KR20120004994A - 치료적 이용 방법 - Google Patents

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안드레아 파이퍼
안드레아스 무스
마리아 필그렌
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에이씨 이뮨 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 T-헬퍼 비의존성 항체 반응이 도움이 되는 질병 및 질환들을 치료하는데 있어서 치료적으로 사용하는 방법에 관한 것으로서, 특히 본 발명은 면역타협 또는 자가면역 질환 동물 또는 인간들에서 상기 질병들 및 질환들이 치료되는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 염증반응이 특별히 회피될 필요가 있는 면역타협 또는 자가면역 질환 동물 또는 인간들에서 알쯔하이머 병을 치료하는 것에 관한 것이다.

Description

치료적 이용 방법{METHOD FOR THERAPEUTIC USE}
본 발명은 환자의 질병 또는 질환, 특히 알쯔하이머 질환을 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질 또는 타우 또는 타우-유사 단백질과 관련되거나 또는 이들에 의해 발병하는 질환 또는 질병의 치료시에 개체, 특히 동물 또는 인간에서의 T-세포 비의존성 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 아밀로이드증, 즉 알쯔하이머 질환과 같은 아밀로이드 단백질과 관련된 일군의 질환 및 이상을 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질과 관련되거나 또는 이들에 의해 발병하는 질환 및 질병의 치료에서의 치료적 및 임상적 이용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신경원 섬유 다발(neurofibrillary tangles)과 관련되거나 또는 이에 의해 발병하는 질환 및 질병의 치료에서의 치료적 및 임상적 이용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 알쯔하이머 질환(AD)을 포함하는 타우파시(tauopathies)의 치료에서의 치료적 및 임상적 이용을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
항원은 고전적으로 T-의존성 및 T-비의존성 항원으로 나뉜다(Alugupulli 2008). 단백질 및 펩티드는 동족 및 비동족 상호작용을 제공함으로써 B 세포를 돕는 항원-특이적 T 세포를 유도하므로 T-의존성 항원이다. 많은 백신은 T-의존성 항원이다. 일반적으로 T-의존성 항원은 항체 반응을 발생시키기 위해 다수의 부스터가 필요하다.
T 세포의 도움없이 항체 반응을 유도하는 항원은 T-비의존성 항원이라고 한다(Bachmann 및 Zinkernagel 1997). 이러한 항원은 생체내, 예를 들면 무흉선 누드(nu/nu) 마우스에서 T 헬퍼 세포의 부재시에 항체 반응을 유도한다. T-비의존성 항원은 통상적으로 이들이 MHC-II 분자에 의해 진행되고 존재하지 않을 수 있으므로 T 세포 반응을 자극하지 않을 수 있는 항원이다. LPS 및 세균성 다당류는 통상적인 T 세포-비의존성 항원이다. 또한, 특정 바이러스 및 박테리아의 몇몇 단백질은 아마도 BCR을 효과적으로 가교결합할 수 있는 이들의 반복적 구조 때문에 T 세포의 부재시에 항체 반응을 자극할 수 있다. B 세포 팽창 및 강한 항체 역가는 T-의존성 항원보다 T-비의존성 항원으로 보다 더 신속하게 유도된다.
일반적으로 B-세포는 간단하게 B-세포 표면 Ig를 가교-결합시킴으로써 면역글로불린(Ig)을 증식 및 제조하기 위해 완전하게 활성화되지 않는다. 최적의 항체 제조를 획득하기 위해서 제2 신호가 필요하며, 즉 T 헬퍼 세포에 의해서 제공된다. 항원은 항원 특이적 T 헬퍼 세포에 MHC 클래스 II 분자에 관해서 내면화된 이후 존재하는 B-세포 표면 상의 Ig와 결합한다. 또한 B-세포는 CD40뿐만 아니라 B7(CD86)도 발현시키며, 이들은 T-세포 상에서 각각 CD40 리간드(CD40L) 및 CD28과 상호작용하여 B-세포 반응을 추가로 조정하는 T-세포에 의해서 사이토카인 분비를 유도한다. 이러한 사이토카인은 B-세포 증식 및 항체-생성 세포(플라즈마 세포)로의 분화를 촉발시킨다. IgG, IgA 또는 IgE로 전환되는 동종형은 클래스 전환 재조합(CSR)으로 알려져 있다. 이러한 전환이 발생하면, 특정 B-세포가 더 이상 다른 동종형, 즉 IgM 또는 IgD를 만들 수 없다.
압도적으로 대부분의 항원은 B-세포 활성을 위한 T-세포 도움이 필요하고, 이에 따라서 T-세포 도움 의존성 항원(TD 항원)이라고 하는 반면에, 소수의 항원은 Tl 항원이라고 하는 T 도움에 비의존하는 항체를 유도할 수 있다(Mond JJ, Vos Q, Lees A, Snapper CM. T-cell independent antigens. Curr Opin Immunol 1995; 7:349-54). 선천적 무흉선 (nu/nu) 마우스 및 X 결합 면역 B-세포 결핍 마우스[xid 마우스로 부르톤 티로신 키나제(Btk)의 기능이 결핍됨]에서 이들의 면역원성을 기초로 Tl 항원은 고전적으로 Tl 타입 1 항원(Tl-1) 및 Tl 타입 2(Tl-2) 항원으로 추가적으로 세분화된다. Tl-1 항원은 nu/nu 마우스 및 xid-마우스에서 탁월한 항체 반응을 자극한다. Tl-2 항원은 또한 nu/nu 마우스에서 탁월한 항체 반응을 자극하지만 xid-마우스에서는 그렇지 않다. Tl-1 항원은 통상적으로 리포다당류(LPS)인 다클론성 B-세포 활성체를 함유한다. 대조적으로 Tl-2 항원은 통상적으로 반복적 생화학 구조, 예컨대 박테리아의 피막 다당질 또는 폴리머 단백질 항원으로 구성되는 항원이다. 대부분의 펩티드 또는 단백질 백신은 B 및 T 세포 둘 다가 활성화되며, 항체 반응이 T-세포 의존적인 원리를 기본으로 한다. 상기는 연령, 면역억제 또는 질환 때문에 T-세포 결핍으로 고통받는 환자에게 문제를 야기시킬 수 있다.
노화 면역 시스템에서 확연한 변화는 흉선 퇴화의 직접적인 결과인 T-세포 수 및 특성에서 일어난다. 흉선, 즉 심장 바로 위의 상부 앞쪽 흉곽에 있는 중추성 림프양 기관은 흉선세포 형성과정이라고 하는 과정에서 성숙한 미접촉 T 세포의 주변부로의 발달, 분비 및 생산량에 대한 책임이 있다. 진행형 노화로 흉선이 퇴화된다. 결과적으로 미접촉 T 세포의 생산량은 연령에 의해서 극적으로 감소한다. 항원의 평생 노출과 함께 감소된 흉선 생산량으로 노인의 미접촉 T-세포 풀이 수축되고, 결과적으로 새로운 항원에 대해 반응하는 숙주의 능력이 제한된다. 상기는 노인들이 새롭게 생성된 질환, 예컨대 50세 이상의 감염 환자 중 50 %가 사망한 심각한 급성 호흡기 증후군(SARS)에 접촉되는 경우에 특히 불안하다. 또한 노인에서 발견되는 미접촉 T-세포는 주변부에 수십 년간 존재하며, 일련의 인자들, 예컨대 산화적 스트레스, 및 세포 기능에 네거티브한 충격을 줄 수 있는 생존 인자의 제한된 농도에 노출된다. 어린 마우스의 세포와 비교해서 노화된 동물의 미접촉 CD4+ T 세포는 덜 활성화된 표현형 및 사이토카인 제조에 대한 감소된 능력으로 현저하게 적은 IL-2를 생성하며, 팽창이 불량하고, 소수의 반응기를 생성한다. 그러나 생체내 및 생체외에서 항원과 강하게 반응하는 노령 동물에서 새롭게 생성된 CD4+ T 세포는 팽창하고, IL-2를 생성하며, 동족 헬퍼 기능을 나타낼 수 있다. 따라서 항원성 자극에 반응하는 노화-관련 장애는 적어도 일부분은 CD4+ T 세포의 역연령(chronological age) 때문일 수 있다.
기억 CD4+ T 세포는 체액 및 세포 반응을 제어하는 중심이 되며, 따라서 백신접종에 대한 이들의 지속성 및 반응은 방어적 면역성의 유지를 위해 매우 중요하다. 노령의 미접촉 T 세포로부터 생성되는 기억 T 세포는 생체내에서 잘 생존 및 유지되지만 이들은 회상 반응 중 이들의 증식 및 사이토카인 분비에 현저하게 결함이 있지만 젊은 개개로부터 발생되는 기억 세포는 이들의 숙주 연령과 같은 연장된 기간 동안 기능을 보유한다. 동물 연구로부터의 이러한 결과는 최근에 인간에게서 확인되었다. 건강한 노인 개개는 인플루엔자에 대한 백신접속 시에 젊은 개개에서 관찰되는 것과 비교가능하게 CD4+ T-세포 반응을 증가시킬 수 있지만 이들은 인플루엔자 백신에 대한 손상된 장기 CD4+ T-세포 면역 반응을 나타낸다.
그러나 T-세포 결함은 노령화의 결과로서 발생할 뿐만 아니라 또한 면역억제 환자 또는 특정 질환, 예컨대 HIV, 암 또는 다른 악성 종양으로 고통받는 환자에서도 발견될 수도 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 항원성 조성물은 백신이 T-세포 비의존적인, MPLA와 결합된 리포좀 상에 존재하는 팔미토일화 펩티드(palmitoylated peptide)을 포함하는 것으로서 생성된다. 상기 펩티드는 베타-시트 입체형태(beta-sheet conformation)이다. 상기 백신은 신속하고 강한 항체 반응을 유도한다. 이것은 또 다른 캐리어 단백질 상에 의존적이지 않으며, 누드 마우스에서 항체 유도에 의해 설명되는 것과 같이 T 세포의 부재시에 항체 반응을 유도할 수 있다. 마지막으로 이것은 이러한 노령의 연령에서의 T 세포 결핍에도 불구하고 노령 마우스에서 강하고 효과적인 항체 반응을 유도한다(Miller R, A. et all, 1996; Adolfsson O, et all, 2001; Linton P.J., et all 1996). 상기 백신의 특성들의 요약은 하기와 같다:
Figure pct00001
특이적 형태(베타-시트)
Figure pct00002
강한 반응(예방접종 후 7일에 1000000 ng/ml)
Figure pct00003
급속하게 빠른 반응(첫번째 예방접종 후 7일)
Figure pct00004
T 세포 도움이 필요 없음
Figure pct00005
캐리어 단백질이 필요 없음
Figure pct00006
노령에서 T 세포 결핍에도 불구하고 노령 마우스에서의 유효성
당업계에 공지되어 있는 Aβ 항원성 조성물, 예컨대 Elan Inc 사(CA; USA)에서 시판되는 AN1792는 일반적으로 강한 Th1 운동 보강제(QS21)와 함께 투여되는 통상적인 T-의존성 항원(Aβ1-42)이다. 알쯔하이머 질환 환자에서 AN1792의 초기 연구에서는 플라시보-치료 환자에서보다 백신접종을 수용한 환자에서 인지적 감소 속도가 더 느린 것과 함께 바람직한 효험이 나타났다(Gilman et al. 2005). 그러나, 치료 환자 중 6 %에서는 완전한 길이의 Aβ1-42에 대한 T-세포-매개 반응 때문에 생길 수 있다고 생각되는 반응인 수막뇌염이 발병한다(Orgogozo et al. 2003). 대부분의 환자에게서 원상태로 되돌릴 수 있지만 이러한 염증성 반응으로 임상 시험이 중단된다.
따라서 필요한 것은 항원, 예컨대 예를 들면 항-Aβ 항원 또는 항-타우 항원의 사용으로 질환 및 질병, 예컨대 아밀로이드증, 즉 알쯔하이머 질환과 같은 아밀로이드 단백질과 관련된 일군의 질환 및 장애를 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질과 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 질환 및 질병, 또는 T-세포 결핍 환자, 특히 CD4 T-세포가 결핍된 환자에서 타우파시를 포함하는 단백질 타우와 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 질환 및 질병의 치료, 증상의 경감, 시작의 지연 또는 예방을 위한 항원-특이적, 즉 Aβ-특이적 또는 타우-특이적 T 세포의 부재시에 B-세포의 직접적인 활성화를 통해 항체 반응을 유도하는 방법이다. 특히 MPLA와 결합하여 리포좀에 의해 나타나는 팔미토일화 Aβ 펩티드 또는 타우 펩티드는 T 세포 도움을 제공하는 캐리어 단백질을 필요로 하지 않고 T 세포 도움을 필요로 하지 않는 Aβ 특이적 항체를 유도한다.
본 발명은 변형된 항원을 포함하는 T-세포 비의존성 항원성 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 질환 및 질병의 치료, 증상의 완화 또는 예방에서의 치료적 및 임상적 사용 방법을 제공하며, 상기 항원은 리포좀의 표면 상에 높은 반복 배열로 존재한다. 특히, 상기 질환 및 질병은 환자, 특히 면역 관용 환자, 특히 T-세포 결핍, 특히 CD4 T-세포의 상기 환자내의 감소 및/또는 CD4 T-세포 상의 CD14 및/또는 CD40L의 감소된 발현으로 유발되는 T-세포 결핍으로 고통받는 환자, 예를 들면 면역타협 환자 또는 자가면역 질환을 갖는 환자에서 아밀로이드증, 즉 알쯔하이머 질환과 같은 아밀로이드 단백질과 관련된 일군의 질병 및 장애를 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질과 관련되거나 또는 이로 인해 유발되며, 또는 타우파시를 포함하는 단백질 타우와 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 질환 및 질병이다.
또한 현재 T-세포 비의존성 면역 반응이 필요한 환자, 특히 면역 관용 환자, 특히 T-세포 면역결핍 질환으로 고통받는 환자에서의 질환은 개체, 특히 동물 또는 인간에서는 피할 수 있으며, 상기 개체는 질병, 예컨대 예를 들면 아밀로이드-관련 또는 타우 단백질-관련 질병의 시작 전에 백신접종을 하거나, 또는 아밀로이드-관련 또는 타우 단백질-관련 질병 또는 질환으로부터 고통받는 경우에 상기 개체를 여기서 기재하는 방법으로 치료할 수 있다는 것을 본 발명의 범주 내에서 놀랍게도 확인하였다.
본 발명에서 근원적인 기술적 문제는 환자, 특히 T-세포 비의존성 면역 반응을 필요로 하는 환자, 예컨대 예를 들면 면연 관용 환자 또는 T-세포 활성화 환자에서 질환 및 질병의 치료, 증상의 경감 또는 예방에서의 항원성 조성물의 치료적 및 진단적 이용 방법의 공급이며, T-세포 비의존성 면역 반응은 치료한 개체에서 유도된다. 특히, 본 발명의 범주 내에서 치료되는 질환 및 질병은 예를 들면 아밀로이드증, 즉 알쯔하이머 질환과 같은 아밀로이드 단백질과 관련된 일군의 질병 및 장애를 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질과 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 질환 및 질병, 또는 타우파시를 포함하는 단백질 타우와 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 질환 및 질병이다.
이러한 기술적 문제는 청구항에서 나타내는 실시양태의 제공으로 해결된다.
따라서 본 발명은 환자, 특히 동물 또는 인간 환자, 특히 상기 T-세포 비의존성 반응을 필요로 하는 환자, 예를 들면 면역 관용 환자 또는 T-세포 활성화 환자에서의 질병, 병태 또는 질환의 치료 시에 T-세포 비의존성 면역 반응을 유도하기 위한 변형된 항원을 포함하는 항원성 조성물에 대한 제1 실시양태에 관한 것으로서, 상기 항원은 리포좀의 표면 상에 존재한다.
하나의 실시양태에서, 여기서 기재한 것과 같은 본 발명의 항원성 조성물은 면역 자극제로서 효과적이다.
본 발명의 특이적 실시양태에서, 상기 항원은 리포좀의 표면 상에 높은 반복 배열로 존재하는 펩티드 항원이다.
추가의 특이적 실시양태에서, 상기 항원은 T-세포 에피토프를 함유하지 않는다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 여기서 기재하는 것과 같은 본 발명의 항원성 조성물은 면역 관용 환자 또는 T-세포 활성화 환자, 특히 면역타협 환자, 특히 자가면역 질환으로 고통받는 환자, 특히 T-세포 결핍, 특히 CD4 T-세포의 상기 환자 내의 결핍 및/또는 CD4 T-세포 상에서 CD14 및/또는 CD40L의 감소된 발현으로 야기되는 T-세포 결핍으로 고통받는 환자를 치료하기 위해 사용하는 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 여기서 기재하는 것과 같은 본 발명의 항원성 조성물에 관한 것이며, 상기 T-세포 결핍은 연령, 면역억제 또는 질환, 특히 예를 들면 하기를 포함하는 HIV, 암 또는 다른 악성 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환에 의해 야기된다: 각각 환자의 면역억제 상태를 유도하는 면역억제성 및 화학요법 화합물로 치료되는 염증성 질환, 예컨대 예를 들면 류마티스성 관절염; 건선, 전신 홍반성 루푸스, 베게너 육아종증, 등.
하나의 실시양태에서, 여기서 기재한 것과 같은 본 발명의 항원성 조성물은 입체형태 항원(conformational antigen)을 포함하며, 상기 항원의 전부 또는 일부는 베타-시트 입체형태이다. 특이적 실시양태에서, 상기 항원성 펩티드는 항원의 규정된 형태, 특히 랜덤 코일, α-헬리칼 및 β-시트 부분의 균형된 비율로 특징화되는 형태를 유지 및 안정화시킬 수 있도록 변형된다. 이러한 규정된 형태로 강하고 매우 특이적인 면역 반응, 특히 T-세포 비의존성 면역 반응이 동물 또는 인간으로의 도입시에 유도된다.
특히, 여기서 규정하는 것과 같은 본 발명의 항원성 조성물은 입체형태 항원을 포함할 수 있으며, 30 % 이상, 특히 40 % 이상, 특히 50 % 이상, 특히 60 % 이상, 특히 70 % 이상, 특히 80 % 이상, 특히 90 % 이상, 특히 95 % 이상 및 최대 100 %가 베타-시트 입체형태이다.
하나의 실시양태에서, 여기서 규정하는 것과 같은 본 발명의 항원성 조성물은 친유성 또는 소수성 부분, 특히 지방산, 트리글리세라이드, 디글리세라이드, 스테로이드, 스핑고리피드, 글리코리피드 또는 포스포리피드(리포좀의 지질 이중층으로의 삽입을 용이하게 함)에 의해 변형되는 펩티드 항원을 포함한다.
특이적 실시양태에서, 친유성 또는 소수성 부분은 지방산, 특히 10 이상의 탄소 원자의 탄소 백본을 갖는 지방산, 특히 팔미트산이다.
본 발명의 또 다른 특이적 실시양태에서, 여기서 규정한 것과 같은 본 발명의 항원성 조성물은 2개의 팔미트산 성분, 특히 4개의 팔미트산 성분을 포함하는 펩티드 항원을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특이적 실시양태에서, 포함되거나 또는 재구성되는, 펩티드가 부착되는 캐리어/애주벤트 및 항원성 펩티드의 전체 순전하와 결합하는 친유성 또는 소수성 부분의 규모는 항원성 펩티드가 강한 면역 반응을 유도하는 이의 노출, 안정화 및 매우 높은 생물학적 활성 형태로 항원성 구성체에 포함되는 항원성 결정인자와 목표 조직의 면역계가 자유롭게 상호작용하도록 하는 매우 높은 생물학적 활성 형태로 노출, 안정화 및 존재하도록 한다.
하나의 실시양태에서, 여기서 규정하는 것과 같은 본 발명의 항원성 조성물은 리포좀의 제제, 및 애주벤트, 특히 지질 A, 특히 해독된 지질 A, 예컨대 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A 또는 알룸을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 여기서 규정하는 것과 같은 본 발명의 항원성 조성물은 항원성 구성체, 특히 Aβ 펩티드의 N-말단으로부터 유도된 단일 또는 반복성 Aβ 펩티드 단편을 포함하는, Aβ 항원성 구성체를 포함한다.
본 발명의 특이적 실시양태에서, Aβ 펩티드의 N-말단은 하기를 포함한다:
a) Aβ 1-30;
b) Aβ 1-20; 또는
c) Aβ 1-16.
본 발명의 또 다른 특이적 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 하기를 포함한다:
a) 4 내지 20 아미노산;
b) 5 내지 16 아미노산;
c) 6 내지 12 아미노산; 또는
d) 4 내지 8 아미노산.
본 발명의 또 다른 특이적 실시양태에서, Aβ 펩티드 단편은 하기이다:
a) Aβ1-15;
b) Aβ1-16;
c) Aβ1-5.
하나의 실시양태에서, 여기서 규정하는 것과 같은 본 발명의 항원성 조성물은 단백질 타우, 특히 인간 단백질 타우의 주요한 병리학적 포스포-에피토프를 모사하는 포스포-펩티드인 항원성 펩티드를 포함하는 항원성 구성체를 포함한다.
본 발명의 특이적 실시양태에서, 상기 타우 단백질은 하기에 대한 아미노산 서열 유사성(identity)을 갖는다:
a) 실질적으로 서열번호 2의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 2의 아미노산 잔기 18(P-Tyr18)에 상응하는 아미노산 잔기가 인산화되어 있는(T1) 95 % 이상의 서열 번호 2;
b) 실질적으로 서열번호 3의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 3의 아미노산 잔기 212(P-Thr212) 및 214(P-Ser214)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상, 특히 2 이상이 인산화되어 있는 95 % 이상의 서열번호 3;
c) 실질적으로 서열번호 4의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 4의 아미노산 잔기 202(P-Ser202) 및 205(P-Thr205)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상, 특히 2 이상이 인산화되어 있는 95 % 이상의 서열번호 4;
d) 실질적으로 서열번호 5의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 5의 아미노산 잔기 396(P-Ser396) 및 404(P-Ser404)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상이지만, 보다 특히 모든 아미노산 잔기가 인산화되어 있는 95 % 이상의 서열번호 5;
e) 실질적으로 서열번호 6의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 6의 아미노산 잔기 404(P-Ser404) 및 409(P-Ser409)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상이지만, 보다 특히 모든 아미노산 잔기가 인산화되어 있는 95 % 이상의 서열번호 6;
f) 실질적으로 서열번호 7의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 7의 아미노산 잔기 202(P-Ser202), 205(P-Thr205), 212(P-Thr212), 및 214(P-Ser214)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상, 특히 2 이상, 특히 3 이상이지만, 보다 특히 모든 아미노산 잔기가 인산화되어 있는 95 %이상의 서열번호 7.
또 다른 특이적 실시양태에서, 여기서 규정하는 것과 같은 본 발명의 항원성 조성물은 하기와 같은 아미노산 서열을 갖는 타우 단백질을 포함한다:
a) 서열번호 2;
b) 서열번호 3;
c) 서열번호 4;
d) 서열번호 5;
e) 서열번호 6; 또는
f) 서열번호 7.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하기 환자에서의 면역 관용을 극복하거나 또는 감소시키기 위해서, 환자, 특히 동물 또는 인간 환자, 특히 T-세포 비의존성 반응을 필요로 하는 환자, 예컨대 예를 들면 면역 관용 환자 또는 T-세포 활성화 환자, 특히 면역타협 환자, 특히 자가면역 질환으로 고통받는 환자, 특히 T-세포 결핍, 특히 CD4 T-세포 상에서 CD14 및/또는 CD40L의 감소된 발현 및/또는 CD4 T-세포의 상기 환자내에서의 결핍에 의해서 유발되는 T-세포 결핍으로 고통받는 환자에서 질환, 병태 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 변형된 항원을 포함하는 이전에 기재한 실시양태의 임의의 항원성 조성물에 관한 것이며, 상기 항원은 리포좀의 표면 상에 높은 반복 배열로 존재하며, 상기 환자는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질과 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 질환 또는 질병으로 고통받는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하기 환자에서 면역 관용을 극복하거나 또는 감소시키기 위해서 환자, 특히 동물 또는 인간 환자, 특히 T-세포 비의존성 반응을 필요로 하는 환자, 예컨대 예를 들면 면역 관용 환자 또는 T-세포 활성화 환자, 특히 면역타협 환자, 특히 자가면역 질환으로 고통받는 환자, 특히 T-세포 결핍, 특히 CD4 T-세포 상에서 CD14 및/또는 CD40L의 감소된 발현 및/또는 CD4 T-세포의 상기 환자내에서의 결핍에 의해 야기되는 T-세포 결핍으로 고통받는 환자에서의 질환, 병태 또는 질병을 치료하는데 이용되는 변형된 항원을 포함하는 이전에 기재한 실시양태의 임의의 항원성 조성물에 관한 것이며, 상기 항원은 리포좀의 표면 상에 높은 반복 배열로 존재하며, 상기 환자는 타우 또는 타우-유사 단백질과 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 질환 또는 질병으로 고통받는다.
본 발명의 특이적 실시양태에서, 아밀로이드-관련 질환 또는 질병은 개체, 특히 동물 또는 인간에서의 인지적 기억 용량의 손실로 특징화된다.
본 발명의 또 다른 특이적 실시양태에서, 상기 질병은 신경학적 질환 또는 질병, 특히 아밀로이드증 그룹으로부터의 질환 또는 질병, 특히 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된 질환 또는 질병이다: 알쯔하이머 질환(AD), 경도인지장애(MCI), 루이소체성 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증을 갖는 유전성 뇌출혈(네덜란드 타입); 파킨슨-치매 복합증(Guam Parkinson-Dementia complex); 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥 병, 파킨슨 병, HIV-관련 치매, ALS(근위축성 측삭경화증), 성인 발병형 당뇨병; 노인성 심아밀로이드증; 내분비계 종양, 뇌졸증, 외상성 뇌손상, 황반변성 및 녹내장.
특이적 실시양태에서, 상기 질환은 알쯔하이머 질환이다.
본 발명의 또 다른 특이적 실시양태에서, 타우-관련 질환 또는 질병은 신경퇴행성 질병, 특히 신경섬유 병변의 형성과 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 신경퇴행성 질환 또는 질병이다.
본 발명의 특이적 실시양태에서, 신경퇴행성 질환 또는 질병은 타우파시, 특히 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 타우파시이다: 알쯔하이머 질환, 크로이츠펠트-야콥 병, 투사형 치매, 다운 증후군, 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커 병, 봉입체 근염 및 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 외상성 뇌손상, 근위축성 측삭경화증/괌 파킨슨-치매 복합증, 신경섬유원 농축을 갖는 비-괌마니안 운동 뉴런 질환(Non- Guamanian motor neuron disease), 은친화성 과립 치매, 피질기저퇴화, 석회화가 있는 미만성 신경섬유원 농축, 크로모좀 17과 결합된 파킨슨병을 갖는 전두측두엽성 치매, 할러보든-슈파쯔 증후군, 다계통위축, 니만-피크 병, 타입 C, 피크 병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상 마비, 아급성경화성범뇌염, 다발만의 치매(Tangle only dementia), 뇌염후 파킨슨증, 근이양증.
본 발명의 특이적 실시양태에서, 상기 신경퇴행성 질병은 알쯔하이머 질환이다.
본 발명의 하나의 측면에서, 이전에 기재된 실시양태의 임의의 항원성 조성물은 임의의 유해 염증성 효과를 나타내지 않는다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 환자, 특히 동물 또는 인간 환자, 특히 상기 T-세포 비의존성 반응을 필요로 하는 환자에서 질환, 병태 또는 질병의 치료시에 T-세포 비의존성 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조를 위해 이전에 기재한 실시양태 중 임의의 것에 따라 변형된 항원을 포함하는 항원성 조성물의 사용 방법에 관한 것으로서, 상기 항원은 특히 높은 반복 배열로 리포좀 표면 상에 존재한다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 상기 항원성 조성물은 면역 자극에 효과적이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 하기 환자에서 면역 관용을 극복하거나 또는 감소시키기 위해서 또는 하기 환자에서 T-세포 반응의 과자극을 피하기 위해서 면역 관용 환자 또는 T-세포 활성화 환자, 특히 동물 또는 인간, 특히 면역타협 환자, 특히 자가면역 질환으로 고통받는 환자, 특히 T-세포 결핍, 특히 CD4 T-세포 상에서 CD14 및/또는 CD40L의 감소된 발현 및/또는 CD4 T-세포의 상기 환자내의 결핍에 의해 유발되는 T-세포 결핍으로 고통받는 환자의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조를 위해 임의의 이전에 기재한 실시양태에 따라 변형된 항원을 포함하는 항원성 조성물을 사용하는 방법에 관한 것으로서, 상기 항원은 리포좀의 표면 상에서 높은 반복 배열로 존재한다.
본 발명에 포함되는 것은 또한 환자, 특히 동물 또는 인간 환자, 특히 상기 T-세포 비의존성 반응을 필요로 하는 환자에서의 질환, 병태 또는 질병의 치료 시에 T-세포 비의존성 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로서, 상기 항원은 특히 높은 반복 배열로 리포좀의 표면 상에 존재한다.
본 발명의 하나의 실시양태에서 상기 항원성 조성물은 면역 자극제로서 효과적이다.
또한 본 발명에 포함되는 것은 상기 환자, 특히 동물 또는 인간 환자, 특히 면역타협 환자, 특히 자가면역 질환으로 고통받는 환자, 특히 T-세포 결핍, 특히 CD4 T-세포 상에서 CD14 및/또는 CD40L의 감소된 발현 및/또는 CD4 T-세포의 상기 환자내의 결핍에 의해 유발되는 T-세포 결핍으로부터 고통받는 환자에서의 질환 또는 질병의 치료시에 T-세포 활성화 환자에서 T-세포 반응의 과자극을 피하기 위해 또는 면역 관용 환자에서 면역 관용을 극복하거나 또는 감소시키기 위한 방법이며, 상기 방법은 이전에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따라서 변형된 항원을 포함하는 항원성 조성물을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 항원은 리포좀의표면 상에 높은 반복 배열로 존재하고; 및 선택적으로 IgG 및/또는 IgM의 항체 농도를 측정함으로써 상기 개개에서 면역 반응을 측정하기 위한 추가 단계를 포함한다.
본 발명은 추가로 또 다른 실시양태에서 면역 관용 환자 또는 T-세포 활성화 환자, 특히 동물 또는 인간, T-세포, 특히 예를 들면 자가면역 질환을 갖는 환자 또는 면역타협 환자와 같은 CD4 T 세포의 결핍에 의해 유발되는 T-세포 결핍으로 고통받는 환자에서의 질환 또는 질병, 특히 아밀로이드-관련 또는 타우-단백질 관련 질병 또는 질환의 치료, 증상의 경감 또는 예방을 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 임의의 이전에 기재된 실시양태에 따른 변형된 항원을 포함하는 항원성 조성물을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 항원은 리포좀의 표면 상에 높은 반복 배열로 존재하고, T-세포 비의존성 면역 반응은 치료 환자에서 유도된다.
따라서 본 발명은 추가로 면역 관용 환자 또는 T-세포 활성화 환자에서 T-세포 비의존성 면역 반응을 유도하기 위한 방법에 관한 것이며, 특히 상기 면역 관용 환자 또는 T-세포 활성화 환자에서의 질병 또는 질환의 치료, 증상의 경감, 시작의 지연 또는 예방을 위한 방법에 관한 것이며, 이러한 질병 또는 질환은 개체, 특히 동물 또는 인간, 특히 T-세포, 특히 CD4 T-세포, 예컨대 예를 들면 면역타협 환자 또는 자가면역 질환을 갖는 환자에서 아밀로이드증, 즉 알쯔하이머 질환과 같은 아밀로이드 단백질과 관련된 일군의 질환 또는 장애를 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질과 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 질병 또는 질환, 또는 타우파시를 포함하는 단백질 타우와 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 질병 또는 질환이며, 상기 방법은 하기와 같은 단계를 포함한다: (a) 상기 개체에 항원성 구성체, 특히 T-비의존성 항원을 포함하는 항원성 구성체의 투여 단계; 및 (b) 특히 IgG의 항체 농도를 측정함으로써 상기 개체에서 면역 반응을 측정하는 단계.
본 발명의 특별한 실시양태에서, 상기 개체는 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍된 고령 인간 환자, 특히 면역타협 환자, 또는 자가면역 질환을 갖는 환자이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 개체는 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍된 면역타협 인간 환자이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 개체는 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍되고, 면역결핍 질환, 특히 HIV로부터 고통받는 인간 환자이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 개체는 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍되며, 암 또는 또 다른 악성종양을 갖는 인간 환자이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 개체는 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍되고, 자가면역 질환으로부터 고통받는 인간 환자이다.
본 발명은 추가로 또 다른 실시양태에서 개체, 특히 동물 또는 인간, 특히 상기 T-세포 비의존성 Aβ 면역 반응을 필요로 하는 개체, 특히 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍된 면역 관용 개체 또는 환자, 예컨대 예를 들면 면역타협 환자 또는 자가면역 반응을 갖는 환자에서 T-세포 비의존성 면역 반응, 특히 Aβ 면역 반응 또는 타우-관련 면역 반응을 유도하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 항원성 구성체, 특히 Aβ-관련 또는 타우-관련 항원성 구성체, 특히 T-비의존성 항원을 포함하는 Aβ-관련 또는 타우-관련 항원성 구성체를 상기 개체에 투여하는 단계; 및 (b) 특히 IgG의 항체 농도를 측정함으로써 상기 개체에서 면역 반응을 측정하는 단계.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 이전에 기재된 실시양태에 따른 방법에 관한 것이며, 상기 Aβ-관련 또는 타우-관련 항원은 생체내에서 T 헬퍼 세포의 부재시에 항체 반응을 유도한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 임의의 이전에 기재된 실시양태에 따른 방법이 제공되며, 상기 Aβ-관련 또는 타우-관련 면역 반응은 IgG 반응이다.
여기서 기재하는 하나의 실시양태에서, 임의의 이전에 기재된 실시양태에 따른 방법이 제공되며 면역 관용 개체 또는 환자 또는 T-세포 활성화 환자, 특히 동물 또는 인간, 특히 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍된 동물 또는 인간은 임의의 유해 염증성 효과를 나타내지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 임의의 이전에 기재된 실시양태에 따른 방법이 제공되며, 상기 면역 관용 개체 또는 환자, 특히 동물 또는 인간은 T-세포 결핍, 특히 CD4 T 세포 결핍, 예컨대 예를 들면 면역타협 환자 또는 자가면역 질환을 갖는 환자이다.
추가의 실시양태에서, 임의의 이전에 기재된 실시양태에 따른 방법이 제공되며, 상기 Aβ 항원성 구성체는 Aβ 펩티드의 N-말단으로부터 유도된 단일 또는 반복성 Aβ 펩티드 단편을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 임의의 이전에 기재된 실시양태에 따른 방법이 제공되며, Aβ 펩티드의 N-말단은 Aβ 1-30; Aβ 1-20; 또는 Aβ 1-16을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 임의의 이전에 기재된 실시양태에 따른 방법이 제공되며, Aβ 펩티드 단편은 4 내지 20 아미노산; 5 내지 16 아미노산; 6 내지 12 아미노산; 또는 4 내지 8 아미노산을 포함한다.
특히 본 발명은 또 다른 실시양태에서 이전의 실시양태에 따른 방법에 관한 것이며, 상기 Aβ 펩티드 단편은 Aβ1-15; Aβ1-16; 또는 Aβ1-5이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 임의의 이전에 기재된 실시양태에 따른 방법에 관한 것이며, 상기 항원성 조성물은 단백질 타우, 특히 인간 단백질 타우의 주요한 병리학적 포스포-에피토프를 모사하는 포스포-펩티드인 항원성 펩티드를 포함하는 항원성 구성체를 포함한다.
본 발명의 특이적 실시양태에서, 상기 타우 단백질은 하기에 대한 아미노산 서열 유사성을 갖는다:
a) 실질적으로 서열번호 2의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 2의 아미노산 잔기 18(P-Tyr18)에 상응하는 아미노산 잔기가 인산화되어 있는(T1) 95 % 이상의 서열 번호 2;
b) 실질적으로 서열번호 3의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 3의 아미노산 잔기 212(P-Thr212) 및 214(P-Ser214)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상, 특히 2 이상이 인산화되어 있는 95 % 이상의 서열번호 3;
c) 실질적으로 서열번호 4의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 4의 아미노산 잔기 202(P-Ser202) 및 205(P-Thr205)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상, 특히 2 이상이 인산화되어 있는 95 % 이상의 서열번호 4;
d) 실질적으로 서열번호 5의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 5의 아미노산 잔기 396(P-Ser396) 및 404(P-Ser404)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상이지만, 보다 특히 모든 아미노산 잔기가 인산화되어 있는 95 % 이상의 서열번호 5;
e) 실질적으로 서열번호 6의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 6의 아미노산 잔기 404(P-Ser404) 및 409(P-Ser409)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상이지만, 보다 특히 모든 아미노산 잔기가 인산화되어 있는 95 % 이상의 서열번호 6;
f) 실질적으로 서열번호 7의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 7의 아미노산 잔기 202(P-Ser202), 205(P-Thr205), 212(P-Thr212) 및 214(P-Ser214)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상, 특히 2 이상, 특히 3 이상이지만, 보다 특히 모든 아미노산 잔기가 인산화되어 있는 95 %이상의 서열번호 7.
또 다른 특이적 실시양태에서, 여기서 규정하는 것과 같은 본 발명의 항원성 조성물은 하기와 같은 아미노산 서열을 갖는 타우 단백질을 포함한다:
a) 서열번호 2;
b) 서열번호 3;
c) 서열번호 4;
d) 서열번호 5;
e) 서열번호 6; 또는
f) 서열번호 7.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 임의의 이전의 실시양태에 따른 방법에 관한 것이며, 상기 항원, 특히 Aβ- 또는 타우-펩티드 항원은 캐리어, 예컨대 예를 들면 소포, 미립체 또는 분자로 재구성되어 존재한다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 임의의 이전의 실시양태에 따른 방법에 관한 것이며, 상기 항원, 특히 Aβ- 또는 타우-펩티드 항원은 리포좀에서 재구성된 것으로 존재한다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 임의의 이전의 실시양태에 따른 방법에 관한 것이며, 상기 항원, 특히 Aβ- 또는 타우-펩티드 항원은 리포좀 캐리어/애주벤트의 지질 이중층으로의 삽입을 촉진시키는 친유성 또는 소수성 부분에 의해서 변형된다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 이전의 실시양태에 따른 방법에 관한 것으로서, 포함되거나 또는 재구성되어, 펩티드가 부착되는 캐리어/애주벤트 및 항원성 펩티드의 전체 순전하와 결합해서 친유성 또는 소수성 부분의 범위는 항원성 펩티드가 강한 면역 반응을 유도하는 이의 노출, 안정화 및 매우 높은 생물학적 활성 형태에서 항원성 구성체에 포함되는 항원성 결정인자와 목표 조직의 면역계가 자유롭게 상호작용하도록 매우 높은 생물학적 활성 형태로 노출, 안정화 및 존재하도록 한다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 임의의 이전의 실시양태에 따른 방법에 관한 것으로서, 친유성 또는 소수성 부분은 지방산, 트리글리세라이드 또는 포스포리피드, 특히 적어도 10개 탄소 원자의 탄소 백본이 있는 지방산, 특히 팔미트산이다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 이전의 실시양태에 따른 방법에 관한 것으로서, 항원, 특히 Aβ- 또는 타우-펩티드 항원은 2개의 팔미트산 성분, 특히 4개의 팔미트산 성분을 포함한다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 임의의 이전의 실시양태에 따른 방법에 관한 것이며, 리포좀 제조는 애주벤트, 특히 지질 A, 특히 해독된 지질 A, 예컨대 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A 또는 알룸을 함유한다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 임의의 하나의 이전 실시양태에 따른 방법에 관한 것이며, 아밀로이드 관련 질병 또는 질환은 이에 제한하지는 않지만 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이다: 인지적 기억 용량의 손상이 특징인 질환 또는 질병, 예컨대 예를 들면 경도인지장애(MCI), 루이소체성 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증을 갖는 유전성 뇌출혈(네덜란드 타입); 파킨슨-치매 복합증; 뿐만 아니라 아밀로이드-유사 단백질을 기본으로 하거나 또는 이들과 관련된 기타 질환, 예컨대 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥 병, 파킨슨 병, HIV-관련 치매, ALS(근위축성 측삭경화증), 성인 발병형 당뇨병; 노인성 심아밀로이드증; 내분비계 종양, 뇌졸증, 외상성 뇌손상, 황반변성 및 녹내장을 포함하는 모든 안구 질환 및 기타, 그러나 특히 알쯔하이머 질환을 포함하는 알쯔하이머 질환(AD)와 같은 신경 질환.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 이전의 실시양태에 따른 방법에 관한 것이며, 아밀로이드-관련 질환은 개체, 특히 면역 관용 개체 또는 환자 또는 T-세포 활성화 환자, 특히 동물 또는 인간에서 인지적 기억 용량의 손상이 특징이다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 이전의 실시양태에 따른 방법에 관한 것이며, 면역 관용 개체 또는 환자 또는 T-세포 활성화 환자, 특히 인지적 기억 용량의 손상이 특징인 아밀로이드-관련 질환으로 고통받는 동물 또는 인간의 치료로 특히 인지적 기억 용량의 가능한 최대의 회복을 위해서 인지적 기억 용량의 유지를 증가시킨다.
본 발명의 또 다른 특이적 실시양태는 임의의 하나의 이전 실시양태에 따른 방법에 관한 것이며, 타우-관련 질환 또는 질병은 신경퇴행성 질환, 특히 신경원섬유 병변의 형성에 의해 유발되거나 또는 이와 관련된 신경퇴행성 질환 또는 질병, 특히 타우파시, 특히 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 타우파시이다: 알쯔하이머 질환, 크로이츠펠트-야콥 병, 투사형 치매, 다운 증후군, 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커 병, 봉입체 근염 및 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 외상성 뇌손상, 근위축성 측삭경화증/괌 파킨슨-치매 복합증, 신경섬유원 농축을 갖는 비-괌마니안 운동 뉴런 질환(Non-Guamanian motor neuron disease), 은친화성 과립 치매, 피질기저퇴화, 석회화가 있는 미만성 신경섬유원 농축, 크로모좀 17과 결합된 파킨슨병을 갖는 전두측두엽성 치매, 할러보든-슈파쯔 증후군, 다계통위축, 니만-피크 병, 타입 C, 피크 병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상 마비, 아급성경화성범뇌염, 다발만의 치매(Tangle only dementia), 뇌염후 파킨슨증, 근이양증, 그러나 특히 알쯔하이머 질환.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 개체, 특히 동물 또는 인간, 특히 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍된 동물 또는 인간에서 T-세포 비의존성 면역 반응, 특히 Aβ-관련 또는 타우-관련 면역 반응을 유도하기 위한 임의의 이전 실시양태에 기재된 것과 같은 항원, 특히 Aβ 펩티드 항원 또는 타우 펩티드 항원의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 개체, 특히 면역 관용 개체 또는 환자 또는 T-세포 활성화 환자에서 질병 또는 질환, 특히 아밀로이드- 또는 타우-단백질 관련 질병 또는 질환의 치료, 증상의 경감 또는 예방 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 개체 또는 환자, 특히 동물 또는 환자, 특히 상기 질병 또는 질환으로 고통받는 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍된 동물 또는 인간에게 항원성 구성체, 특히 임의의 이전 실시양태에서 청구하는 것과 같은 Aβ 또는 타우 항원성 구성체 또는 상기 항원성 구성체를 포함하는 T-세포 비의존성 항원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, T-세포 비의존성 면역 반응, 특히 Aβ 또는 타우 면역 반응이 치료 개체에서 유도된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 개체는 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍된 노령 인간 환자이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 개체는 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍된 면역타협 인간 환자이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 개체는 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍되고, 면역결핍 질환, 특히 HIV로 고통받는 인간 환자이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 개체는 암 또는 또 다른 악성종양이 있으며, T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍된 인간 환자이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 개체는 T-세포 활성화가 나타나며, T-세포 반응의 추가적 자극으로 치료 위험이 야기될 수 있는 인간 환자이다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 임의의 이전 실시양태에 따른 방법에 관한 것이며, 유해 염증성 효과가 유도되지 않는다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 이전 실시양태에 따른 방법에 관한 것이며, 상기 항원, 특히 Aβ 또는 타우-항원성 구성체의 투여로 주로 비-염증성 아류형, 특히 비염증성 Th2 아류형, 특히 동종형 IgG1 및 IgG2b 항체가 생성된다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 이전의 실시양태에 따른 방법에 관한 것으로, 상기 Aβ 항원성 구성체의 투여로 주로 T-세포 비의존성 IgG 아류형, 특히 IgG3 동종형의 항체가 생성된다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 이전의 실시양태에 따른 방법에 관한 것으로서, 실시양태는 뇌에서의 염증성 마커, 특히 IL-1β, IL-6, IFN-γ 및 TNFα로 이루어진 군으로부터 선택된 마커의 현저한 증가를 유도하지 않는다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 임의의 이전의 실시양태에 따른 방법에 관한 것으로서, 상기 Aβ 항원성 구성체의 투여로 뇌에서 불용성, 플라크-관련-Aβ1-40 및 Aβ1-42의 현저한 증가를 유도한다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 실시양태(49)에 따른 방법에 관한 것으로서, 상기 Aβ 항원성 구성체의 투여로 뇌에서 용해성 Aβ1-42의 수준이 현저하게 감소한다.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 임의의 이전 실시양태에 따른 방법에 관한 것으로서, 아밀로이드 관련 질환 또는 질병은 이에 제한하지는 않지만 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이다: 인지적 기억 용량의 손상이 특징인 질환 또는 질병, 예컨대 예를 들면 경도인지장애(MCI), 루이소체성 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증을 갖는 유전성 뇌출혈(네덜란드 타입); 파킨슨-치매 복합증; 뿐만 아니라 아밀로이드-유사 단백질을 기본으로 하거나 또는 이와 관련된 기타 질병, 예컨대 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥 병, 파킨슨 병, HIV-관련 치매, ALS(근위축성 측삭경화증), 성인 발병형 당뇨병; 노인성 심아밀로이드증; 내분비계 종양, 뇌졸증, 외상성 뇌손상, 황반변성 및 녹내장을 포함하는 모든 안구 질환 및 기타를 포함하는 알쯔하이머 질환(AD)와 같은 신경 질환, 특히 알쯔하이머 질환.
본 발명은 또 다른 실시양태에서 임의의 이전 실시양태에 따라, 개체, 특히 면역 관용 개체 또는 환자 또는 T-세포 활성화 환자에서 질병 또는 질환, 특히 타우-단백질 관련 질병 또는 질환의 치료, 증상의 경감 또는 예방을 위한 방법에 관한 것으로서, 타우-관련 질환 또는 질병은 신경퇴행성 질환, 특히 신경원섬유 병변의 형성에 의해 유발되거나 또는 이와 관련된 신경퇴행성 질환 또는 질병, 특히 타우파시, 특히 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 타우파시이다: 알쯔하이머 질환, 크로이츠펠트-야콥 병, 투사형 치매, 다운 증후군, 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커 병, 봉입체 근염 및 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 외상성 뇌손상, 근위축성 측삭경화증/괌 파킨슨-치매 복합증, 신경섬유원 농축을 갖는 비-괌마니안 운동 뉴런 질환, 은친화성 과립 치매, 피질기저퇴화, 석회화가 있는 미만성 신경섬유원 농축, 크로모좀 17과 결합된 파킨슨병을 갖는 전두측두엽성 치매, 할러보든-슈파쯔 증후군, 다계통위축, 니만-피크 병, 타입 C, 피크 병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상 마비, 아급성경화성범뇌염, 다발만의 치매, 뇌염후 파킨슨증, 근이양증, 특히 알쯔하이머 질환.
추가 방법, 후보물질, 화합물 및 상세한 설명은 PCT/EP2006/011861 (WO2007/068411로 공개됨) 및 2009년 4월 3일 출원된 EP 특허 출원 제09 15 7303.0호에 기재되어 있으며, 이들의 상세한 설명은 이의 전문이 참고문헌으로서 여기에 포함되어 있다.
본 발명은 또한 특정 실시양태에서 T-세포 면역결핍 질환을 개체, 특히 동물 또는 인간에서 피할 수 있을 것으로 예상한다. 이러한 개체에는 질환의 시작 이전에 백신접종을 할 수 있거나 또는 질환 또는 질병으로부터 고통받는 경우에 개체는 이전에 기재한 방법으로 치료할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 질병은 아밀로이드-관련 질병이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 질병은 타우-단백질 관련 질병이다. 상기 질병은 그 중에서도 디조지 증후군, 비스코트-올드리치 증후군, 모세혈관확장성 운동실조증 또는 만성 피부 점막 칸디다증일 수 있다.
본 발명에 따른 초분자 항원성 구성체 또는 상기 항원성 구성체를 포함하는 항원성 조성물은 개체, 특히 면역 관용 개체 또는 환자, 또는 T-세포 활성화 환자, 특히 동물 또는 인간, 특히 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍된 동물 또는 인간에게서 T-세포 비의존성 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 초분자 항원성 구성체는 개체, 특히 면역 관용 개체 또는 환자, 또는 T-세포 활성화 환자, 특히 동물 또는 인간, 특히 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍된 동물 또는 인간에서 이에 제한하지는 않지만 인지적 기억 용량의 손상이 특징인 질병 또는 질환, 예컨대 예를 들면 경도인지장애(MCI), 루이소체성 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증을 갖는 유전성 뇌출혈(네덜란드 타입); 파킨슨-치매 복합증; 뿐만 아니라 아밀로이드-유사 단백질, 예컨대 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥 병, 파킨슨 병, HIV-관련 치매, ALS(근위축성 측삭경화증), 성인 발병형 당뇨병; 노인성 심아밀로이드증; 내분비계 종양, 뇌졸증, 외상성 뇌손상, 황반변성 및 녹내장을 포함하는 모든 안구 질환 및 기타, 그러나 특히 인지적 기억 용량의 손상이 특징인 질병 또는 질환, 예컨대 예를 들면 경도인지장애(MCI)를 포함하는 알쯔하이머 질환(AD)과 같은 신경 질환을 포함하는 아밀로이드증, 즉 이차 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 일군의 질병 또는 질환의 영향을 예방, 치료 또는 경감시키기 위한 방법에 사용되며, 상기 방법은 상기 개체에 본 발명에 따른 초분자 항원성 구성체, 특히 본 발명에 따른 상기 초분자 항원성 구성체를 포함하는 백신 조성물을 동물, 특히 상기 질환이 있으며, 이로 인해서 상기 치료가 필요한 동물 또는 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 이에 제한하지는 않지만 인지적 기억 용량의 손상이 특징인 질병 또는 질환, 예컨대 예를 들면 경도인지장애(MCI), 루이소체성 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증을 갖는 유전성 뇌출혈(네덜란드 타입); 파킨슨-치매 복합증; 뿐만 아니라 아밀로이드-유사 단백질, 예컨대 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥 병, 파킨슨 병, HIV-관련 치매, ALS(근위축성 측삭경화증), 성인 발병형 당뇨병; 노인성 심아밀로이드증; 내분비계 종양, 뇌졸증, 외상성 뇌손상, 황반변성 및 녹내장을 포함하는 모든 안구 질환 및 기타, 그러나 특히 인지적 기억 용량의 손상이 특징인 질병 또는 질환, 예컨대 예를 들면 경도인지장애(MCI)를 포함하는 알쯔하이머 질환(AD)과 같은 신경 질환을 포함하는 아밀로이드증, 즉 이차 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 일군의 질병 또는 질환의 영향을 개체, 특히 면역 관용 개체 또는 환자, 또는 T-세포 활성화 환자, 특히 동물 또는 인간, 특히 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 결핍된 동물 또는 인간에서 예방, 치료 또는 경감시키기 위한 약제의 제조를 위한 방법에 제공되며, 상기 방법은 약물학적 허용가능한 형태로 본 발명에 따른 항체를 제제화하는 단계를 포함한다.
특이적 실시양태에서, 본 발명은 궁극적으로 매우 높은 특이적 면역 반응을 유도하여 독특한 특성을 갖는 항체를 생성하는 바람직한 항원 형태의 강화된 노출 및 안정화를 유도하는 항원 제시에 사용한다.
타우
본 발명은 T-세포 결핍된 면역 관용 환자, 특히 CD4 T-세포가 결핍된 환자, 특히 면역 관용 환자에서 질환 및 질병, 특히 아밀로이드증, 즉 알쯔하이머 질환과 같은 아밀로이드 단백질과 관련된 일군의 질환 및 장애를 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질에 의해 유도되거나 또는 이들과 관련된 질환 및 질병, 또는 타우파시를 포함하는 단백질 타우에 의해 유도되거나 또는 이와 관련된 질환 및 질병의 치료, 증상의 완화, 시작의 지연, 또는 예방을 위해 항원성 펩티드를 사용하는 초분자 구성체를 포함하는 상기 면역원성 조성물을 포함하는 T-세포 비의존성 면역원성 조성물 및 치료적 백신 조성물을 제공한다. 상기 항원성 펩티드는 이에 제한되는 것은 아니지만 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질, 예컨대 예를 들면 프리온 단백질, 타우 단백질, 알파-시뉴클린, 헌팅틴 등을 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 초분자 항원성 구성체, 특히 아밀로이드 단백질 또는 아밀로이드-유사 단백질, 예컨대 예를 들면 프리온 단백질, 타우 단백질, 알파-시뉴클린, 헌팅틴, 등으로부터 유도된 펩티드 항원, 특히 β-아밀로이드 펩티드의 N-말단 부분을 표시하기 이전에 본 발명에 따른 및 이전에 기재한 것과 같은 β-아밀로이드 펩티드 항원 또는 타우 펩티드 항원을 포함하는 항원성 구성체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 상기 항원성 펩티드는 변형되어 항원의 규정된 형태, 특히 랜덤 코일, α-헬리칼 및 β-시트 부분의 균형된 비율로 특징되는 형태를 유지 및 안정화시킬 수 있다. 이렇게 규정된 형태는 동물 또는 인간에 도입될 때 강하고 매우 높은 특이적 면역 반응, 특히 T-세포 비의존성 면역 반응을 유도한다.
특히, 여기서 기재한 것과 같은 본 발명의 항원성 조성물은 입체형태 항원을 포함할 수 있으며, 30 % 이상, 특히 40 % 이상, 특히 50 % 이상, 특히 60 % 이상, 특히 70 % 이상, 특히 80 % 이상, 특히 90 % 이상, 특히 95 % 이상 및 최대 100 %는 베타-시트 입체형태이다.
항원성 펩티드의 목적하는 형태의 형성 및 안정화를 수득하는 하나의 방법은 캐리어, 예컨대 예를 들면 소포, 미립체 또는 분자로 부분적 또는 전체적으로 포함되거나 또는 재구성된 또는 부착된 항원성 펩티드를 제시하는 것이며, 또는 항원성 펩티드를 위한 캐리어/애주벤트로서 적당하게 제공할 수 있는 임의의 다른 수단이 있다.
본 발명의 특이적 실시양태에서, 항원성 펩티드는 약한 상호작용, 예컨대 예를 들면 반데르발스의 힘, 소수성 또는 정전기 상호작용, 또는 상기 상호작용 중 둘 이상의 결합을 통해서 캐리어내에 포함되거나 또는 재구성되거나 또는 부착되어 상기 펩티드는 이의 3차원 자유 이동으로 상기 항원성 펩티드를 제한함으로써 유지 및 안정화되는 특이적 형태를 갖고 제시되어 형태 변화가 예방 또는 강하게 제한된다.
본 발명의 특이적 실시양태에서, 항원성 펩티드는 높은 반복 배열, 특히 10 이상의 반복성 항원성 유닛/캐리어 분자, 특히 50 이상의 반복성 항원성 유닛/캐리어 분자, 특히 100 이상의 반복성 항원성 유닛/캐리어 분자, 특히 200 이상의 반복성 항원성 유닛/캐리어 분자, 특히 300 이상의 반복성 항원성 유닛/캐리어 분자, 특히 400 이상의 반복성 항원성 유닛/캐리어 분자, 특히 500 이상의 반복성 항원성 유닛/캐리어 분자를 포함하는 반복 배열로 캐리어 분자의 표면 상에 제시된다.
소포, 입자 또는 미립체가 캐리어/애주벤트, 예컨대 예를 들면 리포좀으로서 사용되는 경우, 항원성 펩티드의 조성은 이의 전체 순전하가 펩티드가 부착되는 캐리어/애주벤트 표면의 것과 동일하도록 선택될 수 있다. 동일하게 하전된 캐리어/애주벤트 표면 및 항원성 펩티드 사이, 그러나 특히 동일하게 하전된 캐리어 표면 및 항원성 펩티드를 구성하는 아미노산 잔기 및 보다 특히 동일하게 하전된 캐리어 표면 및 항원성 펩티드에 포함된 동일하게 하전된 아미노산 잔기 사이에 효과적으로 존재하는 정전기 반발력은 높은 생물학적 활성을 약속하는 규정된 매우 높은 특이적 및 안정화된 형태를 항원성 펩티드가 갖도록 유도할 수 있다. 결과로서, 항원성 펩티드는 예를 들면 목표 조직에서 매우 높은 항체 역가를 수득하는 강하고 형태-특이적 면역 반응을 유도하는, 생물학적 활성 형태의 항원성 구성체에 포함된 항원성 결정인자와 목표 조직이 자유롭게 상호작용하도록 하는 높은 생물학적 활성의 형태로 노출 및 제시된다. 펩티드가 다른 측면 상에 부착, 포함 또는 재구성되는 캐리어 및 하나의 측면 상의 항원성 펩티드의 전체 순전하를 주의깊게 조정함으로써, 항원성 펩티드는 동일하게 하전된 캐리어 표면 및 항원성 펩티드, 특히 동일하게 하전된 캐리어 표면 및 항원성 펩티드를 구성하는 아미노산 잔기, 및 보다 특히 동일하게 하전된 캐리어 표면 및 항원성 펩티드에 포함되는 동일하게 하전된 아미노산 잔기 사이에 효과적으로 존재하는 정전기 반발력에 의해 유도 및 안정화되는 형태로 캐리어 표면 상 또는 매우 근접하게 노출 제시된다. 상기로 인해서 항원성 구성체가 제시되어 목표 조직의 면역 방어 기계류에 자유롭게 접근가능하여 동물 또는 인간에 투여 시에 강하고 매우 높은 특이적 면역원성 반응을 유도할 수 있다. 상기 면역원성 반응은 또한 캐리어로서 리포좀을 사용하는 경우 추가로 증가될 수 있으며, 상기 리포좀은 본 발명에 따른 치료적 백신으로 치료하는 목표 동물 또는 인간내에서 면역 반응을 증가 또는 자극시키기 위한 애주벤트로서 작용할 수 있다. 선택적으로 상기 리포좀은 또한 추가의 애주벤트, 예컨대 예를 들면 지질 A, 알룸, 칼슘 포스페이트, 인터루킨 1, 및/또는 폴리사카라이드 및 단백질의 마이크로캡슐, 특히 해독된 지질 A, 예컨대 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A 또는 알룸을 함유할 수 있다.
본 발명의 특이적 실시양태에서, 전체 순전하가 네가티브인 항원성 펩티드 이전에 여기서 기재한 것과 같은 본 발명에 따른 항원성 펩티드는 리포좀, 특히 리포좀 헤드 군의 순 전체 전하가 네가티브가 되도록 선택되는 성분인 리포좀에서 재구성된 것을 사용한다. 특히, 상기 리포좀은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 성분으로 이루어진다: 디미리스토일 포스파티딜 콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPEA), 디미리스토일 포스파티딜 글리세롤(DMPG) 및 콜레스테롤, 및 선택적으로는 추가로 모노포스포릴 지질 A, 또는 본 발명의 범주 내에서 적당하게 사용할 수 있는 기타 애주벤트, 예컨대 예를 들면 알룸, 칼슘 포스페이트, 인터루킨 1, 및/또는 폴리사카라이드 및 단백질의 마이크로캡슐.
본 발명의 또 다른 특이적 실시양태에서, 여기서 이전에 기재된 것과 같은 본 발명에 따른 변형된 펩티드 항원은 캐리어/애주벤트로 삽입될 수 있어 펩티드를 캐리어/애주벤트에 고정하고, 이를 캐리어/애주벤트 표면 상에 또는 이와 매우 근접하게 제시하여 정전기력이 이전에 기재한 것과 같이 효과적이 될 수 있는 앵커-타입 분자와 공유 결합되어 제공된다.
리포좀을 캐리어/애주벤트로서 사용하는 경우에 항원성 펩티드 구성체는 일반적으로 형성되는 것과 같이 리포좀 막으로 삽입되는 소수성 테일을 갖는다. 또한 항원성 펩티드는 소수성 테일을 함유하여 리포좀에 삽입될 수 있도록 변형될 수 있다.
본 발명의 초분자 항원성 구성체는 일반적으로 항원성 효과를 증가시키기 위해서 변형된 펩티드를 포함하며, 이로 인해서 펩티드가 페길화(폴리에틸렌 글리콜 또는 변형된 폴리에틸렌 글리콜을 사용함)를 경유하여 변형되거나 또는 이전에 기재된 것과 같은 팔미트산, 폴리-아미노 산(예를 들면 폴리-글리신, 폴리-히드티딘), 폴리-사카라이드(예를 들면 폴리칼락투론산, 폴리락트산, 폴리글리콜리드, 키틴, 키토산), 합성 폴리머(폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리에테르), 또는 코-폴리머[예를 들면 폴리(메타크릴산) 및 N-(2-히드록시)프로필 메타크릴아미드] 등에 의한 다른 방법을 경유하여 변형될 수 있다.
본 발명의 특이적 실시양태에서, 이전에 여기서 기재한 것과 같은 본 발명에 따른 항원성 펩티드가 제공되며, 상기는 소수성 테일을 함유하도록 변형되어 상기 펩티드가 리포좀에 삽입될 수 있다. 특히 β-아밀로이드 펩티드는 캐리어/애주벤트의 지질 이중막으로의 삽입을 촉진시키는 친유성 또는 소수성 부분에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 친유성 또는 소수성 부분은 지방산, 트리글리세라이드 및 포스포리피드, 특히 지방산, 트리글리세라이드 및 포스포리피드일 수 있으며, 상기 지방산 탄소 백본은 10개 이상의 탄소 원자, 특히 대략 14개 이상의 탄소 백본 및 최대 대략 24개의 탄소 원자를 갖는 지방산을 갖는 친유성 부분, 보다 특히 14개 이상의 탄소 원자의 탄소 백본을 갖는 소수성 부분을 갖는다. 소수성 부분의 예로는 이에 제한하지는 않지만 팔미트산, 스테아르산, 미리스틱산, 라우릴산, 올레산, 리놀레인산, 리놀렌산 및 콜레스테를 또는 DSPE를 포함한다. 본 발명의 특이적 실시양태에서, 소수성 부분은 팔미트산이다.
C16 :0 지방산 부분의 비교적 감소된 길이때문에 리포좀 이중막에서 펩티드용 앵커를 제공하는 동안 팔미트화는 리포좀 표면 상 또는 이에 매우 근접하게 펩티드가 노출 제시되도록 유도한다. 따라서 항원을 처리하는 세포는 펩티드를 갖는 전체 리포좀에 정착해야 할 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, PEG는 초분자 구성체의 제조에 사용되며, 유리 PEG 말단은 포스파티딜에탄올아민 분자(상기 지방산은 미리스트산, 말미트산, 스테아르산, 올레산 등 또는 이의 결합물일 수 있음)에 공유적으로 부착된다. 상기 초분자 구조는 포스포리피드 및 콜레스테롤(다양한 몰 비율의 포스파티딜에탄올 아민, 포스파티딜 글리세롤, 콜레스테롤)로 구성되는 리포좀으로 재구성될 수 있다. 다른 포스포리피드도 사용할 수 있다. 지질 A는 대략 40 ug/pmole의 포스포리피드의 농도로 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 초분자 항원성 구성체는 페길화 리신-하나 이상의 각 말단, 특히 각 말단에서 1 또는 2에 공유적으로 결합된 이전에 여기서 기재한 것과 같은 항원성 펩티드 서열을 포함한다. PEG(폴리에틸렌글리콜) 사슬의 길이는 n = 8 내지 n = 150,000 또는 그 이상, 특히 n = 10 내지 n = 80,000, 보다 특히 n = 10 내지 n = 10,000으로 다양할 수 있다. 본 발명의 특이적 실시양태에서, PEG 사슬의 길이는 n = 45 미만, 특히 n = 5 내지 n = 40, 보다 특히 n = 10 내지 n = 30, 및 보다 더 특히 n = 10이다.
본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 리포좀은 당업계에 통상의 지식을 가진 사람들에게 공지된 것을 포함한다. 리포좀의 제조를 위한 유용한 임의의 표준 지질을 사용할 수 있다. 표준 이중막 및 다층 리포좀은 본 발명의 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 당업계에 통상의 지식을 가진 사람들에게 공지된 리포좀을 제조하기 위한 임의의 방법을 사용할 수 있는 반면에, 가장 바람직한 리포좀은 참고문헌으로서 여기에 포함된 Alving 등, Infect Immun. 60:2438-2444, 1992의 방법에 따라 제조한다. 상기 리포좀은 선택적으로 애주벤트 또는 면역조절제 또는 둘 다를 함유할 수 있다. 바람직한 면역조절제는 지질 A, 특히 해독된 지질 A, 예컨대 예를 들면 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A이다.
상기 리포좀은 이중 기능을 가질 수 있으며, 상기는 이전에 여기에서 기재한 것과 같은 초분자 구성체를 포함하는 캐리어로서 사용할 수 있으며, 동시에 본 발명에 따른 치료적 백신으로 치료하는 목표 동물 또는 인간 내에서 면역 반응을 증가 또는 자극하기 위한 애주벤트로서 기능을 가진다. 선택적으로, 상기 리포좀은 또한 추가의 애주벤트 또는 면역조절제 또는 둘 다를 함유하며, 예컨대 예를 들면 지질 A, 알룸, 칼슘 포스페이트, 인터루킨 1 및/또는 폴리사카라이드 및 단백질의 마이크로캡슐, 특히 지질 A, 보다 특히 해독된 지질 A, 예컨대 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A 또는 알룸을 추가로 함유할 수 있다.
이전에 여기서 기재한 것과 같은 본 발명에 따른 초분자 항원성 구성체를 포함하는 면역원성 조성물 및/또는 치료적 백신은 주입가능한 현탁액 또는 액상 용액의 형태, 또는 하기에 기재한 것과 같은 본 발명의 조성물의 사용 제조를 위한 키트의 사정과 관련한 주입 이전에 용액화에 적당한 고형 형태로 제조될 수 있다.
초분자 항원성 구성체를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물 및/또는 치료적 백신은 인간 또는 동물, 특히 질병에 의해 영향을 받지 않는 건강한 개체에서 발견되는 상태로의 회복 또는 질병과 관련된 증상을 경감시키기 위해서 상기 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유도하기 위해 아밀로이드- 또는 타우-관련 질병으로 고통받는 인간 또는 동물에 투여한다.
본 발명의 면역원성 조성물 및/또는 치료적 백신은 임의의 적당한 투여의 표준 경로에 의해서 인간 또는 동물에 투여된다. 일반적으로, 상기 조성물은 국소적, 경구, 직장, 비강 또는 비경구(예를 들면 정맥, 피하 또는 근육내) 경로에 의해 투여될 수 있다. 또한 조성물은 생분해성 폴리머와 같은 서방성 매트릭스로 혼입될 수 있으며, 상기 폴리머는 목적으로 하는 도달처 근처, 예를 들면 암 부위에 주입할 수 있다. 상기 방법은 단일 투여량의 투여, 소정의 시간 간격에서 반복된 투여량의 투여, 및 소정의 시간의 기간 동안 지속 투여를 포함한다.
특히, 본 발명에 따른 항원성 펩티드 조성물은 비경구적, 특히 복강내, 피하 및 근육내 주입에 의해 투여된다.
조성물의 정량은 치료 상태, 사용되는 미립자 조성물 및 기타 임상적 인자, 예컨대 환자의 체중, 사이즈 및 상태, 신체 표면적, 투여되는 미립자 화합물 또는 조성물, 동시에 투여하는 기타 약물 및 투여 경로에 따라 달라질 것이다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물 및/또는 치료적 백신은 다른 생물학적 활성 물질 및 질병 치료 절차와 결합하여 투여될 수 있다. 기타 생물학적 활성 물질은 혼합물의 형태로 본 발명에 따른 면역원성 조성물 및/또는 치료적 백신을 이미 포함하는 동일한 조성물 중 일부일 수 있으며, 치료적 백신 및 다른 생물학적 활성 물질은 동일한 약물학적으로 허용가능한 용매 및/또는 담체로 또는 이들과 함께 혼합하거나 또는 별개로 또는 일부의 키트 형태로 함께 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물 및/또는 치료적 백신은 다른 생물학적 활성 물질 또는 물질들과 간헐적으로 또는 순차적으로 수반하여 투여될 수 있다. 예를 들면 본 발명에 따른 면역원성 조성물 및/또는 치료적 백신은 제1 부가적 생물학적 활성 물질과 동시에 또는 상기 조성물의 투여 이전 또는 이후에 순차적으로 투여될 수 있다. 적용 계획은 하나 이상의 부가적 생물학적 활성 물질을 본 발명에 따른 적어도 하나의 면역원성 조성물 및/또는 치료적 백신과 함께 투여되며, 상기 화합물 또는 물질은 다양한 결합물로 동시에, 일부는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 면역원성 조성물 및/또는 치료적 백신, 및 선택적으로 하나 또는 그 이상의 추가 생물학적 활성 물질의 혼합물을 제공하는 것이며, 또한 면역 관용 환자, 또는 T-세포 활성화 환자, 특히 T-세포 결핍, 특히 CD4 T-세포가 결핍된 환자에서 아밀로이드증, 즉 이차 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 일군의 질병 및 질환 또는 타우파시, 즉 이전에 기재한 것과 같은 신경원섬유 병변의 형성과 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 타우-관련 신경퇴행성 질병 또는 질환의 영향의 예방 및/또는 치료적 처치 및/또는 경감을 위해 본 발명에 따른 상기 조성물 또는 이의 혼합물을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 혼합물은 본 발명에 따른 면역원성 조성물 및/또는 치료적 백신에 더하여 생물학적 활성 물질, 예컨대 예를 들면 아밀로이드증, 즉 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질, 예컨대 아밀로이드 형성 펩티드 항원에 대해 발생하는 항체, 특히 초분자 항원성 구성체의 형태로 제시되는 아밀로이드 형성 항원에 대해 발생하는 항체, 보다 특히 여기서 이전에 기재된 것과 같은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 알쯔하이머 질환과 관련된 Aβ 단백질과 관련된 일군의 질환 또는 질병의 약제에 사용되는 공지된 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 다른 생물학적 활성 물질 또는 화합물은 또한 아밀로이드 β에 의해 유발되는 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질과 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 질병 및 질환, 또는 타우파시를 포함하는 타우-관련 신경퇴행성 질환 또는 질병의 치료에 사용될 수 있는 치료적 약물일 수 있거나, 또는 기타 신경 질환의 약제에 사용될 수 있다.
기타 생물학적 활성 물질 또는 화합물은 본 발명에 따른 치료적 백신 및/또는 면역원성 조성물과 동일하거나 또는 유사한 기작 또는 활성의 비관련 기작 또는 활성의 관련 및/또는 비관련 기작의 다양성에 의해서 이의 생물학적 효과를 행사할 수 있다.
일반적으로 다른 생물학적 활성 화합물은 중성자-전파 증강인자, 정신과용 약물, 아세틸콜린 분해 억제제, 칼슘 채널 차단제, 생체 아민, 벤조디아제핀 신경안정제, 아세틸콜린 합성, 저장 또는 방출 증강인자, 아세틸콜린 시냅스 후부의 수용체 작용제, 모노아민 옥시다아제-A 또는 -B 억제제, N-메틸-D-아스파르테이트 글루타메이트 수용체 길항제, 비-스테로이드성 항-염증성 약물, 항산화제 및 세로토닌 수용체 길항제를 포함할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 혼합물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 기타 생물학적 활성 화합물을 포함할 수 있다: 본 발명에 따른 치료적 백신 및 선택적으로 약물학적 허용가능한 캐리어 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께, 산화성 스트레스에 대항하는 화합물, 항-세포사멸 화합물, 금속 킬레이터, DNA 손상 억제제, 예컨대 피렌제핀 및 대사산물, 3-아미노-1-프로판설폰산(3APS), 1,3-프로판디설포네이트(1,3PDS), 세크레타제 활성제, β- 및 γ-세크레타제 억제제, 타우 단백질, 신경전달물질, β-시트 브레이커, 항-염증성 분자, 또는 콜린에스테라아제 저해제(ChEIs), 예컨대 타크린, 리바스티그민, 도네페질, 및/또는 갈란타민, 및 기타 약물 및 영양 보충제.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 면역 관용 환자, 또는 T-세포 활성화 환자, 특히 T-세포 결핍 환자, 특히 CD4 T-세포 결핍 환자에서 아밀로이드증, 즉 알쯔하이머 질환과 같은 아밀로이드 단백질과 관련된 일군의 질환 및 장애를 포함하는 아밀로이드-유사 단백질 또는 아밀로이드와 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 질병 및 질환, 또는 타우파시를 포함하는 신경원섬유 병변의 형성과 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 타우 단백질, 예컨대 타우-관련 신경퇴행성 질환 또는 질병과 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 질병 및 질환의 치료, 증상의 경감 또는 예방을 위한 본 발명에 따른 면역원성 조성물 및/또는 치료적 백신, 및 선택적으로 약물학적 허용가능한 캐리어 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께, 환각, 환영, 사고 질환(뚜렷한 모순된 생각, 탈선, 사고이탈에 의해 나타남), 및 기이하거나 또는 두서없는 행위 뿐만 아니라 쾌감 상실, 둔마된 정서, 무관심 및 은둔형외톨이를 포함하는 포지티브 및 네가티브 정신병 증상의 치료를 위한 "비정형 항정신병약물", 예컨대 예를 들면 클로자핀, 지프라시돈, 리스페리돈, 아리피프라졸 또는 올란자핀을 포함하는 혼합물을 제공한다.
본 발명의 특이적 실시양태에서, 이전에 여기서 기재한 것과 같은 본 발명에 따른 조성물 및 혼합물은 치료적 또는 예방적 유효량으로 본 발명에 따른 면역원성 조성물 및 생물학적 활성 물질 각각을 포함한다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물 및/또는 치료적 백신을 결합하여 혼합물에 적당하게 사용할 수 있는 다른 화합물은 예를 들면 WO 2004/058258(특히 16 및 17 페이지 참조)에 기재되어 있으며, 치료적 약물 목표물(36-39 페이지), 알칸설폰산 및 알카놀설폰산(39-51 페이지), 콜린에스테라아제 억제제(51-56 페이지), NMDA 수용체 길항제(56-58 페이지), 에스트로겐(58-59 페이지), 비-스테로이드성 항-염증성 약물(60-61 페이지), 항산화제(61-62 페이지), 페록시솜 증식제-활성화 수용체(PPAR) 작용제(63-67 페이지), 콜레스테롤 저하제(68-75 페이지); 아밀로이드 억제제(75-77 페이지), 아밀로이드 형성 억제제(77-78 페이지), 금속 킬레이터(78-79 페이지), 항정신병 및 항-우울제(80-82 페이지), 영양 보충제(83-89 페이지) 및 뇌에서 생물학적 활성 물질의 능력을 증가시키는 화합물(89-93 페이지) 및 프로드러그(93 및 94 페이지)(참고문헌으로 여기에 포함된 문헌), 그러나 특히 상기에서 기재한 페이지에서 언급한 화합물들을 포함한다.
정상 숙주 단백질로 동물 또는 인간 숙주의 백신접종으로 자가면역 질환으로 집합적으로 알려진 질환에서 수득되는 숙주 단백질에 대항하여 유도된 자가-항체의 생성을 유도할 수 있다는 것이 오랫동안 알려져 있다. Aβ 및 이의 APP 전구물질 단백질은 이러한 정상 단백질이다. 따라서 백신접종에 상기 숙주 단백질들을 사용하면 목적하지 않는 부작용이 생길 잠재성이 있다. Aβ는 알쯔하이머 질환 또는 신경퇴행성 질환으로 고통받는 환자에서 이미 매우 높게 활성화된 보체계의 과활성화에 의해서 부분적으로 유발될 수 있는 신경염증성 반응을 활성화시킨다는 것에 관한 몇몇 증거들이 문헌에 나타나 있다.
β-시트 입체형태에서의 인간 Aβ는 인간 보체계의 강한 활성제이다. 이는 인간 보상 C1q의 콜라겐 테일에 강하게 결합한다. 보체계의 과활성화로 뉴런 및 이들 과정들을 포함하는 세포 및 조직 주위의 숙주의 자연적 방어계를 바꾸고, 이들의 자기 파괴를 유도할 수 있다. 예를 들면 숙주의 자연적 방어계의 일부이고, 박테리아 및 바이러스로 삽입함으로써 박테리아 및 바이러스 침입에서 숙주를 보호하는 세포막 공격 복합체(membrane attack complex (MAC))는 과활성화시에 숙주세포에 삽입할 수 있으며, 자동파괴를 일으킨다. 또한, 과활성화는 미세아교세포를 자극시켜서 산소-유리 라디칼 및 유해 프로테아제와 같은 독성 화합물들을 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 목적은 이미 과활성화된 보체계를 더 자극하는 잠재성을 가진, 자가항원에 의한 자가면역 질환으로 고통받는 동물 또는 인간을 백신화함으로써 야기된 신경학적 합병증과 같은 잠재적 부작용들을 방지하는 것이다. 이러한 목적은 보체 억제제와 함께, Aβ 펩티드 항원, 특히 팔미토일화 Aβ 펩티드 항원, 더욱 특히 팔미토일화 Aβ1-15 펩티드 항원, 특히 팔미토일화 Aβ1-15 펩티드 항원 (ACI-24, Aβ1-15)을 투여함으로써 본 발명의 범주 내에서 달성될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 실시양태는 Aβ 펩티드 항원에 더해, 특히 본 발명의 상세한 설명에 따른 Aβ 펩티드 항원을 포함하는 백신 조성물; 보체계의 억제제에 관한 것이다.
보체 억제제는 가용성 인간 보체 리셉터 1, 항-인간 보체 단백질 C5(예를 들면, 인간화 C5 모노클론 항체 또는 인간화 모노클론 항체의 단쇄 단편, C1-에스테라아제 억제제-N 및 천연 인간 C1 억제제)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
변형된 아밀로이드 펩티드 항원, 예를 들면 아밀로이드 베타 1-15 펩티드는 Nicolau et. al. (2002) Proc Natl. Acad. Sci USA 99, 2332-2337에 보고된 방법에 따라 합성될 수 있다. Nicolau et al에 보고된 접근법은 미리-형성된 펩티드의 말단 아미노산 잔기들에 친유성 또는 소수성 성분을 수지상 결합함으로써 더욱 변형되는, 항원 펩티드를 첫번째로 합성함에 의해 변형될 수 있다. 특히, 보호 아미노산, Fmoc-보호 아미노산은 공지의 결합화학을 사용하여 수지에 부착된다. 보호기가 제거되고, 제2의 보호 아미노산 잔기가 결합된다. 공지의 보호 화학, 특히 Fmoc/tBu 화학을 사용한 표준 자동화 펩티드 합성 및 표준 측쇄 보호기는 주어진 서열을 갖는 펩티드 단편을 생성하기 위해 아밀로이드 단백질 Aβ1-42의 아미노산 1-15 상에 결합함으로써 Aβ 항원 펩티드, 특히 Aβ1-15 항원 펩티드를 합성하기 위해 사용된다. 최종 단계에서, 2개의 추가로 보호된 아미노산들은 성장 펩티드 단편에 결합된다. 그후 Mtt기들은 선택적으로 제거되고, 팔미트산에 결합된다. 수지를 세정한후, 보호기가 제거되고, 동시에 수지가 제거되며, 표준 방법론을 사용하여 측쇄가 탈보호된다. 그후, 최종 생성물이 고순도로 얻어질 수 있으며, 전기분무 질량분석법과 같은 당 분야에 알려져 있는 방법들에 의해 확인될 수 있다.
본 발명에 따른 친유성 또는 소수성 성분은 지방산, 트리글리세리드 또는 인지질이며, 상기 지방산 탄소 백본은 10개 이상의 탄소원자들을 가진다. 특히, 친유성 또는 소수성 성분은 약 14개 이상의 탄소원자들 및 약 24개의 탄소원자들 이하의 탄소 백본을 갖는 지방산이며, 상기 범위내에 속하는 탄소원자의 각 수는 본 발명의 일부이다. 보다 특히, 친유성 또는 소수성 성분은 14개 이상의 탄소원자들, 특히 16개의 탄소원자들의 탄소 백본을 가진다. 소수성 성분들의 예로는 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 라우르산, 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산이 있으며, 여기에 한정되지는 않는다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 친유성 또는 소수성 성분은 팔미트산이다.
본 발명에 따른 리포좀 항원은 Nicolau et al., 2002에 기술된 바에 따라 제조될 수 있다. 변형된 아밀로이드 Aβ 항원 펩티드, 특히 변형된 Aβ1-15 항원 펩티드는 디미리스토일 포스파티딜 콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPEA), 디미리스토일 포스파티딜 글리세롤(DMPG) 및 선택적으로 모노포스포릴 리피드 A.를 함유하는 콜레스테롤로 구성된 구성체로 재구성될 수 있다.
본 발명의 특이적 실시양태에서, 지질 A를 갖는 리포좀은 항-아밀로이드 백신을 제조하기 위한 보조제로서 사용된다. 미리스토일포스파티딜-콜린, 디미리스토일포스파티딜-글리세롤 및 콜레스테롤은 특히 0.9:1.0:0.7의 몰비로 혼합된다. 예를 들면, 모노포스포릴 리피드 A와 같은 강한 면역조절제는 적당한 농도, 특히 인지질의 mmol당 30 내지 50mg의 농도, 더욱 특히 인지질의 mmol당 40mg의 농도로 첨가된다. 그후, 변형된 항원 Aβ 펩티드는 1:30 내지 1:200, 특히 1:50 내지 1:120, 보다 특히 1:100의 인지질에 대한 펩티드의 몰비로 첨가된다. 용매는 증발을 통해 제거되며, 얻어진 막은 PBS와 같은 멸균 버퍼용액에 의해 수화된다.
리포좀은 Wagner et al (2002) Journal of Liposome Research VoI 12(3), pp 259 - 270에 기술된 직교류 주입기술에 의해 제조될 수도 있다. 수성 버퍼시스템에 지질용액을 주입하는동안, 지질은 "침전물"을 형성한후 소포 내에 자체배열되는 경향이 있다. 상기에서 얻어진 소포 크기는 지질 농도, 교반속도, 주입속도 및 지질선택과 같은 요소들에 따라 다르다. 제조 시스템은 직교류 주입모듈, 극상(예를 들면, PBS 버퍼용액)용 용기들, 에탄올/지질 용액 용기 및 압력장치, 특히 질소압력장치로 구성될 수 있다. 수성 또는 극성 용액이 직교류 주입모듈을 통해 펌프되는 반면, 에탄올/지질 용액은 인가압력을 변화시킴으로써 극상으로 주입된다.
변형된 Aβ 항원 구성체의 면역원성을 측정하기 위해, 마우스, 쥐, 토끼, 돼지, 새 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적당한 동물, 특히 마우스, 특별히 C57BL/6 마우스가 항원 펩티드로 면역화된다. 항원 구성체의 면역원성은 ELISA 분석과 같은 면역분석법을 사용하여 면역화후 적당한 시간간격으로 혈청 샘플들을 프로빙하여 측정된다.
변형된 항원 구성체, 특히 팔미토일화 항원 구성체 및 보다 특히, 팔미토일화 Aβ1-15 구성체 또는 팔미토일화 Tau5-20[pY18]은 아밀로이드증과 연관된 증상들, 2차 아밀로이드증 및 연령 관련 아밀로이드증 또는 기타 아밀로이드-관련 질병을 포함한 아밀로이드 플라크 형성과 연관된 질병들 및 장애들 그룹, 또는 타우병증과 연관된 증상들, 타우 단백질에 의해 야기되거나 또는 연관되고, 신경섬유 병소에 의해 야기되거나 또는 연관된 일군의 질병들 및 장애들으로 고통받는, 면역 관용 동물 또는 인간 환자 또는 T-세포 활성화 환자의 면역화를 위해 사용되며, 상기 동물, 특히 상기 포유동물 또는 인간은 T-세포가 결핍되어 있으며, 특히 CD4 T-세포가 결핍되어 있다.
본 발명에 따른 초분자 항원 구성체, 특히 본 발명에 따른 초분자 항원 구성체를 포함하는 면역 조성물 및/또는 치료 백신은 적당한 표준 투여경로들에 의해 동물, 특히 포유동물 또는 인간에게 투여된다. 일반적으로, 조성물은 국소, 경구, 직장, 비강 또는 비경구적(예를 들면, 정맥내, 피하 또는 근육내) 경로들에 의해 투여될 수 있으며, 상기 동물, 특히 상기 포유동물 또는 인간은 T-세포, 특히 CD4 T-세포가 결핍되어 있다. 그리고, 조성물은 생분해성 중합체와 같은 서방형 기질로 통합될 수 있으며, 중합체는 예를 들면 종양부위에 전달되기를 원하는 부근에 주입된다. 그 방법은 단회 투여, 예정된 시간간격으로 반복 투여 및 예정된 시간기간동안 지연 투여를 포함한다.
본 발명의 특이적 실시양태에서, 본 발명에 따른 항원 구성체, 특히 상기 항원 구성체를 약학적으로 허용가능한 형태로 포함하는 면역원성 조성물 및/또는 치료 백신은 1주 내지 10주, 특히 1주 내지 6주, 보다 특히 1주 내지 4주, 및 보다더 특히 2주 내지 3주의 시간간격으로 반복 투여, 특히 1회 내지 15회 투여, 보다 특히 2회 내지 10회 투여, 보다 특히 3회 내지 7회 투여 및 보다더 특히 4회 내지 6회 투여로, 투여된다. 면역반응은 부스팅후 적당한 시간, 특히 부스팅후 3일 내지 10일, 보다 특히 부스팅후 4일 내지 8일 및 보다 특히 부스팅후 5일 내지 6일에 혈청 샘플들을 수집하고, 공지된 방법들, 특히 ELISA 분석법과 같은 통상적으로 사용되는 면역분석법들 중 하나를 사용하여 항원 구성체의 면역원성을 측정함으로써 검사된다.
본 발명에 따른 항원 구성체, 특히 약학적으로 허용가능한 형태의 본 발명에 따른 항원 구성체를 포함하는 면역원성 조성물 및/또는 치료백신에 의한 면역화는 치료되는 동물 또는 인간에서 상당히 매우 특이적인 T-세포 독립적 면역반응을 일으킨다.
본 발명의 초분자 항원 구성체 조성물은 내면역성 인간 또는 동물 환자 또는 T-세포가 활성화된 환자들, 특히 β-아밀로이드 응집과 같은 다른 병리학적 상태들(알쯔하이머 질환) 또는 암과 같은 이상증식 질환의 항원적 측면 또는 감염 유기체와 같은 항원체에 면역을 유도하기 위해 T-세포, 특히 CD4 T 세포가 실질적으로 감소된 인간 또는 동물에게 투여된다. 면역화 인간 또는 동물은 감염 유기체에 대한 항체들이 순환하고 있으며, 그럼으로써 잘병을 활성화시킬 수 있는 능력을 감소시키거나 또는 불활성화시킨다.
본 발명의 조성물은 적당한 수단들, 바람직하게는 주사에 의해 인간 또는 동물에게 투여된다. 예를 들면, 리포좀내에서 재구성된 변형 항원 펩티드는 피하 주사에 의해 투여된다. 내부적으로 생성되든지 외부 근원으로부터 제공받든지, 순환하는 항체들은 항원에 결합하여, 질병을 일으킬 수 있는 능력을 감소시키거나 또는 불활성화시킨다.
특정 실시양태에서, 초분자 항원 구성체는 β-아밀로이드의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함한다. 펩티드는 전체 아밀로이드 β 펩티드 및 그의 활성 단편들을 포함하거나 그에 대응할 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용가능한 펩티드는 Aβ를 추가로 포함한다.
정의
본 명세서에 사용된, 용어 "개별적인, 특히 동물 또는 인간이 T-세포가 결핍된", "T-세포가 결핍된", "실질적으로 T-세포가 결핍된" 또는 "T-세포 결핍"은 개별적으로 실질적으로 기능적 T-세포(들)이 없다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된, 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 서로 교환할 수 있으며, 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산들로 조성된 생분자를 의미한다.
용어 "펩티드"는 한 아미노산의 α 탄소의 카르복실기와 다른 아미노산의 α 탄소의 아미노기 사이의 축합반응에 의해 형성된 펩티드 결합을 통해 α 탄소들이 결합되는 아미노산(통상적으로 L-아미노산) 사슬들이다. 사슬 말단(즉, 아미노 말단)의 말단 아미노산은 자유 아미노기를 가지는 반면, 사슬의 다른 말단(즉, 카르복시 말단)의 말단 아미노산은 자유 카르복실기를 가진다. 이와 같이, 용어 "아미노 말단"(N-말단이라고 약칭)은 펩티드의 아미노 말단의 아미노산 위의 자유 α-아미노기, 또는 펩티드내 다른 위치의 아미노산의 α-아미노기(펩티드 결합에 참여할 경우 이미노기)를 의미한다. 이와 같이, 용어 "카르복시 말단"(C-말단이라고 약칭)은 펩티드의 카르복시 말단에서 아미노산 위의 자유 카르복실기, 또는 펩티드내 다른 위치의 아미노산의 카르복실기를 의미한다.
통상적으로, 펩티드를 이루는 아미노산들은 펩티드의 아미노 말단에서 시작하고, 카르복시 말단 방향으로 증가하는 순서로 넘버링된다. 따라서, 한 아미노산이 다른 아미노산에 "뒤따르는" 경우, 그 아미노산은 이전 아미노산보다 펩티드의 카르복시 말단에 더 가깝게 위치된다.
용어 "잔기"는 아미노 결합에 의해 펩티드로 통합되는 아미노산을 인용하여 사용된다. 이와 같이, 아미노산은 자연발생 아미노산이거나, 또는 한정되지 않는한, 자연발생 아미노산과 유사한 방법으로 기능하는 공지된 천연 아미노산 유사체들(즉, 아미노산 모사물들)을 포함할 수 있다. 게다가, 아미노결합 모사물은 당 분야에서 통상의 기술을 가진 자들에게 잘 알려져 있는 펩티드 백본 변형물들을 포함한다.
구 "필수구성성분으로 포함하는"은 구가 의미하는 펩티드들의 필수 특성들을 실질적으로 변경시키는 요소들을 배제하는 것으로 사용된다. 따라서, "...필수 구성성분으로 포함하는" 펩티드의 기재는 펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키는 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 배제한다.
그리고, 상기와 같이, 인코딩 서열내 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산(통상적으로 5% 미만, 보다 특히 1% 미만)을 변경, 부가 또는 결실시키는 각 치환, 결실 또는 부가는 변경에 의해 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환하는 보존적으로 변형되는 것임을 당업자는 잘 알 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산들을 제공하는 보존적 치환 표는 당 분야에 잘 알려져 있다. 하기 6개의 기는 각각 다른 하나에 대해 보존적으로 치환하는 아미노산들을 포함한다:
1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).
구 "분리된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 천연 상태로 발견된 것처럼 보통 포함하는 성분들이 실질적으로 또는 필수적으로 자유로운 물질을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 펩티드들은 원상태 환경과 보통 연관된 물질들을 함유하지 않는다. 통상적으로, 본 명세서에 기재된 분리된 면역원성 펩티드들은 은염색된 겔 상 밴드 세기에 의해 측정된 약 80% 이상, 보통 약 90% 이상 및 바람직하게는 약 95% 이상 순수하다.
단백질 순도 또는 균질도는 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동후, 염색시 가시화와 같은 당 분야에 잘 알려진 여러 방법들에 의해 표시될 수 있다. 특정 목적을 위해, 높은 해상도가 필요할 것이며, HPLC 또는 유사한 정제방법들이 사용된다. 면역원성 펩티드들의 길이가 비교적 짧은 경우(즉, 약 50개 미만의 아미노산들), 이들은 종종 표준 화학 펩티드 합성기술을 사용하여 합성된다.
서열의 C-말단 아미노산이 서열내 남은 아미노산들의 순차적 부가에 의해 불용성 지지체에 부착되는 고상 합성법은 본 명세서에 기재된 면역원성 펩티드들의 바람직한 화학합성방법이다. 고상 합성기술은 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 알려져 있다.
선택적으로, 본 명세서에 기술된 면역원성 펩티드들은 재조합 핵산 방법들을 사용하여 합성된다. 일반적으로, 이는 펩티드를 인코딩하는 핵산서열을 생성하는 단계, 특정 프로모터의 조절하에 발현 카세트에 핵산을 넣는 단계, 숙주에서 펩티드를 발현시키는 단계, 발현된 펩티드 또는 폴리펩티드를 분리하는 단계 및 필요에 따라 펩티드를 재생하는 단계를 포함한다. 상기 과정들에 당업자를 안내하기에 충분한 기술들은 문헌에서 찾아볼 수 있다.
한번 발현되면, 재조합 펩티드들은 황산암모늄 침전, 친화도 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 표준 과정들에 따라 정제될 수 있다. 실질적으로, 치료제로서, 약 50%~95% 균질도의 순수한 조성이 바람직하며, 80%~95% 이상의 균질도의 조성이 가장 바람직하다. 당 분야에서 통상의 기술을 가진 자는 화학합성, 생물학적 발현 또는 정제후 면역원성 펩티드들이 구성 펩티드들의 자연 구조와 실질적으로 다른 구조를 가짐을 알 것이다. 이 경우, 증식억제 펩티드를 변성 및 감소시킨후, 펩티드를 바람직한 구조로 되돌릴 필요가 있다. 단백질을 환원 및 변성시키고, 재생을 유도하는 방법들은 당 분야에서 통상의 기술을 가진 자들에게 잘 알려져 있다.
정제된 단백질의 항원성은 면역혈청 또는 단백질 자체에 대하여 생성된 항혈청과의 반응을 입증함으로써 확인될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어("a", "an" 및 "the")는 문맥에 적합하지 않는한, "하나 또는 그 이상"을 의미하며, 복수를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "검출하는" 또는 "검출된"은 면역화학 방법 또는 조직학적 방법과 같은 생분자들의 알려진 검출기술들을 사용하여, 조사되는 생분자의 존재 또는 농도를 정성적으로 또는 정량적으로 측정하는 것을 의미한다.
"분리된"은 자연발생하는 성분들 중 적어도 일부로부터 자유로운 생분자를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체" 또는 "항체들"은 당 분야에 공지되어 있는 용어이며, 공지된 항원들, 특히 면역글로불린 분자들 및 면역글로불린 분자들의 면역적으로 활성인 부분들, 즉 항원과 면역특이적으로 결합하는 결합부위를 포함하는 분자들에 결합하는 분자들의 활성 단편들 또는 분자들을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 면역글로불린은 특정 타입(IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY) 또는 부류(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 면역글로불린 분자의 서브클래스일 수 있다.
"항체'는 본 발명의 범주 내에서, 모노클론 항체, 폴리클론 항체, 키메릭 항체, 단쇄 항체, 이중특이성 항체, 시미안화 항체, 인간 및 인간화 항체 뿐만 아니라 이들의 활성 단편들을 포함하는 것으로 간주된다. 공지된 항원들에 결합하는 분자들의 활성 단편들의 예로는 Fab 및 F(ab')2 단편들이 있으며, 이들은 상기 항체들 및 단편들 중 어느 하나의 Fab 면역글로불린 발현 라이브러리 및 에피토프-결합 단편들의 생성물을 포함한다.
상기 활성 단편들은 여러 기술들에 의해 본 발명의 항체로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 정제된 모노클론 항체는 펩신과 같은 효소에 의해 제거될 수 있으며, HPLC 겔여과될 수 있다. 그후 Fab 단편들을 포함하는 적당한 분획이 수집될 수 있으며, 막여과 등에 의해 농축될 수 있다. 항체의 활성 단편들의 일반적인 분리기술들을 보다 상세하게 기술하기 위해, 예를 들면 Khaw, B. A. et al. J. Nuct. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986을 참조한다.
"인간화 항체"는 비-인간 도너 면역글로불린으로부터 유도된 CDRs를 갖는 변형 항체의 종류를 의미하며, 분자의 남은 면역글로불린-유도 부분은 1개(또는 그 이상)의 인간 면역글로불린(들)로부터 유도된다. 그리고, 프레임워크 지지체 잔기들은 결합 친화력을 보존하기 위해 변형될 수 있다. "인간화 항체들"을 얻기 위한 방법들은 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 잘 알려져 있다. (예를 들면, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technoloy, 9:421 (1991) 참조함)
"인간화 항체"는 예를 들면 토끼와 같은 큰 동물들의 친화력-성숙 인간유사 폴리클론 항체들을 생성할 수 있게 하는 새로운 유전공학접근법에 의해 얻어질 수도 있다(http://www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php).
용어 "모노클론 항체"는 또한, 당 분야에 잘 알려져 있으며, 1개의 항원만 인식하고, 단일 클론으로부터 실험실에서 생성되는 덩어리인 항체를 의미한다. 모노클론 항체들은 암세포(때로는 "불멸의" 세포라고도 함)와 같은 빠르게 성장하는 세포에 보통 단생 항체-생성 B 세포를 결합시킴으로써 제조된다. 얻어진 하이브리드 세포 또는 하이브리도마는 다량의 항체를 생성하는 클론을 급속하게 생성시켜 증가시킨다.
"기능적으로 동일한 항체"는 본 발명의 범주 내에서, 상기 항체와 적어도 하나의 주요 기능적 특성을 실질적으로 공유하는 항체를 의미하며, 그 특성들은 하기 특성들을 포함한다: 예방적으로 또는 치료적으로 투여될때, β-아밀로이드 단백질, 특히 Aβ1-42 단백질, 및 보다 특히 Aβ1-42 단백질의 4-16 에피토프 영역에 대한 결합특이성, 체외 면역반응성, 고분자 중합성 원섬유로의 Aβ1-42 단량체의 응집 및/또는 미리형성된 Aβ1-42 중합성 원섬유의 분해 억제, 및/또는 아밀로이드증, 2차 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 플라크 형성과 연관된 질병 및 질환군 및 하기 질병들을 포함하는 알쯔하이머 병(AD)과 같은 신경학적 질병들을 포함(여기에 국한되지 않음)하는 연령-관련 아밀로이드증과 연관된 질병들의 특성을 파괴하고, 효과를 완화시키는 β-시트: 인지 기억능력의 손실에 의해 특징화되는 질병 또는 질환, 예를 들면 경도인지장애(MCI), 루이 소체 치매(Lewy body dementia), 다운증후군, 아밀로이드증에 의한 유전성 뇌출혈(네덜란드 타입); 괌 파킨슨-치매 합병증; 뿐만 아니라 진행성 핵상마비, 다발성 경화증과 같은 아밀로이드-유사 단백질에 기초하거나 또는 연관된 다른 질병들; 크로이츠펠트 야콥병, 파킨슨병, HIV-연관 치매, ALS(근위축성 측삭 경화증), 성인 발병형 당뇨병; 노인성 심장 아밀로이드증; 내분비성 종양, 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 황반변성 및 녹내장을 포함한 모든 안구질병 등. 항체들은 IgG, IgM 또는 IgA 등과 같은 부류, 또는 IgG1, IgG2a 등과 같은 하위부류 및 상기 언급되거나 또는 당 분야에 공지된 다른 부류들을 가질 수 있다. 그리고, 항체들은 파지 디스플레이와 같은 방법에 의해 생성될 수 있거나, 박테리아, 곤충, 포유동물을 포함하는 유기체 또는 세포주 또는 인간화 항체와 같은 원하는 특징들을 갖는 항체들을 생성하는 다른 종류의 세포 또는 세포주에서 생성될 수 있다. 또한, 항체들은 다른 종으로부터의 Fab 부분 및 Fc 영역을 조합함으로써 형성될 수도 있다.
용어 "항원"은 유기체, 특히 동물, 보다 특히 인간을 포함한 포유동물에서 면역반응을 유도할 수 있는 독립체 또는 그의 단편을 의미한다. 상기 용어는 항원성에 반응할 수 있는 면역원 및 영역 또는 항원성 결정인자들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가용성"은 수용액에 부분적으로 또는 완전히 용해되는 것을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역원성"은 면역원성 제제에 대한 항체, T-세포 및 다른 반응성 면역세포들의 생성을 유도 또는 개선시켜서 인간 또는 동물내 면역반응에 기여하는 물질들을 의미한다.
면역반응은 치료될 질병을 완화시키거나 경감시키기 위해, 본 발명의 투여된 면역원성 조성물에 대하여 충분한 항체, T-세포 및 다른 반응성 면역세포들을 각각 생성할때 일어난다.
용어 "하이브리도마"는 공지되어 있는 용어이며, 다발성 골수증 세포와 같은 불멸의 세포 및 항체-생성 세포의 결합에 의해 생성된 세포를 의미하는 것으로 당업자들은 이해하고 있다. 상기 하이브리드 세포는 항체를 연속해서 공급할 수 있다. 결합방법에 대한 보다 상세한 설명을 위해서는 상기 "모노클론 항체"의 정의와 하기 실시예들을 참조한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "캐리어"는 항원성 펩티드 또는 초분자 구성체가 통합될 수 있거나, 또는 연합될 수 있어서, 인간 또는 동물의 면역계에 항원성 펩티드 또는 펩티드의 일부를 존재시키거나 노출시키게 하는 구조체를 의미한다. 소포, 입자 또는 미립체와 같은 동물 또는 인간 치료법에 적당하게 사용될 수 있는 입자는 본 발명의 문맥내에서 캐리어로서 사용될 수 있다.
용어 "캐리어"는 또한, 전달방법을 포함하며, 항원성 펩티드를 포함하는 초분자 항원성 구성체 조성물은 전달 기작에 의해 원하는 부위로 운반될 수 있다. 상기 전달시스템의 한 예는 콜로이드 금과 같은 콜로이드 금속들을 사용한다.
본 발명의 초분자 항원성 구성체 조성물에 사용될 수 있는 캐리어 단백질들은 말토스 결합 단백질 "MBP"; 소혈청 알부민 "BSA"; 키홀 림펫 헤모시아닌 "KLH"; 난백 알부민; 플라젤린; 티로글로불린; 특정 종의 혈청알부민; 특정 종의 감마 글로불린; 동계(syngeneic) 세포; la 항원함유 동계 세포; 및 D-아미노산 및/또는 L-아미노산의 중합체들을 포함하며, 여기에 국한되지 않는다.
본 발명의 초분자 항원 구성체에서, 리포좀은 상기 초분자 구성체를 포함하는 캐리어로서 사용될 수 있고, 동시에 본 발명에 따른 치료 백신에 의해 치료받는 표적 동물 또는 인간내 면역반응을 증가시키거나 활성화시키기 위해 애주벤트로서 기능하는 이중 기능을 가진다. 또한, 본 발명의 초분자 항원 구성체 조성물은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소혈청 알부민(BSA) 및 다른 애주벤트, 예를 들면 지질 A, 알룸, 인산칼슘, 인터루킨 1 및/또는 다당류 및 단백질의 마이크로캡슐, 특히 해독된 지질 A, 예를 들면 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A, 또는 알룸을 포함하는 다른 애주벤트들, 또다른 보존제, 희석제, 유화제, 안정화제 및 종래의 백신에 사용되고 공지되어 있는 다른 성분들을 포함할 수 있으며, 여기에 국한되지는 않는다. 그리고, 당 분야에 공지된 애주벤트 시스템은 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 상기 애주벤트는 프로인트 불완전 애주벤트, 프로인트 완전 애주벤트, 폴리분산 β-(1,4) 결합 아세틸화 매난("Acemannan"), Titermax®(CytRx Corporation제 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 애주벤트), Chiron corporation제 변형 지질 애주벤트, Cambridge Biotech제 사포닌 유도체 애주벤트, 죽은 백일해균, 그람음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(LPS), 덱스트란 설페이트와 같은 큰 폴리머 음이온 및 알룸, 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄과 같은 무기 겔을 포함하며, 여기에 국한되지 않는다.
그리고, 용어 "유효량"은 인간 또는 동물에 투여될때 면역반응을 유도하는 항원성/면역원성 조성물의 양을 의미한다. 유효량은 일정한 과정들에 따라 당업자에 의해 쉽게 결정된다.
본 명세서에서 사용되는 "면역 관용 환자"는 새로운 항원, 예를 들면 새로 발생한 질병들내에 존재하는 새로운 항원들을 제외한 항원, 특히 비의존 항원에 대하여 제한된 반응능력을 나타내는 동물 또는 인간 환자를 의미한다. 이러한 제한은 적어도 부분적으로, CD4+ T 세포의 생활연령에 기인한다. 그리고, "면역 관용 환자"는 리콜 반응동안 기억 T 세포의 증식 및 시토킨 분비에 있어서의 결함으로 인해 항원 노출에 대한 손상된 장기간 CD4+ T-세포 면역반응을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "T-세포 활성화 환자"는 T-세포 활성화를 나타내고, T-세포 반응의 추가 활성화가 의료 위험을 야기하는, 동물 또는 인간 환자를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "면역저하환자"는 연령, HIV와 같은 질병 또는 암, 또는 류마티스 관절염, 건선, 전신성 홍반성 낭창, 베게너 육아종증 등을 포함(여기에 국한되지 않음)하는 염증성 질환들에 대한 치료와 같은 치료에 의해 손상된 면역계를 갖는 동물 또는 인간 환자를 의미한다.
본 발명의 범주 내에서, 본 발명에 따른 항원 조성물에 대한 항체유도반응이 대부분 T-세포 비의존성임이 입증되었다. 이런 관점에서 누드 마우스 모델이 사용되었으며, 면역화된 누드 마우스에 있어서 본 발명에 따른 항원성 조성물에 의해 유도된 Aβ-특이적 항체반응을 평가하기 위해, 백신화하고 항체반응을 측정했다. 누드 마우스는 Foxn1nu 돌연변이를 운반하고, 그 결과, 적당한 흉선의 부재로 인해 감소된 T-세포 기능을 가진다.
하기 실시예에서 보여지는 바와 같이, 본 발명에 따른 항원성 조성물은 마우스 모델내에서 활기차고 지속되는 항-Aβ IgG 반응을 유도했다. 항체반응의 지속성은 야생형과 누드 마우스에서 유사했으며, 이는 반응기작이 T-세포에 거의 비의존적이라는 것을 극명하게 보여준다. 특히, 유사한 IgG 프로필을 갖는 고등 항체 역가임에도 불구하고, 야생형 마우스와 비교했을때 누드 마우스의 백신화는 매우 유사한 항체 생성 동역학을 유도했다.
항체 반응의 지속성 및 IgG 이소타입 분포는 야생형과 누드 마우스가 유사했으며, 이는 상기 변수들이 ACI-24 백신화의 문맥에서 T-세포와 무관하다는 것을 보여준다.
본 발명에 따른 항원 조성물에 의한 치료에 대한 반응에서 Aβ-항체들의 생성을 위한 T-세포 비의존성 작용기작의 지표인 누드 마우스 연구결과는 CD4 결실 및 비결실 마우스에서 Aβ 특이적 항체반응을 조사함으로써 더욱 뒷받침된다. 본 발명에 따른 항원성 조성물은 예를 들면 난알부민 및 수산화알루미늄(OVA/Alum)과 같은 CD4+ T-세포에 의존적인 것으로 알려진 백신과 비교될 수 있다. 이와 같은 비교에서, 본 발명에 따른 항원성 조성물은 CD4가 결실되지 않은 마우스에서 보여진 것과 유사한 강한 항-Aβ 항체 역가를 유도하여, Aβ에 대한 T-세포 비의존성 항체반응을 유도한다는 것이 입증되었다.
위로부터, 본 발명에 따른 항원성 조성물은 T-세포, 특히 T 헬퍼 세포들의 존재없이 로버스트 항-Aβ 항체를 유도할 수 있으며, 따라서 소위 Tl 비의존성 항원/백신으로 분류된다.
T-세포 비의존성 반응기작은 뇌염과 같은 관련 원치않는 염증반응 및 부적당한 T-세포 활성화의 위험을 감소시키는 측면에서 바람직하다.
그리고, T-세포 비의존성 반응기작은 낮은 임상안전성 위험을 나타내므로, 본 발명의 항원성 조성물을 치료 용도에 특히 적당하게 한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 항원성 조성물은 인간 AD 환자들이 면역내성을 극복하도록 사용될 수 있다. 이러한 본 발명의 측면은 하기 실시예에 의해 뒷받침되며, 이는 본 발명의 항원성 조성물이 필리핀 원숭이에서 항-Aβ IgG 반응을 유도하는 원숭이 모델에서 입증되었다. 항-Aβ IgG 반응을 유도하는 최저 투여량은 50㎍ 내지 150㎍, 특히 65㎍ 내지 120㎍, 특히 70㎍ 내지 100㎍, 특히 75㎍ 내지 80㎍ 범위의 변형된 항원성 펩티드였다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 인간 AD 환자, 특히 T-세포 결핍, 특히 CD4 T-세포 결핍을 갖는 인간 AD 환자에게 면역 관용을 극복시키는 방법을 제공하는데, 그 방법은 상기 환자에게 치료적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 항원성 조성물, 특히 50㎍ 내지 150㎍, 특히 65㎍ 내지 120㎍, 특히 70㎍ 내지 100㎍, 특히 75㎍ 내지 80㎍의 변형 항원성 펩티드, 특히 팔미토일화 항원성 펩티드, 특히 팔미토일화 Aβ1-15 항원성 펩티드를 포함하는 항원성 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
서열목록:
서열번호 1 대조군 서열 T5: Tau 379-408 [pS396, pS404]
서열번호 2 서열 1 (T1): Tau 5-20 [pY18 ]
서열번호 3 서열 8 (T8): Tau 206-221 [pT212, pS214]
서열번호 4 서열 9 (TQ): Tau 196-211 [pS202, pT205
서열번호 5 서열 3 (T3): Tau 393-408 [pS396, pS404]
서열번호 6 서열 4 (JA): Tau 401 -418 [pS404, pS409]
서열번호 7 서열 2 (T2): Tau 200-216 [pS202+ pT205 & pT212+pS214]
서열번호 8 항원성 펩티드 AB 1-15
서열번호 9 항원성 펩티드 Aβ 1-16
서열번호 10 항원성 펩티드 AU 1-16(714)
서열번호 11 항원성 펩티드 Aβ 4-11
서열번호 12 항원성 펩티드 Aβ 22-35
서열번호 : 13 항원성 펩티드 Aβ 29-40
서열번호 : 14 항원성 펩티드 Aβ 1-5
실시예
실시예 1: 암컷 누드 마우스의 항체 반응
본 연구의 목적은 암컷 누드 마우스에서 ACI-24 배치에 의해 유도되는 아밀로이드-베타(Aβ)-특이적 항체반응을 평가하기 위한 것이다. 누드 마우스는 Foxn1nu 돌연변이를 수반하며, 적당하게 기능하는 흉선샘이 부재함에 의해 T 세포 기능이 감소된다. 따라서, 본 연구의 목적은 ACI-24에 의해 유도된 항체반응이 T-세포 비의존적인지를 분석하는 것이다.
C57BL/6 백그라운드를 갖는 누드 마우스와 11주 또는 13주된 그의 새끼들을 피하주사하였다(s.c.). 마우스를 2주 간격으로 3회 면역화시키고, 각 면역화후 1주후 채혈하였다. 전체 항-Aβ IgG 반응을 ELISA에 의해 측정했다. 그리고, 항-Aβ IgG의 이소타입 패턴을 분석하였다.
누드 마우스내에 T-헬퍼 세포가 없는지를 확인하기 위해, CD3+ CD4+ 세포들의 비율을 형광-활성 세포 분리기(FACS)에 의해 평가하였다.
1.1 방법
백신 ACI-24의 제조
40-60℃에서 EtOH에 디미리스토일 포스파티딜 콜린(DMPC, 리포이드, 스위스), 디미리스토일 포스파티딜 글리세롤(DMPG, 리포이드, 스위스) 및 콜레스테롤(솔베이, 네덜란드)을 9:1:7의 몰비로 가용화하여, 리포좀을 제조하였다. pH 11.5의 PBS에서, 60℃에서 팔미토일화 Aβ1-15(Pal1-15, Aβ의 인간 서열)를 1% 옥틸-β-D-글루코피라노시드(β-OG, Pentapharm)에 용해시켰다. 지질/에탄올 용액을 멸균여과하고, β-OG/PBS 용액에 주입하고, 바로 PBS에 희석시켰다. 발생된 리포좀들을 멸균여과하고, 정용여과(ultra-diafiltration)에 의해 농축시켜 결정된 지질농도에 도달했다. 인지질로서 모노포스포릴 지질 A(MPLA, Avanti Polar Lipids, Inc. AL, USA)를 동시에 첨가했다.
1.1.2 면역화
JSW 라이프 사이언스에서, C57BL/6 백그라운드를 갖는 누드 마우스(B6.Cg-Foxn1nu/J) 및 그의 새끼들(11마리/군)에게 표 1에 따른 각 투여(0일, 14일, 28일) 사이에 2주 간격으로 3회 ACI-24 또는 PBS를 피하주사하였다. 하악 신경총으로부터 얻은 플라즈마를 첫번째 주사하기 7일전 및 주사후 7일, 21일, 35일, 56일, 70일, 84일 및 98일후 수집하였다. Aβ1-42 특이적 IgG 및 IgM 항체 역가 및 IgG 이소타입 패턴들을 ELISA에 의해 측정하였다. FACS 분석을 위한 첫번째 면역화후 77일 또는 63일에 혈액 샘플들을 수집하여, CD3+/CD4+ 세포들의 비율을 측정하였다.
Aβ-특이적 항체의 정량화
Aβ1-42-특이적 IgG 항체들을 ELISA에 의해 측정했다. 4℃에서 밤새 10㎍/ml의 Aβ1-42(Bachem, Bubendorf)에 의해 플레이트를 코팅하였다. 0.05% Tween 20(PBS 중, 스위스)에 의해 세정하고, 1% BSA에 의해 차단한후, 플레이트에 혈청의 계열희석액을 첨가하고, 37℃에서 2시간동안 배양했다. 세정후, 알칼린 포스파타제(AP) 콘쥬게이트 항-마우스 IgG 항체(Jackson Immunoresearch West Grove, PA, USA), 겨자무 과산화효소(HRP) 콘쥬게이트 항-마우스 IgM 또는 IgG 이소타입 특이적 항체(IgG1-AP, IgG2a-비오틴, IgG3-비오틴(모두 Pharmingen BD제, San Diego, CA, USA) 또는 IgG2b-HRP(Zymed Laboratories제, San Francisco, CA))와 함께 플레이트를 37℃에서 2시간동안 배양하였다. IgG2a 및 IgG3 항체들에 대해, 실온에서 스트렙타비딘-HRP와 함께 45분간 더 배양을 실시했다. 최종 세정후, AP 기질(pNPP) 또는 HRP 기질(ABTS)와 함께 플레이트를 배양하고, ELISA 플레이트 리더를 사용하여 405nm에서 읽었다. 결과는 상업용으로 사용가능한 항체(6E10, Covance, Emeryville, CA, USA)의 연속 희석을 참고하여 또는 광학밀도(O.D)로 표현되어 있다.
1.1.3 CD3+/CD4+ 세포 정량화
마우스 혈액 샘플을 염화암모늄에 의해 맑아질때까지 용해하고, 그후 400×g에서 7분간 원심분리하고, EDTA를 함유하는 PBS내에 펠릿들을 재현탁시켰다. 그후, CD16/CD32 차폐제에 의해 세포들을 블로킹하고, CD4(PE 콘쥬게이트) 및 CD3(PE-Cy5) 항체들에 의해 4℃에서 30분간 염색하였다. 샘플들을 PBS로 세정하고, 고정액(BD FACS흐름내에서 DB Cellfix 희석 1:40)내에 재현탁시켜서, BD FACS 칼리버 세포측정기상에 얻었다. CD3+ 및 CD4+(T-헬퍼 세포들)에 대해 포지티브로 염색된 게이티드 세포들(gated cells)의 비율을 평가하였다.
하기 표 1은 마우스를 다른 그룹들로 할당하는 것을 설명해준다.
마우스를 다른 그룹들로 할당
그룹 동물 수 및 성별 처리/
용적a 		백신
배치		 프로세스 투여경로b Pal1-15의
투여량
레벨 정량
㎍/dosec 		MPLA의 정량
㎍/dosed
1 11마리,
누드 암컷마우스		 PBS 107K23
14		 NAe s.c. 0 0
2 11마리,
누드 암컷마우스		 ACI-24-125 0.2ml ACI24
0408-A		 D s.c. 77 검출불가
3 11마리,
야생 암컷마우스		 ACI-24-125 0.2ml ACI24
0408-A		 D s.c. 77 검출불가
a : 이론적 용적
b : s.c.:피하
c : 분석 후 측정된 측정량
d : 이론적 정량
e : 사용불가
상기 표는 마우스를 다른 그룹들로 할당하는 것을 설명해준다.
1.2 결과
어떤 동물도 정상보다 빨리 죽지 않고, 치료로 인한 부작용도 없던 것으로 보고되었다. 모든 B6.Cg-Foxn1nu/J 동물들에 대하여, 전형적인 누드 표현형이 존재한 반면, Wt(야생형) 새끼들은 정상 털을 가졌다.
CD3 + /CD4 + 세포 정량화
CD3+/CD4+ 염색후 FACS 분석은 Wt 동물들에 비해, 누드 마우스내 T-헬퍼 세포수(CD3+/CD4+)가 크게 감소한 것을 보여준다(도 1.)
PBS 또는 ACI-24를 주사한 누드 마우스 및 ACI-24를 주사한 Wt 마우스의, CD3 및 CD4에 대해 포지티브로 염색된 게이티드 세포들의 비율. 각 컬럼은 11마리의 마우스군에 대한 수단 및 SD를 나타낸다. 우측 패널: 누드군과 Wt 군의 두 마우스에서 FACS 분석을 나타내는 모식도.
면역반응 분석
Wt 및 누드 마우스의 역가를 분석하여 ACI-24에 의해 유도된 반응이 T 세포 기능에 대하여 비의존적인지 확인하였다. Wt 마우스 및 누드 마우스 둘다에서, ACI-24 백신(배치 GMP-유사#4)은 PBS와 비교되는 로버스트 항-Aβ IgG 반응을 유도하였다(도 2; 2-방식 ANOVA 면역화: P<0.0001, 채혈 P<0.015 및 면역화 * 채혈, P<0.015). 제1 면역화후, 누드 마우스의 역가는 Wt 마우스의 역가와 유사했다. 다른 채혈날 내내, 누드 마우스의 역가는 Wt 마우스의 역가보다 훨씬 높았다(2-방식 ANOVA). 그러나, 1-방식 ANOVA에 의해 분석할 경우, 누드 마우스 역가는 35일째에만 매우 높았다.
부스팅 효과를 확인하기 위해, 각 주사후 역가(즉, 7일째, 21일째 및 35일째)를 분석하였다. ACI-24에 의해 처리한 누드 마우스에서, 부스팅 효과를 나타내지 않은 상기 채혈 날들 사이에 큰 차이가 없었다. ACI-24로 처리한 Wt 마우스의 그룹내에서, 두번째 주사후 부스팅 효과가 있다(1-방식 ANOVA 21일 대 7일).
면역반응의 지속성을 확인하기 위해, 마지막 주사후 역가들을 분석하였다(35일, 56일, 70일, 84일 및 98일). ACI-24로 처리한 누드 마우스와 Wt 마우스 모두에서, 최종 면역화후 3개월후에도 역가는 높았다(1-방식 ANOVA: 7일 대 98일 사이에 큰 차이가 없음). ACI-24로 처리한 Wt 마우스에서, 98일에 역가는 약간 감소했지만, 35일에서의 역가에 비해 큰 반면, 누드 마우스에 대하여는 큰 감소가 관찰되지 않았다.
이와 함께, 상기 결과들은 ACI-24가 누드 마우스와 Wt 마우스 모두에서 로버스트 및 지속적인 항체반응을 유도함을 보여준다.
최종 면역화후 7일, 21일, 35일, 56일, 70일, 84일 및 98일째 ACI-24 백신을 주사맞은 누드 마우스와 Wt 마우스의 플라즈마내 항-Aβ IgG 항체들의 분석. 결과들은 11마리의 마우스 그룹에서 얻은 평균 + 표준편차로 표현된다.
ACI-24 백신은 누드 마우스와 Wt 마우스 모두에서 7일 및 35일째에 PBS와 크게 다른 항-Aβ IgM 항체반응을 유도했다. 두 그룹에서, IgM 역가들은 최초 면역화후 7일째에 더 높았으며, 35일째에 크게 감소되었다. IgM 항체 반응은 동일한 채혈 날에 ACI-24로 처리한 누드 마우스 및 Wt 마우스에서 유사했다.
첫번째 면역화후 7일 및 35일째에 ACI-24 백신을 주사한 누드 마우스와 Wt 마우스의 플라즈마 내 항-Aβ IgM 항체들의 분석. 결과들은 11마리의 마우스 그룹에서 얻은 평균 + 표준편차로 나타낸다.
누드 마우스와 Wt 마우스 그룹 모두에서, ACI-24 백신은 주요 서브클래스로서 IgG2b와 함께 IgG1, IgG2a 및 IgG2b 및 IgG3의 항-Aβ 항체들을 유도했다(도 4).
IgG 서브클래스의 프로필은 Wt 마우스 및 누드 마우스와 유사했다.
최초 면역화후 7일 및 35일째 ACI-24 백신을 주사한 누드 마우스 및 Wt 마우스의 플라즈마내 항-Aβ, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 항체들의 분석. 결과들은 11마리의 마우스 그룹에서 얻은 평균 + 표준편차를 나타내는 1/200(IgG1) 1/1600 (IgG2a) 및 1/6400 (IgG2b) 및 1/1600 (IgG3)의 희석으로 O.D.로 표현된다.
동일한 희석시에, IgG2a 및 IgG2b 역가들을 비교할때, IgG2b 항체들은 Wt 마우스 및 누드 마우스 모두에서 우위를 차지했다(도 5). IgG 역가에 따라, 누드 마우스내 IgG2b 역가는 7일째 및 35일째에 Wt 마우스에서보다 매우 높았다.
최초 면역화후 7일 및 35일째에 ACI-24 백신을 주사한 누드 마우스와 Wt 마우스의 플라즈마내 항-Aβ IgG2a 및 IgG2b 항체들의 분석. 결과들은 11마리의 마우스 그룹에서 얻은 평균 + 표준편차를 나타내는 1/3200의 희석시에 O.D.로 표현된다.
누드 마우스에서 적은 비율의 CD3+ 및 CD4+ 세포에도 불구하고, ACI-24 백신은 로버스트 항-Aβ IgG 반응을 유도했다. 항체 반응의 지속성 및 IgG 이소타입 분포는 Wt 및 누드 마우스에서 유사했으며, 이는 상기 변수들이 ACI-24 백신화의 문맥에서 T 세포에 비의존적임을 보여준다. 면역-항체반응을 일으키는 세포와 비교했을때, ACI-24 면역화는 동일한 항체 동력학을 유도했으며, T 세포 결핍 마우스에서 유사한 IgG 프로필을 갖는 높은 항체 역가는 ACI-24는 누드 마우스와 Wt 마우스 모두에서 T 세포-비의존적 항체 반응을 유도했음을 보여준다.
실시예 2: CD4 감소 마우스에서 ACI-24의 잠재성 - 감소는 면역화전에 1회 일어남.
본 연구의 목적은 CD4 감소된 마우스와 감소되지 않은 C57BL/6 마우스에서 ACI-24에 의해 유도된 아밀로이드-베타(Aβ)-특이적 항체반응을 평가하기 위한 것이었다. 이 백신은 난알부민(OVA) 및 수산화알루미늄(Alum), CD4+ T 세포(T 헬퍼 세포)에 의존성인 것으로 알려진 백신과 비교되었다. C57BL/6 마우스는 항-CD4 모노클론 항체에 의해 복강내(i.p.) 주사되었으며, 3일후 ACI-24 또는 OVA/Alum에 의해 피하(s.c.) 면역화되었다. 면역화후 4일, 7일, 14일 및 21일 후에, 혈액샘플들을 수집하였다. 형광-활성화 세포 분리기(FACS)는 면역화후 21일후에 수행하여 CD4 감소를 확인했다. 총 항-Aβ IgG 반응들은 각 채혈을 위해 ELISA에 의해 측정했다.
2.1 방법
2.1.1 ACI-24 백신의 제조
실시예 1.1에 기술된 바와 같이 리포좀을 제조하였다.
2.1.2 OVA/Alum 백신의 제조
1ml의 멸균수에 10 mg의 OVA (Sigma)를 희석시킴으로써 OVA 백신을 제조하고, PBS에 추가로 희석하여 1 mg/ml의 농도를 얻었다. 5 mg/ml Alum에 대한 0.5 mg/ml OVA의 최종 용액(Alhydrogel 2%; Brenntag Biosector, Frederikssund, Denmark)을 0.9% NaCl에서 제조하였다.
2.1.3 CD4 감소
CD4+ 세포들의 감소는 면역화하기 3일 전(-3일)에 PBS(100 μg/투여량/마우스)내에 희석된 항-CD4 항체(Clone YTS191.1; AbD Serotec, Oxford, UK)의 복강내 주사(200μl)에 의해 얻었다. FACS 분석은 면역화후 21일후에 모든 동물내에서 수행하였다.
2.1.4 면역화
C57BL/6 성체 마우스 (5 암컷/그룹)는 표 2에 따라 0일에(CD4 감소후 3일) ACI-24 또는 OVA/Alum의 200 μl/마우스를 피하주사받았다. 4일, 7일 및 14일 뿐만 아니라 희생시킨날(21일)에 채혈을 실시했다. 모든 채혈로부터의 플라즈마를 제조하고, ElISA에 의해 항-Aβ1-42-특이적 IgG 및 항-OVA-특이적 IgG를 측정했다.
2.1.5 FACS 분석
FACS 분석을 위한 면역화후 21일째 날에 모든 동물들로부터의 혈액을 수집하여 CD4 감소를 확인하였다. 4℃에서 10분간 ACK 분해 버퍼 (Invitrogen, Paisley, UK)에 의해 혈액 제조물을 배양함으로써, 적혈구 세포분해를 수행하였다. 남은 세포들을 차가운 PBS내에서 세정하고, 4℃의 암실에서 30분간 APC-표시된 항-CD3 (클론 KT3; AbD Serotec) 및 FITC-표시된 항-CD4 (클론 RM4-5; AbD Serotec)와 함께 배양했다. 그후, 차가운 PBS내에서 세포들을 세정하고, 차가운 PBS내 1% 파라포름알데히드에 재현탁시키고, CyAn ADP 유동세포 분석기(Beckman Coulter GMBH, Lausanne, Switzerland)에 의해 얻었다. CD3+/CD4+에 대해 포지티브로 염색된 게이티드 세포들의 비율을 처리하고, Summit V4.3.01 소프트웨어(Beckman Coulter GMBH)를 사용하여 측정했다. 표 2는 다른 그룹들로의 마우스의 할당을 나타낸다.
마우스의 다른 그룹들로의 할당
그룹 동물 수
및 성별		 처리/
용적a 		처리/
용적b 		프로세스 Pal1-15의
투여량
레벨 정량
㎍/dosec 		MPLA의 정량
(㎍/dosec,d)		 OVA/Alum의
정량
(㎍/dose)
F 5마리,
암컷		 CD4 감소
(200㎕)		 ACI-24
(200㎕)		 D 83.2 15 -
G 5마리,
암컷		 - ACI-24
(200㎕)		 D 83.2 15 -
H 5마리,
암컷		 CD4 감소
(200㎕)		 OVA/Alum
(200㎕)		 - - - 100/1000
I 5마리,
암컷		 - OVA/Alum
(200㎕)		 - - - 100/1000
a: i.p. : 복강내
b: s.c. : 피하
c: 분석 후 측정된 측정량
d: MPLA 같은 종류 A + B의 합
2.1.6 Aβ-특이적 항체들의 정량화
Aβ1-42-특이적 IgG 반응을 ELISA에 의해 측정하였다. 플레이트를 10 μg/ml의 Aβ1-42 (Bachem, Bubendorf, Switzerland)로 40℃에서 밤새 코팅하였다. PBS-0.05% Tween 20으로 세정하고, 1% BSA로 차폐한후, 혈청의 연속희석액을 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2시간동안 배양했다. 세정후, 플레이트를 알칼린 포스파타제(AP) 콘쥬게이트 항-마우스 IgG 항체 (Jackson lmmunoresearch West Grove, PA, USA)와 함께 37℃에서 2시간동안 배양했다. 최종 세정후, 플레이트를 AP 기질 (pNPP)와 함께 배양하고, ELISA 플레이트 리더를 사용하여 405 nm에서 읽었다. 결과들은 상업용으로 사용가능한 항체 (6E101 Covance, Emeryville, CA1 USA)의 연속 희석액을 참고하여 나타낸다.
2.1.7 OVA-특이적 항체들의 정량화
OVA-특이적 IgG 항체들은 4℃에서 밤새 ELISA에 의해 측정했다. 30 μg/ml의 OVA (Sigma, A5503)로 플레이트를 코팅하고, PBS-0.05% Tween 20으로 세정하고, 1% BSA로 차폐한후, 혈청의 연속 희석액을 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2시간동안 배양했다. 세정후, 플레이트를 AP 콘쥬게이트 항-마우스 IgG 전체 항체(Jackson Immunoresearch, PA, USA)와 함께 37℃에서 2시간동안 배양했다. 최종 세정후, 플레이트를 pNPP와 함께 배양하고, ELISA 플레이트 리더를 사용하여 405nm에서 읽었다. 결과들은 광학밀도(O.D.)로 나타냈다.
2.2 결과
어느 동물도 정상보다 빨리 죽지 않았으며, CD4 감소, ACI-24 또는 OVA/Alum 면역화로 인한 부작용도 관찰되지 않았다. 그룹간의 체중은 유사했지만, 감소된 및 감소되지 않은 ACI-24 면역화 마우스 사이의 21일째에 큰 변화들이 관찰되었다(2-방식 ANOVA, P<0.05). 그룹간에 다른 큰 변화들도 관찰되었지만, 비교가능한 처리군들 사이에는 없었으므로, 관련되었다고 간주되지 않는다.
CD4 감소 및 비-감소 ACI-24 및 OVA/Alum 면역화 마우스의 체중 분석.
결과들은 각 그룹에 대해 n=5를 갖는 평균 + 표준편차로 표현되었다.
2.2.1 CD3 + /CD4 + 세포 정량화
CD3+/CD4+ 염색후 FACS 분석은 CD4 감소된 동물 그룹에서 더욱 낮아진 CD3+/CD4+ (T-헬퍼 세포) 카운트를 나타냈다(도 6). CD4 감소 및 비감소 OVA/Alum 면역화 마우스 사이에 큰 차이를 발견하였다(도 6, 1-방식 ANOVA P<0.05).
2.2.2 ACI-24 면역화후 면역반응
CD4 감소 및 비-감소 마우스에서 항-Aβ의 역가를 분석하여, ACI-24에 의해 유도된 반응이 CD3+/CD4+ (T 헬퍼 세포)에 비의존성인지를 확인하였다. ACI-24 백신은 7일부터 21일까지 로버스트 항-Aβ IgG 반응을 유도하였다. 전체적으로 CD4 감소된 마우스는 더높고, 크지 않은 항-Aβ 역가를 7일부터 최종 채혈때까지(21일) 기록했다.(도 7).
ACI-24 면역화후 4일, 7일, 14일 및 21일째에 C57BL/6 마우스의 플라즈마내 항-Aβ IgG 항체들의 역가
결과들은 5마리의 마우스 그룹에서 얻은 평균 + 표준편차로 표현된다.
2,2.3 OVA/Alum 면역화후 면역반응
항-OVA IgG 역가를 분석하여, CD4 감소가 이루어졌는지의 여부를 확인하고, OVA에 대한 높은 IgG 역가는 CD3+/CD4+ 세포들(T 헬퍼 세포들)에 의존성이다. O.D.가 1/100 또는 1/800에서 기록될때 CD4 감소된 및 비-감소된 동물들 모두에서 4일째 및 7일째에 무시할 수 있을 정도의 역가가 관찰되었다. 14일째에, 비-감소 마우스와 비교했을때 CD4 감소 마우스에서 항-OVA IgG 역가가 크게 감소했으며(도 8, 2-방식 ANOVA P<0.001); O.D.가 1/800에서 기록되었을때 결과가 확인되었다(도 9, 2-방식 ANOVA P<0.05). 21일째에 항-OVA IgG 역가는 CD4 감소 및 비-감소 마우스에서 동일했으며, 이는 상기 시간 프레임동안 CD4 T 세포 인구가 회복되었음을 제시해준다(-3일부터 21일까지).
OVA/Alum 면역화후 4일, 7일, 14일 및 21일째에 C57BL/6 마우스의 플라즈마에서 항-OVA IgG 항체들의 역가. 결과들은 1/100으로 읽을때 마우스 5마리의 그룹에서 얻은 평균 + 표준편차의 OD로 표현된다.
OVA/Alum 면역화후 4일, 7일, 14일 및 21일째에 C57BL/6 마우스의 플라즈마에서 항-OVA IgG의 역가. 결과들은 1/800으로 읽을때 마우스 5마리의 그룹에서 얻은 평균 + 표준편차의 OD로 표현된다.
CD4 감소된 마우스에서 CD3+/CD4+ 세포들의 작은 비율에도 불구하고, ACI-24 백신은 비-감소 마우스와 유사한 강한 항-Aβ 역가를 유도했다. 예상대로, CD4 감소된 마우스에서 OVA에 대한 IgG 역가는 면역화후 14일후 비-감소 마우스에서 관찰된 것보다 크게 낮았으며, 이는 CD4 감소가 고전적인 T-의존성 항체 반응에 직접적인 효과를 가짐을 확인해준다. 이와 함께, 상기 결과들은 CD4 감소가 성공적이고, C57BL/6 마우스 ACI-24가 Aβ에 대하여 T 세포 비의존성 항체 반응을 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 3: CD4 감소된 마우스에서 ACI-24의 잠재성 - 감소는 면역화 전 각각의 주에 일어남
본 연구의 목적은 CD4 감소 및 비-감소 C58BL/6 마우스에서 ACI-24에 의해 유도된 아밀로이드-베타(Aβ)-특이적 항체 반응을 평가하기 위한 것이었다. 이 백신은 난알부민(OVA) 및 수산화알루미늄(Alum), CD4+ T 세포(T 헬퍼 세포)에 의존적인 것으로 알려진 백신과 비교되었다. C57BL/6 마우스에 항-CD4 모노클론 항체를 복강내(i.p.)로 매주 주사하고, 최종 항-CD 주사후 3일후 ACI-24 또는 OVA/Alum에 의해 피하(s.c.)로 면역화하였다. 면역화후 7일, 14일 및 21일 후 혈액 샘플을 수집하였다. CD4 감소를 확인하기 위해 채혈일에 형광-활성 세포 분리기(FACS)를 확인하였다. 각 채혈때마다 전체 항-Aβ IgG 및 항-OVA 반응들을 ELISA에 의해 측정하였다.
3.1 방법
3.1.1 ACI-24 백신의 제조
실시예 1.1에 기술된 바와 같이 리포좀을 제조하였다.
3.1.2 OVA/Alum 백신의 제조
1ml의 멸균수에 10 mg의 OVA (Sigma)를 희석시킴으로써 OVA 백신을 제조하고, PBS에 추가로 희석하여 1 mg/ml의 농도를 얻었다. 5 mg/ml Alum에 대한 0.5 mg/ml OVA의 최종 용액(Alhydrogel 2%; Brenntag Biosector, Frederikssund, Denmark)을 0.9% NaCl에서 제조하였다.
3.1.3 CD4 감소
그룹 A 및 C에서 CD4+ 세포들의 감소는 면역화하기 3일 전(-3일) 및 그후 매주(4일, 11일 및 18일)에 PBS(100 μg/투여량/마우스)내에 희석된 항-CD4 항체(Clone YTS191.1; AbD Serotec, Oxford, UK)의 복강내 주사(200μl)에 의해 얻었다. 그룹 B 및 D는 PBS를 주사하였다. FACS 분석은 모든 채혈일(7일, 14일 및 21일)에 모든 동물내에서 수행하였다.
3.1.4 면역화
C57BL/6 성체 마우스 (8 암컷/그룹)는 표 3에 따라 첫번째 CD4 감소후(0일) 3일후 ACI-24 또는 OVA/Alum의 200 μl/마우스를 피하주사받았다. 4일, 7일 및 14일에 채혈을 실시했다. 모든 채혈로부터의 플라즈마를 제조하고, ElISA에 의해 항-Aβ1-42-특이적 IgG 및 항-OVA-특이적 IgG를 측정했다.
FACS 분석을 위한 면역화후 7일, 14일 및 21일째 날에 모든 동물들로부터의 혈액을 수집하여 CD4 감소를 확인하였다. 4℃에서 10분간 ACK 분해 버퍼 (Invitrogen, Paisley, UK)에 의해 혈액 제조물을 배양함으로써, 적혈구 세포분해를 수행하였다. 남은 세포들을 차가운 PBS내에서 세정하고, 4℃의 암실에서 30분간 APC-표시된 항-CD3 (클론 KT3; AbD Serotec) 및 FITC-표시된 항-CD4 (클론 RM4-5; AbD Serotec)와 함께 배양했다. 그후, 차가운 PBS내에서 세포들을 세정하고, PBS내 1% 파라포름알데히드에 재현탁시키고, CyAn ADP 유동세포 분석기(Beckman Coulter GMBH, Lausanne, Switzerland)에 의해 얻었다. CD3+/CD4+에 대해 포지티브로 염색된 게이티드 세포들의 비율을 처리하고, Summit V4.3.01 소프트웨어(Beckman Coulter GMBH)를 사용하여 측정했다. 표 3은 다른 그룹들로의 마우스의 할당을 나타낸다.
마우스의 다른 그룹들로의 할당
그룹 동물 수
및 성별		 처리/
용적a 		처리/
용적b 		프로세스 Pal1-15의
투여량
레벨 정량
㎍/dosec 		MPLA의 정량
(㎍/dosec,d)		 OVA/Alum의
정량
(㎍/dose)
A 8마리,
암컷		 CD4 감소
(200㎕)		 ACI-24
(200㎕)		 D 83.2 15 -
B 8마리,
암컷		 PBS
(200㎕)		 ACI-24
(200㎕)		 D 83.2 15 -
C 8마리,
암컷		 CD4 감소
(200㎕)		 OVA/Alum
(200㎕)		 - - - 100/1000
D 8마리,
암컷		 PBS
(200㎕)		 OVA/Alum
(200㎕)		 - - - 100/1000
a:i.p. : 복강내
b:s.c. : 피하
c:분석 후 측정된 측정량
d:MPLA 같은 종류 A + B의 합
3.1.5 Aβ-특이적 항체들의 정량화
Aβ1-42-특이적 IgG 반응을 ELISA에 의해 측정하였다. 플레이트를 10 μg/ml의 Aβ1-42 (Bachem, Bubendorf, Switzerland)로 40℃에서 밤새 코팅하였다. PBS-0.05% Tween 20으로 세정하고, 1% BSA로 차폐한후, 혈청의 연속희석액을 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2시간동안 배양했다. 세정후, 플레이트를 알칼린 포스파타제(AP) 콘쥬게이트 항-마우스 IgG 항체 (Jackson lmmunoresearch West Grove, PA, USA)와 함께 37℃에서 2시간동안 배양했다. 최종 세정후, 플레이트를 AP 기질 (pNPP)와 함께 배양하고, ELISA 플레이트 리더를 사용하여 405 nm에서 읽었다. 결과들은 상업용으로 사용가능한 항체 (6E10, Covance, Emeryville, CA1 USA)의 연속 희석액을 참고하여 나타낸다.
3.1.6 OVA-특이적 항체들의 정량화
OVA-특이적 IgG 항체들은 ELISA에 의해 측정했다. 4℃에서 밤새 30 μg/ml의 OVA (Sigma, A5503)로 플레이트를 코팅했다. PBS-0.05% Tween 20으로 세정하고, 1% BSA로 차폐한후, 혈청의 연속 희석액을 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2시간동안 배양했다. 세정후, 플레이트를 AP 콘쥬게이트 항-마우스 IgG 전체 항체(Jackson Immunoresearch, PA, USA)와 함께 37℃에서 2시간동안 배양했다. 최종 세정후, 플레이트를 pNPP와 함께 배양하고, ELISA 플레이트 리더를 사용하여 405nm에서 읽었다. 결과들은 광학밀도(O.D.)로 나타냈다.
3.2 결과
한 동물이 치료/면역화(그룹 C에서 #3)와 무관한 이유로 희생되었지만, 어느 동물도 정상보다 빨리 죽지 않았으며, CD4 감소, ACI-24 또는 OVA/Alum 면역화로 인한 부작용도 관찰되지 않았다. 그룹간의 체중은 다른 치료법에 의해 영향을 받지 않았다.
3.2.1 CD3 + /CD4 + 세포 정량화
모든 채혈일에 대하여, CD3+/CD4+ 염색후 FACS 분석은 CD4 감소된 동물 그룹에서 더욱 낮아진 CD3+/CD4+ (T-헬퍼 세포) 카운트를 나타냈다(P<0.001, 2 방식 ANOVA)(도 10).
7일, 14일 및 21일에 ACI-24 및 OVA/Alum 면역화 그룹에서 CD3 및 CD4에 대하여 포지티브로 염색된 게이티드 세포들의 비율. 결과들은 10마리의 마우스 그룹에서 얻은 CD3+/CD4+ 평균 + 표준편차의 %로 표현된다.
3.2.2 ACI-24 면역화후 면역반응
CD4 감소 및 비-감소 마우스에서 항-Aβ의 역가를 분석하여, ACI-24에 의해 유도된 반응이 CD3+/CD4+ (T 헬퍼 세포)에 비의존성인지를 확인하였다. ACI-24 백신은 7일부터 21일까지 로버스트 항-Aβ IgG 반응을 유도하였다. CD4 감소된 마우스를 비-감소 마우스와 비교했을때 항-Aβ 역가에 있어서 큰 차이가 관찰되지 않았다(도 11).
ACI-24 면역화후 7일, 14일 및 21일째에 C57BL/6 마우스의 플라즈마내 항-Aβ IgG 항체들의 역가. 결과들은 10마리의 마우스 그룹에서 얻은 평균 + 표준편차로 표현된다.
3,2.3 OVA/Alum 면역화후 면역반응
항-OVA IgG 역가를 분석하여, CD4 감소가 이루어졌는지의 여부를 확인하고, OVA에 대한 높은 IgG 역가는 CD3+/CD4+ 세포들(T 헬퍼 세포들)에 의존성이다. O.D.가 1/100 또는 1/800에서 기록될때 CD4 감소된 및 비-감소된 동물들 모두에서 7일째에 무시할 수 있을 정도의 역가가 관찰되었다. 14일째에, 비-감소 마우스와 비교했을때 CD4 감소 마우스에서 항-OVA IgG 역가가 크게 감소했으며(도 12, 2-방식 ANOVA P<0.001); O.D.가 1/800에서 기록되었을때 14일 및 21일째에 결과가 확인되었다(도 13, 2-방식 ANOVA P<0.001 및 P<0.01).
OVA/Alum 면역화후 7일, 14일 및 21일째에 C57BL/6 마우스의 플라즈마에서 항-OVA IgG 항체들의 역가. 결과들은 1/100으로 읽을때 10마리의 마우스 그룹에서 얻은 평균 + 표준편차의 OD로 표현된다.
OVA/Alum 면역화후 7일, 14일 및 21일째에 C57BL/6 마우스의 플라즈마에서 항-OVA IgG의 역가. 결과들은 1/800으로 읽을때 마우스 10마리의 그룹에서 얻은 평균 + 표준편차의 OD로 표현된다.
CD4 감소된 마우스에서 CD3+/CD4+ 세포들의 작은 비율에도 불구하고, ACI-24 백신은 비-감소 마우스와 유사한 강한 항-Aβ 역가를 유도했다. 예상대로, CD4 감소된 마우스에서 OVA에 대한 IgG 역가는 면역화후 14일후(1/100 O.D.) 및 21일후(1/100 및 1/800 O.D.) 비-감소 마우스에서 관찰된 것보다 크게 낮았으며, 이는 CD4 감소가 고전적인 T-의존성 항체 반응에 직접적인 효과를 가짐을 확인해준다. 이와 함께, 상기 결과들은 CD4 감소가 성공적이고, C57BL/6 마우스 ACI-24가 Aβ에 대하여 CD4+ T 세포 비의존성 항체 반응을 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 4: 필리핀 원숭이에서 ACI-24의 면역원성
본 연구의 목적은 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis)에서 ACI-24의 면역원성을 평가하기 위한 것이었다. 아밀로이드 펩티드의 아미노산 서열은 원숭이와 인간을 비교했을때 완전히 상동하므로 필리핀 원숭이를 본 연구를 위해 선택하였다. 원숭이는 β-아밀로이드(Aβ)를 발현하므로, 상기 펩티드에 대한 특정수준의 면역 관용을 가진다. 본 발명자들은 인간 Aβ1-15(Pal1-15)의 팔미토일화 펩티드를 함유하는, ACI-24에 의한 면역화가 상기 원숭이들의 면역 관용을 파괴할 수 있는지의 여부를 분석하기 위해 준비하였다.
ACI-24의 면역원성을 측정하기 위해, 원숭이를 4주 간격으로 ACI-24의 6 투여량을 피하(s.c.) 주사 받았다. ELISA에 의한 백신화후 다른 시간지점에서 면역화 원숭이들의 혈청에서 항-Aβ IgM 및 IgG 항체 역가들을 측정함으로써 항체 반응을 분석하였다.
4.1 방법
4.1.1 ACI-24 백신의 제조
40-60℃에서 EtOH에 디미리스토일 포스파티딜 콜린(DMPC, 리포이드, 스위스), 디미리스토일 포스파티딜 글리세롤(DMPG, 리포이드, 스위스) 및 콜레스테롤(솔베이, 네덜란드)을 9:1:7의 몰비로 가용화하여, 리포좀을 제조하였다. PBS에서, 팔미토일화 Aβ1-15(Pal1-15, Aβ의 인간 서열)를 2% 옥틸-β-D-글루코피라노시드(β-OG, Pentapharm)에 용해시켰다. 지질/에탄올 용액을 멸균여과하고, β-OG/PBS 용액에 주입하고, 바로 PBS에 희석시켰다. 발생된 리포좀들을 멸균여과하여 농축시켜 결정된 지질농도에 도달했다. 인지질로서 모노포스포릴 지질 A(MPLA, Avanti Polar Lipids, Inc. AL, USA)를 동시에 첨가했다. 다른 백신 제조물 ACI-24-125(R/ACI/PAL1-15/Pool/140607+180607), ACI-24-30(희석됨/R/ACI/PAL1-15/Pool/140607+180607) 및 ACI-Empty(R/ACI/Pal1-15/110607/E)을 Polymun Scientific GmbH(Austria)에 의해 제조하였으며, Maccine Ltd.(Singapore)로 배송하였다. Pal1-15, MPLA, 콜레스테롤 및 DMPC의 이론적 및 분석적 정량은 첨부서류(표2)에 개시되어 있다.
4.1.2 면역화
표 4에 따라 5개의 다른 그룹들 중 하나하나에 18마리의 나이브 원숭이들을 넣었다. 그룹 1은 PBS를 받았다. 그룹 2는 Pal1-15없이 MPLA 갖는 리포좀과 같이 비어 있는 리포좀을 받았다("ACI-24-엠프티"라고 표시). 4개의 그룹은 다른 투여량의 Pal1-15, 즉 ACI-24-30, ACI-24-125, ACI-24-500 및 ACI-24-1000을 함유하는 ACI-24를 받았다. 원숭이들을 매 4주마다 6회 0일, 28일, 56일, 84일, 112일 및 140일에 피하 면역화되었다.
표 4는 모든 원숭이들을 다른 그룹들로 할당하는 것을 나타낸다.
원숭이들의 다른 그룹으로의 할당
그룹 동물 수
및 성별		 처리/
용적a 		백신 배치 Pal1-15의
투여량
레벨 정량
㎍/dosec 		MPLA의 정량
(㎍/dosec,d)
1 수컷 2마리,
암컷 1마리		 PBS/0.8㎖ 사용불가 0 0
2 수컷 1마리,
암컷 2마리		 ACI-24-엠프티/0.8㎖ R/ACI/Pal1-15/110607/E 0 82
3 수컷 3마리 ACI-24-30/0.2㎖ 희석/R/ACI/PAL1-15/Pool/140607+180607 28 9
4 수컷 2마리,
암컷 1마리		 ACI-24-125/0.2㎖ R/ACI/PAL1-15/Pool/140607+180607 78 22
5 암컷 3마리 ACI-24-500/0.8㎖ R/ACI/PAL1-15/Pool/140607+180607 311 89
6 수컷 1마리,
암컷 2마리		 ACI-24-1000/1.6㎖ R/ACI/PAL1-15/Pool/140607+180607 621 176
a : 이론적 투여량은 ㎍로 표시되며, 백신명 ACI-24로 표시됨.
b : 이론적 용적
c : 분석 후 측정된 정량 측정
4.1.3 혈액 샘플링
혈액 샘플들(총 8㎖)을 수집하고, 혈액 혈청 및 백혈구 세포들을 -1주에서 24주까지 매주 분리하였다.
대퇴동맥으로부터 약 4㎖의 전체 혈액 샘플을 멸균시험관에 넣고, 1시간 이하동안 실온에서 응고시켰다. 그후, 혈청을 4000rpm에서 10분간 원심분리로 분리하였다. Maccine에서 -80℃에 보관한 샘플의 반과 1㎖ 분취량으로 혈청을 분리하였다. 남은 분취량을 처리시작한후 6주, 10주, 14주, 18주, 20주 및 24주에 AC Immune으로 동결 배송하였다.
대퇴동맥으로부터 약 4㎖의 전체 혈액 샘플을 EDTA 관(2×2㎖)에 넣었다. 혈액 샘플을 넣은 직후, 혈액 세포들의 분해를 Neubauer 챔버 및 Trypan Blue 사출성형으로 조절하였다. 20% 이하의 분해된 혈액 세포들은 본 연구종반까지 2007년 8월로부터 수집된 샘플들의 직접적인 평가시에 존재하는 것으로 기록되었다. 수집후, 튜브를 혈액 롤러상에 두었다. 2㎖의 전체 혈액을 갖는 한 튜브를 2×1㎖으로 나누고, AC Immune에 배송될때까지 -80℃에서 동결시켰다. 백혈구 세포들은 히스토파크(Histopaque) 구배 방법을 사용하여 다른 2㎖로부터 분리하였다. 혈액 2㎖를 히스토파크-1077(Sigma)의 2㎖ 상에 놓았다. 그후, 구배를 브레이크 없이 400g에서 30분간 스핀하였다. 백혈구 세포들을 히스토파크/플라즈마 계면에서 발견하고, 수확하고, 등장성 인산완충식염수로 세정하고, 400g에서 5분간 원심분리하였다. 2회 세정후, 원심분리된 세포들을 2㎖의 차가운 동결매질(70% RPMI; 20% PBS; 10% DMSO)내에 재현탁시켰다. 그후, 그 세포들을 미리-냉각시킨 Nalgene 세포동결 컨테이너에 넣고, -80℃에서 약 24시간동안 보관한후, 분석을 위해 드라이 아이스위에 놓고 AC Immune에 배송할때까지 두 바이알들을 액체 질소에 넣었다.
4.1.4 Aβ-특이적 항체들의 정량화
Aβ1-42-특이적 IgG 반응을 ELISA에 의해 측정하였다. 플레이트를 10 μg/ml의 Aβ1-42 (Bachem, Bubendorf, Switzerland) 및 10 μg/ml의 Aβ1-15 (NeoMPS, France)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBS-0.05% Tween 20으로 세정하고, 1% BSA로 차폐한후, 혈청의 연속희석액을 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2시간동안 배양했다. 세정후, 플레이트를 호스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 콘쥬게이트 항-원숭이 IgG 또는 IgM 항체 (KPL Inc., Gaithersburg, Maryland, USA)와 함께 37℃에서 2시간동안 배양했다. 최종 세정후, 플레이트를 HRP 기질 (ABTS)와 함께 배양하고, ELISA 플레이트 리더를 사용하여 405 nm에서 읽었다.
4.1.5 MPLA-특이적 항체들의 정량화
MPLA-특이적 IgG 항체들은 ELISA에 의해 측정했다. 4℃에서 밤새 10 μg/ml의 MPLA (Avanti Polar Lipids, Inc. AL, USA)로 플레이트를 코팅했다. PBS-0.05% Tween 20으로 세정하고, 1% BSA로 차폐한후, 혈청의 연속 희석액을 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2시간동안 배양했다. 세정후, 플레이트를 호스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 콘쥬게이트 항-원숭이 IgG 전체 항체(KPL Inc., Gaithersburg, Maryland, USA)와 함께 37℃에서 2시간동안 배양했다. 최종 세정후, 플레이트를 HRP 기질 (ABTS)와 함께 배양하고, ELISA 플레이트 리더를 사용하여 405 nm에서 읽었다.
4.1.6 백신 반응기의 정의
첫번째 면역화 이전에 같은 원숭이에서 얻은 O.D.보다 2배 높은 O.D.를 나타낸 원숭이로부터의 혈청은 백신 반응기로 간주되었다.
4.2 결과
필리핀 원숭이에서 ACI-24에 의해 유도된 항체반응의 평가
피하주사된 ACI-24 백신은 9마리의 원숭이에서 로버스트 Aβ-특이적 IgG를 유도했다(도 14). 반응하는 원숭이들을 ACl-24-30 (1 원숭이, 번호 2066), ACI-24-125 (2 원숭이 번호 6178 및 033B), ACI-24-500 (모든 3 원숭이, 7815, 4C73, 194A) 또는 ACI-24-1000 (모든 3 원숭이. 740B, 5951 및 4B2E). PBS 또는 빈 리포좀으로 백신화한 원숭이들은 예상한대로, 검출가능한 항-Aβ IgG 항체들을 나타내지 않았다(도 14).
ACI-24는 3마리의 원숭이에서 항-Aβ IgM 역가들을 유도한후, ACI-24-30 (1 원숭이, 번호 2066), ACI-24-125 (1 원숭이, 번호 033B) 또는 ACI-24-500 (1 원숭이, 번호 7815; 도 15).
ACI-24는 또한, ACI-24-30 (1 원숭이, 번호 2066) 또는 ACI-24-500 (1 원숭이, 번호 7815) 백신화 후 2마리 원숭이에서 항-MPLA IgG 반응을 유도했다(도 16).
첫번째 면역화후 다른 날에 필리핀 원숭이의 혈청에서 항-Aβ IgG 항체들의 분석. 원숭이들은 1일, 28일, 56일, 84일, 112일 및 140일에 다른 피하 주사량으로 PBS, 빈 리포좀 또는 ACI-24에 의해 면역화되었다. 결과들은 x-배 오버 콘트롤으로 표현된다(각 날에 O.D., 면역화전에 얻은 O.D.로 나눔). 각 그래프는 1투여량 그룹을 나타낸다. 숫자는 동물 수를 나타낸다.
첫번째 면역화후 다른 날에 필리핀 원숭이의 혈청내 항-Aβ IgM 항체들의 분석. 원숭이들은 1일, 28일, 56일, 84일, 112일 및 140일에 다른 피하 주사량으로 PBS, 빈 리포좀 또는 ACI-24에 의해 면역화되었다. 결과들은 x-배 오버 콘트롤으로 표현된다(각 날에 O.D., 면역화전에 얻은 O.D.로 나눔). 각 그래프는 1투여량 그룹을 나타낸다. 숫자는 동물 수를 나타낸다.
첫번째 면역화후 다른 날에 필리핀 원숭이의 혈청내 항-MPLA IgG 항체들의 분석. 원숭이들은 1일, 28일, 56일, 84일, 112일 및 140일에 다른 피하 주사량으로 PBS, 빈 리포좀 또는 ACI-24에 의해 면역화되었다. 결과들은 x-배 오버 콘트롤으로 표현된다(각 날에 O.D., 면역화전에 얻은 O.D.로 나눔). 각 그래프는 1투여량 그룹을 나타낸다. 숫자는 동물 수를 나타낸다.
따라서, ACI-24는 필리핀 원숭이에서 항-Aβ IgG 반응을 유도한다. 78㎍의 Pal 1-15를 함유하는 ACI-24-125 백신은 항-Aβ IgG 반응을 유도하는 최저 투여량이다. 따라서, ACI-24는 원숭이에서, 가능하며, ACI-24는 또한 인간 AD 환자들에서 면역 관용을 극복하는 것을 보여준다.
실시예 5: CD40L, CD14 또는 TLR4가 결핍된 마우스 및 누드 마우스에서 ACI-24에 의해 유도된 항체 반응의 평가
본 연구의 목적은 CD40L, CD14 및 TLR4가 결핍된 마우스 및 누드 마우스에서 ACI-24에 의해 유도된 아밀로이드-베타(Aβ)-특이적 항체 반응을 평가하기 위한 것이었다.
누드 마우스는 Foxn1nu 돌연변이를 수반하며, 흉선샘을 적당히 기능하는 것이 누락되어 T 세포 기능이 감소된다. 따라서, 본 연구의 한 가지 목적은 ACI-24에 의해 유도된 항체 반응이 T-세포 비의존성인지 여부를 분석하는 것이다.
CD40L 녹-아웃 마우스는 T-의존성 항원에 대하여 부족한 1차 및 2차 항체 반응을 나타내지만, T-비의존성 항원에 대해서는 정상적으로 반응을 나타낸다.(Renshaw, J Exp Med, 1994, 180, 1889; Borrow, J. Exp. Med. ,1996 ,183, 2129; Xu, Immunity, 1994, 1 ,423). CD4 T 세포위에서의 CD40L 발현은 또한, B세포에 의해 스위칭되는 이소타입에 대하여 또한 중요하다. CD40L 결핍 마우스는 ACI-24에 의해 유도된 항체 반응에 대하여 CD40L/CD40이 얻어지는지의 여부를 측정하기 위해 분석된다.
CD14 및 TLR4는 리포폴리사카라이드(LPS)에 대한 반응에 포함되는 분자들이다. CD14를 갖는 TLR4 및 미엘로이드 분화 단백질-2는 LPS에 대한 선천적인 면역반응을 개시하는 패턴 인지 수용체를 형성한다. 모노 포스포릴 리피드 A (MPLA)는 LPS의 낮은 독성 유도체이며, ACI-24 백신에서 애주벤트로 사용된다. ACI-24에 의해 유도된 항체 반응에 대하여 MPLA의 CD14 및 TLR4 인지를 위한 요건을 CD14 또는 TLR4가 결핍된 마우스에서 측정되었다.
모든 마우스들을 ACI-24 피하 주사하였다(s.c.). 마우스를 2주 간격으로 3회 면역화하고, 다른 시간 간격으로 채혈하였다. 총 항-Ag IgG 반응들은 ElISA에 의해 측정하였다.
5.1 방법
5.1.1 마우스
TLR4 (TLR4 녹아웃 (KO)), CD14 (CD14 KO) 또는 CD40L (CD40L KO)이 결핍한 마우스 및 누드 마우스 (모두 C57BI/6 백그라운드)를 Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME1USA)에서 구입하였다.
5.1.1.1 TLR4 녹아웃 - B6.B10ScN- Tlr4lps - deI / JthJ ( Jackson Stock Number . 007227)
이러한 자발적인 돌연변이는 Tlr4 유전자에서 7 kb 결실이며, 이로써 mRNA 및 단백질이 부재하게 되며, 따라서, LPS 자극에 대한 결함 반응을 나타낸다. C3H/HeJ 마우스에서 발견된 기능적으로 유사한 Tlr4Lps-d 돌연변이는 아미노산 치환을 일으키는 포인트 돌연변이이다. 정상 LPS 반응을 위한 대립 형질, Tlr4lps-n은 다른 C3H 및 C57BL/105 아주에서 가장 많이 발생하며, 마우스 계통에서 많이 발생한다. 이 계통은 Toll 신호화 경로 및 그람-음성 박테리아 감염에 대한 민감성을 연구하기 위해 사용될 수 있다.
5.1.1.2 CD14 녹아웃 - B6.129S-Cd14tm1Fnv/J (Jackson Stock Number. 003726)
CD14가 균일하게 없는 마우스는 실행가능하며 생식력이 있다. No CD14 단백질 생성물은 웨스턴 블롯 분석에 의해 티오글리콜레이트 유발 페리토니얼(T-EP)에서 검출된다. 야생형 T-EP 마크로파지와 달리, 상기 동물들에서 유도된 T-EP 마크로파지는 리포폴리사카라이드(LPS)에 대한 반응에서 TNF-알파 및 IL-6을 분비하는데 실패한다. 상기 반응은 CD-14가 없는 T-EP 마크로파지가 전체 박테리아(E.Coli 생입자의 형태)에 노출될때, CD14-비의존성 기작에 의해 분명하게 관찰된다.
5.1.1.3 누드 마우스 - B6. Cg - Foxn1nu /J ( Jackson Stock Number : 000819)
누드 자발적 돌연변이에 대해 동형접합성인 마우스의 두가지 주요 결점들(Foxninu, formerly Hfh11nu)은 흉막의 결합발생 및 비정상적인 모발성장이다. 마우스가 머리털이 없어지더라도, 이들은 기능적으로 태어나지만, 모발성장 모낭이 결함이 있다. 모발 성장 주기 및 패턴은 착색 마우스에서 특히 분명하지만, 결함있는 모낭은 적당하게 모발을 분출하지 못한다. 동형접합성 강아지들은 수염이 없거나 거의 나오지 않고, 수염에 잔주름이 많으면 24시간만큼 어린것으로 확인될 수 있다. 누드 마우스는 또한, "흉선 원기"의 개발적 실패에 의해 야기된 흉선샘 결핍이다. 결과적으로, 동형접합성 누드 마우스는 T 세포가 없으며, 세포-매개 면역의 부재로부터 고통받는다. 그러나, T-세포 전구체에 결함이 없으며, 맞는 조건하에서는 일부 기능적으로 성숙한 T 세포들이 특히 성체 마우스에서 발견될 수 있다. 헬퍼 T-세포 활성에서의 결함때문에, 검출가능할때 흉선-의존성 항원에 대한 반응들은 주로 IgM에 제한되어 있다. 동형접합성 누드 마우스는 기능적 T 세포의 부재로 인해 B 세포 발생에 부분적인 결함을 나타낸다.
5.1.1.4 CD40L 녹아웃 마우스 - B6.129 S2 - Cd40lgtm1lmx /J ( Jackson Stock Number : 002770)
표적 돌연변이에 대한 마우스 동형접합성은 실행가능하며 생식력이 있다. 동형접합성 돌연변이 마우스는 명시적인 표현형 기형을 나타내지 않는다. B 및 T 세포 서브군집의 비율은 정상이다. 동형접합체들은 체액 면역에서 선택적인 결함들(낮은 기본 혈청 이소타입 수준 및 검출불가능한 IgE) 뿐만 아니라 흉선-의존성 항원에 의한 면역화에 대한 비정상적 2차 항원-특이적 반응들을 나타낸다. 마우스의 표현형은 인간 X-결합형 하이퍼 IgM 증후군과 닮았다.
5.1.2 백신 A CI -24의 제조
리포좀을 실시예 1.1에 기술된 바대로 제조하였다.
백신 제조물, ACI-24(배치: ACI-24-0709-A)를 Polymun Scientific GmbH (Austria)에 의해 제조하고, Zurich 대학 (Switzerland)에 배송하였다.
5.1.3 면역화
C57BL/6 마우스, 누드 마우스, CD40L KO 마우스, CD14 KO 마우스 및 TLR4 KO 마우스 (6 마우스/그룹)은 표 5에 따라 각 투여사이에 2주 간격으로(0일, 14일, 28일) 3회 ACI-24를 피하 주사하였다. C57BL/6 마우스는 음성 대조군으로서 PBS를 주사받았다. 다른 대조군 그룹은 Aβ1-15 펩티드를 주사받았다. 첫번째 주사후 0일, 7일, 14일, 28일 및 56일에 플라즈마 샘플들을 수집했다. Aβ1-42-특이적 IgG 항체 역가들을 ELISA에 의해 측정했다.
5.1.4 Aβ-특이적 항체들의 정량화
Aβ1-42-특이적 IgG 항체들을 ELISA에 의해 측정했다. 4℃에서 밤새 10㎍/ml의 Aβ1-42(Bachem, Bubendorf)에 의해 플레이트를 코팅하였다. 0.05% Tween 20(PBS 중, 스위스)에 의해 세정하고, 1% BSA에 의해 차폐한후, 플레이트에 혈청의 계열희석액을 첨가하고, 37℃에서 2시간동안 배양했다. 세정후, 알칼린 포스파타제(AP) 콘쥬게이트 항-마우스 IgG 항체(Jackson Immunoresearch West Grove, PA, USA)와 함께 배양하였다. 최종 세정후, AP 기질(pNPP) 또는 HRP 기질(ABTS)와 함께 플레이트를 배양하고, ELISA 플레이트 리더를 사용하여 405nm에서 읽었다. 결과는 상업용으로 사용가능한 항체(6E10, Covance, Emeryville, CA, USA)의 연속 희석을 참고하여 표현되어 있다.
마우스의 다른 그룹으로의 할당
그룹 마우스
형질		 동물 수
및 성별		 처리/
용적a 		백신 배치 투여
경로		 Pal1-15의
투여량
레벨 정량
㎍/dosec 		MPLA의 정량
(㎍/dosec,d)
1 C57BL/6
야생형		 암컷마우스
6마리		 ACI-24
0.2㎖		 ACI-24-0709-A s.c. 77.6 11.6
2 CD40L
KO		 암컷마우스
6마리		 ACI-24
0.2㎖		 ACI-24-0709-A s.c. 77.6 11.6
3 누드 암컷마우스
6마리		 ACI-24
0.2㎖		 ACI-24-0709-A s.c. 77.6 11.6
4 CD14
KO		 암컷마우스
6마리		 ACI-24
0.2㎖		 ACI-24-0709-A s.c. 77.6 11.6
5 TLR4
KO		 암컷마우스
6마리		 ACI-24
0.2㎖		 ACI-24-0709-A s.c. 77.6 11.6
5 C57BL/6
야생형		 암컷마우스
6마리		 Aβ1-15
0.2㎖		 Lot 10105
33		 s.c. 80 N/Ad
6 C57BL/6
야생형		 암컷마우스
6마리		 PBS N/A s.c. N/A N/A
a : 이론적 용량
b : s.c. 피하
c : 분석 후 측정된 정량 측정
d : 적용불가
5.2 결과
5.2.1 항체 반응 분석
Wt 누드 및 CD14, CD40L 또는 TLR4 KO 마우스의 항-Aβ IgG 역가를 분석하여 ACI-24에 의해 유도된 반응이 T 세포 및/또는 CD14, CD40L 또는 TLR4에 대해 의존성인지의 여부를 확인하였다.
Wt 마우스에서, ACI-24 백신은 PBS에 비해 로버스트 항-Aβ IgG 반응들을 유도했다(도 17; 2-방식 ANOVA d7, 28 및 56에 대해 P<0.05). CD40L KO 마우스에서, ACI-24 백신은 PBS에 비해 로버스트 항-Aβ IgG 반응들을 유도했으며(도 17; 2-방식 ANOVA d7, 28 및 56에 대해 P<0.05), 역가는 Wt 마우스에서 유도된 항-Aβ IgG 역가보다 크게 낮지 않았다(모든 시간 지점에서, P<0.05). 첫번째 면역화후, (d7 및 d14), 누드 마우스의 역가는 Wt 마우스의 역가와 유사했다. 다른 채혈하는 날에, 누드 마우스의 역가는 Wt 마우스의 역가보다 매우 높았다(2-방식 ANOVA P<0.001, d28 및 d56에 대하여). Aβ1-15 펩티드는 예상대로, 어떤 항-Aβ IgG 역가도 유도하지 않았다.
CD14 KO 마우스의 역가는 분석하는 날 내내 Wt 마우스에서 관찰된 역가와 유사했다(도 18, P> 0.05).
이와 반대로, TLR4 KO 마우스에서 ACI-24에 의해 1회 또는 2회 면역화한후 항-Aβ IgG 역가가 유도되지 않았으며, 역가는 d7, d14 및 d28 모두에 Wt 마우스에서 관찰된 역가보다 크게 낮았다(2-방식 ANOVA P<0.001 d7, di4 및 d28에).
종합하면, 상기 결과들은 ACI-24가 T 세포, CD40L 및 CD14에 비의존성이지만 TLR4에 의존성인 로버스트 항체 반응을 유도한다는 사실을 보여준다.
5.3 결론
Wt 마우스와 누드 마우스에서 ACI-24 백신 유도된 로버스트 항-Aβ IgG 반응은 항체 반응이 ACI-24 백신화의 문맥에서 T 세포에 비의존성임을 증명한다. 또한, 항체반응은 CD40L에 비의존성이며, 이는 T 세포에 비의존성임을 더욱 뒷받침해준다. CD14 KO 마우스에서 항체반응은 Wt 마우스와 유사했으며, 이는 항체반응을 유도하기 위해, CD14가 MPLA에 대한 수용체로서 ACI-24의 애주벤트를 필요하지 않음을 보여준다. 마지막으로, ACI-24 유도된 항체 반응을 위한 TLR4의 필요성은 TLR4 KO 마우스에서 항체반응의 완전한 부재에 의해 분명하게 입증되었다.
실시예 6: 암컷 누드 마우스에서 항-pTau 항체 반응
본 연구의 목적은 암컷 누드 마우스에서 ACI-33(Tau5-20[pY18]) 백신 주사에 의해 유도된 항-pTau 항체 반응을 평가하기 위한 것이었다. 누드 마우스는 Foxn1nu 돌연변이를 수반하고, 적당히 기능하는 흉선 샘의 부재로 인해 T 세포 기능이 감소되었다. 따라서, 본 연구의 목적은 ACI-33에 의해 유도된 항체반응이 T-세포 비의존성인지의 여부를 분석하는 것이었다.
C57BL/6 백그라운드를 갖는 누드 마우스와 11주 또는 13주된 대응하는 야생형 새끼들에게 피하주사하였다(s.c.). 마우스를 2주 간격으로 3회 면역화하고, 각 면역화후 1주후 채혈하였다. 전체 항-pTau(Tau5-20 [pY18]) 펩티드 IgG 반응들을 ELISA에 의해 측정하였다. 그리고, 3회의 면역화후 항체 반응의 이소타입 패턴을 분석하여, IgGs 뿐만 아니라 IgM의 다른 하위클래스의 분포를 평가하였다. 대응 비-pTau (Tau5-20), 전체-길이 (441aa) Tau 단백질 및 인산화 전체-길이(441aa) Tau 단백질도 또한 분석하였다.
누드 마우스에서 T-헬퍼 세포의 부재를 확인하기 위해, CD3+/CD4+ 세포들의 비율을 형광-활성화 세포 분리기(FACS)에 의해 평가하였다.
6.1 방법
6.1.1 백신 ACI-33의 제조
지질 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 콜레스테롤 뿐만 아니라 애주벤트 모노포스포릴 지질 A(MPLA)(모두 Avanti Polar Lipids Inc. AL, USA) 및 Tau-유도된 테트라팔미토일화 포스포펩티드 Tau5-20 [pY18] (Y18 상에 포스포기를 갖는 인간 Tau 5-20; 5.2 mg)을 250㎖ 유리 둥근바닥 플라스크에 무게를 쟀다(각각 몰비율 9:1:7:0.2:0.1). PBS(60㎖)를 첨가하여, 얻은 박막을 재수화하고, 18시간동안 RT에서 조심스럽게 교반하였다. 그후 리포좀 현탁액(배치 ACI-33-090818-A)을 2-8℃에서 저장하기 전에 분취하였다. 최종 펩티드/인지질 몰비는 1:100이었다. 백신들은 JSW Life Sciences GmbH (Austria)로 배송되었다.
6.1.2 면역화
JSW Life Sciences GmbH에서 C57BL/65 백그라운드를 갖는 누드 마우스 (B6.Cg-Foxn1 nu/J) 및 대응하는 야생형 새끼들(6마리 암컷 마우스/그룹)에게 표 6에 따른 각 투여 사이의 2주 간격(0일, 14일, 28일)으로 3회 발생시에 ACI-33을 피하주사하였다. 안면정맥/동맥으로부터의 플라즈마 샘플들을 최초 주사하기 7일 전에 및 주사후 2, 4, 7, 21, 35 및 58일후에 수집하였다. Tau5-20 [pY18]-특이적 IgG 및 IgM 항체 역가 및 IgG 이소타입 패턴들을 ELISA에 의해 측정하였다. 비-pTau5-20, 전체-길이 (441aa) Tau 단백질 및 인산화 전체-길이 (441aa) Tau 단백질에 대한 특이적 IgG 항체 역가들도 또한 ELISA에 의해 측정했다. 또한, CD3+/CD4+ 세포들의 백분율을 측정하기 위해 FACS 분석을 위해 d-7에 혈액샘플들도 수집하였다.
6.1.3 Tau 펩티드-특이적 항체들의 정량화
Tau5-20 [pY18]을 위한 특이적 IgG 항체들을 5개의 혈청 채혈 샘플들(d2, d7, d21, d35 및 d56)에서 ELISA에 의해 측정했다. Tau5-20-, 전체-길이 (441aa). Tau 단백질- 및 인산화 전체-길이 (441aa) Tau 단백질-특이적 IgG는 d35로부터의 혈청에서 측정했다. Tau5-20 [pY18]-특이적 IgM 및 IgG 이소타입 항체들은 d35 혈청 채혈 샘플에서 ELISA에 의해 측정했다. 해당 Tau 펩티드의 10㎍/㎖ 및 해당 Tau 단백질의 1㎍/㎖에 의해 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅했다. PBS-0.05% Tween 20으로 각 웰을 세정하고, PBS-0.05% Tween 20 내 1% BSA에 의해 차폐한후, 플레이트에 혈청의 계열희석액을 첨가하고, 37℃에서 2시간동안 배양했다. 세정후, 알칼린 포스파타제(AP) 콘쥬게이트 항-마우스 IgG 항체(Jackson Laboratories, Baltimore, PA1 USA) 또는 이소타입 특이적 항체 (양고추냉이 과산화효소 (HRP)-콘쥬게이트 항-마우스 IgM, AP-콘쥬게이트 항-마우스 IgG1, 비오틴-콘쥬게이트 항-마우스 lgG3, Pharmingen BD에서 구입, San Diego, CA, USA; 비오틴-콘쥬게이트 항-마우스 lgG2a5 Invitrogen에서 구입, CA 및 HRP-콘쥬게이트 항-마우스 IgG2b Zymed Laboratories에서 구입, San Francisco, CA)와 함께 배양하였다. 세정후, pNPP (파라-니트로-페닐-포스페이트), AP를 위한 포스파타제 기질 또는 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산)), HRP를 위한 기질과 함께 플레이트를 배양하고, ELISA 플레이트 리더를 사용하여 405nm에서 읽었다. 비오틴 콘쥬게이트 항체들을 위해 보충단계를 실시하고, 여기에서 ABTS를 사용하여 검출하기 전에 플레이트를 스트렙타비딘-HRP(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)에서 45분간 배양했다. 결과는 IgG, IgG 이소타입 및 IgM에 대한 불포화 O.D.에서 O.D.(광학밀도)로 표현된다.
6.1.4 CD3+/CD4+ 세포 정량화
마우스 혈액 샘플을 염화암모늄에 의해 맑아질때까지 용해하고, 그후 400×g에서 7분간 원심분리하고, EDTA를 함유하는 PBS내에 펠릿들을 재현탁시켰다. 그후, CD16/CD32 차폐제에 의해 세포들을 블로킹하고, CD4(PE 콘쥬게이트) 및 CD3(PE-Cy5) 항체들에 의해 4℃에서 30분간 염색하였다. 샘플들을 PBS로 세정하고, 고정액(DB FACS흐름내에서 DB Cellfix 희석 1:40)내에 재현탁시켜서, BD FACS 칼리버 세포측정기상에 얻었다. CD3+ 및 CD4+(T-헬퍼 세포들)에 대해 포지티브로 염색된 게이티드 세포들(gated cells)의 비율을 평가하였다.
마우스 면역화
그룹 동물 수
및 성별		 처리/
용적a 		백신
배치		 처리 투여
경로b 		투여량
수준
T1의 정량
㎍/dosec 		MPLA의
정량
㎍/dosec
1 6 ♀
누드 마우스		 ACI-33
0.2㎖		 ACI-33-
090818-A		 ACI-A s.c. 12.6 15.8
2 6 ♀
야생형 마우스		 ACI-33
0.2㎖		 ACI-33-
090818-A		 ACI-A s.c. 12.6 15.8
a : 이론적 용량
b : s.c. : 피하
c :분석 후 측정된 측정정량
6.2 결과
6.2.1 일반적인 관찰
어떤 동물도 정상보다 빨리 죽지 않고, 치료로 인한 부작용도 없던 것으로 보고되었다. 모든 B6.Cg-Foxn1nu/J 동물들에 대하여, 전형적인 누드 표현형이 존재한 반면, 야생형(Wt) 새끼들은 정상 털을 가졌다.
6.2.2 CD3 + /CD4 + 세포 정량화
CD3+/CD4+ 염색후 FACS 분석은 Wt 동물들에 비해, 누드 마우스내 T-헬퍼 세포수(CD3+/CD4+ 세포들)가 크게 감소한 것을 보여준다(도 19).
6.2.3 면역반응 분석
ACI-33 백신화에 의해 발생한 항-Tau5-20[pY18] IgG 역가를 분석하여, wt 및 누드 마우스에서 백신의 면역원성을 연구하였다. 누드의 항-Tau5-20[pY18] IgG 역가를 분석하여, ACI-33에 의해 유도된 반응이 T 세포 기능에 비의존성인지 여부를 연구하였다. 백신은 누드 마우스에서 항-Tau5-20[pY18] IgG 반응을 유도하였으며, 시험된 모든 시간지점에서 wt 또는 누드 마우스에서 ACI-33에 의해 유도된 항체 반응 사이에 큰 차이가 없었다(도 20; 누드 마우스와 wt 마우스 사이에 모든 채혈들에 대하여 2-방식 ANOVA P<0.05).
ACI-33 백신은 두 마우스 타입에서 항-Tau5-20[pY18] IgG 반응을 유도하고, 그후 피하 주사는 2회의 면역화후 피크를 나타냈다(d27)(도 20).
ACI-33 백신화는 누드 마우스와 wt 마우스 사이의 다른 IgG 서브클래스 및 IgM에 대하여 같은 프로필의 항체 역가를 유도했으며, 그에 따라, 백신의 3회의 피하 면역화후 2개의 마우스 타입들 사이에 큰 차이들이 없었다(도 21, 1-방식 ANOVA P>0.05 IgG1 누드 대 IgG1 야생형, lgG2a/2b 누드 대 lgG2a/2b 야생형, lgG3 누드 대 lgG3 야생형, IgM 누드 대 IgM 야생형). 두 마우스 타입에서, IgG2b 및 IgM에 비해, 훨씬 낮은 수준의 IgG1이 있었다(도 21, 1-방식 ANOVA, 누드 마우스: P<0.01 IgG1 대 IgG2b 또는 IgM; Wt 마우스: P<0.05 IgG1 대 IgG2b 또는 IgM). 그리고, 누드 마우스는 IgG3에 비해 매우 낮은 수준의 IgG1을 나타내고(도 21, 1-방식 ANOVA, 누드 마우스: P<0.05 IgG1 대 IgG3), IgG2a의 수준은 IgG2b, IgG3 및 IgM에 비해 낮았다(도 21, 1-방식 ANOVA, 누드 마우스: P<0.05 IgG2a 대 IgG2b, IgG3 또는 IgM).
ACI-33을 3회 피하주사한후 유도된 IgG 역가는 다른 Tau 단백질(항-Tau5-20 [pY18] 및 항-Tau5-20) 및 단백질(항-인산화 전체-길이 (441aa) Tau 단백질 = 항-pTau 단백질 및 항-전체-길이 (441aa) Tau 단백질 = 항-Tau 단백질)상에서 분석하였다(도 22). wt 마우스와 누드 마우스 사이의 단백질과 다른 펩티드들 상의 역가들에는 차이가 없었다. 누드 마우스 그룹에서, 항-Tau5-20 역가들보다 높은 항-Tau5-20 [pY18]에 있어서 큰 차이가 있었다(도 22, 1-방식 ANOVA, P<0.05 항-Tau5-20 [pY18] 역가들 대 항-Tau5-20 역가들).
6.3 결론
누드 마우스에서 CD3+ 및 CD4+ 세포들의 작은 비율에도 불구하고, ACI-33 백신은 로버스트 항-Tau5-20 [pY18] IgG 반응을 유도했다. 항체반응의 지속성 및 IgG 이소타입 분포는 wt 마우스 및 누드 마우스와 유사했으며, 이는 상기 변수들이 ACI-33 백신하의 문맥에서 T 세포들에 비의존성임을 보여준다. 면역-적격(immune-competent) 마우스에 비해, ACI-33 면역화는 T 세포가 결핍된 마우스에서 유사한 IgG 프로필로 동일한 항체 역가 및 동력학을 유도했다. 그리고, 다른 Tau 펩티드 및 단백질들 상에서의 항체 역가는 면역-적격 및 T-세포 결핍 마우스 사이에서 유사했다. 상기 데이터는 ACI-33이 누드 마우스와 wt 마우스 모두에서 T 세포-비의존성 항체반응을 유도했음을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> AC Immune SA <120> METHOD FOR THERAPEUTIC USE <130> R1512 PCT BS <150> 61/161,165 <151> 2009-03-18 <150> 61/256,028 <151> 2009-10-29 <160> 14 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> ACI-37 <220> <221> variation <222> (18)..(18) <223> /replace="phosphorylated serine" <220> <221> variation <222> (26)..(26) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 1 Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr 1 5 10 15 Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 20 25 30 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> ACI-33 <220> <221> variation <222> (14)..(14) <223> /replace="phosphorylated tyrosine" <400> 2 Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr Tyr Gly Leu 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> ACI-39 <220> <221> variation <222> (7)..(7) <223> /replace="phosphorylated threonine" <220> <221> variation <222> (9)..(9) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 3 Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> ACI-40 <220> <221> variation <222> (7)..(7) <223> /replace="phosphorylated serine" <220> <221> variation <222> (10)..(10) <223> /replace="phosphorylated threonine" <400> 4 Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> ACI-35 <220> <221> variation <222> (4)..(4) <223> /replace="phosphorylated serine" <220> <221> variation <222> (12)..(12) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 5 Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> ACI-36 <220> <221> variation <222> (4)..(4) <223> /replace="phosphorylated serine" <220> <221> variation <222> (9)..(9) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 6 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 1 5 10 15 Ile Asp <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> ACI-34 <220> <221> variation <222> (3)..(3) <223> /replace="phosphorylated serine" <220> <221> variation <222> (6)..(6) <223> /replace="phosphorylated threonine" <220> <221> variation <222> (13)..(13) <223> /replace="phosphorylated threonine" <220> <221> variation <222> (15)..(15) <223> /replace="phosphorylated serine" <400> 7 Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu 1 5 10 15 Pro <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><223> antigenic peptide A?1-15 <400> 8 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><223> antigenic peptide A?1-16 <400> 9 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><223> antigenic peptide A?1-16(?14) <400> 10 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His Gln Lys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><223> antigenic peptide A?4-11 <400> 11 Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu 1 5 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><223> antigenic peptide A?22-35 <400> 12 Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><223> antigenic peptide A?29-40 <400> 13 Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 1 5 10 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><223> antigenic peptide A?1-5 <400> 14 Asp Ala Glu Phe Arg 1 5

Claims (62)

  1. T-세포 비의존성 면역 반응을 필요로 하는 환자에서의 질병, 병태 또는 질환의 치료 시에 T-세포 비의존성 면역 반응을 유도하기 위한 변형된 항원을 포함하는 항원성 조성물로서, 상기 항원은 리포좀의 표면 상에 높은 반복 배열로 존재하는 것인 항원성 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    동물 또는 인간에게 사용하기 위한 항원성 조성물.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 조성물은 면역 자극제로서 효과적인 것인, 항원성 조성물.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는 면역 관용(immune tolerant) 환자인 것인, 항원성 조성물.
  5. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는 면역 타협(immunocompromised) 환자인 것인, 항원성 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 환자는 연령, HIV와 같은 질병 또는 암, 또는 이에 한정되는 것은 아니지만, 류마티스 관절염, 건선, 전신성 홍반성 낭창, 베게너 육아종증 등을 포함하는 염증성 질환들에 대한 치료와 같은 치료에 의해 손상된 면역계를 갖는 것인 항원성 조성물.
  7. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는 자가면역 질환으로 고통받는 것인, 항원성 조성물.
  8. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는 T-세포 활성화 환자인 것인, 항원성 조성물.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는 T-세포 결핍으로 고통받는 것인, 항원성 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 환자는 CD4 T-세포가 감소되어 있는 것인, 항원성 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 환자는 CD4 T-세포 상에 CD14 및/또는 CD40L의 감소된 발현을 나타내는 것인, 항원성 조성물.
  12. 청구항 9 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T-세포 결핍은 연령, 면역억제 또는 질병에 의해 유발되는 것인, 항원성 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 질병은 HIV, 암 또는 기타 악성종양인 것인, 항원성 조성물.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 T-세포 에피토프를 함유하지 않는 것인, 항원성 조성물.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 입체형태 항원(conformational antigen)이며, 상기 항원의 전부 또는 일부는 베타-시트 입체형태를 포함하는 것인, 항원성 조성물.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은, 리포좀 캐리어/애주벤트의 지질 이중층으로의 삽입을 용이하게 하는 친유성 또는 소수성 부분에 의해 변형되는 펩티드 항원인 것인, 항원성 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서,
    항원성 펩티드의, 및 그 펩티드가 부착되거나, 도입되거나 또는 재구성되는 캐리어/애주벤트의 전체 순전하와 결합하는 친유성 또는 소수성 부분의 규모는, 상기 항원성 펩티드가 높은 생물학적 활성 입체형태로 노출, 안정화 및 존재하게 하고, 이는 그 노출, 안정화 및 높은 생물학적 활성 입체형태로 항원성 구성체에 포함되는 항원성 결정인자와 목표 조직의 면역계가 자유롭게 상호작용하도록 하고, 이는 강한 면역 반응을 유도하도록 하는 것인, 항원성 조성물.
  18. 청구항 16 또는 청구항 17에 있어서,
    상기 친유성 또는 소수성 부분은 지방산, 트리글리세라이드, 디글리세라이드, 스테로이드, 스핑고리피드, 글리코리피드 또는 포스포리피드인 것인, 항원성 조성물.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 친유성 또는 소수성 부분은 지방산, 특히 10 이상의 탄소 원자의 탄소 백본을 갖는 지방산인 것인, 항원성 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 소수성 부분은 팔미트산인 것인, 항원성 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 펩티드 항원은 2개의 팔미트산 부분들을 포함하는 것인, 항원성 조성물.
  22. 청구항 20에 있어서,
    상기 펩티드 항원은 4개의 팔미트산 부분들을 포함하는 것인, 항원성 조성물.
  23. 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리포좀 제제는 애주벤트, 특히 지질 A, 특히 해독된 지질 A, 예컨대 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A 또는 알룸을 포함하는 것인, 항원성 조성물.
  24. 청구항 14 내지 청구항 24 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 펩티드는 아밀로이드 단백질 또는 아밀로이드-유사 단백질, 예컨대 프리온 단백질, 타우 단백질, α-시누클레인, 헌팅턴으로부터 유도된 펩티드인 것인, 항원성 조성물.
  25. 청구항 24에 있어서,
    항원성 구성체가 Aβ 펩티드의 N-말단으로부터 유도된 반복성 Aβ 펩티드 단편을 포함하는 Aβ 항원성 구성체인 것인, 항원성 조성물.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 Aβ 펩티드의 N-말단은 :
    a. Aβ 1-30;
    b. Aβ 1-20;
    c. Aβ 1-16
    을 포함하는 것인, 항원성 조성물.
  27. 청구항 25에 있어서,
    상기 Aβ 펩티드 단편은 :
    a. 4 내지 20 아미노산;
    b. 5 내지 16 아미노산;
    c. 6 내지 12 아미노산;
    d. 4 내지 8 아미노산
    을 포함하는 것인, 항원성 조성물.
  28. 청구항 25에 있어서,
    상기 Aβ 펩티드 단편은 :
    a. Aβ1-15;
    b. Aβ1-16;
    c. Aβ1-5
    인 것인, 항원성 조성물.
  29. 청구항 1 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원성 구성체는 단백질 타우의 주요한 병리학적 포스포-에피토프를 모사하는 포스포-펩티드인 항원성 펩티드를 포함하는 것인, 항원성 조성물.
  30. 청구항 29에 있어서,
    상기 타우 단백질은 인간 단백질인 것인, 항원성 조성물.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 타우 단백질은 95 % 이상의 서열 번호 2에 대한 아미노산 서열 유사성(identity)을 가지며, 실질적으로 서열번호 2의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 2의 아미노산 잔기 18(P-Tyr18)에 상응하는 아미노산 잔기가 인산화되어 있는(T1) 것인, 항원성 조성물.
  32. 청구항 30에 있어서,
    상기 타우 단백질은 95 % 이상의 서열 번호 3에 대한 아미노산 서열 유사성을 가지며, 실질적으로 서열번호 3의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 3의 아미노산 잔기 212(P-Thr212) 및 214(P-Ser214)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상, 특히 2 이상이 인산화되어 있는 것인, 항원성 조성물.
  33. 청구항 30에 있어서,
    상기 타우 단백질은 95 % 이상의 서열 번호 4에 대한 아미노산 서열 유사성을 가지며, 실질적으로 서열번호 4의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 4의 아미노산 잔기 202(P-Ser202) 및 205(P-Thr205)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상, 특히 2 이상이 인산화되어 있는 것인, 항원성 조성물.
  34. 청구항 30에 있어서,
    상기 타우 단백질은 95 % 이상의 서열 번호 5에 대한 아미노산 서열 유사성을 가지며, 실질적으로 서열번호 5의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 5의 아미노산 잔기 396(P-Ser396) 및 404 (P-Ser404)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상, 특히 모든 아미노산 잔기가 인산화되어 있는 것인, 항원성 조성물.
  35. 청구항 30에 있어서,
    상기 타우 단백질은 95 % 이상의 서열 번호 6에 대한 아미노산 서열 유사성을 가지며, 실질적으로 서열번호 6의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 6의 아미노산 잔기 404(P-Ser404) 및 409(P-Ser409)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상, 특히 모든 아미노산 잔기가 인산화되어 있는 것인, 항원성 조성물.
  36. 청구항 30에 있어서,
    상기 타우 단백질은 95 % 이상의 서열 번호 7에 대한 아미노산 서열 유사성을 가지며, 실질적으로 서열번호 7의 상기 항원성 펩티드와 동일한 면역원성 활성을 가지며, 서열번호 7의 아미노산 잔기 202(P-Ser202), 205(P-Thr205), 212(P-Thr212), 및 214(P-Ser214)에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 이상, 특히 2 이상, 특히 3 이상, 특별히 모든 아미노산 잔기가 인산화되어 있는 것인, 항원성 조성물.
  37. 청구항 30에 있어서,
    상기 타우 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것인, 항원성 조성물.
  38. 청구항 30에 있어서,
    상기 타우 단백질은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것인, 항원성 조성물.
  39. 청구항 30에 있어서,
    상기 타우 단백질은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것인, 항원성 조성물.
  40. 청구항 30에 있어서,
    상기 타우 단백질은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 것인, 항원성 조성물.
  41. 청구항 30에 있어서,
    상기 타우 단백질은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 것인, 항원성 조성물.
  42. 청구항 30에 있어서,
    상기 타우 단백질은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것인, 항원성 조성물.
  43. 청구항 24 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질과 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 질환 또는 질병으로 고통받는 것인, 항원성 조성물.
  44. 청구항 29 내지 청구항 42 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는 타우 또는 타우-유사 단백질과 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 질환 또는 질병으로 고통받는 것인, 항원성 조성물.
  45. 청구항 43에 있어서,
    아밀로이드-관련 질환 또는 질병은 개체, 특히 동물 또는 인간에서의 인지적 기억 용량의 손실을 특징으로 하는 것인, 항원성 조성물.
  46. 청구항 45에 있어서,
    상기 질환은 아밀로이드증 그룹을 형성하는 질환 또는 질병인 것인, 항원성 조성물.
  47. 청구항 46에 있어서,
    상기 질환은 신경학적 질환인 것인, 항원성 조성물.
  48. 청구항 47에 있어서,
    상기 질환은 알쯔하이머 질환(AD), 경도인지장애(MCI), 루이소체성 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증을 갖는 유전성 뇌출혈(네덜란드 타입); 괌 파킨슨-치매 복합증(Guam Parkinson-Dementia complex); 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥 병, 파킨슨 병, HIV-관련 치매, ALS(근위축성 측삭경화증), 성인 발병형 당뇨병; 노인성 심아밀로이드증; 내분비계 종양, 뇌졸증, 외상성 뇌손상, 황반변성 및 녹내장으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 질환 또는 질병인 것인, 항원성 조성물.
  49. 청구항 48에 있어서,
    상기 질병은 알쯔하이머 질환인 것인, 항원성 조성물.
  50. 청구항 44에 있어서,
    타우-관련 질환 또는 질병은 신경퇴행성 질병인 것인, 항원성 조성물.
  51. 청구항 50에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질병 또는 질환은 신경섬유 병변의 형성과 관련되거나 또는 이로 인해 유발되는 것인, 항원성 조성물.
  52. 청구항 51에 있어서,
    신경퇴행성 질병 또는 질환은 타우파시(tauopathy)인 것인, 항원성 조성물.
  53. 청구항 52에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질병 또는 질환은 알쯔하이머 질환, 크로이츠펠트-야콥 병, 투사형 치매, 다운 증후군, 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커 병, 봉입체 근염 및 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 외상성 뇌손상, 근위축성 측삭경화증/괌 파킨슨-치매 복합증, 신경섬유원 농축을 갖는 비-괌마니안 운동 뉴런 질환(Non-Guamanian motor neuron disease), 은친화성 과립 치매, 피질기저퇴화, 석회화가 있는 미만성 신경섬유원 농축, 크로모좀 17과 결합된 파킨슨병을 갖는 전두측두엽성 치매, 할러보든-슈파쯔 증후군, 다계통위축, 니만-피크 병, 타입 C, 피크 병, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상 마비, 아급성경화성범뇌염, 다발만의 치매(Tangle only dementia), 뇌염후 파킨슨증, 근이양증으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인, 항원성 조성물.
  54. 청구항 53에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질병은 알쯔하이머 질환인 것인, 항원성 조성물.
  55. 청구항 1 내지 청구항 54 중 어느 한 항에 있어서,
    개체, 특히 동물 또는 인간은 임의의 유해 염증성 효과를 나타내지 않는 것인, 항원성 조성물.
  56. 면역 관용 환자, 특히 동물 또는 인간에서 상기 환자의 면역 관용을 극복하거나 감소시키기 위해, 질환, 병태 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조를 위해 청구항 1 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 따른 변형된 항원을 포함하는 항원성 조성물의 사용 방법으로서, 상기 항원은 높은 반복 배열로 리포좀 표면 상에 존재하는 것인, 방법.
  57. 환자에서 T-세포 반응의 과자극을 피하기 위해서, T-세포 활성화 환자, 특히 동물 또는 인간의 질환, 병태 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조를 위해 청구항 1 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 따른 변형된 항원을 포함하는 항원성 조성물을 사용하는 방법으로서, 상기 항원은 높은 반복 배열로 리포좀 표면 상에 존재하는 것인, 방법.
  58. 환자에서의 질환, 병태 또는 질병의 치료 시에 환자의 면역 관용을 극복하거나 감소시키는 방법으로서, 청구항 1 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 따른 변형된 항원을 포함하는 항원성 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항원은 높은 반복 배열로 리포좀 표면 상에 존재하는 것인, 방법.
  59. 환자에서의 질환, 병태 또는 질병의 치료시에 T-세포 반응의 과자극을 회피하기 위한 방법으로서, 청구항 1 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 따른 변형된 항원을 포함하는 항원성 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항원은 높은 반복 배열로 리포좀 표면 상에 존재하는 것인, 방법.
  60. 청구항 58 또는 청구항 59에 있어서,
    IgG 및/또는 IgM의 항체 농도를 측정함으로써 개체에서 면역 반응을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  61. 환자에서의 질환, 병태 또는 질병의 치료시에 T-세포 결핍으로 고통받는 면역 관용 환자에서 T-세포 비의존성 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 청구항 1 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 따른 변형된 항원을 포함하는 항원성 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항원은 높은 반복 배열로 리포좀의 표면 상에 존재하는 것인, 방법.
  62. 환자에서의 질환, 병태 또는 질병의 치료시에 T-세포 활성화 환자에서 T-세포 비의존성 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 청구항 1 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 따른 변형된 항원을 포함하는 항원성 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항원은 높은 반복 배열로 리포좀의 표면 상에 존재하는 것인, 방법.
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