JP6371526B2 - タウを認識するリン酸化部位特異的抗体 - Google Patents
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Description
・アミロイドタンパク質前駆体(APP)又はプレセニリンにおける変異に起因する早期発症型家族性ADの症例において、絶対的病原性の原因はアミロイドの蓄積であるが、常にその病理学は、遅発性散発性AD症例の場合と同一の副次的タウオパチーを含み;
・認知機能障害と認知症の重症度は、アミロイドに対するPIB−PETイメージングを含み多くの「偽陽性」:高い脳アミロイド負荷を持つ認知的健常者を同定するいくつかの臨床フェーズ1&2研究によってごく最近例示されるように、アミロイド病理ではなく、タウオパチーと相関しており;
・家族制FTDにおいて、タウオパチーは、変異体タウによって引き起こされ、アミロイド病理無しに直接神経変性を引き起こし;
実験マウスモデルにおいて、アミロイド病理によって引き起こされる認知障害がタンパク質タウ(ロバーソンら、2007)の欠損によってほぼ完全に緩和される(Roberson et al, 2007)。
・タウのリン酸化を病的レベルにまで増加させると考えられているキナーゼの阻害剤
・高リン酸化タンパク質タウの細胞質凝集を阻止する化合物。
第二の実施態様において、本発明は結合ペプチド又はタンパク質又はその機能性部分、特に抗体、特にモノクローナル抗体又はその機能性部分、特に前述の実施態様の何れかに記載の結合ペプチド又は抗体に関し、その結合ペプチド又は抗体は哺乳動物、特にヒトタウタンパク質又はその断片のリン酸化エピトープ、特に病的タンパク質タウのコンフォーマーを認識し、特異的に結合するが、しかし一実施態様では、対応する非リン酸化エピトープ及び/又は関連しないエピトープに結合せず、ここで前記結合ペプチド又は抗体は、104M−1s−1以上、特に3−5×104M−1s−1以上、特に105M−1s−1以上;特に2−9×105M−1s−1以上、特に106M−1s−1以上、特に1−4×106M−1s−1以上、特に107M−1s−1以上の会合定数を有する。
一実施態様(28)において、本発明は、結合ペプチド又はタンパク質又はその機能性部分、特に抗体、特にモノクローナル抗体又はその機能性部分、特に前述の実施態様の何れかに記載の結合ペプチド又は抗体に関し、その結合ペプチド又は抗体は哺乳動物、特にヒトタウタンパク質又はその断片のリン酸化エピトープ、特に病的タンパク質タウのコンフォーマーを認識し、特異的に結合するが、しかし一実施態様では、対応する非リン酸化エピトープ及び/又は関連しないエピトープに結合せず、ここで前記結合ペプチド又は抗体は、配列番号6、7、8、9、10、11に示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン、及び/又は配列番号1、2、3、4、5に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む第二結合ドメインを含む。
本発明の一実施態様(33)は、結合ペプチド又はタンパク質又はその機能性部分、特に抗体、特にモノクローナル抗体又はその機能性部分、特に前述の実施態様の何れかに記載の結合ペプチド又は抗体に関し、その結合ペプチド又は抗体は哺乳動物、特にヒトタウタンパク質又はその断片のリン酸化エピトープ、特に病的タンパク質タウのコンフォーマーを認識し、特異的に結合するが、しかし一実施態様では、対応する非リン酸化エピトープ及び/又は関連しないエピトープに結合せず、ここで前記結合ペプチド又は抗体は、配列番号9に示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン、及び/又は配列番号3に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む第二結合ドメインを含む。
本発明の一実施態様(35)は、結合ペプチド又はタンパク質又はその機能性部分、特に抗体、特にモノクローナル抗体又はその機能性部分、特に前述の実施態様の何れかに記載の結合ペプチド又は抗体に関し、その結合ペプチド又は抗体は哺乳動物、特にヒトタウタンパク質又はその断片のリン酸化エピトープ、特に病的タンパク質タウのコンフォーマーを認識し、特異的に結合するが、しかし一実施態様では、対応する非リン酸化エピトープ及び/又は関連しないエピトープに結合せず、ここで前記結合ペプチド又は抗体は、配列番号11に示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン、及び/又は配列番号5に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも87%同一であるアミノ酸配列を含む第二結合ドメインを含む。
本発明の一実施態様(36)は、結合ペプチド又はタンパク質又はその機能性部分、特に抗体、特にモノクローナル抗体又はその機能性部分、特に前述の実施態様の何れかに記載の結合ペプチド又は抗体に関し、その結合ペプチド又は抗体は哺乳動物、特にヒトタウタンパク質又はその断片のリン酸化エピトープ、特に病的タンパク質タウのコンフォーマーを認識し、特異的に結合するが、しかし一実施態様では、対応する非リン酸化エピトープ及び/又は関連しないエピトープに結合せず、ここで前記結合ペプチド又は抗体は、配列番号69に示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン;及び/又は配列番号68に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90%、91%、92%又は93%同一であるアミノ酸配列を含む第二結合ドメインを含む。
a.配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又は
b.配列番号7に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又は
c.配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又は
d.配列番号9に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号3に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又は
e.配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又は
f.配列番号11に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号5に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又は
g.配列番号69に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号68に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又は
h.配列番号77に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号76に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又は
i.配列番号116に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号88に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又は
j.配列番号92に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号88に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又は
k.配列番号97に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又は
l.配列番号105に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号104に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン
を含む。
本発明の一実施態様(48)は、前述の実施態様の何れか一に記載の結合ペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
a.配列番号31−45、配列番号84−87、配列番号109−112及び117に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子
b.配列番号31−45、配列番号84−87、配列番号109−112及び117に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子
c.配列番号31−45、配列番号84−87、配列番号109−112及び117に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子
d.配列番号35−45、配列番号84−87、配列番号109−112及び117に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子
e.配列番号35−45、配列番号84−87、配列番号109−112及び117に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子
f.配列番号35−45、配列番号84−87、配列番号109−112及び117に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子
g.a)−f)の何れかに記載の核酸分子にハイブリダイズする相補鎖の核酸配列を含む核酸分子;
h.遺伝コードの縮重によって、a)−g)の何れかに定められた核酸配列から逸脱するヌクレオチド配列を含む核酸分子
からなる群から選択される核酸分子を含む。
a.タウタンパク質を含有すると疑われるサンプル又は特定の体の部分又は体の領域を、前述の実施態様の何れか一に記載される結合ペプチド又は又はその断片、特に抗体、特にモノクローナル抗体又はその機能性部分と接触させ、ここで前記結合ペプチド又は抗体又はその断片はタウタンパク質のエピトープに結合し;
b.前記結合ペプチド、特に前記抗体、特に前記モノクローナル抗体又はその機能性部分をタウタンパク質に結合させ、免疫複合体を形成させ;
c.免疫複合体の形成を検出し;そして
d.サンプル中又は特定の体の部分又は領域において、免疫複合体の存在又は欠損をタウタンパク質の存在又は欠損と相関させる
工程を含む。
a.タウ抗原含有すると疑われるサンプル又は特定の体の部分又は体の領域を、前述の実施態様の何れか一に記載される結合ペプチド又は又はその活性断片、特に抗体、特にモノクローナル抗体又はその機能性部分と接触させ、そのペプチド又はその断片はタウタンパク質のエピトープに結合し;
b.前記結合ペプチド、特に前記抗体、特に前記モノクローナル抗体又はその機能性部分をタウ抗原に結合させ、免疫複合体を形成させ;
c.免疫複合体の形成を検出し;そして
d.サンプル中又は特定の体の部分又は領域において、免疫複合体の存在又は欠損をタウ抗原の存在又は欠損と相関させ;
e.前記免疫複合体の量を正常コントロール値と比較する;
工程を含み、
ここで、正常コントロール値と比較して前記凝集体の量の増加は、前記患者が、タウタンパク質関連疾患又は状態に罹患しているか又は発症するリスクであることを示している。
a.タウ抗原含有すると疑われるサンプル又は特定の体の部分又は体の領域を、前述の実施態様の何れか一に記載される結合ペプチド又は又はその機能性部分、特に抗体、特にモノクローナル抗体又はその機能性部分と接触させ、そのペプチド又はその断片はタウタンパク質のエピトープに結合し;
b.前記結合ペプチド、特に前記抗体、特に前記モノクローナル抗体又はその機能性部分をタウ抗原に結合させ、免疫複合体を形成させ;
c.免疫複合体の形成を検出し;そして
d.サンプル中又は特定の体の部分又は領域において、免疫複合体の存在又は欠損をタウ抗原の存在又は欠損と相関させ、
e.前記免疫複合体の量を正常コントロール値と比較する、
工程を含み、
ここで、正常コントロール値と比較して前記凝集体の量の増加は、前記患者が、微小残存病変(minimal residual disease)になお罹患していることを示している。
a.タウ抗原含有すると疑われるサンプル又は特定の体の部分又は体の領域を、前述の実施態様の何れか一に記載される結合ペプチド又は又はその活性断片、特に抗体、特にモノクローナル抗体又はその機能性部分と接触させ、そのペプチド又はその断片はタウタンパク質のエピトープに結合し;
b.前記結合ペプチド、特に前記抗体、特に前記モノクローナル抗体又はその機能性部分をタウ抗原に結合させ、免疫複合体を形成させ;
c.免疫複合体の形成を検出し;そして
d.サンプル中又は特定の体の部分又は領域において、免疫複合体の存在又は欠損をタウ抗原の存在又は欠損と相関させ、
e.治療開始前と後で前記免疫複合体の量を比較する、
ことを含み、
ここで、前記凝集体の量の減少は、前記患者が治療に対して応答する高い可能性を有していることを示す。
a.第一結合ドメインの増幅のために配列番号54の5’プライマーと配列番号51の3’プライマーを含むプライマー対;及び/又は
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号53及び配列番号54の5’プライマーと配列番号47の3’プライマーを含むプライマーの混合
を用いて、
2010年8月25日にDSM ACC3079として寄託されたハイブリドーマ細胞株6C10F9C12A11のDNAのPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a.第一結合ドメインの増幅のために配列番号48及び配列番号49の5’プライマーと配列番号51の3’プライマーを含むプライマーの混合;及び/又は
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号53及び配列番号54の5’プライマーと配列番号47の3’プライマーを含むプライマーの混合;
を用いて、
2010年8月25日にDSM ACC3081として寄託されたハイブリドーマ細胞株6C10E5E9C12のDNAのPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a.第一結合ドメインの増幅のために配列番号50の5’プライマーと配列番号51の3’プライマーを含むプライマー対;及び/又は
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号46の5’プライマーと配列番号47の3’プライマーを含むプライマー対;
を用いて、
2010年8月25日にDSM ACC3080として寄託されたハイブリドーマ細胞株6H1A11C11のDNAのPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a.第一結合ドメインの増幅のために配列番号50の5’プライマーと配列番号51の3’プライマーを含むプライマー対;及び/又は
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号46の5’プライマーと配列番号47の3’プライマーを含むプライマー対;
を用いて、
2010年8月25日にDSM ACC3088として寄託されたハイブリドーマ細胞株6H1G6E6のDNAのPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a.第一結合ドメインの増幅のために配列番号50の5’プライマーと配列番号51の3’プライマーを含むプライマー対;及び/又は
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号46及び配列番号52の5’プライマーと配列番号47の3’プライマーを含むプライマーの混合;
を用いて、
2010年8月25日にDSM ACC3084として寄託されたハイブリドーマ細胞株2B6A10C11のDNAのPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a.第一結合ドメインの増幅のために配列番号50の5’プライマーと配列番号51の3’プライマーを含むプライマー対;及び/又は
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号46及び配列番号52の5’プライマーと配列番号47の3’プライマーを含むプライマーの混合;
を用いて、
2010年8月25日にDSM ACC3087として寄託されたハイブリドーマ細胞株2B6G7A12のDNAのPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a1.第一結合ドメインの増幅のために配列番号48及び配列番号49の5’プライマーと配列番号51の3’プライマーを含むプライマーの混合;又は
a2.第一結合ドメインの増幅のために配列番号50の5’プライマーと配列番号51の3’プライマーを含むプライマー対;及び/又は
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号46の5’プライマーと配列番号47の3’プライマーを含むプライマー対;
を用いて、
2010年8月25日にDSM ACC3086として寄託されたハイブリドーマ細胞株3A8A12G7のDNAのPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a1.第一結合ドメインの増幅のために配列番号48及び配列番号49の5’プライマーと配列番号51の3’プライマーを含むプライマーの混合;又は
a2.第一結合ドメインの増幅のために配列番号50の5’プライマーと配列番号51の3’プライマーを含むプライマー対;及び/又は
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号46の5’プライマーと配列番号47の3’プライマーを含むプライマー対;
を用いて、
2010年8月25日にDSM ACC3085として寄託されたハイブリドーマ細胞株3A8E12H8のDNAのPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a.第一結合ドメインの増幅のために配列番号49;配列番号56及び配列番号57の5’プライマーと配列番号51の3’プライマーを含むプライマーの混合;
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号53及び配列番号55の5’プライマーと配列番号47の3’プライマーを含むプライマーの混合;
を用いて、
2010年8月25日にDSM ACC3082として寄託されたハイブリドーマ細胞株7C2(1)F10C10D3のPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a.第一結合ドメインの増幅のために配列番号57の5’プライマーと配列番号51の3’プライマーを含むプライマーの対;
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号53及び配列番号55の5’プライマーと配列番号47の3’プライマーを含むプライマーの混合;
を用いて、
2010年8月25日にDSM ACC3083として寄託されたハイブリドーマ細胞株7C2(2)B9F11D5のPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a.第一結合ドメインの増幅のために配列番号149の5’プライマーと配列番号51の3’プライマーを含むプライマー対;及び/又は
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号120、123、124、136、137、138、139、及び140からなる群から選択される5’プライマーと配列番号131、134,及び141−148らなる群から選択される3’プライマーを含むプライマーの混合;
を用いて、
本発明は、2011年8月30日にDSM ACC3139として寄託されたハイブリドーマ細胞株A4−2A1−18のDNAのPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a.第一結合ドメインの増幅のために配列番号51及び169−174からなる群から選択される5’プライマー及び配列番号51の3’プライマーを含むプライマーの混合;及び/又は
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号124、127,及び150−158からなる群から選択される5’プライマーと配列番号130,及び159−168らなる群から選択される3’プライマーを含むプライマーの混合;
を用いて、
2011年8月30日にDSM ACC3137として寄託されたハイブリドーマ細胞株A6−2G5−30のDNAのPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a.第一結合ドメインの増幅のために配列番号178、179及び180からなる群から選択される5’プライマー及び配列番号51の3’プライマーを含むプライマーの混合;及び/又は
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号121、127、139、154、155,及び175からなる群から選択される5’プライマーと配列番号128、129、147、176,及び177からなる群から選択される3’プライマーを含むプライマーの混合;
を用いて、
2011年8月30日にDSM ACC3140として寄託されたハイブリドーマ細胞株A4−2A1−40のDNAのPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a.第一結合ドメインの増幅のために配列番号51及び188−192からなる群から選択される5’プライマー及び配列番号51の3’プライマーを含むプライマーの混合;及び/又は
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号120、124、126、181、182及び183からなる群から選択される5’プライマーと配列番号144、145及び184−187からなる群から選択される3’プライマーを含むプライマーの混合;
を用いて、
本発明は、2011年8月30日にDSM ACC3138として寄託されたハイブリドーマ細胞株A6−2G5−41のDNAのPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a.第一結合ドメインの増幅のために配列番号50及び201−204からなる群から選択される5’プライマー及び配列番号51の3’プライマーを含むプライマーの混合;及び/又は
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号121、137、151及び193−197からなる群から選択される5’プライマーと配列番号131、141、144、166、198、199及び200からなる群から選択される3’プライマーを含むプライマーの混合;
を用いて、
2011年8月30日にDSM ACC3136として寄託されたハイブリドーマ細胞株A4−4A6−48のDNAのPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
a.第一結合ドメインの増幅のために配列番号209−214、及び219−221からなる群から選択される5’プライマー及び配列番号215の3’プライマーを含むプライマーの混合;及び/又は
b.第二結合ドメインの増幅のために配列番号216、217及び218からなる群から選択される5’プライマー及び配列番号208の3’プライマーを含むプライマーの混合;
を用いて、
2011年9月6日にDSM ACC3141として寄託されたハイブリドーマ細胞株A6−1D2−12のDNAのPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片に位置するポリヌクレオチドによりコードされる、軽鎖(VL)及び/又は重鎖(VH)ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能性部分に関する。
配列番号1は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7により産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を示す。
配列番号2は、ハイブリドーマ細胞株2B6A10C11により産生されるモノクローナル抗体ACI−36−2B6−Ab1の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を示す。
配列番号3は、ハイブリドーマ細胞株6H1A11C11及び6H1G6E6によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−6H1−Ab1及びACI−36−6H1−Ab2の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を示す。
配列番号4は、ハイブリドーマ細胞株6C10E5E9C12及び6C10F9C12A11によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−33−6C10−Ab2及びACI−33−6C10−Ab1の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を示す。
配列番号5は、ハイブリドーマ細胞株7C2(1)F10C10D3及び7C2(2)B9F11D5によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−41−7C2−Ab1及びACI−41−7C2−Ab2の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を示す。
配列番号6は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7及び3A8E12H8によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1VK−AD及びACI−36−3A8−Ab2VK−ADの軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を示す。
配列番号7は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7及び3A8E12H8によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1VK−G及びACI−36−3A8−Ab2VK−Gの軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を示す。
配列番号8は、ハイブリドーマ細胞株2B6A10C11及び2B6G7A12によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−2B6−Ab1及びACI−36−2B6−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を示す。
配列番号9は、ハイブリドーマ細胞株6H1A11C11及び6H1G6E6によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−6H1−Ab1及びACI−36−6H1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を示す。
配列番号10は、ハイブリドーマ細胞株6C10E5E9C12及び6C10F9C12A11によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−33−6C10−Ab2及びACI−33−6C10−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を示す。
配列番号11は、ハイブリドーマ細胞株7C2(1)F10C10D3及び7C2(2)B9F11D5によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−41−7C2−Ab1及びACI−41−7C2−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を示す。
配列番号12は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7、3A8E12H8、2B6A10C11、2B6G7A12、6H1A11C11及び6H1G6E6によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1、ACI−36−3A8−Ab2、ACI−36−2B6−Ab1、ACI−36−2B6−Ab2、ACI−36−6H1−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号13は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7、3A8E12H8、2B6A10C11、2B6G7A12、6H1A11C11及び6H1G6E6によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1、ACI−36−3A8−Ab2、ACI−36−2B6−Ab1、ACI−36−2B6−Ab2、ACI−36−6H1−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号14は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7、3A8E12H8、2B6A10C11、2B6G7A12、6H1A11C11及び6H1G6E6によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1、ACI−36−3A8−Ab2、ACI−36−2B6−Ab1、ACI−36−2B6−Ab2、ACI−36−6H1−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号15は、ハイブリドーマ細胞株6C10E5E9C12及び6C10F9C12A11によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−33−6C10−Ab2及びACI−33−6C10−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号16は、ハイブリドーマ細胞株6C10E5E9C12及び6C10F9C12A11によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−33−6C10−Ab2及びACI−33−6C10−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号17は、ハイブリドーマ細胞株6C10E5E9C12及び6C10F9C12A11によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−33−6C10−Ab2及びACI−33−6C10−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号18は、ハイブリドーマ細胞株7C2(1)F10C10D3及び7C2(2)B9F11D5によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−41−7C2−Ab1及びACI−41−7C2−Ab2の重鎖可変領域(VH)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号19は、ハイブリドーマ細胞株7C2(1)F10C10D3及び7C2(2)B9F11D5によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−41−7C2−Ab1及びACI−41−7C2−Ab2の重鎖可変領域(VH)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号20は、ハイブリドーマ細胞株7C2(1)F10C10D3及び7C2(2)B9F11D5によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−41−7C2−Ab1及びACI−41−7C2−Ab2の重鎖可変領域(VH)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号21は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7及び3A8E12H8によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1VK−AD及びACI−36−3A8−Ab2VK−ADの軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号22は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7及び3A8E12H8によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1VK−AD及びACI−36−3A8−Ab2VK−ADの軽鎖可変領域(VK)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号23は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7及び3A8E12H8によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1VK−AD及びACI−36−3A8−Ab2VK−ADの軽鎖可変領域(VK)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号24は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7及び3A8E12H8によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1VK−G及びACI−36−3A8−Ab2VK−Gの軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号25は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7、3A8E12H8、2B6A10C11、2B6G7A12、6H1A11C11及び6H1G6E6によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1VK−G、ACI−36−3A8−Ab2VK−G、ACI−36−2B6−Ab1、ACI−36−2B6−Ab2、ACI−36−6H1−Ab1及びACI−36−6H1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号26は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7、3A8E12H8、2B6A10C11、2B6G7A12、6H1A11C11及び6H1G6E6によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1VK−G、ACI−36−3A8−Ab2VK−G、ACI−36−2B6−Ab1、ACI−36−2B6−Ab2、ACI−36−6H1−Ab1及びACI−36−6H1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号27は、ハイブリドーマ細胞株2B6A10C11及び2B6G7A12によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−2B6−Ab1及びACI−36−2B6−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号28は、ハイブリドーマ細胞株6H1A11C11及び6H1G6E6によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−6H1−Ab1及びACI−36−6H1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号29は、ハイブリドーマ細胞株6C10E5E9C12及び6C10F9C12A11によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−33−6C10−Ab2及びACI−33−6C10−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号30は、ハイブリドーマ細胞株6C10E5E9C12及び6C10F9C12A11によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−33−6C10−Ab2及びACI−33−6C10−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号31は、ハイブリドーマ細胞株6C10E5E9C12及び6C10F9C12A11によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−33−6C10−Ab2及びACI−33−6C10−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号32は、ハイブリドーマ細胞株7C2(1)F10C10D3及び7C2(2)B9F11D5によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−41−7C2−Ab1及びACI−41−7C2−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号33は、ハイブリドーマ細胞株7C2(1)F10C10D3及び7C2(2)B9F11D5によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−41−7C2−Ab1及びACI−41−7C2−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号34は、ハイブリドーマ細胞株7C2(1)F10C10D3及び7C2(2)B9F11D5によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−41−7C2−Ab1及びACI−41−7C2−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号35は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7及び3A8E12H8によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1及びACI−36−3A8−Ab2の重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号36は、ハイブリドーマ細胞株2B6A10C11及び2B6G7A12によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−2B6−Ab1及びACI−36−2B6−Ab2の重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号37は、ハイブリドーマ細胞株6H1A11C11及び6H1G6E6によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−6H1−Ab1及びACI−36−6H1−Ab2の重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号38は、ハイブリドーマ細胞株6C10E5E9C12及び6C10F9C12A11によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−33−6C10−Ab2及びACI−33−6C10−Ab1の重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号39は、ハイブリドーマ細胞株7C2(1)F10C10D3及び7C2(2)B9F11D5によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−41−7C2−Ab1及びACI−41−7C2−Ab2の重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号40は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7及び3A8E12H8によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1及びACI−36−3A8−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号41は、ハイブリドーマ細胞株3A8A12G7及び3A8E12H8によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−3A8−Ab1及びACI−36−3A8−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号42は、ハイブリドーマ細胞株2B6A10C11及び2B6G7A12によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−2B6−Ab1及びACI−36−2B6−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号43は、ハイブリドーマ細胞株6H1A11C11及び6H1G6E6によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−36−6H1−Ab1及びACI−36−6H1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号44は、ハイブリドーマ細胞株6C10E5E9C12及び6C10F9C12A11によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−33−6C10−Ab2及びACI−33−6C10−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号45は、ハイブリドーマ細胞株7C2(1)F10C10D3及び7C2(2)B9F11D5によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−41−7C2−Ab1及びACI−41−7C2−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号46−57は、VH/VKフォワード及びリバースプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号58は、タウ379−408[pS396、pS404]のアミノ酸配列を示す。
配列番号59は、タウ5−20[pY18]のアミノ酸配列を示す。
配列番号60は、タウ206−221[pT212、pS214]のアミノ酸配列を示す。
配列番号61は、タウ196−211[pS202、pT205]のアミノ酸配列を示す。
配列番号62は、タウ393−408[pS396、pS404]のアミノ酸配列を示す。
配列番号63は、タウ401−418[pS404、pS409]のアミノ酸配列を示す。
配列番号64は、タウ200−216[pS202+pT205&pT212+pS214]のアミノ酸配列を示す。
配列番号65は、タウ407−418[pS409]のアミノ酸配列を示す。
配列番号66は、タウ399−408[pS404]のアミノ酸配列を示す。
配列番号67は、タウ40とも呼ばれるヒトタウの最長アイソフォームのアミノ酸配列(441aa)を示す。
配列番号68は、ハイブリドーマ細胞株A4−4A6−18により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を示す。
配列番号69は、ハイブリドーマ細胞株A4−4A6−18により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を示す。
配列番号70は、モノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号71は、モノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号72は、モノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号73は、モノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号74は、モノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号75は、モノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号76は、ハイブリドーマ細胞株A6−1D2−12により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を示す。
配列番号77は、ハイブリドーマ細胞株A6−1D2−12により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を示す。
配列番号78は、モノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号79は、モノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号80は、モノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号81は、モノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号82は、モノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号83は、モノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号84は、ハイブリドーマ細胞株A4−4A6−18により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号85は、ハイブリドーマ細胞株A4−4A6−18により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号86は、ハイブリドーマ細胞株A6−1D2−12により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号87は、ハイブリドーマ細胞株A6−1D2−12により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号88は、ハイブリドーマ細胞株A4−2A1−18、A4−2A1−40及びA4−4A6−48によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−2A1−Ab2、及びACI−35−4A6−Ab2のそれぞれの重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を示す。
配列番号89は、モノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−2A1−Ab2、ACI−35−4A6−Ab2、ACI−35−2G5−AB2及びACI−35−2G5−AB3のそれぞれの重鎖可変領域(VH)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号90は、モノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−2A1−Ab2、及びACI−35−4A6−Ab2のそれぞれの重鎖可変領域(VH)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号91は、モノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−2A1−Ab2、ACI−35−4A6−Ab2、ACI−35−2G5−AB2及びACI−35−2G5−AB3のそれぞれの重鎖可変領域(VH)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号92は、ハイブリドーマ細胞株A4−2A1−40により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を示す。
配列番号93は、モノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号94は、モノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号95は、モノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号96は、ハイブリドーマ細胞株A6−2G5−08により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を示す。
配列番号97は、ハイブリドーマ細胞株A6−2G5−08により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を示す。
配列番号98は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号99は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号100は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号101は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号102は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号103は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号104は、ハイブリドーマ細胞株A6−2G5−30及びA6−2G5−41によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2及びACI−35−2G5−AB3のそれぞれの重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を示す。
配列番号105は、ハイブリドーマ細胞株A6−2G5−30及びA6−2G5−41によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2及びACI−35−2G5−AB3のそれぞれの軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を示す。
配列番号106は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2及びACI−35−2G5−AB3のそれぞれの軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を示す。
配列番号107は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2及びACI−35−2G5−AB3のそれぞれの軽鎖可変領域(VK)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号108は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2及びACI−35−2G5−AB3のそれぞれの軽鎖可変領域(VK)のCDR3のアミノ酸配列を示す。
配列番号109は、ハイブリドーマ細胞株A4−2A1−18、A4−2A1−40及びA4−4A6−48によりそれぞれ産生されたモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−2A1−Ab2、及びACI−35−4A6−Ab2の重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号110は、ハイブリドーマ細胞株A4−2A1−40により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号111は、ハイブリドーマ細胞株A6−2G5−08により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB1の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を示す。
配列番号112は、ハイブリドーマ細胞株A6−2G5−08により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB1の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号113は、ハイブリドーマ細胞株A6−2G5−30及びA6−2G5−41によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2及びACI−35−2G5−AB3のそれぞれの重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号114は、ハイブリドーマ細胞株A6−2G5−30及びA6−2G5−41によりそれぞれ産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2及びACI−35−2G5−AB3のそれぞれの軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号115は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2及びACI−35−2G5−AB3の重鎖可変領域(VH)のCDR2のアミノ酸配列を示す。
配列番号116は、ハイブリドーマ細胞株A4−2A1−18により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を示す。
配列番号117は、ハイブリドーマ細胞株A4−2A1−18により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号118は、ハイブリドーマ細胞株A4−4A6−48により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を示す。
配列番号119は、ハイブリドーマ細胞株A4−4A6−48により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を示す。
配列番号120−221は、VH/VKフォワード及びリバースプライマーのヌクレオチド配列を示す。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で用いる場合、互換的であり、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸で構成される生体分子を意味するものと定義される。
1)アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);及び
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
本明細書で用いられる場合「可溶性タウ」タンパク質は、完全可溶化タウタンパク質/ペプチドのモノマーの両方、又はタウ様ペプチド/タンパク質、又は修飾型又は切断型タウペプチド/タンパク質、又はタウペプチド/タンパク質のモノマーの別の誘導体、及びタウタンパク質オリゴマーからなるタンパク質を指す。「可溶性タウ」は、特に神経原線維変化(NFT)を除外する。
本明細書で用いる場合、徐放性マトリックスは、酵素もしくは酸/塩基による加水分解によってまたは溶解によって分解する材料、通常は重合体でできたマトリックスである。このようなマトリックスは、身体内に挿入されると、酵素および体液の働きによる作用を受ける。。徐放性マトリックスは望ましくは、リポソーム、ポリラクチド(ポリ乳酸)、ポリグリコリド(グリコール酸の重合体)、ポリラクチドコ−グリコリド(乳酸とグリコール酸の共重合体)、ポリ無水物、ポリ(オルト)エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、硫酸コンドロイチン、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、およびシリコーンなどの、生体適合性を有する材料から選択される。好ましい生分解性マトリックスは、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはポリラクチドコ−グリコリド(乳酸とグリコール酸の共重合体)のうちいずれか1つのマトリックスである組成物の用量が、例えば、処置される状態、用いる特定の組成物といった様々な要因、ならびに、患者の体重、サイズ、性別および全般的健康状態、体表面積、投与しようとする特定の化合物または組成物、同時に投与する他の薬剤および投与の経路といった他の臨床的因子に依存すると考えられることは、当業者には周知である。
本研究の目的は、抗タウモノクローナル抗体(抗Tau−mAb)(モノクローナル抗体)を産生させてスクリーニングすることであった。ハイブリドーマは骨髄腫細胞株とタウワクチン免疫マウス脾臓の融合により産生した。ハイブリドーマは、リン酸化及び非リン酸化全長タウ蛋白質並びにワクチン製剤に使用されるリン酸化及び非リン酸化タウの抗原性ペプチドの両方に対する反応性について評価した。ハイブリドーマのスクリーニングはまた、タウトランスジェニックマウスの脳切片上の免疫化学を用いて、タウ濃縮体についてハイブリドーマ上清の反応性について行った。
1.1.1 融合
ACI−33(タウ5−20[pY18])でワクチン接種された野生型C57BL/6マウスをハイブリドーマの生産に用いた。マウスは第0日目と次いで第4日目に再びACI−33ワクチンで追加免疫され、融合は第7日目に行った。173x106(ACI−33)、免疫化マウス由来の脾細胞;を、5脾細胞/1骨髄腫細胞の割合でSP2−O−Ag14骨髄腫細胞と融合させた。
8x96ウェルプレートを、IgG発現について二回最初にスクリーニングした。陽性発現するクローンを24ウェルプレートに移し、増殖細胞の細胞上清(=クローン)をタウELISAスクリーニング及び免疫組織化学TAUPIRスクリーニングで検査した。
Elisaプレートをコーティング緩衝液中4℃で16時間、50μl/ウェルの抗マウスIgG抗体(CER Groupe、Marloie、Belgium)でコーティングした。PBS/Tweenでプレート洗浄後、100ul/ウェルのブロッキング溶液を室温で1時間塗布した。希釈していないハイブリドーマ上清の50μlを室温で1時間インキュベートした。洗浄工程後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗マウスIgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG3の混合物(Ab Serotec、Raleigh、NC、USA)を室温で1時間プレートに塗布した。最終洗浄後に、検出が、TMB(3−3’、5,5’−テトラメチルベンジジン)、HRP用ホスファターゼ基質を用いて実施され、プレートをELISAプレートリーダーを用いて405nmで読み取った。結果はO.D.として表される。(光学濃度)。
ハイブリドーマのELISAスクリーニングを、pTauペプチド(ACI−33、T1.5:タウ5−20[pY18];ACI−35、T3.5:タウ393−408[pS396/pS404];ACI−36、T4.5:タウ401−418[pS404/S409];ACI−41、T8.5:タウ206−221[pT212/pS214]及びT9.5:タウ196−211[pS202/pT205]PolyPeptide Laboratories、Hillerod、Denmark)、対応するタウペプチド(ACI−33、T1.6:タウ5−20;ACI−36、T4.6:タウ401−4、ACI−41、T8.6:タウ206−221とT9.6:タウ196−211、PolyPeptide Laboratories、Hillerod、Denmark)、リン酸化された完全長(441aa)タウタンパク質(pTauタンパク質、Vandebroekら、2005)及び完全長(441aa)タウ蛋白(タウタンパク質、SignalChem、Richmond、Canada)で行った。最後に、ウシ血清アルブミン(BSA)を陰性コントロールとして用いた。
TAUPIR実験は実施例3.1.2からのプロトコルに従って行った。
ELISAプレートを炭酸塩−重炭酸塩コーティング緩衝液pH9.6(Sigma、Buchs、Switzerland)に溶解した5ug/mlの抗マウスIgG F(ab’)2断片特異的抗体(Jackson Laboratories、Baltimore、PA、USA)で一晩4℃でコーティングした。プレートを洗浄した後、希釈していないハイブリドーマ上清、陽性コントロールIgG1抗体(1ug/mlの6E10:Covance、Emeryville、CA、USA)又は陰性コントロール(培地のみ)を室温で1時間インキュベートした。洗浄工程後、二次AP結合ヤギ抗マウスIgG(サブクラス1+2a+2b+3)のFcγ断片特異的抗体(Jackson Laboratories、Baltimore、PA、USA)を37℃で2時間プレート上でインキュベートした。最終洗浄後、pNPP(パラ−ニトロフェニル−ホスフェート)、AP用ホスファターゼ基質を行いて検出が行われ、プレートをELISAプレートリーダーを用いて405nmで読み取った。結果はO.D.として表される。(光学濃度)。
1.2.1 ACI−33ハイブリドーマ
融合物から生じる8x96ウェルプレートからの細胞上清を、IgGの産生についてスクリーニングした。検査した768ウェル(8x96ウェル)において、277ウェルが、IgG発現について陽性であり、24ウェルプレートに移した。24ウェルプレートで、79クローンが生育しており、これらの細胞からの上清を分析した。陽性クローンを更にT25フラスコに移し、上清をIgGの産生、ELISAおよびTAUPIRについてスクリーニングした(表2)。
融合物から生じる8x96ウェルプレートからの細胞上清を、IgGの産生についてスクリーニングした。検査した768ウェル(8x96ウェル)において、333ウェルが、IgG発現について陽性であり、24ウェルプレートに移した。24ウェルプレートで、75クローンが生育しており、これらの細胞からの上清を分析した。陽性クローンを更にT25フラスコに移し、上清をIgGの産生、ELISAおよびTAUPIRについてスクリーニングした(表3)。
融合物から生じる8x96ウェルプレートからの細胞上清を、IgGの産生についてスクリーニングした。検査した768ウェル(8x96ウェル)において、215ウェルが、IgG発現について陽性であり、24ウェルプレートに移した。24ウェルプレートで、81クローンが生育しており、これらの細胞からの上清を分析した。陽性クローンを更にT25フラスコに移し、上清をIgGの産生、ELISAおよびTAUPIRについてスクリーニングした(表5)。
生成された抗体は、非リン酸化ペプチドに対してごくわずかに結合し、pTauペプチドに高い特異性を示している。
ハイブリドーマ細胞からの抗体重鎖と軽鎖の可変領域がクローニングされ、相補性決定領域(CDR)のDNA配列とその位置並びに抗体結合の特徴が決定された。
目的は、タウリポソームワクチンで免疫したマウス由来のサブクローニングしたハイブリドーマから産生された抗体のリン酸化タウ(pTau)結合を測定することであった。これをテストするため、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)は、リン酸化及び非リン酸化完全長タウタンパク質ならびにリポソームワクチン製剤に使用されるリン酸化及び非リン酸化タウ抗原性ペプチドの両方に対する精製された抗体の結合を測定するために用いられた。
3.1.1 リン酸化タウ結合アッセイ
抗リン酸化タウ抗体(マウスIgG3アイソタイプ)はリポソームタウワクチン接種マウスから産生された。リポソームワクチンはリン酸化タウ(pTau)ペプチドのリン酸化製剤である。抗タウ抗体を産生するハイブリドーマのサブクローンは母クローンから限界希釈によって選択した。アイソタイピングを、単一のアイソタイプクローンの存在を示すために行った。抗体は、ローラーボトル中で産生され、アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、滅菌0.22μmろ過を行い、定量した。タウ及びpTauへの抗体の結合を試験するためにELISAアッセイを使用した。簡潔には、Nunc MaxiSorp96ウェルプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)が、1μg/mLの完全長(441aa)タウ蛋白質(SignalChem, Richmond, Canada)又はリン酸化完全長(441aa)タウ蛋白質(Vandebroek et al.、2005)でコーティングした。加えて、プレートを10μg/mLのタウ由来ペプチドでコーティングした。ワクチン製剤で使用されていなかったタウ配列及びpTau配列に対する交差反応性を試験するために、プレートは以下のペプチドを10μg/mLでコーティングした:Tau5−20(Y18はリン酸化されるか又はされない)、Tau393−408()S396及びS404はリン酸化されるか又はされない)、Tau401−418(S404及びS409はリン酸化されるか又はされない)、Tau206−221(T212及びS214はリン酸化されるか又はされない)及びTau196−211(S202及びS205はリン酸化されるか又はされない)。コーティングは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で4℃で一晩行われた。プレートを0.05%Tween20/PBSで十分に洗浄し、次いで37℃で1時間、0.05%Tween20/PBS中、1%ウシ血清アルブミン(BSA)でブロックした。試験される抗体を8回又は16回の20〜0μg/mLの間の2倍希釈系列に添加し、37℃で2時間インキュベートさせた。プレートは、その後、前述のように洗浄し、AP−結合抗マウスIgG二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories、Suffolk、England)を37℃で2時間、0.05%Tween20/PBSの6000分の1希釈で加えた。洗浄後、プレートを、p−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物(pNPP;Sigma−Aldrich, Buchs, Switzerland)ホスファターゼ基質溶液と共にインキュベートし、ELISAプレートリーダーを用いて2又は16時間のインキュベーション後に405nmで読み取った。結果は光学濃度(O.D.)として表される。
使用した脳スライスは、TPLHマウスと交配した老齢(>18ヶ月)のダブルトランスジェニックbiGT(P301L変異を有するヒトタウの最長のアイソフォーム(441aa)を含有する、GSK−3βトランスジェニックマウス)からのものであった。さらにタウノックアウトマウス(TKO、6ヶ月)由来の切片も使用した。脳の切片はPBSで5分間洗浄し、次に、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、室温で15分間、PBS:MeOH(1:1)中で1.5%のH2O2でインキュベートした。切片をPBST(PBS/0.1%TritonX100)で3回洗浄後、それらはPBST+10%FCS(ウシ胎児血清)ブロッキング溶液中で室温で30分間インキュベートした。試験された抗タウ抗体とのインキュベーションは、PBST/10%FCSでの示された希釈で4℃で一晩行われた。次に、切片を室温で1時間PBST/10%FCSでHRP結合ヤギ抗マウス(ダコ、グロストラップ、デンマークから購入した)二次抗体とのインキュベーションの前にPBSTで3回洗浄した。検出前に、切片をPBSTで3回洗浄し、5分間、50mMのトリス/HCl pH7.6中でインキュベートした。検出は、ジアミノベンジジン(DAB:150mMのトリスHCl+3ulのH2O2 30%を10ml中に一錠;MP Biomedicals, Solon, OH, USA)で3分間切片をインキュベートすることにより行われた。反応はPBSTで切片を3回洗浄することにより停止させた。次いで、切片をシラン化ガラスプレート上に移し、温プレート上で2時間50℃で空気乾燥した。対比染色は、1分間、メイヤーヘマトキシリン(Fluka Chemie, Buchs, Switzerland)とのインキュベーションを用いて行われ、その後流れる水道水による4分間の洗浄工程が続いた。切片は50%、70%、90%、及び2回の100%エタノール槽を通過させ、次いでキシロール中を2回1分間通過させることにより脱水した。最終的に、切片をDePex(BDH Chemicals Ltd., Poole, England)でガラスカバー下にマウントした。
ヒトの脳内におけるpTauに対する抗pTau抗体ACI−36−3A8−AB1の免疫反応のアッセイはTAUPIRによって行われた。脳のパラフィン切片をキシロール中に5分間に2回、及び100%EtOH中に1分間に2回通すことにより脱パラフィンし、その後90%、70%、50%EtOH、及び蒸留水中で1分間洗浄し、その後PBS中で5分間に2回洗浄した。抗原回復のため、切片は0.01Mのクエン酸溶液水溶液(pH6.0)で10分間加熱することにより処置し、20分間冷却した。切片は、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断するために、室温で15分間PBS:MeOH(1:1)中の1.5%H2O2でインキュベートした。切片をPBST(PBS/0.05%Tween−20)で3回洗浄後、それらはブロッキング溶液としてPBST+10%のウシ胎仔血清(FCS)中で室温で30分間インキュベートした。一次抗pTau抗体ACI−36−3A8−AB1(ブロッキングバッファー中に410ng/mL)によるインキュベーションを4℃で一晩行った。次いで切片をPBSTで3回洗浄し、PBST/10%FCSで1/500希釈したHRP結合ヤギ抗マウス二次抗体(Dako、Glostrup、Denmark)で室温で1時間インキュベートした。検出前に、切片をPBSTで3回洗浄し、5分間、50mMのトリス/HCl pH7.6中でインキュベートした。検出は、ジアミノベンジジン(DAB:150mMのトリスHCl+3ulのH2O2 30%を10mL中に一錠;MP Biomedicals, Solon, OH, USA)で3分間切片をインキュベートすることにより行われた。反応はPBSで切片を3回洗浄することにより停止させた。対比染色はマイヤーのヘマトキシリン(Fluka Chemie, Buchs, Switzerland)で1分間インキュベートすることにより行い、次いで水道水中で4分間洗浄した。切片は、50%、70%、90%のエタノール槽を通し、100%のエタノール槽に2回通し、その後キシロールに1分間に2回通して脱水した。
トランスジェニック動物からの脳抽出物における試験抗体のpTauに対する結合はWBによって行われた。野生型FVB、TPLH、biGT及びTKOマウスから脳のホモジナイズは、次のバッファで行われた:25mM Tris/HCl pH7.6、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、30 mM NaF、0.2mM Na3VO4、1nM オカダ酸、1mM フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)、5mM Na4P2O7、総12ミリリットルあたり1錠の完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(CPIC)。全脳ホモジネートを得るために、脳は1容量/重量の半球(ml/g)が氷上でモーター駆動ポッター様ガラスチューブ/テフロン乳棒により700rpmでホモジナイズされた。全脳ホモジネートは半分がサンプルバッファー((25mMのトリス/HCl pH6.8、4%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、20%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルーおよび5%β−メルカプトエタノール)で希釈し、次いで95℃まで急速に加熱した。サンプルは5分間保持され、サンプルバッファーで1/4希釈され、再び95℃に加熱し、次いで冷却し、可溶化されていなかった破片を除去するために5分間14.000rpmで回転させた。上清を回収し、SDS−PAGEゲル上にロードした。ニトロセルロース膜(Hybond−ECL)への転写はトランスファーバッファー(25mMトリスpHが8.6、190mMのグリシン、20%メタノール)中で行った。膜を、ブロッキング溶液(TBS中0.1%Tween(50mMのトリスHCl、pH7.6、150mMのNaCl、及び5%乾燥ミルクパウダー)に移し、ブロッキング溶液で希釈した試験抗体と4℃で一晩インキュベートした。ブロッキング溶液で1/10’000に希釈した二次抗体HRP結合ヤギ抗マウス(Dako, Glostrup, Denmark)とのとのインキュベーションを室温で1時間行った。検出は、GEヘルスケアからのECLウェスタンブロッティング検出試薬を用いて行った。
3.2.1 濃縮体陽性タウトランスジェニックマウスからの脳切片を用いたELISAアッセイおよびTAUPIR
抗体の結合を、免疫原として使用されるリン酸化タウペプチドに対して、及びリン酸化全長ヒトタウタンパク質に対して測定した。これは、441個のアミノ酸からなるヒトタウタンパク質の最も長いアイソフォームである。対応する非リン酸化ペプチド及び全長ヒトタウタンパク質も含まれていた。表6に示すように、6つの抗体がリン酸化タウペプチドに対して高い結合を示し、リン酸化全長ヒトタウタンパク質に対してはごく限定された結合ないしは全く結合を示さなかった。結合は、対応する非リン酸化タウペプチドまたは非リン酸化全長ヒトタウタンパク質に対しては観察されなかった。これは、リン酸化ヒトタウペプチドに対する抗タウ抗体の高い結合を示している。
AD、FAD、AGD、FTDP−17、CBDとPSP含む診断タウオパチーに罹患した被験体からのヒト脳切片に宿ったタウ凝集体に結合する抗体ACI−36−3A8−AB1の能力を、TAUPIR免疫組織化学により調べた(図2)。抗pTau抗体ACI−36−3A8−AB1は、ヒトの脳切片における糸屑状構造物、神経原線維変化(NFTは)を含むpTau、及びニューロン及びグリア細胞型に存在するpTauの蓄積物の他の形態に結合した。より具体的には、ACI−36−3A8−AB1は、AD脳におけるNFT、糸屑状構造物、及びアミロイド斑を取り巻く変性神経突起を顕著に染色し、それはAD及びFADと診断された被験体で容易に明らかであった。AGDからの脳切片において、ACI−36−3A8−AB1は、複数の好銀性粒子/顆粒が明らかに見え、NFTと糸屑状構造物の両方を染色した(図2)。PSPからの脳切片のACI−36−3A8−Ab1による染色はNFT,糸屑状構造物、及び変性神経突起を示した。更に、ピック体様封入及び房状pTau陽性星状細胞が明らかに示され、PSPでの豊富な特徴であり、そこではpTau染色が、遠位の突起を含む細胞全体に広がっている。FTDP−17において、染色パターンはまた、NFTだけでなく検出された無色の「膨らんだ」ニューロンを持ち、疾患の既知の不均一性を示した。ACI−36−3A8−AB1抗体はまた、CBDの主な特徴であるかすかにタウ陽性である腫れた無彩色のニューロンを染色した。CBDのその他の顕著な病理学的特徴、すなわち、コイル体と呼ばれるオリゴデンドログリア封入もまた、ACI−36−3A8−AB1抗体によって良好に検出された。染色はAT8陰性コントロール被験体において検出されなかったが、弱い染色がAT8陽性のコントロール被験体で同定された。
本研究の目的は、表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて抗タウ抗体とリン酸化タウペプチドとの間の結合親和性を決定することであった。リン酸化タウペプチドは、抗タウ抗体を産生するためのワクチン製剤に使用されるペプチド配列に相当する。この相互作用を研究するために、リン酸化ペプチドをセンサチップの表面に固定化し、その結合は、チップ上に抗体を通過させる際にSPRを使用してリアルタイムでモニターした。
4.1.1 SPR結合アッセイ
全ての実験は、SPRビアコアX機器(GE Healthcare)で行った。固定化の試薬(EDC、NHSおよびエタノールアミン)、センサーチップCM5(カルボキシメチルデキストラン)、並びにバッファHBS−EPは、GE Healthcareから購入した。リン酸化タウペプチドは1:1(v/v)の比でPBS/酢酸ナトリウム緩衝液(10mMの、pH値5.0)に可溶化し、250μgの/mlの最終ペプチド濃度を得た。このペプチド溶液を、次いで、EDC/NHSを用いて予備活性化したCM5センサーチップのフローセル(fc)2を介して結合させた。結合後、エタノールアミンをその表面に通し、218RUの最終的な固定化レベルを与えていた。抗タウ抗体の5つの濃度は、泳動バッファーを用いた段階希釈によってアッセイした。注入は、最も低い濃度から出発して行われ、180秒間、30μL/分の流速でfc1と2の両方に通した。フローセル1を非誘導体化し、機器ノイズとバルク屈折率の変化を補正するために反応をfc2から差し引いた。注入が終了した後、表面を300秒間ランニングバッファーで直ちに洗浄した。残った結合抗体をチップから除去するために、表面の再生を、1M NaClを含む8mMのNaOHの水溶液のパルス(典型的には3μl)を注入することによって実施した。動態解析は、BIAevaluation3.0を使用して数値積分およびグローバル解析のためのアルゴリズムを用いて行った。異なる濃度の抗体の注射について得られたセンソグラムを重ね、ベースラインをゼロに調整した。カーブフィッティングのために、全てのデータを1:1均質(ラングミュア)モデルに対して同時に適合させた。
リン酸化タウペプチドに対する抗タウ抗体の結合を、SPRを用いてリアルタイムで監視した。抗体結合の会合相及び解離相の分析は、会合速度定数(ka)、解離速度定数(Kd)並びに解離定数KDを決定するために使用することができる。抗体ACI−33−6C10−AB1は、抗体の3.7→367nMの範囲で、非誘導体化カルボキシメチルデキストラン表面でペプチドT1.5に特異的に結合する。センソグラムの速度論的分析は、9.46x105M−1s−1の速い会合速度定数と3.27x10−3s−1の解離速度定数を示した(表7)。従って、解離定数KDは3.46nMであることが決定され、抗体が非常に高い親和性でリン酸化ペプチドT1.5を認識していることを示している。全ての試験抗体は、免疫化とハイブリドーマ生成のために使用されたそれぞれのリン酸化ペプチドに高い親和性を示したが、それらは非リン酸化ペプチドにはほとんど親和性を示さなかった。
5.1 方法
抗リン酸化タウのマウスモノクローナル抗体のエピトープマッピングは、異なるリン酸化および非リン酸化ペプチドライブラリーを用いてELISAによって行った。使用されるペプチドライブラリーのアミノ酸配列を表8に示す。各ライブラリは、ペプチドワクチンに存在するリン酸化及び非リン酸化配列にまたがる短いビオチン化ペプチドから成っていた。ペプチドライブラリはANAWA取引SAから購入した。エピトープマッピングは、製造業者(Mimotopes)の指示に従って行った。簡潔には、ストレプトアビジンコーティングプレート(NUNC)は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の0.1%BSAで、4℃で一晩ブロックされた。.PBS−0.05% Tween 20による洗浄後、プレートは各ライブラリからの異なるペプチドにより室温で1時間コーティングされ、0.1%BSA、0.1%アジ化ナトリウムのPBS溶液で最終濃度10μMに希釈された。洗浄後、プレートは、2%のBSAと0.1%のアジ化ナトリウムのPBS溶液で40ng/mlに希釈された試験抗体とともに室温で1時間インキュベートした。プレートは、再び洗浄され、1/6000希釈でAP結合抗マウスIgG二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Suffolk, England)とともに室温で1時間インキュベートした。最終洗浄後、プレートは、p−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物(pNPP;Sigma−Aldrich, Buchs, Switzerland)ホスファターゼ基質溶液とともにインキュベートし、2時間のインキュベーション後にELISAプレートリーダーを用いて405nmで読み取られた。結合は、光学濃度(O.D.)がバックグランドのO.D.の少なくとも2倍である場合、陽性と考えられた。
エピトープマッピング実験の結果として、エピトープは、本明細書に開示されている抗体が特異的に結合する必要なリン酸化アミノ酸残基(表9参照)を含め識別され得る。
・タウaa 15−20,pY18を要件とする(6C10F9C12A11;6C10E5E9C12)
・タウaa 405−412,pS409を要件とする(6H1A11C11;6H1G6E6)
・タウaa 405−411,pS409を要件とする(2B6A10C11;2B6G7A12;3A8A12G7;3A8E12H8)
・タウaa 208−218,pT212とpS214を要件とする(7C2(1)F10C10D3)
・タウaa 393−401,pS396を要件とする(A4−2A1−18;A4−2A1−40)
・タウaa 396−401,pS396を要件とする(A4−4A6−18)
・タウaa 394−400,pS396を要件とする(A6−1D2−12)
・タウaa 402−406,pS404を要件とする(A6−2G5−08)
・タウaa 393−400,pS396を要件とする(A6−2G5−30;A6−2G5−41)
6.1.方法
全てのインビボ試験について、タウトランスジェニックマウスが用いられ、下記の表に示すように、治療抗体を投与した。
全長ヒトTAUアイソフォームTAU441を過剰発現し、マウスThy−1プロモーターの制御下でミスセンス変異V337MとR406Wを担持する雌と雄の6.3月齢(±3日)のTgマウス(TMHTマウス)が研究番号1で用いられた(上の表参照)マウスは、脳内のTAU病理を決定するために、最後の投与後1日に安楽死させた。
遺伝子型のテールティッピングの過程で、動物は古典的な耳標装着により、連続的に番号付けられた。全ての動物は、試験開始前に再度遺伝子型を決定した。マウスは、国際基準に基づいくJSW標準操作手順に従って維持した。動物はRettenmaier(登録商標)によって提供される標準化されたげっ歯類の寝具の個々の換気ケージに収容した。温度を約24℃に維持し、相対湿度を40から70%に維持した。動物は、一定の光サイクル(12時間の明るい/暗い)下で飼育した。乾燥され、ペレット化した標準的なげっ歯類の餌(Altromin(登録商標))と、通常の水道水は動物に対して自由に利用可能であった。個々の動物を、個々の動物のデータシートに記載された任意の臨床徴候について定期的にチェックした。
最初の免疫化の前七日は、インビボでの出血は顔の静脈/動脈からの下顎のサンプリングにより行った。血液サンプルは、静脈および動脈の血液の混合物である。血漿を得るために、血液をヘパリンチューブに回収し、遠心分離した(1,000×gで、10分間、室温)。血漿は使用するまで2つのアリコートに凍結された。
全てのクライオ凍結脳の半球を分析した。レベル(全部で5つのレベル)あたり15クライオ切片、それぞれ10μmの厚(Leica CM 3050S)を矢状に切断した。脳レベルは形態学アトラス“The Mouse Brain” from Paxinos and Franklin(第2版)に従って選択された。5つのレベルの切断はランダムスライスで開始し、次いでサンプリングが均一かつ体系的に継続し、常に連続してレベルごとに15スライスを保持し、レベル間では150μmを廃棄した。脳領域あたり海馬と扁桃体の5つのスライス(各レベルから1)のTAU病理を決定するために、動物はAT180(#MN1040、Thermo Scientific)抗体とHT7(#MN1000、Thermo Scientific)抗体を用いて染色された。一次抗体はCy−3−結合2次抗体により可視化され、続いて、免疫反応性領域がイメージプロプラス(v6.2の)ソフトウェアを用いて評価した。
方法6.1.1に従って処置されたマウスは、脳内のタウ病理を決定するために、2回目の投与後1日に安楽死させた。簡潔には、一つの脳半球からの可溶性皮質サンプルを100から200μLの冷たい抽出緩衝液(25mMのトリス−HCl pH=7.4、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、10mMのβ−グリセロリン酸、30mMのNaF、2mMのNa3VO4、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル)でホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離し(4℃で15分間、74,200×g)、上清を可溶性タウの分析に用いた。皮質サンプルの可溶性画分中の総タンパク質濃度は、BCAタンパク質定量アッセイ(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)によって決定した。
ACI−36−2B6−AB2とACI−36−3A8−AB2を投与したマウスの脳における免疫反応を探るために、pTau PHFエピトープに結合することが報告された2つの抗体(Greenberg et al., 1992; Reig et al., 1995; Hoffmann et al., 1997)を、ウェスタンブロット(WB)アッセイで用いた。皮質からの可溶性画分を等容量のサンプルバッファーA(125mMのトリス−HCl pH6.8、4%[w/vの]ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、20%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルー、5%β−メルカプトエタノール)を添加することによって希釈し、そしてサンプルを、10分間95℃に加熱した。30μgのサンプルを4−12%のBisーTrisゲル(Invitrogen, Basel, Switzerland)上にロードし、MOPS SDS バッファー(Invitrogen)で泳動した。タンパク質はトランスファーバッファー(25mMトリス pH8.6、190mMのグリシン、20%メタノール)中で0.45μmPVDFに転写した。タンパク質の転写を確認するため、膜をPonceau Sで5分間染色し、ブロッキングバッファー(TBS〔50mMトリス−HCl、pHが7.6、150mMのNaCl]中に5%のBSA)で1時間ブロックした。ブロッキングバッファーおよび0.1%Tween中で、膜を一次抗体で4℃で一晩ブロットした。WBで使用された2つのpTau PHF特異的一次抗体は以下である:抗pS396(PHF−13エピトープ;AbCam, Cambridge, UK;3μg/mLで使用)、ヒト又はマウスpTauのリン酸化Ser396に特異的(Hoffmann et al., 1997)、及びAD2(PHF−1エピトープ;BioRad、Reinach, Switzerland;0.4μg/mLで使用)、ヒト及びマウスのpS396及びリン酸化Ser404に特異的(pS404;Reig et al., 1995)。全タウWBのために、タウ5(0.5μg/mL)、ヒト及びマウスのタウの両方に結合する抗体(BD Biosciences, Allschwil, Switzerland)を用いた。一次抗体とのインキュベーション後に、膜をTBS中0.1%のTweenで洗浄し、二次抗体:ヤギ抗マウスIRDye800またはヤギ抗ウサギIRDye680(両方ともLi−Cor Biosciences, NE, USAから)とインキュベートし、両方ともBBと0.1%のTweenで1:15000希釈した。次いで、膜を、室温で1時間光から保護してインキュベートし、TBS中の0.1%のTweenで15分間3回洗浄し、TBSで5分間2回洗浄し、バンドをLi−Corオデッセイ近赤外イメージング・システム(Li−Cor)を使用して定量化した。バンドはβ−アクチンの発現に対して正規化した(AbCam;0.4μg/mLで使用)。ヒトトランスジェニックタウのバンド対マウス内在性のタウのバンドの同定を確認するために、ブロットをヒト完全タウに特異的抗体(Tau13、AbCam;表示せず)で探索した。加えて、治療抗体ACI−36−2B6−Ab2及びACI−36−3A8−Ab2が、抗pS396又はAD2の結合に干渉するのに十分な量で変性した試験サンプルに存在していないことを確認するために、膜を抗マウス一次抗体で探索した。この研究で使用したサンプルではインタクト又は変性した治療抗体は検出されなかた(結果は非表示)。
データは、ノンパラメトリックなクラスカル−ワリス順位和統計を用いて分析し、P<0.05レベルで有意であれば、ダンの事後テストを全群の比較に用いた(GraphPad Prism, GraphPadソフトウエア, CA, USA)。結果は平均±平均値の標準誤差(SEM)を示す個別のデータ点として示される。P<0.05を持つ差は統計的に有意とみなした。
6.2.1.免疫組織化学的(IHC)定量による脳のTAU病理
本研究期間中、ACI−36−2B6−Ab2とACI−36−3A8−Ab2の2回の腹腔内注射は、いかなる著しい悪影響をも示さなかった。IHCによるAT180を使用するpT231とpS235の染色は、ACI−36−3A8−Ab2の処置後に、扁桃体で免疫反応領域(IR)の増大を示した。3mg/kg ACI−36−2B6−Ab2で処置されたマウスは、海馬において著しく小さいAT180IR領域を持っていた。
可溶性タンパク質を含む脳画分中のpTAUとTAUに関する治療の効果は、MSDデュプレックスアッセイを用いて測定した。皮質の全可溶性TAUのレベルは、ACI−36−2B6−Ab2とACI−36−3A8−Ab2で処置されたマウスで著しく減少した(P<0.01、図3の上の段)。ACI−36−2B6−Ab2の3mg/kgの用量により、可溶性pTAUのレベルもまた著しく減少し(P<0.01、図3の下の段)、最大の減少を実証している(p<0.01)。全TAUに対するpTAUの比率は変わらなかった。可溶性のTAUとpTAUのレベルは海馬からのサンプルでは変化しなかった(ここでは非表示)。
構造的には、神経原線維変化(NFT)は、高リン酸化された状態で主に見られる、微小管結合タンパク質タウからなる対らせん状細線維(PHF)からなる(Alonso et al., 1997)。この研究の目的は、ACI−36−2B6−Ab2とACI−36−3A8−Ab2の投与後に、タウトランスジェニックマウスの脳内でpTauPHFを探索し定量化するためにpTauPHFを認識する抗体を使用することであった。
抗pTAU抗体ACI−36−3A8−Ab2によるタウTgマウスの2回の末梢性投与は、大脳皮質において可溶性のTAUと可溶性のpTAUを著しく減少させた。抗pTAU抗体ACI−36−2B6−Ab2によるタウTgマウスの2回の末梢性投与は、大脳皮質において可溶性のTAUと可溶性のpTAUを著しく減少させた。更に、ACI−36−2B6−Ab2は大幅に海馬のpTAU免疫反応性を減少させた。これらの結果は、タウオパチーの低減における、ACI−36−2B6−Ab2及びACI−36−3A8−Ab2抗体を用いた受動抗pTAU免疫化の能力を実証している。
7.1 方法
7.1.1 マウス及び処置
タウトランスジェニックマウスが用いられ、方法6.1の表に示すように、治療抗体を投与した。(研究番号2)
最後の投与後に、6.1.1に従って処置されたマウスの空間記憶能力について試験するために水迷路(MWM)タスクが実行された。MWM実験は開始後第4週に全ての囲い込まれた動物で実施された。MWMは21℃±2℃の温度での水道水で満たされた100センチメートルの直径を持つ白い円形プールで構成されている。プールはは実質的に4つのセクターに分割される。透明なプラットフォーム(直径8cm)が水面下約0.5cmに配置される。全ての試験セッションの最中にて、プラットフォームは、プールの南西の四分円に位置している。各マウスは、連続4日間の各々で3つの試験を実行しなければならなかった。1回の試験は、最大で1分間続いた。この期間、マウスは隠された半透明の標的を見つける機会があった。各試行後に、マウスは環境に適用させるためにプラットフォーム上で10〜15秒間休ませた。第4日の最後の試行後に少なくとも1時間、マウスはいわゆるプローブ試験(PT)を履行する必要があった。PTの最中、プラットフォームはプールから除去され、旧標的位置上の交差の数が、この四分円における滞在とともに、実験者によって記録された。PTにおいて、逃避潜時(マウスが隠されたプラットフォームを見つけて水から脱出するのに必要な時間[秒])、経路(標的に到達する軌跡の長さ[メートル])、標的ゾーンの交差、及び標的四分円における滞在の定量化のために、コンピュータ化されたトラッキングシステム(Biobserveソフトウェア)を用いた。全ての動物は、行動の結果における不十分な視覚能力の影響を排除するために、最後の日のPT後に視覚検査を行う必要があった。
マウスは、脳内のタウ病理を決定するためにMWMの後1日で(最後の投与後1週間で)安楽死させた。脳のタウ病理は、AT180(抗pTau、pT231/pS235)抗体及びHT7(ヒト特異的抗タウ)抗体を用いて免疫組織化学的(IHC)定量によって海馬と扁桃体で決定された。更に、メソスケールディスカバリー(MSD)デュプレックス技術を使用して、ホモジネート画分で皮質と海馬の可溶性pTauと可溶性Tauの治療効果を測定し、pTau(pT231)と総TAUを探索した。IHCアッセイ又はMSDアッセイの何れかで使用される抗体は、この研究で使用される治療抗体と重複するエピトープを持っていない。
マウスは、最後の治療投与後一週間で、組織の収集のために安楽死させた。皮質と海馬を100から200μLの冷たい抽出緩衝液(25mMのトリス−HCl pH=7.4、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、10mMのβ−グリセロリン酸、30mMのNaF、2mMのNa3VO4、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル)でホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離し(4℃で15分間、74,200×g)、皮質と海馬における可溶性タウの分析のために上清を用いた(図4)。ペレットを100−200μLの抽出バッファー2(10mMトリスHCl pH=7.4、800mMのNaCl、300mMのスクロース、1mMのEGTA、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル)に再懸濁する。溶液は遠心分離され(4℃で20分間、4000g)、上清を超遠心チューブに移した。次にサルコシル(30%水溶液)を1%の最終濃度まで添加し、室温で1.5時間インキュベートした。遠心分離後(4℃で30分間、74200g)、上清をを廃棄し、ペレットを100μLの緩衝液3(50mMのトリス−HCl、pH=7.4)に再懸濁した。再懸濁したペレットは皮質と海馬でサルコシル不溶性(SinT)タウとして使用された。可溶性画分及びSinT画分のサンプル中の総タンパク質濃度は、BCAタンパク質定量アッセイ(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)によって決定した。
大脳皮質と海馬におけるpTau PHFの存在下でのACI−36−2B6−Ab1の作用を評価するために、pTau PHFエピトープに結合すると報告された2つの抗体が(Greenberg et al., 1992; Reig et al., 1995; Hoffmann et al., 1997)ウェスタンブロット(WB)アッセイに用いられた。皮質と海馬からの可溶性画分とSinT画分を等容量のサンプルバッファーA(125mMのトリス−HCl pH6.8、4%[w/v]ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、20%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルー、5%β−メルカプトエタノール)を添加することによって希釈し、そしてサンプルを、10分間95℃に加熱した。30μgのサンプルを4−12%のBisーTrisゲル(Invitrogen, Basel, Switzerland)上にロードし、MOPS SDS バッファー(Invitrogen)で泳動した。タンパク質はトランスファーバッファー(25mMトリス pH8.6、190mMのグリシン、20%メタノール)中で0.45μmPVDFに転写した。タンパク質の転写を確認するため、膜をPonceau Sで5分間染色した。膜は次いで洗浄し、ブロッキングバッファー(TBS〔50mMトリス−HCl、pHが7.6、150mMのNaCl]中に5%のBSA)で1時間ブロックした。ブロッキングバッファーおよび0.1%Tween中で、膜を一次抗体で4℃で一晩ブロットした。
データは一方向性ANOVAを用いて解析され、続いて、ダネットの多重比較事後試験(GraphPad Prism, GraphPad Software, CA, USA)を行、各処置をTgコントロール処置マウスと比較した。結果は平均±平均値の標準誤差(SEM)を示す個別のデータ点として示される。P<0.05を持つ差は統計的に有意とみなした。グラブの極端なスチューデント逸脱試験により有意な(p<0.05)異常値として同定された単一の値は除外された。
7.2.1.行動実験−受動免疫後のモリス水迷路(MWM)タスク
毎週3mg/kgで又は4週間の期間に1mg/kgで投与されたACI−36−2B6−Ab1の4回の腹腔内注射は、いかなる著しい悪影響をも示さなかった。
MWM試験の結果は、ACI−36−2B6−Ab1とACI−36−3A8−Ab1で処置されたマウスに関して空間学習が改善される傾向を実証した。
AT180抗体は内因性及びヒトpTAU(Thr231及びSer235で2重リン酸化)を染色する。
アルツハイマー病(AD)は、神経原線維変化によって神経病理学的に特徴付けられる(NFTs;Braak, Braak, &Bohl, 1993)。構造的には、NFTは、高リン酸化された状態で主に見られる、微小管結合タンパク質タウからなる対らせん状細線維(PHF)からなる(Alonso et al.,1997)。本研究の目的は、抗pTau抗体ACI−36−2B6−Ab1とACI−36−3A8−Ab1の4回の投与によって、タウトランスジェニックマウスの脳におけるこれらのpTau PHFエピトープを減らすことだった。
本研究は、リン酸化部位特異的抗pTau抗体ACI−36−2B6−Ab1抗体及びACI−36−3A8−Ab1抗体の4回の投与を用いる受免疫化は、空間学習を改善し、脳のpTau病理を減少させることを示している。
8.1 方法
8.1.1 マウス及び処置
タウトランスジェニックマウスが用いられ、方法6.1の表に示すように、治療抗体を投与し(研究番号3)、下記の表に記載のようにマウスは4つの異なる処置群に割り当てられた。
この実験は、実施例7.1.2に記載のプロトコルに従って行った。第12週に、学習および記憶を評価するために、空間的ナビゲーションをモリス水迷路(MWM)で試験した。
全TAU及びThr231及びpS396をリン酸化したタウは、メソスケールディスカバリー(MSD)から免疫測定法を用いて、Tg動物の脳ホモジネートで定量した。
この実験は、実施例7.1.3に記載のプロトコルに従って行った。TAU病理は、群あたり8匹の海馬及び扁桃体におけるAT180免疫反応によって決定された。
この実験は、実施例7.1.4、7.1.5と7.1.6に記載のプロトコルに従って行った。文書で十分に立証されたタウPHFリン酸化エピトープの量に関して、4回のACI−36−2B6−Ab1及びACI−36−3A8−Ab1の投与の効果を測定するために、処置されたタウTgマウスからの大脳皮質及び海馬の可溶性画分及びSinT画分が、WBを用いて、AD2(PHF−1エピトープ、pS396/pS404)、抗pS396抗体(PHF−13エピトープ、pS396)及びAT180(pT231/pS235)で探索された。
研究番号4は方法6.1に示したようにバイジェニックタウマウスを用いて行った。ウェスタンブロッティングの総ホモジネート(TH)または可溶性画分(S1)を使用して、下図に示すように、大脳皮質サンプルを調製した。膜はpTauまたは全タウに対して次のブロッティング抗体を用いて探索した:
HT−7(26ng/ml)、全ヒトタウに対して特異的
PHF−13(pS396) 1/7500希釈
AT180(pT231) 2.47ug/ml
AT8(pS202) 3ug/ml
pS404 1:5000希釈
pS400 1:5000希釈
12週間の研究期間中毎週1又は3mg/kgで投与されたACI−36−2B6−Ab1の13回の腹腔内注射は、いかなる著しい悪影響をも示さなかった。
MWM試験の結果は、ACI−36−2B6−Ab1で処置されたマウスに関して空間学習が改善される強い傾向を実証した(図9)。
8.2.2.1 皮質ホモジネートの可溶性画分におけるTAU
全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は、群A(Tgビヒクル群;PBS)、群B(Tg、ACI−36−2B6−Ab1 1mg/kg),及び群C(Tg、ACI−36−2B6−Ab1 3mg/kg)に由来するn=16匹の動物の皮質ホモジネートの可溶性画分で評価された。ACI−36−2B6−Ab1による処置は可溶性皮質ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。しかし、ACI−36−2B6−Ab1の処置の際、全TAU、p231TAU,及びp396TAUの平均に(有意性は無いが)わずかな増加が観察された。全TAUに対するpTAUの比率として評価されるTAUリン酸化は影響を受けなかった。
全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は、群A(Tgビヒクル群;PBS)、群B(Tg、ACI−36−2B6−Ab1 1mg/kg),及び群C(Tg、ACI−36−2B6−Ab1 3mg/kg)に由来するn=16匹の動物の皮質ホモジネートのサルコシル不溶性画分で評価された。ACI−36−2B6−Ab1による処置はサルコシル不溶性皮質ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。しかし、ACI−36−2B6−Ab1の処置の際、全TAU及びp231TAUの平均に(有意性は無いが)わずかな増加が観察された。全TAUに対するpTAUの比率として評価されるTAUリン酸化は影響を受けなかった。
全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は、群A(Tgビヒクル群;PBS)、群B(Tg、ACI−36−2B6−Ab1 1mg/kg),及び群C(Tg、ACI−36−2B6−Ab1 3mg/kg)に由来するn=16匹の動物の海馬ホモジネートの可溶性画分で評価された。ACI−36−2B6−Ab1による処置は可溶性海馬ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。ACI−36−2B6−Ab1の処置の際、全TAUに対するpTAUの比率として評価されるTAUのリン酸化のわずかな増加が(有意性は無いが)観察された。
全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は、群A(Tgビヒクル群;PBS)、群B(Tg、ACI−36−2B6−Ab1 1mg/kg),及び群C(Tg、ACI−36−2B6−Ab1 3mg/kg)に由来するn=16匹の動物の海馬ホモジネートのサルコシル不溶性画分で評価された。ACI−36−2B6−Ab1による処置はサルコシル不溶性海馬ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。3mg/kgによる処置は全TAU、p231TAU並びにp396TAUの平均を、有意性に到達することは無いものの増加させたが、1mg/kgで処置すると、全TAU、p231TAU並びにp396TAUの平均のわずかな減少が観察された。全TAUに対するpTAUの比率として評価されるTAUリン酸化は、3mg/kgのACI−36−2B6−Ab1処置によりわずかに増加した。
ACI−36−2B6−Ab1の用量依存性による処置は、大脳皮質の可溶性画分において、pS396/pS404(図5D)及びpT181(図F5E及び5F)pTauエピトープの両方の存在を減少させ、3mg/kg用量で有意な作用を示した。
3ヶ月間ACI−36−2B6−Ab1で処置したbiGTマウスは、大脳皮質可溶性画分で総タウを有意に減少させた(図6Aおよび6B)。pTauエピトープのpT231/AT180(図6C及び6D)、pS202/AT8(図6E)、及びpS396(図6F及び6G)で有意な減少が観察された。有意な減少もまたpTauエピトープpS400(図6H及び6I)及びpS404(図6L及び6M)の両方の総ホモジネート(TH)の両方で観察された。更に、pTauエピトープpS400の可溶性画分で有意な減少も観察され(図6J及び6K)、pTauエピトープpS404について減少傾向がみられた(図6N及び6O)。
8.2.3.1 形態計測−領域面積の決定
解剖及びIHC又は染色の最中で組織に対する負の影響(例えば明確な収縮、異なる切片)と、ある程度、処置が誘発した萎縮を除外し、海馬及び扁桃体の測定されたの領域面積は、調査された脳の全てを通して有意差は認められなかった。個々の切片は、例えば、標識化プロトコルの実行の最中での切片部分の喪失又は組織の折れたたみのために、個体及び群の平均から逸脱する場合がある。従って、任意の標識の全免疫反応性面積[μm2単位]は、領域面積内の標識面積の割合[標識面積/(領域面積*10.000)]を計算することにより、切片の個々の領域面積[mm2単位]に対して規格化した。
AT180抗体は内因性及びヒトpTAU(Thr231及びSer235で2重リン酸化)を検出する。nTgコントロールにおける細胞体内のpTAUの量は、Tg群と比較して有意に低かった(p<0.01並びにp<0.001)。扁桃体では、ACI−36−2B6−Ab1の高用量(3mg/kg 群C)は、ビヒクル処置動物に比べて細胞体pTAUを有意に減少させた(図7、左)。低用量(1mg/kg 群C)は同様の傾向を示したが有意性には至らなかった。同じ効果は、海馬で検出可能であった。ACI−36−2B6−Ab1は用量依存的にpTAUを減少させ、高用量で有意であり低用量でその傾向がみられた(図7、右)。この減少はまた、染色の領域の減少及び個々の神経細胞の細胞体における染色強度の減少として定性的に可視的であった。ニューロンの細胞体で測定されたAT180 IRのAOIのサイズに規格化された染色強度の総和の結果は、扁桃体における高用量の大きな効果の有意な用量依存性を含み、測定されたAT180 IR面積割合が同程度であった。海馬では、事後の比較は有意な水準には達しなかった。
MSDで測定した脳のタウ病理には、有意な変化を示さなかったが、脳切片の免疫染色は、神経細胞体でAT180(pT231/pS235)免疫染色の最大60%の減少を伴う用量依存性を示した。
12週間の研究期間中毎週1又は3mg/kgで投与されたACI−36−3A8−Ab1の13回の腹腔内注射は、いかなる著しい悪影響をも示さなかった。
MWM試験の結果は、3mg/kgのACI−36−3A8−Ab1で処置されたマウスに関して空間学習が改善される有意な効果を実証した(図10)。
8.3.2.1 皮質ホモジネートの可溶性画分におけるTAU
全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は、群A(Tgビヒクル群;PBS)及び群D(Tg、ACI−36−3A8−Ab1、1mg/kg)に由来するn=16匹の動物、及び群E(Tg、ACI−36−3A8−Ab1、3mg/kg)に由来するn=15匹の動物の皮質ホモジネートの可溶性画分で評価された。ACI−36−3A8−Ab1による処置は可溶性皮質ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。しかし、ACI−36−3A8−Ab1の処置の際、全TAU、p231TAU,及びp396TAUの平均に(有意性は無いが)わずかな増加が観察された。全TAUに対するp231TAUの比率として評価される231でのTAUリン酸化は、3mg/kgのACI−36−3A8−AB1による処置後にわずかに減少した。
全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は、群A(Tgビヒクル群;PBS)及び群D(Tg、ACI−36−3A8−Ab1、1mg/kg)に由来するn=16匹の動物、及び群E(Tg、ACI−36−3A8−Ab1、3mg/kg)に由来するn=15匹の動物の皮質ホモジネートのサルコシル不溶性画分で評価された。ACI−36−3A8−AB1による処置はサルコシル不溶性皮質ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。1mg/ACI−36−3A8−Ab1の処置の際、全TAU、p231TAU,及びp396TAUの平均に(有意性は無いが)わずかな減少が観察された。更に、1mg/kgのACI−36−3A8−Ab1で処置された動物の全TAUに対するp231TAUは、ヒヒクルで処置された動物に比べて、2つの群の全TAUに対するp231TAUの平均を変化させることなく、わずかに低いばらつきを(Fテスト:p=0.184において有意性を欠いてはいるが)示した。1mg/kg及び3mg/kgでのACI−36−3A8−Ab1処置群において、p396TAUリン酸化のわずかな増加が観察された。
全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は、群A(Tgビヒクル群;PBS)及び群D(Tg、ACI−36−3A8−Ab1、1mg/kg)に由来するn=16匹の動物、及び群E(Tg、ACI−36−3A8−Ab1、3mg/kg)に由来するn=15匹の動物の海馬ホモジネートの可溶性画分で評価された。IRN6301(群D)の可溶性海馬画分におけるTAU及びpTAUのレベルは異常値であり除外された。ACI−36−3A8−Ab1による処置は可溶性海馬ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。ACI−36−3A8−Ab1の処置の際、全TAUに対するpTAUの比率として評価される、231でのTAUのリン酸化のわずかな増加が(有意性は無いが)観察された。
全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は群A(Tgビヒクル群;PBS)、群B(Tg、ACI−36−3A8−Ab1、1mg/kg),及び群C(Tg、ACI−36−3A8−Ab1、3mg/kg)に由来するn=16匹の動物の海馬ホモジネートのサルコシル不溶性画分で評価された。ACI−36−3A8−Ab1による処置はサルコシル不溶性海馬ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。ACI−36−3A8−Ab1の処置の際、全TAU、p231TAU、並びにp396TAUの平均に(有意性は無いが)わずかな増加が観察された。全TAUに対するp231TAUの比率として評価されるTAUのリン酸化は影響されず、1mg/kgのACI−36−3A8−Ab1による処置は、全TAUに対するp396TAUの比率をわずかに減少させた。
1又は3mg/kgのACI−36−3A8−Ab1で処置されたマウスの可溶性大脳皮質において、pS396/pS404 pTauエピトープの有意な減少(図5D)。ヒト/トランスジェニックpT181 pTauエピトープの存在は、可溶性皮質画分で減少し、1mg/kgで処置されたマウスで有意な作用と3mg/kgで処置されたマウスで傾向を示した。減少傾向は内因性pT181 pTauの量で観察された(図5F)。
3ヶ月間ACI−36−3A8−Ab1で処置したbiGTマウスは、大脳皮質可溶性画分で総タウを有意に減少させた(図6Aおよび6B)。pTauエピトープのpT231/AT180(図6C及び6D)、pS202/AT8(図6E)、及びpS396(図6F及び6G)で有意な減少が観察された。有意な減少もまたpTauエピトープpS400(図6H及び6I)及びpS404(図6L及び6M)の両方の総ホモジネート(TH)の両方で観察された。更に、pTauエピトープpS400の可溶性画分で有意な減少も観察され(図6J及び6K)、pTauエピトープpS404について減少傾向がみられた(図6N及び6O)。
8.3.3.1 形態計測−領域面積の決定
実施例8.2.3.1を参照。
AT180抗体は内因性及びヒトpTAU(Thr231及びSer235で2重リン酸化)を検出する。nTgコントロールにおける細胞体内のpTAUの量は、Tg群と比較して有意に低かった(p<0.001)。扁桃体では、ACI−36−3A8−Ab1[1mg/kg(群D)及び3mg/kg(群E)]の両方の用量が、ビヒクル処置動物に比べて細胞体pTAUを有意に減少させた(図8、左)。類似の効果が海馬で観察可能であり、低用量のACI−36−3A8−Ab1はpTAUを減少させたが、しかしこの場合、高用量では有効性は少なく、減少傾向へと導くのみであった。この減少はまた、染色の領域の減少及び個々の神経細胞の細胞体における染色強度の減少として定性的に可視的であった。ニューロンの細胞体で測定されたAT180 IR強度の規格化された合計の結果は、扁桃体において、AT180 IR面積の割合に匹敵したが、高用量においてのみ有意性に到達した。海馬では結果は、IR面積百分率に全く同等であった。
MSDで測定した脳のタウ病理には、有意な変化を示さなかったが、脳切片の免疫染色は、神経細胞体でAT180(pT231/pS235)免疫染色の最大40%の減少を伴う用量依存性を示した。
以下のハイブリドーマ細胞株がブダペスト条約の規定により、ブラウンシュワイクの微生物及び細胞培養のドイツコレクション有限責任会社(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig)、Inhoffenstrasse 7 B、38124 Braunschweigとともにエーシーイミューン(AC Immune) SA、PSE-EPFL Building B、1015 Lausanne、Switzerland 及びルーヴェン・カトリック大学(Katholieke Universiteit Leuven)、Minderbroedersstraat 8a - Box 5105、B-3000 Leuvenの名目で寄託された:
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米国特許第5268164号
米国特許第5506206号
米国特許第5686416号
米国特許第5004697号
Claims (9)
- 哺乳動物のタウタンパク質のリン酸化エピトープに特異的に結合し、可溶性及び不溶性タウタンパク質に結合する抗体又はその機能性部分であって、
リン酸化エピトープは配列番号67に示されるヒトタウタンパク質における位置409にリン酸化セリン(pS409)を有するアミノ酸405−411又は405−412であり、
前記抗体又はその機能性部分は、
a)配列番号21に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号22に示されるアミノ酸配列を持つCDR2及び配列番号23に示されるアミノ酸配列を持つCDR3を順に含む軽鎖可変領域、及び配列番号12に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号13に示されるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号14に示されるアミノ酸配列を持つCDR3を順に含む重鎖可変領域;又は
b)配列番号27に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号25に示されるアミノ酸配列を持つCDR2及び配列番号26に示されるアミノ酸配列を持つCDR3を順に含む軽鎖可変領域、及び配列番号12に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号13に示されるアミノ酸配列を持つCDR2及び配列番号14に示されるアミノ酸配列を持つCDR3を順に含む重鎖可変領域;又は
c)配列番号24に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号25に示されるアミノ酸配列を持つCDR2及び配列番号26に示されるアミノ酸配列を持つCDR3を順に含む軽鎖可変領域、及び配列番号12に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号13に示されるアミノ酸配列を持つCDR2及び配列番号14に示されるアミノ酸配列を持つCDR3を順に含む重鎖可変領域;又は
d)配列番号27に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号25に示されるアミノ酸配列を持つCDR2及び配列番号26に示されるアミノ酸配列を持つCDR3を順に含む軽鎖可変領域、及び配列番号12に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号13に示されるアミノ酸配列を持つCDR2及び配列番号14に示されるアミノ酸配列を持つCDR3を順に含む重鎖可変領域;又は
e)配列番号28に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号25に示されるアミノ酸配列を持つCDR2及び配列番号26に示されるアミノ酸配を持つCDR3を順に含む軽鎖可変領域、及び配列番号12に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号13に示されるアミノ酸配列を持つCDR2及び配列番号14に示されるアミノ酸配列を持つCDR3を順に含む重鎖可変領域;又は
f)配列番号6、7、8又は9に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号1、2又は3に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;又は
g)配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;又は
h)配列番号7に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;又は
i)配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;又は
j)配列番号9に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号3に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
を含む、抗体又はその機能性部分。 - 哺乳動物タウがヒトタウである、請求項1に記載の抗体又はその機能性部分。
- 抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、請求項1又は2に記載の抗体又はその機能性部分。
- 抗体が、IgG2b又はIgG3アイソタイプのものである、請求項1から3の何れか一項に記載の抗体又はその機能性部分。
- 請求項1から4の何れか一項に記載の抗体又はその機能性部分を産生する細胞株。
- 2010年8月25日にDSM ACC3086として寄託されたハイブリドーマ細胞株3A8A12G7;2010年8月25日にDSM ACC3084として寄託されたハイブリドーマ細胞株2B6A10C11;2010年8月25日にDSM ACC3085として寄託されたハイブリドーマ細胞株3A8E12H8;2010年8月25日にDSM ACC3087として寄託されたハイブリドーマ細胞株2B6G7A12;2010年8月25日にDSM ACC3080として寄託されたハイブリドーマ細胞株6H1A11C11;及び2010年8月25日にDSM ACC3088として寄託されたハイブリドーマ細胞株6H1G6E6から選択されるハイブリドーマである、請求項5に記載の細胞株。
- 請求項1から4の何れか一項に記載の抗体又は機能性部分をコードするポリヌクレオチド。
- 患者のタウタンパク質に関連した疾患、障害又は状態の診断又はそれらの素因の診断に用いるための、請求項1から4の何れか一項に記載の抗体又はその機能性部分を含むキットであって、
診断は、インサイツで、抗体又はその機能性部分の、タウタンパク質のエピトープへの免疫特異的結合を検出することを含み、
a)タウタンパク質を含有すると疑われる特定の体の部分又は体の領域を、請求項1から4の何れか一項に記載の抗体又はその機能性部分と接触させ、;
b)抗体又はその機能性部分をタウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成し;
c)免疫複合体の形成を検出し;そして
d)特定の体の部分又は領域において、免疫複合体の存在又は欠損をタウタンパク質の存在又は欠損と相関させる工程を含み、
ここで、タウタンパク質に関連した疾患、障害又は状態の素因の診断は、さらに
e)前記免疫複合体の量を正常コントロール値と比較する工程を含み、
正常コントロール値と比較した免疫複合体の量の増加が、前記患者がタウタンパク質関連疾患又は状態に罹患しているか又は発症するリスクがあることを示す、キット。 - サンプル中で抗体又はその機能性部分のタウタンパク質のエピトープへの免疫特異的結合を検出することを含む、患者のタウタンパク質に関連した疾患、障害又は状態の診断を補助する方法であって、
a)タウタンパク質を含有すると疑われるサンプルを、請求項1から4の何れか一項に記載の抗体又はその機能性部分と接触させ、;
b)抗体又はその機能性部分をタウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成し;
c)免疫複合体の形成を検出し;そして
d)サンプル中の免疫複合体の存在又は欠損をタウタンパク質の存在又は欠損と相関させることを含み、
ここで、タウタンパク質に関連した疾患、障害又は状態の診断の補助は、さらに
e)前記免疫複合体の量を正常コントロール値と比較することを含み、
正常コントロール値と比較した免疫複合体量の増加が、前記患者がタウタンパク質関連疾患又は状態に罹患しているか又は発症するリスクがあることを示す方法。
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