CN111044716B - 封闭剂及封闭方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种封闭剂，其包括BSA和缓冲液，所述缓冲液的pH值为3.8～5.0。该封闭剂能够克服常规封闭剂中存在的缺陷。此外，本发明还涉及封闭方法。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断领域，具体涉及固相载体的封闭方法。
背景技术
在免疫分析过程中，固相载体常用于与特定的免疫分析物结合，从而作为捕获组分对样本中存在的某一(些)物质进行测定。在结合了特定的免疫分析物后，需要对固相载体未结合的位置(位点)进行封闭，以避免非特异性结合对测定所带来的干扰。
目前，常用的固相载体封闭剂有BSA、脱脂奶粉、酪蛋白等。
脱脂奶粉含有多种不同分子量的蛋白，其最大的优点在于价钱便宜，但其成分相对复杂，而且自身含有生物素，因此在使用生物素-亲和素系统时，会使得高背景或本底水平增高，所以使用范围相对较窄。另外，用脱脂奶粉封闭后的载体也不易长期保存。
BSA是另一种常见的封闭剂，其来源于牛血清，特点在于成分单一，因此适合对特异性要求较高的实验。但是BSA中会存在抗体残留，会导致抗原/抗体之间的交叉反应，产生高背景，使得本底水平增高，从而影响检测结果。
酪蛋白与BSA作用类似，但酪蛋白不易溶解，配置较为困难。
综上所述，当前免疫分析领域中所使用的封闭剂或多或少存在一些缺陷，从而为测试本身带来一定负面影响，故存在着对于改善封闭剂的效果的强烈需求。
发明内容
为了克服已有封闭剂所存在的缺陷，本发明人对常见的BSA封闭剂的参数进行了研究，从而完成本发明。
据此，在第一方面，本发明提供了一种封闭剂，其包括BSA和缓冲液，并且所述缓冲液的pH值为约3.8～约5.0。
对固相载体进行封闭后，与常规的BSA封闭剂相比，本发明的封闭剂显著地减少了本底信号值。不希望受到理论的束缚，我们推测，这是由于在pH约3.8～约5.0的缓冲体系下，能够减少BSA中残留的抗体所发生的交叉反应。由于本底信号值的降低，本发明的封闭剂提高了免疫分析试剂的线性范围。进一步地，采用本发明的封闭剂在较高温度的条件(如水浴)下仍具有封闭效果，提高封闭效率的同时，还能保证封闭效果的稳定性，从而利于准确的检测结果。
在一些实施方式中，BSA的浓度为约20～约200mg/mL。
在优选的实施方式中，BSA的浓度为约80～约120mg/mL。
通过选择约80～约120mg/mL的BSA浓度范围，本发明进一步降低了本底信号值，从而有利于提高检测试剂的线性范围；同时，BSA的使用浓度控制在较低水平，有利于降低检测试剂的成本。
在更优选的实施方式中，本发明的BSA的浓度为约100mg/mL。
在一些实施方式中，本发明的缓冲液由弱酸配制的缓冲液。
在示例性的实施方式中，本发明的缓冲液选自乙酸缓冲液和柠檬酸缓冲液。
在具体的实施方式中，本发明的缓冲液为乙酸缓冲液。
在优选的实施方式中，本发明的缓冲液的pH值为约4.4～约4.9。
通过选择约4.4～约4.9的pH范围，本发明能够进一步降低封闭后的本底信号值，从而有利于提高检测试剂的线性范围。
在更优选的实施方式中，缓冲液的pH值为约4.5～约4.7。
在第二方面，本发明提供了一种免疫检测试剂，其包括本发明的封闭剂。
在第三方面，本发明提供了一种用于免疫检测的试剂盒，其包括本发明的封闭剂。
在第四方面，本发明提供了一种封闭方法，包括将固相载体与封闭剂混合进行孵育，其中，所述封闭剂包括BSA和缓冲液，并且所述缓冲液的pH值为约3.8～约5.0。
在一些实施方式中，BSA的浓度为约20～约200mg/mL。
在优选的实施方式中，BSA的浓度为约80～约120mg/mL。
在更优选的实施方式中，本发明的BSA的浓度为约100mg/mL。
在一些实施方式中，本发明的缓冲液由弱酸配制的缓冲液。
在示例性的实施方式中，所述缓冲液选自乙酸缓冲液和柠檬酸缓冲液。
在具体的实施方式中，本发明的缓冲液为乙酸缓冲液。
在优选的实施方式中，本发明的缓冲液的pH值为约4.4～约4.9。
在更优选的实施方式中，缓冲液的pH值为约4.5～约4.7。
在一些实施方式中，孵育在大于等于33℃且小于等于37℃的温度下进行20min至3天。
在具体的实施方式中，孵育在约37℃的温度下进行20min至3天。
在一些实施方式中，孵育在大于37℃且小于等于45℃的温度下进行20min至1天。
在具体的实施方式中，孵育在45℃的温度下进行20min至1天。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
如本文所使用的，“BSA(牛血清白蛋白)”又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白。
在本发明中，BSA的浓度可以为约20～约200mg/mL，例如，可以为约30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL或190mg/mL。
在本发明中，“缓冲液”是指当加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液pH变化的作用(缓冲作用)的溶液。
根据常用缓冲液的pH范围，本领域技术人员能够选择适用于本发明的缓冲液，示例性缓冲液可以是弱酸缓冲液，如乙酸缓冲液和/或柠檬酸缓冲液等。
如本文所使用的，术语“弱酸”是指电离常数(Ka)小于0.0001(即酸度系数pKa大于4)的酸。
如本文所使用的，术语“乙酸缓冲液”又称醋酸缓冲液，是指使用乙酸作为H+供体的缓冲液。例如，乙酸缓冲液可由乙酸配制而成。又例如，乙酸缓冲液可由乙酸和乙酸钠配制而成。
如本文所使用的，术语“柠檬酸缓冲液”是指使用柠檬酸作为H+供体的缓冲液。例如，柠檬酸缓冲液可由柠檬酸配制而成。又例如，柠檬酸缓冲液可由柠檬酸和柠檬酸钠配制而成。再例如，柠檬酸缓冲液可由柠檬酸和磷酸二氢钠配制而成。
本领域技术人员可以根据所选择的缓冲液种类和所需要pH值来配制合适的缓冲液。例如，当使用pH为4.0的乙酸缓冲液时，可以使用约1.8mL的0.2M乙酸钠和约8.2mL的0.2M的乙酸混合来进行配制。又例如，用pH为4.0的乙酸缓冲液时，可以先使用16.4g/L的乙酸钠、13mL的冰醋酸和950mL的水混合，再使用冰醋酸将pH值调节至4.0。再例如，当使用pH为4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液时，可以使用约9.2mL的0.1M的柠檬酸和约10.8mL的0.1M的柠檬酸钠来进行配制。
在本发明中，缓冲液的pH值可以为约3.8～约5.0，例如可以为约3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8或4.9。
在本发明中，“固相载体”、“固相支持物”、“固体支持物”和“固体载体”可以互换使用，其是指可以附着抗原或抗体或它们的片段的固体表面。对用于本发明的固相载体没有特别的限制，商品化的固相载体及任何可用于免疫分析的固相载体均可用于本发明。示例性的固相载体可以是磁珠(如生物素磁珠、羧基磁珠等)、酶标板、塑料板、塑料管、乳胶珠、琼脂糖珠、玻璃、硝酸纤维素膜、尼龙膜、二氧化硅板或微芯片，但本发明不限于此。
在本发明中，使用封闭剂封闭固相载体时的孵育时间可例如为0至3天，如约20min、30min、1h、2h、6h、1天或2天。
在本发明中，使用封闭剂封闭固相载体时的孵育温度可例如为约33～45℃，如约34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃或44℃。
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1制备具有不同pH的缓冲液的封闭剂
第一步，根据下表1中的记载分别配制pH3.8、pH4.6和pH5.0乙酸缓冲液。
表1
| 投料顺序 | 原料名称 | 浓度 | 备注 |
| ① | 无水乙酸钠 | 16.4g/L | / |
| ② | 纯化水 | 950mL/L | 完全溶解 |
| ③ | 冰醋酸 | 约13mL/L | 使用冰醋酸调pH |
第二步，将100mg/mL的BSA分别溶解于第一步所配制的乙酸缓冲液中，制得下表2所示的封闭剂。
表2
| 封闭剂1 | 封闭剂2 | 封闭剂3 | |
| 乙酸缓冲液pH值 | 3.8 | 4.6 | 5.0 |
实施例2具有不同pH的缓冲液的封闭剂对本底信号的影响
实验材料：
磁珠：购自四川迈克生物新材料技术有限公司，货号XCL1026(链霉亲和素磁珠)。
维生素D测定试剂盒，其配制方式如下表3所示。
表3
维生素D校准品，其配制方式如下表4所示。
表4
实验步骤：
1)取500μL封闭剂与含1mg链霉亲和素磁珠进行混合，37℃封闭1天；按说明书的记载进行洗涤后；得到封闭的链霉亲和素磁珠；
2)使用步骤1)得到的封闭的磁珠按照按照表3配制试剂R1，同时按照表3和表4配制试剂R2和维生素D浓度为0mg/mL的校准品；接着按试剂R1:试剂R2:维生素D校准品体积比1:1:1混合；并孵育10min后，加入发光底物；
3)使用迈克生物化学发光自动分析仪i3000测量发光值。
分别使用实施例1中制备的封闭剂1～3以及常规BSA封闭剂(Tris缓冲液，pH7.3)，按照上述步骤1)至3)共进行五次测定，其中采用未封闭的磁珠作为对照，结果如下表5所示。
表5
由表5可知，在经历相同的封闭条件和水浴后，与常规的BSA封闭剂相比，本发明的封闭剂能够显著地降低本底信号。另外，当本发明的封闭剂pH为4.6时，本底信号的降低效果最佳。
实施例3制备含不同浓度BSA的封闭剂
第一步，根据下表6中的记载配制pH4.6之间的乙酸缓冲液。
表6
第二步，将不同含量的BSA分别溶解于第一步所配制的乙酸缓冲液中，制得下表7所示的封闭剂。
表7
| 封闭剂4 | 封闭剂5 | 封闭剂6 | 封闭剂7 | |
| BSA浓度 | 5mg/mL | 20mg/mL | 50mg/mL | 120mg/mL |
实施例4具有不同BSA含量的封闭剂对本底信号的影响
分别使用实施例1所制备的封闭剂2和实施例3所制备封闭剂4～7，按照实施例2中的方法进行测定，其中以未封闭的磁珠作为对照，结果如下表8所示。
表8
由表8可知，使用本发明的BSA封闭剂并经历1天37℃水浴后，本底信号值随着BSA浓度的增加而降低。
实施例5封闭条件对本底信号的影响
为考察不同封闭条件对本底信号的影响，进一步使用封闭剂2，按照实施例2中的实验方法进行测定，其中封闭条件分别为37℃，1天；37℃，3天；和45℃，1天。结果如下表9所示。
表9
| 37℃，1天 | 37℃，3天 | 45℃，1天 |
| 1560 | 816 | 628 |
| 1317 | 807 | 654 |
| 1422 | 848 | 598 |
| 1406 | 886 | 655 |
| 1492 | 854 | 721 |
由表9可知，在45℃的封闭温度下，本发明的封闭剂具有更低的本底信号。另外，在37℃下，将封闭时长延长至3天有利于进一步降低本底信号。
实施例6水浴后，本发明封闭剂对试剂盒测试效果的影响
实验步骤：
1)取500μL封闭剂2与含1mg的链霉亲和素磁珠进行混合，37℃封闭1天，按说明书的记载进行洗涤后，得到封闭的链霉亲和素磁珠；
2)使用步骤1)处理后的封闭的磁珠按照表3配制试剂R1，将试剂R1在2～8℃下保存，或在37℃下水浴7天；同时按照表3和表4配制试剂R2、试剂R3和维生素D校准品Cal 1～5；接着按试剂R1:试剂R2:维生素D校准品体积比1:1:1混合；并孵育10min后；在加入1体积份试剂R3，孵育10min后，以与标准品中的维生素D竞争，加入发光底物；
3)使用迈克生物化学发光自动分析仪i3000测量发光值。
其中，以未封闭的磁珠作为对照，结果如下表8所示。
表8
由表8可知，在2～8℃的条件下，与对照组相比，使用本发明的封闭剂并未不改变原发光值。而在37℃水浴7天的情况下，采用本发明的封闭剂封闭的磁珠信号保留率变化趋势基本一致，说明能够降低水浴后磁珠的非特异性吸附，使曲线达到平移，达到理想状态。而对照组的磁珠在水浴后信号保留率呈逐渐上升的趋势，曲线变形，难以获得准确的检测结果。
实施例7采用柠檬酸缓冲液配制封闭剂对本底信号的影响
将100mg/mL的BSA加入到pH为4.6的柠檬酸水溶液中使其完全溶解，记为封闭剂8。
按照实施例2中的实验材料和实验方法进行测试，结果如下表9所示。
表9
由表9可知，采用柠檬酸缓冲液的封闭剂8，在37℃水浴1天后可以将本底信号降低至2400左右。
Claims (18)
1.一种用于维生素D检测的免疫检测试剂盒，其包括固相载体和所述固相载体的封闭剂，
其中，所述封闭剂包括BSA和缓冲液，所述缓冲液的pH值为3.8～5.0，并且
其中，所述固相载体为磁珠，并且所述固相载体用于附着抗体或抗原或它们的片段。
2.如权利要求1所述的免疫检测试剂盒，其中，所述BSA的浓度为20～200mg/mL。
3.如权利要求2所述的免疫检测试剂盒，其中，所述BSA的浓度为80～120mg/mL。
4.如权利要求1至3中任一项所述的免疫检测试剂盒，所述缓冲液为使用弱酸配制的缓冲液。
5.如权利要求4所述的免疫检测试剂盒，其中，所述缓冲液选自乙酸缓冲液和柠檬酸缓冲液。
6.如权利要求1至3中任一项所述的免疫检测试剂盒，其中，所述缓冲液的pH值为4.4～4.9。
7.如权利要求6所述的免疫检测试剂盒，其中，所述缓冲液的pH值为4.5～4.7。
8.封闭剂在维生素D检测的免疫分析中用于封闭固相载体的用途，包括将所述固相载体与封闭剂混合进行孵育，
其中，所述封闭剂包括BSA和缓冲液，并且所述缓冲液的pH值为3.8～5.0，并且
其中，所述固相载体为磁珠。
9.如权利要求8所述的用途，其中，所述BSA的浓度为20～200mg/mL。
10.如权利要求9所述的用途，其中，所述BSA的浓度为80～120mg/mL。
11.如权利要求8至10中任一项所述的用途，所述缓冲液为使用弱酸配制的缓冲液。
12.如权利要求11所述的用途，其中，所述缓冲液选自乙酸缓冲液和柠檬酸缓冲液。
13.如权利要求8至10中任一项所述的用途，其中，所述缓冲液的pH值为4.4～4.9。
14.如权利要求13所述的用途，其中，所述缓冲液的pH值为4.5～4.7。
15.如权利要求8所述的用途，其中，所述孵育在大于33℃且小于等于45℃的温度下进行。
16.如权利要求13所述的用途，其中，所述孵育在大于等于33℃且小于等于37℃的温度或在大于37℃且小于等于45℃的温度下进行。
17.如权利要求8或15所述的用途，其中，所述孵育进行20min至3天。
18.如权利要求17所述的用途，其中，所述孵育进行20min至1天。
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