MX2013003800A - Anticuerpos fosfoespecificos que reconocen la proteina tau. - Google Patents

Anticuerpos fosfoespecificos que reconocen la proteina tau.

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Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el uso terapéutico y de diagnóstico en el tratamiento de enfermedades y trastornos que son causados por ovillos neurofibrilares o están asociados con ellos. En particular, la invención se refiere a anticuerpos, que específicamente reconocen y se unen a conformadores de proteína tau patológicos fosforilados y con métodos y composiciones que incluyen dichos anticuerpos para el uso terapéutico y diagnóstico en el tratamiento de tauopatías entre las que encuentra la enfermedad de Alzheimer (EA).

Description

ANTICUERPOS FOSFOESPECÍFICOS QUE RECONOCEN LA PROTÉÍNA TAU La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el uso terapéutico y de diagnóstico en el tratamiento de enfermedades y trastornos que son causados por ovillos neurofibrilares o están relacionados con ellos. En particular, la invención se refiere a anticuerpos, que específicamente reconocen y se unen a conformadores de proteína tau patológicos fosforilados y con métodos y composiciones que incluyen dichos anticuerpos para el uso terapéutico y diagnóstico en el tratamiento de tauopatías entre las que encuentra la enfermedad de Alzheimer (EA).
Los ovillos neurofibrilares y los hilos de neurópilo (HN) son las características neuropatológicas distintivas principales de la enfermedad de Alzheimer (EA). Están compuestos por la proteína tau asociada a miprotúbulos que ha sufrido modificaciones postrad uccionales, que incluyen la fosforilación, la desamidación y la isomerización en residuos de asparginilo o aspartilo. Se originan por el agregado de proteína tau hiperfosforilada y sus conformadores. La EA comparte esta patología con muchas tauopatías neurodegenerativas, en especial, con tipos específicos de demencia frontotemporal (DFT).
La proteína tau es una proteína altamente soluble, "naturalmente no plegada" que se une con avidez a los microtúbulos (MT) para promover su unión y estabilidad. Los MT son de suma importancia para la integridad citoesquelética de las neuronas, y por lo tanto, para la formación y funcionamiento adecuados de los circuitos neuronales, por ende, para el aprendizaje y la memoria. La unión de la proteína tau con el MT es controlada por fosforilación y desfosforilación dinámicas, según lo demuestran en especial las células in vitro y no neuronales. Debido a la gran cantidad de sitios de fosforilación posibles (>80), la contribución exacta de cada uno y la identidad de las quinasas responsables continúan sin definirse in vivo.
En un cerebro con EA, la patología tau se desarrolla con posterioridad a una patología amiloide, y por lo tanto es probable que en respuesta a ella, lo que constituye la esencia de la hipótesis de la cascada amiloide. Esto se basa en los estudios en pacientes con EZ y síndrome de Down y son indicados en ellos, y son corroborados por estudios en ratones transgénicos con patología tau y amiloide combinadas ((Lewis et al., 2001 ; Oddo et al., 2004; Ribe et al., 2005; Muyllaert et al, 2006; 2008; Terwel et al, 2008).
El preciso momento oportuno de ambas patologías en pacientes humanos con EA así como también los mecanismos que unen patología amiloide y tau continúan siendo desconocidos, pero se propone que involucran una activación de vías de señalización neuronal que actúan en GSK3 y cdk5 o a través de ellas como las "tau quinasas" principales (revisado por Muyllaert et al, 2006, 2008).
La hipótesis de que la tauopatía no es un efecto colateral inocente sino un ejecutor patológico principal en EA se basa en las observaciones genéticas, patológicas y experimentales sólidas que se corroboran entre sí por completo: • en los casos de EA genética de aparición precoz que se deben a mutaciones en el precursor de la proteína amiloide (PPA) o presenilina, la causa patogénica obligada es la acumulación amiloide, pero invariablemente la patología comprende tauopatía colateral, idéntica a la de los casos de EA esporádica de aparición tardía; • la gravedad en la disfunción cognitiva y en la demencia se corresponde con la tauopatía, con la patología amiloide, ejemplificado últimamente a través de varios estudios clínicos de fase 1 y 2 que incluyen estudios por imágenes PIB-PET e identifican muchos "falsos positivos"; individuos cognitivamente normales con una alta carga de amiloide cerebral; • en DFT genético, la tauopatía es provocada por tau mutante y causa neurodegeneración en forma directa, sin patología amiloide; · en modelos de ratón experimental, los defectos cognitivos ocasionados por patología amiloide son mitigados casi por completo a través de lá ausencia de proteína tau (Roberson et al, 2007).
Los diversos argumentos relacionados fundamentan la hipótesis de que la proteína tau ejerce una función principal en la dispersión cognitiva en EA y tauopatías neurodegenerativas relacionadas.
Un nuevo tratamiento destacado de EA es a través de inmunoterapia pasiva con mAbs específicos para limpiar péptidos amiloides y sus agregados que se supone son neurotóxicos o sinaptotóxicos.
De la forma propuesta aquí, se prevé la inmunoterapia que apunta a la patología tau para contrarrestar los conformadores de proteína tau patológicos conocidos o que supuestamente causan disfunción sináptica y neurodegeneración. Se propone que la patología amiloide producida y los agregados intraneuronales de proteína tau hiperfosforilada actúen en forma sinérgica en la cascada cognitiva y degenerativa de eventos patológicos que provocan desde trastorno cognitivo leve (TCL) hasta demencia grave de ÉA. Por lo tanto, la combinación de medicación dirigida por tau con la medicación dirigida por amiloide (o cualquier otra) constituye el tratamiento de preferencia y esencialmente el más eficaz para EA, en contraposición a la actual monoterapia.
Otros enfoques terapéuticos que tienen como objetivo la proteíná tau son escasos y comprenden principalmente: • los inhibidores de las quinasas que se cree aumentan la fosforilación de tau a niveles patológicos; • los compuestos que bloquean la agregación citoplásmica de proteína tau hiperfosforilada.
Estos enfoques sufren varios inconvenientes de especificidad y eficacia, un problema que comparten con intentos para modificar el metabolismo del PPA y del amiloide, donde todo ello hace hincapié en la importancia de una búsqueda continua de opciones de tratamientos adicionales, incluso la inmunoterapia contra tau.
No se ha dedicado prácticamente ningún esfuerzo por definir -y mucho menos poner como objetivo- los conformadores de tau patológicos in vivo. En el ensayo clínico ?ß42 de fase II, la patología de ovillo no parecer estar bien considerada ni analizada en demasiada profundidad (Nicoll et al., 2003; Masliah et al., 2005). Por otro lado, el amiloide con objetivo en la inmunoterapia experimental en un modelo de ratón preclínico con patología tipo EA combinada demostró también un efecto en la patología tau aunque los agregados de tau persistieron (Oddo et al., 2004).
Han surgido algunas dudas sobre la posibilidad de abordar la proteína tau intracelular por inmunoterapia. Fueron encontradas por el estudio experimental más reciente en un modelo de ratón de tauopatía (Asuni et al., 2007). Demostraron una reducción en la patología de ovillo y mejoras funcionales por medio de la vacunación con un fosfopéptido derivado de proteína tau. Estos datos corroboran informes previos de a-sinucleína con objetivo en la inmunoterapia en un modelo de enfermedad de Parkinson (EP) y de cuerpos de Lewy (Masliah et al., 2005, 2011 ) y de superóxido dismutasa en un modelo de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) (Urushitiani et al., 2007). Estas enfermedades son ejemplos en los que las proteínas intracelulares llevan a defectos sinapticos y neurodegeneración a través de mecanismos aún no comprendidos por completo. Por otro lado, la proteína tau recombinante de longitud completa producida en bacterias y aislada de ella no parece ser adecuada como vacuna, aunque los adyuvantes empleados, es decir toxina pertussis y completos de Freurid, podrían haber contribuido al resultado negativo del estudio (Rosenmann et al., 2006).
Existe una necesidad insatisfecha de inmunoterapias pasivas y/o activas que funcionen para contrarrestar los conformadores de proteína patológicos que se sabe -o presume- causan trastornos neurodegenerativos, tales como la patología amiloide en EA provocada, por ejemplo, por agregados intraneuronales de proteína tau hiperfosforilada típicos para la EA como amiloide.
Esta necesidad insatisfecha podría satisfacerse dentro del alcance de la presente invención mediante la provisión de unión de proteínas que reconozcan y se unan a fosfoepítopes patológicos de la proteína tau. En particular, la presente I invención provee anticuerpos específicos contra fosfoepítopes lineales o conformacionaíes, simples y complejos, en proteína tau, en particular, en proteína tau agregada que son considerados responsables de la sinaptotoxicidad y neurotoxicidad en tauopatías, incluso en EA.
Conforme a ello, la presente invención se refiere en una forma de realización a un péptido de unión o proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular a un fosfo- epítope en la proteína Tau agregada, en particular a un confórmero de proteína tau patológico pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados, en donde dicho péptido de unión o anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con la proteína tau soluble e insoluble y modula los niveles de la proteína tau soluble e insoluble, en particular I en el cerebro, en particular con una constante de disociación de al menos 10 nM, i en particular de al menos 8 nM, en particular de al menos 5 nM, en particular de al menos 2 nM, en particular de al menos 1 nM, en particular de al menos 500 pM, en particular de al menos 400 pM, en particular de al menos 300 pM, en particular de al menos 200 pM, en particular de al menos 100 pM, en particular de al menos 50 pM.
En una segunda forma de realización, la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados, en donde dicho péptido de unión o anticuerpo tiene una constante de velocidad de asociación de 104 M~V1 o mayor, en particular de entre 3 - 5 x 104 M~V1 o mayor, en particular de 105 M~V1 o mayor; en particular de 2 - 9 x 105 M~ s~1 o mayor; en particular de 106 M~1s~1 o mayor, en particular dé 1 - 4 x 106 M~V1 o mayor, en particular de 107 M-1s"1 o mayor.
En una tercera forma de realización, la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados, en donde dicho péptido de unión o anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 4 nM y una constante de velocidad de asociación de 105 M~1s~1 o mayor, en particular una constante de disociación de al menos 3 nM y una constante de velocidad de asociación de 106 M_1s~1 o mayor, en particular una constante de disociación de al menos 2 nM y una constante de velocidad de asociación de 104 M"1s~1 o mayor, en particular una constante de disociación de al menos 1 nM y una constante de velocidad de asociación de 105 M~ s~1 o mayor, en particular una constante de disociación de al menos 200 pM y una constante de velocidad de asociación de 105 M~1s~' o mayor, en particular una constante de disociación de al menos 100 pM y una constante de velocidad de asociación de 106 M~1s~1 o mayor.
Una forma de realización (4) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica pero, en una forma de realización, no se I une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo se une con 'un epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau tal como sé indica en SEQ ID NO: 67, seleccionada del grupo que consiste en Tau aa 15-20 que comprende Tyr fosforilada en la posición 18 (Y18), Tau aa 405-412 que comprende Ser fosforilada en la posición 409 (pS409), Tau aa 405-41 1 que comprende Ser fosforilada en la posición 409 (pS409); y Tau aa 208-218 que comprende Thr fosforilada en la posición 212 (pT212) y Ser fosforilada en la posición 214 (pS214).
Una forma de realización (5) se refiere al péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, en donde dicho péptido se une con un epítope en un mamífero, en particular en la proteína Tau humana, pero especialmente la proteína Tau humana tal como se indica en SEQ ID NQ: 67, que comprende Tau aa 15-20 con Tyr fosforilada en la posición 18 (Y18).
Una forma de realización (6) se refiere al péptido de unión o anticuerpo de cualquiera o las formas de realización precedentes, en donde dicho péptido se une con un epítope en un mamífero, en particular en la proteína Tau humana, pero especialmente la proteína Tau humana tal como se indica en SEQ ID NÓ: 67, que comprende Tau aa 405-412 con Ser fosforilada en la posición 409 (pS409).
Una forma de realización (7) se refiere al péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, en donde dicho péptido se une con un epítope en un mamífero, en particular en la proteína Tau humana, pero especialmente la proteína Tau humana tal como se indica en SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 405-411 con Ser fosforilada en la posición 409 (pS409).
Una forma de realización (8) se refiere al péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, en donde dicho péptido se une con un epítope en un mamífero, en particular en la proteína Tau humana, pero especialmente la proteína Tau humana tal como se indica en SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 208-218 con Thr fosforilada en la posición 212 (pT212) y Ser fosforilada en la posición 214 (pS214).
En otra forma de realización (9), la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende Un primer dominio de unión que contiene, en particular en secuencia, un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81 , 93, 101, 106, o una secuencia de aminoácido al menos 70%, en particular al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, 94, 102, 107, o una secuencia de aminoácido al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, 75, 83, 95, 103, 108, o una secuencia de aminoácido al menos 60%, en particular al menos 70%, en particular al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%- al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, 89, 98, o una secuencia de aminoácido al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71 , 79, 90, 99, 115, o una secuencia de aminoácido al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, l , 20, 72, 80, 91 , 100, o una secuencia de aminoácido al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica.
Una forma de realización (10) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de s;us partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiéra de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: SEQ ID NO: 21 , 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81 , o una secuencia de aminoácido al menos 85% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, 75, 83, o una secuencia de aminoácido al menos 80% idéntica; y/o un dominio de anticuerpos que contiene un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71 , 79, o una secuencia de aminoácido al menos 85% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, o una secuencia de aminoácido al menos 85% idéntica.
Una forma de realización (1 1 ) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81 , o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, 75, 83, o una secuencia de amihoácido al menos 90% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71 , 79, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica.
Una forma de realización (12) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión (dominio de anticuerpo) que contiene en secuencia' un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81 , o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, 75, 83, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71 , 79, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica.
Una forma de realización (13) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , 24, 27, 28, 29, 32, o una secuencia de aminoácido al menos 98% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, 17, 20, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica.
Una forma de realización (14) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , 24, 27, 28, 29, 32, o una secuencia de aminoácido al menos 98% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, o una secuencia de aminoácido al menos 98% idéntica; y/o un segundo dominio de unión qué contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, o una secuencia de aminoácido al menos 98% idéntica, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, 17, 20, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica.
Una forma de realización (15) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sús partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende ún primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81 , 93, 101 , o 106, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, 94, 102, o 107, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, 75, 83, 95, 103, o 108, y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, 89, o 98, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71 , 79, 90, 99, o 115, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, 91 , 0 100.
Una forma de realización (16) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprendé un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , o una secuencia de aminoácido al menos 76%, en particular al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, en particular al menos 95%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% idéntica, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, o una secuencia de aminoácido al menos 95%, en particular 98%, en particular 99% idéntica, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, o una secuencia de aminoácido al menos 66%, en particular al menos 70%, en particular al menos 75%, en particular al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, en particular al menos 95%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% idéntica, y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, o una secuencia de aminoácido al menos 95%, en particular 98%, en particular 99% idéntica, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, o una secuencia de aminoácido al menos 88%, en particular al menos 90%, en particular al menos 95%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% idéntica, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, o una secuencia de aminoácido al menos 66%, en particular al menos 70%, en particular al menos 75%, en particular al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, en particular al menos 95%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% idéntica.
Una forma de realización (17) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus' fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 24, o SEQ ID NO: 27, o SEQ ID NO: 28, o una secuencia de aminoácido al menos 88%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, en particular al menos 95%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% idéntica, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 25, o una secuencia de aminoácido al menos 95%, en particular 98%, en particular 99% y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 26, o una secuencia de aminoácido al menos 66%, en particular al menos 70%, en particular al menos 75%, en particular al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, en particular al menos 95%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% idéntica y/o un segundo dominio de unión que- contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, o una secuencia de aminoácido al menos 95%, en particular 98%, en particular 99% idéntica, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, o una secuencia de aminoácido al menos 88%, en particular al menos 90%, en particular al menos 95%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% idéntica, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, o una secuencia de aminoácido al menos 66%, en particular al menos 70%, en particular al menos 75%, en particular al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, en particular al menos 95%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% idéntica.
Una forma de realización (18) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un- anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con la forma de realización (15) que comprende un primer dominio de unión, en donde el CDR1 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 27, o una secuencia de aminoácido al menos 88% idéntica.
Una forma de realización (19) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con forma de realización (15), que comprende un primer dominio de unión en donde el CDR1 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 28, o una secuencia de aminoácido.al menos 88% idéntica.
Una forma de realización (20) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sús partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la I proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende ün primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 29, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 30, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 31 , o una secuencia de aminoácido al menos 95%, en particular 98%, en particular 99% idéntica y/o un segundó dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 15, o una secuencia de aminoácido al menos; 95%, en particular 98%, en particular 99% idéntica, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 16, o una secuencia de aminoácido al menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 17, o una secuencia de aminoácido al menos 36%, en particular al menos 40%, en particular al menos 50%, en particular al menos 60%, en particular al menos 70%, en particular al menos 75%, en particular al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, en particular al menos 95%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% idéntica.
Una forma de realización (21 ) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiéra de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular* con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados, en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 32, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 34, o una secuencia de aminoácido al menos 95%, en particular 98%, en particular 99% idéntica y/o un segundó dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 18, o una secuencia de aminoácido al menos 95%, en particular 98%, en particular 99% idéntica, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 19, o una secuencia de aminoácido al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 20, o una secuencia de aminoácido al menos 63%, en particular al menos 70%, en particular al menos 75%, en particular al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, en particular al menos 95%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% idéntica.
Una forma de realización (22) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las i formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 73, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 74, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 75, o una secuencia de aminoácido al menos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular a) menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 70, o una secuencia de aminoácido al menos 95%, en particular 98%, en particular 99% idéntica, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 71 , o una secuencia de aminoácido al menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 72, o una secuencia de aminoácido al menos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica.
Una forma de realización (23) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 81 , un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 82, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 83, o una secuencia de aminoácido al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%J al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 78, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 79, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 80, o una secuencia de aminoácido al menos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en ¡particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica.
Una forma de realización (24) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 93, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 94, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 95, o una secuencia de aminoácido al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica a cualquiera de los anteriores CDRs y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 89, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 90, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SE ID NO: 91 , o una secuencia de aminoácido al menos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al meónos 98%, en particular al menos 99% o 100% % idéntica a cualquiera de los anteriores CDRs.
Una forma de realización (25) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 101 , un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 102, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 103, o una secuencia de aminoácido al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos i 85%, en particular al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica a cualquiera de los anteriores CDRs y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 98, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 99, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: í 100, o una secuencia de aminoácido al menos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% % idéntica a cualquiera de los anteriores CDRs.
Una forma de realización (26) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 106, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 107, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 108, o una secuencia de aminoácido al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos ! 85%, en i particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica a cualquiera de los anteriores CDRs y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 89, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID i NO: 115, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 91 , o una secuencia de aminoácido al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en ¡particular al menos 99% o 100% % idéntica a cualquiera de los anteriores CDRs.
En otra forma de realización (27), la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados, en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11 , o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica, y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, o una secuencia de aminoácido al menos 85% idéntica.
En una forma de realización (28), la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica, y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, o una secuencia de aminoácido al menos 91% idéntica. ¡ Una forma de realización (29) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la i proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión (dominio de anticuerpo) que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11 , o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, o una secuencia de aminoácido al menos 91% idéntica.
En otra forma de realización (30), la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados, en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada e'n SEQ ID NO: 69, 77, 116/92, 97, 105, o una secuencia de aminoácido en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica, y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 68, 76, 88, 96, 104, o una secuencia de aminoácido al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 86%, en particular al menos 87%, en particular al menos 88%, en particular al menos 89%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica.
Una forma de realización (31 ) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7, o una secuencia de aminoácido al menos 90% y 94%, respectivamente, idénticas; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 , o una secuencia de aminoácido al menos 91 % idéntica.
Una forma de realización (32) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un i confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 8, o una .secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica.
Una forma de realización (33) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 9, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica.
Una forma de realización (34) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende Un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 10, o una secuencia de aminoácido al menos 99% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácido al menos 89% idéntica.
Una forma de realización (35) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 11 , o una secuencia de aminoácido al menos 98% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácido al menos 87% idéntica.
Una forma de realización (36) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados, en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 69, o una secuencia de aminoácido al menos 98% o 99% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 68, o una secuencia de aminoácido al menos 90%, 91%, 92% o 93% idéntica.
Una forma de realización (37) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 77, o una secuencia de aminoácido al menos 93%, 94% o 95% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 76, o una secuencia de aminoácido al menos 88%, 89% o 90% idéntica.
Una forma de realización (38) de la presente invención sé refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 116, 92 ó 118, o una secuencia de aminoácido al menos 93%, 94% o 95% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 88, o una secuencia de aminoácido al menos 90%, 91 %, 92% o 93% idéntica. 1 Una forma de realización (39) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 97, o una secuencia de aminoácido al menos 99% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 96, o una secuencia de aminoácido al menos 86%, 87%, 88%, 89P/o o 90% idéntica.
Una forma de realización (40) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular con un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 105, o una secuencia de aminoácido al menos 98% o 99% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 104, o una secuencia de aminoácido al menos 88%, 89% o 90% idéntica.
En otra forma de realización (41 ), la presente invención se refiere a un péptido de unión o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, dé acuerdo con las formas de realización (22) - (24), en donde dicho primer dominio! de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 21-34 y dicho segundo dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 12-20.
Una forma de realización (42) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con forma de realización (31 ), en donde dicho primer dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 21-23 y SEQ ID NOs: 24-26, respectivamente, y dicho segundo dominio de unión contiene los CDRs, tal como se indica en SEQ ID NOs: 12-14.
Una forma de realización (43) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con forma de realización (32), en donde dicho primer dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 27, 25, 26 y dicho segundo dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 12-14. 1 Una forma de realización (44) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, dé acuerdo con forma de realización (33), en donde dicho primer dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 28, 25 y 26, y dicho; segundo dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 12-14. i Una forma de realización (45) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, dé acuerdo con forma de realización (34), en donde dicho primer dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 29-31 , y dicho segundo dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 15-17.
Una forma de realización (46) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con forma de realización (35), en donde dicho primer dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 32-34, y dicho segundo dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 18-20.
Una forma de realización (47) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en i particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con forma de realización (27), en donde dicho primer dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 73-75, y dicho segundo dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 70-72.
Una forma de realización (48) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con forma de realización (27), en donde dicho primer dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 81-83, y dicho segundo dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 78-80.
Una forma de realización (49) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con forma de realización (27), en donde dicho primer dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 101-103, y dicho segundó dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 98-100.
Una forma de realización (50) de la presente invención se refiere a un péptido de unión o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con forma de realización (27), en donde dicho primer dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 89, 115, y 91 , y dicho segundo dominio de unión contiene los CDRs tal como se indica en SEQ ID NOs: 106-108.
En otra forma de realización más (51 ), la presente invención se refiere a un péptido de unión o una proteína o una de sus partes funcionales, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, en particular un péptido de unión o anticuerpo de cualquiera de las I formas de realización precedentes, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados en donde dicho péptido de unión o anticuerpo comprende a. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 ; o ' b. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos i mostrada en SEQ ID NO: 7 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 ; o ' c. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 8 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2; o , d. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 9 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3; o e. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 10 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4; o f. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 11 y/o un segundo dominio de unión qué contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5; o ? g. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 69 y/o un segundo dominio de unión qué contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 68; o h. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 77 y/o un segundo dominio de unión qué contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 76; o i. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 116 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 88; o j. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 92 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 88; o k. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 97 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6; o I. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 105 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 104.
En una forma de realización (52) de la invención, el péptido de unión de cualquiera de las formas de realización precedentes es un anticuerpo, en particular un anticuerpo del isotipo lgG2a, lgG2b o lgG3, en particular un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo completamente humano.
Una forma de realización (48) de la invención se refiere a un polinucleótido que codifica el péptido de unión de cualquiera de las formas de realización precedentes.
En una forma de realización (53), dicho polinucleótido comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en a. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se indica en SEQ ID NOs: 35-45, SEQ ID NOs: 84- 87, SEQ ID NO: 109-112 y 1 7; b. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad de secuencia con la I secuencia mostrada en SEQ ID NOs: 35-45, SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 y 1 17; 1 c. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en SEQ ID NOs: 35-45, SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 y 117; d. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en SEQ ID NOs: 35-45, SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 y 1 17; e. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 98% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en SEQ ID NOs: 35-45, SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 y 117; f. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de i nucleótidos que tiene al menos el 99% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en SEQ ID NOs: 35^5, SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 y 117; g. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, cuya cadena complementaria híbrida en la molécula' de ácido nucleico de cualquiera de a) - f); h. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que se desvía de la secuencia de nucleótidos definida en cualquiera de a) - g) por degeneración del código genético, en donde dicha molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de a) - h) reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular en la proteína humana Tau tal como se indica en SEQ ID NO: 67, seleccionada del grupo que consiste en Tau aa 15-20 que comprende Tyr fosforilada en la posición 18 (Y18), Tau aa 405-412 que comprende Ser fosforilada en la posición 409 (pS409), Tau aa 405-411 que comprende Ser fosforilada en la posición 409 (pS409); y Tau aa 208-218 que comprende Thr fosforilada en la posición 212 (pT212) y Ser fosforilada en la posición 214 (pS214), Tau aa 393-401 , que comprende Ser fosforilada en la posición 396 (pS396), Tau aa 396-401 que comprende Ser fosforilada en la posición 396 (pS396), Tau aa 394-400 que comprende Ser fosforilada en la posición 396 (pS396), Tau aa 402-406 que comprende Ser fosforilada en la posición 404 (pS404), y Tau aa 393-400 que comprende Ser fosforilada en la posición 396 (pS396), en donde, en una forma de realización, dicho péptido de unión tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 10 nM, en particular de al menos 8 nM, en particular de al menos 5 nM, en particular de al menos 2 nM, en particular de al menos 1 nM, en particular de al menos 500 pM, en particular de al menos 400 pM, en particular de al menos 300 pM, en particular de al menos 200 pM, en particular de al menos 100 pM, en particular de al menos 50 pM y/o tiene una constante de velocidad de asociación de 104 M"1s"1 o mayor, en particular de entre 3 - 5 x 104 M~1s~1 o mayor, en particular de 105 M"1s~1 o mayor; en particular de 6 - 9 x 105 M"1s~1 o mayor; en particular de 106 M" s~1 o mayor, en particular de 1 - 4 x 106 M~V1 o mayor, en particular de 107 M"1s~1 o mayor, pero, en una forma de realización, no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados.
En varias formas de realización (54) de la invención, se provee un péptido de unión o una parte funcional de él, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de él, o un polinucleótido, de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores, o una combinación de ellos, que sea capaz de reconocer específicamente y de unirse a ui fosfoepítope en un mamífero, en particular en la proteína humana tau, en particular una proteína tau asociada a microtúbulos, en particular una proteína tau hiperfosforilada y asociada a microtúbulos agregados como la presente en los filamentos helicoidales pareados (FHP), que son las estructuras predominantes en ovillos neurofibrilares, hilos de neurópilo y neuritis distrófica, pero en una forma de realización, no se une con el epítope no fosforilado correspondiente y/o con epítopes no relacionados.
En una forma de realización específica (55) de la invención, la proteína humana tau es la proteína humana tau mostrada en la SEQ ID NO: 67.
De esta manera, los péptidos de unión y los anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores pueden ser usados (56) para reducir los niveles de proteína tau soluble total, en particular, de proteína tau fosforilada soluble, en el cerebro, en particular, en la corteza cerebral y/o hipocampo de un mamífero o de un ser humano que contenga niveles aumentados de proteína tau soluble y/o proteína tau fosforilada soluble.
Los péptidos de unión y los anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores también pueden ser usados (57) para reducir los niveles de filamentos helicoidales pareados que contienen proteína tau hiperfosforilada (pTau PHF) en el cerebro, en particular, en la corteza cerebral y/o hipocampo de un mamífero o de un ser humano que contenga niveles aumentados de dichos filamentos helicoidales pareados de proteína tau (pTau PHF).
La reducción en el nivel de proteína tau soluble total y/o proteína tau fosforilada soluble y/o filamentos helicoidales pareados de pTau (pTau PHF) en el cerebro, en particular en la corteza cerebral y/o hipocampo de un mamífero o de un ser humano que contenga niveles aumentados de dichas variantes de proteínas tau, que contribuyen a enfermedades, trastornos o estados asociados con la proteína tau en tales mamíferos o seres humanos, puede llevar a una mejora y/o mitigación de los síntomas asociados con dichas enfermedades, trastornos o estados asociados con la proteína tau (58).
Por lo tanto, los péptidos de unión y los anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores pueden ser usados (59) en terapia, en particular, en terapia con seres humanos, para retardar o detener el avance de una enfermedad, trastorno o estado asociado con la proteína tau.
Los péptidos de unión y los anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores pueden ser usados (60), además, en terapia, en particular, en terapia con seres humanos, para mejorar o mitigar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o estados asociados con la proteína tau como ser, por ejemplo, el deterioro o la pérdida de funciones cognitivas que incluyen el razonamiento, el juicio situacional, la capacidad de la memoria, el aprendizaje, la navegación espacial, etc.
En una forma de realización (61 ), la invención se refiere a los péptidos de unión y a los anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores para su uso en terapia, en particular, para su uso en el tratamiento de tauopatías, un grupo de enfermedades y trastornos asociados con la proteína tau, o para mitigar los síntomas asociados con tauopatías. | En una forma de realización (62), la invención se refiere a los péptidos de unión y a anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores para mantener o aumentar la capacidad de la memoria cognitiva en un mamífero que sufre de una tauopatía.
En una forma de realización específica (63) de la invención, los péptidos de unión y los anticuerpos que comprenden al menos uno o la totalidad de los CDRs de cadena ligera de anticuerpos ACI-36-2B6-Ab1 , ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-3A8-Ab1 y ACI-36-3A8-Ab2 de acuerdo con lo dado por las SEQ ID NOs: 25, 26, 27 y SEQ ID NOs: 21 , 22, 23, respectivamente, y/o al menos uno o la totalidad de los CDRs de cadena pesada de anticuerpos ACI-36-2B6-Ab1 , ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-3A8-Ab1 y ACI-36-3A8-Ab2 de acuerdo con lo dado por las SEQ ID NOs: 12, 13, 14, son empleados en terapia, en particular en terapia con seres humanos, para mejorar o mitigar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o estados asociados con la proteína tau como ser, por ejemplo, el deterioro o la pérdida de funciones cognitivas entre las que se incluyen el razonamiento, el juicio situacional, la memoria, el aprendizaje, la návegación espacial, etc.
En una forma de realización específica (64) de la invención, los anticuerpos que comprenden la cadena ligera de anticuerpos ACI-36-2B6-Ab1 , ACk36-2B6-Ab2, ACI-36-3A8-Ab1 y ACI-36-3A8-Ab2 de acuerdo con lo dado por las SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NOs: 6, 7, respectivamente, y/o la cadena pesada de anticuerpos ACI-36-2B6-Ab1 , ACI-36-2B6-Ab12, ACI-36-3A8-Ab1 y ACI-36-3A8-Ab2 de acuerdo con lo dado por las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, son empleados en terapia, en particular en terapia con seres humanos, para mejorar o mitigar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o estados asociados con la proteína tau como ser, por ejemplo, el deterioro o la pérdida de funciones cognitivas entre las que se incluyen el razonamiento, el juicio situacional, la memoria, el aprendizaje, la navegación espacial, etc.
En una forma de realización específica (65) de la invención, los péptidos de unión y los anticuerpos que comprenden al menos uno o la totalidad de los CDRs de cadena ligera de anticuerpos ACI-33-6C10-Ab1 y ACI-33-6C10-Ab2 de acuerdo con lo dado por las SEQ ID NOs: 29, 30, 31 , y/o al menos uno o la totalidad de los CDRs de cadena pesada de anticuerpos ACI-33-6C10-Ab1 y ACI-33-6C10-Ab2 de acuerdo con lo dado por las SEQ ID NOs: 15, 16, 17, son empleados en terapia, en particular en terapia con seres humanos, para mejorar o mitigar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o estados asociados con la proteína tau como ser, por ejemplo, el deterioro o la pérdida de funciones cognitivas entre las que se incluyen el razonamiento, el juicio situacional, la memoria, el aprendizaje, la navegación espacial, etc.
En una forma de realización específica (66) de la invención, los péptidos de I unión y los anticuerpos que comprenden al menos uno o la totalidad de los CDRs de cadena ligera de anticuerpos ACI- 1-7C2-Ab1 y ACI-41-7C2-Ab2 de acuerdo con lo dado por las SEQ ID NOs: 32, 33, 34, y/o al menos | uno o la totalidad de los CDRs de cadena pesada de anticuerpos ACI-41-7C2-Ab1 y ACI-41-7C2-Ab2 de acuerdo con lo dado por las SEQ ID NOs: 18, 19, 20, son empleados en terapia, en particular en terapia con seres humanos, para mejorar o mitigar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o estados asociados con la proteína tau como ser, por ejemplo, el deterioro o la pérdida de funciones cognitivas entre las que se incluyen el razonamiento, el juicio situacional, la memoria, el aprendizaje, la navegación espacial, etc.
En una forma de realización específica (67) de la invención, los péptidos de unión y los anticuerpos que comprenden al menos uno o la totalidad de los CDRs de cadena ligera de anticuerpos ACI-35-2A1-AM ; ACI-35-2A1-Ab2; : ACI-35- 4A6-AM ; ACI-35-4A6-Ab2; ACI-35-1 D2-Ab1 ; ACI-35-2G5-AM ; de acuerdo i con lo dado por las SEQ ID NOs: 73-75, 81-83, 93-95, 101-103, 106-108, y/o al menos uno o la totalidad de los CDRs de cadena pesada de anticuerpos ACI-35-2A1-Ab1 ; ACI-35-2A1-Ab2; ACI-35- A6-AM ; ACI-35^1A6-Ab2; ACI-35-1 D2-Ab1 ; ACI-35-2G5-Ab1 ; de acuerdo con lo dado por las SEQ ID NOs: 70-72, 78-80, 89-91 , 98-100, son empleados en terapia, en particular en terapia con seres humanos, para mejorar o mitigar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o estados asociados con la proteína tau como ser, por ejemplo, el deterioro o la pérdida de funciones cognitivas entre las que se incluyen el razonamiento, el juicio situacional, la memoria, el aprendizaje, la navegación espacial, etc.
En una forma de realización específica (68) de la invención, los péptidos de unión y los anticuerpos que comprenden al menos uno o la totalidad de los CDRs de cadena ligera de anticuerpos ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3 de acuerdo con lo dado por las SEQ ID NOs: 106-108, y/o al menos uno o la totalidad de los CDRs de cadena pesada de anticuerpos ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3; de acuerdo con lo dado por las SEQ ID NOs: 89, 115 y 91 , son empleados en terapia, en particular en terapia con seres humanos, para mejorar o mitigar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o estados asociados con la proteína tau como ser, por ejemplo, el deterioro o la pérdida de funciones cognitivas entre las que se incluyen el razonamiento, el juicio situacional, la memoria, el aprendizaje, la navegación espacial, etc.
La unión de los péptidos o anticuerpos de acuerdo con las formas de realización anteriores en ovillos de tau y pTau en el cerebro puede ser determinada mediante la aplicación de una prueba de inmunorreactividad de proteína de partes elegidas de cerebro y por transferencia Western de homogenatos de tejido cerebral, respectivamente, de acuerdo con lo descripto en los Ejemplos.
En otra forma de realización (69), la presente invención provee una composición farmacéutica que comprende un péptido de unión o una parte funcional de él, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de él, o un polinucleótido, de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores, o una combinación de ellos, en uná cantidad efectiva desde el punto de vista terapéutico junto con un portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
En una forma de realización (70), el péptido de unión o una parte funcional i de él, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclohal o una parte funcional de él, o un polinucleótido, o una composición farmacéutica, de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores, o una combinación de ellos, es empleado en terapia, en particular en terapia con humanos para el tratamiento o mitigación de los síntomas de enfermedades o trastornos asociados con la proteína tau que incluyen trastornos neurodegenerativos tales como las tauopatías.
De esta forma, los péptidos de unión, los anticuerpos y/o las composiciones farmacéuticas de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores pueden ser usados (71 ) para retardar o detener el avancé de una enfermedad, trastorno o estado asociado a la proteína tau, mediante ' la administración de dichos péptidos de unión, anticuerpos y/o composiciones farmacéuticas a una animal, en particular a un mamífero, en particular a un ser humano, que sufra de una enfermedad o estado como este.
Además, los péptidos de unión, los anticuerpos y/o las composiciones farmacéuticas de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores pueden ser usados (72) para mejorar o mitigar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o estados asociados a la proteína tau, como ser, por ejemplo, el deterioro o la pérdida de funciones cognitivas que incluyen el razonamiento, el juicio situacional, la capacidad de memoria, el aprendizaje, la navegación espacial, etc., mediante la administración de dichos péptidos de unión, anticuerpos y/o composiciones farmacéuticas a una animal, en particular a un mamífero, en particular a un ser humano, que sufra de una enfermedad o estado como este.
En una forma de realización (73), el péptido de unión o una parte funcional de él, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclohal o una parte funcional del él, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores, o una combinación de ellos, es usado en el tratamiento de enfermedades y t Irastornos que son provocados por la formación de lesiones neurofibrilares o están asociados con ella, donde la patología cerebral predominante en tauopatía comprende un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran coexistencia con patologías tau y amiloide que incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, enfermedad de i Alzheimer, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, demencia pugilística, síndrome de Down, enfermedad de Gerstmann-Stráussler-Scheinker, miositis por cuerpos de inclusión y angiopatía amiloide cerebral por proteína priónica, lesión; cerebral traumática y otras enfermedades o trastornos que no muestran una patología amiloide distinta que incluyen, pero sin que la enumeración sea taxativa, esclerosis lateral amiotrófica/complejo parkinsonismo-demencia dé Guam, enfermedad neuromotriz no Guam con ovillos neurofibrilares, demencia con gránulos argirofílicos, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17, enfermedad de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Niemann-Pick, tipo C, degeneración palido-ponto-nigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, demencia por ovillos neurofibrilares, parkinsonismo postencefálico, distrofia miotónica.
En una forma de realización (74), el péptido de unión o una parte! funcional de él, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una i parte funcional de él, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores, o una combinación de ellas, es usado en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
En una forma de realización (75) de la invención, se provee un método para modular los niveles de proteína tau soluble y/o insoluble, en particular en el cerebro, en particular en la corteza cerebral y/o en el hipocampo de un animal, en particular un mamífero o un ser humano, que comprende la administración a dicho animal, en particular a dicho mamífero o ser humano, del péptido de unión o una parte funcional de él, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de él, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores, o una combinación de ellas.
En un aspecto, la modulación se refiere a la reducción de los niveles de la proteína tau soluble, en particular de la proteína tau fosforilada soluble, en el cerebro, en particular en la corteza cerebral y/o el hipocampo, de un animal, en particular un mamífero o un ser humano que contiene niveles incrementados de la proteína tau soluble y/o la proteína tau fosforilada soluble.
En una forma de realización (76) de la invención, se provee un método para reducir los niveles de la proteína tau insoluble, en particular de filamentos helicoidales pareados que contienen proteína tau hiperfosforilada (pTau PHF), en el cerebro, en particular en la corteza cerebral y/o en el hipocampo de un animal, en particular un mamífero o un ser humano que contenga niveles aumentados de la proteína tau insoluble, en particular de los filamentos helicoidales pareados de proteína tau (pTau PHF), que comprende la administración a dicho animal, en particular a dicho mamífero o ser humano, del péptido de unión o úna parte funcional de él, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo m noclonal o una parte funcional de él, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores, o una combinación de ellas.
En una forma de realización (77), la presente invención se refiere a un método para retardar o detener el avance de una enfermedad, trastorno o estado asociado con la proteína tau, en particular de un mamífero o de un ser humano, que comprende la administración a dicho animal, en particular a dicho mamífero o ser humano, que sufre de una enfermedad o estado como este, del péptido de unión o una parte funcional de él, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de él, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores, o una combinación de ellos.
En una forma de realización (78), la presente invención se refiere a un método para mejorar o mitigar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o estados asociados con la proteína tau, como ser, por ejemplo, el deterioro o la pérdida de funciones cognitivas que incluyen el razonamiento, el juicio situacional, la capacidad de memoria, el aprendizaje, la navegación espacial, etc., en un animal, en particular de un mamífero o de un ser humano, que comprende la administración a dicho animal, en particular a dicho mamífero o ser humano, que sufre de una enfermedad o estado como este, del péptido de unión o una parte funcional de él, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de él, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores, o una combinación de ellos.
En una forma de realización (79), la presente invención se refiere a un método para conservar o aumentar la capacidad de memoria cognitiva en un mamífero que sufre de una tauopatía.
En otra forma de realización (80) de la presente invención, se provee un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con la proteína tau que incluye una enfermedad o un trastorno neurodegenerativo como ser una tauopatía que comprende la administración a un animal, en particular a un mamífero, pero en especial a un ser humano, que sufre de una enfermedad o estado como este, del péptido de unión o una parte funcional de él, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de él, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores, o una combinación de ellos.
En una forma de realización (81) de la invención, se provee un método para el tratamiento de enfermedades y trastornos que son causados por la formación de lesiones neurofibrilares o están asociados con ella, donde la patología cerebral predominante en tauopatía comprende un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran coexistencia con patologías tau y amiloides que incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, demencia pugilística, síndrome de Down, enfermedad de Gerstmann-Stráussier-Scheinker, miositis por cuerpos de inclusión y angiopatía amiloide cerebral por proteína priónica, lesión cerebral traumática y otras enfermedades o trastornos que no muestran una patología amiloide distinta que incluyen, pero sin que la enumeración sea taxativa, esclerosis lateral amiotrófica/complejo parkinsonismo-demencia de Guam, enfermedad neuromotriz no Guam con ovillos neurofibrilares, demencia con gránulos argirofílicos, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17, enfermedad de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Niemann-Pick, tipo C, degeneración palido-ponto-nigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, demencia por ovillos neurofibrilares, parkinsonismo postencefálico, distrofia miotónica, método que comprende la administración a una animal, en particular a una mamífero, pero en especial a un ser humano, que sufre de una enfermedad o trastorno como estos, del péptido de unión o una parte funcional de él, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo mpnoclonal o una parte funcional de él, o un polinucleotido o una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores, o una combinación de ellos.
En otra forma de realización (82) de la invención, se provee un método para inducir una respuesta inmune pasiva en un animal, en particular en un mamífero o en un ser humano, que sufre de un trastorno neurodegenerativo como ser una tauopatía mediante la administración a dicho animal o ser humano del péptido de unión o de una parte funcional de él, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de él, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización anteriores, o una combinación de ellos.
En otra forma de realización más (83) de la invención, se proporciona un método para diagnosticar una enfermedad, trastorno o condición asociados con la i proteína tau en un paciente que comprende detectar la unión inmunoespecífica de un péptido de unión o uno de sus fragmentos activos, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con cualquiera de las formas de realización precedentes, a un epítope de la proteina tau en una muestra o in situ que incluye las etapas de a. poner en contacto la muestra o una parte del cuerpo específica o área corporal sospechada de contener la proteína tau con un péptido de unión o uno de sus fragmentos, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho péptido de unión o anticuerpo o su fragmento se une con un epítope de la proteína tau; b. permitir que dicho péptido de unión, en particular dicho anticuerpo, en particular dicho anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, se una con la proteína tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico; y d. correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de la proteína tau en la muestra o parte o área específica del cuerpo.
En otra forma de realización más (84) de la invención, se proporciona un método para diagnosticar una predisposición a una enfermedad, trastorno o condición asociado a la proteína tau en un paciente que comprende detectar la unión inmunoespecífica de un péptido de unión o uno de sus fragmentos activos, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con cualquiera de las formas de realización i precedentes, a un epítope de la proteína tau en una muestra o in situ, que incluye las etapas de a. poner en contacto la muestra o una parte corporal o área corporal específicas sospechadas de contener el antígeno tau con un péptido de unión o uno de sus fragmentos activos, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido o su fragmento se une con un epítope de la proteína tau; i b. permitir que dicho péptido de unión, en particular dicho anticuerpo, en particular dicho anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, se una con el antígeno tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico; y d. correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la i presencia o ausencia de antígeno tau en la muestra o parte o área específica del cuerpo; e. comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico a un valor de control i normal; en donde un aumento en la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o condición asociada a la proteína tau.
En una forma de realización (85) de la invención, se proporciona un método para controlar una enfermedad residual mínima en un paciente después del tratamiento con el péptido de unión o una de sus partes funcionales, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, o un polinucleótido, o una composición farmacéutica, de acuerdo con cualquiera de las formas de realización precedentes, en donde dicho método comprende: a. poner en contacto la muestra o una parte corporal o área; corporal i específicas sospechadas de contener el antígeno tau con el péptidó de unión o una de sus partes funcionales, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido o su fragmento se une con un epítope de la proteína tau; b. permitir que dicho péptido de unión, en particular dicho anticuerpo, en particular dicho anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, se una con el antígeno tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico; y d. correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de antígeno tau en la muestra o parte o área específica del cuerpo, 1 e. comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico a un valor de control normal, en donde un aumento en la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente todavía padece de una enfermedad residual mínima.
En una forma de realización (86), se proporciona un método para predecir la respuesta de un paciente en tratamiento con el péptido de unión o una de sus partes funcionales, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, o un polinucleótido, o una composición farmacéutica, de acuerdo con cualquiera de las formas de realización precedentes, que comprende a. poner en contacto la muestra o una parte corporal o área corporal específicas sospechadas de contener el antígeno tau con un péptido de unión o uno de sus fragmentos activos, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales de acuerdo con cualquiera de las formas de realización precedentes, cuyo péptido o su fragmento se une con un epítope de la proteína tau; b. permitir que dicho péptido de unión, en particular dicho anticuerpo, en particular dicho anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, se una con el antígeno tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico; y d. correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de antígeno tau en la muestra o parte o área específica del cuerpo, e. comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico antes y después del inicio del tratamiento, en donde una disminución de la cantidad de dicho agregado indica que dicho paciente tiene un alto potencial de responder al tratamiento.
En otra forma de realización (87), la invención se refiere a un kit de ensayo para detección y diagnosis de enfermedades, trastornos o condiciones asociados con la proteína tau que comprende un péptido de unión o uno de sus fragmentos activos, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con cualquiera de las formas de realización precedentes.
En una forma de realización (88), dicho kit de ensayo comprende un recipiente que llevar uno o varios péptidos de unión o sus fragmentos activos, en I particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales, de acuerdo con cualquiera de las formas de realización precedentes e instrucciones de uso de los péptidos de unión o anticuerpos a los fines de unirse con el antígeno tau para formar un complejo inmunológico y detectar la formación del complejo inmunológico de modo que la presencia o la ausencia del complejo inmunológico se correlacione con la presencia o! ausencia del antígeno tau.
En otra forma de realización más (89), la presente invención se refiere a un epítope seleccionado del grupo que consiste en Tau aa 15-20 de proteína tau humana mostrada en SEQ ID NO: 67 que comprende Tyr fosforilada en la posición 18 (Y18), Tau aa 405-412 que comprende Ser fosforilada en la posición 409 (pS409), Tau aa 405-411 que comprende Ser fosforilada en la posición 409 (pS409); y Tau aa 208-218 que comprende Thr fosforilada en la posición 212 (pT212) y Ser fosforilada en la posición 214 (pS214). ' En una forma de realización (90), dicho epítope consiste en Tau aa 15-20 con Tyr fosforilada en la posición 18 (Y18).
En una forma de realización (91 ), dicho epítope consiste en Tau aa 405-412 con Ser fosforilada en la posición 409 (pS409).
En una forma de realización (92), dicho epítope consiste en Tau aa 405-411 con Ser fosforilada en la posición 409 (pS409).
En otra forma de realización (93), la invención se refiere a una línea celular que produce un péptido de unión o uno de sus fragmentos activos, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales de acuerdo con cualquiera de las formas de realización precedentes.
En una forma de realización (94), la invención se refiere a una línea celular que es la línea celular de hibridoma 6C10F9C12A11 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3079.
En una forma de realización (95), la invención se refiere a una línea celular que es la línea celular de hibridoma 6C10E5E9C12 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3081.
En una forma de realización (96), la invención se refiere a una línea celular que es la línea celular de hibridoma 6H1A11C11 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3080. ¡ En una forma de realización (97), la invención se refiere a una línea celular que es la línea celular de hibridoma 6H1 G6E6 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3088.
I En una forma de realización (98), la invención se refiere a una línea celular que es la línea celular de hibridoma 2B6A10C11 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3084.
En una forma de realización (99), la invención se refiere a una línea celular que es la línea celular de hibridoma 2B6G7A12 depositada el 10 de marzo de 2010 como DSM ACC3087.
En una forma de realización (100), la invención se refiere a una línea celular que es la línea celular de hibridoma 3A8A12G7 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3086.
En una forma de realización (101 ), la invención se refiere a una línea celular i que es la línea celular de hibridoma 3A8E12H8 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3085.
En una forma de realización (102), la invención se refiere a una línea celular que es la línea celular de hibridoma 7C2(1 )F10C10D3 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3082.
En una forma de realización ( 03), la invención se refiere a una línea celular que es la línea celular de hibridoma 7C2(2)B9F11 D5 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3083.
En una forma de realización (103a), la invención se refiere a una línea celular, que es una línea celular de hibridoma A4-4A6-48 depositada , el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3136.
En una forma de realización (103b), la invención se refiere a una línea celular, que es una línea celular de hibridoma A6-2G5-30 depositada, el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3 37.
En una forma de realización (103c), la invención se refiere a una línea celular, que es una línea celular de hibridoma A6-2G5-41 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3138.
En una forma de realización (103d), la invención se refiere a una línea celular, que es una línea celular de hibridoma A4-2A1-18 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3139. ! En una forma de realización (103e), la invención se refiere a una línea celular, que es una línea celular de hibridoma A4-2A1-40 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3140.
En una forma de realización (103e), la invención se refiere a una línea celular, que es una línea celular de hibridoma A6-1 D2-12 depositada el 6 de septiembre de 2011 como DSM ACC3141. ¡ En una forma de realización (104), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleotido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 6C10F9C12A11 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3079 usando i a. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 54 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID! NO: 53 y SEQ ID NO: 54 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una forma de realización (105), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de i cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleotido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 6C10E5E9C12 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3081 usando a. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una forma de realización (106), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleotido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 6H1A11 C11 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3080 usando a. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 50 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 46 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una forma de realización (107), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleotido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 6H1 G6E6 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3088 usando a. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 50 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 46 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundó dominio de unión.
En una forma de realización (108), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleotido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 2B6A10C11 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3084 usando ¡ a. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 50 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 52 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una forma de realización (109), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleotido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 2B6G7A12 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3087 usando a. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 50 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 52 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una forma de -realización (1 10), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleotido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 3A8A12G7 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3086 usando a<\. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; o a2. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 50 y un i cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 46 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una forma de realización (111 ), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleotido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 3A8E12H8 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3085 usando a<i . una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; o a2. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 50 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o : b. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 46 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundó dominio de unión.
En una forma de realización (112), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleotido ubicado en un fragmento de nucleotido que se pued'e obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 7C2(1 )F10C10D3 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3082 usando a. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 55 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una forma de realización (113), la invención se refiere a un anticuerpo i monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleotido ubicado en un fragmento de nucleotido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 7C2(2)B9F11D5 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3083 usando a. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 57 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 55 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una forma de realización (114), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleotido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma A4-2A1-18 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3139 usando 1 a. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 149 y un I cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 120, 123, 124, 136, 137, 138, 139 y 140 y un cebador 3' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID ÑOs: 131 , 134 y 141-148, para amplificación de un segundo dominio de unión.
En una forma de realización (115), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleotido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma A6-2G5-30 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3137 usando a. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 51 y 169-174 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 124, 127, y 50-158 y un cebador 3' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 130, y 159-168, para amplificación de un segundo dominio de unión.
En una forma de realización (116), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma A4-2A1-40 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3140 usando a. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 178, 179 y 180 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 , para amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 121 , 127, 139, 154, 155, y 175 y un cebador 3' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 128, 129, 147, 176, y 177, para amplificación de un segundo dominio de unión.
En una forma de realización (117), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleotido ubicado en un fragmento de nucleotido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma A6-2G5-41 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3138 usando ¡ a. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 51 y 188-192 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 , para amplificación de un primer dominio de unión; y/o i b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 120, 124, 126, 181 , 182 y 183 y un cebador 3' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 144, 145 y 184-187, para amplificación de un segundo dominio de unión.
En una forma de realización (118), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleotido ubicado en un fragmento de nucleotido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma A4-4A6-48 depositada el 30 de agosto de 201 como DSM ACC3136 usando 1 a. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 50 y 201-204 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 , para amplificación de un primer dominio de unión; y/ó b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 121 , 137, 151 y 193-197 y un cebador 3' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 131 , 141 , 144, 166, 198, 199 y 200, para amplificación de un segundo dominio de unión.
En una forma de realización (119), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una de sus partes funcionales que comprende un dominio de cadena liviana (VL) y/o un dominio de cadena pesada (VH), que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma A6-1 D2-12 depositada el 6 de septiembre de 2011 como DSM ACC3141 usando a. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 209-214, y 219-221 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 215, para amplificación de un primer dominio de unión; iy/? b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 216, 217 y 218 y un cebador 3' de SEQ ID NOs: 208, para amplificación de un segundo dominio de unión.
En una forma de realización (120), el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las formas de realización precedentes puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo anticuerpo humano, un anticuerpo de camélido, un diacuerpo, modificado o sometido a ingeniería. ' En una forma de realización (121 ), el péptido de unión o su parte ¡funcional puede ser un fragmento que comprende una cadena pesada y/o una cadena liviana, en particular una cadena pesada tal como se indica en SEQ ID NOs: 1-5 y/o una cadena liviana tal como se indica en SEQ ID NOs: 6-11 , en particular un fragmento Fab o F(ab')2.
En una forma de realización específica (122), la invención se refiere a una cadena pesada tal como se indica en SEQ ID NOs: 1-5.
En otra forma de realización específica (123), la invención se refiere a una cadena liviana tal como se indica en SEQ ID NOs: 6-11.
En una forma de realización (124), la invención proporciona un método para producir los péptidos de unión o anticuerpos de cualquiera de las formas de realización precedentes, que comprende la etapa de cultivar la línea celular de cualquiera de las formas de realización precedentes en un medio de cultivo apropiado y, opcionalmente, purificar los péptidos de unión o anticuerpo de la línea celular o medio de cultivo.
Breve descripción de las figuras y de las secuencias FIGURAS La Figura 1-1 a la figura 1-2 muestra un anticuerpo unido a una fosfo-tau en partes del cerebro de ratones biGT (tau bigénico) mediante el uso de TAUPIR.
La Figura 2 muestra un anticuerpo unido a una fosfo-tau en partes del cerebro de pacientes con EA y tauopatía mediante el uso de TAUPIR con anticuerpo ACI-36-3A8-Ab1.
La Figura 3 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo anti-tau después de estudio in vivo de una (1 ) semana en epítope pTau aT231 médiante el uso de MSD.
La Figura 4 representa un diagrama que demuestra cómo fueron preparados los cerebros para fracciones de proteína tau solubles e insolubles en sarcosilo (SinT).
La Figura 5 muestra los resultados de la transferencia Western de epítope pTau después de un tratamiento con anticuerpo antiTau en un estudio in vivo de un (1 ) mes (Figuras 5A, 5B, 5C, 5G, 5H, 51) o de tres (3) meses (Figuras 5D, 5E, 5F).
La Figura 6-1 a la figura 6-8 muestra los resultados de la transferencia Western de epítope pTau después del tratamiento con anticuerpo antiTau para un estudio in vivo de tres (3) meses mediante el uso de ratones bigénicos biGT.
La Figura 7 muestra IHC después del tratamiento con anticuerpo antiTau con ACI-36-2B6-Ab1 en un estudio in vivo de tres (3) meses.
La Figura 8 muestra IHC después del tratamiento con anticuerpo antiTau con ACI-36-3A8-Ab1 en un estudio in vivo de tres (3) meses.
La Figura 9 muestra los resultados del test de Morris Water-Mazé después del tratamiento con anticuerpo antiTau con ACI-36-2B6-A en un estudio in vivo de tres (3) meses.
La Figura 10 muestra los resultados del test de Morris Water-Maze después del tratamiento con anticuerpo antiTau con ACI-36-3A8-Ab1 en un estudio in vivo de tres (3) meses.
SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-36-3A8-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma 3A8A12G7.
SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-36-2B6-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma 2B6A10C11.
SEQ ID NO: 3 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-36-6H1-Ab1 y ACI-36-6H1-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 6H1A11C11 y 6H1G6E6, respectivamente.
SEQ ID NO: 4 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-33-6C10-Ab2 y ACI-33-6C10-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma 6C10E5E9C12 y 6C10F9C12A11 , respectivamente.
SEQ ID NO: 5 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-41-7C2-Ab1 y ACI-41-7C2-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 7C2(1 )F10C10D3 y 7C2(2)B9F11 D5, respectivamente.
SEQ ID NO: 6 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-36-3A8-Ab1vK-AD y ACI-36-3A8-Ab2vK-AD producido por la línea celular de hibridoma 3A8A12G7 y 3A8E12H8, respectivamente.
SEQ ID NO: 7 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-36-3A8-Ab1VK-G y ACI-36-3A8-Ab2vK-G producido por la línea celular de hibridoma 3A8A12G7 y 3A8E12H8, respectivamente.
SEQ ID NO: 8 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-36-2B6-Ab1 y ACI-36-2B6-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 2B6A10C11 y 2B6G7A12, respectivamente.
SEQ ID NO: 9 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-36-6H1-Ab1 y ACI-36-6H1-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 6H1A11C11 y 6H1G6E6, respectivamente.
SEQ ID NO: 10 representa la secuencia de aminoácidos de, la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-33-6C10-Ab2 y ACI-33-6C10-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma 6C10E5E9C12 y 6C10F9C12A11 , respectivamente.
SEQ ID NO: 11 representa la secuencia de aminoácidos de la región i variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-41-7C2-Ab1 y i ACI-41-7C2-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 y 7C2(2)B9F11 D5, respectivamente.
SEQ ID NO: 12 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-36-3A8-Ab1 , ACI-36-3A8-Ab2, ACI-36-2B6-Ab1 , ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36^6H1-Ab1 y ACI-36-6H1-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 3Á8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11 , 2B6G7A12, 6H1A11C11 y 6H1G6E6, respectivamente.
SEQ ID NO: 13 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal Ab1 , ACI-36-3A8-Ab2, ACI-36-2B6-Ab1 , ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36^6H1-Ab1 y ACI-36-6H1-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11 , 2B6G7A12, 6H1 A11C11 y 6H1G6E6, respectivamente.
SEQ ID NO: 14 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI--36-3A8-Ab1 , ACI-36-3A8-Ab2, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1-AM y ACI-36-6H1-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11 , 2B6G7A12, 6H1A11C11 y 6H1G6E6, respectivamente.
SEQ ID NO: 15 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-33-6C10- Ab2 y ACI-33-6C10-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma 6C10E5E9C12 y 6C10F9C12A11 , respectivamente.
SEQ ID NO: 16 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-33-6C10-Ab2 y ACI-33-6C10-Ab1 producido por la línea celular de ¡hibridoma 6C10E5E9C12 y 6C 0F9C12A11 , respectivamente.
SEQ ID NO: 17 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-33-6C10-Ab2 y ACI-33-6C10-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma 6C10E5E9C12 y 6C10F9C12A11 , respectivamente.
SEQ ID NO: 18 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI 1-7C2-Ab1 y ACI-41-7C2-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 7C2(1 )F10C10D3 y 7C2(2)B9F11 D5, respectivamente.
I SEQ ID NO: 19 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACIT41-7C2-Ab1 y ACI-41-7C2-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 7C2(1 )F10C10D3 y 7C2(2)B9F11 D5, respectivamente.
SEQ ID NO: 20 representa la secuencia de aminoácidos del CQR3 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACk41-7C2-Ab1 y ACI-41-7C2-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 7C2(1 )F10C 0D3 y 7C2(2)B9F11 D5, respectivamente.
SEQ ID NO: 21 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-36-3A8- Ab1 ??-AD y ACI— 36— 3A8— A 2vK-AD producido por la línea celular de hibridoma 3A8A12G7 y 3A8E12H8, respectivamente.
SEQ ID NO: 22 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACIi-36-3A8-Ab1 VK-AD y ACI— 36— 3A8— Ab2vK-AD producido por la línea celular de ¡hibridoma 3A8A12G7 y 3A8E12H8, respectivamente.
SEQ ID NO: 23 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACIk36-3A8-Ab1 VK-AD y ACI-36-3A8-Ab2VK-AD producido por la línea celular de hibridoma 3A8A12G7 y 3A8E12H8, respectivamente.
SEQ ID NO: 24 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-36-3A8-Ab1 VK-G y ACI— 36— 3A8— Ab2vK-G producido por la línea celular de hibridoma 3A8A12G7 y 3A8E12H8, respectivamente.
SEQ ID NO: 25 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-36-3A8-Ab1 K-G, ACI-36-3A8-Ab2VK^, ACI-36-2B6-Ab1 , ACI-36-2B6-Ab2, ; ACI-36-6H1-Ab1 y ACI-36-6H1-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11 , 2B6G7A12, 6H1A1 1 C11 y 6H1 G6E6, respectivamente.
SEQ ID NO: 26 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-36-3A8-Ab1 VK-G. ACI-36-3A8-Ab2VK-G, ACI-36-2B6-Ab1 , ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1-Ab1 y ACI-36-6H1-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11 , 2B6G7A12, 6H1A11C11 y 6H1G6E6, respectivamente.
SEQ ID NO: 27 representa la secuencia de aminoácidos del CD i R1 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACIr-36-2B6-Ab1 y ACI-36-2B6-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 2B6A10C11 y 2B6G7A12, respectivamente.
SEQ ID NO: 28 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-36-6H1-Ab1 y ACI-36-6H1-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 6H1A11C11 y 6H1G6E6, respectivamente.
SEQ ID NO: 29 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-33-6C10-Ab2 y ACI-33-6C10-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma 6C10E5E9C12 y 6C10F9C12A11 , respectivamente.
SEQ ID NO: 30 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-33-6C10-Ab2 y ACI-33-6C10-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma 6C10E5E9C12 y 6C10F9C12A11 , respectivamente.
SEQ ID NO: 31 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-33-6C10-Ab2 y ACI-33-6C10-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma 6C10E5E9C12 y 6C10F9C12A11 , respectivamente.
SEQ ID NO: 32 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ???-^1-702- Ab1 y ACI-41-7C2-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 7C2(1 )F10C10D3 y 7C2(2)B9F11 D5, respectivamente.
SEQ ID NO: 33 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-41-7C2-Ab1 y ACI-41-7C2-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 7C2(1 )F10C10D3 y 7C2(2)B9F11 D5, respectivamente.
SEQ ID NO: 34 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-41-7C2-Ab1 y ACI-41-7C2-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 7C2(1 )F10C10D3 y 7C2(2)B9F11 D5, respectivamente.
SEQ ID NO: 35 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-36-3A8-Ab1 y ACI-36-3A8-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 3A8A12G7 y 3A8E12H8, respectivamente.
SEQ ID NO: 36 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-36-2B6-Ab1 y ACI-36-2B6-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 2B6A10C11 y 2B6G7A12, respectivamente.
SEQ ID NO: 37 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-36-6H1-Ab1 y ACI-36-6H1-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 6H1A11 C1 1 y 6H1 G6E6, respectivamente.
SEQ ID NO: 38 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-33-6C10-Ab2 y ACI-33- 6C10-At>1 producido por la línea celular de hibridoma 6C10E5E9C12 y 6C10F9C12A11 , respectivamente.
SEQ ID NO: 39 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-41-7C2-Ab1 y ACI-41-7C2-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 7C2(1 )F1QC10D3 y 7C2(2)B9F11 D5, respectivamente.
SEQ ID NO: 40 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-36-3A8-Ab1 yj ACI-36-3A8-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 3A8A12G7 y 3Á8E12H8, respectivamente.
I SEQ ID NO: 41 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable I de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-36-3A8-Ab1 y ACI-36-3A8-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 3A8A12G7 y 3A8E12H8, respectivamente.
I SEQ ID NO: 42 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-36-2B6-Ab1 y ACI-36-2B6-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 2B6A10C11 :y 2B6G7A12, respectivamente.
SEQ ID NO: 43 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-36-6H1-Ab1 y ACI-36-6H1-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 6H1A11C11 y 6H1G6E6, respectivamente.
SEQ ID NO: 44 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-33-6C10-Ab2 y ACI-33- 6C10-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma 6C10E5E9C12 y 6C10F9C12A11 , respectivamente.
SEQ ID NO: 45 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-41-7C2-Ab1 y ACI-41 -7C2-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma 7C2(1 )F10C10D3 y 7C2(2)B9F11 D5, respectivamente. ! SEQ ID NO: 46 - 57 representa secuencias de nucleótidos de cebadores delanteros e inversos VH/VK SEQ ID NO: 58 representa la secuencia de aminoácidos de Tau 379-408 [pS396, pS404] SEQ ID NO: 59 representa la secuencia de aminoácidos de Tau 5-20 [pY18 ] 1 SEQ ID NO: 60 representa la secuencia de aminoácidos de Tau 206-221 [pT212, pS214] SEQ ID NO: 61 representa la secuencia de aminoácidos de Tau 196-21 1 [pS202, pT205] ¡ SEQ ID NO: 62 representa la secuencia de aminoácidos de Tau 393-408 [pS396, pS404] SEQ ID NO: 63 representa la secuencia de aminoácidos de Tau 401-418 [pS404, pS409] SEQ ID NO: 64 representa la secuencia de aminoácidos de Tau 200-216 [pS202+ pT205 & pT212+pS214] SEQ ID NO: 65 representa la secuencia de aminoácidos de Tau 407-418 [pS409] SEQ ID NO: 66 representa la secuencia de aminoácidos de Tau 399-408 [pS404] SEQ ID NO: 67 representa la secuencia de aminoácidos de la isoforma más larga de Tau humana (441 aa), también denominada Tau40 ! SEQ ID NO: 68 representa la secuencia de aminoácidos de 1 la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-r4A6-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma A4-4A6-18.
SEQ ID NO: 69 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma A4-4A6-18.
SEQ ID NO: 70 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI÷35— 4A6-Ab1 SEQ ID NO: 71 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 SEQ ID NO: 72 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 SEQ ID NO: 73 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 SEQ ID NO: 74 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI 35-4A6-Ab1 SEQ ID NO: 75 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 SEQ ID NO: 76 representa la secuencia de aminoácidos de la región váriable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1 D2-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma A6-1 D2-12.
SEQ ID NO: 77 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1 D2-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma A6-1 D2-12.
SEQ ID NO: 78 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACk35-1 D2-Ab1.
SEQ ID NO: 79 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1 D2-Ab1.
SEQ ID NO: 80 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1 D2-Ab1 SEQ ID NO: 81 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1 D2-Ab1 SEQ ID NO: 82 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1 D2-Ab1 SEQ ID NO: 83 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1 D2-Ab1 SEQ ID NO: 84 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma A4-4A6-18.
SEQ ID NO: 85 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma A4-4A6-18.
SEQ ID NO: 86 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal AC 1-35-1 D2-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma A6-1 D2-12.
SEQ ID NO: 87 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1 D2-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma A6-1 D2-12.
SEQ ID NO: 88 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1 , ACI-35-2A1-Ab2, y ACI-35-4A6-Ab2, respectivamente, producido por la línea celular de hibridoma A4-2A1-18, A4-2A1-40 y A4-4A6-48, respectivamente.
SEQ ID NO: 89 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1 , ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35-4A6-Ab2, ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
SEQ ID NO: 90 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI^35-2A1-Ab1 , ACI-35-2A1-Ab2, y ACI-35-4A6-Ab2, respectivamente. ¦ SEQ ID NO: 91 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1 , ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35-4A6-Ab2, ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
SEQ ID NO: 92 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma A4-2A1-40 SEQ ID NO: 93 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI^35-2A1-Ab2.
SEQ ID NO: 94 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI÷35-2A1-Ab2. ! SEQ ID NO: 95 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab2. | SEQ ID NO: 96 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-A producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-08.
SEQ ID NO: 97 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-08.
SEQ ID NO: 98 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI÷35-2G5-Ab1.
SEQ ID NO: 99 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI -35-2G5-Ab1.
SEQ ID NO: 100 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI 35-2G5-Ab1. ! SEQ ID NO: 101 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab1. j SEQ ID NO: 102 representa la secuencia de aminoácidos del C R2 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab1.
I SEQ ID NO: 103 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ÁCI-35-2G5-Ab1.
SEQ ID NO: 104 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente, producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-30 y A6-2G5-41 , respectivamente.
SEQ ID NO: 105 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente, producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-30 y A6-2G5-41 , respectivamente.
SEQ ID NO: 106 representa la secuencia de aminoácidos del CDR1 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
SEQ ID NO: 107 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5- I AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
SEQ ID NO: 108 representa la secuencia de aminoácidos del CDR3 de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI^35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
SEQ ID NO: 109 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1 , ACI-35-2A1-Ab2, y ACI-35-4A6-Ab2, respectivamente, producido por la línea celular de hibridoma A4-2A1-18, A4-2A1-40 y A4-4A6-48, respectivamente.
SEQ ID NO: 110 representa la secuencia de nucleótidos de ;la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-^35-2A1-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma A4-2A1-40.
SEQ ID NO: 111 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB1 producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-08.
SEQ ID NO: 112 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB1 producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-08.
/ SEQ ID NO: 113 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente, producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-30 y A6-2G5-41 , respectivamente. , SEQ ID NO: 114 representa la secuencia de nucleótidos de ¡ la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente, producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-30 y A6-2G5-41 , respectivamente.
SEQ ID NO: 115 representa la secuencia de aminoácidos del CDR2 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3.
SEQ ID NO: 116 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI^35-2A1- I Ab1 producido por la línea celular de hibridoma A4-2A1-18.
I SEQ ID NO: 117 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1 producido por la línea celular de hibridoma A4-2A1-18.
SEQ ID NO: 1 18 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-i4A6-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma A4-4A6-48.
SEQ ID NO: 119 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena liviana (VK) de anticuerpo monoclonal ACI^35^4A6-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma A4-4A6^48.
SEQ ID NO: 120 - 121 representa secuencias de nucleótidos de cebadores delanteros e inversos VH/VK.
Definiciones de los términos Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína", de la forma empleada en la presente, son indistintos y son definidos de manera que hagan referencia a una biomolécula compuesta por aminoácidos unidos por una unión de péptido.
Los términos "péptidos" o "péptido de unión" son utilizados en la presente en forma indistinta y hacen referencia a cadenas de aminoácidos (típicamente L-aminoácidos) cuyos carbonos alfa están unidos a través de uniones de péptido formadas por una reacción de condensación entre el grupo carboxilo del carbono alfa de un aminoácido y el grupo amino del carbono alfa de otro aminoácido. El aminoácido terminal en un extremo de la cadena (es decir, la terminal de amino) tiene un grupo amino libre, mientras que el aminoácido terminal en el otró extremo de la cadena (es decir, la terminal de carboxilo) tiene un grupo carboxilo libre. Como tal, el término "amino terminal" (que se abrevia N-termínal) hace referencia al grupo amino alfa libre sobre el aminoácido en la terminal de amino del péptido, o al grupo amino alfa (grupo ¡mino cuando participa en una unión de péptido) de un aminoácido en cualquier otro lugar dentro del péptido. De forma similar, el término "carboxilo terminal" (que se abrevia C-terminal) hace referencia al grupo carboxilo libre sobre el aminoácido en la terminal de carboxilo de un péptido, o al grupo carboxilo de un aminoácido en cualquier otro lugar dentro del péptido. Un péptido de unión constituye anticuerpos tales como anticuerpos policlonales o monoclonales, anticuerpos humanos o humanizados, diacuerpos, anticuerpos de camélidos, etc, o partes funcionales de él de acuerdo con lo definido en la presente.
Los términos "fragmento de él", "su fragmento" o "fragmento" de la forma utilizada en la presente, hacen referencia a un fragmento del péptido funcional que tiene esencialmente la misma actividad (biológica) que los péptidos definidos en la presente (por ejemplo, de acuerdo con lo mostrado en las SEQ ID NOs159-66 en la tabla 1 , respectivamente), es decir que dichos fragmentos aún son capaces de suscitar una respuesta inmune muy específica, en particular específica respecto de su conformación, en un organismo, pero en particular dentro de un animal, en particular de un mamífero o de un ser humano, que es muy efectiva y capaz de evitar o mitigar tauopatías o los síntomas asociados con tauopatías. En particular, dichos fragmentos aún contienen el o los fosfoepítopes patológicos específicos del péptido tau, de acuerdo con lo utilizado y definido en la presente.
Típicamente, los aminoácidos que conforman un péptido están numerados en orden, comenzando en la terminal de amino y aumentando en la dirección a la terminal de carboxilo del péptido. De esta manera, cuando se dice que un aminoácido "sigue" a otro, ese aminoácido está ubicado más cerca de lá terminal de carboxilo del péptido que del aminoácido precedente.
El término "residuo" es utilizado en la presente para hacer réferencia a un aminoácido que es incorporado en un péptido por una unión de amida. Como tal, el aminoácido puede presentarse en forma natural como aminoácido o, a menos que se lo limite de otra forma, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que funcionan de una forma similar a los aminoácidos que se presentan en forma natural (es decir, los miméticos de aminoácidos). Además, un mimético de unión de amida incluye modificaciones estructurales de péptido, que resultan conocidos para los expertos en el arte.
La expresión "que esencialmente consiste/n en" es empleada en la presente de manera que quede excluido cualquier elemento que sustahcialmente altere las propiedades esenciales de los péptidos a los que hace referencia la frase. De esta manera, la descripción de un péptido "que esencialmente consiste en..." excluye cualquier sustitución, agregado o eliminación de aminoácido que sustancialmente altere la actividad biológica de ese péptido.
Además, el experto en el arte sabrá reconocer que, de acuerdo con lo mencionado con anterioridad, cada sustitución, eliminación o agregado que altere, agregue o elimine un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (típicamente menos del 5%, más típicamente menos del 1%) en una secuencia codificada, es una variante, modificada en forma conservadora donde las alteraciones dan como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido similar desde el punto de vista químico. Las tablas de sustitución conservadoras que proveen aminoácidos similares en cuanto a su función resultan bien conocidas en el arte. Los siguientes seis grupos contienen, cada uno de ellos, aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) alanina (A), serina (S), treonina (T); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) arginina (R), lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); y 6) fenilalanina (F); tirosina (Y), triptófano (W).
Las expresiones "aislado" o "biológicamente puro" hacen referencia al material que es sustancial o esencialmente libre de componentes que por lo general lo acompañan de la forma que se encuentra en su estado original. De esta manera, los péptidos descriptos en la presente no contienen materiales que en forma normal estén asociados con su entorno in situ. En general, los péptidos I inmunogénicos aislados descriptos en la presente son puros en al menos alrededor el 80%, de forma usual al menos alrededor el 90%, y de preferencia, al menos alrededor el 95% de acuerdo con lo medido por intensidad de banda en un gel de tinción con plata.
La pureza o la homogeneidad de la proteína pueden ser indicadas por una cantidad de métodos conocidos en el arte, como ser electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguido de visualización de tinción. Para ciertos propósitos, será necesaria una alta resolución y HPLC o medios similares para purificación. ' Cuando los péptidos inmunogénicos presentan una longitud relativamente corta (es decir, menor que alrededor de 50 aminoácidos), con frecuencia son sintetizados mediante el uso de técnicas químicas de síntesis de péptidos I estándar.
La síntesis de fase sólida donde el aminoácido de C— terminal de la secuencia está unido a un soporte insoluble seguido del agregado secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia es un método preferido para la síntesis química de los péptidos inmunogénicos descriptos en la presente. Las técnicas para síntesis de fase sólida resultan conocidas para los expertos en el arte.
En forma alternativa, los péptidos inmunogénicos descriptos en la presente son sintetizados mediante el uso de metodología de ácido nucleico recombinante. En general, esto implica la creación de una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, coloca el ácido nucleico en un cásete de expresión bajo el control de un promotor de péptido, expresa el péptido en un huésped, aisla el péptido o polipéptido expresado y, de requerirse, renaturaliza el péptido. En la literatura se encuentran técnicas suficientes para guiar al experto en el arte a través de dichos procedimientos.
Una vez que los péptidos recombinantes expresados pueden ser purificados de acuerdo con los procedimientos estándar, que incluyen precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares. Las composiciones sustancialmente puras con una homogeneidad de alrededor del 50% al 85% resultan de preferencia, y con una homogeneidad de entre 80% y 95% o más resultan de mayor preferencia para ser utilizadas como agentes terapéuticos.
El experto en el arte reconocerá que, después de la síntesis química, la expresión biológica o la purificación, los péptidos inmunogénicos pueden poseer una conformación sustancialmente diferente de las conformaciones origínales de los péptidos constituyentes. En este caso, con frecuencia es necesario desnaturalizar y reducir el péptido antiproliferatívo y luego hacer que el péptido se repliegue en la conformación preferida. Los métodos para reducir y desnaturalizar proteínas e inducir el repliegue resultan conocidos para los expertos en el arte.
La antigenicidad de la proteína purificada puede ser confirmada, por ejemplo, mediante la demostración de la reacción con suero inmune o bien, con antísueros producidos contra la proteína propiamente dicha.
Los términos "un" y "el" con sus respectivos femeninos de la forma utilizada en la presente son definidos de manera que signifiquen "uno o más" e incluyen los plurales a menos que el contexto resulte inapropiado.
Los términos "detectar" o "detectado" de la forma utilizada en la presente significan el uso de técnicas conocidas para detectar moléculas biológicas como ser métodos inmunoquímicos o histológicos y hacer referencia a la determinación cuantitativa o cualitativa de la presencia o concentración de la biomolécula en investigación.
El término "aislada" significa una molécula biológica libre de al menos algunos de los componentes en los que se presenta en forma natural.
Los términos "anticuerpo", "anticuerpos" o "partes funcionales de él", de la forma empleada en la presente, consisten en un término reconocido en el arte y hacen referencia a moléculas o fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos, en particular a moléculas de inmunoglobulina y a porciones activas desde el punto de vista inmunológico de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión que se une a un antígeno en forma inmunoespecífica. La inmunoglobulina de acuerdo con la invención puede ser de cualquier tipo (IgG, Ig , IgD, IgE, IgA y IgY) o clase (lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 y lgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
Dentro del alcance de la presente invención, el término "anticuerpos" pretende incluir anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, de cadena simple, biespecíficos, simionizados, anticuerpos humanos y humanizados, anticuerpos de camélido, diacuerpos, así como también partes funcionales o fragmentos activos de ellos. Entre los ejemplos de fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos se incluyen fragmentos de Fab y F(ab')2, incluyendo los productos de una biblioteca de expresión de inmunoglobulina Fab y fragmentos que unen epítopes de cualquiera de los anticuerpos y fragmentos arriba mencionados.
Estos fragmentos activos pueden derivar de un anticuerpo de la presente invención mediante una cantidad de técnicas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales purificados pueden ser segmentados con una enzima, como ser la pepsina, y ser sometidos a HPLC de filtración en gel. La fracción apropiada que contiene fragmentos Fab puede luego ser recolectada y concentrada por filtración de membrana y similares. Para una descripción adicional de técnicas generales para el aislamiento de fragmentos activos de anticuerpos, referirse, por ejemplo, a i Khaw, B. A. et al. J. Nucí. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et a\. Methods Enzymology, 121 :663-69, Academic Press, (1986). ! La expresión "anticuerpo humanizado" hace referencia un tipo de anticuerpo modificado donde sus CDRs derivan de una inmunoglobulina dadora no humana, y las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de la molécula derivan de una (o más) inmunoglobulina(s) humanas.
Un anticuerpo humanizado puede hacer referencia, además, a un anticuerpo con una región variable donde una o más de sus regiones estructurales cuentan con aminoácidos humanos o de primates. Además, los residuos del soporte estructural pueden ser modificados para conservar la afinidad de la unión. Los métodos para obtener "anticuerpos humanizados" resultan conocidos para los expertos en el arte (referirse, por ejemplo, a Queen et al, Proc. Nati Acad SciEE.UU, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technoloy, 9:421' (1991 )).
Asimismo, puede obtenerse un "anticuerpo humanizado" a través de un nuevo enfoque de modificación genética que permita la producción de anticuerpos policlonales tipo humano de afinidad madura en animales grandes como ser, por ejemplo, conejos (http://www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php).
La expresión "anticuerpo completamente humano" o anticuerpo "humano" hace referencia a un anticuerpo derivado de ratones transgénicos que llevan genes de anticuerpo humano o de células humanas. No obstante, para él sistema inmune humano, la diferencia entre anticuerpos "completamente humano", "humano" y "humanizados" puede ser insignificante o inexistente y como tal, las tres expresiones pueden ser de igual eficacia o seguridad. ( La expresión "anticuerpo monoclonal" también es reconocida en el arte y hace referencia a un anticuerpo que se produce en masa en el laboratorio a partir de un solo clon y que reconoce un solo antígeno. Los anticuerpos monoclonales son producidos, típicamente, mediante la fusión de una célula B productora de I anticuerpos, por lo general de corta vida, en una célula de rápido crecimiento, como ser una célula de cáncer (a veces mencionada como una célula "inmortal"). La célula híbrida resultante, o hibridoma, se multiplica con rapidez y créa un clon que produce grandes cantidades del anticuerpo. 1 El término "antígeno" hace referencia a una entidad o fragmento de él que puede inducir una repuesta inmune en un organismo, en particular de un animal, de forma más particular de un mamífero, incluso un ser humano. El término incluye inmunogenes y regiones responsables de la antigenicidad p de los determinantes antigénicos.
De la forma empleada en la presente, el término "soluble" significa disuelto en forma parcial o total en una solución acuosa.
Asimismo, de la forma empleada en la presente, el término "inmunogénico" hace referencia a sustancias que suscitan o mejoran la producción de anticuerpos, células T y otras células inmunes reactivas dirigidas contra un agente inmunogénico y contribuyen a una respuesta inmune en seres humanos o en animales.
Una respuesta inmune se presenta cuando un individuo produce suficientes anticuerpos, células T y otras células inmunes reactivas contra composiciones inmunogénicas administradas de la presente invención para moderar ó mitigar el trastorno a ser tratado.
El término "hibridoma" es reconocido en el arte y los expertos en el arte entienden que hace referencia a una célula producida por la fusión de una célula que produce anticuerpos y una célula inmortal, por ejemplo, una célula de mieloma múltiple. Esta célula híbrida es capaz de producir un suministro continuo de anticuerpos. Referirse a la definición de "anticuerpo monoclonal" anterior y a los Ejemplos que aparecen más abajo para una descripción detallada del método de fusión.
El término "portador", de la forma utilizada en la presente, significa una estructura a la que puede incorporarse un péptido antigénico o constructo supramolecular o puede estar asociado, lo cual presenta o expone péptidos antigénicos o parte del péptido al sistema inmune de un ser humano o de un animal. Cualquier partícula que pueda ser utilizada en forma adecuada n terapia animal o humana como ser, por ejemplo, una vesícula, una partícula o un cuerpo particulado puede ser empleada como portador dentro del contexto de la presente invención.
El término "portador" comprende, además, métodos de administración donde las composiciones de constructo antigénico supramolecular que comprenden el péptido antigénico pueden ser transportadas a sitios convenientes mediante mecanismos de administración. Un ejemplo de un sistema de administración como este utiliza metales coloidales como ser oro coloidal.
Entre las proteínas portadoras pueden ser empleadas en las composiciones de constructo antigénico supramolecular de la presente invención se incluyen, pero sin que la enumeración sea taxativa, el péptido de unión de maltosa "MBP", albúmina de suero bovino "BSA", hemocianina de lapa "KLH", ovpalbúmina, flagelina, tiroglobulina, albúmina de suero de cualquier especie, gamaglóbulina de cualquier especie, células singeneicas que transportan antígenos la y polímeros de aminoácidos D y/o L.
Además, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad farmacéuticamente efectiva" hacen referencia a la cantidad de péptido de unión que, cuando es administrada a un ser humano o a un animal, es suficiente como para que de como resultado un efecto terapéutico en dicho ser humano o animal. La cantidad efectiva es fácilmente determinada por los expertos en el arte que sigan los procedimientos de rutina.
Las expresiones "pTau PHF", "PHF" y "filamentos helicoidales pareados" son empleadas en la presente como sinónimas y hacen referencia a pares de filamentos de alredor de 10 nm enrollados en hélices con una periodicidad de 160 nm visible en microscopio de electrones. El ancho varía entre 10 y 22 nm. Los PHF son estructuras predominantes en los ovillos neurofibrilares de la enfermedad de Alzheimer (EA) y en hilos de neurópilo. Los PHF también pueden verse en algunos, pero no en todos, neuritas distróficas asociadas con placas neuríticas. El componente principal de los PHF es una forma hiperfosforilada de proteína tau asociada a microtúbulos. Los PHF están compuestos por proteínas tau hiperfosforiladas antiparalelas unidas a disulfuro. Tau PHF puede ser separado de sus 20 residuos de aminoácidos de C-terminal. Los mecanismos subyacentes de la formación de PHF son inciertos pero la hiperfosforilación de táu puede desengancharla de los microtúbulos, lo que aumenta el grupo soluble de tau.
Dentro del alcance de la presente invención, se ha demostrado que la respuesta inducida por el anticuerpo a la composición antigénica de acuerdo con la invención es ampliamente independiente de la célula T. Se utilizó un modelo de ratón desnudo en esta cuestión y se vacunaron ratones desnudos; se midieron las respuestas del anticuerpo para evaluar la respuesta del anticuerpo específico de ?ß inducida por la composición antigénica de acuerdo con la invención en los ratones desnudos inmunizados. Los ratones desnudos llevan la mutación Foxnl nu y como consecuencia, presentan una función reducida de célula T debido a la falta de un timo adecuado.
La expresión "cantidad farmacéuticamente efectiva", de la forma empleada en la presente, hace referencia a una dosis de un ingrediente activo en una composición farmacéutica adecuada para la cura, o al menos para la detención parcial de los síntomas de la enfermedad, trastorno o estado a ser tratado o cualquier complicación asociada con ellos.
La presente invención provee péptidos de unión que reconocen y se unen a fosfoepítopes patológicos de la proteína tau. En particular, la presente invención provee anticuerpos específicos contra fosfoepítopes lineales y conformácionales, simples y complejos, en proteína tau que son considerados responsables de la sinaptotoxicidad y neurotoxicidad en tauopatías, incluso en EA.
En consecuencia, la presente invención hace referencia en una forma de realización a un péptido de unión o una parte funcional de él, en particular a un anticuerpo, en particular a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de él, cuyo péptido de unión o anticuerpo reconoce y se une específicamente a un fosfoepitope en un mamífero, en particular a la proteína tau de un ser humano o a un fragmento de ella, en particular a un confórmero de proteína tau patológica, pero, en una forma de realización, no se une al epítope no fosforilado correspondiente y/o a epítopes no relacionados, donde dicho péptido de unión o anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con una constante disociación de la menos 10 nM, en particular de al menos 8 nM, en particular de al menos 5 nM, en particular de al menos 2 nM, en particular de al menos 1 nM, en particular de al menos 500 pM, en particular de al menos 400 pM, en particular de al menos 300 pM, en particular de al menos 200 pM, en particular de al menos 100 pM, en particular de al menos 50 pM.
Proteína "tau soluble" tal como se usa en la presente se refiere a proteínas que consisten en ambos monómeros de proteína tau/péptido completamente solubilizados o de péptidos/proteínas tipo tau, o de péptidos/proteínas tau modificadas o truncadas o de otros derivados de monómeros de péptidos/proteínas tau, y de oligómeros de proteína tau. "Tau soluble" excluye ovillos particularmente neurofibrilares (NFT).
Proteína "tau insoluble" tal como se usa en la presente se refiere a múltiples monómeros agregados de péptidos o proteínas tau o de péptidos/proteínas tipo tau, o de péptidos/proteínas tau modificadas o truncadas o de otros derivados de monómeros de péptidos/proteínas tau que forman estructuras oligorhéricas o poliméricas que son insolubles tanto in vitro en medio acuoso e in vivo en el organismo mamífero o humano, más en particular en el cerebro, pero en particular a múltiples monómeros agregados de tau o de péptidos/proteínas tau modificados o truncados o de sus derivados que son insolubles en el organismo mamífero o humano, más en particular en el cerebro, respectivamente. "Tal insoluble" incluye en particular ovillos neurofibrilares (NFT).
"Tau monomérico" o "monómero tau" tal como se usa en la presente se refiere a proteínas tau completamente solubilizadas sin complejos agregados en medio acuoso.
"Tau agregado", "tau oligomérico" y "oligómero tau" se refieren a múltiples monómeros agregados de péptidos o proteínas tau o de péptidos/proteínas tipo tau, o de péptidos/proteínas tau modificados o truncados o de otros derivados de péptidos/proteínas tau que forman estructuras oligoméricas o poliméricas que son insolubles o solubles tanto en medio acuoso in vitro como in vivo en el organismo mamífero o humano, más en particular en el cerebro, pero en particular á múltiples monómeros agregados de tau o de péptidos/proteínas tau modificados o truncados o de sus derivados que son insolubles o solubles en el organismo mamífero o humano, más en particular en el cerebro, respectivamente.
En una forma de realización, la presente invención provee una composición farmacéutica que comprende un péptido de unión o una parte funcional de él, en particular un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de él, o un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho péptido de unión o anticuerpo, de acuerdó con una cualquiera de las formas de realización anteriores y reivindicada en la presente, o una combinación de ellos, en una cantidad terapéuticamente efectiva junto con un portador farmacéuticamente aceptable. ' Los portadores, diluyentes y/o excipientes farmacéuticos adecuados resultan conocidos en el arte e incluyen, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas de fosfato, agua, emulsiones tales como emulsiones de acéite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc.
Los péptidos de unión de acuerdo con la invención que incluyen anticuerpos, anticuerpos parcialmente monoclonales y sus fragmentos activos pueden ser preparados en una formulación fisiológicamente aceptable y pueden comprender un portador, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable mediante el uso de técnicas conocidas. Por ejemplo, los péptidos de unión de acuerdo con la invención y de acuerdo con lo descripto en la presente que incluyen cualquier péptido de unión funcionalmente equivalente o partes funcionales de él, en particular los anticuerpos monoclonales de la invención que incluyen cualquier anticuerpo funcionalmente equivalente o partes funcionales de él, son combinados con un portador, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable para formar una composición terapéutica. Los portadores, diluyentes y/o excipientes farmacéuticos adecuados resultan conocidos en el arte e incluyen, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas de fosfato, agua, emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc.
La formulación de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede ser lograda de acuerdo con la metodología estándar conocida por los expertos en el arte. i Las composiciones de la presente invención pueden ser administradas a un sujeto en forma de sólido, líquido o aerosol en una dosis farmacéuticamente efectiva adecuada. Entre los ejemplos de composiciones sólidas de incluyen pildoras, cremas y unidades de dosificación implantables. Las pildoras pueden ser administradas en forma oral. Las cremas terapéuticas pueden ser administradas en forma tópica. Las unidades de dosificación implantables pueden ser administradas en forma local, por ejemplo, en el lugar del tumor, o pueden ser implantadas para la liberación sistemática de la composición terapéutica, por ejemplo, en forma subcutánea. Entre los ejemplos de composiciones líquidas se incluyen formulaciones adaptadas para la inyección intramuscular* subcutánea, intravenosa, intraarterial y formulaciones para la administración tópica e intraocular. Entre los ejemplos de formulaciones en aerosol se incluyen las formulaciones para inhalar para ser administradas a los pulmones.
Las composiciones pueden ser administradas por vías de administración estándar. En general, la composición puede ser administrada por vía tópica, oral, rectal, nasal, intradérmica, intraperitoneal o parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea o intramuscular).
Además, la composición puede ser incorporada en matrices de liberación constante tales como polímeros biodegradables, donde los polímeros son implantados en las proximidades de la zona donde se desea realizar la administración, por ejemplo, en el sitio de un tumor. El método incluye la administración de una dosis única, la administración de dosis repetidas a intervalos de tiempo previamente determinados y la administración ^onstante durante un período de tiempo previamente determinado.
De la forma utilizada en la presente, una matriz de liberación constante es una matriz hecha de materiales, por lo general de polímeros, que son degradables a través de hidrólisis enzimática o de ácido/base o por disolución. 1 Una vez introducida en el cuerpo, la matriz reacciona ante las enzimas y los fluidos corporales. La matriz de liberación constante es seleccionada de manera conveniente mediante los materiales biocompatibles tales como liposomas, poliláctidos (ácido poliláctido), poliglicólido (polímero de ácido glicólico), co-glicólido poliáctido (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico), poliahhídridos, poli(orto)ésteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, ácidos de poliamino, aminoácidos tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinilpolipropileno, polivinilpirrolidona y siliconai Una matriz biodegradable de preferencia es una matriz de uno de los siguientes: poliláctido, poliglicólido o co— glicólido poliláctico (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico).
Los expertos en el arte saben que la dosificación de la composición dependerá de varios factores tales como, por ejemplo, el estado que se esté tratando, la composición en particular que se emplee y otros factores clínicos tales como el peso, el tamaño, el sexo y la salud general del paciente, la superficie corporal, el compuesto particular o la composición particular a ser administradas, otros fármacos que sean administrados en ese momento y la vía de administración.
La composición de acuerdo con la invención puede ser administrada en combinación con otras composiciones que comprenden una sustancia o compuesto biológicamente activo como ser, por ejemplo, un compuesto conocido empleado en la medicación de tauopatías y/o de amiloidosis, un grupo de enfermedades y trastornos asociados con una proteína amiloide o tipo amiloide como ser la proteína ß-amiloide involucrada en al enfermedad de Alzheimer.
La otra sustancia o compuesto biológicamente activo puede ejercer su efecto biológico mediante el mismo mecanismo o uno similar al de la vacuna terapéutica de acuerdo con la invención o mediante un mecanismo de acción no relacionado o mediante una pluralidad de mecanismos de acción relacionados y/o no relacionados.
En general, el otro compuesto biológicamente activo puede incluir mejoradores de neurotransmisión, fármacos psicoterapéuticos, inhibidores de acetilcolina esterasa, bloqueadores de canales de calcio, aminas biogénicas, tranquilizantes de benzodiacepina, síntesis de acetilcolina, mejoradores de almacenamiento o liberación, agonistas de receptores postsinápticos de acetilcolina, inhibidores de oxidasa A o B de monoamina, antagonistas de receptores de N-metil-D-aspartato glutamato, fármacos antiinflamatorios no esteroides, antioxidantes y antagonistas de receptores serotonérgicos.
En particular, el agente o compuesto biológicamente activo puede comprender al menos un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en compuestos contra estrés oxidativo, compuestos antiapoptóticos, quejantes de metal, inhibidores de reparación de ADN como ser pirencepina y metabolitos, ácido 3-amino-1-propanosulfónico (3APS), 1 ,3-propanodisulfonato (1 ,3-PDS), activadores de secretasa, inhibidores de [beta]- y 7-secretasa, proteínas tau, neurotransmisores, moléculas antiinflamatorias, "antipsicóticos atípicos" tales como, por ejemplo, clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol u olanzapina, o inhibidores de galantamina (ChEIs) como ser tacrina, rivastigmina, donépezil, y/o galantamina y otros fármacos y suplementos dietarios tales como, por ejemplo, vitamina B12, cisteína, un precursor de acetilcolina, lecitina, colina, ginkgo biloba, acetil-L-carnitina, idebenona, propentofilina, o un derivado de xantina, junto con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de ellos, y en forma opcional, un portador farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente y/o un excipiente e instrucciones para el tratamiento de enfermedades.
En otra forma de realización, la composición de acuerdo con la invención puede comprender niacina o memantina junto con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos mpnoclonales y sus fragmentos activos, y en forma opcional, un portador y/o un diluyente y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable En otra forma de realización de la invención, las composiciones provistas comprenden "antipsicóticos atípicos" tales como, por ejemplo, clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol u olanzapina para el tratamiento dé síntomas psicóticos positivos y negativos que incluyen alucinaciones, delirios, trastornos en el pensamiento (manifestados por una incoherencia marcada, descarrilamiento, tangencialidad), y comportamiento desorganizado o fuera de lo común, así como también anhedonia, afecto aplanado, apatía y insociabilidad, junto con él péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales y sus fragmentos activos, y en forma opcional, un portador y/o un diluyente y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Otros compuestos que pueden ser empleados en forma adecuada en composiciones además del péptido de unión de acuerdo con la invención, son aquellos divulgados por ejemplo en el documento WO 2004/058258 (referirse en especial a las páginas 16 y 17) que incluyen dianas de fármacos terapéuticos (páginas 36 a 39), ácidos alcanosulfónicos y ácidos alcanosulfúricos (páginas 39 a 51), inhibidores de colinestearasa (páginas 51 a 56), antagonistas de receptores de NMDA (páginas 56 a 58), estrógenos (páginas 58 a 59), fármacos antiinflamatorios no esferoides (páginas 60 a 61 ), antioxidantes (páginas 61 a 62), agonistas de receptores activados por proliferadores de peroxisoma (PPAR) (páginas 75 a 77), inhibidores de formación de amiloide (páginas 77 a 78), quelantes de metal (páginas 78 a 79), antipsicóticos y antidepresivos (páginas 80 a 82), suplementos dietarios (páginas 83 a 89) y compuestos que aumentan la disponibilidad de sustancias biológicamente activas en el cerebro (referirse a las páginas 89 a 93), y profármacos (páginas 93 y 94), cuyo documento es incorporado a la presente a modo de referencia, pero en especial los compuestos mencionados en las páginas indicadas con anterioridad.
La materia farmacéuticamente activa proteinácea puede estar presente en cantidades comprendidas entre 1 ng y 10 mg por dosis. En general, el régimen de administración debe estar entre 0,1 [mu]g y 10 mg del anticuerpo de acuerdo con la invención, en particular entre 1 ,0 [mu]g y 1 ,0 mg, y en forma más particular entre 1 ,0 [mu]g y 100 [mu]g, y todos los números que se encuentren dentro de estos rangos también son parte de la invención. Si la administración se produce a través de una infusión continua, una dosis más adecuada puede encontrarse entre unidades de 0,01 [mu]g y 10 mg por kilo de masa corporal por hora, y ¡todos los números que se encuentren dentro de estos rangos también son parte de la invención.
En general, la administración será parenteral, por ejemplo, intravenosa. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones! estériles acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones. Entre los solventes no acuosos se incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal como ser aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los solventes acuosos pueden seleccionarse entre el grupo que consiste en agua, alcohol/soluciones acuosas, emulsiones y suspensiones que incluyen medios salinos o tamponados. Entre los vehículos parenterales se incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, cloruro de sodio y dextrosa, Ringer lactato o aceites fijos. Entre los vehículos intravenosos se incluyen reaprovisionantes de fluidos y nutrientes, reaprovisionantes de electrolitos (como aquellos basados en dextrosa de Ringer) y otros. Los conservantes también pueden estar presentes tales como, por ejemplo, agentes antimicrobiales, antioxidantes, quelantes, gases inertes, etc.
La composición farmacéutica puede comprender, además, portadores proteináceos tales como, por ejemplo, albúmina de suero o inmunoglobulina, en particular de origen humano. Otros agentes biológicamente activos pueden estar presentes en la composición farmacéutica de la invención según su uso pretendido.
Cuando el objetivo de unión está ubicado en el cerebro, ciertas formas de realización de la invención contemplan el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales y sus fragmentos activos, para atravesar la barrera hematoencefálica. Detérminadas enfermedades neurodegenerativas están asociadas con un aumento de permeabilidad de la barrera hematoencefálica, de manera que el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales o sus fragmentos activos puedan ser introducidos con facilidad en el cerebro. Cuando la barrera hematoencefálica permanece intacta, existen varios enfoques conocidos en el arte para transportar moléculas a través de1 ella, que incluyen, pero sin que la enumeración sea taxativa, método físicos, métodos basados en lípidos y métodos basados en los canales y en los receptores.
Los métodos físicos para transportar el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, o sus fragmentos activos, a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero sin que la enumeración sea taxativa, sortear la barrera hematoencefálica por completo o mediante la creación de aberturas en la barrera hematoencefálica. Los métodos para rodearla incluyen, pero sin que la enumeración sea taxativa, la inyección directa en el cerebro (referirse, por ejemplo, a Papanastassiou et al, Gene Therapy 9: 398-406 (2002)) y al implante de un dispositivo de administración en el cerebro (referirse, por ejemplo, a Gilí et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); y a Gliadel Wafers(TM), Guildford Pharmaceutical). Los método para crear aberturas en la barrera incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, ultrasonido (referirse, por ejemplo, a la publicación de patente estadounidense N.° 2002/0038086), presión osmótica (por ejemplo, por administración de manitol hipertónico ((Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N. Y. (1989)), permeabilización, por ejemplo, por bradiquinina o permeabilizante A-7 (referirse, por ejemplo a las patentes estadounidenses N.° 5.112.596, 5.268.164, 5.506.206 y 5.686.416), y transfección de neuronas que unen la barrera hematoencefálica con vectores que contienen genes qué codifican el péptido de unión o fragmento que une el antígeno (referirse, por ejemplo, a la publicación de la patente estadounidense N.° 2003/0083299) Los métodos de transporte basados en lípidos del péptido de unión de acuerdo con la invención incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales o uno de sus fragmentos activos a través de la barrera hematoencefálica incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, el encapsulamiento del péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales o su fragmento activo en liposomas que son acoplados a fragmentos activos de ellos que sé unen a receptores en el endotelio vascular de la barrera hematoencefálica (referirse, por ejemplo, a la publicación de solicitud de patente estadounidense N.° 2002/0025313), y el revestimiento del péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales o su fragmento activo en partículas de lipoproteína de baja densidad (referirse, por ejemplo, a la publicación de solicitud de patente estadounidense N.° 2004/0204354) o apolipoproteína E (referirse, por ejemplo, a la publicación de solicitud de patente estadounidense N.° 2004/0131692).
Los métodos basados en canales y receptores para transportar el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, o su fragmento activo, a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero sin que la enumeración sea taxativa, el uso de bloqueadores de glucocorticoide para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (referirse, por ejemplo, a las publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses N.° 2002/0065259, 2003/0162695 y 2005/0124533); la activación de canales potasio (referirse, por ejemplo, a la publicación dé solicitud de patente estadounidense N.° 2005/0089473), la inhibición de transportadores de fármacos ABC ((referirse, por ejemplo, a la publicación de solicitud de patente estadounidense N.° 2003/0073713); el revestimiento de anticuerpos con transferrina y la modulación de actividad de uno o más receptores de transferrina (referirse, por ejemplo, a la publicación de solicitud de patente estadounidense N.° 2003/0129186) y la cationización de los anticuerpos (referirse, por ejemplo, a la publicación de solicitud de patente estadounidense N.° 5.004.697).
Se pueden proporcionar únicas o repetidas administraciones de péptido de unión de acuerdo con la invención que incluyen anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, o uno de sus fragmentos activos, o de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención a un sujeto dúrante un período prolongado. La duración de administración puede ser de entre 1 semana y de hasta 12 meses o más. Durante este tiempo, el péptido de unión, anticuerpo o composición farmacéutica se puede administrar una vez por semana, una vez cada dos semanas, tres, semanas, cuatro semanas, etc. o con una frecuencia mayor o menor según las necesidades del sujeto por tratar.
En otra forma de realización, la presente invención provee métodos y kits para la detección y el diagnóstico de enfermedades, trastornos o estados asociados con la proteína tau, que incluyen enfermedades o trastornos neurodegenerativos tales como tauopatías que comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades y trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran coexistencia de patologías tau y amiloides que incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, demencia pugilística, síndrome de Down, enfermedad de Gerstmann-Stráussler-Scheinker, miositis por cuerpos de inclusión y ángiopatía amiloide cerebral por proteína priónica, lesión cerebral traumática; y otras enfermedades o trastornos que no muestran una patología amiloide distinta que incluyen, pero sin que la enumeración sea taxativa, esclerosis lateral amiotrófica/complejo parkinsonismo-demencia de Guam, enfermedad néuromotriz no Guam con ovillos neurofibrilares, demencia con granulos argirofílicos, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17, enfermedad de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Niemann-Pick, tipo C, degeneración palido-ponto-nigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, demencia por ovillos neurofibrilares, parkinsonismo postencefálico, distrofia miotónica. Las anomalías patológicas pueden ser producidas por la formación de lesiones neurofibrilares o pueden estar asociadas con ellas, donde la patología cerebral predominante es la tauopatía.
Además, la presente invención provee métodos y kits para diagnosticar una predisposición a enfermedades, trastornos o estados asociados con la proteína tau, que incluyen enfermedades o trastornos neurodegenerativos tales como tauopatías que comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran coexistencia de patologías tau o amiloides, o para monitorear una enfermedad de residuo mínimo en un paciente o para predecir la capacidad de respuesta de un paciente ante un tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales y sus fragmentos activos, o una composición de acuerdo con la invención y según se la describe en la presente. Estos métodos incluyen métodos inmunológicos conocidos comúnmente empleados para detectar o cuantificar sustancias en muestras biológicas o en un estado in situ.
El diagnóstico de una enfermedad o estado asociado con la protéína tau o de una predisposición a una enfermedad o estado asociado con la proteína tau en un sujeto que necesita de ello, en particular un mamífero, en forma más ¡particular un ser humano, que incluye enfermedades o trastornos neurodegenerativos tales como tauopatías que comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran coexistencia de patologías tau o amiloides, puede lograrse mediante la detección del unión inmunoespecífico de un péptido de unión de la invención, en particular de un anticuerpo, en particular de un anticuerpo monoclonal o un fragmento activo de él, con un epítope de la proteína tau en una muestra¡ o in situ, que incluye poner la muestra o una parte del cuerpo específica o zona del cuerpo que se sospecha contiene la proteína tau en contacto con un anticuerpo que una i un epítope de la proteína tau, lo que permite la formación del ; complejo inmunológico y la correlación de la presencia o ausencia del , complejo inmunológico con la presencia o ausencia de la proteína tau en la muestra o parte o área del cuerpo específica, donde, en forma opcional, se compara la cantidad del complejo inmunológico con un valor control normal, donde un aumento en la cantidad del complejo inmunológico comparado con un valor control normal indica que el sujeto sufre de una enfermedad o estado asociado a la proteína tau o se encuentra en riesgo de desarrollarlo.
El monitoreo de la enfermedad residual mínima en un sujeto, en particular un mamífero, en forma más particular un ser humano, después del tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales y sus fragmentos activos, o una composición de acuerdo con la invención pueden ser logrados mediante la detección de la unión inmunoespecífica de un péptido de unión de la invención, en particular de un anticuerpo, en particular de un anticuerpo monoclonal o un fragmento activo de él, con un epítope de la proteína tau en una muestra o in situ, que incluye poner la muestra o una parte del cuerpo específica o zona del cuerpo que se sospecha contiene la proteína tau en contacto con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales y sus fragmentos activos, para unir un epítope de la proteína tau, lo que permite que el péptido de unión de la invención, en particular de un anticuerpo, en particular de un anticuerpo monoclonal o un fragmento activo de él, se unan con lá proteína tau para formar un complejo inmunológico, donde se detecta la formáción del complejo inmunologico y se logra la correlación de la presencia o ausencia del complejo inmunologico con la presencia o ausencia de la proteína tau en la muestra o parte o área del cuerpo específica, donde, en forma opcional, se compara la cantidad de dicho complejo inmunologico con un valor control normal, donde un aumento en la cantidad de dicho complejo inmunologico comparado con un valor control normal indica que el sujeto aún puede sufrir de una enfermedad residual mínima.
La predicción de la capacidad de respuesta de un sujeto, en particular un mamífero, en forma más particular un ser humano, a un tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales y sus fragmentos activos, o una composición de acuerdo con la invención pueden ser logrados mediante la detección de la unión inmunoespecífica de un péptido de unión de la invención, en particular de un anticuerpo monoclonal o un fragmento activo de él, con un epítope de la proteína tau en una muestra o in situ, que incluye poner la muestra o una parte del cuerpo específica o zona del cuerpo que se sospecha contiene la proteína tau en contacto con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales y sus fragmentos activos, que une un epítope de la proteína tau, lo que permite que el péptido de unión de la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales o sus fragmentos activos, se unan con la proteína tau para formar un complejo inmunologico, donde se detecta la formación del complejo inmunologico y se logra la correlación de la presencia o ausencia del complejo inmunologico con la presencia o ausencia de la proteína tau en la muestra o parte o área del cuerpo específica, donde, en forma opcional, se compara la cantidad de dicho complejo inmunologico con un valor control normal antes y después del inicio del tratamiento, donde una disminución en la cantidad de dicho complejo inmunológico indica que dicho paciente, tiene una gran probabilidad de responder al tratamiento. , Las muestras biológicas que pueden emplearse en el diagnóstico de una enfermedad o estado asociado con la proteína tau, para diagnosticar una predisposición a una enfermedad o estado asociado co la proteína tau, que incluye enfermedades o trastornos neurodegenerativos tales como tauopátías que comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran coexistencia de patologías tau o amiloides, o para monitorear una enfermedad de residuo mínimo en un paciente o para predecir la capacidad de respuesta de un paciente ante un tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales y sus fragmentos i activos, o una composición de acuerdo con la invención y según se la describe en i la presente, por ejemplo, fluidos tales como suero, plasma, saliva, secreciones gástricas, moco, fluido cerebroespinal, fluido linfático y similares o muestras de tejido o células obtenidas de un organismo como ser tejido neural, , cerebral, cardíaco o vascular. Para determinar la presencia o ausencia de la proteína tau en una muestra, puede emplearse cualquier inmunoensayo conocido para los expertos en el arte como ser, por ejemplo, ensayos que utilicen métodos de detección indirecta con reactivos secundarios para su detección, ensayos de aglutinación e inmunoprecipitación y ELISA. Una descripción detallada de estos ensayos se encuentra, por ejemplo, en Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual (Coid Spring Harbor Laboratory, Nueva York 1988 555-612, WO96/13590 de Maertens y Stuyver, Zrein et al. (1998) y WO96/29605.
Para un diagnóstico in situ, el péptido de unión de acuerdo con la invención incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales y sus fragmentos activos, de la invención o cualquier parte activa y funcional de él puede ser administrada al organismo a ser diagnosticado a través de métodos conocidos en el arte como ser, por ejemplo, inyección intravenosa, intranasal, intraperitoneal, intracerebral, intraarterial como ser una unión específica entre un anticuerpo de acuerdo con la invención con una región eptitópica en la proteína amiloide. El complejo de unión de péptido/antígeno puede ser detectado en forma conveniente a través de una etiqueta unida al péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, o un fragmento funcional de él, o cualquier otro método de detección conocido en el arte.
Los inmunoensayos empleados en aplicaciones de diagnóstico o en aplicaciones para diagnosticar una predisposición a una enfermedad o estado I asociado con la proteína tau, que incluyen enfermedades o trastornos i neurodegenerativos tales como tauopatías que comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran coexistencia de patologías tau o amiloides, o para monitorear una enfermedad de residuo mínimo en un paciente o para predecir la capacidad de respuesta de un paciente ante un tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales y sus fragmentos activos, o una composición de acuerdo con la invención y según se la describe en la presente, típicamente se basan en antígenos etiquetados, péptidos de unión o reactivos secundarios para su detección. Estas proteínas o reactivos pueden ser etiquetados con compuestos que en general son conocidos para los expertos en el arte, que incluyen enzimas, radioisótopos y sustancias fluorescentes, luminiscentes y cromogénicas que incluyen, pero sin que la enumeración sea taxativa, partículas coloreadas tales como cuentas de látex y oro coloidales. De estos, puede usarse el etiquetado radioactivo para casi todos los tipos de ensayo y con la mayoría de las ¡variantes. Las etiquetas conjugadas por enzimas son en particular útiles cuando debe evitarse radioactividad o cuando se necesitan resultados rápidos. Aunque los fluorocromos requieren de un equipo costoso para su uso, proveen un método muy sensible para su detección. Los péptidos de unión útiles en estos ensayos son aquellos divulgados y reivindicados en la presente que incluyen anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y anticuerpos policlonales de afinidad purificada.
En forma alternativa, el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales y sus fragmentos activos, puede ser etiquetado en forma indirecta mediante la reacción con sustancias etiquetadas que cuentan con una afinidad para la inmunoglobulina, como ser los anticuerpos secundarios o de proteína A o G. El péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales y sus fragmentos activos, puede ser conjugado con una segunda sustancia y detectado con una tercera sustancia etiquetada que presenta una afinidad para la segunda sustancia conjugada al anticuerpo. Por ejémplo, el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales y sus fragmentos activos, puede ser conjugado con biotina y el conjugado de biotina/péptido de unión detectado mediante avidina etiquetada o estreptavidina. De forma similar, el péptido de unión puede ser conjugado con un hapteno y el conjugado de hapteno/péptido de unión detectado mediante el uso de péptido de unión anti-hapteno etiquetado, i Los expertos en el arte conocerán estas y otras etiquetas adecuadas que pueden ser empleadas de acuerdo con la presente invención. La formulación de la i composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede ser lograda de acuerdo con la metodología estándar conocida por los expertos en el; arte. Las técnicas típicas son descriptas por Kennedy, J. H., et al., 1976 {Clin. Chim. Acta 70:1-31 ), y Schurs, A. H. W. M., et al. 1977 (Clin. Chim Acta 57:1^40). Las técnicas de acoplamiento mencionadas en estos últimos casos consisten en el método de glutaraldehído, el método de periodato, el método de dimáleimida y otros, y todos se incorporan a la presente a modo de referencia.
Los inmunoensayos actuales utilizan un método de anticuerpo doble para detectar la presencia de un analito, donde el anticuerpo es etiquetado en forma directa por su reactividad son un segundo anticuerpo que ha sido etiquetado con una etiqueta detectable. El segundo anticuerpo es, de preferencia, uno que se una con anticuerpos del animal del que deriva el anticuerpo monoclonal. ' En otras palabras, si el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de ratón, entonces el segundo anticuerpo etiquetado será un anticuerpo anti-ratón. Para el anticuerpo a ser usado en el ensayo descripto en la presente, esta etiqueta es, de preferencia, una cuenta revestida con el anticuerpo, en particular, una cuenta magnética. Para el anticuerpo a ser usado en el inmunoensayo descripto en la presente, la etiqueta es, de preferencia, una molécula detectable como ser una sustancia radioactiva, fluorescente o electroquimicoluminiscente.
Un sistema de anticuerpo doble alternativo, al que con frecuencia se hace referencia como sistemas de formato rápido porque están adaptados a determinaciones rápidas de la presencia de un analito, también puede ser empleado dentro del alcance de la presente invención. El sistema requiere de una alta afinidad entre el anticuerpo y el analito. De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, la presencia de la proteína amiloide es determinada mediante el uso de anticuerpos, cada uno específico para la proteína amiloide. Uno de dichos pares de anticuerpos es mencionado en la presente como un "anticuerpo detector" y el otro de dicho par de anticuerpos es mencionado en la presente como un "anticuerpo de captura". El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede ser empleado como un anticuerpo de captura o bien, como un anticuerpo detector. El anticuerpo monoclonal de la presente invención también puede ser empleado como un anticuerpo de captura y detector, juntos en un único ensayo. Una forma de realización de la presente invención utiliza, de esta forma, el método tipo sándwich de anticuerpo doble para detectar la proteína amiloide en una muestra de fluido biológico. En este método, el analito (proteína amiloide) se encuentra entre el anticuerpo detector y el anticuerpo de captura, donde el anticuerpo de captura es inmovilizado en forma irreversible sobre un soporte sólido. El anticuerpo detector contendría una etiqueta detectable, con el fin de identificar la presencia del sándwich de anticuerpo-analito y así, la presencia del analito.
Entre las sustancias de fase sólida ilustrativas se encuentran, sin que la enumeración sea taxativa, placas de microtítulación, tubos de ensayo de poliestireno, cuentas magnéticas, plásticas o de vidrio y placas que son conocidos en el campo de los radioinmunoensayos e inmunoensayos de enzima. Los métodos para acoplar anticuerpos en fases sólidas también son conocidos para los expertos en el arte. Últimamente, se ha empleado una cantidad de materiales porosos tales como nylon, nitrocelulosa, acetato de celulosa, fibras de vidrio y otros polímeros porosos como soportes sólidos.
La presente invención también hace referencia a un kit de diagnóstico para detectar la proteína tau en una muestra biológica que comprende una composición de acuerdo con lo definido con anterioridad. Además, la presente invjención se refiere al kit de diagnóstico que se acaba de mencionar que, además de una composición de acuerdo con lo definido con anterioridad, también comprende un reactivo de detección de acuerdo con lo definido con anterioridad. La expresión "kit de diagnóstico" hace referencia, en general, a un kit de diagnóstico conocido en el arte. En forma más específica, esta última expresión hace referencia a un kit de diagnóstico de acuerdo con lo descripto en Zrein et al. (1998).
Otro objeto de la presente invención es el de provee nuevas inmunosondas y kits de ensayo para la detección y diagnóstico de enfermedades y estados asociados con la proteína tau, que comprende péptidos de unión de acuerdo con la presente invención. Para la inmunosondas, los péptidos de unión están unidos en forma directa o indirecta a una molécula informante adecuada, por; ejemplo, una enzima o un radionucleido. El kit de prueba incluye un recipiente que contiene uno o más péptidos de unión de acuerdo con la presente invención e instrucciones para el uso de los péptidos de unión con el fin de unir un antígeno tau para formar un complejo inmunológico y detectar la formación del complejo inmunológico de manera que la presencia o ausencia del complejo inmunológico se correlacione con la presencia o ausencia de la proteína tau.
EJEMPLOS Ejemplo 1 : Generación v detección selectiva de hibridomas y anticuerpos El objetivo de este estudio fue el de generar y detectar en forma selectiva mAbs anti-tau (anticuerpos monoclonales). Se generaron hibridomas por fusión en un bazo de ratón inmunizado con vacuna de tau con una línea celular de mieloma. Se evaluaron los hibridomas para comprobar su capacidad de reacción con relación a la proteína tau de longitud completa fosforilada y no fosforilada, así como también los péptidos antigénicos de tau fosforilados y no fosforilados empleados en la preparación de la vacuna. Asimismo, se llevó a cabo una detección selectiva de hibridoma para comprobar la capacidad de reacción del sobrenadante de hibridomas respecto de los ovillos de tau mediante él uso de inmunoquímica en cortes de cerebro de ratón transgénico tau. 1.1 Métodos 1.1.1 Fusión Se usó un ratón C57BL/6 de tipo salvaje vacunado con ACI-33 (Tau5-20 I [pY18] para la producción de hibridoma. El ratón recibió un refuerzo con la vacuna ACI-33 el día 0 y nuevamente en el día 4 y se llevó a cabo la fusión el día 7. Se fundieron 173x106 (ACI-33) esplenocitos a partir del ratón inmunizado con células de mieloma SP2-O-Ag14 a una razón de 5 esplenocitos por cada célula de mieloma.
Se usó un ratón C57BL/6 de tipo salvaje vacunado con ACI-35 (Tau5-408 [PS396, pS404] para la producción de hibridoma. El ratón recibió un refuerzo con la vacuna ACI-35 el día 0 y nuevamente en el día 4 y se llevó a cabo la fusión el día (sic) se fundieron (sic) 6 x 107 (ACI-35) esplenocitos a partir del ratón inmunizado con células de mieloma 2 x 107 SP2-0-Ag14 a una razón de 3 esplenocitos por cada célula de mieloma.
Se usó un ratón C57BL/6 de tipo salvaje vacunado con ACI-36 (Tau401- i 418 [pS404/S409]) para la producción de hibridoma. El ratón recibió un refuerzo con la vacuna ACI-36 el día O y nuevamente en el día 4 y se llevó a cabo la fusión el día 7. Se fundieron 84x106 esplenocitos a partir del ratón inmunizado con células de mieloma SP2-0-Ag14 a una razón de 5 esplenocitos por cada célula de mieloma.
Se usó un ratón C57BL/6 de tipo salvaje vacunado con ACI-41 (combinación de Tau206-221 [pT212/pS214] y Tau196-211 [pS202/pT205]) para la producción de hibridoma. El ratón recibió un refuerzo con la vacuna ÁCI-41 el día 0 y nuevamente en el día 4 y se llevó a cabo la fusión el día 8. Se fundieron 162x106 esplenocitos a partir del ratón inmunizado con células de mieloma SP2- 0-Ag14 a una razón de 5 esplenocitos por cada célula de mieloma.
Las cuatro fusiones dieron como resultado 8 x 96 placas de cavidades y los clones fueron denominados de acuerdo con la placa (del 1 al 8), luego con la i hilera (de A a G) y por último, con la columna (de 1 a 12). 1.1.2 Método de detección selectiva de clones En primer lugar, se evaluaron las 8 x 96 placas de cavidades dos veces para comprobar la expresión de IgG. Luego, se transfirieron los clones de expresión positiva en 24 placas de cavidades y se testearon los sobrenadantes celulares (= clones) de células en desarrollo en una prueba ELISA tau y una detección selectiva TAUPIR de ¡nmunohistoquímíca. Los sobrenadantes1 positivos en ELISA y/o TAUPIR fueron transferidos a T25 matraces y los clones fueron nuevamente sometidos a detección selectiva para comprobar la expresión de IgG en la prueba ELISA aTau y la detección selectiva TAUPIR. 1.1.3 Detección selectiva de IgG Se revistieron placas de ELISA con 50 ul/cavidad de anticuerpo IgG antirratón (CER Groupe, Maloie, Bélgica) en un tampón de revestimiento durante 16 horas a una temperatura de 4 °C. Después de lavar las placas con PBS/Tween se aplicaron 100 ul/cavidad de una solución bloqueante durante l hora a temperatura ambiente. Se incubaron 50 ul de sobrenadante de hibridoma sin diluir durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del paso del lavado,; se aplicó una combinación de lgG1 , lgG2a, lgG2b e lgG3 antirratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Ab Serotec, Raleigh, NC, EE. UU.) en las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un lavado final, se llevó a cabo la detección con TMB (3-3',5,5'-tetrametilbencidina), el sustrato de fosfatasa para HRP y se leyeron las placas a 405 nm mediante el uso de un lector de placas ELISA. Los resultados son expresados como densidad óptica (DO). 1.1.4 Detección selectiva de ELISA de hibridomas tau Se llevó a cabo una prueba ELISA de hibridomas en péptido pTau (ACI-33, T1.5: Tau5-20 [pY18]; ACI-35, T3.5: Tau393^K)8[pS396/pS404]; ACI-36, T4.5: Tau401^t18 [pS404/S409]; ACI-41 , T8.5: Tau206-221 [pT212/pS214] y T9.5: Tau196-211 [pS202/pT205] PolyPeptide Laboratories, Hillerod, Dinamarca), correspondientes al péptido tau (ACI-33, T1.6: Tau5-20; ACI-36, T4 6: Tau401-4; ACI-41 , T8.6: Tau206-221 y T9.6: Tau196-211 , PolyPeptide Laboratories, Hillerod, Dinamarca), proteína tau de longitud completa fosforilada (441 aa) (pTau protein, Vandebroek et al., 2005) y proteína tau de longitud completa (441 aa) {Tau protein, SignalChem, Richmond, Canadá). Por último, se usó albúmina de suero bovino (BSA) como control negativo.
Se revistieron placas con 10 pg/ml del péptido tau correspondiente y 1 pg/ml de la proteína tau correspondiente durante la noche a 4 °C. Después de lavar cada cavidad con PBS al 0,05% Tween 20 y de bloquear con BSA al 1 % en PBS al 0,05% de Tween 20, se agregaron el sobrenadante de hibridoma sin diluir o control negativo de medio a las placas y se las incubó a 37 °C durante 2 horas. Después del lavado, se incubaron las placas con un anticuerpo total de IgG antirratón conjugado con fosfatasa (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, EE. UU.) durante 2 horas a 37 °C. Después del lavado, se incubaron las placas con pNPP (paranitrofenilfósfato), el sustrato de fosfatasa para AP y se leyeron las placas a 405 nm mediante el uso de un lector de placas ELISA. Los resultados son expresados como densidad óptica (DO). 1.1.5 Detección selectiva de hibridomas IHC: unión de anticuerpos anth-tau con ovillos en secciones de cerebro de ratones transgénicos (TAUPIR) Los experimentos TAUPIR fueron realizados de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 3.1.2. 1.1.6 Detección selectiva de IgG de matraces T25 Se revistieron placas de ELISA con 5 ug/ml de anticuerpo de fragmento específico IgG F(ab')2 antirratón (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, EE. UU.) en un tampón de revestimiento de carbonato-bicarbonato con un pH de 9,6 (Sigma, Buchs, Suiza) durante la noche a 4 °C. Después de lavar las placas, se incubaron el sobrenadante de hibridoma sin diluir, el anticuerpo IgG de control positivo (6E10 a 1 ug/ml: Covance, Emeryville, CA, EE. UU.) o de control negativo (medio de cultivo solo) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del paso del lavado, se incubó el anticuerpo de fragmento específico Fcy de IgG antirratón de cabra conjugado con AP secundario (subclases 1 +2a+2b+3) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, EE. UU.) en placas durante 2 horas a 37 °C. Después del lavado final, se llevó a cabo la detección con pNPP (paranitrofenilfósfato), el sustrato de fosfatasa para AP y se leyeron las placas a 405 nm mediante el uso de un lector de placas ELISA. Los resultados son expresados como densidad óptica (DO). ¡ 1.2 Resultados 1.2.1 Hibridomas ACI-33 Se sometieron a detección selectiva los sobrenadantes celulares de las 8 x 96 placas de cavidades resultantes de la fusión para la producción de IgG. En las 768 placas (8 x 96 placas), 277 placas testeadas resultaron positivas respecto de la expresión de IgG y fueron transferidas a 24 placas de cavidades. En las 24 placas de cavidades, se hizo desarrollar 79 clones y se analizó el sobrenadante a partir de esas células. Los clones positivos fueron transferidos además en matraces T25 y los sobrenadantes fueron sometidos a detección selectiva para la producción de IgG, ELISA y TAUPIR (Tabla 2).
El clon 6C10 fue el único positivo en las 3 detecciones selectivas y fue seleccionado por subclonación. 1.2.2 Hibridomas ACI-36 ' Se sometieron a detección selectiva los sobrenadantes celulares de las 8 x 96 placas de cavidades resultantes de la fusión para la producción de IgG. En las 768 placas (8 x 96 placas), 333 placas testeadas resultaron positivas respecto de la expresión de IgG y fueron transferidas a 24 placas de cavidades. En las 24 placas de cavidades, se hizo desarrollar 75 clones y se analizó el sobrenadante a partir de esas células. Los clones positivos fueron transferidos además en matraces T25 y los sobrenadantes fueron sometidos a detección selectiva para la producción de IgG, ELISA y TAUPIR (Tabla 3).
Con el fin de seleccionar clones para los siguientes pasos, se llevó a cabo una clasificación de todos los sobrenadantes positivos para detecciones selectivas de IgG/ELISA/TAUPIR sobre la base de los resultados de ELISA y TAUPIR. La clasificación de los resultados de ELISA y TAUPIR fue llevada a cabo de acuerdo con lo explicado en la sección de métodos. La tinción TAUPIR fue casi idéntica para los cinco clones primeros y esto correspondió a los resultados de ELISA. Se descartó 4C12 dado que fue encontrado en la misma placa que 4C1 , lo que aumentó la probabilidad de que los 2 clones fueran los mismos (reconociendo el mismo epítope). Los mejores 4 clones seleccionados fueron 3A8, 2B6, 4C1 y 6H1. Los otros 6 clones (4C12, 2G1 , 2F9, 7D6, 3B9, 4E12) fueron conservados como soporte.
Se llevó a cabo una clasificación de los 10 clones que mostraron positividad en la prueba ELISA y TAUPIR para seleccionar los mejores (Tabla 4). Los resaltados en gris son los mejores 5 clones. 12.3 Hibridomas ACI-41 Se sometieron a detección selectiva los sobrenadantes celulares de las 8 x 96 placas de cavidades resultantes de la fusión para la producción de IgG. En las 768 placas (8 x 96 placas), 215 placas testeadas resultaron positivas respecto de la expresión de IgG y fueron transferidas a 24 placas de cavidades. En las 24 placas de cavidades, se hizo desarrollar 81 clones y se analizó el sobrenadante a partir de esas células. Los clones positivos fueron transferidos además en matraces T25 y los sobrenadantes fueron sometidos a detección selectiva para la producción de IgG, ELISA y TAUPIR (Tabla 5).
Los clones 5D10 y 7C2 fueron los únicos positivos en las 3 detecciones selectivas y fueron seleccionados por subclonacion. El clon 5D10 une solamente el péptido T8.5 mientras que el clon 7C2 une los dos péptidos de la vacuna ACI-41 (T8.5 y T9.5) (referirse a la Figura 10 en la solicitud de patenté de PCT (PCT/EP2010/054418).
El subclón 5D10A4 que se origina a partir de 5D10 era específico para el péptido p-tau. 1.3. Conclusión Los anticuerpos generados han mostrado una alta especificidad a los péptidos pTau con solo una unión marginal con los péptidos no fosforilados.
A partir de 4 fusiones (ACI-33, ACI-36, ACI-35 y ACI-41 ), se depositó un total de 16 clones en DSMZ (Tabla 1 ) y fueron seleccionados para una subclonación adicional.
Los clones madre positivos mencionados con anterioridad fueron cultivados en forma adicional en 96 placas de cavidades, luego en 24 placas de cavidades y por último, en matraces T25. En cada etapa, los sobrenadantes de los Clones de hibridoma fueron sometidos a detección selectiva por ELISA, TAUPIR y transferencia Western.
Ejemplo 2: Clonación de regiones variables de cadena ligera y pesada de anticuerpos Los genes de región variable pesada y ligera de anticuerpos a partir de células de hibridoma son clonados y las secuencias de ADN y la ubicación de las regiones que determinan complementariedad (CDRs) son determinadas así como también las características de unión de los anticuerpos.
Se preparó ARN total a partir de 3 x 106 células de hibridoma (1 vial) mediante el uso del Qiagen RNeasy mini kit (Cat No: 74104). Se eluyó ARN en 50 mL de agua y se lo verificó en un gel de agarosa al 1 ,2%.
Se prepararon cADNs VH y VK mediante el uso de transcriptasa inversa con cebadores de región constante IgG y kappa. Se ampliaron las primeras cadenas de cADNs mediante por PCR mediante el uso de un gran conjunto de cebadores de secuencia de señal. Los ADNs amplificados fueron purificados con gel y clonados en el vector pGem® T Easy (Promega). Los clones VH y VK obtenidos fueron evaluados para comprobar los insertos del tamaño esperado. La secuencia de ADN de clones seleccionados fue determinada en ambas direcciones por secuenciación de ADN automatizada. Las ubicaciones de las regiones que determinan complementariedad (CDRs) en las secuencias fueron determinadas con referencia a otras secuencias de anticuerpo (Kabat EA et al., 1991 ).
Ejemplo 3: Estudios de unión I El objetivo fue medir la unión de fosfo-tau (pTau) de los anticuerpos generados a partir de hibridomas subclonados derivados de ratones inmunizados con las vacunas liposomales tau. Para evaluar esto, se utilizó un ensayo de inmunoabsorción unida a enzimas (ELISA) para medir la unión de los anticuerpos purificados tanto en la proteína tau de longitud completa fosforilada y no fosforilada, así como también los péptidos antigénicos de tau fosforilados y no fosforilados empleados en la preparación de la vacuna liposomal.
La detección selectiva fue completada a través de otros dos métodos. Se realizó inmunohistoquímica (IHC) en secciones de cerebro de una animal transgénico tau (TAUPIR) mediante el uso de un anticuerpo antMau como el anticuerpo primario. En forma adicional, se llevó a cabo una transferencia Western (WB) en homogenatos de proteína de cerebro de ratones transgénicos tau, mediante el uso de un anticuerpo anti-tau como anticuerpo de transferencia. 3.1 Métodos 3.1.1 Ensayo de unión fosfo-tau Se generaron los anticuerpos anti-fosfo tau (isotipo lgG3 de ratón) de ratones vacunados con tau liposomal. Las vacunas liposomales eran preparaciones fosforiladas de un péptido fosfo-tau (p-tau). Los subclones de hibridoma que producen los anticuerpos anti-tau fueron seleccionados mediante la limitación de la dilución de los clones madre. Se realizó ¡sotipificación para indicar la presencia de un clon de un solo isotipo. Los anticuerpos fueron producidos en frascos rotativos, purificados por cromatografía de afinidad, sometidos a filtración estéril a 0,22 pm, y cuantificados. Para evaluar la unión del anticuerpo de tau y p-tau, se usó un ensayo ELISA. En resumen, se revistieron 96 placas de cavidades Nunc MaxiSorp (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 1 pg/mL de proteína tau de longitud completa (441 aa) (SignalChem, Richmond, Canadá) o proteína tau fosforilada de longitud completa (441 aa) (Vandebroek et al., 2005). En forma adicional, se revistieron placas con 10 pg/mL de péptido derivado de tau. Para realizar una prueba de capacidad de reacción cruzada en secuencias de tau y p-tau que no fueron usadas en la preparación de la vacuna, se revistieron placas con 10 g/mL de los siguientes péptidos: Tau5-20 (fosforilado y no fosforilado en Y18), Tau393-408 (fosforilado y no fosforilado en S396 y S404), Tau401-418 (fosforilado y no fosforilado en S404 y S409), Tau206-221 (fosforilado y no fosforilado en T212 y S214) y Tau196-211 (fosforilado y no fosforilado en S202 y T205). El revestimiento fue realizado durante la noche en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 °C. Se lavaron las placas con cuidado con 0,05% de Tween 20/PBS y luego fueron bloqueadas con 1 % de albúmina de suero bovino (BSA) en 0,05% de Tween 20/PBS durante 1 hora a 37 °C. Luego, se agregó el anticuerpo que estaba siendo sometido a prueba en una serie de dilución de 8 a 16 dos veces entre 20 y 0 pg/mL, y se lo dejo incubar ¡durante 2 horas a 37 °C. Luego, se lavaron las placas de acuerdo con lo descripto con anterioridad y se agregó anticuerpo secundario IgG antirratón conjugado con AP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Suffolk, Inglaterra) en una dilución de 1/6000 en 0,05% de Tween 20/PBS durante 2 horas a 37 °C. Después del lavado, se incubaron las placas con una solución de fosfatasa de hexahidrato disódico de p-nitrofenilfosfato (pNPP; Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) y se leyeron las placas a 405 nm después de 2 a 16 horas de incubación mediante el uso de un lector de placas ELISA. Los resultados son expresados como densidad óptica (DO). 3.12 Unión de anticuerpos anti-tau con ovillos tau en secciones de cerebro de animales transgénicos tau (TAUPIR) Se usaron cortes de cerebro de ratones transgénicos biGT doble transgénico adultos ( de más de 18 meses de edad) (ratones transgénicos GSK-3-beta cruzados con ratones TPLH, que contienen la isoforma más prolongada (441 aa) de tau humana con la mutación P301 L). En forma adicional, también se usaron secciones de ratones nuligénicos tau (TKO, de 6 meses de edad). Las secciones del cerebro fueron lavadas durante 5 minutos en PBS y luego se las incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente en 1 ,5% de H2O2 en PBS:MeOH (1 :1 ) para bloquear la actividad de peroxidasa endógena. Después de lavar las secciones 3 veces en PBST (PBS/0.1% TritonX100), fueron incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiente en una solución de bloqueo de PBST + 10% de FCS (suero de ternero fetal). La incubación con el anticuerpo anti-tau que se sometió a prueba fue realizada durante la noche a 4 °C en diluciones indicadas en PBST/10% FCS. Luego, se lavaron las secciones 3 veces en PBST antes de la incubación con anticuerpo secundario antirratón de cabra conjugado con HRP (adquirido en Dako, Glostrup, Dinamarca) en PBST/10% FCS durante 1 i hora a temperatura ambiente. Antes de la detección, se lavaron las secciones 3 j veces con PBST y se la incubó en 50 mM Tris/HCI con un pH de 7,6 durante 5 minutos. La detección se llevó a cabo mediante la incubación de las Secciones durante 3 minutos en diaminobencidina (DAB: 1 comprimido en 10 mi de 50 mM Tris.HCI + 3 ul H202 30%; MP Biomedicals, Solón, OH, EE. UU.). La reacción fue detenida mediante el lavado de las secciones 3 veces en PBST. Luego, se transfirieron las secciones a placas silanizadas y secadas con aire sobre una placa calentada a 50 °C durante 2 horas. El contraste de color fue realizado mediante el uso de incubación con hematoxilina Mayers (Fluka Chemie, Buchs, Suiza) durante 1 minuto, seguido de un paso de lavado durante 4 minutos bajo agua corriente. Se deshidrataron las secciones haciéndolas pasar por un baño al 50%, 70%, 90% y 100% de etanol (dos veces en este último caso), y luego dos veces por xilol durante 1 minuto. Por último, las secciones fueron colocadas sobre DePex (BDH Chemicals Ltd, Poole, Inglaterra) bajo una placa de vidrio.
Adicionalmente, se usaron sobrenadantes de hibridoma en dilución 1/10 (todos los anticuerpos derivados de ACI-35 mostrados en la Tabla 1 ) para secar membranas con proteínas de homogenados de cerebro separados por SDS-PAGE de ratones transgénicos tau, ratones de tipo salvaje o ratones knock-out tau. 3.1.3 Unión de anticuerpo anti-tau con ovillos tau en secciones de cerebro de pacientes con AD y tauopatías (TAUPIR) El ensayo de inmunorreacción del anticuerpo anti-tau ACI-36-3A8-Ab1 a p-tau en el cerebro humano fue realizado por TAUPIR.
Las secciones de parafina del cerebro fueron desparafinizadas haciéndolas pasar por xilol 2 veces durante 5 minutos y 2 veces durante 1 minuto jen 100% EtOH, seguido del lavado de 1 minuto en 90%, 70% y 50% de EtOH y agua destilada, seguido de 2 lavados de 5 minutos en PBS.
Para recuperar el antígeno, se trataron las secciones con calentamiento durante 10 minutos en solución 0,01 M de ácido cítrico en agua (con un pH de 6,0) y enfriamiento durante 20 minutos. Las secciones fueron incubadas durante 15 minutos a temperatura ambiente en 1 ,5% de H2O2 en PBS:MeOH (1 :1 ) para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. Después de lavar las secciones 3 veces en PBST (PBS/0,05%Tween-20), estas fueron incubadas durante 30 minutos en PBST + suero de ternero fetal al 10% (FCS) como solución de bloqueo. La incubación con el anticuerpo anti-ptau primario ACI-36-3A8-Ab1 (410 ng/mL en tampón de bloqueo) fue realizada durante la noche a 4 °C. Luego, i se lavaron las secciones 3 veces en PBST antes de la incubación con anticuerpo secundario antirratón de cabra conjugado con HRP (Dako, Glostrup, Dinamarca) diluido en una proporción de 1 a 500 en PBST/10% FCS durante 1 hora a temperatura ambiente. Antes de la detección, se lavaron las secciones 3 veces con PBS y se las incubó en 50 mM Tris/HCI con un pH de 7,6 durante 5 minutos. La detección fue realizada mediante la incubación de las secciones durante 3 minutos en diaminobencidina (DAB: 1 comprimido en 10 mL de 50 mM Tris-HCI + 3 pL H202 30%; MP Biomedicals, Solón, OH, EE. UU.). La reacción fue detenida mediante el lavado de las secciones 3 veces en PBS. El contraste de color fue realizado mediante el uso de incubación con hematoxilina Mayers (Fluka Chemie, Buchs, Suiza) durante 1 minuto, seguido de un paso de lavado durante 4 minutos bajo agua corriente. Se deshidrataron las secciones haciéndolas pasar por un baño al 50%, 70%, 90% y 100% de etanol (dos veces en este último casó), y luego dos veces por xilol durante 1 minuto.
Por último, las secciones fueron colocadas sobre DePex (BDH Chemicals Ltd, Poole, Inglaterra) bajo una placa de vidrio. Las secciones con tinción fueron i examinadas por microscopía por luz blanca e imágenes digitales tomadas con una cámara 3CCD (Leica, Wetzlar, Alemania). Se tomaron las imágenes y se las analizó mediante el uso de un software dedicado (IM500, Leica). Las imágenes son mostradas con una aplicación de 20 x 1 ,6. 3.1.4 Transferencia Western (WB) La unión del anticuerpo sometido a prueba a p-tau en el extracto de cerebro del animal transgénico fue realizada por WB. La homogenización del cerebro de ratones TKO, biGT, TPLH y FVB fue realizada en el tampón siguiente: 25 mM Tris/HCI pH7,6, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 30 mM NaF, 0,2 i mM Na3V04l 1 nM ácido ocádico, 1 mM fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), 5 mM Na4P207, 1 comprimido cóctel de inhibidor de proteasa completo (CPIC) por cada 12 mi en total. Para obtener un homogenato de cerebro total, se homqgenizó el cerebro en hielo en 1 vol/peso del hemisferio (ml/gr) con una mano de mortero de teflón/tubo de vidrio tipo alfarero accionado a motor a 700 rpm. Los homogenatos de cerebro totales fueron diluidos a la mitad en un tampón de muestra (125 mM Tris/HCI pH 6,8, 4% (p/v) sulfato de dodecilo de sodio (SDS), 20% glicerbl, 0,01 % azul bromofenol y 5% beta-mercapto-etanol), luego llevado con rapidez a 95 °C. Las muestras fueron mantenidas durante 5 minutos, diluidas a un cuarto en tampón de muestra, llevadas nuevamente a 95 °C y luego enfriadas y agitadas a 14.000 rpm durante 5 minutos para aclarar todo resto que no hubiera sido solubilizado. Se recolectaron los sobrenadantes y se los cargó en gel de SDS- PAGE. La transferencia en membrana nitrocelulosa (Hybond-ECL) fue realizada en un tampón de transferencia (25 mM Tris pH 8,6, 190 mM glicina, 20% metanol). Las membranas fueron transformadas en la solución de bloqueo (0,1 % de Tween de TBS (50 mM Tris.HCI, pH7,6, 150 mM NaCI y 5% de leche en polvo seca) antes de incubarlas durante la noche a 4 °C con el anticuerpo de la prueba diluido en la solución de bloqueo. La incubación con anticuerpo secundario de antirratón de cabra conjugado con HRP (Dako, Glostrup, Dinamarca) diluido en una proporción de 1 a 10.000 en solución de bloqueo fue llevada a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora. La detección se llevó a cabo mediante el uso de reactivos de detección por transferencia Western de ECI de GE Healthcare. 3.2 Resultados 3.2.1 Ensayo ELISA y TAUPIR usando secciones de cerebro en ratones tau transgénicos tau positivos en ovillo Se midió la unión de anticuerpos en comparación con el péptido tau fosforilado usado como inmunógeno, y con la proteína humana tau de longitud completa, fosforilada. Se trata de isoforma más prolongada de proteína humana tau que consiste en 441 aminoácidos. El péptido no fosforilado correspondiente y la proteina humana tau de longitud completa también fueron incluidos. De acuerdo con lo indicado en la Tabla 6, los anticuerpos demostraron una alta capacidad de unión con el péptido tau fosforilado, con una unión limitada o sin unión alguna a la proteína humana tau de longitud completa fosforilada. No se observó ninguna unión con el péptido tau no fosforilado correspondiente o con la proteína humana tau de longitud completa no fosforilada. Esto demuestra una alta capacidad de unión de anticuerpos anti-tau con los péptidos tau humana fosforilados.
Para evaluar la unión no específica respecto de otras secuencias tau fosforiladas y no fosforiladas, el anticuerpo fue sometido a una prueba para verificar la unión con cinco péptidos tau no fosfo y fosfo, uno de los cuales fue empleado como la secuencia de péptido de antígeno. No se observó ningún péptido tau fosfo o no fosfo con capacidad de reacción cruzada, salvo los péptidos usados en la vacuna, incluso a altas concentraciones de péptido.
La unión de anticuerpos anti-tau con p-tau en cerebros dé ratones transgénicos tau fue evaluada por tinción de TAUPIR (Figura 1 ) y por WB (Figura 2). Los anticuerpos que demuestran unión con ovillos tau y cabezas de európilos están presentes en la corteza y el hipocampo de los cerebros dé ratones transgénicos tau (biGT). Las diluciones de anticuerpo usadas para TAUPIR variaban de 0,05 a 0,0033 ug/mL. También se usaron anticuerpos antMau como un anticuerpo primario en una WB mediante el uso de homogenatos de cerebro totales de ratones TKO, biGT, TPHL y FVB de tipo salvaje y se separaron por SDS-PAGE. Se usaron dos anticuerpos anti-p-tau comerciales como controles, MC1 y Tau5. Todos los anticuerpos anti-tau unidos a pTau están presentes en los cerebros de ratones transgénicos tau.
Blotting En membranas que contenían homogenatos de proteína separados por SDS-PAGE de ratones transgénicos tau, ratones de tipo salvaje y ratones knock-out tau, todos anticuerpos ACI-35 (revelado en la Tabla 1 ) se unieron a bandas de proteína que tenían idéntico patrón de migración de 46 kDa que Tau y pTau (datos no mostrados). 3.2.2 Estudio de TAUPIR en secciones de cerebro de pacientes con EA y tauopatías La capacidad del anticuerpo ACI-36-3A8-A para unirse con agregados de tau alojados en secciones de cerebro humano de sujetos con tauopatías diagnosticadas, incluso EA, FAD, AGD, FTDP-17, CBD y PSP, fue examinada por inmunohistoquímica TAUPIR (Fgura 2). El anticuerpo anti-ptau ACI-36†3A8-Ab1 unido a p-tau que contiene ovillos neurofibrilares (NFTs), hilos de neurópilo en secciones de cerebro humano y otras formas de acumulaciones de p-tau presentes en neuronas y en tipos de célula glial. En forma más específica, NFTs con tinción prominente de ACI-36-3A8-Ab1 , hilos de neurópilo y neuritos distróficos que rodean las placas amiloides en cerebros con EA, que resultó de fácil observación en los sujetos diagnosticados con EA y FAD. En secciones de cerebro de AGD, tanto NFTs con tinción de ACI-36-3A8-Ab1 y los hilos de neurópilo con múltiples gránulos/granos argirofílicos claramente visibles (Figura 2). La tinción de las secciones de cerebro de PSP con ACI-36-3A8-Ab1 mostraron NFTs, hilos de neurópilo y neuritos distróficos. En forma adicional, las inclusiones tipo cuerpo de Pick y los astrositos positivos p-tau en penacho fueron advertidos con claridad al ser una característica abundante en PSP, donde la tinción de p-tau se extiende a través de toda la célula, incluso en procesos distales. En FTDP-17, el patrón de tinción también ilustró la heterogeneidad conocida de la enfermedad, no solo con NFTs detectados sino también con neuronas "aglobadas" acromáticas. El anticuerpo ACI-36-3A8-Ab1 también coloreó neuronas acromáticas hinchadas que eras ligeramente tau positivas, característica principal de CBD. Otra característica patológica prominente de CBD, es decir las inclusiones oligodendrogliales, denominadas cuerpos en espiral, también fueron bien detectadas por el anticuerpo ACI-36-3A8-Ab1. No se detectó ninguna tinción en un sujeto control AT8 negativo mientras que se identificó una tinción débil en un I sujeto control AT8 positivo.
El uso de TAUPIR en secciones de cerebro humano de sujetos a los que previamente se les ha diagnosticado diferentes formas de tauopatía, el anticuerpo anti-ptau ACI-36-3A8-Ab1 demostró una buena unión con varias características patológicas ricas en p-tau presentes en los cerebros de estos sujetos.
Ejemplo 4: Estudios de unión II El objetivo del estudio fue el de determinar la afinidad de unión entre los anticuerpos anti-tau y el péptido fosfo-tau mediante el uso de resonancia de plasmón superficial (SPR). El péptido fosfo-tau corresponde a la secuencia de péptido usada en la preparación de la vacuna para generar el anticuerpo anti-tau. Para estudiar esta interacción, se inmovilizaron fosfopéptidos en la superficie de un chip sensor y se monitoreó la unión en tiempo real utilizando SPR al hacer pasar el anticuerpo sobre el chip. ??_ Métodos I 4.1.1 Ensayo de unión por SPR Todos los experimentos de SPR fueron llevados a cabo en un instrumento Biacore X (GE Healthcare). Los reactivos para la inmovilización (EDG, NHS y etanolamina), el chip sensor CM5 (carboximetildextrano) así como también el HBS-EP del tampón de corrida fueron adquiridos de GE Healthcare. Se solubilizaron péptidos fosfo-tau en PBS/tampón de acetato sódico (10 mM, con un pH de 5,0) en una relación de 1 :1 vol/vol para dar una concentración de péptido final de 250 Mg/ml. Esta solución de péptido fue luego acoplada a través de una célula de flujo (fe) 2 de un chip sensor CM5 que fue previamente activado mediante EDC/NHS. Después del acoplamiento, se pasó etanolamina; sobre la superficie, lo que dio un nivel de inmovilización final de 218 RUs. Se sometieron a ensayo cinco concentraciones de los anticuerpos anti-tau mediante diluciones en serie a través de un tampón de corrida. Se produjeron inyecciones comenzando por la concentración más baja y se pasaron por la fe 1 y 2 a una velocidad baja de 30 pL/min durante 180 segundos. La célula de flujo 1 fue no derivatizada y las respuestas fueron tomadas de fe 2 para corregir el ruido del instruménto y los cambios de refracción de masa. Una vez finalizada la inyección, se lavaron las superficies de inmediato con tampón de corrida durante 300 segundos. Para eliminar el anticuerpo unido restante del chip, se llevó a cabo una regeneración de superficie mediante la inyección de un pulso (típicamente de 3 µ?) de NaoÓH 8 mM en NaC1 1 M con contenido de agua. Se realizó un análisis cinético mediante el uso de algoritmos para integración numérica y análisis global a través de BIAevaluation 3.0. Los sensogramas obtenidos para las inyecciones de anticuerpo I en diferentes concentraciones superpuestos y las líneas de base ajustadas en i cero. Para el ajuste de la curva, se adaptaron todos los datos en forma simultánea a un modelo homogéneo 1 :1 (Langmuir).
De modo alternativo, se inmovilizó el péptido T3 biotinilado inmovilizado (T3.30) en un chip de estreptavidina Biacore SA (GE Healthcare) usando un instrumento Biacore X. Los anticuerpos se diluyeron en tampón de corrida de HBS-EP (GE Healthcare) y se inyectaron a 50 ul/min durante 120 s seguido de 100 s de disociación. La regeneración superficial se realizó usando un pulso (1-3 ul) de 16 mM de NaOH. El filtrado se realizó usando BIAevaluación y asumiendo una interacción de unión de Langmuir de 1 :1.
Péptidos utilizados 4.2 Resultados La unión de los anticuerpos anti-tau con el péptido tau fosforilado fue monitoreada en tiempo real mediante el uso de SPR. Podrían emplearse análisis de fases de asociación y disociación de unión de anticuerpos para determinar la constante de velocidad de asociación (ka), la constante de velocidad de disociación (/¾) así como también la constante de disociación KD. El anticuerpo ACI-33-6C10-Ab1 se une específicamente con un péptido T1.5 sobre la superficie de carboximetildextrano no derivatizada en el rango de 3.7? 367 nM i del anticuerpo. Los análisis cinéticos de los sensogramas revelaron una constante de velocidad de asociación de 9,46 x 105 M~V1 y la constante de velocidad de disociación de 3,27 x 10~3 s~1 (Tabla 7). Por lo tanto, la constante de disociación KD fue determinada en 3,46 nM, lo que muestra que el anticuerpo reconoce el fosfopéptido T1.5 con una muy alta afinidad. Todos los anticuerpos evaluados mostraron una alta afinidad respecto de sus fosfopéptidos respectivos usados para la inmunización y la generación de hibridomas, pero también demostraron una pequeña afinidad con los no fosfopéptidos.
Ejemplo 5: Mapeo de epítope de anticuerpos anti-p-tau 5.1 Métodos El mapeo de epítope de anticuerpos monoclonales de ratón anti fosfo tau fue realizado por ELISA mediante el uso de diferentes librerías de fosfo o no fosfo péptidos. Las secuencias de aminoácidos de librerías de péptidos usadas son mostradas en la Tabla 8. Cada librería consistía en péptidos biotinilados cortos que abarcan secuencias fosfo y no fosfo presentes en la vacuna de péptido. Las librerías de péptidos fueron adquiridas en ANAWA Trading S.A. El mapeo de epítope fue realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Mimotopes). En resumen, las placas revestidas con estreptavidina (NUNC) fueron bloqueadas con BSA al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante la noche a 4 °C. Después del lavado con PBS- Tween 20 al 0,05%, las placas fueron revestidas durante 1 hora a temperatura ambiente con los diversos péptidos de cada librería/diluidos en BSA al 0,1 %, azida de sodio al 0,1 % en PBS hasta llegar a una concentración final de 10 µ?. Después del lavado, se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo a ser sometido a ensayo diluido en 40 ng/ml en BSA al 2%, y azida de sodio al 0,1% en PBS. Se lavaron las placas en anticuerpo secundario IgG antirratón conjugado con AP ((Jackson ImmunoResearch Laboratories, Suffolk, Inglaterra) en una dilución dé 1/6.000 durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado final, se llevaron las placas incubadas con una solución sustrato de fosfatasa de hexahidrato de p-nitrofenilfosfato disódico (pNPP, Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) y se leyeron las placas a 405 nm transcurridas 2 horas de la incubación mediante el uso de un lector de placas ELISA. La unión fue considerada positiva si la densidad óptica (DO) era de al menos 2 veces mayor que la DO base. 5.2 Resultados Como resultado de los experimentos de mapeo de epítope, los epítopes podrían ser identificados a través de la inclusión del residuo de aminoácidos fosforilados requeridos (referirse a la Tabla 9) al que los anticuerpos divulgados en la presente se unen específicamente.
· Tau aa 15-20, con un requerimiento de pY18 (6C10F9C12A1 1 ; 6C10E5E9C12) • Tau aa 405-412, con un requerimiento de pS409 (6H1A1 1 C1 1 ; 6H1 G6E6) • Tau aa 405-411 , con un requerimiento de pS409 (2B6A10C11 ; 2B6G7A12; 3A8A12G7; 3A8E12H8) · Tau aa 208-218, con un requerimiento de pT212 y pS214 (7C2(1 )F10C10D3) • Tau aa 393-401 , con un requerimiento de pS396 (A4-2A1-18; A4-2A1-40) • Tau aa 396-401 , con un requerimiento de pS396 (A4-4A6-18) • Tau aa 394-400, con un requerimiento de pS396 (A6-1 D2-12) , · Tau aa 402-406, con un requerimiento de pS404 (A6-2G5-08) • Tau aa 393-400, con un requerimiento de p396 (A6-2G5-30; A6-2G5-41 ) Ejemplo 6: Inmunización pasiva de unas semana de ratones transgénicos tau 6.1. Métodos i Para todos los estudios in vivo, se usaron ratones transgénicos tau a los que se les administró el tratamiento de anticuerpos de acuerdo con lo mostrado en la Tabla que aparece a continuación.
Ratones transgénicos y anticuerpos usados para estudios in vivo *control del vehículo para todos los estudios; en forma intraperitoneal (i.p;) 6.1.1. Ratones y los tratamientos Se usaron ratones Tg macho y hembra de 6,3 meses de edad (±3 días) de sobreexpresión de la ¡soforma TAU441 de tau humana de longitud completa, que soportan mutaciones de cambio de sentido V337M y R406W bajo el control de activador de murino Thy-1 (ratones TMHT), para el estudio N.° 1 (referirse a la Tabla que se encuentra más abajo). Los ratones fueron sometidos a eutanasia 1 día después de la última administración para determinar la patología tau en el cerebro. 6.1.2 Identificación y alojamiento del animal I En el transcurso de proceso para la genotipificación, a los animales se los numeró en forma consecutiva a través de la clásica marca en la oreja. Se volvió a determinar el genotipo de todos los animales antes del inicio del estudio. Los ratones fueron mantenidos de acuerdo con los procedimientos operativos estándar de JSW sobre la base de estándares internacionales. Se colocó a los animales en jaulas individuales ventiladas con una base para roedores estandarizada de Rettenmaier®. Se mantuvo la temperatura a alrededor de 24 °C y la humedad relativa fue mantenida entre 40% y 70%. Los animales fueron alojados según un ciclo de luz constante (12 horas de luz/oscuridad). Los animales disponían ad libitum de agua corriente normal y alimento para roedores estándar, seco, en pastillas (Altromin®). Se comprobaban los signos clínicos en forma regular a cada uno de los animales y se tomaba nota en una planilla individual de cada animal.
I 6.1.3. Sangrados in vivo Transcurridos siete días desde la primera inmunización, se provocaban sangrados in vivo por muestreo mandibular de la vena/arteria facial. Las; muestras de sangre son una combinación de sangre venosa y arterial. Para obtener el plasma, se reunía sangre en tubos de heparina y se los centrifugaba (1000 x g, 10 minutos, temperatura ambiente). Se congelaba el plasma en dos alícuotas hasta su uso. i 6.1.4. Análisis cuantitativo inmunohistoquímico (IHC) Se analizaron los hemisferios de todos los cerebros criocongelados. Se cortaron en forma longitudinal 15 criosecciones por nivel (5 niveles en total), cada una de 10pm de espesor (Leica CM 3050S). Se eligieron los niveles cerebrales de acuerdo con el atlas morfológico sobre el cerebro del ratón de Paxinos y Frankin (2da edición). El corte de los cinco niveles comenzó con un corte aleatorio y el posterior muestreo continuo de manera uniforme y sistemática, siempre manteniendo 15 cortes por nivel en series y descartando 150 pm entre los niveles.
Para determinar la patología tau en el hipocampo y las amígdalas, se sometieron a tinción 5 cortes (1 de cada nivel) por región cerebral y animal mediante el uso de anticuerpos AT180 (N.° MN1040, Thermo Scientific) y HT7 (N.° MN1000, Thermo Scientific). Se visualizaron los anticuerpos primarios por el anticuerpo secundario acoplado a Cy-3 (Jackson Laboratories) y con posterioridad, se evaluó el área inmunoactiva mediante el uso de software Image Pro Plus (versión 6.2).
Se midieron objetos inmunoactivos sobre una restricción de tamaño (30 pm2 en las amígdalas, 7 pm2 en el hipocampo) y sobre un umbral de intensidad dinámico. Se registró en forma automática el área total y la intensidad total de los objetos y el umbral individual. De usarse, se definió el umbral dinámico como la "intensidad media dentro del AOI más la cantidad de veces del factor de la desviación estándar de intensidades de píxeles dentro del AOI". En cualquiera de los casos, los valores debían exceder un umbral mínimo establecido. Los niveles exactos del umbral son dados en la tabla siguiente.
Umbrales Valor mínimo Factor dinámico Amígdala AT180 25 2 Hipocampo AT180 28 Amígdala HT7 35 2 Hipocampo HT7 25 05 El tamaño de la región fue medido por delineación manual del hipocampo y de la amígdala. Se normalizaron los datos del área HT7 y AT180 IR al tamaño de las regiones.
Los datos relacionados con todos los IHC con n > 4 siguieron una distribución gaussiana de acuerdo con la prueba de normalidad de Kolmogorov Smirnov y son representados como media + SEM. Para el grupo vehículo que consiste en cuatro animales solamente, por lo que resultan demasiado pocos para una prueba de normalidad, se dio por supuesta la distribución gaussiana. Se calcularon diferencias de grupo mediante ANOVA paramétrica de un sentido seguida de una prueba post hoc de Newman Keuls, calculada con software GraphPadPrism. El nivel de error alfa fue establecido en 0,05.
Se determinó la patología tau del cerebro en el hipocampo y en la amígdala mediante un análisis cuantitativo inmunohistoquímico (IHC) a través del uso de anticuerpos AT180 (anti-ptau) y HT7 (anti-tau). Además, los efectos del tratamiento sobre tau y p-tau soluble en la corteza y en el hipocampo fueron medidos en la fracción homogénea soluble mediante el uso de tecnología doble MesoScale Discovery (MSD), que sondea p-tau y tau total.
Ninguno de los anticuerpo usado para el ensayo de IHC o el; de MSD cuentan con un epítope que se superponga con los dos anticuerpos del tratamiento usados en este estudio. 6.1.5. Generación de la fracción para el análisis cuantitativo del nivel de proteína tau soluble en las fracciones cerebrales solubles de ratones Tg Los ratones tratados de acuerdo con el método 6.1.1 fueron sometidos a eutanasia 1 día después de la segunda administración para determinar la patología tau en el cerebro. En resumen, se homogeneizaron muestras de corteza solubles de un hemisferio cerebral en 100 a 200 pL de tampón de extracción en frío (25 mM Tris-HCI pH=7,4, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mM ß-glicerofosfato, 30 mM NaF, 2 mM Na3V04, cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa). Se centrifugaron los homogenatos (74.200 x g durante 15 minutos a una temperatura de 4 °C) y se usaron los sobrenadantes para el análisis de tau soluble. Se determinó la concentración de proteína total en las fracciones solubles de muestras de corteza mediante un ensayo de cuantificáción de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.). 6.1.6. Análisis de la presencia de p-tau por transferencia Western Para investigar la inmunorreactividad de los cerebros de ratones a los que se les administró ACI-36-2B6-Ab2 y ACI-36-3A8-Ab2, se usaron dos anticuerpos que, según los informes, unen epítopes de PHF p-tau (Greenberg et al., 1992; Reig et al., 1995; Hoffmann et al., 1997) en ensayos de transferencia Western (WB).
Se diluyeron fracciones solubles de la corteza mediante el agregado de un volumen igual de tampón de muestra A (125 mM Tris/HCI pH 6,8, 4% (p/v) sulfato de dodecilo de sodio (SDS), 20% glicerol, 0,01 % azul bromofenol y 5% beta-mercapto-etanol), y luego se llevaron las muestras a una temperatura de 95 °C durante 10 minutos.
Se cargaron 30 pg de muestra en un gel Bis-Tris de 4-12% (Invitrogen, Basel, Suiza) y se corrió el tampón de SDS OPS (Invitrogen). Las proteínas fueron transferidas a una membrana de PVDF de 0,45 pm en un tampón de transferencia (25 mM Tris pH 8,6, 190 mM glicina, 20% metanol). Para verificar la transferencia de proteína, se sometieron a tinción las membranas con Ponceau S durante 5 I minutos, se las lavó y bloqueó durante 1 hora en tampón de bloqueo (BSA al 5% en TBS [50 mM Tris-HCI, pH 7,6, 150 mM NaCI]). Se transfirieron las membranas durante la noche a 4 °C con los anticuerpos primarios en tampón de bloqueo y Tween al 0,1%. Los dos anticuerpos primarios de PHF específico p-tau usados para las WBs fueron: anti-pS396 (PHF-13 epítope; AbCam, Cambridge, Reino Unido; usado en 3 pg/mL), específico de Ser396 (pS396) fosforilado de ¡p-tau de murino humana (Hoffmann et al., 1997), y AD2 (PHF-1 epítope; BioRad, Reinach, Suiza; usado en 0,4 pg/mL), específico para murino pS396 y humana y Ser404 fosforilado (pS404; Reig et al., 1995). Para WBs de tau totales, Tau5 (0,5 pg/mL), se usó un anticuerpo que liga tau humana y murino (BD Biosciences, Allschwil, Suiza). Después de la incubación con el anticuerpo primario, se lavaron las membranas con Tween al 0,1% en TBS, y se las incubó con los anticuerpos secundarios: antirratón de cabra-IEDye 800 o anticonejo de cabra IRDye 680 (ambos de Li-Cor Biosciences, NE, EE. UU.) ambos diluidos en 1 :15.000 en BB y Tween al 0,1 %. Luego, se incubaron las membranas durante 1 hora a temperatura ambiente protegidas de la luz, se las lavó durante 15 minutos 3 veces con Tween al 0,1 % en TBS, y durante 5 minutos 2 veces con TBS, y se cuantificaron las bandas mediante el uso del sistema por imágenes infrarrojas cercanas Odyssey de Li-Cor (Li-Cor). Las bandas fueron normalizadas a la expresión de beta-actina (AbCam; que se usó a 0,4 pg/mL). Para verificar la identificación de las bandas transgénicas humanas en comparación con las tau endógenas de ratón, se investigaron las transferencias con un anticuerpo específico para tau total humana (Tau13, AbCam; que no se muestran). En forma adicional, se investigaron las membranas con un anticuerpo primario antirratón, para verificar ¡ que los anticuerpos del tratamiento, ACI-36-2B6-Ab2 y ACI-36-3A8-Ab2, no estuvieran presentes en las muestras de las pruebas desnaturalizadas en una cantidad suficiente como para que interfieran en la unión de anti-pS396 o AD2. No se detectaron anticuerpos del tratamiento intactos o desnaturalizados (cuyos resultados no se muestran) en las muestras usadas para este estudio. 6.1.7. Análisis estadístico Se analizaron los datos mediante el uso de estadísticas de suma de rangos de Kruskal-Wailis, y de ser significativo a un nivel de P < 0,05, se usó la prueba post hoc de Dunn que compara todos los grupos (GraphPad Prism, GraphPad Software, CA, EE. UU.). Los resultados son presentados como puntos de datos individuales que muestran una media + SEM. Se consideraron las diferencias con P < 0,05 como significativas desde el punto de vista estadístico. 6.2 Resultados 6.2.1. Patología tau cerebral por análisis cuantitativo inmunohistoquímico (IHC) Dos inyecciones i.p. de ACI-36-2B6-Ab2 y ACI-36-3A8-Ab2 no mostraron ningún efecto colateral importante durante el período del estudio. La tinción para pT231 y pS235 mediante el uso de AT180 por IHC mostró una mayor área inmunorreactiva (IR) en la amígdala después del tratamiento con ACI-36-3A8-Ab2. Los ratones tratados con 3 mg/kg de ACI-36-2B6-Ab2 presentaban un área IR de AT 180 significativamente menor en el hipocampo.
El tratamiento con ACI-36-3A8-AB2 aumentó p-tau de IR con AT 180 en comparación con el grupo PBS en la amígdala. En el hipocampo, el tratamiento con ACI-36-2B6-AB2 redujo la p-tau. AT 180 etiqueta específicamente p-tau. La frecuencia de células IR de AT 180 fue reducida en los ratones tratados con ACI-36-2B6-AB2. Este efecto fue mayor en el grupo de dosis baja (3 mg/kg) (ACI-36-2B6-AB2 LD). El patrón de tinción somal no difiere entre los grupos.
A mayores dosis de 10 mg/kg, se observó una tendencia no significativa para menos IR de AT 180 en el hipocampo tanto para ACI-36-2B6-Ab2 como para ACI-36-3A8-Ab2, cuando se lo comparó con los ratones tratados con el vehículo control. En forma cualitativa, los animales tratados con ACI-36^2B6-Ab2 mostraron una cantidad menor de neuronas hipocampales con un etiquetado de AT180 muy intenso. 6.2.2. Reducción del nivel de tau total en la fracción cerebral posterior a la inmunización pasiva El efecto de los tratamientos en p-tau y tau en la fracción cerebral que contiene proteínas solubles fue medido mediante el uso de un ensayo doble de MSD. Los niveles de TAU soluble total en la corteza se vieron muy reducidos en los ratones tratados con ACI-36-2B6-Ab2 y ACI-36-3A8-Ab2 (p<0.01 ; Figura 3, panel superior). Los niveles de Piau soluble también se vieron muy reducidos (p < 0,05; Figura 3, panel inferior), donde la dosis de 3 mg/kg de ACI-36-2B6-Ab2 demuestra la gran reducción (p < 0.01 ). La relación entre Piau y TAU total permaneció sin cambios. Los niveles de TAU soluble y pTAU no cambiaron en las muestras del hipocampo (que no se muestran aquí). 6.2.3. Efectos de la administración de ACI-36-2B6-Ab2 y ACI-36-3A8-Ab2 en la presencia de epítopes fosfo-tau que se encuentran en filamentos helicoidales pareados (PHFs) En un sentido estructural, los ovillos neurofibrilares (NFTs) consiste en filamentos helicoidales pareados (PHFs) compuestos por la proteína tau asociada a microtúbulos, que se encuentra principalmente en un estado hiperfósforilado (Alonso et al., 1997). El objetivo de este estudio fue el de usar anticuerpos que reconocen PHF de pTau para investigar y cuantificar estos epítopes dé PHF de pTau en los cerebros de ratones transgénicos Tau, después de la administración de ACI-36-2B6-Ab2 y ACI-36-3A8-Ab2.
Para medir los efectos de dos administraciones de ACI-36-2B6-Ab2 o ACI-36-3A8-Ab2 en la cantidad de fosfo epítopes de PHF Tau bien documentada, se investigaron fracciones solubles de corteza cerebral dé ratones tratados Tg Tau con AD2 (epítope PHF-1 , pS396/pS404) y anticuerpo ahti-pS396 (epítope PHF-13, pS396) mediante el uso de WBs. Se cuantificó la inmunorreactividad mediante el uso de un sistema por imágenes infrarrojas. Los efectos del tratamiento de ACI-36-3A8-AB2 y ACI-36-2B6-AB2 en la inmunorreactividad de PHF de AD2 en la corteza de ratones Tg Tau fueron determinados a través de AD2 que estudia pS396 y pS404, dos residuos fosfo de PHF de Tau documentados con anterioridad (Greenberg et al., 1992; Réig et al., 1995).
Se cuantificaron las bandas, lo que indica pTau humana y de ratón fosforilada en S396 y S404 mediante el uso del anticuerpo AD2 (PHF-1 ), a través del uso de un sistema por imágenes infrarrojas de Li-Cor. Se determinaron los valore para cada uno de los ratones así como también la media ± SEM.
Se observó una tendencia no significativa para una reducción en la inmunorreactividad de pTau de AD-2 positivo para la banda de pTau humana transgénica. No obstante, se observó una reducción significativa en la cantidad de pTau de AD2 positiva de ratón en los ratones tratados con 3 mg/kg de ACI-36-2B6-Ab2 y una tendencia no significativa cuando se los trató con 10 mg/kg de ACI-36-2B6-Ab2 o ACI-36-3A8-Ab2.
Cuando se usó un anticuerpo diferente que reconoce específicamente pTau pS396 para realización una tinción (Hoffmann et al., 1997), se observó un efecto incluso mayor. Los ratones tratados con 3 mg/kg de ACI-36-½B6-Ab2 presentaban pTau endógena de ratón y humana de pS396 positiva menos significativa, con una tendencia hacia la reducción cuando son tratados con 10 mg/kg de ACI-36-2B6-Ab2 o ACI-36-3A8-Ab2. Para evaluar los efectos en Tau total de ratón y humana, que incluye tanto pTau total y fosforilada, se verificaron las transferencias con el anticuerpo Tau5. En comparación con el vehículo control, no se moduló Tau total por ACI-36-2B6-Ab2 o ACI-36-3A8-Ab2 administrado en 10 mg/kg, sin embargo, se observó una tendencia para Tau total reducida para ACI-36-2B6-Ab2 administrado de ratón en 3 mg/kg. 6.2.4 Compendio Dos administraciones periféricas de Tau Tg de ratón con el anticuerpo ACI-36-3A8-Ab2 anti-pTAU redujeron en forma significativa TAU soluble: y pTAU soluble en la corteza cerebral. Dos administraciones periféricas de Tau Tg de ratón con el anticuerpo ACI-36-2B6-Ab2 anti-pTAU redujeron en forma significativa TAU soluble y pTAU soluble en la corteza cerebral. En forma adicional, en el hipocampo, el ACI-36-2B6-AB2 redujo en forma significativa la inmunorreactivida de pTAU. Estos resultados demuestran la capacidad de inmunización anti-pTAU pasiva mediante el uso de anticuerpos ACI-36-2B6-Ab2 y ACI-36-3A8-Ab2 para reducir la tauopatía.
Dos administraciones periféricas de ACI-36-2B6-Ab2 en 3 mg/kg a ratones Tg Tau redujeron la presencia de epítopes de PHF pTau en la corteza de acuerdo con lo medido por transferencia Western. A una dosis mayor de 10 mg/kg, tanto ACI-36-2B6-Ab2 como ACI-36-3A8-Ab2 demostraron una tendencia reducida a la inmunorreactividad de epítope de PHF de pTau. Estos resultados muestran que los anticuerpos ACI-36-2B6-Ab2 y ACI-36-3A8-Ab2 pueden ser usados en forma adecuada en inmunoterapia pasiva contra tauopatías tales i como la enfermedad de Alzheimer. i Ejemplo 7: Tratamiento de 1 mes en ratones que sobreexpresan Tau humana 7.1 Métodos 7.1.1 Ratones y los tratamientos Se usaron ratones transgénicos tau a los que se les administró el tratamiento de anticuerpos de acuerdo con lo mostrado en la Tabla en el Método 6.1. (Estudio N.° 2.) 7.1.2. Prueba de comportamiento: tarea de laberinto de agua de Morris (MWM) Después de la última administración, se llevó a cabo la tarea de laberinto de agua (MWM) para evaluar el rendimiento de la memoria espacial en ratones tratados de acuerdo con el 6.1.1. La prueba de MWM fue llevada a cabo con todos animales enjaulados en 4 semanas después del inicio. La MWM consiste en un recipiente circular blanco con un diámetro de 100 cm, lleno de agua corriente a una temperatura de 21 ±2 °C. El recipiente está virtualmente dividido en cuatro sectores. Se coloca una plataforma transparente (de 8 cm de diámetro) de alrededor de 0,5 cm por debajo del nivel del agua. Durante todas las sesiones de la prueba, la plataforma es ubicada en el cuadrante sudoeste del recipiente. Cada ratón debe realizar tres intentos en cada uno de los cuatro días consecutivos. Un solo intento duró un máximo de un minuto. Durante ese tiempo, el ratón tuvo la oportunidad de encontrar el objetivo diáfano oculto. Después de cada intento, se dejó descansar a los ratones sobre la plataforma durante 10-15 segundos para que se orienten en los alrededores. Al menos una hora después del último intento en el día 4, los ratones debieron completar una prueba de sondeo (PT). Durante la PT, se retiró la plataforma del recipiente y la persona a cargo del experimento registró la cantidad de veces que cada ratón cruzó sobre la posición objetivo i anterior junto con la permanencia en este cuadrante. Para la cuantificaéión de la i latencia de escape (el tiempo [en segundos] que necesitó el ratón para encontrar i la plataforma oculta y por lo tanto, escapar del agua), del camino (la longitud de la I trayectoria [en metros] para alcanzar el objetivo), de los cruces de la zona objetivo y de la permanencia en el cuadrante objetivo en la PT, se usó un sistema de seguimiento computarizado (Biobserve Software). Todos los animales debían realizar una prueba visual después de la PT en el último día para eliminar la influencia de capacidades visuales insuficientes en los resultados de comportamiento. 7.1.3. Determinación de la patología tau cerebral por análisis cuantitativo inmunohistoquímico (IHC) Los ratones fueron sometidos a eutanasia 1 día después de la prueba de MWM (1 semana después de la última administración) para determinar la patología Tau en el cerebro. Se determinó la patología Tau del cerebro en el hipocampo y en la amígdala mediante un análisis cuantitativo inmunohistoquímíco (IHC) a través del uso de anticuerpos AT180 (anti-pTau, pT231/pS235) y HT7 (anti-Tau específico de humano). Además, los efectos del tratamiento sobre Tau y pTau soluble en la corteza y en el hipocampo fueron medidos en la fracción homogénea mediante el uso de tecnología doble MesoScale Discovery (MSD), que sondea pTau (pT231 ) y Tau total. Ninguno de los anticuerpos usados para el ensayo de IHC o el de MSD cuentan con un epítope que se superponga con el anticuerpo del tratamiento usado en este estudio. 7.1.4. Preparación de la muestra para el análisis de Tau soluble en la corteza y en el hipocampo Los ratones fueron sometidos a eutanasia durante la recolección de tejido, una semana después de la última administración del tratamiento. Se homogeneizaron la corteza y el hipocampo en 100 a 200 pL de tampón de extracción en frío 1 (25 mM Tris-HCI pH=7,4, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mM ß-glicerofosfato, 30 mM NaF, 2 mM Na3V04, cóctel de inhibidor de proteasa y fosfatasa). Se centrifugaron los homogenatos (74.200 x g durante 15 minutos a una temperatura de 4 °C) y se usaron los sobrenadantes para el análisis de Tau soluble en la corteza y en el hipocampo (Figura 4). Se volvieron al suspender los gránulos en 100-200 pL de tampón de extracción 2 (10 mM Tris HCI pH=7,4, 800 mM NaCI, 300 mM sacarosa, 1 mM de EGTA, cócteles de inhibidores de fosfatasa y proteasa) y los transfirió a un tubo de 1 ,5 mL. Se centrifugaron las soluciones (4.000 g durante 20 minutos a una temperatura de 4 °C) y se transfirieron los sobrenadantes a tubos de ultracentrifugación. Luego, se agregó sarcosilo (una solución acuosa al 30%) a la concentración final de 1% y se la incubó durante 1 ,5 horas a temperatura ambiente. Después de la centrifugación (74.200 g durante 30 minutos a una temperatura de 4 °C) se descartaron los sobrenadantes y se volvieron a suspender los gránulos en 100 µ?_ de tampón 3 (50 mM Tris-HCI, pH=7,4). Se usaron los gránulos vueltos a suspender como Tau insoluble en sarcosilo (SinT) en la corteza y en el hipocampo. Se determinó la concentración de proteína total en las muestras de fracciones solublés y SinT mediante un ensayo de cuantificación de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.). 7.1.5. Transferencia Western para Tau y PHF pTau Para investigar el efecto de la administración de ACI-36-2B6-Ab1 en presencia de PHF pTau en la corteza cerebral y en el hipocampo, se informó que dos anticuerpos unen epítopes de PHF pTau (Greenberg et al., 1992; Reig et al., 1995; Hoffmann et al., 1997) en ensayos de transferencia Western (WB). Las fracciones solubles y SinT de la corteza y del hipocampo fueron diluidas mediante el agregado de un volumen igual del tampón de muestra A (125 mM Tris/HCI pH 6,8, 4% (p/v) sulfato de dodecilo de sodio (SDS), 20% glicerol, 0,01% azul bromofenol y 5% beta-mercapto-etanol), y luego se llevaron las muestras a una temperatura de 95 °C durante 10 minutos. Se cargaron 30 pg de muestra en un gel Bis-Tris de 4-12% (Invitrogen, Basel, Suiza) y se corrió el tampón de SDS MOPS (Invitrogen). Las proteínas fueron transferidas a una membrana de PVDF de 0,45 pm en un tampón de transferencia (25 mM Tris pH 8,6, 190 mM glicina, 20% metanol). Para verificar la transferencia de proteína, se sometieron a tinción las membranas con Ponceau S durante 5 minutos, luego se las lavó y bloqueó durante 1 hora en tampón de bloqueo (BSA al 5% en TBS [50 mM Tris-HCI, pH 7,6, 150 mM NaCI]). Se transfirieron las membranas durante la noche a 4 °C con los anticuerpos primarios en tampón de bloqueo y Tween al 0,1%.
Los dos anticuerpos primarios de PHF específico p-tau usados para las WBs fueron: ant¡-pS396 (PHF-13 epítope; AbCam, Cambridge, Reino Unido; usado en 3 pg/nnL), específico de Ser396 (pS396) fosforilado de p-tau de murino humana (Hoffmann et al., 1997), y AD2 (PHF-1 epítope; BioRad, Reinach, Suiza; usado en 0,4 pg/mL), específico para murino pS396 y humana y Ser404 fosforilado (pS404; Reig et al., 1995). Para investigar el efecto de la administración de ACI-36-2B6-Ab1 en presencia de PHF pTau en la corteza cerebral y en el hipocampo, se informó que dos anticuerpos unen epítopes de PHF pTau en ensayos de transferencia Western (WB). Para WBs de Tau totales, Tau5, se usó un anticuerpo que liga Tau humana y murino (BD Biosciences, Allschwil, Suiza) en 0,5 pg/mL. Se transfirieron todas las membranas en forma adicional para que se normalizara la beta-actina (AbCam; usada a 0,4 pg/mL) para la carga de proteína.
Después de la incubación con el anticuerpo primario, se lavaron las membranas con Tween al 0,1% en TBS, y se las incubó con los anticuerpos secundarios: antirratón de cabra-IRDye 800 o anticonejo de cabra IRDye 680 (ambos de Li-Cor Biosciences, NE, EE. UU.) ambos diluidos en 1 :15.000 en BB y Tween al 0,1%. Luego, se incubaron las membranas durante 1 hora a temperatura ambiente protegidas de la luz, se las lavó durante 15 minutos 3 veces con Tween al 0,1 % en TBS, y durante 5 minutos 2 veces con TBS, y se cuantificaron las bandas mediante el uso del sistema por imágenes infrarrojas cercanas Odyssey de Li-Cor (Li-Cor). Las bandas de interés fueron normalizadas en expresión de beta-actina. Para verificar la identificación de las bandas transgénicas humanas en comparación con las Tau endógenas de ratón, se investigaron las transferencias con un anticuerpo específico para Tau total humana sin la reacción cruzada con murino (Tau13, AbCam; que no se muestran). En forma adicional, se investigaron las membranas con un anticuerpo primario antirratón, pará verificar que los anticuerpos del tratamiento no estuvieran presentes en las muestras de las pruebas desnaturalizadas en una cantidad suficiente como para que interfieran en la unión de los anticuerpos de transferencia primarios. No se detectaron anticuerpos del tratamiento intactos o desnaturalizados (cuyos resultados no se muestran) en las muestras usadas para este estudio. Los valores son expresados como inmunorreactividad (IR) corregida por beta-actina. 7.1.6. Análisis estadístico Se analizaron los datos mediante el uso de ANOVA de un sentido seguido de una prueba post hoc de comparación múltiple de Dunnett (GraphPad Prism, GraphPad Software, CA, EE.UU.) que compara cada tratamiento con ratones tratados con Tg control. Los resultados son presentados como puntos de datos I individuales que muestran una media ± SEM. Se consideraron las diferencias con p < 0,05 como significativas desde el punto de vista estadístico. No se incluyeron los valores simples que fueron identificados como valores atípicos significativos (p < 0,5) por test t de Student de desvío extremo.
L2 Resultados 7.2.1 Prueba de comportamiento: tarea de laberinto de agua de Morris (MWM) después de la inmunización pasiva Las cuatro inyecciones i.p. de ACI-36-2B6-Ab1 administradas en forma semanal a 3 mg/kg o 1 mg/kg durante un período de cuatro semanas no mostraron ningún efecto adverso grave.
Durante la última semana del tratamiento, se evaluó el aprendizaje de navegación espacial y la memoria de los animales. Los animales debían completar un entrenamiento de 4 días con 3 intentos por día seguido de una prueba de sondeo y una prueba visual. Se evaluó la latencia de escape (el tiempo [en segundos] que necesitó el ratón para encontrar la plataforma oculta y por lo tanto, escapar del agua), el camino (la longitud de la trayectoria [en metros] para alcanzar el objetivo), la velocidad de nado (coeficiente calculado del camino y la latencia de escape), y la cantidad de cruces objetivo y la permanencia en el cuadrante objetivo.
Los animales Tg (el grupo A) así como también los animales de control nTg (F) tratados con el vehículo mostraron las curvas de aprendizaje esperadas cuando se evaluó la latencia de escape y la longitud de la trayectoria del nado para alcanzar la plataforma durante los cuatro días de prueba. Los animales de control Tg (A) contaban con una deficiencia significativa en el aprendizaje de acuerdo con lo mostrado por las curvas de aprendizaje más planas en laténcias de escape y las trayectorias del nado en comparación con animales de control nTg (F). Las laténcias de escape y las trayectorias del nado fueron significativamente más largas (ANOVA de dos días) en los días 3 y 4 del entrenamiento (p< 0,001 ; prueba posterior de Bonferroni). El tratamiento con ACI-36-2B6-Ab1 y, ACI-36-3A8-Ab1 , de dosis alta o baja (grupos B y C y D y E, respectivamente) no condujeron a una mejora significativa de las capacidades de aprendizaje espacial en comparación con los animales control Tg (grupo A) y demostraron curvas de aprendizaje similares. Al ajustar el rendimiento del día 1 de cada grupo en 100% y todos los demás días como porcentaje del día 1 , puede observarse uria mejora para los ratones tratados con ACI-36-3A8-Ab1 (ambas dosis). El efecto alcanzó una importancia estadística para la longitud de la trayectoria del nado en el día 3 (p < 0,01 en el grupo D y p < 0,05 en el grupo E) y en el día 4 (p < 0,05 en el grupo D).
Para los ratones tratados con ACI-36-2B6-Ab1 (ambas dosis), puede observarse una ligera mejoría en la longitud de la trayectoria del nado, aunque sin importancia estadística.
No se detectaron diferencias entre grupos de tratamiento en términos de velocidad de nado en los cuatro días de entrenamiento.
Los resultados de la prueba de MWM demostraron tendencias hacia un aprendizaje espacial mejorado para los ratones tratados con ACI-36-2B6-Ab1 y ACI-36-3A8-Ab1. 7.2.2. Patología Tau cerebral por análisis cuantitativo inmunohistoquímico (IHC) El anticuerpo AT180 produce una tinción en pTAU humana y endógena (doblemente fosforilado en Thr231 y Ser235).
Se determinó IR de AT180 en la amígdala y en el hipocampo después de inmunización con ACI-36-2B6-AB1 y ACI-36-3A8-AB1. Se midió el porcentaje del área de IR de AT180 en la amígdala y en el hipocampo.
La cantidad de PTAU intrasomal en los controles de nTg fue significativamente menor en comparación con los grupos Tg (p <0,001 ). En la amígdala, se observó una tendencia a aumentar pTAU somal para el tratamiento de ACI-36-2B6-Ab1 de 3 mg/kg. Por el contrario, ambas dosis de ACI-36-2B6- Ab1 tendieron a reducir pTAU en comparación con los animales tratados con el vehículo en el hipocampo. Las intensidades de tinción media fueron comparables en todos los grupos transgénicos.
El tratamiento ACI-36-3A8-AM con no alteró pTAU somal en el hipocampo y en la amígdala y los niveles de pTAU neuronales en la amígdala y en el hipocampo no difirieron significativamente entre grupos transgénicos tratados. La suma de las intensidades de tinción y la media fueron comparables' en todos los grupos transgénicos.
Dado que el anticuerpo HT7 es específico para TAU humana, solo se midió una pequeña señal en controles nTg, que deriva de la autofluorescencia de los puntos de lipofuscina que superan los siete píxeles de tamaño. El tratamiento de ACI-36-2B6-Ab1 no alteró el área de IR positiva de HT7 somal en el hipocampo en comparación con el vehículo control (PBS). En la amígdala, los ratones que recibieron la dosis menos de ACI-36-2B6-Ab1 tendieron a presentar mayores niveles de TAU humana total (prueba T: p = 0,0954) en términos del área de IR. i Asimismo, este aumento fue visible en términos cualitativos como un aumento del área de tinción y la intensidad de tinción en los somas neuronales individuales. No se observaron diferencias inducidas por el tratamiento que fueran significativas desde el punto de vista estadístico en las neuronas del hipocampo. ' El tratamiento de ACI-36-3A8-Ab1 no alteró en forma significativa el área de IR positiva de HT7 somal en la amígdala y el hipocampo en comparación con el vehículo control (PBS). La suma de las intensidades de tinción y la media fueron comparables en todos los grupos transgénicos (los datos no se muestran).
La patología Tau cerebral no mostró ningún cambio en los niveles de Tau total o pTau en la fracción soluble cerebral, no obstante, la inmunotinción de secciones cerebrales demostró una reducción en pTau del hipocampo en ratones tratados con ACI-36-2B6-Ab1. 7.2.3. Efectos de la administración de anticuerpo anti-Tau en epítopes fosfo-Tau presentes en filamentos helicoidales pareados (PHFs) La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza desde el punto de vista neuropatológico, por ovillos neurofibrilares (NFTs, Braak, Braak & Bohl, 1993). En un sentido estructural, los NFTs consisten en filamentos helicoidales jareados (PHFs) compuestos por la proteína Tau asociada a microtúbulos, que se encuentra principalmente en un estado hiperfosforilado (Alonso et al., 1997). El objetivo de este estudio fue el de reducir estos epítopes de PHF de pTAu en los cerebros de ratones transgénicos Tau a través de cuatro administraciones del anticuerpo anti-pTau ACI-36-2B6-Ab2 y ACI-36-3A8-Ab2.
Para medir los efectos de cuatro administraciones de ACI-36-2B6-Ab2 en la cantidad de fosfo epítopes de PHF Tau bien documentada, se investigaron fracciones SinT y solubles de corteza cerebral y de hipocampo de ratones tratados Tg Tau con AD2 (epítope PHF-1 , pS396/pS404) y anticuerpo anti-pS396 (epítope PHF-13, pS396) mediante el uso de WBs. Como marcadores de PHFs de Tau, la presencia de pS396/pS404 han sido previamente documentada (Greenberg et al., 1992; Reig et al., 1995) y en forma más específica, el sitio pS396 (Hoffmánn et al., 1997). En los ratones Tg Tau, Tau es expresada como Tau de murino endógena y como el transgén de Tau humana, con una diferencia en peso molecular que puede ser claramente identificada en WBs cuando un anticuerpo de transferencia se une a Tau desde ambas especies y Tau desde dos transcripciones diferentes es expresada en cantidades suficientes. Por lo tanto, cuando es posible, las bandas de Tau transgénica humana y de ratón endógena son identificadas para cada anticuerpo de transcripción y son cuantificadas por separado. Para verificar los patrones de migración para estas bandas de Tau en nuestros ensayos de WB, se usó un anticuerpo anti-Tau que se une a Tau total, pero es específico humano (Tau13), y por lo tanto, solo muestra el transgén humano en cerebros Tg Tau para muestras de control Tg Tau para verificar patrones de migración para Tau de ratón y de humano en los ratones transgénicos de Tau. En forma adicional, se normalizaron todas las bandas cuantificadas con beta-actina.
La presencia de epítopes de PHF, investigadas en la fracción soluble de la corteza cerebral, fue reducida en los ratones tratados con ACI-36-2B6-Ab1 y in ACI-36-3A8-Ab1. Esto resultó significativo tanto para las bandas de ratón como para las humanas mediante el uso del anticuerpo pS396 (PHF-13) para las WBs (Figuras 5A y B).
Cuando se usó el anticuerpo AD2 (PHF-1 , pS396/pS404) para WBs de extractos de ratones tratados con ACI-36-2B6-Ab1 y ACI-36-3A8-Ab1 , se observo una significativa reducción (Figura 5C).
Debe destacarse que aunque los dos anticuerpos de PHF específico que son usados para estas WBs tienen epítopes similares y una buena especificidad respecto de sus objetivos fosforilados, el anticuerpo pS396 (PHF-13) parece tener una mejor relación entre señal y ruido y fue el mejor anticuerpo general para estas WBs.
El efecto objetivo directo del anticuerpo del tratamiento fue investigado en la corteza mediante el uso de ACI-36-2B6-Ab1 y ACI-36-2B6-Ab1 , respectivamente, como el anticuerpo de transferencia. Este anticuerpo anti-pTau se une con el epítope fosfo-Tau como el anticuerpo del tratamiento usado en este estudio. Se han probado las transferencias con anterioridad con un solo anticuerpo IgG antirratón secundario.
Se cuantificó la transferencia mediante el uso de un sistema por imágenes infrarrojas. Se determinaron los valore para cada uno de los ratones ¡así como también la media ± SEM.
No se detectó ninguna señal sobre la base, lo que verifica la falta de efectos de bloqueo o de interferencia por parte del anticuerpo del tratamiento, en estas muestras (cuyos datos no se muestran).
En ratones tratados con ACI-36-2B6-Ab1 , se observó una tendencia hacia una señal reducida al nivel de ratones nTg tratados control, lo que indica un efecto objetivo directo (Figura 5G). En ratones tratados con ACI-36-3A8-Ab1 , no se observaron efectos significativos del tratamiento (Figura 5G).
El significativo efecto del tratamiento de ACI-36-2B6-Ab1 en Tau total en la corteza soluble de ratones Tg de Tau se observó a través del uso de un anticuerpo Tau5 para transferencia que une la Tau de ratón endógena! y la Tau humana transgénica (Figuras 5H y 51). Se observó una reducción significativa en Tau total para Tau de ratón engódena y para Tau humana transgénica en la fracción soluble de la corteza cerebral.
Las bandas, que indican la Tau total de ratón A) y humana B) (Tau5), fueron cuantificadas mediante el uso de un sistema por imágenes infrarrojas. Se determinaron los valores para cada uno de los ratones así como también la media ± SEM.
La presencia de epítopes de PHF en la fracción insoluble en detergente fue llevada a cabo por la preparación de fracciones de cerebro (SinT) insolubles en sarcosilo.
Se cuantificó la transferencia mediante el uso de un sistema por imágenes infrarrojas. Se determinaron los valore para cada uno de los ratones así como también la media ± SEM.
En esta fracción, estuvo presente mucha menos Tau cuando se la compara con la fracción Tau soluble tanto en la corteza como en el hipocampo. Esto puede deberse a la edad de los ratones Tg de Tau usado en este estudio, que a los 4 meses no pueden haber acumulado una cantidad significativa de Tau agregada e insoluble en el hipotálamo y en la corteza . Por lo tanto, cuando se investigan epítopes de PHF en la fracción SinT, solo el anticuerpo AD2 (PHF-1 , pS396/pS404) proveyó una señal que resultó suficiente para la cuantificación confiable de las bandas.
Los ratones tratados con 1 mg/kg de ACI-36-2B6-Ab1 y con 1 mg/kg de ACI-36-3A8-Ab1 , respectivamente, presentaron una reducción significativa en el epítope de PHF-1 en bandas que representan la Tau de ratón endógena (Figura 5C). Las señales observadas para Ja banda humana transgénica no fueron lo suficientemente intensas como para ser cuantificadas en forma confiable.
También se investigó el hipocampo, mediante el uso de los mismos anticuerpos y fracciones que para la corteza. Se detectaron señales más bajas para todos los anticuerpos de transferencia en fracciones del hipocampo en comparación con la corteza.
Se determinaron los efectos del tratamiento con ACI-36-2B6-AB1 y ACI-36-3A8-AB1 en la inmunorreactividad de pS396 (PHF-13) en el hipocampo soluble de ratones Tg de Tau. Las bandas, que indican los epítopes de pTau de ratón A) y humana B) pS396 (PHF-13) fueron cuantificadas mediante el uso de un sistema por imágenes infrarrojas. Se determinaron los valores para cada uno de los ratones así como también la media ± SEM.
El tratamiento con ACI-36-2B6-Ab1 no alteró en forma significativa la presencia del epítope pS396 (PHF-13) en la fracción de hipocampo soluble de Tau de ratón, con una pequeña tendencia a una reducción en la banda de transgén humano.
El tratamiento con ACI-36-3A8-Ab1 mostró tendencias a una reducción en presencia del epítope pS396 (PHF-13) en la fracción de hipocampo soluble de Tau de ratón y la banda de transgén humano.
De forma similar a lo que se observó para WBs de pS396 (PHF-13), se detectó una tendencia para una señal reducida en ambos extractos de ratones tratados con ACI-36-2B6-Ab1 y ACI-36-3A8-Ab1 para Tau total en la fracción de hipocampo soluble de Tau humana.
De forma similar a las muestras SinT de la corteza, la fracción! SinT del hipocampo presentaba muy bajos niveles de pTau. Los ratones tratados con ACI-36-2B6-Ab1 y ACI-36-3A8-Ab1 , respectivamente, no presentaron ningún cambio en el epítope de PHF-1 (pS396/pS404) en bandas que representan la Tau de ratón endógena. Las señales observadas para la banda humana transgénica no fueron lo suficientemente intensas como para ser cuantificadas en forma confiable. 7.2.4 Compendio El estudio indica que la inmunización pasiva mediante el uso de cuatro administraciones de los anticuerpos anti-pTau de fosfosita específica ACI-36-2B6-Ab1 y ACI-36-3A8-Ab1 mejora el aprendizaje espacial y reduce la patología pTau cerebral.
Cuatro administraciones periféricas de anticuerpo anti-pTau ACI-36-2B6- Ab1 en 1 y 3 mg/kg a ratones Tg Tau redujeron la presencia de epítopes de PHF pTau en la corteza de acuerdo con lo medido por transferencia Western. Se observó una tendencia a la reducción en el hipocampo. De forma similar, también se observó una reducción en la Tau total. Se observó una reducción significativa en la inmunorreactividad de PHF-1 de pTau en la fracción de corteza soluble, y también se observó una tendencia que indicó efectos objetivo directos del tratamiento con el anticuerpo. Estos resultados proveen un mayor sustento para los anticuerpos ACI-36-2B6-Ab1 y ACI-36-3A8-Ab1 en inmunoterapia pasiva contra tauopatias tales como la enfermedad de Alzheimer.
Ejemplo 8: Tratamiento de 3 meses en ratones que sobreexpresan Tau' humana 8.1 Métodos 8.1.1 Ratones y los tratamientos Se usaron ratones transgénicos tau a los que se les administró el tratamiento de anticuerpos de acuerdo con lo mostrado en la Tabla en el Método 6.1. (estudio N.° 3) y se asignaron ratones en cuatro grupos de tratamiento Se trataron en total 45 ratones Tg más 3 reservas asignados a los grupos de tratamiento A a C y 15 ratones nTg más 1 reserva (grupo F) en el día 0, 7, 14, 21 , 28, 35, 42, 56, 63, 70, 77 y 84 por inyección i.p. de anticuerpo antí-pTAU o PBS (vehículo control), ACI-36-2B6-Ab1 o ACI-36-3A8-Ab1. Se dividieron en i forma aleatoria los animales en 5 grupos de inicio diferentes (escalas) que comprenden animales de todos los grupos tratados. La cantidad de animales en una escala fue limitada para asegurar la misma edad y un manejo uniforme. Después de la duodécima administración, se llevó a cabo una tarea de laberinto de agua (MWM) para evaluar el rendimiento de la memoria espacial. Después de la MWM, se les administró a los ratones el artículo de prueba una vez más (inyección décimo tercera) antes de ser sometidos a eutanasia 24 horas más tarde de haber determinado la patología Tau. Se determinó la patología tau del cerebro en el hipocampo y en la amígdala mediante un análisis cuantitativo inmunohistoquímico (IHC) a través del uso del anticuerpo AT180 (anti-pTau, pT231/pS235). Además, los efectos del tratamiento sobre Tau y pTau soluble e insoluble en sarcosilo en la corteza y en el hipocampo fueron medidos mediante el uso de tecnología MesoScale Discovery (MSD), que sondea pTau (pT231 y pS396) y Tau total. 8.1.2. Prueba de comportamiento: tarea de laberinto de agua de Morris (MWM) Este experimento fue llevado a cabo de acuerdo con el protocolo descripto en el Ejemplo 7.1.2. En la duodécima semana, se evaluó la navegación espacial con la prueba de laberinto de agua de Morris (MWM) para comprobar el aprendizaje y la memoria. 8.13. Biología molecular Se cuantificó Tau total y Tau fosforilado en Thr 231 y en pS396 en homogenatos de cerebro de animales Tg mediante el uso de un ensayo inmunoabsorbente de MesoScale Discovery (MSD). 8.1.4. Determinación de la patología tau cerebral por análisis cuantitativo inmunohistoquimico (IHC) Este experimento fue llevado a cabo de acuerdo con el protocolo descripto en el Ejemplo 7.1.3. Se determinó la patología TAU mediante la inmunorreactividad de AT180 en el hipocampo y en la amígdala de 8 animales por grupo. 8.1.5. Efectos de la administración de anticuerpo anti-Tau durante tres meses en epítopes fosfo-Tau presentes en filamentos helicoidales pareados (PHFs) Este experimento fue llevado a cabo de acuerdo con los protocolos descriptos en 7.1.4., 7.1.5. y 7.1.6. Para medir los efectos de cuatro administraciones de ACI-36-2B6-AM y ACI-36-3A8-Ab1 en la cantidad de fosfo epítopes de PHF Tau bien documentada, se investigaron fracciones SinT y solubles de corteza cerebral y de hipocampo de ratones tratados Tg Tau con AD2 (epítope PHF-1 , pS396/pS404), anticuerpo anti-pS396 (epítope PHF-13, pS396) y AT180 (pT231/pS235) mediante el uso de WBs. 8.1.6. Efectos de la administración de anticuerpo anti-Tau durante tres meses en epítopes fosfo-Tau mediante el uso de ratones bigénicos Tau biGT El estudio N.° 4 fue llevado a cabo mediante el uso de ratones Tau bigénicos según lo muestra el Método 6.1. Se prepararon muestras de corteza cerebral de acuerdo con lo mostrado en la figura siguiente, a través del uso del homogenato total (TH) o la fracción soluble (S1 ) para transferencia Western. Se investigaron las membranas mediante el uso de los siguientes anticuerpos de transferencia para pTau o Tau total: • HT-7 (26ng/ml), específica de Tau humana total • PHF-13 (pS396) con una dilución de 1/7500 • AT180 (pT231 ) en 2,47ug/ml • AT8 (pS202) en 3ug/ml • pS404 con una dilución de 1 :5000 • pS400 con una dilución de 1 :5000 Se normalizaron todas las cuantificaciones con beta-actina.
Tejido homogeneizado ^f;| | tampón de sacarosa/ sal (sobrenadante) ? Fracción (citosólica) soluble (sobrenadante) (gránulo) Fracción soluble Fracción insoluble en sarcosilo en sarcosilo 8.2 Resultados para el anticuerpo ACI-36-2B6-A Las trece inyecciones i.p. de ACI-36-2B6-Ab1 administradas en forma semanal a 1 ó 3 mg/kg durante un período de doce semanas de estudio no mostraron ningún efecto adverso grave. 8.2.1. Resultados de comportamiento - Laberinto de agua de Morris Los resultados de la prueba de MWM demostraron fuertes tendencias hacia un aprendizaje espacial mejorado para los ratones tratados con AC-l-36-2B6-AM (Figura 9). I Durante la última semana del tratamiento, se evaluó el aprendizaje de navegación espacial y la memoria de los animales. Los animales debían completar un entrenamiento de 4 días con 3 intentos por día seguido de una prueba de sondeo y una prueba visual. Se evaluó la latencia de escape (el tiempo [en segundos] que necesitó el ratón para encontrar la plataforma oculta y por lo tanto, escapar del agua), el camino (la longitud de la trayectoria [en metros] para alcanzar el objetivo), la velocidad de nado (coeficiente calculado del camino y la latencia de escape), y la cantidad de cruces objetivo y la permanencia en el cuadrante objetivo. Los animales control Tg (el grupo A) y los animales de control nTg (grupo F) tratados con el vehículo mostraron las curvas de aprendizaje esperadas en términos de latencia de escape y longitud de la trayectoria del nado para alcanzar la plataforma durante los cuatro días de prueba. Los animales de control Tg (A) mostraron una deficiencia significativa en la capacidad de aprendizaje reflejada en las curvas de aprendizaje más planas de latencias de escape y las trayectorias del nado en comparación con animales de control nTg (grupo F). Las latencias de escape y las trayectorias del nado fueron significativamente diferentes (ANOVA de dos vías) en los días 3 (p < 0,001 , longitud; prueba posterior de Bonferroni) y 4 del entrenamiento (p< 0,01 ; prueba posterior de Bonferroni). El tratamiento con ACI-36-2B6-Ab1 , de dosis alta o baja (B y C) no mejoró en forma significativa la capacidad de aprendizaje espacial en comparación con los animales control Tg (A). Al ajustar el rendimiento de cada grupo en 100% el día 1 de entrenamiento y todos los demás días como porcentaje del día 1 , puede observarse una leve mejora para los ratones tratados con ACI-36-2B6-Ab1 (ambas dosis) en longitud de trayectoria del nado, aunque sin importancia desde el punto de vista estadístico. j No se detectaron diferencias de tratamiento entre grupos cuando se calculó la velocidad de nado en los cuatro días de entrenamiento. En la prueba de sondeo (PT), se registró la permanencia en el cuadrante objetivo (cuadrante sudoeste) así como también los cruces de zona objetivo. Los controles nTg (grupo F) ocuparon más tiempo en el cuadrante objetivo y cruzaron la zona objetivo con mayor frecuencia respecto de los controles Tg (grupo A) pero sin importancia sustancial.
El tratamiento con ninguna dosis, ya sea alta o baja, condujo a una mejora de las capacidades de aprendizaje espacial en comparación con los ratones de control Tg de acuerdo con lo evaluado en la PT. 8.2.2. Biología molecular 8.2.2.1. Tau en fracción soluble de homogenatos de la corteza Se evaluaron TAU total, p231TAU, p396TAU y las relaciones entre pTAU y TAU total en la fracción soluble de homogenatos de la corteza de animales n = 16 a partir del grupo A (grupo vehículo Tg; PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 1 mg/kg) y C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 3 mg/kg). Un tratamiento con ACI-36-2B6-Ab1 no afectó en forma significativa TAU total y pTAU en los homogenatos de la corteza soluble. No obstante, se observó un ligero aumento (sin importancia) de la TAU total media, p231TAU y p396TAU ante el tratamiento con ACI-36-2B6-Ab1. No se vio afectada la fosforilación de TAU evaluada como las relaciones entre pTAU y TAU total. 8.2.2.2. Tau en fracción insoluble de sarcosilo de homogenatos de la corteza Se evaluaron TAU total, p231TAU, p396TAU y las relaciones entre pTAU y TAU total en las fracciones insolubles de sarcosilo de los homogenatos de la corteza de animales n = 16 a partir del grupo A (grupo vehículo Tg; PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 1 mg/kg) y C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 3 mg/kg). Un tratamiento con ACI-36-2B6-Ab1 no afectó en forma significativa TAU total y pTAU en los homogenatos de la corteza insoluble en sarcosilo. Se observó un ligero aumento (sin importancia) de la TAU total media y p231TAU ante el tratamiento con ACI-36-2B6-Ab1. No se vio afectada la fosforilación de TAU evaluada como las relaciones entre pTAU y TAU total. 8.2.2.3. Tau en fracción soluble de homogenatos del hipocampo Se evaluaron TAU total, p231TAU, p396TAU y las relaciones entre pTAU y TAU total en la fracción soluble de homogenatos del hipocampo de animales n = 16 a partir del grupo A (grupo vehículo Tg; PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-AB1 1 mg/kg) y C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 3 mg/kg). Un tratamiento con ACI-36-2B6-Ab1 no afectó en forma significativa TAU total y pTAU en los homogenatos del hipocampo soluble. Se observó una ligera reducción (sin importancia) de la fosforilación de TAU evaluada como las relaciones entre pTAU y TAU total ante el tratamiento con ACI-36-2B6-Ab . 8.2.2.4. Tau en fracción insoluble de sarcosilo de homogenatos del hipocampo Se evaluaron TAU total, p231TAU, p396TAU y las relaciones entre pTAU y TAU total en las fracciones insolubles de sarcosilo de los homogenatos del hipocampo de animales n = 16 a partir del grupo A (grupo vehículo Tg; PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-AB1 1 mg/kg) y C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 3 mg/kg). Un tratamiento con ACI-36-2B6-Ab1 no afectó en forma significativa TAU total y pTAU en los homogenatos del hipocampo insoluble en sarcosilo. Un tratamiento con 3 mg/kg aumentó la TAU total media, p231TAU así como también p396TAU, aunque sin alcanzar una importancia significativa, mientras se observó una ligera reducción de la TAU total media, p231TAU así como también de p396TAU ante un tratamiento de 1 mg/kg. La fosforilación de TAU evaluada como las relaciones entre pTAU y TAU total fue ligeramente aumentada ante el tratamiento con 3 mg/kg de ACI-36-2B6-Ab1. 8.2.2.5. Western Blots para coteza soluble El tratamiento con ACI-36-2B6-Ab1 en función de la dosis redujo la presencia tanto de epítopes tau pS396/pS404 (Figura 5D) como de pT181 (Figuras 5E y 5F) en la fracción soluble de la corteza cerebral con un efecto significativo en la dosis de 3 mg/kg. 8.2.2.6 TAU en ratones bigénicos Tau bi'GT Los ratones biGT tratados con ACI-36-2B6-Ab1 durante 3 meses I presentaron una TAU total significativamente reducida en la fracción soluble de corteza cerebral (Figura 6A y 6B). Se observó una reducción significativa para epítopes pTau pT231/AT180 (Figuras 6C y 6D), pS202/AT8 (Figura ¡ 6E) y pS396 (Figuras 6F y 6G). También se observó una reducción significativa en el homogenato total (TH) para epítope pTAU pS400 (Figuras 6H y 61) y pS404 (Figuras 6L y 6M). Además, también se observo una reducción significativa en la fracción soluble para epítopes pTau pS400 (Figuras 6J y 6K) y una tendencia a reducirse para el epítope pTau pS404 (Figuras 6N y 60) 8.2.3. Histología 8.2.3.1. Morfometría - Determinación de áreas de la región Las áreas de la región medida del hipocampo y de la amígdala no difieren en forma significativa en todos los cerebros investigados, lo que excluye los efectos negativos en el tejido durante la disección e IHC o tinción (por ejemplo, la contracción inequívoca, el seccionamiento diferente) y hasta un cierto punto, la atrofia inducida por el tratamiento. Cada una de las secciones puede desviarse de la media del grupo e individual por ejemplo, por el pliegue de tejido o pérdida de partes de la sección durante la ejecución del protocolo de etiquetado. Por lo tanto, el área inmunorreactiva total [en pm2] de cualquier etiquetado fue normalizada en el área de las regiones individuales de las secciones [en mm2] mediante el cálculo del porcentaje del área etiquetada dentro del área de la región [área etiquetada/(área de la región * 10.000)]. 8.2.3.2. Resultados de A T180 IH El anticuerpo AT180 detecta la pTAU humana y endógena (doblemente fosforilada en Thr231 y Ser235). La cantidad de pTAU intrasomal en los controles de nTg fue significativamente menor en comparación con los grupos Tg (p <0,01 así como también p < 0,001 ). En la amígdala, la dosis mayor de ACI-36-2B6-Ab1 (3 mg/kg - grupo C) redujo significativamente la pTAU somal en comparación con animales tratados con el vehículo (Figura 7 izquierda). La dosis menor (1 mg/kg - grupo C) mostró la misma tendencia pero no alcanzó importancia. El mismo efecto resultó detectable en el hipocampo donde ACI-36-2B6-Ab1 redujo pTAU de dosis dependiente, significativa para la dosis mayor y tendenciosamente para la menor (Figura 7 derecha). Asimismo, esta reducción fue visible en términos cualitativos como una reducción del área de tinción y la intensidad de tinción en los somas neuronales individuales. Los resultados de la suma de intensidades de tinción normalizadas en el tamaño de AOI de IR de AT180 medida en los somas neuronales fueron comparables con el porcentaje de área de IR de AT180 medidos, incluso una dependencia a la dosis significativa del efecto mayor de la dosis mayor en la amígdala. En el hipocampo, las comparaciones post hoc no alcanzaron un nivel significativo. 8.2.4 Compendio La patología Tau cerebral de forma en que fue medida por MSD no mostró un cambio significativo, no obstante, la inmunotinción de secciones del cerebro demostró una dependencia a la dosis con hasta un 60% de reducción en la inmunotinción ??? 80 (pT231/pS235) en somas neuronales.
El estudio indica que la inmunización pasiva mediante el uso de trece administraciones de un anticuerpo anti-pTau de fosfosita específica ACI-36-2B6-Ab1 puede mejorar el aprendizaje espacial y reducir la patología pTau cerebral. 8.3 Resultados del anticuerpo ACI-36-3A8-Ab1 Las trece inyecciones i.p. de ACI-36-3A8-Ab1 administradas en forma semanal a 1 o 3 mg/kg durante un período de doce semanas de estudio no mostraron ningún efecto adverso grave. 8.3.1. Resultados de comportamiento - Laberinto de agua de Morris Los resultados de la prueba de MWM demostraron un efecto significativo de un aprendizaje espacial mejorado para los ratones tratados con ACI-36-3A8-AM en 3 mg/kg (Figura 10).
Los animales control Tg (el grupo A) y los animales de control nTg (grupo F) tratados con el vehículo mostraron las curvas de aprendizaje esperadas en términos de latencia de escape y longitud de la trayectoria del nado para alcanzar la plataforma durante los cuatro días de prueba. Los animales de control Tg (A) mostraron una deficiencia significativa en la capacidad de aprendizaje reflejada en las curvas de aprendizaje más planas de latencias de escape y las trayectorias del nado en comparación con animales de control nTg (grupo F). Las latencias de escape y las trayectorias del nado fueron significativamente diferentes (ANOVA de dos vías) en los días 3 (p <; 0,001 , longitud; prueba posterior de Bonferroni) y 4 del entrenamiento (p< 0,01 ; prueba posterior de Bonferroni). El tratamiento con ACI-36-3A8-Ab1 , de dosis alta o baja (D y E) no mejoró en forma significativa la capacidad de aprendizaje espacial en comparación con los animales control Tg (A) cuando se analizaron en valores absolutos. Al ajustar el rendimiento de cada grupo en 100% en el día 1 de entrenamiento y todos los demás días como porcentaje del día 1 , puede observarse una mejora en la capacidad de aprendizaje y memoria ante un tratamiento de ACI-36-3A8-Ab1 (ambas dosis). Los animales tratados , con la dosis baja de ACI-36-3A8-Ab1 (grupo D) rindieron solo un poco mejor en la MWM si se los compara con los controles Tg (grupo A). El efecto de un tratamiento semanal con 3 mg/kg ACI-36-3A8-Ab1 (grupo E) fue mucho más pronunciado hasta casi restablecer el rendimiento de animales nTg. Comparado con los controles Tg (A), el efecto de 3 mg/kg ACI-36-3A8-Ab1 resultó significativo desde el punto de vista estadístico para la longitud de la trayectoria del nado en el día 3 y en el día 4 (p < 0,05). No se detectaron diferencias de tratamiento entre grupos cuando se calculó la velocidad de nado en los ¡cuatro días de entrenamiento.
En la prueba de sondeo (PT), se registró la permanencia en el cuadrante objetivo (cuadrante sudoeste) así como también los cruces de zona objetivo. Los controles nTg (grupo F) ocuparon más tiempo en el cuadrante objetivo y cruzaron la zona objetivo con mayor frecuencia respecto de los controles Tg (grupo A) pero sin importancia sustancial. El tratamiento con ninguna dosis, ya sea alta o baja, condujo a una mejora significativa desde el punto de vista estadístico en comparación con los ratones de control Tg de acuerdo con lo evaluado en la PT. No obstante, los animales tratados con ACI-36-3A8-Ab1 presentaron más cruces de zona objetivo (aunque sin importancia estadística) en comparación con el control Tg, que se encuentra de acuerdo con el resultado de la longitud de nado durante los 4 días de entrenamiento. 8.3.2. Biología molecular 8.3.2.1. Tau en fracción soluble de homogenatos de la corteza Se evaluaron TAU total, p231TAU, p396TAU y las relaciones entre pTAU y TAU total en la fracción soluble de homogenatos de la corteza de animales n = 16 a partir del grupo A (grupo vehículo Tg; PBS), y D (Tg, ACI-36-3A8-Ab1 1 mg/kg) de animales n = 15 a partir del grupo E (Tg, ACI-36— 3A8-Ab1 , 3 mg/kg). Un tratamiento con ACI-36-3A8-Ab1 no afectó en forma significativa TAU total y pTAU en los homogenatos de la corteza soluble. No obstante, se observó un ligero aumento (sin importancia) de la TAU total media, p231TAU y p396TAU ante el tratamiento con ACI-36-3A8-Ab1. La fosforilación de TAU en 231 evaluada como las relaciones entre p231TAU y TAU total fue ligeramente reducida ante el tratamiento con 3 mg/kg de ACI-36-3A8-AB1. 8.3.2.2. Tau en fracción insoluble de sarcosilo de homogenatos de la corteza Se evaluaron TAU total, p231TAU, p396TAU y las relaciones entre pTAU y TAU total en la fracción insoluble en sarcosilo de homogenatos de la corteza de animales n = 16 a partir del grupo A (grupo vehículo Tg; PBS), y D (Tg, ACI-36-3A8-Ab1 1 mg/kg) y de animales n = 15 a partir del grupo E (Tg, ACI-36-3A8-Ab1 , 3 mg/kg). Un tratamiento con ACI-36-3A8-Ab1 no afectó en forma significativa TAU total y pTAU en los homogenatos de la corteza insoluble en sarcosilo. Se observó una ligera reducción (sin importancia) de la TAU total media, p231TAU y p396TAU ante el tratamiento con ACI-36-3A8-Ab1. Además, las relaciones entre p231TAU y TAU total de animales tratados con 1 mg/kg ACI-36-3A8-Ab1 mostraron una variabilidad ligeramente menor en comparación con los animales tratados con el vehículo (pero sin importancia en I la prueba F: p = 0,184) sin cambiar las relaciones entre p231TAU media y TAU total de los dos grupos. Para grupos tratados con 1 mg/kg y 3 mg/kg ACI-36-3A8-Ab1 , se observó un ligero aumento en la fosforilación de p396TAU. 8.3.2.3. Tau en fracción soluble de homogenatos del hipocampo Se evaluaron TAU total, p231TAU, p396TAU y las relaciones entre pTAU y TAU total en la fracción soluble de homogenatos del hipocampo de animales n = 16 a partir del grupo A (grupo vehículo Tg; PBS), y D (Tg, ACI-36-3A8-AM 1 mg/kg) y de animales n = 15 a partir del grupo E (Tg, ACI-36-3A8-Ab1 , 3 mg/kg). Los niveles de TAU y pTAU en las fracciones de hipocampo soluble de IRN6301 (grupo D) eran valores atípicos y los excluyó. Un tratamiento con ACI-36-3A8-Ab1 no afectó en forma significativa TAU total y pTAU en los homogenatos de hipocampo soluble. Se observó una ligera reducción (sin importancia) de la fosforilación de TAU en 231 evaluada como las relaciones entre pTAU y TAU total ante el tratamiento con ACI-36-3A8-Ab1. 8.3.2.4. Tau en fracción insoluble de sarcosilo de homogenatos del hipocampo Se evaluaron TAU total, p231TAU, p396TAU y las relaciones entre pTAU y TAU total en las fracciones insolubles de sarcosilo de los homogenatos del hipocampo de animales n = 16 a partir del grupo A (grupo vehículo Tg; PBS), B (Tg, ACI-36-3A8-AB1 1 mg/kg) y C (Tg, ACI-36-3A8-Ab1 3 mg/kg). Un tratamiento con ACI-36-3A8-Ab1 no afectó en forma significativa TAU total y pTAU en los homogenatos del hipocampo insoluble en sarcosilo. Se observó un ligero aumento (sin importancia) de la TAU total media, p231TAU y p396TAU ante el tratamiento con ACI-36-3A8-Ab1. La fosforilación de TAU evaluada como la relación entre p231TAU y TAU total no fue afectada y el tratamiento con 1 mg/kg de ACI-36-3A8-Ab1 ligeramente redujo la relación entre p396TAU y TAU total. 8.3.2.5. Western Blots para corteza soluble Una significativa reducción de epítope pTau pS396/pS404 en la corteza cerebral soluble en ratones tratados con 1 ó 3 mg/kg de ACI-36-3A8-Ab1 (Figura 5D). La presencia de epítope pTau pT181 humano/transgénico se redujo en la fracción de la corteza soluble, con un significativo efecto en ratones tratados con 1 mg/kg y la tendencia en ratones tratados con 3 mg/kg (Figura 5E). Se observó una tendencia de una reducción en la cantidad de pTau' pT181 endógeno (Figura 5F). ¦ 8.3.2.6TAU en ratones bigénicos Tau biG T Los ratones biGT tratados con ACI-36-3A8-Ab1 durante 3 meses presentaron una TAU total significativamente reducida en la fracción soluble de corteza cerebral (Figura 6A y 6B). Se observó una reducción significativa para epítopes pTau pT231/AT180 (Figuras 6C y 6D), pS202/AT8 (Figura 6E) y pS396 (Figuras 6F y 6G). También se observó una reducción significativa en el homogenato total (T^í) para epítope pTAU pS400 (Figuras 6H y 61) y pS404 (Figuras 6L y 6M). Además, también se observo una reducción significativa en la fracción soluble para epítopes pTau pS400 (Figuras 6J y 6K) y una tendencia a reducirse para el epítope pTau pS404 (Figuras 6N y 60) 8.3.3. Histología 8.2.3.1. Morfometría - Determinación de áreas de la región Referirse al Ejemplo 8.2.3.1. 8.3.3.2. Resultados de AT180 IH El anticuerpo AT180 detecta la pTAU humana y endógena (doblemente fosforilada en Thr231 y Ser235). La cantidad de PTAU intrasomal en los controles de nTg fue significativamente menor en comparación con los grupos Tg (p <0,00t). En la amígdala, ambas dosis de ACI-36-3A8-Ab1 [(1 mg/kg - grupo D) y 3 mg/kg (grupo E)] redujeron significativamente la pTAU somal en comparación con animales tratados con el vehículo (Figura 8 izquierda). Un efecto similar pudo detectarse en el hipocampo donde la dosis menor de ACI-36-3A8-Ab1 redujo pTAU; no obstante, en este caso, la dosis mayor fue menos efectiva y solo llevó a una reducción tendenciosa (Figura 8 derecha). Asimismo, esta reducción fue visible en términos cualitativos como una reducción del área de tinción y la intensidad de tinción en los somas neuronales individuales. Los resultados de la suma normalizada de intensidades de IR de AT180 medida en los somas neuronales fueron comparables en la amígdala con un porcentaje de área de IR de AT180 medida pero alcanzó importancia solo para la dosis mayor. En el hipocampo, el resultado fue totalmente comparable con el porcentaje del área de IR. 8.3.4 Compendio La patología Tau cerebral de forma en que fue medida por MSD no mostró un cambio significativo, no obstante, la inmunotinción de secciones del cerebro demostró una dependencia a la dosis con hasta un 40% de reducción en la inmunotinción AT180 (pT231/pS235) en somas neuronales.
El estudio indica que la inmunización pasiva mediante el uso de trece administraciones de un anticuerpo anti-pTau de fosfosita específica ACI-36-3A8-Ab1 mejora el aprendizaje espacial y reducir la patología pTau cerebral.
Depósitos: Se depositaron las siguientes líneas celulares de hibridoma a nombre de AC Immune SA, PSE-EPFL Building B, 1015 Lausanne, Suiza y de Katholieke Universiteit Leuven, Minderbroedersstraat 8a - Box 5105, B-3000 Leuven ante el "Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH (DSMZ) en Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig, en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest: I Tabla 1. Secuencia Tau, vacuna descri ción del anticuer o *En base a la isoforma más larga de Tau humana (Tau441 ). p indica residuo fosforilado.
Tabla 2. Resultados del control de hibridoma ACI-33 Tabla 3. Resultados del control de hibridoma ACI-36 Tabla 4: Clasificación para clones positivos en ELISA y TAUPIR de ACI- 36 Tabla 5. Resultados del control de hibridoma ACI-41 Tabla 6. Control de hibridomas para unirse con el blanco Tabla 7. Afinidad de unión de anticuerpos anti-tau Tabla 8. Librerías de péptidos usadas para mapeo de epítope Librería de pépiidos para T1 N." de a minoácidos Tau (441 ) 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Aminoácido R Q E F E V II E D H A G T ??? G Péptido N.° T1.18 A G T G Tabla 8. Continuación Librería de péptidos para T4 N.* aminoácido Tau(441) m 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 4 Aminoácido G D T S[p] P R H L Pl N V s s T G S Péptido N.° 1X17 G D T s(p} P R H L T4.1B ¾p) N V s s T G s T4.19 N V s s T q s ¥ 20 V s s T G s Aminoácido G D T s P R H L s M V s s T G s Péptido N.* T3-2G G D T s P R H L T4.19 N V s s T G s T J0 V s s T G s Tabla 8. Continuación Ubrerfa de péptidos para T8 ?.· de aminoácido Tau(441) ^Qg 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 Aminoácido P G S R S R TW P L P T :P P Péptido N." 18.7 P G s R s R T(p) P § TU G s R s R T(p) P S(P) I TB-9 s R s R TÍP) P S<P) L I TB.10 R s R ?f) P so») L P §¦ TB-11 s R T(p) P Sft>) L P T ?&.12 R T(P) P Sft») L P T P 18.13 Tft») P s&>) L P T P P 18.14 P L P T P P 78.15 s(pl L P T P P Aminoácido P G s R s R T P s L P T P P Péptido N.» 18.16 P G s R s R T P 8 18.17 G s R s R T P s 1 ?8.18 s R s R T P s L ¾ 18.19 R s R T P s L P I M s R T P s L P T 1 18L21 R T P s L P T P 18L22 T P s L P T P P 18L23 P s L P T P P 78.24 s L P T P P Tabla 8. Continuación Librería de péptidos para T9 N.°de aminoácidos Tou( 41)|gg 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 Aminoácido G Y s s P G SfPl P G 1fc>) P G S R Péptido N.< Aminoáoido G Y s s P G s P G T P G s R Péptido ?.· 19.16 G Y s s P G s P (A 19.17 Y s s P G s P G i 19.18 s s P G s P G T ** a 19.19 s P G s P G T P T9JO P G s P G T P G 1 1921 G s P G T P G s ° o 19U22 s P G T P G s R z 19L23 P G T P G s R 19L24 G T P G s R Tabla 8. Continuación Librería de péptidos para T3 H." de aminoácidos Tau(441) 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406 40 Aminoácidos V Y K S(P) P V V s G D T S(P) P R H . Pcptido N T3.9 V Y K S(P) P V V s T3.10 Y K ¦0 s S(P) P V V s G s T3.11 K S(p) P V V s G D * T3.12 S(p) P V V s G D T 0.
T3.13 P V V s G D T S(P) ¾ 0 T3.14 V V s G D T S(P) P T3.15 V s G D T S(p) P R T3.16 s G D T S(P) P R H T3.17 G D T S(P) P R H Aminoácido V Y K s P V V s G D T s P R H Péptido N.° T3.18 V Y K s P V V s (? 0 T3.19 Y K s P V V s G V SJ T320 K s P V V s G D a T321 s P V V s G D T 1 T3 2 P V V s G D T s T323 V V s G D T s P e T324 V s G D T s P . R T325 s G D T s P R H T326 G D T s P R H Tabla 9. Aminoácidos Tau y fosfo-residuos requeridos para la unión de anticuerpos.
En base a la isoforma más larga de Tau humana (Tau441 ) 10 15 Tabla 11. Secuencia de nucleótidos de las regiones variables de cadena pesada y cadena liviana (VH y VK) 10 15 10 15 •Dos secuencias VK productivas 6 y 7 en la Tabla 10; secuencias 40 y 41 en la Tabla 11) se aislaron de las líneas celulares 3A8A12G7 y 3A8E12H8; las secuencias "VK_G" se prepararon de clones hechos usando mezcla de cebador "G" y secuencias "VK,AD" de clones hechos usando mezclas de cebadores "A" y "D". Conforme a ello, dos anticuerpos con diferentes secuencias kappa son producidos por estos hibrídomas.
Tabla 12. Cebadores usados ara la secuenciación r 5 15 5 10 15 10 10 Codones degenerados: R = AoG S =CoGoT 15 Y = CoT M K = GoT W Tabla 13. Isoforma más larga de Tau humana (441 aa), también denominada REFERENCIAS Alonso A.D.. et al. (1997), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 94, 298-303 Alvinq et al. (1992) Infect. Immun. 60:2438-2444 Asuni et al., (2007) J Neuroso. 27 (34), 91 15-29 Braak H., et al. (1993), Eur. Neurol.. 33. 403-408 Gilí et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003) Greenberq S.G., et al. (1992), J. Biol. Chem., 267, 564-569.
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Claims (120)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo, o una de sus partes funcionales que reconoce y se une específicamente con un fosfo-epítope en la proteína Tau de mamífero o en uno de sus fragmentos, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con la proteína Tau soluble e insoluble y modula los niveles Tau solubles e insolubles.
2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo modula los niveles de Tau soluble e insoluble en el cerebro de un mamífero.
3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2 o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo modula los niveles de Tau soluble e insoluble en la corteza cerebral y/o el hipocampo.
4. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o| fragmento de anticuerpo reduce los niveles de proteína Tau soluble total.
5. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo reduce los niveles de proteína Tau fosforilada soluble.
6. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo reduce los niveles de filamentos helicoidales en pares que contienen proteína Tau hiperfosforilada.
7. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo reduce los niveles de proteína Tau soluble total, proteína tau fosforilada soluble y filamentos helicoidales pTau en pares.
8. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho mamífero es un humano.
9. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una constante de disociación de al menos 10 nM. 1
10. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una constante de disociación de al menos 5 nM, al menos 2 nM; al menos 1 nM, al menos 500 pM, al menos 300 pM, al menos 200 pM, al menos 100 pM.
11. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o ¡fragmento de anticuerpo tiene una constante de tasa de asociación de 104 M" s_ o más; dé 105 M"1s" 1 o más, de 106 M"V1 o más.
12. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 4 nM y una constante de tasa de asociación de 105 M"V1 o más.
13. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 3 nM y una constante de tasa de asociación de 106 M"1s~1 o más.
14. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 2 nM y una constante de tasa de asociación de 104 lvT1s"1 o más.
15. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo d fragmento de anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 1 nM y una constante de tasa de asociación de 105 M"V1 o más.
16. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 200 pM y una constante de tasa de asociación de 105 M" s"1 o más.
17. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 100 pM y una constante de tasa de asociación de 106 M~1s~1 o más. ;
18. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une con un epítope seleccionado del grupo que consiste en Tau aa 15-20 que comprende una Tyr fosforilada en la posición 18 (Y18), Tau aa 405-412 que comprende una Ser fosforilada en la posición 409 (pS409), Tau aa 405-411 que comprende una Ser fosforilada en la posición 409 (pS409); Tau aa 208-218 que comprende una Thr fosforilada en la posición 212 (pT212) y una Ser fosforilada en la posición (pS214); Tau aa 393-401 que comprende una Ser fosforilada en la posición 396 (pS396), Tau aa 396-401 que comprende una Ser fosforilada en la posición 396 (pS396), Tau aa 394-400 que comprende una Ser fosforilada en la posición 396 (pS396), Táu aa 402-406 que comprende una Ser fosforilada en la posición 404 (pS404), y Tau aa 393-400 que comprende una Ser fosforilada en la posición 396 (pS396).
19. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13 o uño de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une con un epítope que comprende Tau aa 15-20 con una Tyr fosforilada en la posición 18 (Y18).
20. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15 o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une con un epítope que comprende Tau aa 405-412 con una Ser fosforilada en la posición 409 (pS409).
21. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une con un epítope que comprende Tau aa 405-411 con una Ser fosforilada en la posición 409 (pS409).
22. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12 o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une con un epítope que comprende Tau aa 396-401 que comprende una Ser fosforilada en la posición 396 (pS396).
23. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12 o uno de sus fragmentos funcionales, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une con un epítope que comprende Tau aa 402—406 que comprende una Ser fosforilada en la posición 404 (pS404).
24. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene, en particular en secuencia, un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81 , 93, 101, 106, o una secuencia de aminoácido al menos 70%, en particular al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, 94, 102, 107, o una secuencia de aminoácido al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, 75, 83, 95, 103, 108, o una secuencia de aminoácido al menos 60%, en particular al menos 70%, en particular al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos i 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, 89, 98, o una secuencia de aminoácido al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71, 79, 90, 99, 115, o una secuencia de aminoácido al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, 91 , 100, o una secuencia de aminoácido al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica.
25. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , 24, 27, 28, 29, 32, o una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, o una secuencia de aminoácido al menos 60% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de i aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, o una secuencia de aminoácido al menos 80% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, 17, 20, o una secuencia de aminoácido al menos 60% idéntica.
26. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NÓ: SEQ ID NO: 21 , 24, 27, 28, 29, 32, o una secuencia de aminoácido al menos 85% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30* 33, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, o una secuencia de aminoácido al menos 80% idéntica; y/o a dominio de anticuerpo que contiene un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, o una secuencia de aminoácido al menos 85% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, 17, 20, o una secuencia de aminoácido al menos 85% idéntica.
27. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , 24, 27, 28, 29, 32, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica y un CDR3 con la l secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, 17, 20, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica
28. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión (dominio de anticuerpo) que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , 24, 27, 28, 29, 32, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, 17, 20, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica.
29. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , 24, 27, 28, 29, 32, o una secuencia de aminoácido al menos 98% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, 17; 20, o una secuencia dé aminoácido al menos 90% idéntica.
30. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , 24, 27, 28, 29, 32, o una secuencia de aminoácido al menos 98% idéntica; un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, o una secuencia de aminoácido al menos 98% idéntica;, y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, o una secuencia de aminoácido al menos 98% idéntica, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, 17, 20, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica.
31. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , 24, 27, 28, 29, 32, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, 26, 31 , 34, y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 15, 18, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, 16, 19, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, 17, 20. '
32. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , o una secuencia de aminoácido al menos 76% idéntica, un CDR2 con la! secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 22, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23, o una secuencia de aminoácido al menos 66% idéntica, y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, a DR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, o una secuencia de aminoácido al menos 88% idéntica, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, o una secuencia de aminoácido al menos 66% idéntica.
33. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 24, o una secuencia de aminoácido al menos 88% idéntica, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 25, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 26, o una secuencia de aminoácido al menos 66% idéntica y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13, o una secuencia de aminoácido al menos 88% idéntica, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14, o una secuencia de aminoácido al menos 66% idéntica
34. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 33 o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión en donde el CDR1 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 27, o una secuencia de aminoácido al menos 88% idéntica.
35. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 33 o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión en donde el CDR1 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 28, o una secuencia de aminoácido al menos 88% idéntica.
36. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 29, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 30, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 31 , y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 15, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 16, o una secuencia de aminoácido al menos 94% idéntica, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 17, o una secuencia de aminoácido al menos 36% idéntica.
37. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 32, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 34, y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 18, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 19, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 20, o una secuencia de aminoácido al menos 63% idéntica.
38. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 73, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 74, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 75, o una secuencia de aminoácido al menos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 70, o una secuencia de aminoácido al menos 95%, en particular 98%, en particular 99% idéntica, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 71 , o una secuencia de aminoácido al menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 72, o una secuencia de aminoácido al menos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica.
39. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID ÑO: 81 , un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 82, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 83, o una secuencia de aminoácido al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en párticular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 78, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 79, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 80, o una secuencia de aminoácido al menos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica.
40. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 93, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 94, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 95, o una secuencia de aminoácido al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica a cualquiera de los anteriores CDRs y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 89, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 90, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 91 , o una secuencia de aminoácido al menos al 'menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% % idéntica a cualquiera de los anteriores GDRs.
41. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 101 , un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 102, y un CQR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 103, o una secuencia de aminoácido al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica a cualquiera de los anteriores CDRs y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 98, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 99, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 100, o una secuencia de aminoácido al menos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% % idéntica a cualquiera de los anteriores CDRs.
42. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que comprende un primer dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 106, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 107, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 108, o una secuencia de aminoácido al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica a cualquiera de los anteriores CDRs y/o un segundo dominio de unión que contiene en secuencia un CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 89, un CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 15, y un CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 91 , o una secuencia de aminoácido al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% % idéntica a cualquiera de los anteriores CDRs.
43. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedente^ o uno de sus fragmentos funcionales que comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11 , o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica, y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, o una secuencia de aminoácido al menos 85% idéntica.
44. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales que comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11 , o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica, y/o un segundo dominio de unión que contiene la I secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, o una secuencia de aminoácido al menos 91 % idéntica.
45. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales que comprende un primer dominio de unión (dominio de anticuerpo) que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11 , o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, o una secuencia de aminoácido al menos 91 % idéntica.
46. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedéntes o uno de sus fragmentos funcionales que comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 69, 77, 116/92, 97, 105, o una secuencia de aminoácido al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%,en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica, y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 68, 76, 88, 96, 104, o una secuencia de aminoácido al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, en particular al menos 85%, en particular al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, en particular al menos 96%, en particular al menos 97%, en particular al menos 98%, en particular al menos 99% o 100% idéntica.
47. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales que comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7, o una secuencia de aminoácido al menos 90% y 94%, respectivamente, idénticas; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 , o una secuencia de aminoácido al menos 91 % idéntica.
48. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales que comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 8, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica.
49. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales que comprende un primer dominio de unión, que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 9, o una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica.
50. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales que comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 10, o una secuencia de aminoácido al menos 99% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácido al menos 89% idéntica.
51. El péptido de unión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 11 , o una secuencia de aminoácido al menos 98% idéntica; y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácido al menos 87% idéntica.
52. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales que comprende a. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 ; o b. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 7 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 ; o c. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 8 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2; o d. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 9 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3; o e. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 10 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4; o f. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 11 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5; o g. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 69 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 68; o h. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 77 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia i de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 76; o i. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 116 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 88; o j. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 92 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 88; o k. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 97 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6; o I. un primer dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 105 y/o un segundo dominio de unión que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 104.
53. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales, que es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo completamente humano o uno de sus fragmentos funcionales.
54. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales que es del isotipo lgG2b, lgG2a o lgG3.
55. Un péptido o proteína de unión del anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-54.
56. El péptido o proteína de unión o el anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes,: en donde dicho péptido de unión, anticuerpo de proteína o fragmento de anticuerpo reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en el mamífero, en particular en 'la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular a un fosfo-epítope en la proteína Tau agregada, pero no se une con el correspondiente epítope no fosfbrilado y/o con epítopes no relacionados.
57. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo cualquiera de las reivindicaciones precedentes o uno de sus fragmentos funcionales.
58. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 57 que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en a. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se indica en SEQ ID NOs: 35-45; b. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en SEQ ID NOs: 35-45, SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 y 117- 19; c. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la, secuencia mostrada en SEQ ID NOs: 35-45; SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 y 1 17; d. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en SEQ ID NOs: 35-45; SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 y 1 17-119; e. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 98% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en SEQ ID NOs: 35-45; SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 y 1 17-119; f. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria híbrida en la molécula de ácidos núcleicos de cualquiera de a) - f); g. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que se desvía de la secuencia de nucleótidos definida en cualquiera de a) - g) por degeneración del código genético: en donde dicha molécula de ácido nucleico tal como se define en cualquiera de a) - g) reconoce y específicamente se une con un fosfo-epítope en un mamífero, en particular en la proteína humana Tau o en uno de sus fragmentos, en particular a un confórmero de proteína tau patológica, pero no se une con el correspondiente epítope no fosforilado y/o con epítopes no relacionados, en donde dicho anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con la proteína tau agregada, y modula los niveles de tau soluble e insoluble.
59. Una composición farmacéutica que comprende un péptido o una proteína de unión, un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales o un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o una combinación de ellos, en una cantidad terapéuticamente efectiva junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
60. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 59, que comprende al menos dos péptidos o proteínas de unión, anticuerpos o sus fragmentos funcionales o polinucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que reconoce y se une con dos diferentes fosfo-epítopes en la proteína tau de mamífero.
61. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 59 ó 60, que comprende un anticuerpo adicional o uno de sus fragmentos funcionales que reconoce y se une con una proteína o péptido amiloidogénico diferente.
62. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, un péptido b proteína de unión, un polinucleótido o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o una combinación de ellos, para su uso en terapia, en particular, para su uso en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos como ser tauopatías en un mamífero, en particular en un ser humano que necesita de dicho tratamiento.
63. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, un péptido ó proteína de unión, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación anterior, pasa su uso en el tratamiento o mitigación de deficiencias cognitivas en un mamífero, en particular en un ser humano que sufre de una deficiencia como esta.
64. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, un péptido ó proteína de unión, polinucleótido o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación anterior, donde el tratamiento o mitigación de deficiencias cognitivas en un mamífero, en particular en un ser humano, lleva al detenimiento en el avance de las deficiencias cognitivas. j
65. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, un péptido' o proteína de unión, polinucleótido o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación anterior, donde el tratamiento o mitigación de deficiencias cognitivas en un mamífero, en particular en un ser humano, lleva al aumento de la retención, en particular a una i restauración completa de la capacidad de memoria cognitiva en el sujeto tratado.
66. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, un péptidol o proteína de unión, polinucleótido o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación anterior para su uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos que son causados por la formación de lesiones neurofibrilares o están asociados con ella, patología cerebral predominante en tauopatía que comprende un grupo heterogéneo de enfermedades o í trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran coexistencia de patologías tau y amiloides que incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, ! demencia pugilística, síndrome de Down, enfermedad de Gerstmann-Stráussler-Scheinker, miositis por cuerpos de inclusión y angiopatía amiloide cerebral por proteína priónica, lesión cerebral traumática y otras enfermedades o trastornos que no muestran una patología amiloide distinta que incluyen, pero sin que la enumeración sea taxativa, esclerosis lateral amiotrófica/complejo parkinsonismo-demencia de Guam, enfermedad neurómotriz no i Guam con ovillos neurofibrilares, demencia con gránulos argirofílicos, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia froptotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17, enfermedad de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Niemann-Pick, tipo C, degeneración palido-ponto- nigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, demencia por ovillos neurofibrilares, parkinsonismo postencefálieo, distrofia miotónica.
67. El anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, un péptido1 p proteína de unión, polinucleótido o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación anterior para su uso en el tratamiento de enfermedad de Alzheimer.
68. Un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno neurodegenerativo como ser una tauopatía que comprende la administración a un animal, en particular a un mamífero, pero en especial a un ser humano, que sufre de una enfermedad o trastorno neurodegenerativo como este, de un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, un péptido o proteína de unión, un polinucleótido o una composición farmacéutica de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o una combinación de ellas.
69. El método de acuerdo con la reivindicación anterior para el tratamiento de enfermedades y trastornos que son causados por la formación de lesiones neurofibrilares o están asociados con ella, patología cerebral predominante en tauopatía que comprende un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran coexistencia de patologías tau y amiloides que incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, demencia pugilística, síndrome de Down, enfermedad de Gerstmann-Stráussler-Scheinker, miositis por cuerpos de inclusión y angiopatía amiloide cerebral por proteína priónica, lesión cerebral traumática y otras enfermedades o trastornos que no muestran una patología amiloide distinta que incluyen, pero sin que la enumeración sea taxativa, esclerosis lateral amiotrófica/com piejo parkinsonismo-demencia de Guam, enfermedad neuromotriz no Guam con ovillos neurofibrilares, demencia con gránulos argirofílicos, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17, enfermedad de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiples sistemas, enfermedad de Niemann-Pick, tipo C, degeneración palidc—pontc— nigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, demencia por ovillos neurofibrilares, parkinsonismo postencefálico, distrofia miotónica.
70. Un método para inducir una respuesta inmune pasiva en un animal, en particular en un mamífero o ser humano, que sufre de una enfermedad o trastorno neurodegenerativo como ser una tauopatía mediante la administración a dicho animal o ser humano de un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, un péptido o proteína de unión, o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o una combinación de ellas.
71. Un método de diagnosis de una enfermedad, trastorno oí condición asociados con la proteína tau en un paciente que comprende detectar 'a unión inmunoespecífica de un anticuerpo o uno de sus fragmentos activos a un epítope de la proteína tau en una muestra o in situ que incluye las etapas de a. poner en contacto la muestra o una parte del cuerpo específica o área corporal sospechada de contener la proteína tau con un anticuerpo o uno de sus fragmentos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, cüyo péptido o su fragmento se une con un epítope de la proteína tau; b. permitir que el anticuerpo se una con la proteína tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico; y d. correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de la proteína tau en la muestra o parte o área específica del cuerpo. 1
72. Un método de diagnosis de una predisposición a una enfermedad, trastorno o condición asociado a la proteína tau en un paciente que comprende detectar la unión inmunoespecífica de un anticuerpo o uno de sus fragmentos activos a un epítope de la proteína tau en una muestra o in situ que incluye las etapas de ! a. poner en contacto la muestra o una parte corporal o área corporal específicas sospechadas de contener el antígeno tau con un anticuerpo o Uno de sus fragmentos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, cuyo péptido o su fragmento se une con un epítope de la proteína tau; b. permitir que el anticuerpo se una con el antígeno tau para j formar un complejo inmunológico; ' c. detectar la formación del complejo inmunológico; y ¡ d. correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de antígeno tau en la muestra o parte o área específica del cuerpo, e. comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico a un valor de control normal, en donde un aumento en la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente padece o está en riesgo de| desarrollar una enfermedad o condición asociados con la proteína Tau.
73. Un método de control de una enfermedad residual mínima en ún paciente después del tratamiento con un anticuerpo o una composición farmacéutica ele acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende: a. poner en contacto la muestra o una parte corporal o área corporal específicas sospechadas de contener el antígeno tau con un anticuerpo o uno de sus fragmentos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, cuyo péptido o su fragmento se une con un epítope de la proteína tau; b. permitir que el anticuerpo se una con el antígeno tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico; y d. correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de antígeno tau en la muestra o parte o área específica del cuerpo, e. comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico a un valor de control normal, , en donde un aumento en la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente todavía padece de una enfermedad residual mínima.
74. Un método para predecir la respuesta de un paciente en tratamiento con un anticuerpo o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende a. poner en contacto la muestra o una parte corporal o área corporal específicas sospechadas de contener el antígeno tau con un anticuerpo o uno de sus fragmentos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, cuyo péptido o su fragmento se une con un epítope de la proteína tau; b. permitir que el anticuerpo se una con el antígeno tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico; y 274 d.. correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de antígeno tau en la muestra o parte o área específica del cuerpo, e. comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico antes y d spués del inicio del tratamiento, en donde una disminución de la cantidad de dicho agregado indica que dicho paciente tiene un alto potencial de responder al tratamiento.
75. Kits de ensayo para la detección y diagnosis de enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con la proteína Tau que comprenden un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.
76. Kit de ensayo de acuerdo con la reivindicación precedente que Comprende un recipiente que porta uno o varios anticuerpos o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la presente invención e instrucciones de uso de los anticuerpos a los fines de unirse con el antígeno tau para formar un complejo inmunológico y detectar la formación del complejo inmunológico de modo que la presencia o la ausencia del complejo inmunológico se correlacione con la presencia o ausencia del antígeno tau.
77. Un epítope seleccionado del grupo que consiste en Tau aa 15-20 que comprende Tyr fosforilada en la posición 18 (Y18), Tau aa 405-412 que comprende Ser fosforilada en la posición 409 (pS409), Tau aa 405-411 que comprende Ser fosforilada en la posición 409 (pS409); y Tau aa 208-218 que comprende Thr fosforilada en la posición 212 (pT212) y Ser fosforilada en la posición (pS214), Tau aa 393-401 que comprende una Ser fosforilada en la posición 396 (pS396), Tau aa 396-401 que comprende una Ser fosforilada en la posición 396 (pS396), Tau aa 394-400 que comprende una Ser fosforilada en la posición 396 (pS396), Tau aa 402-406 que comprende una Ser fosforilada en la posición 404 (pS404), y Tau aa 393-400 que comprende una Ser fosforilada en la posición 396 (pS396).
78. Una línea celular que produce un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.
79. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma 6C10F9C12A11 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3079.
80. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma 6C10E5E9C12 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3081.
81. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma 6H1A11C11 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3080.
82. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma 6H1G6E6 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3088.
83. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 77, que es la línea celular de hibridoma 2B6A10C11 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3084.
84. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma 2B6G7A12 depositada el 10 de marzo de 2010 como DSM ACC3087.
85. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma 3A8A12G7 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3086.
86. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma 3A8E12H8 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3085.
87. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma 7C2(1 )F10C10D3 depositada el 25 de agosto de 2010 cómo DSM ACC3082.
88. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma 7C2(2)B9F11 D5 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ÁCC3083.
89. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleotido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 6C10F9C12A11 depositada el 25 de agosto de 2010 como DS ACC3079 usando a. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 54 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
90. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 6C10E5E9C12 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3081 usando I a. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
91. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 6H1A11 C11 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3080 usando a. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 50 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 46 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
92. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleotido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 6H1 G6E6 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3088 usando a. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 50 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 46 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
93. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleotido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 2B6A10C1 1 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3084 usando a. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 50 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 52 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
94. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleotido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 2B6G7A12 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3087 usando a. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 50 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 52 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
95. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea' celular de hibridoma 3A8A12G7 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3086 usando ai. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; o a2. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 50 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 46 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
96. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 3A8E12H8 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3085 usando ai. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; o a2. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 50 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 46 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
97. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleotido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de líneaj celular de hibridoma 7C2(1 )F10C10D3 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3082 usando a. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 55 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación de un segundo dominio de unión.
98. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleotido que se puede obtener por amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma 7C2(2)B9F11D5 depositada el 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3083 usando a. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID O: 57 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 55 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 47 para la amplificación: de un segundo dominio de unión.
99. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleotido que se puede obtener por amplificación por PCR de ADN de línea celular de hibridoma A4-2A1-18 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3139 usando a. un par de cebadores que comprende un cebador 5' de SEQ ID NO: 149 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 120, 123, 124, 136, 137, 138, 139, y 140 y un cebador 3' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 131 , 134 y 141-148, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
100. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación por PCR de ADN de línea celular de hibridoma A6-2G5-30 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3137 usando a. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 51 y 169-174 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 , para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del i grupo que consiste en SEQ ID NOs: 124, 127 y 150-158 y un cebador 3' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 130 y 159^168, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
101. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación por PCR de ADN de línea ¡celular de hibridoma A4-2A1-40 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3140 usando a. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 178, 179 y 180 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 , para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 121 , 127, 139, 154, 155 y 175 y un cebador 3' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 128, 129, 147, 176 y 177, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
102. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleotido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación por PCR de ADN de línea celular de hibridoma A6-2G5-41 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3138 usando a. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 51 y 188-192 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 , para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 120, 124, 126, 181 , 182 y 183 y un cebador 3' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 144, 145 y 184-187, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
103. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleotido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación por PCR de ADN de línea celular de hibridoma A4-4A6-48 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3136 usando a. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 50 y 201-204 y un cebador 3' de SEQ ID NO: 51 , para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 121 , 137, 151 y 193-197 y un cebador 3' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 131 , 141 , 144, 166, 198, 199 y 200, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
104. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la reivindicación 1 que está codificado por un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener por amplificación por PCR de ADN de línea celular de hibridoma A6-1 D2-12 depositada el 6 de septiembre de 2011 como DS ACC3141 usando a. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 209-214, y 219-221 un cebador 3' de SEQ ID NO: 215, para la amplificación de un primer dominio de unión; y/o b. una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 216, 217 y 218 y un cebador 3' de SEQ ID NOs: 208, para la amplificación de un segundo dominio de unión. i
105. El anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo del isotipo lgG2a, lgG2b o lgG3, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo completamente humano.
106. Un fragmento de unión o proteína o un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
107. Una línea celular que produce el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-54, 56 o cualquiera de las reivindicaciones 89 - 105.
108. Una línea celular que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 57 ó 58.
109. Un método para producir el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 54, 56 o con una cualquiera de las reivindicaciones 89 a 105, que comprende el paso de cultivo de la línea celular de acuerdo con la reivindicación 106 en un medio de cultivo adecuado.
110. Un método para producir un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 54, 56 o cualquiera de las reivindicaciones 89-105, que comprende el paso de cultivo de la línea celular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 78-88 en un medio de cultivo adecuado.
111. El método de acuerdo con la reivindicación 100 ó 110, que comprende, además, el paso de purificación del anticuerpo a partir de la línea celular o medio de cultivo.
112. El uso del anticuerpo que incluye cualquier parte funcional de él de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 54, 56 o cualquiera de las reivindicaciones 89-105, con una cualquiera de las reivindicaciones 88 a 99, en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de tauopatías, un grupo de enfermedades y trastornos asociados con la proteína tau.
113. El uso del anticuerpo que incluye cualquier parte funcional de él de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 54, 56 o cualquiera de las reivindicaciones 89-105, en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento o mitigación de los síntomas asociados con tauopatías, un grupo de enfermedades y trastornos asociados con la proteína tau. ¡
114. El uso del anticuerpo que incluye cualquier parte funcional de él de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 54, 56 o cualquiera de las reivindicaciones 89-105, en la preparación de un medicamento para su uso en la retención o aumento de la capacidad de memoria cognitiva en un mamífero que sufre de una tauopatía.
115. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 78, que es una línea celular de hibridoma A4-4A6-48 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3136.
116. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 78, que es una línea celular de hibridoma A6-2G5-30 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3137.
117. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 78, que es una línea celular de hibridoma A6-2G5-41 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3138.
118. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 78, que es una línea celular de hibridoma A4-2A1 -18 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3139.
119. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 78, que es una linea celular de hibridoma A4-2A1-40 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3140.
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