ES2252438T3

ES2252438T3 - Procedimiento para la identificacion, aislamiento y produccion de antigenos para un patogeno especifico.

Info

Publication number: ES2252438T3
Application number: ES02716669T
Authority: ES
Inventors: Andreas Meinke; Eszter Nagy; Uwe; Von Ahsen; Christoph Klade; Tamas Henics; Wolfgang Zauner; Duc Bui Minh; Oresta Vytvytska; Hildegard Etz; Agnieszka Dryla; Thomas Weichhart; Martin Hafner; Brigitte Tempelmaier; Claire M. Fraser; Steven Gill
Original assignee: Intercell Austria AG
Current assignee: Valneva Austria GmbH
Priority date: 2001-01-26
Filing date: 2002-01-21
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2022-01-21
Also published as: KR100901915B1; US20050037444A1; US20110020402A1; WO2002059148A2; EP1630172A2; AU2007234519A1; ZA200305764B; PL214482B1; IL186706A0; EP1616876A2; AU2007234519B2; US20130034575A1; SK10492003A3; CA2436057A1; CA2436057C; US8715688B2; IL157082A0; HUP0402048A2; US7771728B2; WO2002059148A3

Abstract

Procedimiento para la identificación, aislamiento y producción de antígenos reactivos en suero hiperinmunes de un patógeno, siendo dichos antígenos adecuados para uso en una vacuna para un tipo dado de animal o para seres humanos, caracterizado por las siguientes etapas: proporcionar una preparación de anticuerpos a partir de una combinación de plasma de dicho tipo dado de plasma animal o de un ser humano o suero individual con anticuerpos contra dicho patógeno específico, u proporcionar al menos una librería de expresión de superficie bacteriana de dicho patógeno específico, u seleccionar dicha al menos una librería de expresión de superficie bacteriana con dicha preparación de anticuerpos, u identificar los antígenos que se unen en dicha selección a anticuerpos en dicha preparación de anticuerpos u seleccionar los antígenos identificados con preparaciones de anticuerpos individuales de suero individual de individuos con antígenos contra dicho patógeno específico, u identificar la porción antigénica reactiva en suero hiperinmune de dichos antígenos identificados y dichos antígenos reactivos de sueros hiperinmunes se unen a una parte relevante de dichas preparaciones de anticuerpos individuales de dicho suero individual y u opcionalmente aislar dichos antígenos reactivos de sueros hiperinmunes y producir dichos antígenos reactivos en suero hiperinmune mediante procedimientos químicos o recombinantes, con tal que dicho suero individual sea de pacientes que muestran un título de anticuerpo contra dicho patógeno específico sea mayor que el percentil 90 y un título de IgG superior a 10000 U.

Description

Procedimiento para la identificación, aislamiento y producción de antígenos para un patógeno específico.

La invención se refiere a un procedimiento para identificación, aislamiento y producción de antígenos para un patógeno específico.

Las vacunas pueden salvar más vidas (y recursos) que cualquier otra intervención médica. Debido a los programas de vacunación por todo el mundo la incidencia de muchas enfermedades fatales se ha disminuido drásticamente. Aunque esta noción es válida para un panel entero de enfermedades, por ejemplo, difteria, tos ferina, sarampión y tétanos, no existen vacunas eficaces para numerosas enfermedades infecciosas incluyendo las infecciones más virales, tales como VIH, VCH, VCM y muchas otras. No existen vacunas eficaces para otras enfermedades, infecciosas o no infecciosas, reivindicando las vidas de millones de pacientes al año incluyendo malaria o cáncer. Además, la rápida emergencia de bacterias y microorganismos resistentes a antibióticos reclama tratamientos alternativos con vacunas que son una elección lógica. Finalmente, la gran necesidad de vacunas también se ilustra por el hecho de que las enfermedades infecciosas, en lugar de los trastornos cardiovasculares o cáncer o lesiones son la causa mayor de muerte y discapacidad en el mundo.

Varias vacunas establecidas constan de organismos atenuados vivos en los que existe el riesgo de reversión a la cepa de tipo salvaje virulento. En particular en los huéspedes inmunocomprometidos esto puede ser un escenario vivo amenazador. Como alternativa, las vacunas se administran como una combinación de antígenos derivados de patógenos junto con compuestos que inducen o potencian respuestas inmunes contra estos antígenos (estos compuestos se denominan comúnmente adyuvante), ya que estas vacunas subunitarias en sí mismas no son eficaces generalmente.

Aunque no existe duda de que las vacunas anteriores son tratamientos médicos valiosos, existe la desventaja de que, debido a su complejidad se pueden evocar efectos secundarios graves, por ejemplo, a antígenos que están contenidos en la vacuna que muestran reactividad cruzada con moléculas expresadas por las células de individuos vacunados. Además, los requerimientos existentes de las autoridades reguladoras, por ejemplo la Organización Mundial de la salud (OMS), la Administración de Alimentos y fármacos (FDA), y sus homólogos europeos, para la especificación exacta de composición de vacunas y mecanismos de inducción o inmunidad, son difíciles de cumplir.

Algunas vacunas ampliamente usadas son vacunas de células enteras (bacterias o virus atenuados) (por ejemplo, Bacile Calmette-Guerin (BCG) (tuberculosis), sarampión, paperas, rubéola, vacuna de polio oral (Sabin), bacterias o virus muertos (por ejemplo, tos ferina, vacuna de polio inactivada (Salk), vacunas subunitarias (por ejemplo, toxoide (difteria, tétanos)), polisacárido capsular (H. influenzae tipo B), subunidad recombinante de levadura (proteína de superficie de Hepatitis B).

Una vacuna puede contener una variedad completa de antígenos diferentes. Los ejemplos de antígenos u organismos muertos enteros tales como virus o bacterias inactivados, hongos, protozoos o incluso células cancerosas. Los antígenos también pueden consistir en subfracciones de estos organismos/tejidos, de proteínas, o, en su forma más simple, de péptidos. Los antígenos también pueden ser reconocidos por el sistema inmune en forma de proteínas glicosiladas o también pueden ser o contener polisacáridos o lípidos. Los péptidos cortos de pueden usar ya que por ejemplo células T citotóxicas (CTL) reconocen antígenos en forma de aminoácidos cortos usualmente 8-11 aminoácidos de longitud junto con complejo principal de histocompatibilidad (MCH). Las células B pueden reconocer epítopes lineales tan cortos como 4-45 aminoácidos, así como estructuras tridimensionales (epítopes conformacionales). Con el fin de obtener, respuestas inmunes específicas de antígeno, sostenidas, los adyuvantes necesitan desencadenar cascadas inmunes que implican todas las células de sistema inmune necesario. Principalmente, los adyuvantes actúan, pero no están restringidos en su modo de acción, sobre los llamados células presentadoras de antígenos (APC). Estas células usualmente primero encuentran el (los) antígeno(s) seguido de la presentación de antígeno procesado o no modificado a las células efectoras inmunes. Los tipos de células intermedias también pueden estar implicadas. Solamente las células efectoras con la especificidad apropiada se activan en una respuesta inmune productiva. El adyuvante también puede retener localmente antígenos y co-inyectar otros factores. Además el adyuvante puede actuar como un quimioatrayente para otras células inmunes o puede actuar localmente y/o de manera sistémica como un agente estimulante para el sistema inmune.

Las células presentadoras de antígenos pertenecen al sistema inmune innato, que se ha desarrollado como una defensa de huésped de primera línea que limita la infección temprana después de la exposición al microorganismo. Las células del sistema inmune innato reconocen patrones o estructuras relativamente específicas en sus dianas en lugar de estructuras específicas más sofisticadas que son reconocidas por el sistema inmune adaptativo. Los ejemplos de células del sistema inmune innato son macrófagos y células dendríticas pero también son granulocitos (por ejemplo neutrófilos), células naturales asesinas y otras. Por el contrario, las células del sistema inmune adaptativo reconocen estructuras específicas, antigénicas, incluyendo péptidos, en el caso de células T y péptidos así como estructuras tridimensionales en el caso de células B. El sistema inmune adaptativo es mucho más específico y sofisticado que el sistema inmune innato y mejora tras la exposición repetida a un patógeno/antígeno dado. Filogenéticamente, el sistema inmune innato es mucho más antiguo y se puede encontrar ya en organismos muy primitivos. No obstante, el sistema inmune innato es crítico durante la fase inicial de la exposición antigénica ya que, además de contener patógenos, las células del sistema inmune innato, es decir APC, ceba las células del sistema inmune innato y de esta manera desencadena respuestas inmunes específicas que conducen a la eliminación de intrusos. En suma, las células del sistema innato inmune y en particular las APC juegan un papel crítico durante la fase de inducción de respuestas inmunes mediante a) conteniendo infecciones por medio de un sistema de reconocimiento patrón primitivo y b) cebando las células del sistema inmune adaptativo que conduce a respuestas inmunes específicas y memoria que da como resultado la eliminación de patógenos intrusos o de otras dianas. Estos mecanismos también pueden ser importantes para eliminar o contener células tumorales.

Los antígenos usados para tales vacunas se han seleccionado a menudo por su posibilidad o por su facilidad de disponibilidad. Existe una demanda para identificar antígenos eficaces para un patógeno dado o preferiblemente un conjunto casi completo de todos los antígenos de un patógeno dado que son prácticamente (clínicamente) relevantes. Tales antígenos pueden ser candidatos de antígenos preferidos en una vacuna.

Es por lo tanto un objeto de la presente invención cumplir con estas demandas y proporcionar un procedimiento con los que tales antígenos se puedan proporcionar y con los que un conjunto prácticamente completo de antígenos, por ejemplo, un patógeno dado se pueda identificar con un suero dado como fuente de anticuerpos. Tal procedimiento deberías ser adecuado para cambiar rápidamente patógenos que desarrollan una rápida resistencia contra fármacos o vacunas comunes. El procedimiento también debe ser aplicable para identificar y aislar antígenos de tumores, alérgenos, antígenos autoinmunes.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para la identificación, aislamiento y producción de antígenos reactivos al suero hiperinmunes a partir de un patógeno, siendo dichos antígenos adecuados para uso en una vacuna para un tipo dado de animal o para seres humanos, caracterizado por las siguientes etapas:

\bullet: proporcionar una preparación de anticuerpos a partir de una combinación de plasma de dicho tipo dado de plasma animal o de un ser humano o suero individual con anticuerpos contra dicho patógeno específico,

\bullet: proporcionar al menos una librería de expresión de superficie bacteriana de dicho patógeno específico,

\bullet: seleccionar dicha librería de expresión de superficie bacteriana con dicha preparación de anticuerpos,

\bullet: identificar los antígenos que se unen en dicha selección a anticuerpos en dicha preparación de anticuerpos,

\bullet: seleccionar los antígenos identificados con preparaciones de anticuerpos de sueros individuales con anticuerpos contra dicho patógeno específico,

\bullet: identificar la porción antigénica reactiva de suero hiperinmune de dichos antígenos identificados y dichos antígenos reactivos de sueros hiperinmunes se unen a una parte relevante de dichas preparaciones de anticuerpos individuales de dicho suero individual y

\bullet: opcionalmente aislar dichos antígenos reactivos de sueros hiperinmunes y producir dichos antígenos reactivos de suero hiperinmune mediante procedimientos químicos o recombinantes, con tal que dicho suero individual sean de pacientes que muestran un título de anticuerpo contra dicho patógeno específico sea mayor que el percentil 90 y un título de IgG superior a 10000 U.

Este procedimiento también es adecuado en general para identificar un conjunto prácticamente completo de antígenos reactivos de sueros hiperinmunes de un patógeno específico con suero dado como fuentes de anticuerpos, si se seleccionan al menos tres librerías de expresión diferentes en un programa de identificación de patógeno/antígeno usando el procedimiento de acuerdo con la presente invención. La presente invención por lo tanto también se refiere a un procedimiento de identificación, aislamiento y producción de un conjunto prácticamente completo de antígenos reactivos de sueros hiperinmunes de un patógeno específico, siendo dichos antígenos adecuados para uso en una vacuna para un tipo dado de animal o para seres humanos, caracterizado por las siguientes etapas:

\bullet: proporcionar una preparación de anticuerpos a partir de una combinación de plasma de dicho tipo dado de plasma animal o de seres humanos o suero individual con anticuerpos contra dicho patógeno específico,

\bullet: proporcionar al menos tres librerías de expresión de dicho patógeno específico siendo al menos uno una librería de expresión de superficie bacteriana,

\bullet: seleccionar dichas al menos tres librerías de expresión diferentes con dicha preparación de anticuerpos,

\bullet: identificar los antígenos que se unen en al menos una de dichas al menos tres selecciones a anticuerpos en dicha preparación de anticuerpos,

\bullet: seleccionar los antígenos identificados con preparaciones de anticuerpos individuales de suero individual a partir de individuos con anticuerpos contra dicho patógeno específico,

\bullet: identificar la porción antigénica reactiva de suero hiperinmune de dichos antígenos identificados con dichos antígenos reactivos de sueros hiperinmunes se unen a una parte relevante de dichas preparaciones de anticuerpos individuales de dicho suero individual,

\bullet: repetir dichas etapas de selección e identificación al menos una vez,

\bullet: comparar los antígenos reactivos de sueros hiperinmunes identificados en las etapas de selección e identificación repetidas con los antígenos reactivos de sueros hiperinmunes en las etapas de selección e identificación iniciales,

\bullet: adicionalmente repetir dichas etapas de selección e identificación, si al menos un 5% de los antígenos reactivos de sueros hiperinmunes se han identificado en las etapas de selección e identificación solamente, hasta que al menos un 5% de los antígenos reactivos de sueros hiperinmunes se identifiquen en una etapa de repetición adicional solamente para obtener un conjunto completo de antígenos reactivos de sueros hiperinmunes de un patógeno específico y

El procedimiento de acuerdo con la presente invención consta principalmente de tres partes esenciales, a saber 1. identificar fuentes de suero hiperinmune que contienen anticuerpos específicos contra un patógeno dado, 2. seleccionar una librería de expresión de superficie bacteriana con una preparación de anticuerpos adecuada en la que se seleccionan antígenos adecuados (o fragmentos antigénicos de tales antígenos), y 3. en una segunda ronda de selección, en la que los antígenos reactivos de sueros hiperinmunes se identifican mediante su capacidad de unirse a una porción relevante de preparaciones de anticuerpos individuales de sueros individuales con el fin de mostrar que estos antígenos son prácticamente relevantes y no solamente reactivos de sueros hiperinmunes, pero también ampliamente inmunogénicos (es decir, una gran cantidad de sueros individuales reaccionan con un antígeno dado). Con el presente procedimiento es posible proporcionar un conjunto de antígenos de un patógeno dado que es prácticamente completo con respecto al patógeno elegido y el suero elegido. Por lo tanto, una preferencia con respecto a candidatos de antígenos "erróneos" o un conjunto incompleto de antígenos de un patógeno dado está excluido por el presente procedimiento.

La integridad del conjunto de antígenos de un patógeno dado dentro del significado de la presente invención es, naturalmente, dependiente de la integridad de las librerías de expresión usadas en el presente procedimiento y sobre al calidad y tamaño de colecciones de suero (número de plasmas/sueros individuales) ensayados, ambos con respecto a la representabilidad de la librería y utilidad del sistema de expresión. Por lo tanto, las realizaciones preferidas del presente procedimiento se caracterizan en que al menos una de dichas librerías de expresión se selecciona entre una librería de superficie bacteriana.

Una colección de sueros usada en la presente invención se debe ensayar contra un panel de compuestos antigénicos conocidos de un patógeno dado, tal como polisacárido, lípido y componentes proteináceos de la pared celular, membranas celulares y citoplasma, así como productos secretados. Preferiblemente, se usan tres colecciones de sueros diferentes: 1. Con repertorio de anticuerpos muy estables: adultos normales, personas clínicamente saludables, que superan los encuentros previos o vehículos actualmente de por ejemplo, un patógeno dado sin enfermedad y síntomas agudos, 2. Con anticuerpos inducidos de manera aguda por la presencia del organismo patógeno: pacientes con enfermedades agudas con diferentes manifestaciones (por ejemplo, S. aureus sepsis o infección de heridas, etc.), 3. Sin anticuerpos específicos del todo (como controles negativos): niños de 5-8 meses de edad que pierden las inmunoglobulinas transmitidas por vía maternal 5-6 meses después de nacer. Los sueros tienen que reaccionar con múltiples antígenos específicos de patógenos con el fin de considerarse inmune para un patógeno dado (bacteria, hongos, gusano u otro), y para que sea relevante en el procedimiento de selección de acuerdo con la presente invención.

En el programa de identificación de antígeno para identificar un conjunto completo de antígenos de acuerdo con la presente invención, se prefiere que dichas al menos tres librerías de expresión diferentes sean al menos una librería de representación ribosomal, una librería de superficie bacteriana y un proteonema, siendo al menos una librería de expresión de superficie bacteriana. Se ha observado que aunque todas las librerías de expresión pueden estar completas, usando solamente una o dos librerías de expresión en un programa de identificación de antígenos no conducirá a un conjunto completo de antígenos debido a las propiedades de expresión preferenciales de cada una de las librarías de expresión diferentes. Mientras es por lo tanto posible obtener antígenos reactivos de sueros hiperinmunes usando solamente una o dos librerías de expresión diferentes, esto podría en muchos casos no dar como resultado finalmente la identificación de un conjunto completo de antígenos reactivos de sueros hiperinmunes. De hecho, el término "completo" de acuerdo con la presente invención no indica un máximo teórico pero es sin duda una integridad práctica, es decir, que al menos un 95% de los antígenos prácticamente relevantes o determinantes antigénicos se han identificado de un patógeno dado. La relevancia práctica se define por lo tanto mediante la existencia de anticuerpos contra antígenos dados en la población de los pacientes.

De acuerdo con la presente invención también fluidos que contienen combinaciones de sueros o fracciones de plasmas u otros anticuerpos combinados son "combinaciones de plasma".

Una librería de expresión como se usa en la presente invención al menos debe permitir la expresión de todos los antígenos potenciales, por ejemplo, todas las proteínas de superficie de un patógeno dado. Con las librerías de expresión de acuerdo con la presente invención, se proporciona al menos un conjunto de antígenos potenciales de un patógeno dado, siendo este conjunto preferiblemente el complemento teórico completo de polipéptidos codificados por el genoma del patógeno (es decir, librerías genómicos como se describe en el ejemplo 2) y se expresa a bien en un huésped recombinante (véase el ejemplo 1) o in vitro (véase el ejemplo 4). Este conjunto de antígenos potenciales también puede ser una preparación de proteínas, en el caso de patógenos extracelulares preferiblemente una preparación de proteínas que contiene proteínas de superficie de dicho patógeno obtenido a partir de dicho patógeno en condiciones fisiológicos definidos (véase el ejemplo 5). Aunque el planteamiento genómico tiene el potencial de contener el conjunto completo de antígenos, el último tiene la ventaja de contener las proteínas en su estado natural, es decir, incluyendo por ejemplo modificaciones post-traduccionales o formas procesadas de estas proteínas, no obvio a partir de la secuencia de ADN. Éstos u otros cualesquiera conjuntos de antígenos potenciales a partir de un patógeno, un tumor, un alérgeno o un tejido o huésped propenso a autoinmunidad son de aquí en adelante denominados "librería de expresión". Las librerías de expresión de tipos muy diferentes se pueden aplicar en el curso de la presente invención. Los ejemplos adecuados se proporcionan por ejemplo en Ausubel y col., 1994. Las librerías de expresión especialmente preferidas que representan una representación del conjunto genético de un patógeno en forma recombinante tal como técnicas de traducción in vitro, por ejemplo representación episomal, o sistemas de expresión procarióticos, por ejemplo, librerías de expresión de superficie bacteriana o que parecen estados de expresión fisiológicos específicos de un patógeno dado en un estado fisiológico dado, tal como un proteonema.

La representación ribosomal en un procedimiento establecido en una tecnología de ADN recombínate, que es aplicable para cada patógeno específico para el objeto de la presente invención (Schaffitzel y col.,). Las librerías de representación de superficie bacteriana se representarán por una librería recombinante de un huésped bacteriano que representa un (total) conjunto de secuencias péptidicas expresadas de un patógeno dado sobre por ejemplo, una proteína de membrana exterior seleccionada en la membrana del huésped bacteriano (Georgiou y col., 1997). Aparte de la representación de las secuencias péptido o proteínas en una proteína de membrana externa, otras técnicas de representación, tal como tecnologías de representación de bacteriófagos y expresión mediante proteínas exportadas también son preferidas como librería de expresión de superficie bacteriana (Forrrer y col., 1999; Rodi y Makowski, 1993; Georgiou y col., 1997).

La preparación de antígenos para la primera ronda de selección en el procedimiento de acuerdo con la presente invención se puede derivar a partir de una fuente que contiene anticuerpos para un patógeno dado. Preferiblemente, si se usa una combinación de plasma como una fuente para la preparación de anticuerpos, se selecciona una combinación de plasma humano que comprende dadores que han experimentado o están experimentando una infección con el patógeno dado. Aunque tal selección se plasma o combinaciones de plasma es en principio tecnología habitual en por ejemplo la producción de preparaciones de hiperinmunoglobulina, era sorprendente que tales tecnologías tienen estos efectos como se muestra especialmente para las realizaciones preferidas de la presente invención.

Preferiblemente las librerías de expresión son librerías de expresión genómicas de un patógeno dado, o como alternativa librerías de ARN m. Se prefiere que estas librerías genómicas o de ARN son librerías completas genómicas o de expresión de ARN m que significa que contienen al menos una vez todas las proteínas posibles, péptidos o fragmentos de péptidos del patógeno dado se pueden expresar. Preferiblemente las librerías de expresión genómica muestran una redundancia de al menos 2 x, más preferiblemente al menos 5 x, especialmente al menos 10 x.

Preferiblemente, los procedimientos de acuerdo con la presente invención comprenden la selección de al menos una libraría de representación ribosomal, una librería de representación de superficie bacteriana y un proteonema con la preparación de anticuerpos e identificación de antígenos que se unen en al menos dos, siendo al menos una librería de representación de superficie bacteriana preferiblemente que se une a todas, de dichas selecciones a anticuerpos en dicha preparación de anticuerpos. Tales antígenos se pueden considerar entonces extremadamente adecuadas como antígenos hiperinmunogénicos independientemente de su modo de expresión.

El procedimiento de acuerdo con la presente invención se puede aplicar a cualquier patógeno dado. Por lo tanto, los patógenos preferidos se seleccionan a partir del grupo de patógenos bacteriano, virales, fúngicos y protozoarios. El procedimiento de acuerdo con la presente invención es también aplicable a cáncer, es decir para la identificación de antígenos asociados a tumores, y para la identificación de alérgenos o antígenos implicados en enfermedades autoinmunes. De hecho, especialmente los procedimientos recombinantes son bastante simples para los patógenos que tienen un genoma pequeño o un número comparativamente pequeño de proteínas expresadas (tales como patógenos bacterianos o virales) y son más complicados para organismos complejos (eucarióticos) que tienen grandes genomas. Sin embargo, también tales librería genómicas grandes de patógenos de organismos superiores se pueden analizar bien con el procedimiento de acuerdo con la presente invención, al menos de una forma más rápida y fiable que con procedimientos conocidos para identificar antígenos adecuados.

Los patógenos preferidos a analizar o cuyos antígenos se van a extraer, respectivamente, incluyen virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de hepatitis A (VAH), virus de hepatitis B (VBH), virus de hepatitis C (VHC), virus de sarcoma de Rous (VSR), virus de Epstein Barr (VEB), virus de la gripe (VI), rotavirus (RV), Staphylococcus aureus (S. aureus), Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis), Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae), Chlamydia trachomatis (C. trachomatis), Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), Mycobacterium leprae (M. leprae), Stretococcus pneumoniae (S. pneumoniae), Streptococcus pyogenes (S. pyogenes), Streptococcus agalactiae (S. Agalactiae), Enterococcus faecalis (E. faecalis), Bacillus anthracis (B. antharacis), Vibrio cholerae (V. cholerae), Borrelia burgdorferi (B. burgdorferi), Plasmodium sp., (enfermedades fúngicas tales como Pneucystis carinii, Aspergillus sp., Cryptococcus sp., Candida albicans o infecciones parasíticas tales como ascariasis (Ascaris lumbricoides) y teniasis (Taenia saginata). El procedimiento de acuerdo con la presente invención es más aplicable a bacterias, gusanos o candida.

Como un organismo modelo para la presente aplicación se ha elegido Staphylococcus aureus para demostrar la aplicabilidad y eficacia del procedimiento de acuerdo con la presente invención. Especialmente respecto a los ejemplos es evidente que la invención es fácilmente transferible a todos los patógenos potenciales, especialmente los enumerados anteriormente.

Era sorprendente que el procedimiento de acuerdo con la presente invención permite una selección eficaz y rápida de un patógeno dado, especialmente en vista del hecho de que solamente una pequeña fracción de un repertorio de anticuerpos de paciente se dirige a un patógeno dado, incluso en un estado en el que este patógeno es vencido. Se ha descubierto dentro del curso de la presente invención, especialmente durante al realización del ejemplo con S. aureus que solamente entre un 1-2% del repertorio de anticuerpos de un paciente que tiene títulos altos contra S. aureus son de hecho anticuerpos dirigidos contra S. aureus. Además, sobre el 70% de este 1% específico se dirige contra antígenos no proteicos, tales como ácido teicoico, se manera que solamente un total de 0,1% o menos de los anticuerpos se dirigen a antígenos proteináceos.

Una de las ventajas de usar librerías de expresión recombinantes, especialmente librerías de representación de ribosomas y librerías de representación de superficie bacteriana, es que los antígenos reactivos de suero hiperinmunes identificados se pueden producir de manera instantánea mediante la expresión de las secuencias codificadoras y clones seleccionados que expresan los antígenos reactivos de suero hiperinmunes sin tecnología de ADN recombinante adicional o etapas de clonación respectivamente.

Los antígenos reactivos de suero hiperinmunes obtenibles mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invención se pueden por lo tanto terminar inmediatamente para una preparación farmacéutica, preferiblemente mediante la adición de un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, inmediatamente después de su producción (en el curso de la segunda etapa de selección), por ejemplo mediante la expresión de la plataforma de la librería de expresión.

Preferiblemente, la preparación farmacéutica que contiene el antígeno reactivo de suero hiperinmune es una vacuna para prevenir o tratar una infección con el patógeno específico para el que se han seleccionado los antígenos.

La preparación farmacéutica puede contener cualesquiera sustancias auxiliares adecuadas, tales como sustancias tampón, estabilizadores o ingredientes activos adicionales, especialmente ingredientes conocidos con respecto a la producción de vacunas.

Un vehículo o excipiente preferible para los antígenos reactivos de suero hiperinmunes de acuerdo con la presente invención es un compuesto inmunoestimulador para la estimulación adicional de la respuesta inmune al antígeno reactivo de suero hiperinmune dado. Preferiblemente, el compuesto inmunoestimulador en la preparación farmacéutica de acuerdo con la presente invención se selecciona entre el grupo de sustancias policatiónicas, especialmente péptidos policatiónicas, desoxinucleótidos inmunoestimuladores, alumbre, adyuvantes completos de Freund, compuestos neuroactivos, especialmente la hormona del crecimiento humana, o las combinaciones de los mismos.

El (los) compuesto(s) policatiónico(s) a usar de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier compuesto policatiónico que muestra los efectos característicos de acuerdo con el documento WO 97/30721. Preferiblemente los compuestos policatiónicos se seleccionan entre polipéptidos básicos, policationes orgánicos, poliaminoácidos básicos o las mezclas de los mismos. Estos poliaminoácidos deben tener una longitud de cadena de al menos 4 residuos de aminoácidos (véase: Tuftsin como se describe en Goldman y col. (1983)). Especialmente preferidas son las sustancias como polilisina, poliarginina y polipéptidos que contienen más del 20%, especialmente más del 50% de aminoácidos básicos en un intervalo de más de 8, especialmente más de 20, residuos de aminoácidos o las mezclas de los mismos. Otros policationes preferidos y sus composiciones farmacéuticas se describen en el documento WO 97/30721 (por ejemplo, polietilenimina) y el documento WO 99/38528. Preferiblemente estos polipéptidos contienen entre 20 y 500 residuos de aminoácidos, especialmente entre 30 y 200 residuos.

Estos compuestos policatiónicos se puede producir químicamente o recombinantemente o se pueden derivar de fuentes naturales.

Los (poli)péptidos catiónicos también pueden ser antimicrobianos con propiedades como se reseña en el documento de Ganz y col., 1999; Hancock, 1999. Estos (poli)péptidos pueden ser de origen procatiótico o animal o vegetal o se pueden producir químicamente o recombinantemente (Andreu y col., 1998; Ganz y col., 1999; Simmaco y col., 1998). Los péptidos también pueden pertenecer a la clase de defensinas (Ganz y col., 1999; Ganz y col., 1999). Las secuencias de tales péptidos se pueden, por ejemplo, encontrar en la base de datos de secuencias antimicrobianas bajo la siguiente dirección de internet:

: http://www.bbcm.univ.trieste.it/\simtossi/pag2.html

Tales péptidos de defensa de huésped o defensas son también una forma preferida del polímero policatiónico de acuerdo con la presente invención. Generalmente un compuesto que permite una activación del producto final (o regulación hacia abajo) del sistema inmune adaptativo, preferiblemente mediada por APC (incluyendo células dendríticas) se usa como polímero policatiónico.

Especialmente preferidas para uso como sustancia policatiónica en la presente invención son péptidos antimicrobianos derivados de catelicidina o derivados de los mismos (solicitud de patente internacional PCT/EP01/09529, incorporado en esta memoria descriptiva como referencia), especialmente péptidos antimicrobianos derivados de catelicidina de mamíferos, preferiblemente de seres humanos, bovina u de ratón.

Los compuestos policatiónicos derivados de fuentes naturales incluyen VIH-VER o VIH-TAT (derivados de péptidos catiónicos, péptidos de antenapedios, quitosan u otras derivados de quitina) u otros péptidos derivados de estos péptidos o proteínas mediante producción bioquímica o recombinante. Otros compuestos policatiónicos preferidos son catelina o sustancias relacionadas o derivadas de catalina. Por ejemplo, catelina de ratón es un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos:

NH_{2}-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQE-COOH.

Las sustancias relacionadas o derivadas contienen la totalidad o partes de la secuencia de catalina con al menos 15-20 residuos de aminoácidos. Las derivaciones pueden incluir la sustitución o modificación de los aminoácidos naturales que no están entre los 20 aminoácidos convencionales. Además, residuos catiónicos adicionales se pueden introducir en tales moléculas de catalina. Estas moléculas de catalina se prefiere que se combinen con el antígeno. Estas moléculas de catalina sorprendentemente han resultado ser también una adyuvante eficaz para un antígeno sin la adición de adyuvantes adicionales. Por lo tanto es posible usar tales moléculas de catalina como adyuvantes eficaces en la formulación de vacunas con o sin sustancias inmunoactivadoras adicionales.

Otra sustancia policatiónica preferida a usar de acuerdo con la presente invención es un péptido sintético que contiene al menos 2 motivos KLK separados por un engarce de 3-7 aminoácidos hidrófobos (solicitud de patente internacional PCT/EP01/12041, incorporado en esta memoria descriptiva como referencia).

Los desoxinucleótidos inmunoestimuladores son por ejemplo, ADN neutro o artificial que contiene CpG, tramos cortos de ADN derivados de no vertebrados o en forma de oligonucleótidos cortos (ODN) que contienen citosina-guanina dinucleótidos (CpG) no metilados en un cierto contexto de base (por ejemplo, Krieg y col., 1995) pero también conteniendo ODN (I-ODN) como se describe en el documento WO 01/93905.

Los compuestos neuroactivos, por ejemplo, combinados con sustancias policatiónicas se describen en el documento WO 01/24822.

De acuerdo con una realización preferida la preparación de anticuerpos individuales para la segunda ronda de selección se derivan de pacientes que han sufrido una infección aguda con el patógeno dado, especialmente de pacientes que muestran un título de anticuerpo para el patógeno dado por encima de un cierto nivel, mayor que el percentil 90, especialmente mayor que el percentil 95 del suero humano (paciente o vehículo) ensayado. Usando tales de preparaciones de anticuerpos individuales de título alto en la segunda ronda de selección permite una identificación muy selectiva d los antígenos reactivos de suero hiperinmunes al patógeno dado.

Es importante que la segunda selección con las preparaciones de anticuerpos individuales (que también pueden ser el suero seleccionado) permite una identificación selectiva de los antígenos reactivos de suero hiperinmunes de todos los candidatos prometedores de la primera ronda. Por lo tanto, preferiblemente al menos 10 preparaciones de anticuerpos individuales (es decir, preparaciones de anticuerpos (por ejemplo sueros) de al menos 10 individuos diferentes que han sufrido una infección del patógeno elegido) se debe usar en al identificación de estos antígenos en al segunda ronda de selección. De hecho, es posible usar también al menos 10 preparaciones individuales, sin embargo, la selectividad de la etapa puede no ser óptima con un bajo número de preparaciones de anticuerpos individuales. Por otra parte, si un antígeno reactivo de suero hiperinmune dado (o fragmento antigénico del mismo) se reconoce en al menos 10 preparaciones de anticuerpos individuales, preferiblemente al menos 30, especialmente al menos 50 preparaciones de anticuerpos individuales, la identificación de antígeno reactivo de suero hiperinmune es también suficiente selectiva para una identificación apropiada. La reactividad de suero hiperinmune de hecho se puede ensayar con tantas preparaciones individuales como sea posible (por ejemplo, con más de 100 o incluso con más de 1000).

Por lo tanto, la porción relevante de la preparación de antígenos reactivos de suero hiperinmunes de acuerdo con el procedimiento de la presente invención debe ser preferiblemente al menos 10, más preferido al menos 30, especialmente al menos 50 preparaciones individuales. Como alternativa (o en combinación) un antígeno reactivo de suero hiperinmune también se puede preferiblemente identificar con al menos 20%, preferiblemente al menos 30, especialmente preferido al menos 40% de todas las preparaciones de anticuerpos individuales usadas en al segunda ronda de selección.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el suero a partir del que las preparaciones de anticuerpos individuales para la segunda ronda de selección se preparan (o que se usan como preparaciones de anticuerpos), se seleccionan por su título contra el patógeno específico (por ejemplo, contra una preparación de este patógeno, tal como un lisado, componentes de la pares celular y proteínas recombinantes. Los sueros se seleccionan con un título de IgG total superior a 4000 U, especialmente superior a 6000 U, y/o un título de IgG superior a 10.000 U, especialmente superior a 12.000 U (U = unidades, calculadas de la lectura a DO_{405 \ nm} a una dilución dada) cuando el organismo total (lisado total o células enteras) se usa como antígeno en ELISA. Las proteínas individuales con títulos de Ig superiores a 800-1000 U se prefieren específicamente para seleccionar los antígenos reactivos de suero hiperinmunes de acuerdo con la presente invención solamente para un título total. El estado de las proteínas individuales se puede derivar de la figura 9.

De acuerdo con el ejemplo de demostración que es también una realización preferida de la presente invención el patógeno dado es un patógeno Staphylococcus, especialmente Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. Los estafilococos son patógenos oportunistas que pueden provocar enfermedad que varía entre infecciones menores a enfermedades amenazadoras de la vida. De los numerosos estafilococos al menos 3 están asociados comúnmente con enfermedades humanas; S. aureus, S. epidermidis y raramente S. saprophyticus (Crossley y Archer, 1997). S. aureus se ha usado dentro del curso de la presente invención como un ejemplo ilustrativo de la forma de las funciones de la presente invención. Además de eso, también es un organismo importante con respecto a sus impactos patogénicos graves. Las infecciones de estafilococos son una amenaza tremenda y creciente en el mudo hospitalario. La apariencia y enfermedad que provoca la capacidad de los estafilococos están relacionadas con el uso ampliamente extendido de antibióticos que inducen y continúan la inducción de resistencia multifármaco. Por esa razón el tratamiento medico contra las infecciones por estafilococos no pueden basarse solamente en los antibióticos nada más. Por lo tanto, un cambio táctico en el tratamiento de estas enfermedades es desesperadamente necesario el cual pretende prevenir infecciones. La inducción de anticuerpos de alta afinidad de tipo opsónico y neutralizante mediante la vacunación ayuda a que el sistema inmune innato elimine las bacterias y toxinas. Esto hace que el procedimiento de acuerdo con la presente invención sea una herramienta óptima para la identificación de proteínas antigénicas de estafilococos.

Cada ser humano está colonizado con S. epidermidis. Los hábitats normales de S. epidermidis son la piel y la membrana de las mucosas. Los hábitats principales de las especie más patogénica, S. aureus, son las fosas nasales anteriores y perineo. Algunos individuos llegan a ser vehículos permanentes de S. aureus, a menudo con la misma cepa. La fase del vehículo es clínicamente relevante debido a que los vehículos que experimentan cirugía tienen más infecciones de los no vehículos. En general, la flora establecida de las fosas nasales previene la adquisición de nuevas cepas. Sin embargo, la colonización con otras cepas se puede producir cuando el tratamiento de antibiótico que se proporciona conduce a la eliminación de al cepa vehículo susceptible. Debido a que esta situación se produce en hospitales, los pacientes se pueden llegar a colonizar con estafilococos nocosomiales resistentes. Estas bacterias tienen una adaptabilidad innata que se complementa mediante el uso ampliamente extendido y algunas veces inapropiado de agentes antimicrobianos. Por lo tanto los hospitales proporcionan un ambiente fértil parta la resistencia a fármacos se desarrolle (estrecho contacto entre pacientes enfermos, uso extensivo de antimicrobianos, infecciones nosocomiales). Tanto S. aureus como S. epidermidis han llegado a hacerse resistentes a muchos antibióticos usados comúnmente, de manera más importante a meticilina (MRSA) y vancomicina (VISA). La resistencia a fármacos es un asunto de salud pública importante creciente, y pronto muchas infecciones provocadas por estafilococos pueden ser intratables por antibióticos. Además de su efecto adverso sobre al salud pública, la resistencia antimicrobiana contribuye a costes de asistencia sanitaria más altos, ya que el tratamiento de infecciones resistentes a menudo requiere el uso de fármacos más tóxicos y más caros, y pueden dar como resultado estancias más largas en hospital para pacientes
infectados.

Además, incluso con la ayuda de antibióticos infectados, las infecciones por estafilococo más graves tienen un 30-50% de mortalidad.

Los estafilococos llegan a ser potencialmente patogénicos tan pronto como el equilibrio natural entre los microorganismos y el sistema inmune se altera, cuando las barreras naturales (piel, membrana mucosa) se rompen. Los S. aureus coagulasa positiva en las especie de estafilococos más patogénicas, temidas por los cirujanos durante mucho tiempo. Lo más frecuentemente provoca infecciones en las heridas quirúrgicas, e induce la formación de abscesos. Esta infección local podría llegar a ser sistémica, provocando bacteremia y septicemia. Especialmente después de las infecciones virales y en las personas mayores, puede provocar neumonía grave. S. aureus también es una causa frecuente de infecciones relacionadas con dispositivos médicos, tal como catéteres intravasculares y percutáneos (endocarditis, septicemia, peritonitis), dispositivos prostéticos (artritis séptica, osteomielitis). S. epidermidis provoca enfermedades lo la mayoría relacionadas con la presencia de un cuerpo extraño y el uso de dispositivos, tales como infecciones relacionadas con catéteres, infecciones derivadas del fluido cerebroespinal, peritonitis en pacientes con diálisis (principalmente CAPD), endocarditis e individuos con válvulas prostáticas. Esto se ejemplifica en los individuos inmunocomprometidos tales como pacientes de oncología y recién nacidos prematuros en los que las infecciones por estreptococos coagulasa negativa se producen en asociación con el uso de dispositivos intravasculares. El incremento en incidencia está relacionado con el incremento de uso de estos dispositivos y número creciente de pacientes inmunocomprometidos.

Se sabe mucho menos acerca de S. saprophyticus, otro estafilococo coagulasa positiva, que provoca infección aguda del tracto urinario en personas previamente sanas. Con unas pocas excepciones éstas son mujeres de 1-25 años de edad.

La patogénesis de estafilococos es multifactorial. Con el fin de iniciar la infección los patógenos tienen que ganar acceso a las células y tejidos del huésped, es decir adherirse. S. aureus expresa proteínas de superficie que promueven la unión a las proteínas del huésped tal como laminina, fibronectina, elastina, vitronectina, fibrinógeno y muchas otras moléculas que forman parte de la matriz extracelular (proteínas de unión de matriz extracelular, ECMBP). S. epidermidis está equipado con moléculas de la superficie celular que promueven la adherencia a material extraño y a través de ese mecanismo establecen infección en el huésped. Las otras armas poderosas que los estafilococos usan son los productos secretados, tales como enterotoxinas, exotoxinas, y enzimas que dañan los tejidos. Las toxinas matan o desorientan las células inmunes que son importantes en la defensa del huésped. Los varios tipos diferentes de toxinas son responsables de la mayor parte de los síntomas durante las infecciones.

La defensa del huésped contra S. aureus se basa principalmente en mecanismos inmunológicos innatos. La piel y membrana mucosa son barreras formidables contra la invasión por estafilococos. Sin embargo, una vez que la piel de las membranas mucosas se rompen (heridas, catéteres percutáneos, etc), la línea primera de la defensa celular no adaptativa comienza su acción coordinada a través de complemento y fagotitos, especialmente los leucocitos polimorfonucleares (PMN). Estas células se pueden considerar como las piedras angulares en la eliminación de las bacterias invasoras. Ya que los estafilococos son principalmente patógenos extracelulares, la respuesta adaptativa anti estafilocócica es la arma humoral del sistema inmune, y está mediada a través de tres mecanismos principales: promoción de opsonización, neutralización de toxinas, e inhibición de la adherencia. Se cree que la opsonización es especialmente importante, debido a su requerimiento para una fagocitosis eficaz. Para la opsonización eficaz la superficie microbiana tiene que estar revestida con anticuerpos y factores de complemento para el reconocimiento mediante PMN a través de los receptores para el fragmento Fc de la molécula de IgG o a C3b activado. Después de la opsonización, los estafilococos son fagocitados y muertos. Además, S. aureus se puede unir a células endoteliales, e internalizarse mediante un procedimiento de tipo fagocitosis. Los anticuerpos unidos a antígenos específicos sobre al superficie celular de bacterias sirven como ligandos para la unión de PMN y promueven fagocitosis. Los anticuerpos muy idénticos unidos a las ahdesinas y otras proteínas de la superficie celular se espera que neutralicen la adherencia y prevenir la
colonización.

Existe una pequeña evidencia clínica de que la inmunidad mediada por células tiene una contribución significativa en la defensa contra los estafilococos, incluso se tiene que admitir que al cuestión no se dirige adecuadamente. Sin embargo, se sabe, que el Staphylococcus aureus utiliza una disposición amplia de contramedidas moleculares para manipular el microambiente defensivo del huésped infectado secretando polipéptidos denominados superantígenos, que dirigen la comunicación multirreceptora entre las células T y las células presentadoras de antígenos que es fundamental para iniciar la eliminación inmune específica del patógeno. Los superantígenos juegan un papel crítico en el síndrome de choque tóxico y envenenamiento por alimentos, todavía su función en infecciones rutinarias no se comprende bien. Además, se puede esperar una respuesta de anticuerpo de larga duración (memoria) sin la implicación de las células. También se sabe que al mayoría de los anticuerpos anti-estafilocócicos son contra los antígenos independientes de las células T (polisacáridos capsulares, ácido lipotectoico, péptidoglicano) sin una función de memoria. Los antígenos proteináceos dependientes de las células T pueden generar respuestas de anticuerpo protectores de larga duración. Estas proteínas y péptidos estafilococias no se han determinado todavía.

Por todas estas razones mencionadas anteriormente, un cambio táctico en el campo de guerra contra las infecciones estafilocócicas se necesita con urgencia. Una forma de combatir las infecciones es prevenirlas mediante la inmunización activa. Varios grupos de investigación e instituciones nacionales en todo el mundo han iniciado el desarrollo de vacunas contra S. aureus, pero no existe una vacuna eficaz aprobado hasta ahora. Se ha mostrado que un estado deficiente en anticuerpos contribuye a la persistencia estafilocócica, que sugiere que los anticuerpos anti-estafilocócicos son importantes en la defensa del huésped. Los anticuerpos -añadidos como inmunización pasiva o inducidos mediante vacunación activa- dirigidos hacia componentes de superficie pueden tanto prevenir la adherencia bacteriana, neutralizar toxinas y promover fagocitosis. Una vacuna basada en la proteína de unión a fibronectina induce la inmunidad protectora contra mastitis en ganado vacuno y sugiere que este planteamiento es probable que trabaje en seres humanos (refs). Tomando todo esto junto se sugiere que una vacuna eficaz debe estar compuesta por proteínas o polipéptidos, que se expresan por todas las cepas y son capaces de inducir alta afinidad, anticuerpos abundantes contra componentes de superficie de S. aureus. Los anticuerpos deben ser IgG1 y/o IgG3 para opsonización, y cualquier subtipo de IgG e IgA para la neutralización de adherencia y acción de toxina. Una vacuna definida químicamente debe ser definitivamente superior comparada con una vacuna de células enteras (atenuada o matada), ya que los componentes de S. aureus que paralizan las células TH (superantígenos) o inhiben la opsonización (Proteína A) se pueden eliminar, y las proteínas individuales que inducen anticuerpos protectores se pueden seleccionar. La identificación de los antígenos relevantes para generar inmunización pasiva eficaz (terapia de anticuerpos monoclonales humanizados), que pueden reemplazar la administración de inmunoglobulina humana con todos sus efectos secundarios peligrosos. Las infecciones por estafilococos neonatales, septicemia grave y otras afecciones agudas amenazantes para la vida son la diana principal de al inmunización pasiva. Una vacuna eficaz ofrece gran potencial para pacientes que afrontan una cirugía electiva en general, y los que reciben dispositivos endovasculares, en particular. Además, los pacientes que sufren enfermedades crónicas que disminuyen las respuestas inmunes o que están sometidos a diálisis peritoneal ambulatoria se benefician probablemente de tal vacuna.

Para el ejemplo ilustrativo que se refiere a se han empleado en paralelo tres diferentes planteamientos. Todos estos tres procedimientos se basan en la interacción de las proteínas o péptidos de Staphylococcus con los anticuerpos presentes de sueros humanos con el procedimiento de acuerdo con la presente invención. Esta interacción se basa en el reconocimiento de epítopes con las proteínas que pueden ser péptidos cortos (epítopes lineales) o dominios polipeptídicos (epítopes estructurales). Las proteínas antigénicas se identifican mediante los procedimientos diferentes que usan combinaciones de sueros preseleccionados t -en la segunda ronda de selección- mediante sueros seleccio-
nados.

Después de las selección de alto rendimiento, las proteínas antigénicas seleccionadas se expresan como proteínas recombinantes o productos traducidos in vitro (en caso de que no se puedan expresar en sistemas de expresión procarióticos), y se ensayan en una serie de ensayos de ELISA y transferencia de Western para la determinación de inmunogenicidad con una gran colección de sueros humanos (>100 no infectados, >50 sueros de pacientes). Los antígenos preferidos se localizan en la superficie de la célula o secretarse, es decir accesibles extracelularmente. Los anticuerpos contra las proteínas de la pared celular (tales como proteínas de unión de matriz extracelular) se espera que sirvan de doble propósito: inhibir la adhesión y promover la fagocitosis. Los anticuerpos contra las proteínas secretadas son beneficiosos en la neutralización de toxinas. También se sabe que las bacterias se comunican entre sí a través de proteínas secretadas. Los anticuerpos de neutralización contra estas proteínas interrumpirán el crecimiento que promueve la comunicación cruzada entre o dentro de especies de estafilococos. La bioinformática (secuencias señal, señales de localización de la pared celular, dominios transmembrana) probaron que son muy útiles en la determinación de la localización de la superficie celular o secreción. El planteamiento experimental incluye el asilamiento de anticuerpos con los epítopes correspondientes y proteínas de suero humano, y los usa como reactivos e los siguientes ensayos: tinción de la superficie celular de estafilococos desarrollados en diferentes condiciones (FACS, microscopio), determinación de la capacidad neutralizante (toxina, adherencia), y promoción de opsonización y fagocitosis (en el ensayo de fagocitosis in vitro).

El reconocimiento de los epítopes lineales mediante anticuerpos puede estar basado en las secuencias tan cortas como 4-5 aminoácidos. De hecho no significa necesariamente que estos péptidos cortos sean capaces de inducir el anticuerpo dado in vivo. Por esa razón los epítopes definidos, polipéptidos y proteínas se pueden ensayar adicionalmente en animales (principalmente en ratones) por su capacidad para inducir anticuerpos contra las proteínas seleccionadas in vivo. Los antígenos con la capacidad probada de inducir anticuerpos se ensayarán en modelos animales por al capacidad de evitar infecciones.

Los anticuerpos producidos contra los estafilococos por e sistema inmune humano y presentes de sueros humanos son indicativos de la expresión in vivo de las proteínas antigénicas y su inmunogenicidad.

De acuerdo con lo anterior, los antígenos reactivos de suero hiperinmunes de Staphylococcus aureus o Staphylococcus epidermidis pueden estar disponibles mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invención, es decir un antígeno reactivo de suero hiperinmune seleccionado entre el grupo constituido por las secuencias enumeradas en una cualquiera de las tablas 2 a, 2 b, 2 c, 2 d, 3, 4 y 5, especialmente seleccionadas entre el grupo constituido por las Seq. ID Nº 56, 57, 59, 60, 67, 70, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 85, 87, 88, 89, 90, 92, 95, 96, 97, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 126, 128, 132, 134, 138, 140, 142, 151, 152, 154, 155 y los fragmentos hiperinmunes de los mismos.

Los antígenos de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis se han extraído mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invención que se puede usar en la fabricación de una preparación farmacéutica, especialmente para la fabricación de una vacuna contra infecciones de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. Los ejemplos de tales antígenos reactivos de suero hiperinmunes de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis a usar en una preparación farmacéutica se seleccionan entre el grupo constituido por las secuencias enumeradas en una cualquiera de las tablas 2 a, 2 b, 2 c, 2 d, 3, 4 y 5, especialmente seleccionadas entre el grupo constituido por las Seq. ID Nº 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 66, 67, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 126, 128, 132, 134, 138, 140, 142, 151, 152, 154, 155, 158 y los fragmentos hiperinmunes de los mismos, especialmente para la fabricación de una vacuna contra infecciones de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis.

Un fragmento hiperinmune se define como un fragmento del antígeno identificado que es por sí mismo antigénico o se puede hacer antigénico cuando se proporciona como hapteno. Por lo tanto, también antígeno o fragmentos antigénicos que muestran uno o (para fragmentos más largos) solamente uno pocos cambios de aminoácidos están capacitados con la presente invención, con tal que las capacidades antigénicas de tales fragmentos con cambios de aminoácidos no se deterioren de manera grave en el (los) cambio(s), es decir adecuados para generar una respuesta inmune apropiada en un individuo vacunado con este antígeno e identificado mediante preparaciones de anticuerpos individuales de sueros individuales.

Los ejemplos preferidos de tales fragmentos hiperinmunes de un antígeno reactivo de suero hiperinmune se seleccionan entre el grupo constituido por péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de la columna "aa inmunogénicos predichos", "localización de región inmunogénica identificada" y "reactividad de suero con región relevante" de las tablas 2 a, 2 b, 2 c y 2 d y las secuencias de aminoácidos de al columna "áreas de superficie antígenica supuesta" de la tabla 4 y 5, especialmente péptidos que comprenden los animoácidos Nº aa 12-29, 34-40, 63-71, 101-110, 114-122, 130-138, 140-195, 197-209, 215-229, 239-253, 255-274 y 39-94 de la Seq. ID Nº 55,

500

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504

y los fragmentos que comprenden a l menos 8, especialmente más de 10 aa de dichas secuencias. Todos estos fragmentos individualmente y cada uno de ellos forman un aspecto seleccionado preferido de la presente invención.

Los epítopes auxiliares especialmente adecuados también se pueden derivar de estos antígenos. Los epítopes auxiliares especialmente preferidos son fragmentos que comprenden péptidos seleccionados entre los péptidos mencionados en la columna "áreas de superficie antigénica supuesta" en las tablas 4 y 5 del grupo de aminoácidos 6-40, 583-598, 620-646 y 871-896 de la Seq. ID. Nº 56, aa 24-53 de la Seq ID Nº 70, aa 240-260 de la Seq ID Nº 74, aa 1660-1682 y 1746-1790 de la Seq ID Nº 81, aa 1-29, 680-709, y 878-902 de la Seq ID Nº 83, aa 96-136 de la Seq ID Nº 89, aa 1-29, 226-269 y 275-326 de la Seq ID Nº 94, aa 23-47 y 107-156 de la Seq ID Nº 114 y aa 24-53 de al Seq ID Nº 142 y los fragmentos de los mismos que son epítopes de células T.

Se contempla una vacuna que comprende tal antígeno reactivo de suero hiperinmune o un fragmento del mismo como se ha identificado anteriormente para Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. Tal vacuna puede comprender uno o más antígenos contra S. aureus y S. epidermidis. Opcionalmente tal S. aureus y S. epidermidis también se pueden combinar contra otros patógenos en una vacuna de combinación. Preferiblemente esta vacuna además comprende una sustancia inmunoestimuladora, preferiblemente seleccionada entre el grupo constituido por polímeros policatiónicos, especialmente péptidos policatiónicos, desoxinucleótidos inmunoestimuladores (ODN), compuestos neuroactivos, especialmente hormona de crecimiento humano, alumbre, adyuvantes completos o incompletos de Freund o las combinaciones de los mismos. Tal vacuna también puede comprender el antígeno representada sobre una plataforma de proteína de representación de superficie sobre la superficie de un microorganismo modificado por ingeniaría genética tal como E. coli.

Se contemplan preparaciones específicas que comprenden anticuerpos surgidos contra al menos uno de los antígenos de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis y fragmentos antigénicos de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis como se han definido anteriormente. Estos anticuerpos son preferiblemente anticuerpos monoclonales.

Los procedimientos para producir tales preparaciones de anticuerpos, policlonal o monoclonal, están también disponibles para los expertos en la técnica se describen de manera apropiada en al técnica previa. Un procedimiento preferido para producir tal preparación policlonal se caracteriza por las siguientes etapas:

\bullet: iniciar una respuesta inmune en un animal no humano mediante la administración de un antígeno de Staphylococcus o un fragmento del mismo, como se ha definido anteriormente, a dicho animal,

\bullet: retirar el bazo o células del bazo de dicho animal,

\bullet: producir células de hibridoma de dicho bazo o células de bazo,

\bullet: seleccionar y clonar células de hibridoma específicas para dicho antígeno y

\bullet: producir la preparación de anticuerpos mediante cultivo de dichas células de hibridoma clonadas y opcionalmente etapas de purificación adicionales.

Preferiblemente, la retirada del bazo o las células de bazo está relacionada con la muerte de dicho animal.

Los anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos se pueden quimerizar o humanizar (Graziano y col., 1995) para permitir la administración repetida. Como alternativa los anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos se pueden obtener a partir de librerías de representación de fagos (McGuinnes y col., 196) o a partir de fragmentos antigénicos de los mismos (Brüggemann y col., 1996).

Un procedimiento preferido para producir preparaciones de anticuerpos policlonales para dichos antígenos de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis identificados con la presente invención se caracteriza por las siguientes etapas:

\bullet: retirar un anticuerpo que contiene fluido corporal de dicho animal,

\bullet: y

\bullet: producir al preparación de anticuerpos sometiendo dicho fluido corporal que contiene anticuerpos a etapas de purificación adicionales.

Estas preparaciones de anticuerpos monoclonales o policlonales se pueden usar para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir enfermedades debidas a infección por estafilococos. Además, se pueden usar para propósitos de diagnosis y formación de imágenes.

El procedimiento se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos y en las figuras, pero no se debe restringir a ellos.

La figura 1 muestra la preselección de suero basándose en títulos de anticuerpos de estafilococos medidos por ELISA.

La figura 2 muestra la distribución de tamaños de los fragmentos de ADN en la librería LSA50/6 en pMAL.1.

La figura 3 muestra la selección de MACS con suero humano biotinilado. La librería LSA50/6 en pMAL.1 se seleccionó con 10 \mug biotinilado, suero humano en la primera (A) y con 1 \mug en al segunda ronda de selección (B). P. suero, suero de pacientes; B. suero, cuero de niños. Números de células seleccionadas después de la 2ª y 3ª elución se muestran para cada ronda de selección.

La figura 4 muestra la reactividad de suero con clones específicos aislados por representación de superficie celular según se analiza por análisis de transferencia Western con suero de pacientes a una dilución de 1 : 5000.

La figura 5 muestra ELISA de péptidos con suero de pacientes e individuos sanos con un epítope identificado por representación de ribosomas.

La figura 6 muestra la inmunotransferencia en 2 D de proteínas de superficie de S. aureus detectadas con suero humano., 800 \mug de proteína de S. aureus/COL desarrollado sobre BHI se resolvieron por IEF (pI 4-7) y SDS-PAGE (9-16%), y posteriormente transferido a membrana PVDF. Después de bloqueo, la membrana se incuba con suero IC35 (1 : 20.000). La unión de IgG de suero se visualizó mediante un conjugado IgG/HRPO y desarrollo de ECL.

La figura 7 muestra un gel de 2 D representativo que muestra proteínas de superficie de S. aureus teñidas por azul Coomassie. 1 mg de proteína de S. aureus/COL se resolvieron por IEF (pI 4-7) y SDS-PAGE (8- 16%). Se marcan las manchas seleccionadas para secuenciar después del análisis de proteomas.

Las figuras 8 A y 8 B muestran la estructura de las proteínas de la pared celular LPXTG.

La figura 9 muestra la respuesta de IgG en pacientes no infectados (N, C) e infectados (P) a LPXTGV, un antígeno novedoso y adhesina de superficie probable de S. aureus, descubierto mediante tanto planteamientos de repersenatción de superficie bacteriana inventiva y proteonemas.

La figura 10 muestra la tinción de superficie de S. aureus con las IgG anti-LPXTGV purificadas.

La figura 11 muestra un gel de 2 D en el que las proteínas de superficie de S. aureus se tiñen con azul Coomassie (izquierda). 1 mg de proteína de S. aureus/agr desarrolladas hasta fase logarítmica temprana se resolvió por IEF (pI 65-11) y SDS_PAGE (9-16%). Se marcan las manchas seleccionadas para secuenciar después del análisis de proteonoma serológico. La inmunotransferencia en 2 D correspondiente (derecha) por 2 D. 800 \mug de proteína de las misma preparación se resolvió en paralelo mediante 2 DE, y posteriormente se transfirieron a membrana PVDF. Después de bloqueo, la membrana se incubó con la combinación P (1 : 10.000). la unión de IgG de suero se visualizó mediante un conjugado de IgG/HRPO anti-humano y desarrollo de ECL.

Ejemplos Descubrimiento de Staphylococcus aureus novedoso

Ejemplo 1

Preparación de anticuerpos de suero humano

Los anticuerpos producidos contra estafilococos por el sistema inmune humano y presente en suero humano son indicativos de la expresión in vivo de las proteínas antigénicas y su inmunogenicidad. Estas moléculas son esenciales para al identificación de antígenos individuales en el planteamiento como la presente invención que se basa en la interacción de anticuerpos anti-estafilocócicos y los péptidos o proteínas de S. aureus correspondientes. Para ganar acceso a repertorios relevantes de anticuerpos, suero humano se recogió de I. pacientes con infecciones de S. aureus agudas, tales como bacteriemia, septicemia, infecciones de catéteres y dispositivos intravasculares y percutáneos, infección de heridas, e infección de tejido blando superficial y profundo. S. aureus se mostró que el agente causante mediante ensayos microbiológicos médicos. II. Una colección de muestras de sueros de adultos no infectados también se incluía en el presente análisis, ya que las infecciones e estafilococos son comunes, y los anticuerpos están presentes como consecuencia de la inmunización natural de los encuentros previos con estafilococos de la piel e infecciones de tejido blando (forúnculos, infección de heridas, periodontitis, etc).

Los sueros se caracterizaron por anticuerpos de S. aureus mediante una serie de ensayos ELISA. Varios antígenos de estafilococos se han usado para probar que el título medido no era un resultado de la suma de anticuerpos de reacción cruzada. Para ese propósito no solamente extractos de S. aureus de células enteras (deficiente en proteína A) o bacterias enteras de usaron en los ensayos ELISA, pero también los componentes individuales de la pared celular, tales como ácido lipoteicoico y péptidoglicano aislado de S. aureus. De manera más importante, se estableció una colección de proteínas recombinantes que representa proteínas de al superficie celular de estafilococos conocidos para al mejor caracterización de las presentes colecciones de suero humano.

Recientemente se ha reseñado que no solamente IgG, sino también anticuerpos de suero de IgG se pueden reconocer por los receptores FcRIII de PMMM y promueven la organización (Phillips-Quagliata y col., 2000; Shibuya y col., 2000). El papel principal de los anticuerpos de IgA es la neutralización, principalmente en la superficie mucosa. El nivel de IgA de suero refleja la calidad, cantidad y especificidad de la IgA secretora dímera. Por esa razón la colección de suero no solamente se analizó para evaluar los niveles de IgG anti-estafilocócica, sino también para IgA. En los ensayos ELISA altamente específicos se usaron reactivos secundarios para detectar anticuerpos de los tipos de alta afinidad, tales como IgG e IgA, y evitan IgM. La producción de anticuerpos de IgM se produce durante la respuesta humoral adaptativa primaria, y da como resultado anticuerpos de baja actividad, mientras que los anticuerpos de IgG e IgA ya experimentado maduración de afinidad, y son más valiosos en la lucha o prevención de enfermedad.

Procedimientos experimentales

Ensayo inmune ligado a enzimas (ELISA). Las placas ELISA se recubrieron con 2-10 \mug/ml de los diferentes antígenos en tampón de recubrimiento (carbonato de sodio pH 9,2). Las diluciones en serie de suero (100-100.000) se realizaron en TBS-BSA. Anticuerpos secundarios de IgG antihumano o IgS anti-humano marcados con HRP (peroxidasa de rábano picante) altamente específica (adsorbida de manera cruzada) se usaron de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes (aproximadamente 2.000 x). Los complejos antígeno-anticuerpo se cuantificaron midiendo la conversión del sustrato (ABTS) en producto coloreado basándose en las lecturas de DO 405 nm en un lector automático de ELISA (Walace Victor 1420). Los títulos se compararon a una dilución dada cuando al respuesta de dilución era lineal (tabla 1). Los aproximadamente 100 sueros se clasificaron basándose en la reactividad contra componentes de estafilococos múltiples, y los más altos (aproximadamente percentil 90) se seleccionaron para análisis adicional en la identificación de antígenos. De manera importante, los anticuerpos anti-estafilocócicos se individuos clínicamente sanos probaron que eran muy estables, dando los mismos títulos altos de ELISA contra todos los antígenos estafilocócicos medidos después de 3, 6 y 9 meses (datos no mostrados). Por el contrario, anticuerpos anti-S. aureus en pacientes disminuyen, entonces desaparecen después de un par de semanas a continuación de la infección (Coloque-Navarro y col., 1998). Sin embargo, los anticuerpos de pacientes son muy importantes, ya que éstos son una prueba directa de al expresión in vivo de los antígenos bacterianos ensayados en o ELISA o identificados como inmunogénicos durante las selecciones de acuerdo con la presente invención.

Este planteamiento comprensivo que sigue durante la caracterización de anticuerpos es único, y condujo a identificación no ambigua de sueros hiperinmunes anti-estafilocócicos.

Purificación de anticuerpos para selección genómica. Cinco sueros de tanto del grupo de pacientes como del no infectado se seleccionaron basándose en los títulos anti-estafilocócicos globales. Los anticuerpos contra las proteínas de E. coli se retiraron o bien incubando los sueros inactivados por calor con E. coli entera (DF5a, transformado con pHIE11, desarrollados en la misma condición como se usó para representación bacteriana) o con cromatografía de afinidad de lisado de E. coli para representación ribosómica. Las preparaciones altamente enriquecidas de IgG del conjunto, sueros agotados se generaron mediante cromatografía de afinidad de proteína G, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (UltraLink Immobilized Protein G, Pierce). Los anticuerpos IgA se purificaron también mediante cromatografía de afinidad usando igA anti-humano marcado con biotina (Southern Biotech) inmobibizada sobre streptavidina-agarosa (GIBCO BRL). La eficacia del agotamiento y purificación se comprobó mediante SDS-PAGE, transferencia de Westtern, ELISA, y mediciones de concentración de proteínas. Para proteómicos, el agotamiento de las preparaciones de IgG e IgA no era necesario, ya que el reactivo secundario aseguraba la especificidad.

Ejemplo 2

Generación de librerías aleatorias, seleccionadas en fase, de fragmentos pequeños, de ADN genómico de Staphylococcus aureus Procedimientos experimentales

Preparación de ADN genómico de estafilococos. Este procedimiento se desarrolló como una modificación de dos protocolos publicados previamente (Sohail, 1998, Betley y col., 1984) y originalmente específicamente adaptado para la cepa COL de Staphylococcus aureus resistente a meticilina con el fin de obtener ADN genómico con alta calidad y gran escala. 500 ml de medio BHI (Infusión de cerebro y corazón) suplementado con 5 \mug/ml de tetraciclina se inoculó con bacterias de una picadura congelada y se desarrollaron con aireación y agitación durante 18 horas a 37ºC. Después el cultivo se recogió en dos alícuotas de 250 ml cada uno, se centrifugó con 1600 x g durante 15 minutos y se retiró el sobrenadante. Los residuos bacterianos se volvieron a suspender cuidadosamente en 26 ml de Tris-HCl 0,1 mM, pH 7,6 y se centrifugaron de nuevo con 1600 x g durante 15 minutos. Los sedimentos se volvieron a suspender en 20 ml de Tris-HCl 1 mM, pH 7,6, EDTA 0,1 mM y se transfirieron en tubos estériles de polipropiloeno de 50 ml. 1 ml de ARNasa A tratada con calor y 200 U de ERNasa T1 se aañdieron a cada tubo y la solución se mezcló cuidadosamente. 250 \mul de lisostafina (10 mg/ml de solución madre, preparadas recientemente en ddH_{2}O) se añadió después a los tubos, se mezcló cuidadosamente y se incubó a 40ºC durante 10 minutos en agua en baño de agitación en agitación continua. Después de la adición de 1 ml de SDS al 10%, 40 \mul de proteinasa K (25 mg/ml de solución madre) y 100 \mul de Pronasa (10 mg/ml), se invirtieron los tubos varias veces otra vez y se incubaron a 40ºC durante 5 minutos en un baño de agua con agitación. 3,75 ml d NaCl 5 M y 2,5 ml de solución de bromuro de trimetil amonio (CTAB) (10% v/v, 4% p/v de NaCl) se añadieron después y los tubos se incubaron adicionalmente a 65ºC en una baño de agua con agitación durante 10 minutos. Las muestras se enfriaron hasta temperatura ambiente y se extrajeron con PhOH/CHCl/IAA (25:25:1) y con CHCl_{3}/IAA (24:1). Las fases acuosas se recogieron cuidadosamente y se transfirieron a tubos nuevos de 50 ml. A cada tubo se añadieron 1,5 ml de resina Strataclean ™, se mezclaron suavemente pero concienzudamente y se incubaron durante 1 minuto a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron y las capas superiores que contenían el ADN se recogieron en tubos limpios de 50 ml. El ADN se precipitó a temperatura ambiente añadiendo 0,6 x volumen de isopropanol, se separaron de la solución, con una pipeta Pasteur estéril y se transfirieron en tubos que contenían etanol enfriado en hielo al 80%. El ADN se recuperó centrifugando el precipitado con 10-12000 x g, después se secó al aire y se disolvió en ddH_{2}O.

Preparación de pequeños fragmentos de ADN genómico. Los fragmentos de ADN genómico se cizallaron mecánicamente en fragmentos que variaban en tamaño entre 150 y 300 pares de bases usando un sonicador de copa-trompa (sonicador 2200 Bandelin Sonoplus UV equipado con una copa trompa BB5, pulsos de 10 segundos a 100 % de rendimiento de potencia) o en fragmentos de tamaño entre 50 y 70 pares de bases mediante tratamiento suave con ADNasa I (Novagen). Se observó que la sonicación producía una distribución de tamaño de fragmentos mucho más estrecha cuando se rompía el ADN en fragmentos del intervalo de tamaño de 150-300 pares de bases. Sin embargo, a pesar de la extensa exposición del ADN a fuerzas de cizalladura hidromecánica inducida por ondas ultrasónicas, la disminución posterior en tamaño de fragmento no podía ser lograda de manera eficaz y reproducible. Por lo tanto, se obtuvieron fragmentos de 50 a70 pares de bases de tamaño mediante tratamiento con ADNasa I usando el kit de escisión de Novagen de escopeta. Se preparó una dilución 1 : 20 de ADNasa proporcionada con el kit y la digestión se realizó en presencia de MnCl_{2} en un volumen de 60 \mul a 20ºC durante 5 minutos para asegurar la escisión de doble cadena por la enzima. Las reacciones se detuvieron con 2 \mul de EDTA 0,5 M y se evaluó la eficacia de fragmentación sobre un gel de TAE agarosa al 2%. Este tratamiento dio como resultado en una fragmentación total de ADN genómico en fragmentos de 50-70 pares de bases aproximadamente. Los fragmentos después se hicieron romos dos veces usando ADN polimerasa de T4 en presencia de dNTPs 100 \muM para asegurar el flijo eficaz de los extremos. Los fragmentos se usaron inmediatamente en reacciones de ligadura o se congealaron a -20ºC para uso posterior.

Descripción de los vectores. El vector pMAL4.1 se construyó sobre una estructura central de pEH1 (Hashemzadeh-Bonehi y col., 1998) con el gen de ersistencia a kanamicina. Además alberga un gen de b-lactamasa (bla) clonado en el sitio de clonación múltiple. El gen bla estaba precedido por la secuencia péptidica guía de ompA para asegurar la secreción eficaz a través de la membrana citoplásmica. Un sitio de restricción Sma I sirve para la inserción de la librería. El sitio Sma I está flanqueado por ub sitio FseI cadena arriba y un sitio NotI cadena abajo que se usaron para la recuperación de los fragmentos seleccionados. Los tres sitios de restricción se insertan después de la secuencia guía ompA de tal forma que el gen bla se transcribe en el marco de lectura -1 que da como resultado un codón de parada de 15 pares de bases después del sitio NotI. una inserción de +1 pares de bases reestablece la ORF de bla de manera que la lactamasa b se produce con una ganancia posterior de resistencia a ampicilina.

El vector pMAL.4 se construyó sobre una estructura central pSKA-IBA (Skerra, 1994) con el gen de lactamasa b intercambiado con el gen de resistencia a kanamicina. Además alberga un gen de lactamasa b (bla) clonado en el sitio de clonación múltiple. La secuencia que codifica la lactamasa b madura está precedida de la secuencia guía de péptidos de ompA para permitir la secreción eficaz a través de la membrana citoplásmica. Además a una secuencia que codifica los primeros 12 aminoácidos (secuencia espaciadora) de lactamasa b madura sigue la secuencia de péptidos guía ompA para evitar la fusión de secuencias inmediatamente después del sitio guía de escisión de peptidasa, ya que por ejemplo racimos de aminoácidos cargados positivamente en esta región disminuiría o anularía la translocación de la membrana citoplásmica (Kajava y col., 2000). Un sitio de restricción SmaI sirve para la inserción de librerías. El sitio SmaI está flanqueado por un sitio FseI cadena arriba y un sitio NotI cadena abajo que se usó para la recuperación del fragmento seleccionado. Los tres sitios de restricción se insertan después de la secuencia que codifica la secuencia espaciadora de 12 aminoácidos de tal forma que el gen bla se transcribe en el marco de lectura -1 dando como resultado un codón de parada de 15 pares de bases después del sitio NotI. Una inserción de +1 pares de bases reestablece el ORF de bla de manera que la proteína de lactamasa b se produce con una ganancia posterior de resistencia a ampicilina.

El vector pMAL9.1 se construyó clonando el gen lamB en el sitio de clonación múltiple de pEH1. Posteriormente, se insertó una secuencia en lamB después del aminoácido 154, que contenía los sitios de restricción FseI, SmaI y NotI. El marco de lectura se esta inserción se eligió de manera que la transferencia de los fragmentos de ADN seleccionados en fase se escindieron mediante digestión con FseI y NotI de plásmidos pMAL4.1 o pMAL4.31 al plásmido pMAL9.1 producirá una fase de lectura continua de lamB y la inserción respectiva.

El vector pHIE11 se construyó mediante clonación del gen fhuA en el sitio de clonación múltiple pEH1. Después, se insertó uña secuencia en fhuA después del aminoácido 405, que contenía el sitio de restricción FseI, XbaI y NotI. La fase de lectura para esta inserción se eligió de manera que la transferencia de fragmentos de ADN seleccionados en fase se escindieron mediante digestión con FseI y NotI de plásmidos pMAL4.1 o pMAL4.31 al plásmido pHIE11 producirá una fase de lectura continua de fhuA y la inserción respectiva.

Clonación y evaluación de la librería para la selección en fase. Fragmentos de ADN de S. aureus genómico se ligaron en el sitio SmaI de o bien el vector pMAL4.1 o pMAL4.31. El ADN recombinante se electroporó en células de E. coli electrocompetentes DH10B (GIBCO BRL) y los transformantes de sembraron sobre agar LB suplementado con kanamicina (50 \mug/ml) y ampicilina (50 \mug/ml). Las placas se incubaron durante toda una noche a 37ºC y se recogieron las colonias para la extracción a gran escala de ADN. Una placa representativa se almacenó y se guardó para recoger colonias para análisis de PCR de colonias y secuenciación a gran escala. Un ensayo de PCR de colonias sencillo de usó para determinar inicialmente la distribución de tamaño de fragmentos brutos así como la eficacia de inserción. A partir de los datos de secuenciación se evaluó el tamaño de fragmento preciso, la integridad de la articulación en el sitio de inserción así como la exactitud de la selección en fase (regla 3 n + 1).

Clonación y evaluación de la librería para representación de la superficie bacteriana. Los fragmentos de ADN genómnicos se escindieron a partir del vector pMAL4.1 o pMAL4.31, que contenía la librería de S. aureus con las enzimas de restricción FseI y NotI. La población entera de los fragmentos se transfirieron después en plásmidos pMAL9.1 (LamB) o pHIE11 (FhuA) que se han digerido con FseI y NotI. Usando estas dos enzimas de restricción, que reconocen una secuencia rica en GC de 8 pares de bases, la fase de lectura que se seleccionó en el vector pMAL4.1 o pMAL4.31 se mantuvo en cada uno de los vectores de plataforma. La librería de plásmidos se transformó después en células DH5a de E. coli mediante electroporación. Las células se sembraron en placas grandes de agar LB suplementadas con 50 \mug/ml de kanamicina y se desarrollaron durante toda una noche a 37ºC a una densidad que produjo colonias individuales claramente visibles. Las células después se separaron por raspado de asestas placas, se lavaron con medio LB reciente y se almacenaron en alícuotas para seleccionar librarías a -80ºC.

Resultados

Librerías de selección en fase. Dos libraerías (LSA50/6 y LSA250/1) se generaron en el vector pMAL4.1 con tamaños de aproximadamente 50 y 250 pares de bases, respectivamente. Para ambas librerías un número total de clones después de la selección en fase de 1-2 x 10^{6} se recibió usando aproximadamente 1 \mug de ADN de plásmido pMAL4.1 y 50 ng de ADN de S. aureus genómco fragmentado. Para evaluar la aleatoriedad de la librería LSA50/6, se secuenciaron 671 clones elegidos al azar. El análisis bioinformática mostró que de estos clones inactivados ninguno estaba presente más de una vez. Además, se mostró que el 90% de los clones estaban en el intervalo de tamaño de 17 a 90 pares de bases con una tamaño medio de 25 pares de bases (figura 2). Todas las 672 secuencias seguían la regla 3 n + 1, que muestra que todos los clones se seleccionaron de manera apropiada en fase.

Librerías de representación de superficie bacteriana. La representación de péptidos en al superficie de E. coli requería la transferencia de las inserciones d la librería LSA50/6 a partir del vector de selección en fase pMAL4.1 a los plásmidos de representación pMAL4.1 (LamB) o pHIE11 (FhuA). Los fragmentos de ADN geonómico se escindieron mediante restricción por FseI y NotI y ligación de 5ng inserciones con 0,1 \mug de ADN de plásmido dio como resultado 2-5 x 10^{6} clones. Los clones se separaron por raspado de las placas y se congelaron sin purificación adicional.

Ejemplo 3

Identificación de secuencias peptídicas de alta inmunogenicidad de S. aureus usando librerías genómicas representadas en superficie bacteriana y suero humano Procedimientos experimentales

Selección de MACS. Aproximadamente 2,5 x 10^{8} células de una libraría dada se hicieron crecer en 5 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de kanamicina durante 2 horas a 37ºC. La expresión se indujo mediante la adición de ITPG 1 mM durante 30 minutos. Las células se lavaron dos veces con medio LB reciente y aproximadamente 2 x 10^{7} células se volvieron a suspender en 100 \mul de medio LB y se transfirieron a un tubo Eppendorf.

10 \mug de suero biotinilado se añadió a las células y la suspensión se incubó durante toda una noche a 4ºC con agitación suave. Se añadieron 900 \mul de suero LB, la suspensión se mezcló y posteriormente se centrifugó durante 10 minutos a 6000 rpm a 4ºC. Las células se lavaron una vez con 1 ml de medio LB y después se volvieron a suspende en 100 \mul de medio LB. 10 \mul de microperlas MACS acopladas a estreptavidina (Milteny Biotech, Alemania) se añadieron y la incubación de continuó durante 20 minutos a 4ºC. Después se añadieron 900 \mul de medio LB y la suspensión de células en microperlas de MACS se cargó en la columna de MS equilibrada (Miltenyi Biotech, Alemania) que se fijó al imán. Las columnas MS se equilibraron lavando una vez con 1 ml de EtOH al 70% y dos veces con 2 ml de medio LB).

La columna de lavó después tres veces con 3 ml de medio LB. La elución se realizó retirando el imán y lavando con 2 ml de medio LB. Después de lavar la columna con 3 ml de medio LB, el eluato de 2 ml se cargó una segunda vez en la misma columna y se repitió el procedimiento de lavado y elución. El procedimiento de carga, de lavado y elución se realizó una tercera vez, dando como resultado un eluato final de 2 ml.

Se realizó una segunda ronda de selección como sigue. Las células del eluato final se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron en 1 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de kanamicina. El cultivó se incubó a 37ºC durante 90 minutos y después se indujo con ITPG 1 mM durante 30 minutos. Las células se recogieron posteriormente, se lavaron una vez con 1 ml de medio LB y se suspendieron en 10 \mul de medio LB. Una vez que el volumen se redujo, se añadió 1 \mug de suero humano, biotinilado y la suspensión se incubó durante toda una noche a 4ºC con agitación cuidadosa. Todas las etapas adicionales eran exactamente las mismas que en la primera ronda de selección. Las células seleccionadas después de dos rondas de selección se sembraron en placas de agar LB suplementado con 50 \mug/ml de kanamicina y se desarrollaron durante toda una noche a 37ºC.

La evaluación de clones seleccionados mediante secuenciación y análisis de transferencia de Western. Los clones seleccionados se hicieron crecer durante toda una noche a 37ºC en medio LB suplementado con 50 \mug/ml de kanamicina para preparar ADN usando procedimientos habituales. La secuenciación se realizó a MGW (Alemania) o en colaboración con TIGR (Estados Unidos).

Para el análisis de transferencia de Western aproximadamente 10 a 20 \mug de proteína celular total se separó mediante SDS-PAGE al 10% y se transfirieron en membrana HybondC (Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra). Las proteínas de fusión LamB o FhuA se detectaron usando suero humano como el anticuerpo primario a una dilución de 1 : 5000 y anticuerpos de IgG humanos acoplados a HRP a una dilución de 1 : 5000 como anticuerpos secundarios. La detección se realizó usando el kit de detección de ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra). Como alternativa, anticuerpos de conejo anti FhuA o de ratón anti LamB se usaron como anticuerpos primarios en combinación con los anticuerpos secundarios respectivos acoplados a HRP para la detección de las proteínas de fusión.

Resultados

La selección de librarías de representación de superficie bacteriana mediante separación de células activadas por magnetismo (MACS) usando suero humano biotinilado. Las librerías LSA50/6 en pMAL9.1 y LSA250/1 en pHIE11 se seleccionaron con una combinación de sueros de pacientes biotinilados, humanos (véase el ejemplo 1) Preparación de anticuerpos a partir de suero humano). El procedimiento de selección se realizó como se ha descrito en los procedimientos experimentales. Como control, se usó suero humano de niños que tienen la mayor probabilidad de no estar infectados con S. aureus. En las condiciones descritas entre 10 y 50 veces más células con el paciente comparado con el suero de niños se seleccionaron de manera rutinaria (Figura 3). Para evaluar el comportamiento de la selección, se cogieron al azar aproximadamente 100 clones seleccionados y se sometieron a análisis de transferencia de Western con el mismo suero de pacientes combinado. Este análisis reveló que 30 a 50% de los clones seleccionados mostraron reactividad con los anticuerpos presentes en suero de pacientes mientras que la cepa control que expresa LamB y FhuA sin una inserción específica de S. aureus no reaccionó con el mismo suero. El análisis por PCR de colonias mostró que todos los clones seleccionados contenían una inserción en el intervalo de tamaño esperado.

La secuenciación posterior de un número mayor de clones recogidos de manera aleatoria (500 a 800 por selección) condujo a la identificación del gen y la secuencia de péptidos o proteínas correspondiente que se reconoció específicamente por el suero de paciente humano usado para selección. La frecuencia con la que se selecciona un clon específico refleja al menos en parte la abundancia y/o afinidad de los anticuerpos específicos en el suero usado para la selección y reconocimiento de del epítope presentado por este clon. A este respecto se encontró que algunos clones (ORF2264, ORF1951, ORF0222, lipasa e IsaA) se recogieron hasta 90 veces, indicando su propiedad altamente inmunogénica. Todos los clones que se presentan en al tabla 2 se han verificado mediante análisis de transferencia de Western usando extractos celulares enteros de clones individuales para mostrar la reactividad indicada con la combinación de suero humano usado en la selección.

Además hay que indicar que la mayoría de los genes identificados por la selección de representación de superficie bacteriana codifican proteínas que están o bien unidas a las superficies de S. aureus y/o se secretan. Esto está de acuerdo con el papel esperado de proteínas unidas a superficie o secretadas en la virulencia de S. aureus.

Determinación de la reactividad de secuencias peptídicas altamente inmunogénicas con diferentes sueros humanos. 10 a 30 sueros de pacientes humanos diferentes se usaron posteriormente para evaluar la presencia de anticuerpos contra las secuencias peptídicas inmunogénicas que se han descubierto en la selección de acuerdo con la presente invención. Para eliminar la posible reactividad cruzada con proteínas expresadas mediante E. coli, todos los sueros se pre-adsorbidos con un lisado celular total de células DHa de E. coli que expresan proteína FhuA.

Este análisis se resume en la tabla 2 y como ejemplo mostrado en la figura 4 y es indicativo de la validez de la presente selección. Además se muestra que ya los epítopes seleccionados cortos puede dar lugar a la producción de anticuerpos en un mayor número de pacientes (ORF1618, ORF1632, IsaA, Empbp, Proteína A). Las secuencias de péptidos que no se reconocen por un gran conjunto de sueros de pacientes todavía puede ser parte de una proteína altamente inmunogénica, pero la propia proteína recombinante se puede ensayar para ese propósito para cada caso individual.

Ejemplo 4

Identificación de secuencias de péptidos altamente inmunogénicas a partir de fragmentos genómicos de S. aureus usando representación de ribosomas y suero humano Procedimientos experimentales

Selección de representación de ribosomas: 2,4 ng de la librería genómica de S. aureus LSA250/1 en pMAL4.1 (descrito anteriormente) se amplificó por PCR con los oligos ICC277 e ICC202 con l fin de usarse para representación de ribosomas. Los oligos ICC277

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se hibridizan en 5' y 3' del sitio de inserción Fse I-Not I del plásmido pMAL4.1, respectivamente. ICC277 introduce un promotor de ARN polimerasa de fago T7, una secuencia palindrómica que da como resultado una estructura en forma de tallo y bucle en el nivel de ARN, un sitio de unión de ribosoma (RBS) y el comienzo de de traducción del gen 10 del fago T7 incluyendo el codón de comiemnzo ATG.El oligo ICC202 se hibridiza en la posición de nucleótido 668 de la fase de lectura abierta de lactamasa \beta y también introduce una estructura en forma de tallo y bucle en el extremo 31 del ARN resultante. La PCR se realizó con el kit de PCR de alta fidelidad (Roche Diagnostic) durante 25 ciclos a una temperatura de hibridación de 50ºC y por otra parte condiciones de convencionales.

La librería de PCR resultante se usó en 5 rondas consecutivas de selección y amplificación mediante representación de ribosoma similar como se ha descrito previamente (Hanes y col., 1997) pero con modificaciones como se describe más adelante.

Una ronda de representación de ribosoma contenía las siguientes etapas: la transcripción in vitro de 2 \mug de producto de PCR con el kit RiboMax (Promega) dio como resultado aproximadamente 50 \mug de A. La traducción in vitro se realizó durante 9 minutos a 37ºC en 22 \mul de volumen con 4,4 \mul de Pemiz z (Tris-acetato 250 mM pH 7,5, 1,75 mM de cada aminoácido, ATP 10 MM, GTP 2,5 mM, AMPc 5 mM, acetilfosfato 150 mM, 2,5 mg/ml de ARNt de E. coli, 0,1 mg/ml de ácido polínico, PEG 8000 al 7,5%, glutamato de potasio 200 mM, Mg (Ac)2 13,8 mM, 8 \mul de extracto S30 (x mg/ml) y aproximadamente 2 \mug de ARN transcrito in vivo a partir de la combinación. El extracto S30 se preparó como ha descrito (Chen y col, 1983). A continuación, la muestra se transfirió a un tubo enfriado con hielo que contenía 35,2 \mul de leche-WBT al 10% (TRIS-acetato pH 7,5, NaCl 150 mM, Mg/Ac)2 50 mM, Tween-20 al 0,1%, leche en polvo al 10%) y 52,8 \mul de WBTH (como antes más 2,5 mg/ml de heparina). Posteriormente, la inmunoprecipitación se realizó mediante al adición de 10 \mug de IgG purificadas, incubación durante 90 minutos en hielo, seguido de la adición de 30 \mul de perlas de proteína G MAGmol (Miltenyi Biotec, 90 minutos en hielo). La muestra se aplicó a una columna preequilibrada \mu (Miltenyi Biotec) y se lavó tres veces con tampón WBT enfriado con hielo. A continuación 20 \mul de tampón de elución EB20 (TRIS-acetato 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, 50 \mug/ml de ARN de S. cerevisiae) se aplicó a la columna, se incubó durante 5 minutos a 4ºC. la elución se completó mediante la elución de 2 x 50 \mul de EB20. El ARNm de al muestra de elución se purificó con el kit de aislamiento de ARN de alta pureza (Roche Diagnostic). La transcripción inversa posterior se realizó con el kit de transcriptasa inversa Superscript II (Roche Diagnostic) de acuerdo con la instrucción del fabricante con 60 pmoles de oligo ICC202 durante 1 hora a 50ºC en 50 \mul ce volumen. 5 \mul de esta mezcla se usó para al siguiente reacción de PCR con cebadores ICC202 e ICC277 como se ha descrito anteriormente.

Se realizaron tres rondas de representación de ribosomas y la combinación de PCR seleccionada resultante se clonó posteriormente en el plásmido pHIE11 (descrito anteriormente) mediante escisión son las endonucleasas de restricción NotI y FseI.

Evaluación de clones seleccionados mediante secuenciación y análisis de ELISA de péptidos: los clones seleccionados se desarrollaron durante toda una noche a 37ºC en 3 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de kanamicina para preparar ADN de plásmido usando procedimientos convencionales. La secuenciación se realizó en MWG (Alemania) o en el Instituto de Investigación genómica (TIGR; Rockville, MD, Estados Unidos). Los péptidos correspondientes a las inserciones se sintetizaron y se revistieron en NaHCO_{3} 10 mM pH 9,3 a una concentración de 10 \mug/ml (50 \mul) en placas de microvaloración de 96 pocillos (Nunc). Después de bloqueo con BSA al 1% en PBS a 37ºC, diluciones 1 : 200 y 1 : 1000 de los sueros indicados se diluyeron en BSA al 1%/PBS y se aplicaron a los pocillos. Después de ñavar con PBS/Tween-20 al 0,1%, anticuerpos secundarios de IgG anti-humanos marcada con biotina (SBA) se añadieron y éstos de detectaron mediante al adición posterior de estreptavidina acoplada a peroxiaddsa de rábano picante de acuerdo con procedimientos convencionales.

Resultados

La librería genómica de 250 pares de bases (LSA250/1) como se ha descrito anteriormente se usó para selección. Las IgG purificadas de adultos no infectados pero con título alto contra S. aureus como se ha descrito anteriormente se usaron para selección de péptidos antigénicos.

Se realizaron tres rondas de selección de representación de ribosomas de acuerdo con procedimientos experimentales; terminadas mediante clonación y secuenciación de la combinación de PCR resultante.

Los análisis de secuencias de una gran cantidad de clones recogidos al azar (700) condujeron a la identificación del gen y la secuencia de péptidos y proteínas correspondiente que se reconoció específicamente mediante el suero de alto título usado para selección. La frecuencia con la que se seleccionó un clon específico refleja al menos en parte la abundancia y/o afinidad de los anticuerpos específicos e el suero usado para selección y reconocimiento del epítope presentado por este clon. Es digno de mención que algunos clones (ORF) se recogieron hasta 50 veces, indicando su propiedad altamente inmunogénica. La tabla 2 muestra el nombre de ORF, la Seq ID Nº y el número de veces que se identificó por la selección de la invención.

Para un número de péptidos de ORF inmunoseleccionados correspondientes a al región inmunogénica identificada se sintetizaron y se ensayaron en ELISA de péptidos para evaluar su reactividad hacia la combinación de sueros, se identificaron también con un número de suero adicional de pacientes que sufrieron de una infección por S. aureus. Los dos ejemplos en los gráficos en la figura 5 muestran los valores de péptidos de aureolisina y Pls. No solamente eran reactivos hiperinmunes contra la combinación de de sueros de alto título sino también hacia un número de sueros de pacientes individuales. Todos los péptidos sintetizados correspondientes a regiones inmunogénicas mostraron reactividad hacia la combinación de sueros de alto título y la tabla 2 resume el número de veces que los péptidos eran reactivos hacia los sueros de pacientes individuales, similar a como se ha descrito anteriormente.

Además, se encontró que para las ORF que también se identificaron mediante la representación de superficie bacteriana descrita anteriormente), muy a menudo la real región inmunogénica dentro de ORF era idéntica o superponiéndose con la identificada mediante representación de ribosomas. Esta comparación se puede ver en la tabla 2.

Ejemplo 5

Identificación de antígenos altamente inmunogénicos de S. aureus usando análisis de proteoma sexológico Procedimientos experimentales

Preparaciones de proteínas de superficie de S. aureus que contenían antígenos altamente inmunogénicos. Las cepas de S. aureus COL (Shafer e Iandolo, 1979) y agr- (Recsei y col., 1986) se almacenaron como soluciones madre en glicerol a -80ºC o en placas BHI (DIFCO) a 4ºC. Los clones individuales se usaron para la inoculación de cultivos de toda la noche en o bien BHI ("condiciones convencionales") o RPMI 1640 (GibcoBRL), el último agotado a partir de hierro ("condiciones de estrés") tratando o/n con ácido iminodiacético (Sigma). Se inoculó medio reciente 1 : 100 el día siguiente y las bacterias de se desarrollaron hasta una DO_{600} entre 0,3 y 0,7. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación y se lavaron con PBS enfriado con hielo. Las proteínas de superficie se prepararon mediante tratamiento por lisostafina en condiciones isotónicas (Lim y col., 1998). En resumen, aproximadamente 3 x 10^{9} bacterias (de acuerdo con una DO_{600} = 1, son aproximadamente 5 x 10^{7} bacterias) se suspendieron en 1 ml de tampón de digestión que contiene rafinosa al 35% (Aldrich Chemical Chemical Company), inhibidores de proteasa (Roche) y 5 unidades de lisostafina (Sigma). Después de incubación a 37ºC durante 30 minutos, se sedimentaron cuidadosamente los protoplastos mediante centrifugación a baja velocidad. Este tratamiento libera las proteínas de superficie unidos covalentemente al puente de pentaglicina de la pared celular de péptidoglicano al sobrenadante (en Crossley, 1997). Las proteínas de la superficie celular se precipitaron o bien con metanol/cloroformo (Wessel, 1984) o se concentraron en tubos de filtración de centrífugas (Millipore). Las muestras de proteínas se congelaron y se almacenaron a -80ºC o se disolvieron en tampón de muestra y se usaron para localización isoeléctrica (IEF) inmediatamente (Pasquali y col., 1997).

Análisis de proteoma sexológico se las preparaciones de proteína s de superficie de S. aureus. Las muestras se obtuvieron de a) S. aureus/agr desarrollados en "condiciones de estrés", b) S. aureus/COL desarrollado en "condiciones convencionales" y c) S. aureus/COL "condiciones de estrés". La carga en tiras de 17 cm que contenían gradientes de pH inmovilizado (pH 4-7, BioRad) se hizo usando el "procedimiento de rehinchamiento en gel" (Pasquali y col., 1997). Los geles para transferencia se cargaron con 100-800 \mug de proteína, los ges preparativos con 400-1000 \mug de proteína. La localización isoeléctrica y SDS-PAGE (ges de gradiente al 9-16%) se realizaron como han descrito (Pasqueli y col., 1997). Para al transferencia de western las proteínas de transfirieron en membranas PVDF (BioRad) mediante transferencia semiseca. La eficacia de la transferencia se comprobó mediante tinción con negro de amido. Después del bloqueo (PBS/Tween 20 al 0,1%/ leche seca al 10%, 4ºC durante 16 horas), las manchas se incubaron durante dos horas con suero (1 >: 2.500 - 1: 100.000 en solución de bloqueo, véase la tabla 3). Después de de lavar, la unión específica de IgG de suero se visualizó con un conjugado cabra-antihumano IgG/peroxidasa (1:25000, Southern Biotech) como anticuerpo secundario y desarrollo con un sustrato quimioluminiscente (ECI ™, Amersham). Un resultado representativo se muestra en la figura 6. Las membranas se eliminaron mediante tratamiento con tampón \beta-ME al 2%/tampón Laemmli durante 30 minutos a 50-65ºC, inmediatamente se volvieron a explorar con un suero diferente, y se desarrollaron como se ha descrito anteriormente. este procedimiento se repitió hasta cinco veces. Las señales que muestran con suero control de paciente y/o de donantes sanos pero no con al combinación de niños, se emparejaron a los ges preparativos teñidos con Coomassie (ejemplo mostrado en la figura 7). Los resultados de estos análisis de proteomas serológicos de preparaciones de proteínas de superficie de S. aureus se resumen en la tabla 3. La secuenciación de las manchas de proteínas mediante MALDI-TOF-MS de huella digital de péptidos y MS/MS tándem. Las piezas de gen se lavaron alternativamente tres veces con 10 \mul de tampón de digestión (NH_{4}HCO_{3}/CAN 10 mM/CAN, 1 : 1). Después las piezas de gel se encogieron con 10 \mul de ACn y se volvieron a hinchar con 2 \mul de solución de proteasa (0,05 \mug/vl de tripsina, Promega, Madison, Estados Unidos). La digestión se realizó durante 10-12 horas a 37ºC. Para os péptidos de MALDI-TOF-MS se extrajeron a partir de las piezas de gel con 10 \mul de tampón de digestión. El sobrenadante se concentró con ZipTip ™ (Millipore, Bedford, Estados Unidos), los péptidos se eluyeron en diana MALDI con 0,5 \mul de tampón de extracción (TFA al 0,1%/CAN, 1:1) y se añadieron 0,5 \mul de solución de matriz (HCCA en ACN/TFA al 0,1%, 1 : 1). MALDI-TOF-MS se hizo usando un REFLEX III (Bruker Daltonik, Bremen, Alemania) equipada con una fuente de hierro SCOUT84. La tensión de aceleración se fijó a 25 kV, y la tensión de reflexión hasta 28,7 kV. El intervalo de masas se fijó entre 700 Da y 4000 Da. La adquisición de datos se hizo en un SUN Ultra usando el software XACQ, versión 4.0. El procesamiento de los datos de análisis posteriores se hizo usando el software XMASS, versión 4.02 (Bruker Daltonik, Bremen, Alemania). Los resultados se resumen en las tablas 3 y 4.

Ejemplo 6

Caracterización de proteínas altamente inmunogénicas de S. aureus

Los antígenos identificados mediante los diferentes procedimientos de selección con las preparaciones de IgG e IgA a partir de sueros preseleccionados se caracterizan después, de las siguientes formas:

1. Las proteínas se purifican, más preferiblemente como proteínas recombinantes expresadas en E. coli o en un sistema de expresión Gram + o en un sistema de traducción in vitro, y se evaluó para antigenicidad mediante una serie de sueros humanos. Las proteínas se modifican basándose en análisis bioinformática: Las secuencias N-terminales que representan el péptido señal se retiran, las regiones C-terminales cadena abajo del anclaje de la pared celular también se retiran, y se introducen aminoácidos extras como marcas para la facilidad de la purificación (tal como Strep-tagII, His tag, etc.). Un gran número de sueros se usa después conteniendo anticuerpos específicos contra la proteína dada (véase la figura 9 como ejemplo). Uno de los antígenos seleccionados es una proteína de 895 aa de longitud, que se llamó LPXTGV (véase las tablas 2 y 4), ya que contiene la secuencia de anclaje de la pared de células Gram + LPXTG. Esta marca se ha mostrado que sirve como sitio de escisión para sortasa, una trans-peptidasa que se une covalentemente al motivo LPXTG que contiene proteínas para la pared celular de péptidoglicano. LPXTGV está también equipada con un péptido señal típico (Figura 8). Los datos de ELISA que usan esta proteína como una proteína de recombinación marcada con strep demuestran que esta proteína es altamente inmunogénica (los títulos altos con relación a otras proteínas recombinantes) en un alto porcentaje de sueros (figura 9). De manera importante, los pacientes con infección de S. aureus aguda producen significativamente más de estos anticuerpos anti-LPXTGV, que los normales sanos, sugiriendo que al proteína se expresa durante la infección in vivo. Los títulos de ELISA globales de las proteínas antigénicas individuales se comparan, y los títulos de las proteínas antigénicas individuales se comparan, y las que inducen los niveles de anticuerpos más altos (altamente inmunogénicos) en la mayoría de los individuos (la proteína se expresa por la mayoría de las cepas in vivo) se favorece. Ya que al especificad y calidad de antígenos (clase, subtipo, funcional, no funcional) de los anticuerpos contra S. aureus producida en pacientes individuales puede variar dependiendo del sitio de infección, las enfermedades crónicas acompañantes (por ejemplo diabetes y afecciones crónicas (por ejemplo dispositivo intravascular), y la repuesta inmune de individuos, se prestó especial atención a las diferencias entre los diferentes pacientes, ya que los registros médicos que pertenecen a cada suero estaban disponibles. Además, cada suero de pacientes está acompañado por la cepa patogénica aislada del paciente en el momento del muestreo de suero.

2. Anticuerpos específicos se purifican para caracterización funcional. La pureza y la integridad de las proteínas recombiantes se comprueban (por ejemplo detectando la Strep-tag N-terminal en análisis de transferencia de Western en comparación con la tinción por plata en SDS-PAGE). Los antígenos se inmovilizaron a través de las marcas para crear una matriz de afinidad, y se usaron para la purificación de anticuerpos específicos de sueros de alta reactividad, 20 \mug de anticuerpo a partir de 125 mg de IgG se purificaron. Basándose en los datos de ELISA se recibió una preparación pura, que no tenía por ejemplo, actividad anti-LTA y anti-péptidoglicano (ambos dominantes con IgG no fraccionada). Los anticuerpos después se usan para ensayar la localización de la superficie celular mediante FACS y microscopía fluorescente (figura 10).

3. Aparición de genes en aislamientos clínicos.

Un antígeno de vacuna ideal sería un antígeno que está presente en todas, o en al mayoría de, las cepas del organismo diana al que se dirige la vacuna. Con el fin de establecer si los genes que codifican los antígenos de Staphylococcus aureus se producen de manera ubicua en cepas de S. aureus, PCR se realizó en una serie de aislamientos de S. aureus con cebadores específicos para el gen de interés. Los aislamientos de S. aureus se obtuvieron a partir de pacientes con diversas infecciones de S. aureus. Además también se recogieron y se analizaron varios aislamientos nasales de portadores clínicos y varias cepas de laboratorio Las cepas se tiparon de acuerdo con el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) de los genes spa y coa (Goh y al., 1992, Frénay y col., 1994, vanden Bergh y col., 1999). A partir de estos resultados se identificaron 30 cepas diferentes - 24 aislamientos de pacientes, e 3 aislamientos nasales y 3 cepas de laboratorio. Para establecer la distribución de genes de antígenos seleccionados, el ADN genómico de estas 30 cepas se sometió a PCR con cebadores específicos de genes que flanquean el epítope seleccionado (ORF1361 : Seq ID Nº 187 y 188; ORF2268: Seq ID Nº 193 y 194; ORF1951: Seq ID Nº 195 y 196; ORF1632: Seq ID Nº 181 y 182; ORF0766: Seq ID Nº 183 y 184; ORF0576: Seq ID Nº 1858 y 186; ORF0222: Seq ID Nº 189 y 190; ORF0360: Seq ID Nº 191 y 192. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis de gel para identificar un producto del tamaño predicho correcto. Las ORF 1361, 2268, 1951, 1632, 0766 y 0222 están presentes en el 100% de las cepas ensayadas y ORF0576 en el 97%. Sin embargo ORF0360 se produjo solamente en el 71% de las cepas. De este modo las ORF 1361, 2268, 1951, 1632, 0766, 0766, 0576 y 0222 cada una tienen las presencia ubicua requerida entre los aislamientos de S. aureus.

Estos antígenos (o fragmentos antigénicos de los mismos, especialmente los fragmentos identificados) se prefieren especialmente para uso en un proyecto de vacunación contra S. aureus.

4. Identificación de epítopes auxiliares de HLA clase altamente promiscuos dentro de las ORF de antígenos seleccionados.

Las ORF correspondientes a los antígenos identificados en base de reconocimiento por anticuerpos en sueros humanos, lo más probablemente también contienen epítopes de células T lineales. Especialmente el hallazgo sorprendente el curso de la invención de que incluso individuos sanos no infectados, no colonizados sanos muestran títulos de anticuerpos extremadamente altos (>100.000 para algunos antígenos, véase el ejemplo 5) que son estables durante más de 1 año, (véase el ejemplo 1), sugiere a existencia de memoria dependiente de células T más probablemente mediados por células T auxiliares CD4+. La definición molecular de los epítopes auxiliares clase II HLA es útil para el diseño de vacunas anti-estafilocócicas sintéticas, que pueden inducir memoria inmunológica. En este escenario los epítopes auxiliares derivados de antígenos estafilocócicos proporcionan "ayuda afín" a la respuesta de células B contra estos antígenos o fragmentos de los mismos. Además es posible usar epítopes auxiliares para inducir la memoria a antígenos independientes de T como por ejemplo carbohidratos (vacunas conjugadas). Por otra parte, los estafilococos de origen intracelular se pueden eliminar mediante células T citotóxicas CD8+, que reconocen epítopes restringidos HLA clase I.

Los epítopes de células T se pueden predecir mediante diversos algoritmos de dominio público: http://bimas.dcrt.
nih.gov/molbio/hla.bind/ (Parker y col., 1994, http://134.2.96.221/scripts/MCHServer.d11/home.htm (Rammensee y col., 1994, http://mypage.ihost.com/usinet.hamme76/ (Sturniolo y col., 1999). El último algoritmo de pREdicción ofrece la posibilidad de identificar epítopes auxiliares, es decir, péptidos que se unen varias moléculas de HLA Clase II. Con el fin de identificar epítopes auxiliares altamente promiscuos dentro de antígenos estafilocócicos las ORF correspondientes a la Seq ID 64 (IsaA), Seq ID 114 (POV2), Seq ID 89 (ORF0222), Seq ID 70 (LPXTGIV), Seq ID 56 (LPXTGV), Seq ID 142 (LPXTGVI), Seq ID 81 (ORF3200), Seq ID 74 (ORF1951), Seq ID 94 (Empbp), Seq ID 83 (autolisina) y la Seq ID 58 (ORF2498) se analizaron usando el paquete TEPITOPE http://mypage.ihost.com/usinet.
hamme76/ (Sturniolo y col., 1999). El análisis se hizo para 25 alelos DR prevalentes y se seleccionaron péptidos si se predecía que eran a) fuertes ligantes (umbral al 1%) durante al menos 10/25 alelos o b) ligantes intermedios (umbral al 3%) para al menos 17/25 alelos.

Se seleccionaron los siguientes péptidos que contenían uno o varios epítopes auxiliares promiscuos (y se reivindican):

Seq ID 56: pos. 6-40, 583-598, 620-646, 871-896

Seq ID 58: ningún péptido reúne los criterios de selección

Seq ID 64: ningún péptido reúne los criterios de selección

Seq ID 70: pos. 24-53

Seq ID 74: pos. 240-260

Seq ID 81: pos. 1660-1682, 1746-1790

Seq ID 83: pos. 1-29, 680-709, 878-902

Seq ID 89: pos. 96-136

Seq ID 94: pos. 1-29, 226-269, 275-326

Seq ID 114: pos. 23-47, 107-156

Seq ID 142: pos. 24-53

Los correspondientes péptidos o fragmentos de los mismos (por ejemplo superposición de 15 meros) se pueden sintetizar y ensayar para evaluar su capacidad de unirse a diversas moléculas de HLA in vitro. Su inmunogenicidad de puede ensayar determinando la proliferación dirigida a péptido (antígeno) (BrdU) o incorporación de 3H-timidina) o la secreción de citoquinas (ELIspot, tinción de citoquina intracelular) de células T in vitro (Mayer y col., 1996, Smittel y col., 2000, Sester y col., 2000). A este respecto será interesante determinar las diferencias cuantitativas y cualitativas en la respuesta de células T a los antígenos estafilocócicos o los péptidos promiscuos seleccionados o fragmentos de los mismos en poblaciones de pacientes con diferentes infecciones estafilocócicas, o colonización frente a individuos sanos ni recientemente infectados ni colonizados. Además, se espera una correlación entre los títulos de anticuerpos y al cantidad y calidad de la respuesta de células T observada en estas poblaciones. Como alternativa, la inmunogenicidad de los péptidos predichos se puede ensayar en ratones HLA-transgénicos (Sonderstrup y col., 1999).

Similares procedimientos se pueden tomar para la identificación de epítopes restringidos HLA clase I dentro de antígenos estafilocócicos.

Péptidos sintéticos que representan uno o más epítopes auxiliares de células T más promiscuos de S. aureus

Se sintetizaron los péptidos de superposición parcial que extienden las regiones indicadas de la Seq ID 56
(LPXTGV), Seq ID 70 (LPXTGIV), Seq ID 74 (ORF1hom1), Seq ID 81 (EM_BP), Seq ID 83 (autolisina), Seq ID 89 (ORF1hom2), Seq ID 94 (EMPBP), Seq ID 114 (POV2) y la Seq ID 142 (LPXTGVI). Las secuencias de los péptidos individuales se proporcionan en la tabla 5. Todos los péptidos se sintetizaron usando química de Fmoc, se purificaron por HPLC y se analizaron mediante espectrometría de masas. Los péptidos liofilizados se disolvieron en DNSO y se almacenaron a -20ºC a una concentración de 5-10 mM.

Unión de péptidos sintéticos que representan epítopes auxiliares de células T promiscuos a moléculas HLA in vitro

La unión de péptidos a moléculas HLA sobre al superficie de células presentadoras de antígenos es un requisito previo para la activación de células T. la unión se determinó in vitro mediante dos ensayos bioquímicos independientes que usan versiones solubles recombinantes de moléculas de HLA clase II. un ensayo mide el reemplazo competitivo dependiente de la concentración de un péptido de referencia marcado por los péptidos de ensayo. El segundo ensayo se basa en la formación de complejos SDS estables tras al unión de ligandos de afinidad intermedios. Un sumario d los resultados obtenidos por los dos ensayos se proporciona en la tabla 5.

Moléculas de HLA solubles (DRA1*0101/DRB1*0101 y DRA1*0101/DRB1*0401) se expresaron en células SC-2 y se purificaron como se describe en Aichinger y col., 1997. para el ensayo de competición (Hammer y col., 1995) moléculas de HLA se aplicaron entre 50 y 200 ng/pocillo. Para el péptido HA (PKYVKQNTLKLAT, Valli y col, 1993) indicador biotinilado PRB*1*0101 se usó a 0,008 \muM. Para el péptido UD4 (YPKVKQNTLKAA, Valli y col, 1993) indicador biotinilado PRB*1*0401 se usó entre 0,03 y 0,06 \muM. Los péptidos de ensayo se usaron en diluciones en serie entre 0,02 nM y 200 \muM. Las moléculas, péptidos indicadores y de ensayo se incubaron durante toda una noche a 37ºC, pH 7. Los complejos HLA:péptido obtenidos después de la incubación con diluciones en serie de péptidos de ensayo y de referencia (los ligantes de alta afinidad conocidos HA y UD4 se usaron como control positivo) se capturaron en placas ELISA revestidas con anticuerpo L243, que se conoce que reconoce un epítope conformacional formado solamente por heterodímeros asociados correctamente. La biotina incorporada se midió mediante detección colorimétrica convencional usando un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Dako) con comprimidos NBT/BCIP (Sigma) como sustrato y lectura automática de DO sobre un lector Victor (Wallac).

Respuestas de células T contra epítopes de auxiliares T determinados mediante ensayo IFNg Elispot

Tras la estimulación antigénica las células T comienzan a proliferar y a secretar citoquinas tal cmo interfereon gamma (IFNg). Las células T humanas que reconocen específicamente epítopes dentro de antígenos de S. aureus se detectaron mediante IFNg-LLIspot (Schmittek y col., 200. PBMCs de individuos sanos con una fuerte respuesta de IgG anti- S. aureus se aislaron a partir de 50-100 ml de sangre venosa mediante centrifugación en gradiente de densidad de ficol y se usaron después de congelación y descongelación. Las células se sembraron a 200.0000/pocillo en placas de 96 pocillos. Los péptidos se añadieron como mezclas correspondientes a antígenos individuales, en ambos casos a 10 \mug/ml cada uno. La concanavalina A (Amersham) y PPD (derivado de proteína purificada con tuberculina Statens Serun Institute) servían como controles positivos de ensayo, medio de ensayo sin péptido como control negativo. Después de incubación durante toda la noche en placas de filtración de 96 pocillos Multi-Screen (Millipore) revestidas con el anticuerpo monoclonal ahti-humano IFNg B140 (Bender Med Systems) el ELIspot se desarrolló usando el sustrato anticuerpo monoclonal anti-humano IFNg B308-BT2 (Bender Med Systems), estreptavidina-fosfatasa alcalina (DAKO) y BCIP/NBT fosfatasa alcalina (Sigma). Las manchas se contaron usando un lector de placas automático (Bioreader 2000, BIO-SYS). Las manchas contadas en pocillos con células estimuladas con medio de ensayo solamente (control negativo, generalmente por debajo de 10 manchas/100.000 células) se consideraron como fondo y se restaron de los números de manchas en los pocillos con péptidos.

TABLA 5 Epítopes auxiliares T promiscuos contenidos en antígenos de S. aureus

1

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{1)}   \begin{minipage}[t]{130mm}Unión a moléculas
DRA1*0101/DRB1*0401 se determinó usando un ensayo de  competición
(+, ++: unión, -: sin competición hasta péptido de ensayo 200  \mu
M  nd: no hecho)\end{minipage} \cr   ^{2)} 
 \begin{minipage}[t]{130mm}Resultado de 5 individuos sanos con
fuerte respuesta anti- S. aureus   IgG. Los datos se
representan  como machas/200.000 células (los valores de fondo se
restan)\end{minipage} \cr}

5. Los antígenos se pueden inyectar en ratones - y los anticuerpos contra estas proteínas se pueden medir.

6. La capacidad protectora de los anticuerpos inducidos por los antígenos de la vacunación se puede ensayar en modelos de animales.

Tanto 5. como 6. son procedimientos fácilmente disponibles para los expertos en la técnica.

Ejemplo 7

Aplicaciones

A) Una vacuna eficaz ofrece gran potencial para pacientes que afrontan cirugía electiva en general, y los que reciben dispositivos endovasculares, en particular. Los pacientes que padecen de enfermedades crónicas con disminución de respuestas inmunes o que experimentan continua diálisis peritoneal ambulatoria se van a beneficiar probablemente de una vacuna con S. aureus mediante antígenos reactivos en suero inmunogénicos de acuerdo con la presente invención. La identificación de los antígenos relevantes ayudará a generar inmunización pasiva eficaz (terapia de anticuerpo monoclonal humanizado), que puede reemplazar la administración de inmunoglobulina humana con todos sus efectos secundarios peligrosos. Por lo tanto una vacuna eficaz ofrece gran potencial para pacientes que afrontan cirugía electiva en general, y los que reciben dispositivos endovasculares en particular.

S. aureus puede provocar muchas enfermedades diferentes

1. Septicemia, bacteriemia

2. Pacientes hemodializados - bacteriemia, septicemia

3. Pacientes con diálisis peritoneal - peritonitis.

4. Pacientes con dispositivos endovasculares (cirugía cardiaca, etc) - endocarditis, bacteriemia, septicemia

5. Pacientes ortopédicos con dispositivos prostéticos - artritis séptica

6. Vacunación preventiva de población general

B) Vacunación pasiva y activa, ambas con especial atención a células T con la última: es un propósito inducir una fuerte respuesta de los auxiliares T durante la vacunación para lograr una eficaz respuesta humoral y también memoria inmunológica. Hasta ahora, no existe evidencia directa de que las células T jueguen un papel importante en al eliminación de S. aureus, sin embargo, no esta adecuadamente dirigida, hasta ahora. Una respuesta humoral contra antígenos proteináceos debe implicar ayuda de células T, y es esencial para desarrollar memoria. Las células CD4+ no atacadas se pueden diferenciar en células Th1 o Th2. Ya que, las respuestas inmunológicas innatas (citoquinas) influenciarán esta decisión, la implicación de las células T debe ser diferente durante una infección aguda, grave con relación a la inmunización de individuos sanos con vacunas subunitarias, que no contienen componentes que deterioran la respuesta inmune durante el curso natural de la infección. Las consecuencias de la inducción de las respuestas de Th1 o Th2 son profundas. Las células conducen a inmunidad mediada por células, mientras que las células Th2 proporcionan inmunidad humoral.

C) Vacunas preventivas y terapéuticas

Preventiva: vacunación activa/inmunización pasiva de personas en grupos de alto riesgo, antes de infección.

Terapéutica: vacunación pasiva de los ya enfermos.

Vacunación activa para eliminar el transporte nasal.

Ejemplo específico para una aplicación Eliminación de transporte de MRSA y prevención de colonización del personal médico

Las tasas de transporte de S. aureus en las fosas nasales de personas fuera de los hospitales varía entre 10 y 40%. Los pacientes y personal hospitalarios que tiene tasas de transporte mayores. Las tasas son especialmente altas en pacientes que están sometidos a diálisis y en diabéticos, adictos a drogas y pacientes con una variedad de afecciones dermatológicas. Los pacientes con riesgo mayor de infección de MRSA son aquellos en grandes hospitales de atención terciaria, particularmente los ancianos e inmunocomprometidos, aquellos en unidades de cuidados intensivos, pacientes con quemaduras, aquellos con heridas quirúrgicas, y pacientes con catéteres intravenosos.

Los datos de ELISA fuertemente sugieren que existe una respuesta de IgA pronunciada a S. aureus, que no es obvia o conocida en al bibliografía. Ya que al respuesta inmune mucosal predominante es la producción de IgA con actividad neutralizante, es evidente que los epítopes y antígenos estafilocócicos identificados con las preparaciones de IgA altamente puras conducen a una vacuna mucosal eficaz.

\bullet: Indicación clara: amenaza de todos los departamentos donde realizan operación (especialmente ortopédicos, traumatología, cirugía gen.

\bullet: Población bien definida para vacunación (doctores y enfermeras).

\bullet: Trabajadores de atención sanitaria identificados como portadores intranasales de una cepa epidémica de S. aureus y actualmente tratados con mupirocina y rifampicina hasta que eliminan la bacteria. Algunas veces no es eficaz, y lleva tiempo.

\bullet: Modelo animal disponible: existen modelos de ratones para transporte intranasal.

3

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}

4

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Tabla I

Títulos de ELISA de sueros de individuos no infectados contra proteínas estafilocócocas múltiples

Los niveles de anticuerpos anti-estafilocócicos se midieron individualmente mediante ELISA convencional con lisado total preparado a partir de S. aureus desarrollados en medio BHI (BHI), ácoido lipoteitoico (LTA), péptidoglicano (PG), 13 proteínas recombinantes, que representa proteínas de superficie celular y secretadas, tales como factor de agrupamiento A y B (ClfA, ClfB) proteína de unión a fibronectina (FnBPA), proteínas de repetición de SD (sdrc, sdrE), proteína análoga MHC clase II (map-w), proteína de unión de elastina (EBP), enolasa (reseñada por estar localizada en superficie celular e inmunogénica), lipoproteínas de transporte de hierro (LP309, LP342), sortasa (srtA), coagulasa (coa), proteína de unión a fibrinógeno extracelular (fib). Los péptidos sintéticos cortos que representan 2 de de los cinco dominios de repetición D inmunodominantes de FnBPA también estaban incluidos (D1 + D3) como antígenos. Los sueros individuales se clasificaron basándose en el título de IgG, y obtuvieron una puntuación entre 1-9. La puntuación 1 marca el suero de título más alto y puntúan 8 o 9 marcas cuyos sueros eran el 8º o 9º entre todos los sueros ensayados para el antígeno dado. Da como resultado los análisis del percentil 20 superior de sueros (8-9/40). Los cinco "sueros mejores" que significa el más hiper reactivo en términos de anticuerpos anti-estreptocócicos se seleccionaron basándose en el número de puntuaciones 1-8. **** significa que la reactividad de anticuerpo contra el antígeno particular era excepcionalmente alto (> 2 x unidades ELISA con relación al 2º suero más reactivo).

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 2a Proteínas inmunogénicas identificadas por representación de superficie bacteriana y de ribosoma: S. aureus

Representación de superficie bacteriana: A, librería LSA2501 en fhuA con sueros de pacientes 1 (655); B, librería LSA50/6 en lamB con suero de pacientes 1 (484); C, librería LSA250/1 en fhuA con suero IC 1 (571); E, librería LSA50/6 en lamB con suero IC 2 (454); F, librería LSA50/6 en lamB con sueros de pacientes P1 (1105); G, librería LSA50/6 en lamb con suero IC (471); H, librería LSA250/1 en fhuA con sueros de pacientes 1 (IgA, 708). Representación de ribosomas: D, librería LSA250/6 con suero IC (1686). *, identificado 18 veces de 33 seleccionadas; se eliminó por lo tanto de la selección C. **, predicción de secuencias antigénicas más largas que 5 aminoácidos se realizó con el programa ANTIGENIC (Kolaskar y Tongaonkar, 1990); #, secuencia idéntica presente dos veces en ORF; # #, clon no en la base de datos (sin secuencia por TIGR).

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 2b Proteínas inmunogénicas identificadas por representación de superficie bacteriana y de ribosoma: S. aureus

Representación de superficie bacteriana: A, librería LSA250/1 en fhuA con sueros de pacientes 1 (655); B, librería LSA50/6 en lamB con suero de pacientes 1 (484); C, librería LSA250/1 en fhuA con suero IC 1 (571); E, librería LSA50/6 en lamB con suero IC 2 (454); F, librería LSA50/6 en lamB con sueros de pacientes P1 (1105); G, librería LSA50/6 en lamb con suero IC (471); H, librería LSA250/1 en fhuA con sueros de pacientes 1 (IgA, 708). Representación de ribosomas: D, librería LSA250/6 con suero IC (1686). **, la predicción de secuencias antigénicas más largas que 5 aminoácidos se realizó con el programa ANTIGENIC (Kolaskar y Tongaonkar, 1990). ORF, fase abierta de lectura; ARF, fase alternativa de lectura.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 2c Proteínas inmunogénicas identificadas por representación de superficie bacteriana y de ribosoma: S. epidermidis

Representación de superficie bacteriana: A, librería LSE150 en fhuA con sueros de pacientes 2 (957); B, librería LSE70 en lamB con suero de pacientes 2 (1420); C, librería LSE70 en lamB con suero de pacientes 1 (551). Representación de ribosomas: D, librería LSE150 en pMAL4.31 con P2 (1235). **, la predicción de secuencias antigénicas más largas que 5 aminoácidos se realizó con el programa ANTIGENIC (Kolaskar y Tongaonkar, 1990). ORF, fase abierta de lectura; ARF, fase alternativa de lectura; CRF, fase de lectura sobre la hebra complementaria. ORF, fase abierta de lectura; CRF, fase de lectura sobre la hebra complementaria.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 2d Proteínas inmunogénicas identificadas por representación de superficie bacteriana y de ribosoma: S. aureus (nueva anotación)

Representación de superficie bacteriana: A, librería LSA250/1 en fhuA con sueros de pacientes 1 (655); B, librería LSA50/6 en lamB con suero de pacientes 1 (484); C, librería LSA250/1 en fhuA con suero IC 1 (571); E, librería LSA50/6 en lamB con suero IC 2 (454); F, librería LSA50/6 en lamB con sueros de pacientes P1 (1105); G, librería LSA50/6 en lamb con suero IC 1 (471). Representación de ribosomas: D, librería LSA250/6 con suero IC (1686). **, la predicción de secuencias antigénicas más largas que 5 aminoácidos se realizó con el programa ANTIGENIC (Kolaskar y Tongaonkar, 1990); #, secuencia idéntica presente dos veces en ORF.

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TABLA 3 Análisis de proteoma sexológico de proteínas de superficie de S. aureus usando suero humano a)"Condiciones de estrés" de S. auresus/agr

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Mancha ID/suero	CI 40 1:20.000	CI 35, N26, C4	Conjunto infantil	N22 1:10.000
		1:50.000 cada uno	C2, 5, 6, 10, 12,	CI 40: 1:50.000
			1:10.000
PCK2	+	+	-	+
PCK4	+	+++	-	+++
PCK5	-	(+)	-	+
PCK6	+	+	-	+

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Mancha ID/suero	CI 35 1:50.000	Conjunto P	Conjunto infantil
	N22 1:10.000	(P6, 18, 25, 28, 29)	C2, 5, 6, 10, 12,
		C4 1:50.000 cada uno	1:10.000
PAC1	++	++	-
PAC2	++	+++	-
PAC3	-	(+)	-
PAC5	-	++	-

Mancha	Conjunto P (P6, 18, 25, 28,	Infantil 14	Conjunto CI/IgG (N26, CI34,	Conjunto CI/IgA (N26, CI34,
ID/suero	29) C4 1:50.000 cada uno	1:10.000	35) 1:30.000 cada uno	35) 1:30.000 cada uno
PAC11	++	-	++	++
PAC12	++	-	++	++
PAC13	-	-	-	++
PAC14	-	-	+	+
PAC15	-	-	+++	+++
PAC16	+	-	+	+
PAC17	+	-	+	+
PAC18	++	-	-	-
PAC19	-	-	++	++
PAC20	++	-	-	-
POV31	+++	-	-	-
POV32	+	-	-	-
POV33	+	-	-	-
POV34	+	-	-	-
POV35	+	-	-	-
POV36	+	-	-	-
POV37	++	-	-	-
POV38	++	-	-	-
POV39	+++	-	-	-
POV40	+++	-	-	-

b)"Condiciones convencionales" de S. aureus/COL

Mancha	Conjunto CI (N26, CI34,	Infantil 14	CI 35	P18	P25	P29	Infantil 18
ID/suero	35) 1:30.000 cada uno	1:10.000	1:20.000	1:10.000	1:10.000	1:2.500	1:10.000
POV2	+++	+++	+++	+++	+++	-	-
POV3.1	+++	+++	+++	+++	+++	-	-
POV3.2	+++	+++	+++	+++	+++	-	-
POV4	+	+++	-	-	-	-	-
POV7	-	-	+++	-	-	-	-
POV10	-	++	(+)	(+)	-	(+)	-
POV12	-	-	-	-	-	+++	-
POV13	++	+++	+++	+++	++	++	-
POV14	++	+++	+++	++	++	++	-
POV15	+	+	-	+	(+)	-	-

c)"Condiciones de estrés" de S. aureus/COL

Mancha	Conjunto P	CI34 + CI35	P18	P29	Infantil
ID/suero	(P6, 18, 25, 28, 29)	1:20.000 cada uno	1:10.000	1:10.000	1:10.000
	1:50.000 cada uno
POV16	-	+++	-	-	-
POV17	-	+++	(+)	-	-
POV18	+	-	++	-	-
POV19	(+)	-	+++	-	-
POV21	-	-	+	-	-
POV23	-	+	-	-	-
POV24	-	+	-	-	-
POV25	+	-	-	-	-

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TABLA 4 Antígenos de S. aureus identificados por secuenciación de MALDI-TOF-EM (ORF en letra negrita también identificada por visualización de superficie bacteriana)

Predicción de regiones antigénicas en antígenos seleccionadas identificados mediante análisis de proteoma serológico usando suero humano

Mancha ID	Proteína de	Función supuesta (mediante homología)	Seq ID Nº:	Localización
	S. aureus		(ADN, prot)	supuesta
	(Nº de ORF/abrev)
PCK2	OPF0599	glicinamida-ribosil sintasa	107, 108	citoplásmica
PCK5	ORF0484 yitU	proteína hipot. conservada (situ)	109, 110	citoplásmica
PCK6	ORF2309 mqo	malato quinona oxidasa asociada a	111, 112	membrana
		membrana		periférica
POV2	ORF0766 ux1	proteína fosfasata que contribuye a	113, 114	trans-membrana
		resistencia a meticilina
POV4, 17	ORF0078 EF- Tu	parte C-terminal de la proteína de 44	115, 116	citoplásmica/
PAC14, 19		kDa similar al factor de elongación Tu		secretada
POV5 1)	ORF0782	proteína reductasa portadora de la	117, 118	citoplásmica
		3-cetoacil-acilo (fabG)
POV7	ORF0317 SecA	proteína de transporte a través de la	39, 91	citoplásmica
		membrana SecA
POV10	ORF1252 yrzC	proteína hipotética de 11,9 kd BACSU	119, 120	citoplásmica
		hipotética (familia upf0074 (rff2)
POV12	ORF0621 pdhB	dihidrolipoamida acetiltransferasa (pdhB)	121, 122	citoplásmica
POV14	ORF0072 rpoB	ARN polimerasa \beta dirigida a ADN	125, 126	citoplásmica

TABLA 4 (continuación)

Mancha ID	Proteína de	Función supuesta (mediante homología)	Seq ID Nº:	Localización
	S. aureus		(ADN, prot)	supuesta
	(Nº de ORF/abrev)
POV15	OEF0077 EF-G	proteína de unión de vitronectina de	127, 128	citoplásmica
		85 kDa
POV18	no encontrado YLY1	proteína de estrés general YLY1	129, 130	citoplásmica
POV30 ^{1)}	ORF0069 RL7	proteína ribosómica L7	131, 132	citoplásmica
POV21	ORF0103 yckG	probable celulosa-6-fosfato sintasa	133, 134	citoplásmica
		(yckG)
POV24	ORF0419	proteína hipotética conservada (yurX)	137, 138	citoplásmica
POV25	ORF2441 gidA	proteína a de división inhibida por	139, 140	citoplásmica
		glucosa (gid A)
PAC1	ORF1490 prsA	precursor de proteína exportadora de	173, 174	periplásmica
		proteína PRSA (prsA)
PAC2	ORF1931 ModA	proteína de unión de molibdato	175, 176	superficie
		periplásmica (ModA)
PAC3	ORF2053	activador transcripcional dependiente	177, 178	citoplásmica
		de metales pesados, regulador supuesto
		de bomba de eflujo de resistencia a
		multifármacos pmrA
PAC5	ORF2233 ydaP	piruvato oxidasa (ydaP)	179, 180	citoplásmica
PAC11	ORF1361	LPXTGV, matriz extracelular-bdg	3, 56	superficie
PAC12	ORF1244 alaS	alanil-ARNt sintetasa	159, 160	citoplásmica
PAC13	ORF0835 yrmA	enzima procesadora de ARN / ATP-bdg	161, 162	citoplásmica
PAC15	ORF1124 bfmBB	componente de lipoamid acetiltransferasa	163, 164	citoplásmica
		de complejo cadena alfa-ceto ácido
		deshidrogenasa ramificado
PAC16	ORF0340 GAPDH	gliceraldehído-3 fosfato deshidrogenasa	165, 166	citoplásmica
PAC17	no encontrado	5'-metiltioadenosina nucleosidasa /
	Contig83	S-adenosilhomo-cisteína nucleosidasa
PAC20	ORF2711	75% de identidad a ORF2715	167, 168	desconocida
		similar a proteínas hipotéticas
POV31	ORF0659	proteína de superficie de 29 kDa	236, 238	superficie
POV32	ORF0659	proteína de superficie de 29 kDa	236, 238	superficie
POV33	ORF0659	proteína de superficie de 29 kDa	236, 238	superficie
POV34	ORF0659	proteína de superficie de 29 kDa	236, 238	superficie
POV35	ORF0659	proteína de superficie de 29 kDa	236, 238

TABLA 4 (continuación)

Mancha ID	Proteína de	Función supuesta (mediante homología)	Seq ID Nº:	Localización
	S. aureus		(ADN, prot)	supuesta
	(Nº de ORF/abrev)
POV36	ORF00661	proteína de dominio de anclaje de	235, 237	superficie
		pared celular del motivo LPXTG
POV37	ORF0659	proteína de superficie de 29 kDa		superficie
POV38	ORF0659	proteína de superficie de 29 kDa	236, 238	superficie
POV39	ORF0657	proteína de superficie anclada de LPXTG	1, .142	superficie
POV40	no identificada

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Seq ID números	Mancha ID	ORF de S. aureus	Localización supuesta	Áreas de superficie antigénica
(proteína)		nº/abrev.		(paquete antigénico)
112	PCK6	ORF2309 mqo	membrana periférica	\begin{minipage}[t]{40mm}61-75, 82-87, 97-104, 113-123, 128-133, 203-216, 224-229, 236-246, 251-258, 271-286, 286-294, 301-310, 316-329, 337-346, 348-371, 394-406, 418-435, 440-452\end{minipage}
114	POV2	ORF766 aux1	transmembrana	\begin{minipage}[t]{40mm}30-37, 44-55, 83-91, 101-118, 121-128, 136-149, 175-183, 185-193, 206-212, 222-229, 235-242\end{minipage}
116	POV4	ORF078 EF-Tu	citoplásmica/secretada	\begin{minipage}[t]{40mm}28-38, 76-91, 102-109, 118-141, 146-153, 155-161, 165-179, 186-202, 215-221, 234-249, 262-269, 276-282, 289-302, 306-314, 321-326, 338-345, 360-369, 385-391\end{minipage}
176	PAC2	ORF1931 ModA	periplásmica	\begin{minipage}[t]{40mm}29-44, 74-83, 105-113, 119-125, 130-148, 155-175, 182-190, 198-211, 238-245\end{minipage}
174	PAC1	ORF1490 prsA	periplásmica	\begin{minipage}[t]{40mm}5-24, 38-44, 100-106, 118-130, 144-154, 204-210, 218-223, 228-243, 257-264, 266-286, 292-299\end{minipage}
168	PAC29	ORF2711	desconocida	\begin{minipage}[t]{40mm}7-14, 21-30, 34-50, 52-63, 65-72, 77-84, 109-124, 129-152, 158-163, 175-190, 193-216, 219-234\end{minipage}

Mancha ID	GI nº o TIGR nº	Proteína de S. aureus	Localización supuesta (por homología)	Seq ID nº:
		(ORF nº /abrev.)		(ADN, Prot)
PCK2	TIGR1280	ORF0599 mqo	glicinamida-ribosil sintasa	107, 108
PCK4	7672993	ORF2268 lsaA	posiblemente adhesión/agregación	12, 64
PCK5	TIGR6209	ORF0484 yitU	proteína hipotética conservasa (situ)	109, 110
PCK6	TIGR6182	ORF2309 ModA	malato-quinona-oxidasa asociada a	112, 113
			membrana
POV2	6434044	ORF0766 aux1	proteína fosfatasa que contribuye a	113, 114
			resistencia a meticilina
POV3.1	7672993	ORF2268 lsaA	posiblemente adhesión/agregación	12, 64
POV3.2	7672993	ORF2268 lsaA	posiblemente adhesión/agregación	12, 64
POV4	TIGR8079	ORF0078 EF-Tu	parte C-terminal de proteína de 44 kDa	115, 116
			similar al factor de elongación Tu
POV5 ^{1)}	TIGR8091	ORF0782	proteína reductasa vehículo de	117, 118
			3-cetoacil-acil (fabG)
POV7	2500720	ORF0317 SecA	transporte de proteína a través de la	39, 91
			membrana SecA
POV10	TIGR8097	ORF1252 yrcC	proteína hipotética BACSU hipotética	119, 120
			11,9 kd (familia upf0074 (rff2)
POV12	2499415	ORF0621 pdhB	dihidrolipoamida acetiltransferasa (odhB)	121, 122
POV13	74700965	ORF0094 SdrD	homólogo de la proteína de	123, 124
			fibrinógeno-bdg (LPTXG) (SdrD)
POV14	1350849	ORF0072 rpoB	ARN polimerasa \beta dirigida a ADN	125, 126
POV15	6920067	ORF0077 EF-G	proteína de unión a vitronectina de 85 kD	127, 128
POV17	TIGR8079	ORF0078	parte C-terminal de la proteína de 44 kDa	115, 116
			similar al factor de elongación Tu
POV18	3025223	no encontrada	proteína de estrés general YLY1	129, 130
POV30 ^{1)}	350771	ORF0069 RL7	proteína ribosómica L7	131, 132
POV21		ORF0103	probable hexulosa-6-fosfatasa sintasa	133, 134
			(yckG)
POV23		ORF0182	lipoproteína (S. epidermis)	135, 136
^{1)} \begin{minipage}[t]{155mm} identificada a partir de un lisado total de S. aureus 8325-4 spa-desarrollada en condiciones habituales. La seroactividad con suero de pacientes 1/1 y normales 2/4 pero no con suero infantil (C5). \end{minipage}

Referencias

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Intercell Biomedizinische Forschungs und Entwicklungs AG Cister Biotechnologies GMBH

R 39035

Prioridad: solicitud de patente austriaca Nº A 130/2001 de 26. 01. 2001

Seq. ID números 1-598

Organismos: S. aureus; S. epidermis

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Claims

1. Procedimiento para la identificación, aislamiento y producción de antígenos reactivos en suero hiperinmunes de un patógeno, siendo dichos antígenos adecuados para uso en una vacuna para un tipo dado de animal o para seres humanos, caracterizado por las siguientes etapas:

\bullet: seleccionar dicha al menos una librería de expresión de superficie bacteriana con dicha preparación de anticuerpos,

\bullet: seleccionar los antígenos identificados con preparaciones de anticuerpos individuales de suero individual de individuos con antígenos contra dicho patógeno específico,

\bullet: identificar la porción antigénica reactiva en suero hiperinmune de dichos antígenos identificados y dichos antígenos reactivos de sueros hiperinmunes se unen a una parte relevante de dichas preparaciones de anticuerpos individuales de dicho suero individual y

\bullet: opcionalmente aislar dichos antígenos reactivos de sueros hiperinmunes y producir dichos antígenos reactivos en suero hiperinmune mediante procedimientos químicos o recombinantes, con tal que dicho suero individual sea de pacientes que muestran un título de anticuerpo contra dicho patógeno específico sea mayor que el percentil 90 y un título de IgG superior a 10000 U.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para la identificación, aislamiento y producción de un conjunto prácticamente completo de antígenos reactivos de sueros hiperinmunes de un patógeno específico, siendo dichos antígenos adecuados para uso en una vacuna para un tipo dado de animal o para seres humanos, caracterizado por las siguientes etapas:

\bullet: identificar la porción antigénica reactiva en suero hiperinmune de dichos antígenos identificados dichos antígenos reactivos de sueros hiperinmunes se unen a una parte relevante de dichas preparaciones de anticuerpos individuales de dicho suero individual,

\bullet: opcionalmente aislar dichos antígenos reactivos de sueros hiperinmunes y producir dichos antígenos reactivos de suero hiperinmune mediante procedimientos químicos o recombinantes, con tal que dicho suero individual sea de pacientes que muestran un título de anticuerpo contra dicho patógeno específico sea mayor que el percentil 90 y un título de IgG superior a 10000 U.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 caracterizado porque se realiza la selección con al menos una librería de expresión, en el que la librería de expresión se selecciona entre una librería de representación de ribosomas y un proteoma.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2 caracterizado porque dichas al menos tres librerías de expresión diferentes son al menos una librería de representación de ribosomas, una librería de superficie bacteriana y un proteoma.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha combinación de plasma es una combinación de plasma humano tomada de individuos que han experimentado o están experimentando una infección con dicho patógeno.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dichas librerías de expresión son librerías de expresión genómicas de dicho patógeno.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dichas librerías de expresión son librerías de expresión son librerías de expresión genómicas, preferiblemente con una redundancia de al menos 2 x, más preferido al menos 5 x, especialmente al menos 10 x.

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque comprende las etapas de selección de al menos una librería de representación de ribosomas, una librería de representación de superficie bacteriana y un proteoma con dicha preparación de anticuerpos e identificar antígenos que se unen en al menos dos, preferiblemente que se unen a todas dichas selecciones a anticuerpos en dicha preparación de anticuerpos.

9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque dicho patógeno se selecciona entre el grupo de patógenos bacterianos, virales, fúngicos y protozoarios.

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque dicho patógeno se selecciona entre el grupo de virus de inmunodeficiencia, virus de hepatitis A, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, virus de sarcoma de Rous, virus de Epstein Barr, virus de la gripe, rotavirus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Stretococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Plasmodium sp., Aspergillus sp., o Candida albicans.

11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, caracterizado porque al menos una librería de expresión es una librería de representación de ribosomas y dichos antígenos reactivos de suero hiperinmune se producen mediante la expresión de las secuencias codificadoras de dichos antígenos reactivos de suero hiperinmune contenidos en dicha librería.

12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque dichos antígenos reactivos de suero hiperinmune se terminan a una preparación farmacéutica, opcionalmente mediante la adición de un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque dicha preparación farmacéutica es una vacuna.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque dicho vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable es un compuesto inmunoestimulador.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque dicho compuesto inmunoestimulador se selecciona entre el grupo de sustancias policatiónicas, especialmente péptidos policatiónicos, desoxinucleótidos inmunoestimuladores, alumbre, adyuvantes completos de Freund, compuestos neuroactivos, especialmente la hormona del crecimiento humana, o las combinaciones de los mismos.

16. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque dichas preparaciones de anticuerpos individuales se derivan de pacientes con infección aguda con dicho patógeno siendo un título de anticuerpo para dicho patógeno mayor que 95% de suero de paciente humano o vehículo ensayado.

17. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque al menos 10, preferiblemente al menos 30, especialmente al menos 50, preparaciones de anticuerpos individuales se usan en al identificación de dichos antígenos de reactivos de suero hiperinmune.

18. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque dicha porción relevante de dichas preparaciones de anticuerpos individuales son al menos 10, preferiblemente al menos 30, especialmente al menos 50 preparaciones de anticuerpos individuales, y al menos 20 %, preferiblemente al menos 30%, especialmente al menos 40%, de todas las preparaciones de anticuerpos individuales usadas en dicha selección.

19. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque dichos sueros individuales se seleccionan por tener un título de IgA contra un lisado, componentes de la pared celular o proteínas recombinantes de dicho patógeno siendo superior a 4000 U, especialmente sueros a 6000 U, y/o por tener un título de IgG que es superior a 12000 U.

20. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque dicho patógeno es un patógeno Staphylococcus, especialmente Staphylococcus aureus y/o Staphylococcus epidermidis.