CN104569386B - 一种罗非鱼源无乳链球菌elisa快速检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种罗非鱼源无乳链球菌elisa快速检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒及其检测方法，属于检测技术领域。所述的试剂盒包含酶标板，包被缓冲液、封闭液、洗涤缓冲液、一抗血清，稀释液、二抗羊抗兔IgG-HRP酶标抗体，底物显色液和终止液。其中，所用的包被抗原为用包被缓冲液稀释的浓度为106～108cfu/mL的病原菌液。该间接ELISA？方法是将以经分离并培养得到的病原菌液为作为包被抗原；而且判断标准如下：（被检样品OD450？值－空白对照OD450值）/（阴性对照样品OD450值－空白对照OD450值）≥2.1。通过特异性试验、阻断实验、重复性试验及临床检测，证明本发明具有特异性好、灵敏度高、重复性好及快速、简便、准确的特点，可用于罗非鱼源无乳链球菌的临床大规模检测和流行病学调查。

Description

一种罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种无乳链球菌早期快速检测技术，尤其是一种罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒及其检测方法，属于检测技术领域。
背景技术
无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)又名B族链球菌(GroupBStreptococcus，GBS)，革兰氏阳性球菌，是自然界中广泛存在的一种条件致病菌。罗非鱼是我国出口量最大的养殖鱼类，曾经以易养抗病力强著称，但2009年在我国海南省首次大规模爆发无乳链球菌病后，已成为危害我国罗非鱼产业最严重的病原菌。从生产角度，该病面临表现症状复杂化，发病快，死亡率高等特点，给防治技术的研究和应用带来了困难，也是目前尚无有效手段控制的症结之一。因此，建立简便，稳定的无乳链球菌快速检测技术，尤其是早期快速检测技术就显得尤为重要和迫切。PCR检测方法(双重PCR，三重PCR，巢式PCR)灵敏度高，但受实验条件、费用高、假阳性率高点等因素的限制，不宜推广。相比之下ELISA方法操作简单易行，无需特殊仪器，更适合基层单位进行罗非鱼无乳链球菌病原菌的筛查。郭玉娟(2012年)和霍欢欢(2013年)的研究表明，我国罗非鱼源无乳链球菌的分子血清型均为Ia型，说明不同年份和不同地区的罗非鱼源无乳链球菌在血清型上未发生明显的变异，为无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的研制和临床适用提供了基础保障。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒及其检测方法，能实现对罗非鱼源无乳链球菌高通量快速检测。
按照本发明提供的技术方案，一种罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒，包括酶标板，包被缓冲液、BSA封闭液、PBST洗涤缓冲液、一抗阳性血清、阴性对照血清、稀释液、酶标二抗、底物显色液和终止液；
包被抗原为用包被缓冲液稀释的浓度为106～108cfu/mL的病原菌液；
所述快速检测试剂盒的检测方法是将以经分离并培养得到的病原菌液为作为包被抗原；阳性判断标准如下：(被检样品OD450值－空白对照OD450值)/(阴性对照样品OD450值－空白对照OD450值)≥2.1。
所述包被缓冲液为0.05M碳酸盐缓冲液，pH为9.6；其组份为Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，无菌水定容至1000mL，4℃保存不超过1周。
所述PBST洗涤缓冲液为含吐温-20的0.15MPBS，其组份为：NaCl8.0g；Na2HPO4.12H2O2.9g；KCl0.2g；KH2PO40.24g；吐温-200.5mL；H2O1000mL。
所述的BSA封闭液为0.25％～1％的牛血清蛋白溶液，其组份为：0.25g～1g的牛血清蛋白、100mL的PBST洗涤缓冲液。
所述的一抗阳性血清是以罗非鱼源无乳链球菌LB110808-2为抗原，免疫兔子获得效价达1:2560以上的多克隆抗体；未进行免疫的兔血清作为阴性对照血清。
所述的酶标二抗为羊抗兔IgG-HRP酶标抗体。
所述的稀释液为0.1％的牛血清蛋白溶液，其组份为0.1g的牛血清蛋白、100mL的PBST洗涤缓冲液。
所述的底物显色液为可溶型单组分TMB(即四甲基联苯胺)底物溶液，其组分为TMB(2mg/mL无水乙醇)0.5mL，底物缓冲液10mL，0.75％H2O232.0μL；所述的底物缓冲液配制方法为0.2MNa2HPO425.7mL，0.1M柠檬酸24.3mL，ddH2O定容至50mL。
所述的终止液为2MH2SO4。
所述罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的检测方法，步骤为：
(1)抗原包被：用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释病原菌，每种病原菌分别设阴性对照孔和空白对照孔，每个被检样品孔和阴性对照孔内分别加入50～150μL的106～108cfu/mL浓度的病原菌，空白对照孔加入50～150μL的包被缓冲液，60℃烘箱内4～12小时烘干；
(2)洗板：每个酶标板孔内加入200～300μLPBST洗涤缓冲液，静置1～5分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；
(3)封闭：每个酶标板孔内加入100～300μL0.25％～1％的BSA封闭液，封闭60～120分钟；空白对照孔不加任何试剂；
(4)洗板：每个酶标板孔内加入200～300μLμLPBST洗涤液，静置1～5分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；
(5)加一抗阳性血清：一抗阳性血清用稀释液稀释5000～30000倍后，每孔100μL，37℃孵育60～90min；被检样品孔加一抗阳性血清，阴性对照孔加阴性对照血清，空白对照孔不加任何试剂；
(6)洗板：每个酶标板孔内加入200～300μLPBST洗涤液，静置1～5分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；
(7)加酶标二抗：每孔加入工作浓度1000～2000倍稀释的50～150μL的羊抗兔IgG-HRP酶标抗体，37℃孵育60～90min；
(8)洗板：每个酶标板孔内加入200～300μLPBST洗涤液，静置1～5分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；
(9)加底物：每孔加入可溶型单组分TMB底物溶液50～150μL，37℃避光反应15～20min；
(10)终止反应：每孔加入终止液50μL；
(11)读数：在酶标仪450nm下读数；
(12)结果的判断：
a、肉眼观察：与阴性对照孔进行比较，若被检样品孔中现黄色，则被检样品孔为阳性；若被检样品孔与阴性对照孔一样为无色，则被检样品孔为阴性；
b、酶标仪检测：(被检样品OD450值－空白对照OD450值)/(阴性对照样品OD450值－空白对照OD450值)≥2.1，被检样品孔为阳性，反之则为阴性。
本发明的有益效果：本发明所建立的检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好及方便快捷和使用范围广的优点。本发明可在96孔酶标板中进行，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法，适用于基层单位对罗非鱼源无乳链球菌的临床大规模检测和流行病学调查。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1一种罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒
所述的试剂盒包含酶标板，包被缓冲液、封闭液、PBST洗涤缓冲液、一抗阳性血清、阴性对照血清、稀释液、酶标二抗、底物显色液和终止液，其中，所用的包被抗原为用包被缓冲液稀释的浓度为106cfu/mL的病原菌液。
该间接ELISA方法是将以经分离并培养得到的病原菌液为作为包被抗原；而且阳性判断标准如下：(被检样品OD450值－空白对照OD450值)/(阴性对照样品OD450值－空白对照OD450值)≥2.1。
所述包被缓冲液为0.05M碳酸盐缓冲液，pH为9.6，其组份为Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，无菌水定容至1000mL，4℃保存不超过1周。
所述PBST洗涤缓冲液为含吐温20的0.15MPBS，其组份为：NaCl8.0g；Na2HPO4.12H2O2.9g；KCl0.2g；KH2PO40.24g；吐温-200.5mL；H2O1000mL。
所述的封闭液为0.25％～1％的牛血清蛋白溶液，其组份为：0.25g～1g的牛血清蛋白、100mL的PBST洗涤缓冲液。
所述的一抗血清是以罗非鱼源无乳链球菌LB110808-2为抗原，免疫兔子获得效价达1:2560以上的多克隆抗体；未进行免疫的兔血清作为阴性对照血清。
所述的酶标二抗为羊抗兔IgG-HRP酶标抗体。
所述的稀释液为0.1％的牛血清蛋白溶液，其组份为：0.1g的牛血清蛋白、100mL的PBST洗涤缓冲液。
所述的底物显色液为可溶型单组分TMB(即四甲基联苯胺)底物溶液，其组分为TMB(2mg/mL无水乙醇)0.5mL，底物缓冲液10mL，0.75％H2O232.0μL；所述的底物缓冲液配制方法为0.2MNa2HPO425.7mL，0.1M柠檬酸24.3mL，ddH2O定容至50mL。
所述的终止液为2MH2SO4。
所述的试剂盒采用从罗非鱼上分离并培养得到的病原菌作为分析样品，其特征是，包括以下步骤：
(1)抗原包被：用PH9.6的碳酸盐缓冲液稀释病原菌，每种病原菌分别设阴性对照孔和空白对照孔，每个被检样品孔和阴性对照孔内分别加入100μL的106cfu/mL浓度的病原菌，空白对照孔加入100μL的包被缓冲液，60℃烘箱内4小时烘干；
(2)洗板：每个酶标板孔内加入300μLPBST洗涤液，静置3分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复5次；
(3)封闭：每个酶标板孔内加入200μL1％的BSA封闭液，封闭60分钟；空白对照孔不加任何试剂；(4)洗板：每个酶标板孔内加入300μLPBST洗涤液，静置3分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复5次；
(5)加一抗血清：一抗血清用稀释液稀释10000倍后，每孔100μL，37℃孵育lh；被检样品孔加一抗阳性血清，阴性对照孔加阴性对照血清，空白对照孔不加任何试剂；
(6)洗板：每个酶标板孔内加入300μLPBST洗涤液，静置3分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复5次；
(7)加酶标二抗：每孔加入工作浓度1000倍稀释的100μL的羊抗兔IgG-HRP酶标抗体，37℃孵育lh；
(8)洗板：每个酶标板孔内加入300μLPBST洗涤液，静置3分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复5次；
(9)加底物：每孔加入可溶型单组分TMB底物溶液100μL，37℃避光反应20min。
(10)终止反应：每孔加入终止液50μL。
(11)读数：在酶标仪450nm下读数。
(12)结果的判断：
a、肉眼观察：与阴性对照孔进行比较，若被检样品孔中现黄色，则被检样品孔为阳性；若被检样品孔与阴性对照孔一样为无色，则被检样品孔为阴性；
b、酶标仪检测：(被检样品OD450值－空白对照OD450值)/(阴性样品OD450值－空白对照OD450值)≥2.1，被检样品孔为阳性，反之则为阴性。
实施例2一种罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的研制
1、一抗血清的收集和纯化
一抗血清收集采用背部多点注射免疫新西兰兔，共免疫4次，免疫间隔期为7d；首次免疫为弗氏完全佐剂与罗非鱼源无乳链球菌菌体(l:l)混合乳化，每只兔子注射免疫2.0mL；加强免疫为弗氏不完全左剂与罗非鱼源无乳链球菌菌体(l:l)混合乳化，每只兔子注射3.0mL。最后一次免疫7d后，耳缘静脉采血，试管凝集效价达1:2560以上即可耳静脉采血。血液室温静置数小时后，4000r/min离心吸取血清。同样的方法收集未进行免疫的兔血清，作为阴性对照血清。
血清纯化采用饱和硫酸铵盐析法。取2mL免疫血清加等量的pH7.40.01M磷酸盐缓冲液，将血清稀释l倍；再逐滴加入4mL饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌；置4℃冰箱静置lh，然后4℃低温4000r/min离心15min，弃上清，沉淀用2mL0.01M磷酸盐缓冲液溶解；冰浴中逐滴加入1mL饱和硫酸钱边加边搅拌，使饱和度为33％，置4℃冰箱静置lh，冷冻离心收集沉淀，重复操作2遍。将沉淀溶于1mL0.0lM磷酸盐缓冲液中，用100KD的超滤管于4℃离心除盐，用0.0lmol/L的磷酸盐缓冲液充分洗涤除盐，经1％BaCl和奈氏试剂检验虑液中己无NH4+和SO4 2-后，停止超滤。同样的方法用于阴性对照血清的纯化。
2、抗原最适包被浓度的确定
用棋盘式滴定法确定。将l08CFU·mL-1浓度的无乳链球菌从1:10至1:10000做系列稀释，每个稀释度包被2孔，每孔100μL，60℃烘干，固定阳性血清浓度(1:2000)，酶标二抗作1:1000稀释，根据说明书方法测定。以能产生OD450值为1.0左右，且P/N值(阳性对照OD450值一空白对照OD450值/阴性对照OD450值一空白对照OD450值)最大的抗原稀释度为最佳稀释度。结果见表1。
表1抗原最适包被浓度的确定
108 107 106 105 104
阳性血清 1.754 1.560 0.900 0.234 0.094
阴性对照 0.150 0.113 0.079 0.074 0.0874 -->
P/N 17.126 24.152 29.293 7.667 1.176
从表1中可以看出，当抗原包被浓度为l06CFU·mL-1时，OD450值最接近1.0时，且P/N值最大为29.293。所以抗原最佳包被浓度为l06CFU·mL-1。
2、免疫血清最适稀释度的确定
无乳链球菌抗原按最适工作浓度包被，将阳性血清和阴性血清分别按1:5000、1:10000、1:15000、1:20000、l:25000、l:30000进行系列稀释，每孔100L，每个稀释度2孔；酶标抗体作1:1000稀释，根据说明书方法测定。选择阳性血清的OD450值接近1.0，P/N值最大的稀释度为最适稀释度。结果见表2。
表2免疫血清最适稀释度的确定
5000× 10000× 15000× 20000× 25000× 30000×
阳性血清 1.0245 1.005 0.9295 0.8775 0.8895 0.7575
阴性对照 0.061 0.064 0.065 0.0675 0.0635 0.0595
P/N 78.08 68.214 55.031 42.538 54.290 67.476
从表2中可以看出，当免疫血清稀释度为10000倍时，OD450值最接近1.0时，且P/N值较大，为68.214。所以免疫血清最适稀释度为1:10000。
3、封闭液浓度和封闭时间的确定
无乳链球菌抗原按最适工作浓度包被，免疫血清采用最适稀释度，以0.25％BSA，0.5％BSA，1％BSA，3％BSA不同浓度的牛血清蛋白溶液为封闭液，根据说明书方法测定。以能产生OD450值为1.0左右，且P/N值(阳性对照OD450值一空白对照OD450值/阴性对照OD450值一空白对照OD450值)最大的抗原稀释度为最佳稀释度。结果见表3。
表3封闭液浓度和封闭时间的确定
从表3中可以看出，随着封闭时间的延长，P/N值基本都是逐渐加大，但考虑到试剂盒检测的时效性和OD450值尽量接近1.0，确定最适封闭浓度为1％BSA，封闭时间为60min。
4、免疫血清敏感性的确定
将无乳链球菌菌悬液稀释成107CFU·mL-1，而后进行十倍比稀释至102CFU·mL-1，将血清稀释到最适工作浓度，以确定最小的抗原检测浓度。以产生OD450值接近1.0，P/N值≥2.1判为阳性。结果见表4。
表4免疫血清敏感性的确定
菌悬液浓度(CFU·mL-1) 107 106 105 104 103 102
阳性血清 1.300 0.676 0.167 0.076 0.061 0.056
阴性对照 0.069 0.058 0.053 0.056 0.064 0.062
P/N 69.389 96.154 77.333 5.444 0.760 0.409
从表4可以看出，菌悬液为104CFU·mL-1时即可检出，即每孔103CFU，说明所建立的间接ELISA方法有很高的灵敏度。
5、特异性实验
(1)交叉实验：用浓度均为106CFU·mL-1的嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌包被酶标板，罗非鱼源无乳链球菌作为对照，血清采用最适稀释度，P/N值≥2.1判为阳性，检测是否有交叉反应情况。结果见表5。
表5免疫血清交叉性的确定
从表5可以看出，只有无乳链球菌交叉反应呈阳性，其余细菌呈阴性。
(2)阻断实验：将106CFU·mL-1L的无乳链球菌菌液包被酶标反应板，将阳性血清从l：200开始倍比稀释，各稀释度分别加入等量的无乳链球菌菌液，混匀后于37℃放置lh，同时设不做任何处理的抗无乳链球菌阳性血清和阴性血清作为对照，进行ELISA测定，测定其阻断率。其阻断率按下式计算：RP＝(N－T)/N，式中：RP为阻断率(％)；N为未经处理阳性血清的OD450值，T为经无乳链球菌菌液处理的阳性血清的OD450值。
表6阻断实验
200× 400× 800× 1000× 2000× 4000× 8000× 16000× 32000× 64000× 128000× 256000×
阻断后 1.041 1.172 1.150 1.179 1.122 0.978 0.768 0.604 0.396 0.239 0.145 0.104
阻断前 1.317 1.392 1.388 1.389 1.351 1.231 1.109 1.109 0.918 0.694 0.517 0.328
阴性对照 0.254 0.165 0.125 0.125 0.103 0.088 0.059 0.055 0.070 0.062 0.064 0.061
阻断率 20.927 15.841 17.147 15.119 16.957 20.561 30.762 45.582 56.917 65.609 72.023 68.244
从表6可以看出，无乳链球菌处理后的阳性血清随着稀释度的增加，OD450值明显下降，并逐渐接近阴性水平；而未经无乳链球菌处理的阳性血清随着稀释度的增加下降缓慢。阻断率最高可达72.023％，说明阳性血清对无乳链球菌具有特异性。
6、重复性实验
3种无乳链球菌抗原按最适工作浓度包被，免疫血清采用最适稀释度，按照实施例1的方法进行检测，每个检测8孔，由每孔的OD450值计算出平均OD450值与标准差(SD)，进而计算出板内变异系数(CV)(试验结果见表7)。同种无乳链球菌抗原按最适工作浓度包被，免疫血清采用最适稀释度，按照实施例1的方法在随机5块板上重复上述测定，每板检测8孔，根据OD450值可以计算出板间变异系数(试验结果见表8)。CV(％)＝SD/X×100，式中：CV为变异系数(％)，SD为标准差，X为OD450平均值。从表7和表8可以看出，板内变异系数和板间变异系数均小于10％，说明酶标板的吸附稳定性很好。
表7板内重复性结果
平均值 标准差 变异系数
阳性血清 1.162 1.154 1.137 1.179 1.175 1.136 1.187 1.150 1.160 0.019 1.638
阴性对照 0.068 0.072 0.073 0.075 0.069 0.070 0.079 0.069 0.072 0.004
P/N 50.727 52.524 39.000 56.200 74.733 51.762 45.320 64.588 52.509
阳性血清 1.165 1.131 1.156 1.211 1.162 1.140 1.184 1.157 1.163 0.025 2.150
阴性对照 0.068 0.072 0.073 0.075 0.069 0.070 0.079 0.069 0.072 0.004
P/N 50.864 51.429 39.679 57.800 73.867 51.952 45.200 65.000 52.663
阳性血清 1.152 1.164 1.180 1.197 1.164 1.164 1.167 1.153 1.168 0.015 1.284
阴性对照 0.068 0.072 0.073 0.075 0.069 0.070 0.079 0.069 0.072 0.004
P/N 50.273 53.000 40.536 57.100 74.000 53.095 44.520 64.765 52.870
表8板间重复性结果
1板 平均值 标准差 变异系数
阳性血清 1.156 1.136 1.078 1.092 1.065 1.037 1.027 1.007 1.075 0.052 4.854
阴性对照 0.078 0.082 0.084 0.091 0.093 0.086 0.082 0.075 0.084 0.006
P/N 39.500 33.938 30.235 25.415 23.605 27.417 30.531 38.280 30.251
2板
阳性血清 1.162 1.154 1.137 1.179 1.175 1.136 1.187 1.150 1.160 0.019 1.649
阴性对照 0.068 0.072 0.073 0.075 0.069 0.070 0.079 0.069 0.072 0.004
P/N 50.727 52.524 39.000 56.200 74.733 51.762 45.320 64.588 52.509
3板
阳性血清 1.009 0.981 0.961 0.987 0.996 0.971 1.026 1.008 0.992 0.022 2.218
阴性对照 0.078 0.076 0.053 0.062 0.067 0.067 0.067 0.067 0.067 0.012
P/N 30.094 30.194 114.500 155.167 177.905 64.421 63.869 67.018 87.896
4板
阳性血清 0.957 0.952 1.022 1.022 1.010 0.966 1.076 1.045 1.006 0.045 4.423
阴性对照 0.056 0.079 0.120 0.064 0.080 0.080 0.080 0.080 0.080 0.028
P/N 151.167 33.333 14.667 107.444 33.357 30.790 34.487 34.574 54.977
5板
阳性血清 0.867 0.890 0.925 0.956 0.987 0.954 0.999 1.026 0.951 0.054 5.723
阴性对照 0.065 0.066 0.061 0.076 0.067 0.067 0.067 0.067 0.067 0.006
P/N 43.211 46.778 67.462 39.261 47.000 47.684 72.692 60.938 53.128
实施例3一种罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的临床验证。
采用实施例1的方法对2009～2013年我国罗非鱼主产区收集的44株无乳链球菌(菌株信息见表1中标号1～44)ELISA快速检测，结果见表9，从表9看出，所有44株罗非鱼源无乳链球菌ELISA检测结果显示呈阳性。
表9一种罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的临床验证结果
序号 菌种编号 P/N 检测结果 序号 菌种编号 P/N 检测结果
1 HN090816-1 6.52 + 23 BHC110810-2 13.55 +
2 HN090816-2 6.21 + 24 BHC110810-3 7.88 +
3 LG100621-1 37.71 + 25 BHX110810-1 10.69 +7 -->
4 LG100621-3 5.07 + 26 BHX110810-2 5.24 +
5 LG100621-4 4.18 + 27 BHX110810-3 20.41 +
6 LG100621-5 4.98 + 28 GX1201 15.01 +
7 HN20 8.21 + 29 GX1202 5.88 +
8 HN1201 9.30 + 30 GX1203 11.56 +
9 HN1202 5.97 + 31 GX1204 10.44 +
10 HN1203 6.52 + 32 GD35 12.66 +
11 HN1204 3.22 + 33 GD36 17.97 +
12 HN1205 4.38 + 34 GD37 10.50 +
13 HN1206 7.82 + 35 GD45 4.33 +
14 HN1207 11.90 + 36 GD51 8.83 +
15 HN1208 18.69 + 37 GD1301 23.54 +
16 HN1209 6.74 + 38 GD1302 15.87 +
17 LB110808-2 5.51 + 39 GD1303 69.63 +
18 YF110808-1 21.88 + 40 GD1304 8.46 +
19 YF110808-2 18.31 + 41 GD1305 53.89 +
20 YF110808-3 4.03 + 42 FJ0701 10.01 +
21 YF110808-4 28.31 + 43 FJ1001 53.47 +
22 BHC110810-1 18.64 + 44 FJ1101 75.08 +
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的检测方法，其特征是步骤为：
（1）抗原包被：用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释病原菌，每种病原菌分别设阴性对照孔和空白对照孔，每个被检样品孔和阴性对照孔内分别加入50～150μL的106～108cfu/mL浓度的病原菌，空白对照孔加入50～150μL的包被缓冲液，60℃烘箱内4～12小时烘干；
（2）洗板：每个酶标板孔内加入200～300μLPBST洗涤缓冲液，静置1～5分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；
（3）封闭：每个酶标板孔内加入100～300μL0.25%～1%的BSA封闭液，封闭60～120分钟；空白对照孔不加任何试剂；
（4）洗板：每个酶标板孔内加入200～300μLPBST洗涤液，静置1～5分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；
（5）加一抗阳性血清：一抗阳性血清用稀释液稀释5000～30000倍后，每孔100μL，37℃孵育60～90min；被检样品孔加一抗阳性血清，阴性对照孔加阴性对照血清，空白对照孔不加任何试剂；
（6）洗板：每个酶标板孔内加入200～300μLPBST洗涤液，静置1～5分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；
（7）加酶标二抗：每孔加入工作浓度1000～2000倍稀释的50～150μL的羊抗兔IgG-HRP酶标抗体，37℃孵育60～90min；
（8）洗板：每个酶标板孔内加入200～300μLPBST洗涤液，静置1～5分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；
（9）加底物：每孔加入可溶型单组分TMB底物溶液50～150μL，37℃避光反应15～20min；
（10）终止反应：每孔加入终止液50μL；
（11）读数：在酶标仪450nm下读数；
（12）结果的判断：
a、肉眼观察：与阴性对照孔进行比较，若被检样品孔中现黄色，则被检样品孔为阳性；若被检样品孔与阴性对照孔一样为无色，则被检样品孔为阴性；
b、酶标仪检测：（被检样品OD450值－空白对照OD450值）/（阴性对照样品OD450值－空白对照OD450值）≥2.1，被检样品孔为阳性，反之则为阴性。
2.如权利要求1所述罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的检测方法，其特征是：所述包被缓冲液为0.05M碳酸盐缓冲液，pH为9.6。
3.如权利要求1所述罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的检测方法，其特征是：所述PBST洗涤缓冲液为含吐温-20的0.15M的PBS溶液。
4.如权利要求1所述罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的检测方法，其特征是：所述的BSA封闭液为质量浓度0.25%～1%的牛血清蛋白溶液。
5.如权利要求1所述罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的检测方法，其特征是：所述的一抗阳性血清是以罗非鱼源无乳链球菌LB110808-2为抗原，免疫兔子获得的多克隆抗体；未进行免疫的兔血清作为阴性对照血清。
6.如权利要求1所述罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的检测方法，其特征是：所述的酶标二抗为羊抗兔IgG-HRP酶标抗体。
7.如权利要求1所述罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的检测方法，其特征是：所述的稀释液为质量浓度0.1%的牛血清蛋白溶液。
8.如权利要求1所述罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的检测方法，其特征是：所述的底物显色液为可溶型单组分TMB四甲基联苯胺底物溶液。
9.如权利要求1所述罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的检测方法，其特征是：所述的终止液为2M的H2SO4。
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