CN109781996A - 一种肺炎克雷伯菌抗体elisa快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒及检测方法，属于抗体检测领域，能够实现对水貂血清中肺炎克雷伯菌抗体水平的快速检测。本发明包括包被抗原、包被缓冲液、2％BSA封闭液、PBST洗涤缓冲液、一抗阳性血清、阴性对照血清、样品稀释液、酶标二抗、底物显色液和终止液；包被抗原为用包被缓冲液稀释成浓度为10⁷～10⁹cfu/mL的病原菌液。通过试验证实本发明的肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒具有特异性好、灵敏度高、重复性好、快速、简便、准确等特点，同时还具有结果稳定、使用范围广的优点，可用于水貂血清中肺炎克雷伯菌抗体的大规模检测，有利于了解整个水貂群肺炎克雷伯菌病抗体的状况。

Description

一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于抗体检测技术领域，具体涉及一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒及检测方法。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，Kpn)为革兰阴性菌，属于肠杆菌科克雷伯菌属，是动物呼吸道和肠道内的寄生性条件致病菌，正常条件下极少侵害家畜，只有在特殊情况下如免疫功能低下或长期使用抗菌药物时，能致动物的肺炎、子宫炎、乳腺炎及其他化脓性炎症，偶尔能引起败血症。水貂肺炎克雷伯病是由肺炎克雷伯菌引起的，以肺部出血、脓肿、蜂窝织炎、麻痹和脓毒败血症为特征的传染病。近年来，有关肺炎克雷伯氏菌感染水貂被而引起严重疾病的报道迅速增加，其在毛皮动物养殖业中的危害越发严重，已成为危害水貂养殖的主要传染病之一。因此，建立简便，稳定的血清中肺炎克雷伯菌抗体检测技术，尤其是早期快速检测技术就显得尤为重要和迫切。

目前，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测肺炎克雷伯菌抗体的研究尚未见报道。

发明内容

为克服现有技术存在的不足，本发明提供一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒及检测方法，能够实现对水貂血清中肺炎克雷伯菌抗体水平的快速检测。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，包括：包被抗原、包被缓冲液、BSA封闭液、PBST洗涤缓冲液、一抗阳性血清、阴性对照血清、样品稀释液、酶标二抗、底物显色液和终止液；

所述包被抗原为用包被缓冲液稀释成浓度为10⁷～10⁹cfu/mL的病原菌液；

所述一抗阳性血清是以肺炎克雷伯菌为抗原，免疫水貂获得的血清；

所述阴性对照血清为未进行免疫的水貂血清。

作为优选的实施方式，所述包被缓冲液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6。

作为优选的实施方式，所述2％BSA封闭液为质量浓度1～5％的牛血清蛋白溶液。

作为优选的实施方式，所述PBST洗涤缓冲液为0.15M的PBS溶液。

作为优选的实施方式，所述样品稀释液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6。

作为优选的实施方式，所述酶标二抗为兔抗貂IgG-HRP酶标抗体。

作为优选的实施方式，所述底物显色液为可溶型单组分TMB四甲基联苯胺底物溶液。

作为优选的实施方式，所述终止液为2M的H₂SO₄。

本发明还提供了一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测方法，包括以下步骤：

步骤一、抗原包被

用包被缓冲液将病原菌稀释成浓度为10⁷～10⁹cfu/mL的病原菌液；设被检样品孔、阴性对照孔和空白对照孔，被检样品孔和阴性对照孔内分别加入上述病原菌液，加入量为50～150μL/孔，空白对照孔内加入包被缓冲液进行包被，加入量为100～300μL/孔；

步骤二、洗板

每个酶标板孔内加入100～300μL PBST洗涤缓冲液，静置3～5min，甩去洗液，在吸水纸上拍干，重复3～5次；

步骤三、封闭

每个酶标板孔内加入100～300μLBSA封闭液，封闭30～120min；空白对照孔不加任何试剂；

步骤四、洗板

重复步骤二；

步骤五、加一抗阳性血清

用样品稀释液将一抗阳性血清按1:(100～1000)倍稀释；被检样品孔加入一抗阳性血清，阴性对照孔加入阴性对照血清，加入量均为50～150μL/孔，37℃孵育30～90min；空白对照孔不加任何试剂；

步骤六、洗板

重复步骤二；

步骤七、加酶标二抗

用样品稀释液将酶标二抗按1:(2500～7500)倍稀释；每个酶标板孔内加入50～150μL的酶标二抗，37℃孵育30～90min；

步骤八、洗板

重复步骤二；

步骤九、加底物

每个酶标板孔内加入50～150μL底物显色液，37℃避光反应5～20min；

步骤十、终止反应

每个酶标板孔内加入50μL终止液；

步骤十一、结果判断

在酶标仪中读取D_450nm处的吸光度值；当被检样品的OD₄₅₀值＞X+3SD时，判定为阳性；当被检样品的OD₄₅₀值＜X+2SD时，判定为阴性；介于两者之间判定为可疑；X为吸光度值的平均值，SD为标准方差。

本发明的有益效果是：本发明首次采用水貂肺炎克雷伯菌液作为包被抗原，建立了可检测水貂肺炎克雷伯菌抗体的ELISA快速检测方法，可对水貂血清中的水貂肺炎克雷伯菌的抗体水平进行快速检测。

通过试验证实本发明的肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒具有特异性好、灵敏度高、重复性好、快速、简便、准确等特点，同时还具有结果稳定、使用范围广的优点，可用于水貂血清中肺炎克雷伯菌抗体的大规模检测，有利于了解整个水貂群肺炎克雷伯菌病抗体的状况。

另外，本发明的肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测方法在96孔酶标板中进行，样品检测成本低于传统的仪器检测，而且操作筒单易行，无需特殊仪器，大大提高了工作效率。

具体实施方式

按照本发明提供的技术方案，本发明的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，主要包括：包被抗原、包被缓冲液、2％BSA封闭液、PBST洗涤缓冲液、一抗阳性血清、阴性对照血清、样品稀释液、酶标二抗、底物显色液和终止液；其中的包被抗原为：用包被缓冲液稀释成浓度为10⁷～10⁹cfu/mL的病原菌液；一抗阳性血清是以肺炎克雷伯菌为抗原，免疫水貂获得的血清；未进行免疫的水貂血清作为阴性对照血清。

上述的包被缓冲液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6，其具体包括的组份为：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，无菌水定容至1000mL，室温保存。

上述的2％BSA封闭液为质量浓度1～5％的牛血清蛋白溶液，其具体的组份为：1～5g的牛血清蛋、100mL的PBST洗涤缓冲液。

上述的PBST洗涤缓冲液为0.15M的PBS溶液，其具体包括的组份为：NaCl 8.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，KH₂PO₄0.24g，吐温-20 0.5mL，H₂O1000mL。

上述的样品稀释液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6。

上述的酶标二抗为兔抗貂IgG-HRP酶标抗体。

上述的底物显色液为可溶型单组分TMB四甲基联苯胺底物溶液。底物显色液为可溶型单组分TMB(四甲基联苯胺)底物溶液，其具体的组份包括：TMB(2mg/mL无水乙醇)0.5mL，底物缓冲液10mL，H₂O₂(0.75％)32.0uL。其中的底物缓冲液的组份及配制方法为：0.2M Na₂HPO₄25.7mL，0.1M柠檬酸24.3mL，ddH₂O定容至50mL。

上述的终止液为2M的H₂SO₄。

本发明的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测方法，快速检测方法是将以分离并培养得到的病原菌液作为包被抗原，主要包括以下步骤：

步骤一、抗原包被

采用96孔酶标板；首先用包被缓冲液将病原菌稀释成浓度为10⁷～10⁹cfu/mL的病原菌液，优选浓度为10⁹cfu/mL；每种病原菌均设被检样品孔、阴性对照孔和空白对照孔，每个被检样品孔和阴性对照孔内均分别加入上述病原菌液，加入量为50～150μL/孔，空白对照孔内加入包被缓冲液进行包被，加入量为100～300μL/孔；

步骤二、洗板

每个酶标板孔内加入100～300μL PBST洗涤缓冲液，静置3～5min，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；

步骤三、封闭

每个酶标板孔内加入100～300μLBSA封闭液，封闭30～120min；空白对照孔不加任何试剂；

步骤四、洗板

重复步骤二：每个酶标板孔内加入100～300μLPBST洗涤缓冲液，静置3～5min，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；

步骤五、加一抗阳性血清

用样品稀释液将一抗阳性血清按照1:(100～1000)的稀释倍数进行稀释，优选稀释倍数为1:500；被检样品孔加入一抗阳性血清，阴性对照孔加入阴性对照血清，加入量均为50～150μL/孔，37℃孵育30～90min；空白对照孔不加任何试剂；

步骤六、洗板

重复步骤二：每个酶标板孔内加入100～300μL PBST洗涤缓冲液，静置3～5min，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；

步骤七、加酶标二抗

用样品稀释液将酶标二抗按照1:(2500～7500)的稀释倍数进行稀释，优选稀释倍数为1:5000；每个酶标板孔内加入50～150μL的酶标二抗，37℃孵育30～90min；

步骤八、洗板

重复步骤二：每个酶标板孔内加入100～300μLPBST洗涤缓冲液，静置3～5min，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；

步骤九、加底物

每个酶标板孔内加入50～150μL底物显色液，37℃避光反应5～20min；

步骤十、终止反应

每个酶标板孔内加入50μL终止液；

步骤十一、结果判断

在酶标仪中读取D_450nm处的吸光度值；根据统计学原理，当被检样品的OD₄₅₀值＞X+3SD时，判定为阳性；当被检样品的OD₄₅₀值＜X+2SD时，判定为阴性；介于两者之间判定为可疑；X为吸光度值的平均值，SD为标准方差。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1ELISA方法的建立及条件优化

1、抗原最佳包被浓度的优化以及一抗阳性血清、阴性对照血清稀释度的优化。病原菌液稀释后的浓度分别为：10⁷cfu/mL、10⁸cfu/mL、10⁹cfu/mL，一抗阳性血清、阴性对照血清的稀释度均为四个等级，分别为1:100、1:250、1:500、1:1000。经方阵法在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定了抗原最佳包被浓度为10⁹cfu/mL(表1)及一抗阳性血清、阴性对照血清最佳稀释度为1:500(表2)。

表1：抗原最佳包被浓度确定

表2：一抗最佳稀释度确定

2、抗原最佳包被时间的优化：将抗原用最佳包被量分别于三个条件下包被酶标板：4℃过夜；4℃过夜+37℃包被1h；37℃包被1h；在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定了抗原最佳包被时间为4℃过夜(表3)。

表3：抗原最佳包被时间确定

3、封闭液的优化：用2％BSA、5％胎牛血清、5％脱脂乳分别对包被的酶标板分解进行封闭，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定了最佳封闭剂为2％BSA封闭液(表4)。

表4：最佳封闭液确定

4、封闭时间的优化：用最佳封闭液对包被好的酶标板分别封闭37℃封闭0.5h、37℃封闭1h、37℃封闭1.5h、37℃封闭2h，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定了最佳封闭时间为37℃封闭1h(表5)。

表5：最佳封闭时间确定

5、一抗作用时间的优化：将一抗阳性血清、阴性对照血清分别按最佳浓度稀释后，37℃分别作用30min、45min、60min、90min，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定了最佳一抗作用时间为60min(表6)。

表6：最佳一抗作用时间确定

6、二抗最佳稀释度的优化：将HRP标记的二抗作1:2500、1:5000、1:7500稀释，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定了二抗最佳稀释度为1:5000(表7)。

表7：二抗最佳稀释度确定

7、二抗作用时间的优化：将最佳稀释度的酶标二抗37℃分别作用30min、45min、60min、90min，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定了二抗最佳作用时间为60min(表8)。

表8：二抗最佳作用时间确定

8、显色时间的确定：将TMB溶液在其他条件相同的情况下，加入反应体系，分别在37℃条件下避光显色5min、10min、15min、20min，根据P/N值确定了最佳显色时间为10min(表9)。

表9：最佳显色时间确定

实施例2ELISA快速检测方法阴阳性判定标准的建立

用建立的ELISA快速检测方法对50份阴性水貂血清分别检测2次，计算出阴性血清OD₄₅₀值的平均值和标准差。血清OD₄₅₀值＞0.374时，可判定为阳性；血清OD₄₅₀值＜0.34时，可判定为阴性的判定标准，介于0.34～0.374之间判定为可疑(表10)。

表10：50份肺炎克雷伯菌阴性血清OD₄₅₀值

实施例3交叉反应试验(特异性实验)

用包被好的酶标板同时检测大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌阳性血清、肺炎克雷伯菌阴阳性血清，分析本方法与其他的细菌有无交叉反应(表11)。

表11：特异性实验

血清	OD<sub>450</sub>值	结果
			大肠杆菌	0.084	-
巴氏杆菌	0.098	-
			沙门氏菌	0.101	-
绿脓杆菌	0.109	-
			肺炎克雷伯菌阳性血清	0.984	+
肺炎克雷伯菌阴性血清	0.233	-

通过特异性试验可知，本发明的检测方法与其他的细菌无交叉反应。

实施例4重复性试验

1、批内重复：同一批次包被的酶标板对8份血清做批内重复实验，每份血清3个平行(表12)。由表12可以看出，批内变异系数在0.182～4.22％，均小于5％，说明该本发明的检测方法具有良好的批内重复性。

表12：批内重复

2、批间重复：3个不同批次包被的酶标板8份血清，每份血清3个平行(表13)。由表13可以看出，批内变异系数在0.091～4.30％，均小于5％，说明本发明的检测方法具有良好的批间重复性。

表13：批间重复

本发明公开了一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

Claims (9)

1.一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，包括：包被抗原、包被缓冲液、2％BSA封闭液、PBST洗涤缓冲液、一抗阳性血清、阴性对照血清、样品稀释液、酶标二抗、底物显色液和终止液；

所述包被抗原为用包被缓冲液稀释成浓度为10⁷～10⁹cfu/mL的病原菌液；

所述一抗阳性血清是以肺炎克雷伯菌为抗原，免疫水貂获得的血清；

所述阴性对照血清为未进行免疫的水貂血清。

2.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6。

3.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，所述2％BSA封闭液为质量浓度1～5％的牛血清蛋白溶液。

4.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，所述PBST洗涤缓冲液为0.15M的PBS溶液。

5.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6。

6.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为兔抗貂IgG-HRP酶标抗体。

7.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，所述底物显色液为可溶型单组分TMB四甲基联苯胺底物溶液。

8.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为2M的H₂SO₄。

9.采用权利要求1至8中任意一项所述的试剂盒实现的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、抗原包被

用包被缓冲液将病原菌稀释成浓度为10⁷～10⁹cfu/mL的病原菌液；设被检样品孔、阴性对照孔和空白对照孔，被检样品孔和阴性对照孔内分别加入上述病原菌液，加入量为50～150μL/孔，空白对照孔内加入包被缓冲液进行包被，加入量为100～300μL/孔；

步骤二、洗板

每个酶标板孔内加入100～300μLPBST洗涤缓冲液，静置3～5min，甩去洗液，在吸水纸上拍干，重复3～5次；

步骤三、封闭

每个酶标板孔内加入100～300μLBSA封闭液，封闭30～120min；空白对照孔不加任何试剂；

步骤四、洗板

重复步骤二；

步骤五、加一抗阳性血清

用样品稀释液将一抗阳性血清按1:(100～1000)倍稀释；被检样品孔加入一抗阳性血清，阴性对照孔加入阴性对照血清，加入量均为50～150μL/孔，37℃孵育30～90min；空白对照孔不加任何试剂；

步骤六、洗板

重复步骤二；

步骤七、加酶标二抗

用样品稀释液将酶标二抗按1:(2500～7500)倍稀释；每个酶标板孔内加入50～150μL的酶标二抗，37℃孵育30～90min；

步骤八、洗板

重复步骤二；

步骤九、加底物

每个酶标板孔内加入50～150μL底物显色液，37℃避光反应5～20min；

步骤十、终止反应

每个酶标板孔内加入50μL终止液；

步骤十一、结果判断

在酶标仪中读取D_450nm处的吸光度值；当被检样品的OD₄₅₀值＞X+3SD时，判定为阳性；当被检样品的OD₄₅₀值＜X+2SD时，判定为阴性；介于两者之间判定为可疑；X为吸光度值的平均值，SD为标准方差。