항체)을 사용하여 Tau 트랜스제닉 마우스, 야생형 마우스 또는 Tau 녹아웃 마우스로부터 SDS-PAGE 분리된 뇌 균질물 단백질을 함유하는 막을 블롯팅하였다.

3.1.3. AD 및 타우병증 환자로부터의 뇌 절편에서 Tau 엉킴에 대한 항-Tau 항체의 결합 (TAUPIR)

인간 뇌에서 pTau에 대한 항-pTau 항체 ACI-36-3A8-Ab1의 면역반응에 대한 검정을 TAUPIR에 의해 수행하였다. 뇌 파라핀 절편을 크실롤 (2회)에서 5분 동안 및 100% EtOH (2회)에서 1분 동안 통과시켜 탈파라핀화시킨 후에, 90%, 70%, 및 50% EtOH 및 증류수에서 1분 세척한 다음 PBS에서 2회 5분 세척하였다. 항원 복구를 위해, 절편을 물 중 0.01 M 시트르산 용액 (pH 6.0)에서 10분 동안 가열하여 처리하고, 20분 동안 냉각시켰다. 절편을 PBS:MeOH (1:1) 중 1.5% H₂O₂에서 15분 동안 RT에서 인큐베이션하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하였다. 절편을 PBST (PBS/0.05%트윈-20)에서 3회 세척한 후에, 이들을 차단 용액으로서 PBST + 10% 태아 소 혈청 (FCS)에서 30분 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 일차 항-pTau 항체 ACI-36-3A8-Ab1 (차단 완충제 중 410 ng/mL)과의 인큐베이션을 밤새 4℃에서 수행하였다. 이어서, 절편을 PBST에서 3회 세척한 후에 PBST/10% FCS에 1/500 희석된 HRP-접합된 염소 항-마우스 이차 항체 (다코, 덴마크 글로스트럽)와 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 검출 전에, 절편을 PBS로 3회 세척하고, 50 mM 트리스/HCl pH 7.6에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 절편을 디아미노벤지딘 (DAB: 10 mL의 50 mM 트리스-HCl + 3 μL H₂O₂ 30% 중 1 정제; MP 바이오메디칼스, 미국 오하이오주 솔론)에서 3분 동안 인큐베이션하여 검출을 수행하였다. 절편을 PBS에서 3회 세척하여 반응을 중단시켰다. 마이어스 헤마톡실린 (플루카 케미, 스위스 부흐스)과 1분 동안 인큐베이션하여 대조염색을 수행한 후에 흐르는 수돗물에서 4분 동안 세척하여였다. 절편을 50%, 70%, 90%, 및 100% (2회) 에탄올 조를 통해, 이어서 크실롤 (2회)에 의해 1분 동안 통과시켜 탈수시켰다.

최종적으로, 절편을 유리 커버-슬립 아래에 DePeX (BDH 케미칼스 리미티드, 잉글랜드 풀)와 마운팅하였다. 염색된 절편을 백색광 현미경검사 및 3CCD 카메라 (라이카(Leica), 독일 웨즐러)로 촬영한 디지털 영상으로 조사하였다. 영상을 포착하고, 전용 소프트웨어 (IM500, 라이카)를 이용하여 분석하였다. 영상은 20x1.6 배율로 나타낸다.

3.1.4. 웨스턴 블롯 (WB)

트랜스제닉 동물로부터의 뇌 추출물에서 pTau에 대한 시험 항체의 결합을 WB에 의해 수행하였다. 야생형 FVB, TPLH, biGT 및 TKO 마우스로부터의 뇌 균질화를 하기 완충제에서 수행하였다: 25 mM 트리스/HCl pH7.6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 30 mM NaF, 0.2 mM Na₃VO₄, 1 nM 오카다산, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF), 5 mM Na4P2O7, 1 정제 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (CPIC) (총 12 ml당). 전체 뇌 균질물을 수득하기 위해, 뇌를 1 vol/중량 반구 (ml/g)로 얼음 상에서 모터-유도 포터-유사 유리 튜브/테플론 막자로 700 rpm에서 균질화시켰다. 전체 뇌 균질물을 샘플 완충제 (125 mM 트리스/HCl pH6.8, 4% (w/v) 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 20% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 블루 및 5% 베타-메르캅토-에탄올)에서 절반으로 희석한 후에, 빠르게 95℃로 가열하였다. 샘플을 5분 동안 유지하고, 샘플 완충제에서 1/4 희석하고, 다시 95℃로 가열한 후에 냉각시키고, 14,000 rpm에서 5분 동안 회전시켜 용해되지 않은 잔해를 제거하였다. 상청액을 수집하고, SDS-PAGE 겔 상에 부하하였다. 니트로셀룰로스 막 (하이본드(Hybond)-ECL)으로의 전달을 전달 완충제 (25 mM 트리스 pH 8.6, 190 mM 글리신, 20% 메타올)에서 수행하였다. 막을 차단 용액 (TBS (50 mM 트리스.HCl, pH7.6, 150 mM NaCl, 및 5% 분유) 중 0.1% 트윈)으로 전달한 후에, 시험 항체를 차단 용액에 희석하면서 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 차단 용액에 1/10'000 희석된 이차 항체 HRP-접합된 염소 항-마우스 (다코, 덴마크 글로스트럽)와의 인큐베이션을 RT에서 1시간 동안 수행하였다. 검출을 지이 헬쓰케어(GE Healthcare)로부터의 ECl 웨스턴 블롯팅 검출 시약을 사용하여 수행하였다.

3.2 결과

3.2.1 엉킴 양성 Tau 트랜스제닉 마우스로부터의 뇌 절편을 이용하는 ELISA 검정 및 TAUPIR

면역원으로 사용된 인산화 Tau 펩티드에 대한, 및 인산화 전장 인간 Tau 단백질에 대한 항체의 결합을 측정하였다. 이는 441개 아미노산으로 이루어지는 인간 Tau 단백질의 가장 긴 이소형이다. 상응하는 비인산화 펩티드 및 전장 인간 Tau 단백질이 또한 포함되었다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 항체는 인산화 Tau 펩티드에 대한 높은 결합을 입증하였으며, 인산화 전장 인간 Tau 단백질에 대해서는 오직 제한적으로 결합하거나 전혀 결합하지 않았다. 상응하는 비인산화 Tau 펩티드 또는 비인산화 전장 인간 Tau 단백질에 대한 결합이 관찰되지 않았다. 이는 인산화 인간 Tau 펩티드에 대한 항-tau 항체의 높은 결합을 입증한다.

다른 인산화 및 비인산화 Tau 서열에 대한 비-특이적 결합을 시험하기 위해, 항체를 5개의 포스포 및 비-포스포 Tau 펩티드 (이 중 하나가 항원 펩티드 서열로 사용됨)에 대한 결합에 대해 시험하였다. 백신에 사용된 펩티드 이외의 포스포 또는 비-포스포 Tau 펩티드에 대한 교차-반응성은 심지어 펩티드의 높은 농도에서도 관찰되지 않았다.

Tau 트랜스제닉 마우스의 뇌에서 pTau에 대한 항-tau 항체의 결합을 TAUPIR 염색 (도 1) 및 WB (도 1)에 의해 평가하였다. 항체는 Tau 트랜스제닉 (biGT) 마우스의 뇌의 피질 및 해마에 존재하는 Tau 엉킴 및 신경망사에 대한 결합을 입증하였다. TAUPIR에 사용되는 항체 희석액은 0.05 내지 0.0033 ug/mL 범위였다. 항-tau 항체는 또한 야생형 FVB, TPLH, biGT 및 TKO 마우스로부터의 전체 뇌 균질물을 사용하는 WB에서 일차 항체로 사용되었고, SDS-PAGE에 의해 분리되었다. 2개의 상업적인 항-pTau 항체, MC1 및 Tau5를 대조군으로 사용하였다. 모든 항-tau 항체는 Tau 트랜스제닉 마우스의 뇌에 존재하는 pTau에 결합하였다. 블롯팅

Tau 트랜스제닉 마우스 야생형 마우스, 및 Tau 녹아웃 마우스로부터 SDS-PAGE 분리된 단백질 균질물을 함유하는 막 상에서, 모든 ACI-35 항체 (표 1에 개시됨)는 Tau 및 pTau와 동일한 46 kDa 이동 패턴을 갖는 단백질 밴드에 결합하였다 (데이터는 나타내지 않음).

3.2.2 AD 및 타우병증 환자로부터의 뇌 절편에서의 TAUPIR 연구

AD, FAD, AGD, FTDP-17, CBD 및 PSP를 포함하여, 타우병증으로 진단된 대상체로부터의 인간 뇌 절편에 존재하는 Tau-응집체에 결합하는 항체 ACI-36-3A8-Ab1의 능력을 TAUPIR 면역조직화학에 의해 조사하였다 (도 2). 항-pTau 항체 ACI-36-3A8-Ab1은 신경원섬유 엉킴 (NFT), 인간 뇌 절편의 신경망사, 및 뉴런 및 신경교 세포-유형에 존재하는 다른 유형의 pTau 축적을 함유하는 pTau에 결합하였다. 보다 구체적으로, ACI-36-3A8-Ab1은 NFT, 신경망사, 및 AD 뇌의 아밀로이드 플라크를 둘러싼 이영양성 신경돌기를 두드러지게 염색하였으며, 이는 AD 및 FAD로 진단된 대상체에서 용이하게 명백하였다. AGD로부터의 뇌 절편에서, ACI-36-3A8-Ab1은 NFT 및 신경망사를 둘 다 염색하였으며, 여러 은친화성 입자/과립이 분명하게 시각화되었다 (도 2). PSP로부터의 뇌 절편을 ACI-36-3A8-Ab1로 염색하여 NFT, 신경망사, 및 이영양성 신경돌기를 나타내었다. 추가로, PSP에서 풍부한 특징인 픽체(Pick body)-유사 봉입체 및 촘촘한 pTau 양성 성상교세포가 분명하게 나타났으며, 여기서 pTau 염색은 말단부 과정을 포함하여 세포 전반에 걸쳐 확장된다. FTDP-17에서, 염색 패턴은 또한 NFT 뿐만 아니라 검출된 무색 "부푼" 뉴런을 갖는 질환의 공지된 이질성을 설명하였다. ACI-36-3A8-Ab1 항체는 또한 CBD의 주요 특성인 희미하게 Tau-양성의 부푼 무색 뉴런을 염색하였다. CBD의 또 다른 우세한 병리학적 특징, 즉 코일드체(coiled body)로 불리는 핍지교 봉입체를 또한 ACI-36-3A8-Ab1 항체에 의해 검출하였다. AT8-음성 대조군 대상체에서 염색이 검출되지 않은 반면 약한 염색이 AT8-양성 대조군 대상체에서 확인되었다.

다양한 형태의 타우병증을 갖는 것으로 이전에 진단된 대상체로부터의 인간 뇌 절편에 대한 TAUPIR을 이용하여, 항-pTau 항체 ACI-36-3A8-Ab1은 이들 대상체의 뇌에 존재하는 다양한 공지된 pTau-풍부 병리학적 특징에 대한 우수한 결합을 입증하였다.

실시예 4: 결합 연구 II

연구의 목적은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 이용하여 항-tau 항체 및 포스포-tau 펩티드 사이의 결합 친화도를 결정하는 것이다. 포스포-tau 펩티드는 항-tau 항체를 생성하기 위한 백신 제조에 사용된 펩티드 서열에 상응한다. 이 상호작용을 연구하기 위해, 포스포펩티드를 센서 칩의 표면에 고정화하고, 결합을 항체가 칩 위를 통과할 때 SPR을 이용하여 실시간으로 모니터링하였다.

4.1 방법

4.1.1 SPR 결합 검정

모든 SPR 실험을 비아코어(Biacore) X 기기 (지이 헬쓰케어) 상에서 수행하였다. 고정화를 위한 시약 (EDC, NHS 및 에탄올아민), 센서 칩 CM5 (카르복시메틸 덱스트란) 뿐만 아니라 러닝 완충제 HBS-EP를 지이 헬쓰케어로부터 구입하였다. 포스포-tau 펩티드를 PBS/나트륨 아세테이트 완충제 (10 mM, pH 5.0)에 1:1 (v/v) 비로 용해시켜 250 μg/ml의 최종 펩티드 농도를 얻었다. 이어서, 이 펩티드 용액을 EDC/NHS를 사용하여 미리 활성화시킨 CM5 센서 칩의 유동 셀 (fc) 2를 통해 커플링시켰다. 커플링 후에, 에탄올아민을 표면 상에서 통과시키고, 218 RU의 최종 고정화 수준을 제공하였다. 5개 농도의 항-tau 항체를 러닝 완충제를 사용하는 일련의 희석에 의해 검정하였다. 주사를 최저 농도에서 시작하여 수행하였으며, fc 1 및 2 둘 다의 위에서 30 μL/분의 유량으로 180 s 동안 통과시켰다. 유동 셀 1은 유도체화되지 않았고, 반응을 fc 2로부터 감하여 기기 노이즈 및 벌크 굴절 변화에 대해 보정하였다. 주사가 완료된 후에, 표면을 즉시 러닝 완충제로 300 s 동안 세척하였다. 칩으로부터 남아았는 결합된 항체를 제거하기 위해, 표면 재생을 1M NaCl을 함유하는 물 중 8 mM NaOH의 펄스 (전형적으로 3 μl)를 주사하여 수행하였다. 동역학적 분석은 수치 적분을 위한 알고리즘을 이용하여 수행하였고, 전체적인 분석은 비아이밸류에이션(BIAevaluation) 3.0을 이용하여 수행하였다. 상이한 농도의 항체의 주사에 대해 수득한 센소그램을 중첩시키고, 기준선을 0으로 조정하였다. 곡선 핏팅을 위해, 모든 데이터를 1:1 동질성 (랭뮤어(Langmuir)) 모델로 동시에 핏팅하였다.

대안적으로, 고정화된 비오티닐화 T3 펩티드 (T3.30)를 비아코어 X 기기를 이용하여 스트렙타비딘 비아코어 SA 칩 (지이 헬쓰케어)에 고정화하였다. 항체를 HBS-EP 러닝 완충제 (지이 헬쓰케어)에 희석하고, 120s 동안 50ul/분으로 주사한 후에 100s 해리시켰다. 표면 재생을 16 mM NaOH의 펄스 (1-3 ul)를 이용하여 수행하였다. 핏팅은 비아이밸류에이션을 이용하고 1:1 랭뮤어 결합 상호작용을 가정하여 수행하였다.

사용된 펩티드

4.2 결과

인산화 Tau 펩티드에 대한 항-tau 항체의 결합을 SPR을 이용하여 실시간으로 모니터링하였다. 항체 결합의 회합 및 해리 상의 분석을 이용하여 회합률 상수 (k _a), 해리율 상수 (k _d) 뿐만 아니라 해리 상수 K_D를 결정할 수 있다. 항체 ACI-33-6C10-Ab1은 항체의 범위 3.7 → 367 nM에서 비-유도체화 카르복시메틸 덱스트란 표면 위에서 펩티드 T1.5에 특이적으로 결합한다. 센소그램의 동역학적 분석은 9.46 x 10⁵ M^-1s^-1의 빠른 회합률 상수 및 3.27 x 10^-3 s^-1의 해리율 상수를 보여주었다(표 7). 따라서, 해리 상수 K_D는 3.46 nM인 것으로 결정되었으며, 이는 항체가 포스포펩티드 T1.5를 매우 높은 친화도로 인식한다는 것을 나타낸다. 모든 시험된 항체는 면역화 및 하이브리도마 생성에 사용된 그의 각각의 포스포펩티드에 대해 높은 친화도를 나타내었으나, 이들은 비-포스포펩티드에 대해 친화도를 거의 나타내지 않았다.

실시예 5: 항 pTau 항체의 에피토프 맵핑

5.1 방법

항-포스포 Tau 마우스 모노클로날 항체의 에피토프 맵핑은 상이한 포스포 및 비-포스포 펩티드 라이브러리를 이용하여 ELISA에 의해 수행하였다. 사용된 펩티드 라이브러리의 아미노산 서열을 표 8에 나타내었다. 각각의 라이브러리는 펩티드 백신에 존재하는 포스포 및 비-포스포 서열에 걸친 짧은 비오티닐화 펩티드로 이루어졌다. 펩티드 라이브러리는 ANAWA 트레이딩 SA(ANAWA Trading SA)로부터 구입하였다. 에피토프 맵핑을 제조업체 (미모토프스(Mimotopes)) 지침에 따라 수행하였다. 간략하게, 스트렙타비딘 코팅된 플레이트 (눈크)를 포스페이트-완충 염수 (PBS) 중 0.1% BSA로 밤새 4℃에서 차단하였다. PBS-0.05% 트윈 20으로 세척한 후에, 플레이트를 각각의 라이브러리로부터의 상이한 펩티드 (PBS 중 0.1% BSA, 0.1% 나트륨 아지드에 10 μM의 최종 농도로 희석됨)로 1시간 동안 RT에서 코팅하였다. 세척 후에, 플레이트를 PBS 중 2% BSA, 및 0.1% 나트륨 아지드에 40 ng/ml로 희석된 시험될 항체와 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 1/6000 희석된 AP-접합된 항-마우스 IgG 이차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories), 잉글랜드 서포크)와 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 최종 세척 후에, 플레이트를 p-니트로페닐 포스페이트 이나트륨 6수화물 (pNPP; 시그마-알드리치, 스위스 부흐스) 포스파타제 기질 용액과 인큐베이션하고, 2시간 인큐베이션 후에 405 nm에서 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 판독하였다. 결합은 광학 밀도 (O.D.)가 백그라운드 O.D.에 비해 적어도 2배인 경우에 양성으로 간주되었다.

5.2 결과

에피토프 맵핑 실험의 결과로서, 본원에 개시된 항체가 특이적으로 결합하는, 요구되는 인산화 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프를 확인할 수 있었다 (표 9 참조).

ㆍ Tau aa 15-20, pY18 (6C10F9C12A11; 6C10E5E9C12)에 요구됨

ㆍ Tau aa 405-412, pS409 (6H1A11C11; 6H1G6E6)에 요구됨

ㆍ Tau aa 405-411, pS409 (2B6A10C11; 2B6G7A12; 3A8A12G7; 3A8E12H8)에 요구됨

ㆍ Tau aa 208-218, pT212 및 pS214 (7C2(1)F10C10D3)에 요구됨

ㆍ Tau aa 393-401, pS396 (A4-2A1-18; A4-2A1-40)에 요구됨

ㆍ Tau aa 396-401, pS396 (A4-4A6-18)에 요구됨

ㆍ Tau aa 394-400, pS396 (A6-1D2-12)에 요구됨

ㆍ Tau aa 402-406, pS404 (A6-2G5-08)에 요구됨

ㆍ Tau aa 393-400, p396 (A6-2G5-30; A6-2G5-41)에 요구됨

실시예 6: Tau 트랜스제닉 마우스의 1-주 수동 면역화

6.1. 방법

모든 생체내 연구를 위해, Tau 트랜스제닉 마우스를 사용하였고, 하기 표에 나타낸 바와 같이 처리 항체를 투여하였다.

생체내 연구에 사용된 트랜스제닉 마우스 및 항체

6.1.1. 마우스 및 처리

뮤린 Thy-1 프로모터의 제어 하에 미스센스 돌연변이 V337M 및 R406W를 보유하는, 전장 인간 TAU 이소형 TAU441을 과다발현하는 암컷 및 수컷 6.3개월령 (±3 일) Tg 마우스 (TMHT 마우스)를 연구 번호 1에 사용하였다 (상기 표 참조). 마우스를 마지막 투여 1일 후에 안락사시켜 뇌에서 TAU 병리상태를 결정하였다.

6.1.2 동물 확인 및 사육

유전자형 분석을 위한 꼬리 티핑의 과정에서, 동물을 고전적인 이어마킹(earmarking)에 의해 연속적으로 넘버링하였다. 모든 동물은 연구 시작 전에 유전자형을 다시 분석하였다. 마우스를 국제 표준을 기반으로 JSW 표준 작업 절차에 따라 유지하였다. 동물을 레텐마이어(Rettenmaier)^®에 의해 공급된 표준화된 설치류 잠자리 상에서 개별 환기 케이지에서 사육하였다. 온도를 대략 24℃에서 유지하고, 상대 습도는 40 내지 70%에서 유지하였다. 동물을 일정한 광-사이클 (12시간 명/암) 하에 사육하였다. 건조되고 펠릿화된 표준 설치류 사료 (알트로민(Altromin)^®) 및 정상 수돗물이 임의량으로 동물에게 이용가능하였다. 각각의 개별 동물을 개별 동물 동물 데이터시트에 언급된 임의의 임상 징후에 대해 정기적으로 확인하였다.

6.1.3 생체내 채혈

제1 면역화 7일 전에, 생체내 채혈을 안면 정맥/동맥으로부터의 하악 샘플링에 의해 수행하였다. 혈액 샘플은 정맥 및 동맥 혈액의 혼합물이다. 혈장을 얻기 위해, 혈액을 헤파린 튜브에 수집하고, 원심분리하였다 (1000 x g, 10분, 실온). 혈장은 사용할 때까지 2개의 분취액으로 냉동시켰다.

6.1.4. 면역조직화학 (IHC) 정량화

모든 동결된 뇌 반구를 분석하였다. 각각 10μm 두께 (라이카 CM 3050S)의 수준당 15개 냉동-절편 (함께 5개 수준)을 시상 절개하였다. 뇌 수준을 문헌 [morphology atlas "The Mouse Brain" from Paxinos and Franklin (2nd edition)]에 따라 선택하였다. 5개 수준의 절개는 무작위적인 슬라이스로 시작한 후에 균일하고 체계적으로 계속 샘플링하였으며, 항상 수준당 15개 슬라이스를 일렬로 유지하고, 수준 사이에 150 μm는 폐기하였다. 해마에서 TAU 병리상태를 결정하기 위해, 뇌 영역 및 동물당 편도체 5개 슬라이스 (각 수준으로부터 1개씩)를 AT180 (# MN1040, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 및 HT7 (# MN1000, 써모 사이언티픽) 항체를 이용하여 염색하였다. 일차 항체를 Cy-3-커플링된 이차 항체 (잭슨 래보러토리즈)에 의해 시각화하고, 이후에 면역반응성 면적을 이미지 프로 플러스(Image Pro Plus) (v6.2) 소프트웨어를 이용하여 평가하였다.

크기 제한 (편도체에서 30 μm², 해마에서 7 μm²) 초과 및 동적 강도 역치 초과의 면역반응성 대상이 측정되었다. 대상의 총 면적 및 강도 및 개별 역치를 자동으로 정리하였다. 사용된다면, 동적 역치는 "AOI 내의 평균 강도 플러스 인자 곱하기 AOI 내의 픽셀 강도의 표준 편차"로 정의되었다. 임의의 경우에, 값은 최소 세트 역치를 넘어야 한다. 정확한 역치 수준은 하기 표에 주어진다.

영역 크기는 해마 및 편도체의 수동 묘사에 의해 측정하였다. HT7 및 AT180 IR 면적 데이터를 영역 크기에 대해 정규화하였다.

n > 4를 갖는 모든 IHC 관련 데이터는 콜모고로프 스미르노프(Kolmogorov Smirnov) 정규성 시험에 따른 가우스 분포에 따르고, 평균 + SEM으로 표현하였다. 단지 4마리 동물로 이루어져서 정규성 시험에 너무 적은 비히클 군의 경우에, 가우스 분포를 가정하였다. 군 차이를 모수적 일원 ANOVA에 이어 뉴먼 컬스(Newman Keuls) 사후 시험에 의해 계산하였다 (그래프패드프리즘(GraphPadPrism) 소프트웨어로 계산됨). 알파-오차 수준을 0.05로 설정하였다.

뇌 TAU 병리상태를 해마 및 편도체에서 면역조직화학 (IHC) 정량화에 의해 AT180 (항-pTAU) 및 HT7 (항-TAU) 항체를 이용하여 결정하였다. 또한, 피질 및 해마에서 가용성 pTAU 및 TAU에 대한 처리 효과를 가용성 균질물 분획에서 pTAU 및 전체 TAU를 프로빙하는 메조스케일 디스커버리(MesoScale Discovery) (MSD) 듀플렉스 기술을 이용하여 측정하였다.

IHC 또는 MSD 검정에 사용된 어떠한 항체도 이 연구에 사용된 2개의 처리 항체와 중첩되는 에피토프를 갖지 않는다.

6.1.5. Tg 마우스의 가용성 뇌 분획에서 가용성 Tau 단백질 수준의 정량화를 위한 분획의 생성

방법 6.1.1.에 따라 처리된 마우스를 제2 투여 1일 후에 안락사시켜 뇌에서 Tau 병리상태를 결정하였다. 간략하게, 하나의 뇌 반구로부터의 가용성 피질 샘플을 100 내지 200 μL의 차가운 추출 완충제 (25 mM 트리스-HCl pH=7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mM β-글리세로포스페이트, 30 mM NaF, 2 mM Na₃VO₄, 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일)에서 균질화시켰다. 균질물을 원심분리 (4℃에서 15분 동안 74,200 x g)하고, 상청액을 가용성 Tau의 분석에 사용하였다. 피질 샘플의 가용성 분획에서 전체 단백질의 농도를 BCA 단백질 정량화 검정 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국 일리노이주 록포드)에 의해 결정하였다.

6.1.6. 웨스턴 블롯에 의한 pTau 존재의 분석

ACI-36-2B6-Ab2 및 ACI-36-3A8-Ab2이 투여된 마우스의 뇌에서 면역반응성을 프로빙하기 위해, pTau PHF 에피토프에 결합하는 것으로 보고된 2개의 항체 (문헌 [Greenberg et al., 1992; Reig et al., 1995; Hoffmann et al., 1997])를 웨스턴-블롯 (WB) 검정에 사용하였다. 피질로부터의 가용성 분획을 동일한 부피의 샘플 완충제 A (125 mM 트리스-HCl pH 6.8, 4% [w/v] 나트륨 도데실 술페이트 [SDS], 20% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 블루, 5% β-메르캅토에탄올)를 첨가하여 희석하고, 샘플을 10분 동안 95℃로 가열하였다. 30 μg의 샘플을 4-12% 비스-트리스 겔 (인비트로젠(Invitrogen), 스위스 바젤) 상에 부하하고, MOPS SDS 완충제 (인비트로젠)에서 전개시켰다. 단백질을 전달 완충제 (25 mM 트리스 pH 8.6, 190 mM 글리신, 20% 메탄올) 중 0.45 μm PVDF 막으로 전달하였다. 단백질 전달을 검증하기 위해, 막을 폰슈(Ponceau) S로 5분 동안 염색하고, 세척하고, 차단 완충제 (TBS [50 mM 트리스-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl] 중 5% BSA) 중에서 1시간 동안 차단하였다. 막을 4℃에서 차단 완충제 및 0.1% 트윈 중 일차 항체로 밤새 블롯팅하였다. WB에 사용된 2개의 pTau PHF-특이적 일차 항체는 다음과 같다: 인간 또는 뮤린 pTau의 인산화 Ser396 (pS396) (문헌 [Hoffmann et al., 1997])에 특이적인 항-pS396 (PHF-13 에피토프; 아브캄(AbCam), 영국 캠브리지; 3 μg/mL에서 사용됨), 및 인간 및 뮤린 pS396 및 인산화 Ser404 (pS404; 문헌 [Reig et al., 1995])에 특이적인 AD2 (PHF-1 에피토프; 바이오라드(BioRad), 스위스 레이나치; 0.4 μg/mL에서 사용됨). 전체 Tau WB를 위해, 인간 및 뮤린 Tau 둘 다에 결합하는 항체인 Tau5 (0.5 μg/mL) (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 스위스 알슈빌)를 사용하였다. 일차 항체와의 인큐베이션 후에, 막을 TBS 중 0.1% 트윈으로 세척하고, 이차 항체: 염소 항-마우스-IRDye800 또는 염소 항-토끼-IRDye680 (둘 다 리-코르 바이오사이언시스(Li-Cor Biosciences)의 것임, 미국 네브라스카주) (둘 다 BB 및 0.1% 트윈 중에 1:15000 희석됨)과 인큐베이션하였다. 이어서 막을 광으로부터 보호된 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, TBS 중 0.1% 트윈으로 15분 동안 3회, 및 TBS로 5분 동안 2회 세척하고, 밴드를 리-코르 오디세이(Li-Cor Odyssey) 근적외선 영상화 시스템 (리-코르)을 이용하여 정량화하였다. 밴드를 β-액틴 발현 (아브캄; 0.4 μg/mL에서 사용됨)에 대해 정규화하였다. 인간 트랜스제닉 대 마우스 내인성 Tau 밴드의 확인을 검증하기 위해, 블롯을 인간 전체 Tau에 특이적인 항체 (Tau13, 아브캄; 나타내지 않음)로 프로빙하였다. 추가로, 막을 항-마우스 일차 항체로 프로빙하여 처리 항체, ACI-36-2B6-Ab2 및 ACI-36-3A8-Ab2가 변성된 시험 샘플에 항-pS396 또는 AD2의 결합을 방해하기에 충분한 양으로 존재하지 않는다는 것을 검증하였다. 이 연구에 사용된 샘플에서 무손상 또는 변성된 처리 항체가 검출되지 않았다 (결과는 나타내지 않음).

6.1.7. 통계적 분석

데이터를 비-모수적 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 순위 합계 통계를 이용하여 분석하였고, 유의성이 P<0.05 수준이라면, 던(Dunn) 사후 시험을 이용하여 모든 군을 비교하였다 (그래프패드 프리즘, 그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주). 결과는 평균 ± SEM을 보여주는 개별 데이터 점으로 제시된다. P<0.05를 갖는 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

6.2 결과

6.2.1. 면역조직화학 (IHC) 정량화에 의한 뇌 TAU 병리상태

ACI-36-2B6-Ab2 및 ACI-36-3A8-Ab2의 2회 i.p. 주사는 연구 기간 동안 어떠한 전체적인 역효과도 나타내지 않았다. IHC에 의해 AT180을 사용하는 pT231 및 pS235에 대한 염색은 ACI-36-3A8-Ab2 처리 () 후에 편도체에서 증가된 면역반응성 면적 (IR)을 나타내었다. 3 mg/kg ACI-36-2B6-Ab2로 처리된 마우스는 해마 ()에서 유의하게 보다 적은 AT180 IR 면적을 가졌다.

ACI-36-3A8-AB2 처리는 편도체에서 PBS 군과 비교하여 AT180 IR pTAU를 증가시켰다. 해마에서 ACI-36-2B6-AB2 처리는 pTAU를 감소시켰다. AT180은 pTAU를 특이적으로 표지한다. AT180 IR 세포의 빈도는 ACI-36-2B6-AB2 처리된 마우스에서 감소하였다. 이 효과는 낮은 용량 (3 mg/kg) 군 (ACI-36-2B6-AB2 LD)에서 보다 강하였다. 세포체 염색 패턴은 군 사이에서 상이하지 않다.

보다 높은 10 mg/kg 용량에서, 보다 적은 AT180 IR에 대한 비-유의성 경향이 비히클 대조군 처리된 마우스와 비교하였을 때 해마에서 ACI-36-2B6-Ab2 및 ACI-36-3A8-Ab2 둘 다의 경우에 관찰되었다. 정성적으로, ACI-36-2B6-Ab2 처리된 동물은 고도로 강한 AT180 표지를 갖는 해마 뉴런의 보다 낮은 수를 보여주었다.

6.2.2. 수동 면역화 후의 뇌 분획에서의 전체 Tau 수준의 감소

가용성 단백질을 함유하는 뇌 분획에서 pTAU 및 TAU에 대한 처리의 효과를 MSD 듀플렉스 검정을 이용하여 측정하였다. 피질에서 전체 가용성 TAU의 수준은 ACI-36-2B6-Ab2 및 ACI-36-3A8-Ab2로 처리된 마우스에서 유의하게 감소하였다 (p<0.01; 도 3 상부 패널). 가용성 pTAU의 수준이 또한 유의하게 감소하였으며 (p<0.05; 도 3 하부 패널), 3 mg/kg 용량의 ACI-36-2B6-Ab2가 최대 감소를 입증하였다 (p<0.01). 전체 TAU에 대한 pTAU의 비는 변화하지 않고 유지되었다. 가용성 TAU 및 pTAU의 수준은 해마로부터의 샘플에서 변화하지 않았다 (여기에 나타내지 않음).

6.2.3. 쌍을 이룬 나선형 필라멘트 (PHF)에 존재하는 포스포-Tau 에피토프에 대한 ACI-36-2B6-Ab2 및 ACI-36-3A8-Ab2 투여의 효과

구조적으로, 신경원섬유 엉킴 (NFT)은 과인산화 상태에서 주로 발견되는 미세관-연관 단백질 Tau로 구성된 쌍을 이룬 나선형 필라멘트 (PHF)로 이루어진다 (문헌 [Alonso et al., 1997]). 이 연구의 목적은 ACI-36-2B6-Ab2 및 ACI-36-3A8-Ab2의 투여 후에 Tau 트랜스제닉 마우스의 뇌에서 이들 pTau PHF 에피토프를 프로빙하고 정량화하기 위해 pTau PHF를 인식하는 항체를 사용하는 것이다.

널리 기록된 Tau PHF 포스포 에피토프의 양에 대한 2회 ACI-36-2B6-Ab2 또는 ACI-36-3A8-Ab2 투여의 효과를 측정하기 위해, 처리된 Tau Tg 마우스로부터의 뇌 피질 가용성 분획을 WB를 이용하여 AD2 (PHF-1 에피토프, pS396/pS404) 및 항-pS396 항체 (PHF-13 에피토프, pS396)로 프로빙하였다. 면역반응성을 적외선 영상화 시스템을 이용하여 정량화하였다. Tau Tg 마우스의 피질에서 AD2 PHF 면역반응성에 대한 ACI-36-3A8-AB2 및 ACI-36-2B6-AB2 처리의 효과를 Tau의 이전에 기록된 2개의 PHF 포스포 잔기인 pS396 및 pS404를 프로빙하는 AD2를 사용하여 결정하였다 (문헌 [Greenberg et al., 1992; Reig et al., 1995]).

AD2 (PHF-1) 항체를 이용하여 S396 및 S404 상에서의 인간 및 마우스 pTau 인산화를 나타내는 밴드를 리-코르 적외선 영상화 시스템을 이용하여 정량화하였다. 개별 마우스에 대한 값 뿐만 아니라 평균 ± SEM을 결정하였다.

AD-2-양성 pTau 면역반응성의 감소에 대한 비-유의성 경향이 트랜스제닉 인간 pTau 밴드에서 관찰되었다. 그러나, 마우스 AD2-양성 pTau의 양의 유의한 감소가 3 mg/kg의 ACI-36-2B6-Ab2로 처리된 마우스에서 관찰되었고, 10 mg/kg의 ACI-36-2B6-Ab2 또는 ACI-36-3A8-Ab2로 처리하였을 때 비-유의성 경향이 관찰되었다.

pTau pS396을 특이적으로 인식하는 상이한 항체를 염색에 사용한 경우에 (문헌 [Hoffmann et al., 1997]), 훨씬 더 큰 효과가 관찰되었다. 3 mg/kg의 ACI-36-2B6-Ab2로 처리된 마우스는 유의하게 보다 적은 pS396-양성 인간 트랜스제닉 및 마우스 내인성 pTau를 가졌으며, 10 mg/kg ACI-36-2B6-Ab2 또는 ACI-36-3A8-Ab2로 처리하였을 때 감소하는 경향이 있었다. 비인산화 및 모든 pTau를 둘 다 포함하는 전체 인간 및 마우스 Tau에 대한 효과를 평가하기 위해, 블롯을 Tau5 항체로 프로빙하였다. 비히클 대조군과 비교하여, 전체 Tau는 10 mg/kg에서 투여된 ACI-36-2B6-Ab2 또는 ACI-36-3A8-Ab2에 의해 조절되지 않았으나, 감소된 전체 Tau에 대한 경향이 3 mg/kg에서 투여된 ACI-36-2B6-Ab2에서 관찰되었다.

6.2.4 요약

항-pTAU 항체 ACI-36-3A8-Ab2로의 Tau Tg 마우스의 2회 말초 투여는 뇌 피질에서 가용성 TAU 및 가용성 pTAU를 유의하게 감소시켰다. 항-pTAU 항체 ACI-36-2B6-Ab2로의 Tau Tg 마우스의 2회 말초 투여는 뇌 피질에서 가용성 TAU 및 가용성 pTAU를 유의하게 감소시켰다. 추가로, ACI-36-2B6-Ab2는 해마에서 pTAU 면역반응성을 유의하게 감소시켰다. 이러한 결과는 ACI-36-2B6-Ab2 및 ACI-36-3A8-Ab2 항체를 사용하는 수동 항-pTAU 면역화의 타우병증 감소에 있어서의 능력을 입증한다.

Tau Tg 마우스에게 3 mg/kg에서 ACI-36-2B6-Ab2를 2회 말초 투여하여 웨스턴-블롯팅에 의해 측정된 바와 같이 피질에서 pTau PHF 에피토프의 존재를 감소시켰다. 10 mg/kg의 보다 높은 용량에서, ACI-36-2B6-Ab2 및 ACI-36-3A8-Ab2는 둘 다 감소된 pTau PHF 에피토프 면역반응성에 대한 경향을 나타내었다. 이러한 결과는 ACI-36-2B6-Ab2 및 ACI-36-3A8-Ab2 항체가 타우병증, 예컨대 알츠하이머병에 대한 수동 면역요법에 적합하게 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 7: 인간 Tau 과다발현 마우스의 1-개월 처리

7.1 방법

7.1.1 마우스 및 처리

Tau 트랜스제닉 마우스를 사용하여, 방법 6.1. (연구 번호 2)에서 표에 나타낸 바와 같은 처리 항체를 투여하였다.

7.1.2. 행동 시험 - 모리스 수중 미로 (MWM) 과제

마지막 투여에 따라, 수중 미로 (MWM) 과제를 수행하여 6.1.1에 따라 처리된 마우스 상에서 공간 기억 수행에 대해 시험하였다. MWM 시험은 시작후 제4주에 모든 분류된 동물로 수행하였다. MWM은 직경이 100 cm이고, 21±2℃의 온도에서 수돗물로 채워진 백색 원형 풀로 이루어진다. 풀은 실제로 4개의 구획으로 나뉘어진다. 투명한 플랫폼 (8 cm 직경)은 물 표면 약 0.5 cm 아래에 위치한다. 모든 시험 세션 동안, 플랫폼은 풀의 남서쪽 사분면에 위치한다. 각각의 마우스는 연속 4일 동안 매일 3회 시행을 수행하여야 한다. 단일 시행은 최대 1분 동안 지속된다. 이 시간 동안, 마우스는 숨겨진 속이 비치는 표적을 찾을 기회를 갖는다. 각각의 시행 후에, 마우스를 10-15초 동안 플랫폼 상에서 쉬도록 하여 주변에 적응시켰다. 제4일에 마지막 수행 적어도 1시간 후에, 마우스는 소위 프로프 시행 (PT)을 완수하여야 한다. PT 동안, 플랫폼을 풀로부터 제거하고, 이전의 표적 위치를 넘는 횡단의 수를 이 사분면에서의 체류와 함께 실험에 의해 기록하였다. 탈출 지연 (마우스가 숨겨진 플랫폼을 찾아 물에서 탈출하는데 필요한 시간 [초]), 경로 (표적에 도달하기 위한 궤도의 길이 [미터]), 표적 구역 횡단 및 PT에서 표적 사분면에서의 체류의 정량화를 위해, 컴퓨터 추적 시스템 (바이오브서브 소프트웨어(Biobserve Software))을 이용하였다. 모든 동물은 행동 결과에 대해 불충분한 보는 능력의 영향을 배제하기 위해 마지막 날에 PT 후에 시각 시험을 수행하여야 한다.

7.1.3. 면역조직화학 ( IHC ) 정량화에 위한 뇌 Tau 병리상태 결정

마우스를 MWM 1일 후 (마지막 투여 1주일 후)에 안락사시켜 뇌에서 Tau 병리상태를 결정하였다. 뇌 Tau 병리상태를 해마 및 편도체에서 면역조직화학 (IHC) 정량화에 의해 AT180 (항-pTau, pT231/pS235) 및 HT7 (인간-특이적 항-Tau) 항체를 사용하여 결정하였다. 또한, 피질 및 해마에서 가용성 pTau 및 가용성 Tau에 대한 처리 효과를 균질물 분획에서 pTau (pT231) 및 전체 Tau를 프로빙하는 메조스케일 디스커버리 (MSD) 듀플렉스 기술을 이용하여 측정하였다. IHC 또는 MSD 검정에 사용된 항체는 이 연구에 사용된 처리 항체와 중첩되는 에피토프를 갖지 않았다.

7.1.4. 피질 및 해마에서 가용성 Tau의 분석을 위한 샘플 제조

마우스를 마지막 처리 투여 1주일 후에 조직 수집을 위해 안락사시켰다. 피질 및 해마를 100 내지 200 μL의 차가운 추출 완충제 1 (25 mM 트리스 HCl pH=7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mM β-글리세로포스페이트, 30 mM NaF, 2 mM Na₃VO₄, 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일)에서 균질화시켰다. 균질물을 원심분리하고 (4℃에서 15 동안 74,200 g), 상청액을 피질 및 해마에서의 가용성 Tau의 분석에 사용하였다 (도 4a). 펠릿을 100-200 μL 추출 완충제 2 (10 mM 트리스 HCl pH=7.4, 800 mM NaCl, 300 mM 수크로스, 1mM EGTA, 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일)에 재현탁시키고, 1.5 mL 튜브로 옮겼다. 용액을 원심분리하고 (4℃에서 20분 동안 4,000 g), 상청액을 초원심분리 튜브로 옮겼다. 이어서, 사르코실 (30% 수용액)을 1%의 최종 농도로 첨가하고, 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 원심분리 (4℃에서 30분 동안 74,200 g) 후에 상청액을 따라내고, 펠릿을 100 μL 완충제 3 (50 mM 트리스-HCl, pH=7.4)에 재현탁시켰다. 재현탁된 펠릿을 피질 및 해마에서 사르코실-불용성 (SinT) Tau로 사용하였다. 가용성 및 SinT 분획 샘플에서 전체 단백질의 농도를 BCA 단백질 정량화 검정 (써모 피셔 사이언티픽, 미국 일리노이주 록포드)에 의해 결정하였다.

7.1.5. pTau PHF 및 Tau에 대한 웨스턴 블롯

뇌 피질 및 해마에서 pTau PHF의 존재에 대한 ACI-36-2B6-Ab1 투여의 효과를 평가하기 위해, pTau PHF 에피토프에 결합하는 것으로 보고된 2개의 항체 (문헌 [Greenberg et al., 1992; Reig et al., 1995; Hoffmann et al., 1997])를 웨스턴-블롯 (WB) 검정에 사용하였다. 피질 및 해마로부터의 가용성 및 SinT 분획을 동일한 부피의 샘플 완충제 A (125 mM 트리스-HCl pH 6.8, 4% [w/v] 나트륨 도데실 술페이트 [SDS], 20% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 블루, 5% β-메르캅토에탄올)를 첨가하여 희석하고, 샘플을 10분 동안 95℃로 가열하였다. 30 μg의 샘플을 4-12% 비스-트리스 겔 (인비트로젠, 스위스 바젤) 상에 부하하고, MOPS SDS 완충제 (인비트로젠)에서 전개시켰다. 단백질을 전달 완충제 (25 mM 트리스 pH 8.6, 190 mM 글리신, 20% 메탄올) 중 0.45 μm PVDF 막으로 전달하였다. 단백질 전달을 검증하기 위해, 막을 폰슈 S로 5분 동안 염색하였다. 이어서, 막을 세척하고, 차단 완충제 (TBS [50 mM 트리스-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl] 중 5% BSA)에서 1시간 동안 차단하였다. 막을 4℃에서 차단 완충제 및 0.1% 트윈 중 일차 항체로 밤새 블롯팅하였다.

WB에 사용된 2개의 pTau PHF-특이적 일차 항체는 하기와 같다: 인간 또는 뮤린 pTau의 인산화 Ser396 (pS396) (문헌 [Hoffmann et al., 1997])에 특이적인 항-pS396 (PHF-13 에피토프; 아브캄, 영국 캠브리지; 3 μg/mL에서 사용됨), 및 인간 및 뮤린 pS396 및 인산화 Ser404 (pS404; 문헌 [Reig et al., 1995])에 특이적인 AD2 (PHF-1 에피토프; 바이오라드, 스위스 레이나치; 0.4 μg/mL에서 사용됨). 표적 효과의 검출을 위해, ACI-36-2B6-Ab1을 1.6 μg/mL에서 블롯팅에 사용하였다. 전체 Tau WB를 위해, Tau5 (인간 및 뮤린 Tau 둘 다에 결합하는 항체) (BD 바이오사이언시스, 스위스 알슈빌)를 0.5 μg/mL에서 사용하였다. 모든 막을 추가로 β-액틴 (아브캄; 0.4 μg/mL에서 사용됨)에 대해 블롯팅하여 단백질 부하에 대해 정규화하였다.

일차 항체와의 인큐베이션 후에, 막을 TBS 중 0.1% 트윈으로 세척하고, 이차 항체: 염소 항-마우스-IRDye800 또는 염소 항-토끼-IRDye680 (둘 다 리-코르 바이오사이언시스로부터의 것임, 미국 네브라스카주) (둘 다 BB 및 0.1% 트윈에 1:15,000 희석함)와 인큐베이션하였다. 이어서, 막을 광으로부터 보호된 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, TBS 중 0.1% 트윈으로 15분 동안 3회, 및 TBS로 5분 동안 2회 세척하고, 밴드를 리-코르 오디세이 근적외선 영상화 시스템 (리-코르)을 이용하여 정량화하였다. 관심 밴드를 β-액틴 발현에 대해 정규화하였다. 인간 트랜스제닉 대 마우스 내인성 Tau 밴드의 확인을 검증하기 위해, 블롯을 인간 전체 Tau에 특이적이고 뮤린 Tau와 교차반응하지 않는 항체 (Tau13, 아브캄; 나타내지 않음)로 프로빙하였다. 추가로, 막을 항-마우스 일차 항체로 프로빙하여, 처리-항체가 변성된 시험 샘플에 일차 블롯팅 항체의 결합을 방해하기에 충분한 양으로 존재하지 않는다는 것을 검증하였다. 이 연구에 사용된 샘플에서 무손상 또는 변성된 처리 항체가 검출되지 않았다 (결과는 나타내지 않음). 값은 임의의 β-액틴-보정된 면역반응성 (IR)으로 나타낸다.

7.1.6. 통계적 분석

데이터를 일원 ANOVA에 이어, 각각의 처리를 Tg 대조군-처리된 마우스에 비교하는 던넷(Dunnett) 다중 비교 사후 시험 (그래프패드 프리즘, 그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주)을 이용하여 분석하였다. 결과는 평균 ± SEM을 보여주는 개별 데이터 점으로 나타낸다. p<0.05를 갖는 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주된다. 그루브 극단 스튜던트화 이탈 시험(Grubb's extreme studentized deviate test)에 의해 유의한 (p<0.05) 이상치로 확인된 단일 값을 제외하였다.

7.2 결과

7.2.1. 행동 시험 - 수동 면역화에 따른 모리스 수중 미로 (MWM) 과제

4주 기간에 걸쳐 3 mg/kg 또는 1 mg/kg에서 매주 투여된 ACI-36-2B6-Ab1의 4회 i.p. 주사는 어떠한 전체적인 역효과도 나타내지 않았다.

처리 마지막 주 동안, 동물의 공간 탐지 학습 및 기억을 평가하였다. 동물은 4일의 훈련을 완수하였고, 훈련 중에 일당 3회 시행에 이어 1회 프로브 시행 및 시각적 시험을 수행하였다. 탈출 지연 (마우스가 숨겨진 플랫폼을 찾아 물에서 탈출하는데 필요한 시간 [초])), 경로 (표적에 도달하기 위한 궤도의 길이 [미터]), 수영 속도 (경로 및 탈출 지연의 계산된 몫), 표적 횡단의 횟수 및 표적 사분면에서의 체류를 평가하였다.

비히클로 처리된 Tg (군 A) 뿐만 아니라 nTg (F) 대조군 동물은 4일의 시험 기간에 걸쳐 플랫폼에 도달하기 위한 탈출 지연 및 수영 경로의 길이를 평가하였을 때 예상되는 학습 곡선을 나타내었다. Tg 대조군 (A) 동물은 nTg 대조군 동물 (F)과 비교하여 보다 평평한 탈출 지연 및 수영 경로의 학습 곡선에 의해 나타난 바와 같이 유의한 학습 손상을 나타내었다. 탈출 지연 및 수영 경로는 훈련 제3일 및 제4일에 유의하게 (이원 ANOVA) 더 길었다 (p<0.001; 본페로니(Bonferroni)의 사후 시험). 낮은 또는 높은 용량의 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-3A8-Ab1로의 처리 (각각 군 B 및 C 및 D 및 E)는 Tg 대조군 동물 (군 A)과 비교하여 공간 학습 능력을 유의하게 개선하지 않았고, 유사한 학습 곡선을 나타내었다. 각각의 군의 제1일 수행을 100%로 조정하고, 모든 추가의 일에서의 수행을 제1일의 백분율로서 조정하였을 때, ACI-36-3A8-Ab1 처리된 마우스 (두 투여량)에서 개선이 관찰되었다. 효과는 제3일 (p<0.01 군 D 및 p<0.05 군 E) 및 제4일 (p<0.05 군 D)에서 수영 경로 길이의 경우에 통계적 유의성에 도달하였다.

ACI-36-2B6-Ab1 처리된 마우스 (두 투여량)의 경우에 통계적 유의성이 없더라도 수영 경로 길이에서 약간의 개선이 관찰되었다.

4일의 모든 훈련일에 수영 속도와 관련하여 처리군 사이에 차이가 검출되지 않았다.

MWM 시험으로부터의 결과는 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-3A8-Ab1로 처리된 마우스에서 개선된 공간 학습에 대한 경향을 입증하였다.

7.2.2. 면역조직화학 (IHC) 정량화에 의한 뇌 TAU 병리상태

AT180 항체는 내인성 및 인간 pTAU (Thr231 및 Ser235에서 이중으로 인산화됨)를 염색한다.

ACI-36-2B6-AB1 및 ACI-36-3A8-AB1 면역화 후에 편도체 및 해마에서 AT180 IR을 결정하였다. 편도체 및 해마에서 AT180 IR 면적 백분율을 측정하였다.

nTg 대조군에서 세포체내 pTAU의 양은 Tg 군과 비교하여 유의하게 더 낮았다 (p<0.001). 편도체에서, 세포체 pTAU를 증가시키는 경향이 3 mg/kg ACI-36-2B6-Ab1 처리에서 관찰되었다. 대조적으로, ACI-36-2B6-Ab1의 두 투여량은 해마에서 비히클 처리된 동물과 비교하여 pTAU를 낮추는 경향이 있다. 평균 염색 강도는 모든 트랜스제닉 군에서 대등하였다.

ACI-36-3A8-Ab1 처리는 해마 및 편도체에서 세포체 pTAU를 변경시키지 않았고, 편도체 및 해마에서 뉴런 pTAU 수준은 처리된 트랜스제닉 군 사이에서 유의하게 상이하지 않았다. 염색 강도의 평균 및 합계는 모든 트랜스제닉 군에서 대등하였다.

HT7 항체가 인간 TAU에 특이적이므로, 크기가 7 픽셀을 초과하는 리포푸신 도트의 자가형광으로부터 유래된 작은 신호만이 nTg 대조군에서 측정되었다. ACI-36-2B6-Ab1 처리는 비히클 대조군 (PBS)과 비교하여 해마 ()에서 세포체 HT7 양성 IR 면적으로 변경시키지 않았다. 편도체에서, 보다 낮은 용량의 ACI-36-2B6-Ab1을 투여받은 마우스는 IR 면적 ()과 관련하여 보다 높은 수준의 전체 인간 TAU를 갖는 경향이 있다 (T-시험: p = 0.0954). 이러한 증가는 또한 개별 뉴런 세포체에서 염색 면적 및 염색 강도의 증가로서 정성적으로 시각화될 수 있다. 통계적으로 유의한 처리 유발된 차이가 해마 뉴런에서 관찰되지 않았다.

ACI-36-3A8-Ab1 처리는 비히클 대조군 (PBS)과 비교하여 편도체 () 및 해마 ()에서 세포체 HT7 양성 IR 면적을 유의하게 변경시키지 않았다. 염색 강도의 평균 및 합계는 모든 트랜스제닉 군에서 대등하였다 (데이터는 나타내지 않음).

뇌 Tau 병리상태는 뇌 가용성 분획에서 전체 Tau 또는 pTau 수준의 변화를 나타내지 않았으나, 뇌 절편의 면역염색은 ACI-36-2B6-Ab1로 처리된 마우스에서 해마 pTau의 감소를 입증하였다.

7.2.3. 쌍을 이룬 나선형 필라멘트 (PHF)에 존재하는 포스포-Tau 에피토프에 대한 항-Tau 항체 투여의 효과

알츠하이머병 (AD)은 신경병리학적으로 신경원섬유 엉킴 (NFT; 문헌 [Braak, Braak, & Bohl, 1993])을 특징으로 한다. 구조적으로, NFT는 과인산화 상태에서 주로 발견되는 미세관-연관 단백질 Tau로 구성된 쌍을 이룬 나선형 필라멘트 (PHF)로 이루어진다 (문헌 [Alonso et al., 1997]). 본 연구의 목적은 항-pTau 항체 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-3A8-Ab1의 4회 투여에 의해 Tau 트랜스제닉 마우스의 뇌에서 이들 pTau PHF 에피토프를 감소시키는 것이다.

널리 기록된 Tau PHF 포스포 에피토프의 양에 대한 4회 ACI-36-2B6-Ab1 투여의 효과를 측정하기 위해, 처리된 Tau Tg 마우스로부터의 뇌 피질 및 해마 가용성 및 SinT 분획을 WB를 이용하여 AD2 (PHF-1 에피토프, pS396/pS404) 및 항-pS396 항체 (PHF-13 에피토프, pS396)로 프로빙하였다. Tau PHF의 마커로서, pS396/pS404의 존재는 이전에 기록되었으며 (문헌 [Greenberg et al., 1992; Reig et al., 1995]), 보다 구체적으로 pS396 부위가 기록되었다 (문헌 [Hoffmann et al., 1997]). Tau Tg 마우스에서, Tau는 내인성 뮤린 Tau 및 인간 Tau 트랜스진으로서 발현되며, 이들은 블롯팅 항체가 두 종으로부터의 Tau에 결합하고, 2종의 상이한 전사체로부터의 Tau가 충분한 양으로 발현되는 경우에 WB 상에서 명확하게 확인될 수 있는 분자량 차이를 갖는다. 따라서 가능한 경우에, 내인성 마우스 및 인간 트랜스제닉 Tau 밴드를 각각의 블롯팅 항체에 대해 확인하였고, 개별적으로 정량화하였다. 본 발명자들의 WB 검정에서 이들 Tau 밴드에 대한 이동 패턴을 검증하기 위해, 전체 Tau에 결합하지만, 인간 특이적이며 (Tau13), 이에 따라 오직 Tau Tg 뇌에서 인간 트랜스진을 보여주는 항-Tau 항체를 Tau Tg 대조군 샘플로 사용하여 Tau 트랜스제닉 마우스에서 인간 및 마우스 Tau의 이동 패턴을 검증하였다. 추가로, 모든 정량화된 밴드를 β-액틴에 대해 정규화하였다.

뇌 피질로부터의 가용성 분획에서 프로빙된 PHF 에피토프의 존재는 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-3A8-Ab1 처리된 마우스에서 감소되었다. 이는 WB에 대해 pS396 (PHF-13) 항체를 사용한 마우스 및 인간 밴드 둘 다에서 유의하였다 (도 5A 및 B).

AD2 (PHF-1, pS396/pS404) 항체가 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-3A8-Ab1 처리된 마우스로부터의 추출물의 WB에 사용된 경우에, 유의한 감소가 관찰되었다 (도 5C).

이들 WB에 사용된 2개의 PHF-특이적 항체가 이들의 인산화 표적(들)에 대해 유사한 에피토프 및 양호한 특이성을 갖는다고 하더라도, pS396 (PHF-13) 항체가 보다 우수한 신호-대-노이즈 비를 갖는 것으로 나타나고, 이들 WB에 대해 보다 우수한 전체적 항체였음에 주목하여야 한다.

처리-항체의 직접적인 표적 효과를 블롯팅 항체로서 각각 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-2B6-Ab1을 이용하여 피질에서 프로빙하였다. 이 항-pTau 항체는 이 연구에 사용된 처리 항체와 동일한 포스포-Tau 에피토프에 결합한다. 블롯은 이전에 이차 항-마우스 IgG 항체만으로 프로빙하였다.

밴드를 적외선 영상화 시스템을 이용하여 정량화하였다. 개별 마우스에 대한 값 뿐만 아니라 평균 ± SEM을 결정하였다.

백그라운드 초과의 신호는 검출되지 않았으며, 이는 이들 샘플에서 처리 항체에 의한 차단 효과 또는 감섭의 부족을 증명한다 (데이터는 나타내지 않음).

ACI-36-2B6-Ab1 처리된 마우스에서, 대조군-처리된 nTg 마우스의 수준 아래로 감소된 신호에 대한 경향이 관찰되었고, 이는 직접적인 표적 효과를 나타낸다 (도 5G). ACI-36-3A8-Ab1 처리된 마우스에서 처리의 유의한 효과가 관찰되지 않았다 (도 5G).

Tau Tg 마우스의 가용성 피질에서의 전체 Tau에 대한 ACI-36-2B6-Ab1 처리의 유의한 효과가 내인성 마우스 Tau 및 트랜스제닉 인간 Tau 둘 다에 결합하는 블롯팅을 위한 Tau5 항체를 이용하여 관찰되었다 (도 5H 및 5I). 전체 Tau의 유의한 감소가 뇌 피질의 가용성 분획에서 내인성 마우스 Tau 및 트랜스제닉 인간 Tau 둘 다의 경우에 관찰되었다.

마우스 A) 및 인간 B) 전체 Tau (Tau5)를 나타내는 밴드를 적외선 영상화 시스템을 이용하여 정량화하였다. 개별 마우스에 대한 값 뿐만 아니라 평균 ± SEM을 결정하였다.

세제 불용성 Tau 분획에서 PHF 에피토프의 존재는 사르코실-불용성 (SinT) 뇌 분획을 제조함으로써 이루어졌다.

피질 및 해마 둘 다에서 가용성 Tau 분획과 비교하였을 때 훨씬 적은 Tau가 이 분획에 존재하였다. 이는 이 연구에 이용된 Tau Tg 마우스의 연령 때문일 수 있으며, 이는 4개월에 해마 및 피질에 유의한 양의 불용성 및 응집된 Tau를 축적하지 않을 수 있다. 따라서, SinT 분획에서 PHF 에피토프를 프로빙하였을 때, 오직 AD2 (PHF-1, pS396/pS404) 항체가 밴드의 신뢰할만한 양자화에 충분한 신호를 제공하였다.

각각 1 mg/kg의 ACI-36-2B6-Ab1 및 1 mg/kg의 ACI-36-3A8-Ab1로 처리된 마우스는 내인성 마우스 Tau를 나타내는 밴드에서 PHF-1 에피토프가 유의하게 감소하였다 (도 5C). 트랜스제닉 인간 밴드에서 관찰된 신호는 신뢰할만하게 정량화될 정도로 충분히 강하지 않았다.

피질과 동일한 항체 및 분획을 이용하여 해마를 또한 프로빙하였다. 피질과 비교하여 해마로부터의 분획에서 모든 블롯팅 항체에 대해 보다 낮은 신호가 검출되었다.

Tau Tg 마우스의 가용성 해마에서 pS396 (PHF-13) 면역반응성에 대한 ACI-36-2B6-AB1 및 ACI-36-3A8-AB1 처리의 효과를 결정하였다. 마우스 A) 및 인간 B) pTau pS396 (PHF-13) 에피토프를 나타내는 밴드를 적외선 영상화 시스템을 이용하여 정량화하였다. 개별 마우스에 대한 값 뿐만 아니라 평균 ± SEM을 결정하였다.

ACI-36-2B6-Ab1 처리는 마우스 Tau 가용성 해마 분획에서 pS396 (PHF-13) 에피토프의 존재를 유의하게 변경시키지 않았으며, 인간 트랜스진 밴드에서 약간 감소하는 경향이 있었다.

ACI-36-3A8-Ab1 처리는 마우스 Tau 가용성 해마 분획 및 인간 트랜스진 밴드에서 pS396 (PHF-13) 에피토프의 존재가 감소하는 경향을 나타내었다.

pS396 (PHF-13) WB에서 관찰된 것과 유사하게, 감소된 신호에 대한 경향이 인간 Tau 가용성 해마 분획에서 전체 Tau에 대해 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-3A8-Ab1 처리된 마우스 둘 다에서 검출되었다.

피질 SinT 샘플과 유사하게, 해마로부터의 SinT 분획은 매우 낮은 수준의 pTau를 가졌다. 각각 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-3A8-Ab1로 처리된 마우스는 내인성 마우스 Tau를 나타내는 밴드에서 PHF-1 (pS396/pS404) 에피토프가 변화하지 않았다. 트랜스제닉 인간에서 관찰된 신호는 신뢰할만한 양자화에 충분한 정도로 강하지 않았다.

7.2.4 요약

연구는 포스포사이트 특이적 항-pTau 항체 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-3A8-Ab1 항체의 4회 투여를 사용한 수동 면역화가 공간 학습을 개선하고, 뇌 pTau 병리상태를 감소시킨다는 것을 나타낸다.

Tau Tg 마우스에게 1 및 3 mg/kg에서 항-pTau 항체 ACI-36-2B6-Ab1을 4회 말초 투여하여 웨스턴-블롯팅에 의해 측정된 바와 같이 피질에서 pTau PHF 에피토프의 존재를 감소시켰다. 감소에 대한 경향은 해마에서 관찰되었다. 유사하게, 전체 Tau의 감소가 또한 관찰되었다. pTau PHF-1 면역반응성의 유의한 감소가 불용성 피질 분획에서 관찰되었으며, 항체 처리의 직접적인 효적 효과를 나타내는 경향이 또한 관찰되었다. 이러한 결과는 타우병증, 예컨대 알츠하이머병에 대한 수동 면역요법에서 항-pTau 항체 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-3A8-Ab1에 대한 추가의 뒷받침을 제공한다.

실시예 8: 인간 Tau 과다발현 마우스의 3-개월 처리

8.1 방법

8.1.1 마우스 및 처리

Tau 트랜스제닉 마우스를 이용하여, 방법 6.1. (연구 번호 3)에서의 표에 나타낸 바와 같이 처리 항체를 투여하고, 마우스를 하기 표에 기재된 바와 같이 4개의 상이한 처리군에 배정하였다.

총 45마리 Tg 마우스 플러스 3마리 예비 마우스 (처리군 A 내지 C에 할당됨) 및 15마리 nTg 마우스 플러스 1마리 예비 마우스 (군 F)를 PBS (비히클 대조군) 또는 항-pTAU 항체, ACI-36-2B6-Ab1 또는 ACI-36-3A8-Ab1의 i.p. 주사에 의해 제0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77 및 84일에 처리하였다. 모든 처리군의 동물을 포함하여 동물을 5개의 상이한 출발군 (스케일)으로 무작위적으로 분류하였다. 스케일에서 동물의 수는 동일한 연령 및 균일한 관리가 보장되도록 제한하였다. 12회 투여에 따라, 수중 미로 (MWM) 과제를 수행하여 공간 기억 수행을 시험하였다. MWM에 따라, 마우스를 시험 물질을 1회 더 투여 (13회 주사)한 후에 안락사시키고, 24시간 후에 Tau 병리상태를 결정하였다. 뇌 Tau 병리상태를 해마 및 편도체에서 면역조직화학 (IHC) 정량화에 의해 AT180 (항-pTau, pT231/pS235) 항체를 이용하여 결정하였다. 또한, 피질 및 해마에서 가용성 및 사르코실-불용성 Tau 및 pTau에 대한 치료 효과를 pTau (pT231 및 pS396) 및 전체 Tau를 프로빙하는 메조스케일 디스커버리 (MSD) 기술을 이용하여 측정하였다.

8.1.2. 행동 시험 - 모리스 수중 미로 (MWM) 과제

이 실험은 실시예 7.1.2에 기재된 프로토콜에 따라 수행하였다. 12주에, 공간 탐지를 모리스 수중 미로 (MWM)에서 시험하여 학습 및 기억을 평가하였다.

8.1.3. 분자 생물학

전체 TAU 및 Thr231 및 pS396에서 인산화된 Tau를 Tg 동물의 뇌 균질물에서 메조스케일 디스커버리 (MSD)로부터의 면역흡착 검정을 이용하여 정량화하였다.

8.1.4. 면역조직화학 (IHC) 정량화에 의한 뇌 Tau 병리상태 결정

이 실험은 실시예 7.1.3에 기재된 프로토콜에 따라 수행하였다. TAU 병리상태를 군당 8마리 동물의 해마 및 편도체에서 AT180 면역반응성에 의해 결정하였다.

8.1.5. 쌍을 이룬 나선형 필라멘트 (PHF)에 존재하는 포스포-Tau 에피토프에 대한 3개월 항-Tau 항체 투여의 효과

이 실험은 7.1.4., 7.1.5. 및 7.1.6에 기재된 프로토콜에 따라 수행하였다. 처리된 Tau Tg 마우스로부터 널리 기록된 Tau PHF 포스포 에피토프의 양에 대한 4회의 ACI-36-2B6-Ab1 및 ACI-36-3A8-Ab1 투여의 효과를 측정하기 위해 뇌 피질 및 해마 가용성 및 SinT 분획을 WB를 이용하여 AD2 (PHF-1 에피토프, pS396/pS404), 항-pS396 항체 (PHF-13 에피토프, pS396) 및 AT180 (pT231/pS235)으로 프로빙하였다.

8.1.6. biGT Tau 바이제닉 마우스를 이용하는 포스포-Tau 에피토프에 대한 3개월 항-Tau 항체 투여의 효과

연구 번호 4를 방법 6.1에 나타낸 바와 같이 바이제닉 Tau 마우스를 이용하여 수행하였다. 뇌 피질 샘플을 웨스턴 블롯팅을 위한 전체 균질물 (TH) 또는 가용성 분획 (S1)을 이용하여 도 4b에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 막을 pTau 또는 전체 Tau에 대한 하기 블롯팅 항체를 이용하여 프로빙하였다:

ㆍ HT-7 (26ng/ml), 전체 인간 Tau에 대해 특이적임

ㆍ PHF-13 (pS396), 1/7500 희석

ㆍ AT180 (pT231), 2.47ug/ml

ㆍ AT8 (pS202), 3ug/ml

ㆍ pS404, 1:5000 희석

ㆍ pS400, 1:5000 희석

모든 정량화는 β-액틴에 대해 정규화하였다.

8.2 ACI-36-2B6-Ab1 항체에 대한 결과

12주의 연구 기간에 걸쳐 1 또는 3 mg/kg에서 매주 투여된 ACI-36-2B6-Ab1의 13회의 i.p. 주사는 어떠한 전반적인 역효과도 나타내지 않았다.

8.2.1 행동 결과 - 모리스 수중 미로

MWM 시험으로부터의 결과는 ACI-36-2B6-Ab1로 처리된 마우스에서 개선된 공간 학습에 대한 강한 경향을 입증하였다 (도 9).

처리 마지막 주 동안, 동물의 공간 탐지 학습 및 기억을 평가하였다. 동물은 4일의 훈련을 완수하였고, 훈련 중에 일당 3회 시행에 이어 1회 프로브 시행 및 시각적 시험을 수행하였다. 탈출 지연 (마우스가 숨겨진 플랫폼을 찾아 물에서 탈출하는데 필요한 시간 [초]), 경로 (표적에 도달하기 위한 궤도의 길이 [미터]), 수영 속도 (경로 및 탈출 지연의 계산된 몫), 표적 횡단의 횟수 및 표적 사분면에서의 체류를 평가하였다. 비히클 처리된 Tg (군 A) 및 nTg (군 F) 대조군 동물은 4일의 시험 기간에 걸쳐 플랫폼에 도달하기 위한 탈출 지연 및 수영 경로의 길이와 관련하여 예상되는 학습 곡선을 나타내었다. Tg 대조군 (A) 동물은 nTg 대조군 동물 (군 F)과 비교하여 보다 평평한 탈출 지연 및 수영 경로의 학습 곡선에 반영된 학습 능력의 유의한 손상을 나타내었다. 탈출 지연 및 수영 경로는 훈련 제3일 (p<0.01, 지연; p<0.001, 길이; 본페로니의 사후 시험) 및 제4일 (p<0.01; 본페로니의 사후 시험)에 유의하게 (이원 ANOVA) 상이하였다. 낮은 또는 높은 용량의 ACI-36-2B6-Ab1로의 처리 (B 및 C)는 Tg 대조군 동물 (A)과 비교하여 공간 학습 능력을 유의하게 개선하지 않았다. 각각의 군의 훈련 제1일의 수행을 100%로 조정하고, 모든 추가의 일에서의 수행을 제1일의 백분율로서 조정하였을 때, 통계적 유의성은 없었으나 ACI-36-2B6-Ab1 처리된 마우스 (낮은 및 높은 투여량)에서 수영 경로 길이의 약간의 개선이 관찰될 수 있었다. 4일의 모든 훈련일에서 수영 속도를 계산하였을 때 처리군 사이에 어떠한 차이도 검출되지 않았다. 프로브 시행 (PT)에서, 표적 사분면 (남서쪽 사분면)에서의 체류 뿐만 아니라 표적 구역 횡단을 기록하였다. nTg 대조군 (군 F)은 통계적 유의성은 없었으나 Tg 대조군 (군 A)에 비해 표적 사분면에서 보다 많은 시간을 소비하고, 보다 자주 표적 구역을 횡단하였다.

PT에서 평가된 바와 같이 Tg 대조군 마우스와 비교하여 낮은 또는 높은 용량으로의 처리는 어느 것도 공간 학습 능력의 개선으로 이어지지 않았다.

8.2.2 분자 생물학

8.2.2.1 피질 균질물의 가용성 분획에서의 TAU

전체 TAU, p231TAU, p396TAU, 및 전체 TAU에 대한 pTAU의 비를 군 A (Tg 비히클 군; PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 1 mg/kg), 및 C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 3 mg/kg)로부터의 n=16 동물의 피질 균질물의 가용성 분획에서 평가하였다. ACI-36-2B6-Ab1로의 처리는 가용성 피질 균질물에서 전체 TAU 및 pTAU에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 그러나, 평균 전체 TAU, p231TAU, 및 p396TAU의 약간의 증가 (유의성 없음)가 ACI-36-2B6-Ab1 처리 시에 관찰되었다. 전체 TAU에 대한 pTAU의 비로서 평가된 TAU 인산화는 영향을 받지 않았다.

8.2.2.2 피질 균질물의 사르코실 불용성 분획에서의 TAU

전체 TAU, p231TAU, p396TAU, 및 전체 TAU에 대한 pTAU의 비를 군 A (Tg 비히클 군; PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 1 mg/kg), 및 C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 3 mg/kg)로부터의 n=16 동물의 피질 균질물의 사르코실 불용성 분획에서 평가하였다. ACI-36-2B6-Ab1로의 처리는 사르코실 불용성 피질 균질물에서 전체 TAU 및 pTAU에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 평균 전체 TAU 및 p231TAU의 약간의 감소 (유의성 없음)가 ACI-36-2B6-Ab1 처리 시에 관찰되었다. 전체 TAU에 대한 pTAU의 비로서 평가된 TAU 인산화는 영향을 받지 않았다.

8.2.2.3 해마 균질물의 가용성 분획에서의 TAU

전체 TAU, p231TAU, p396TAU, 및 전체 TAU에 대한 pTAU의 비를 군 A (Tg 비히클 군; PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-Ab1, 1 mg/kg), 및 C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1, 3 mg/kg)로부터의 n=16 동물의 해마 균질물의 가용성 분획에서 평가하였다. ACI-36-2B6-Ab1로의 처리는 가용성 해마 균질물에서 전체 TAU 및 pTAU에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 전체 TAU에 대한 pTAU의 비로서 평가된 TAU 인산화의 약간의 감소 (유의성 없음)가 ACI-36-2B6-Ab1 처리 시에 관찰되었다.

8.2.2.4 해마 균질물의 사르코실 불용성 분획에서의 TAU

전체 TAU, p231TAU, p396TAU, 및 전체 TAU에 대한 pTAU의 비를 군 A (Tg 비히클 군; PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-Ab1, 1 mg/kg), 및 C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1, 3 mg/kg)로부터의 n=16 동물의 해마 균질물의 사르코실 불용성 분획에서 평가하였다. ACI-36-2B6-Ab1로의 처리는 사르코실 불용성 해마 균질물에서 전체 TAU 및 pTAU에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 3 mg/kg으로의 처리는 유의성에 도달하지는 않았으나 평균 전체 TAU, p231TAU 뿐만 아니라 p396TAU를 증가시킨 반면, 1 mg/kg 처리 시에 평균 전체 TAU, p231TAU 뿐만 아니라 p396TAU의 약간의 감소가 관찰되었다. 전체 TAU에 대한 pTAU의 비로서 평가된 TAU 인산화는 3 mg/kg ACI-36-2B6-Ab1 처리 시에 약간 증가하였다.

8.2.2.5. 가용성 피질에 대한 웨스턴 블롯

ACI-36-2B6-Ab1로의 처리는 뇌 피질의 가용성 분획에서 pS396/pS404 (도 5D) 및 pT181 (도 5E 및 5F) pTau 에피토프를 둘 다 용량-의존성으로 감소시켰다 (3 mg/kg 용량에서 유의한 효과가 있음).

8.2.2.6 biGT Tau 바이제닉 마우스에서의 TAU

3개월 동안 ACI-36-2B6-Ab1로 처리된 biGT 마우스는 뇌 피질 가용성 분획에서 전체 Tau를 유의하게 감소시켰다 (도 6A 및 6B). pTau 에피토프 pT231/AT180 (도 6C 및 6D), pS202/AT8 (도 6E), 및 pS396 (도 6F 및 6G)에서 유의한 감소가 관찰되었다. pTau 에피토프 pS400 (도 6H 및 6I) 및 pS404 (도 6L 및 6M)에 대한 두 전체 균질물 (TH)에서 또한 유의한 감소가 관찰되었다. 또한, pTau 에피토프 pS400에 대한 가용성 분획에서 유의한 감소가 또한 관찰되었고 (도 6J 및 6K), pTau 에피토프 pS404에 대해 감소하는 경향이 관찰되었다 (도 6N 및 6O).

8.2.3 조직학

8.2.3.1 형태계측 - 영역 면적의 결정

해마 및 편도체의 측정된 영역 면적은 절개 및 IHC 또는 염색 동안 부정적 영향 (예를 들어, 명백한 수축, 상이한 절편화) 및 특정 정도까지의 치료 유발된 위축을 제외시킨 모든 조사된 뇌 전체에 걸쳐 유의하게 상이하지 않았다. 개별 절편은 예를 들어 표지화 프로토콜의 수행 동안 조직의 폴딩 또는 절편의 일부의 손실 때문에 개별 및 군 평균을 벗어날 수 있다. 따라서, 임의의 표지의 전체 면역반응성 면적 [μm2]을 영역 면적내의 표지된 면적의 백분율 [표지된 면적/(영역 면적 * 10.000)]을 계산함으로써 절편의 개별 영역 면적 [mm2]에 대해 정규화하였다.

8.2.3.2 AT180 IH의 결과

AT180 항체는 내인성 및 인간 pTAU (Thr231 및 Ser235에서 이중으로 인산화됨)를 검출한다. nTg 대조군에서 세포체내 pTAU의 양은 Tg 군과 비교하여 유의하게 더 낮았다 (p<0.01 뿐만 아니라 p<0.001). 편도체에서, 보다 높은 용량의 ACI-36-2B6-Ab1 (3 mg/kg - 군 C)이 비히클 처리된 동물과 비교하여 세포체 pTAU를 유의하게 감소시켰다 (도 7, 좌측). 보다 낮은 용량 (1 mg/kg - 군 C)은 동일한 경향을 나타내었으나 유의성에 도달하지 않았다. 동일한 효과가 해마 (ACI-36-2B6-Ab1이 용량-의존성으로 pTAU를 감소시킴)에서 검출가능하였으며, 보다 높은 용량에서 유의하였고 보다 낮은 용량에서 경향을 나타내었다 (도 7, 우측). 이러한 감소는 또한 개별 뉴런 세포체에서 염색 면적 및 염색 강도의 감소로서 정량적으로 가시화할 수 있었다. 뉴런 세포체에서 측정된 AT180 IR의 AOI 크기에 대해 정규화된 면역 강도 총합의 결과는 편도체에서 보다 높은 용량의 보다 큰 효과의 유의한 용량-의존성을 포함하여 측정된 AT180 IR 면적 백분율과 대등하였다. 해마에서 사후 비교는 유의한 수준에 도달하지 않았다.

8.2.4 요약

MSD에 의해 측정된 바와 같이 뇌 Tau 병리상태는 유의한 변화를 나타내지 않았으나, 뇌 절편의 면역염색은 뉴런 세포체에서의 AT180 (pT231/pS235) 면역염색이 60%까지 감소하며 용량-의존성임을 입증하였다.

연구는 포스포사이트 특이적 항-pTau 항체 ACI-36-2B6-Ab1의 13회의 투여를 이용하는 수동 면역화가 공간 학습을 개선하고, 뇌 pTau 병리상태를 유의하게 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다.

8.3 ACI-36-3A8-Ab1 항체의 결과

12주의 연구 기간에 걸쳐 1 또는 3 mg/kg에서 매주 투여된 ACI-36-3A8-Ab1의 13회의 i.p. 주사는 어떠한 전체적인 역효과도 나타내지 않았다.

8.3.1 행동 결과 - 모리스 수중 미로

MWM 시험으로부터의 결과는 3 mg/kg에서 ACI-36-3A8-Ab1로 처리된 마우스에 대해 개선된 공간 학습의 유의한 효과를 입증하였다 (도 10).

비히클 처리된 Tg (군 A) 및 nTg (군 F) 대조군 동물은 4일의 시험 기간에 걸쳐 플랫폼에 도달하기까지의 탈출 지연 및 수영 경로의 길이와 관련하여 예상되는 학습 곡선을 나타내었다. Tg 대조군 (A) 동물은 nTg 대조군 동물 (군 F)과 비교하여 보다 평평한 탈출 지연 및 수영 경로의 학습 곡선에 반영된 학습 능력의 유의한 손상을 나타내었다. 탈출 지연 및 수영 경로는 훈련 제3일 (p<0.01, 지연; p<0.001, 길이; 본페로니의 사후 시험) 및 제4일 (p<0.01; 본페로니의 사후 시험)에서 유의하게 (이원 ANOVA) 상이하였다. 낮은 또는 높은 용량의 ACI-36-3A8-Ab1로의 처리 (D 및 E)는 절대 값을 분석하였을 때 Tg 대조군 동물 (A)과 비교하여 공간 학습 능력을 유의하게 개선하지 않았다. 각각의 군의 훈련 제1일의 수행을 100%로 조정하고, 모든 추가의 일에서의 수행을 제1일의 백분율로서 조정하였을 때, 학습 및 기억 용량이 ACI-36-3A8-Ab1 처리 (낮은 및 높은 투여량) 시에 개선될 수 있다. 낮은 용량의 ACI-36-3A8-Ab1로 처리된 동물 (군 D)은 Tg 대조군 (군 A)과 비교하여 MWM에서 단지 약간 더 우수하게 수행하였다. 3 mg/kg ACI-36-3A8-Ab1로의 매주 처리 (군 E)의 효과는 훨씬 더 두드러졌으며, nTg 동물의 수행을 거의 회복하였다. Tg 대조군 (A)과 비교하여 제3일 및 제4일에서 수영 경로 길이에 대한 3 mg/kg ACI-36-3A8-Ab1의 효과는 통계적으로 유의하였다 (p<0.05). 4일의 모든 훈련 기간에서 수영 속도를 계산하였을 때 처리군 사이에 어떠한 차이도 검출되지 않았다.

프로브 시행 (PT)에서, 표적 사분면 (남서쪽 사분면)에서의 체류 뿐만 아니라 표적 구역 횡단을 기록하였다. nTg 대조군 (군 F)은 통계적 유의성은 없었으나 Tg 대조군 (군 A)에 비해 표적 사분면에서 보다 많은 시간을 소비하고, 보다 자주 표적 구역을 횡단하였다. PT에서 평가된 바와 같이 Tg 대조군 마우스와 비교하여 낮은 또는 높은 용량으로의 처리는 어느 것도 통계적으로 유의한 개선으로 이어지지 않았다. 그러나, ACI-36-3A8-Ab1 처리된 동물은 - 통계적으로 유의하지 않더라도 - Tg 대조군과 비교하여 표적 구역을 보다 많이 횡단하였다 (4일의 훈련 기간에 걸친 수영 길이의 결과에 따름).

8.3.2 분자 생물학

8.3.2.1 피질 균질물의 가용성 분획에서의 TAU

전체 TAU, p231TAU, p396TAU, 및 전체 TAU에 대한 pTAU의 비를 군 A (Tg 비히클 군; PBS) 및 D (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 1 mg/kg)로부터의 n=16 동물 및 군 E (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 3 mg/kg)로부터의 n=15 동물의 피질 균질물의 가용성 분획에서 평가하였다. ACI-36-3A8-Ab1로의 처리는 가용성 피질 균질물에서 전체 TAU 및 pTAU에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 그러나, 평균 전체 TAU, p231TAU, 및 p396TAU의 약간의 증가 (유의성 없음)가 ACI-36-3A8-Ab1 처리 시에 관찰되었다. 전체 TAU에 대한 p231TAU의 비로서 평가된 231에서의 TAU 인산화는 3 mg/kg ACI-36-3A8-AB1로의 처리 후에 약간 감소되었다.

8.3.2.2 피질 균질물의 사르코실 불용성 분획에서의 TAU

전체 TAU, p231TAU, p396TAU, 및 전체 TAU에 대한 pTAU의 비를 군 A (Tg 비히클 군; PBS) 및 D (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 1 mg/kg)로부터의 n=16 동물 및 군 E (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 3 mg/kg)로부터의 n=15 동물의 피질 균질물의 사르코실 불용성 분획에서 평가하였다. ACI-36-3A8-AB1로의 처리는 사르코실 불용성 피질 균질물에서 전체 TAU 및 pTAU에 유의한 영향을 미치지 않았다. 평균 전체 TAU, p231TAU, 및 p396TAU의 약간의 감소 (유의성 없음)가 1 mg/ ACI-36-3A8-Ab1 처리 시에 관찰되었다. 또한, 1 mg/kg ACI-36-3A8-Ab1 처리된 동물의 p231TAU 대 전체 TAU 비는 비히클 처리된 동물과 비교하여 약간 더 낮은 가변성을 나타내었으며 (그러나, F-시험에서 유의성이 부족함: p=0.184), 두 군의 평균 p231TAU 대 전체 TAU 비는 변화하지 않았다. 1 mg/kg 및 3 mg/kg ACI-36-3A8-Ab1 처리된 군에서 p396TAU 인산화의 약간의 증가가 관찰되었다.

8.3.2.3 해마 균질물의 가용성 분획에서의 TAU

전체 TAU, p231TAU, p396TAU, 및 전체 TAU에 대한 pTAU의 비를 군 A (Tg 비히클 군; PBS) 및 D (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 1 mg/kg)로부터의 n=16 동물 및 군 E (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 3 mg/kg)로부터의 n=15 동물의 해마 균질물의 가용성 분획에서 평가하였다. IRN6301 (군 D)의 가용성 해마 분획에서의 TAU 및 pTAU 수준은 이상치였고, 이들은 제외되었다. ACI-36-3A8-Ab1로의 처리는 가용성 해마 균질물에서 전체 TAU 및 pTAU에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 전체 TAU에 대한 p231TAU의 비로서 평가된 231에서의 TAU 인산화의 약간의 감소 (유의성 없음)가 ACI-36-3A8-Ab1 처리 시에 관찰되었다.

8.3.2.4 해마 균질물의 사르코실 불용성 분획에서의 TAU

전체 TAU, p231TAU, p396TAU, 및 전체 TAU에 대한 pTAU의 비를 군 A (Tg 비히클 군; PBS), B (Tg ACI-36-3A8-Ab1, 1 mg/kg), 및 C (Tg, ACI-36-3A8-Ab1, 3 mg/kg)로부터의 n=16 동물의 해마 균질물의 사르코실 불용성 분획에서 평가하였다. ACI-36-3A8-Ab1로의 처리는 사르코실 불용성 해마 균질물에서 전체 TAU 및 pTAU에 유의한 영향을 미치지 않았다. 평균 전체 TAU, p231TAU 뿐만 아니라 p396TAU의 약간의 증가 (유의성 없음)가 ACI-36-3A8-Ab1 처리시에 관찰되었다. 전체 TAU에 대한 p231TAU의 비로서 평가된 TAU 인산화는 영향을 미치지 않았으며, 1mg/kg ACI-36-3A8-Ab1로의 처리는 전체 TAU에 대한 p396TAU의 비를 약간 감소시켰다.

8.3.2.5. 가용성 피질에 대한 웨스턴 블롯

1 또는 3 mg/kg의 ACI-36-3A8-Ab1로 처리된 마우스의 가용성 뇌 피질에서 pS396/pS404 pTau 에피토프의 유의한 감소 (도 5D). 인간/트랜스제닉 pT181 pTau 에피토프의 존재는 가용성 피질 분획에서 감소하였으며, 1 mg/kg으로 처리된 마우스에서 유의한 효과가 있고 3 mg/kg으로 처리된 마우스에서 감소하는 경향이 있었다 (도 5E). 감소하는 경향은 내인성 pT181 pTau의 양에서 관찰되었다 (도 5F).

8.3.2.6 biGT Tau 바이제닉 마우스에서의 TAU

ACI-36-3A8-Ab1로 3개월 동안 처리된 biGT 마우스는 뇌 피질 가용성 분획에서 전체 Tau를 유의하게 감소시켰다 (도 6A 및 6B). pTau 에피토프 pT231/AT180 (도 6C 및 6D), pS202/AT8 (도 6E) 및 pS396 (도 6F 및 6G)에서 유의한 감소가 관찰되었다. pTau 에피토프 pS400 (도 6H 및 6I) 및 pS404 (도 6L 및 6M)에 대한 두 전체 균질물 (TH)에서 또한 유의한 감소가 관찰되었다. 또한, pTau 에피토프 pS400에 대한 가용성 분획에서 유의한 감소가 또한 관찰되었으며 (도 6J 및 6K), pTau 에피토프 pS404에서 감소하는 경향이 관찰되었다 (도 6N 및 6O).

8.3.3 조직학

8.3.3.1 형태계측 - 영역 면적의 결정

실시예 8.2.3.1을 참조한다.

8.3.3.2 AT180 IH의 결과

AT180 항체는 내인성 및 인간 pTAU (Thr231 및 Ser235에서 이중으로 인산화됨)를 검출한다. nTg 대조군에서 세포체내 pTAU의 양은 Tg 군과 비교하여 유의하게 더 낮았다 (p<0.001). 편도체에서, 두 용량의 ACI-36-3A8-Ab1 [1 mg/kg (군 D) 및 3 mg/kg (군 E)]이 비히클 처리된 동물과 비교하여 세포체 pTAU를 유의하게 감소시켰다 (도 8, 좌측). 유사한 효과가 해마 (보다 낮은 투여량의 ACI-36-3A8-Ab1이 pTAU를 감소시킴)에서 검출가능하였으나, 이러한 경우에 보다 높은 용량이 덜 효과적이었으며, 단지 극단적으로 감소시켰다 (도 8, 우측). 이러한 감소는 또한 개별 뉴런 세포체에서 염색 면적 및 염색 강도의 감소로서 정성적으로 시각화가능하였다. 뉴런 세포체에서 측정된 AT180 IR의 강도의 정규화된 합계의 결과는 편도체에서 측정된 AT180 IR 면적 백분율과 대등하였으나, 단지 보다 높은 용량에서만 유의성에 도달하였다. 해마에서 결과는 전체적으로 IR 면적과 대등하였다.

8.3.4 요약

MSD에 의해 측정된 바와 같이 뇌 Tau 병리상태는 유의한 변화를 나타내지 않았으나, 뇌 절편의 면역염색은 뉴런 세포체에서 AT180 (pT231/pS235) 면역염색이 40%까지 감소하며 용량-의존성임을 입증하였다.

연구는 포스포사이트 특이적 항-pTau 항체 ACI-36-3A8-Ab1의 13회 투여를 이용한 수동 면역화가 공간 학습을 개선하고, 뇌 pTau 병리상태를 유의하게 감소시킨다는 것을 보여준다.

기탁:

하기 하이브리도마 세포주를 부다페스트 조약의 규정 하에 브라운슈바이크의 "도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) (DSMZ) (인호펜스트라쎄 7 B, 38124 브라운슈바이크)와 AC 이뮨 SA(AC Immune SA) (PSE-EPFL 빌딩 B, 1015 로잔, 스위스) 및 루벤 카톨릭 대학(Katholieke Universiteit Leuven) (민데르브뢰더스트라쎄 8a - Box 5105, B-3000 루벤)의 명의로 기탁하였다:

참고문헌 목록

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DSMACC3079

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DSMACC3081

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DSMACC3141

20110906

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DSMACC3082

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DSMACC3088

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DSMACC3080

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DSMACC3086

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DSMACC3084

20100825

SEQUENCE LISTING <110> AC Immune S.A. K.U. Leuven Research & Development <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION <130> P2654 PCT/A BS <150> EP 10 18 6810.7 <151> 2010-10-07 <150> EP 11 17 4248.2 <151> 2011-07-15 <160> 221 <170> BiSSAP 1.0 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SOURCE <222> 1..115 <223> /mol_type="protein" /organism="Mus musculus" <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Asn Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Tyr Tyr Ala Val Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SOURCE <222> 1..115 <223> /mol_type="protein" /organism="Mus musculus" <400> 2 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Claims

포유동물 타우(Tau) 단백질 상의 포스포-에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편이며,
표면 플라즈몬 공명으로 측정시 포유동물 타우 단백질에 10 nM 미만의 해리 상수로 결합하고 상응하는 비인산화 에피토프에는 결합하지 않고,
여기서 상기 포스포-에피토프는 위치 409에 인산화 Ser (pS409)을 갖는 아미노산 405-411 또는 405-412인
항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, 상기 포유동물 타우가 인간 타우인 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, 포유동물 타우 단백질 상의 포스포-에피토프에 5 nM 미만의 해리 상수로 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, 포유동물 타우 단백질 상의 포스포-에피토프에 10⁴ M^-1s^-1 이상의 회합률 상수로 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서, 포유동물 타우 단백질 상의 포스포-에피토프에 10⁵ M^-1s^-1 이상의 회합률 상수로 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서,
a) 서열 21로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
서열 22로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
서열 23으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3
을 함유하는 경쇄 가변 도메인, 및/또는
서열 12로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
서열 13으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
서열 14로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3
을 함유하는 중쇄 가변 도메인,
b) 서열 27과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
서열 25로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
서열 26으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3
을 함유하는 경쇄 가변 도메인, 및/또는
서열 12로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
서열 13으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
서열 14로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3
을 함유하는 중쇄 가변 도메인,
c) 서열 24로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
서열 25로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
서열 26으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3
을 함유하는 경쇄 가변 도메인, 및/또는
서열 12로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
서열 13으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
서열 14로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3
을 함유하는 중쇄 가변 도메인,
d) 서열 27로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
서열 25로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
서열 26으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3
을 함유하는 경쇄 가변 도메인, 및/또는
서열 12로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
서열 13으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
서열 14로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3
을 함유하는 중쇄 가변 도메인, 또는
e) 서열 28로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
서열 25로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
서열 26으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3
을 함유하는 경쇄 가변 도메인, 및/또는
서열 12로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
서열 13으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
서열 14로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR3
을 함유하는 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
제6항에 있어서,
서열 6, 7, 8 또는 9로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 가변 도메인, 및/또는
서열 1, 2 또는 3으로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항에 있어서,
a. 서열 6으로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 가변 도메인 및/또는
서열 1로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 가변 도메인, 또는
b. 서열 7로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 가변 도메인 및/또는
서열 1로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 가변 도메인, 또는
c. 서열 8로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 가변 도메인 및/또는
서열 2로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 가변 도메인, 또는
d. 서열 9로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 가변 도메인 및/또는
서열 3으로 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, IgG2a, IgG2b 또는 IgG3 이소형의 항체인 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체인 항체 또는 그의 기능적 단편.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제11항에 있어서,
a. 서열 35-37 또는 40-43으로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자,
b. 상보적 가닥이 상기 a)의 핵산 분자에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 및
c. 유전자 코드의 축중성(degeneracy)에 의해 상기 a) 및 b) 중 어느 하나에서 정의된 뉴클레오티드 서열로부터 벗어난 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편, 및
제약상 허용되는 담체
를 포함하는, 타우병증의 치료 또는 완화에 사용하기 위한 제약 조성물.
제13항에 있어서, 신경병성 장애 또는 인지 결핍인 상태의 치료 또는 완화에 사용하기 위한 제약 조성물.
제13항에 있어서, 인지 결핍의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물이며, 인지 결핍의 치료가 그러한 치료를 받은 대상체에서 인지 기억 용량의 증가로 이어지는 것인 제약 조성물.
제13항에 있어서, 신경원섬유 병변의 형성에 의해 유발되거나 또는 이와 연관된 질환 또는 장애의 치료 또는 완화에 사용하기 위한 제약 조성물.
제13항에 있어서, 타우 및 아밀로이드 병리상태의 공존을 보여주는 질환 또는 장애의 치료 또는 완화에 사용하기 위한 제약 조성물.
제13항에 있어서, 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 권투선수 치매, 다운 증후군, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커병, 봉입체 근염, 프리온 단백질 뇌 아밀로이드 혈관병증, 외상성 뇌 손상, 괌의 근위축성 측삭 경화증/파킨슨증-치매 복합증, 신경원섬유 엉킴을 갖는 비-괌 운동 뉴런 질환, 은친화성 입자 치매, 피질기저 변성, 석회화를 갖는 미만성 신경원섬유 엉킴, 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두엽 치매, 할러보르덴-스파츠병, 다계통 위축, 니만-픽병 유형 C, 담창구-교뇌-흑질 변성, 픽병, 진행성 피질하 교세포증, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 엉킴 단독 치매, 뇌염후 파킨슨증, 또는 근긴장성 이영양증의 치료 또는 완화에 사용하기 위한 제약 조성물.
제13항에 있어서, 알츠하이머병의 치료 또는 완화에 사용하기 위한 제약 조성물.
a. 타우 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편과 접촉시키는 단계,
b. 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 타우 단백질에 결합되게 하여 면역학적 복합체가 형성되도록 하는 단계,
c. 상기 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계, 및
d. 상기 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 샘플 중 타우 단백질의 존재 또는 부재와 연관시키는 단계
를 포함하며, 샘플 중의 타우 단백질에 대한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편의 면역특이적 결합을 검출하는 것을 포함하는, 환자에서 타우 단백질-연관 질환, 장애 또는 상태를 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
a. 타우 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편과 접촉시키는 단계,
b. 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 타우 단백질에 결합되게 하여 면역학적 복합체가 형성되도록 하는 단계,
c. 상기 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계,
d. 상기 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 샘플 중 타우 단백질의 존재 또는 부재와 연관시키는 단계, 및
e. 상기 면역학적 복합체의 양을 정상 대조 값과 비교하는 단계
를 포함하며, 여기서 정상 대조 값과 비교하여 상기 면역학적 복합체의 양의 증가는 환자가 타우 단백질-연관 질환, 장애 또는 상태를 앓고 있거나 또는 타우 단백질-연관 질환, 장애 또는 상태가 발생할 위험이 있다는 것을 나타내는 것인,
샘플 중의 타우 단백질에 대한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편의 면역특이적 결합을 검출하는 것을 포함하는, 환자에서 타우 단백질-연관 질환, 장애 또는 상태에 대한 소인을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
a. 타우 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편과 접촉시키는 단계,
b. 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 타우 단백질에 결합되게 하여 면역학적 복합체가 형성되도록 하는 단계,
c. 상기 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계,
d. 상기 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 샘플 중 타우 단백질의 존재 또는 부재와 연관시키는 단계, 및
e. 상기 면역학적 복합체의 양을 정상 대조 값과 비교하는 단계
를 포함하며, 여기서 정상 대조 값과 비교하여 상기 면역학적 복합체의 양의 증가는 환자가 여전히 최소 잔류 질환을 앓고 있다는 것을 나타내는 것인,
타우 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편을 사용한 치료 후의 환자에서 최소 잔류 질환을 모니터링하기 위한 정보를 제공하는 방법.
a. 타우 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편과 접촉시키는 단계,
b. 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이 타우 단백질에 결합되게 하여 면역학적 복합체가 형성되도록 하는 단계,
c. 상기 면역학적 복합체의 형성을 검출하는 단계,
d. 상기 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 샘플 중 타우 단백질의 존재 또는 부재와 연관시키는 단계, 및
e. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편을 사용한 치료의 개시 전후에 상기 면역학적 복합체의 양을 비교하는 단계
를 포함하며, 여기서 상기 면역학적 복합체의 양의 감소는 환자가 치료에 대해 반응할 높은 잠재성을 갖는다는 것을 나타내는 것인,
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편을 사용하여 치료받는 환자의 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하는, 타우병증의 검출 및 진단을 위한 시험 키트.
제24항에 있어서,
상기 항체 또는 그의 기능적 단편을 수용하는 용기, 및
타우 단백질에 결합시켜 면역학적 복합체를 형성하고 면역학적 복합체의 형성을 검출하여 면역학적 복합체의 존재 또는 부재를 타우 단백질의 존재 또는 부재와 연관시키기 위한 목적으로 상기 항체 또는 그의 기능적 단편을 사용하는 것에 관한 설명서
를 포함하는 시험 키트.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편을 생산하는 세포주.
제26항에 있어서,
2010년 8월 25일에 DSM ACC3080으로서 기탁된 하이브리도마 세포주 6H1A11C11,
2010년 8월 25일에 DSM ACC3088로서 기탁된 하이브리도마 세포주 6H1G6E6,
2010년 8월 25일에 DSM ACC3084로서 기탁된 하이브리도마 세포주 2B6A10C11,
2010년 3월 10일에 DSM ACC3087로서 기탁된 하이브리도마 세포주 2B6G7A12,
2010년 8월 25일에 DSM ACC3086으로서 기탁된 하이브리도마 세포주 3A8A12G7, 또는
2010년 8월 25일에 DSM ACC3085로서 기탁된 하이브리도마 세포주 3A8E12H8
인 세포주.
제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포주.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포주를 적합한 배양 배지 내에서 배양하는 단계
를 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 기능적 단편을 생산하는 방법.
제29항에 있어서,
세포주 또는 배양 배지로부터 상기 항체 또는 그의 기능적 단편을 정제하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
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