JP2504912B2 - 固相へ抗体をコ―ティングするための２段階法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原のアッセイのため
に基材上に抗体をコーティングする方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】イムノアッセイは免疫化学手段により抗
原または抗体を定量するのに使用される。通常、量を変
化させた抗原または抗体のいずれかを、一定量のそのい
ずれか他方に加えて抗原−抗体複合体を形成し、量を変
えた方の反応物の標準曲線により示される、量を変えた
方の反応物の函数として該複合体の形成を測定する。次
に、未知量の量を変えた方の反応物の反応を標準曲線に
適用して比較可能な変化を生じる、量を変えた方の反応
物の量を測定することができる。

【０００３】抗原−抗体複合体は溶液中で形成してよく
（均質アッセイ）、または反応物の一方を固体支持体に
結合することができる（不均質アッセイ）。通常、不均
質アッセイは非複合体形成物質を除くために洗浄工程を
利用する。本発明は、不均質アッセイのみに関する。

【０００４】イムノアッセイにおいては、抗体または抗
原のいずれか一方を最初に固体支持体、例えばプラスチ
ック表面またはビーズに結合させることにより、固相イ
ムノアッセイと呼ばれるイムノソルベントアッセイ中の
未反応の物質からの抗原−抗体反応生成物の分離を促進
する。本発明は、固体支持体への抗体の付加に関する。

【０００５】固相イムノアッセイにおいては、さまざま
な基材、例えばフルオロクローム、アイソトープまたは
酵素を用いて、例えば蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノラジオメトリ
ックアッセイ（ＩＲＭＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩ
Ａ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および
ビオチン−アビジン系において抗原−抗体を検出するた
めの手段として抗原または抗体を標識してきた。抗原ま
たは抗体を人工膜に取り込むことにより反応の検出を促
進するための不活性試薬としてリポソームも使用されて
きた。

【０００６】固相イムノアッセイの調製において抗体を
固相にコーティングするための幾つかの方法が工夫され
てきた。もっとも単純な方法は、非特異的に正しく配置
されていない様式で直接固相表面に一次抗体をコートす
る、１段階工程である。この１段階で抗体をコートされ
た表面を次に抗原アッセイのために使用する（例えば、
カット（Ｋ．Ｊ．Ｃａｔｔ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，２１
３，８２５（１９６７）を参照）。

【０００７】抗体を抗原に接触させた場合、イムノアッ
セイのための上記調製法における純化（ｒｅｆｉｎｅｍ
ｅｎｔ）は、最高のアッセイ感度のための一次（捕捉）
抗体の正確な配置である。これは、抗原結合部位に遠位
の一次抗体に結合することができる二次抗体の使用によ
り達成された。

【０００８】二次抗体は親和性により精製され、そして
一次抗体に対してＦｃ特異的であってよい。イムノグロ
ブリン（Ｉｇ）モノマーのＦｃ部分は、Ｙ型のＩｇ分子
の幹（ｓｔｅｍ）に対応し、そしてひとつ以上のジスル
フィド結合により結合した２つの重鎖のＣ末端部分から
なる。Ｆｃ特異性により、抗原のイムノアッセイのため
の最良のＦａｂ配置で一次抗体が二次抗体に結合する。
ＩｇのＦａｂ部分は、重鎖のＮ末端にジスルフィド結合
した軽鎖、即ち、Ｙ型分子の２つの突出部分（ｌｉｍ
ｂ）からなる。

【０００９】多段階のコーティング法において、表面
は、一次抗体に対する抗体である二次抗体で予め最初に
コートされていてよい。次に、この予めコートされた表
面を抗原に対する一次抗体でコートし、そしてこの２つ
のコートされた表面を抗原のアッセイに使用する。この
種の方法は、例えば、米国特許第４，０９２，４０８号
および第４，１６６，８４４号において、および、サン
コリ（Ｇ．Ｍ．Ｓａｎｋｏｌｌｉ）らの「抗ＩｇＧ Ｆ
ｃイムノグロブリンの前処理によるマイクロリットルウ
エルの抗体結合特性改良法」、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔ
ｈ．，１０４，１９１−１９４（１９８７）に記載され
ている。二次抗体および一次抗体のコーティングは、１
段階の共コーティング法（ｃｏｃｏａｔｉｎｇ）により
２つの抗体を混合して単純化してもよい。

【００１０】固相へのコーティングをイムノアッセイに
おいて使用する場合、固相の未コート領域への非特異的
結合がアッセイの正確さ、精度または感度を干渉し、そ
して高いバックグラウンドおよび間違った読みをもたら
すかもしれない。ブロック剤は非特異的結合部位をブロ
ックするために分離コーティング工程において使用され
た。ウシ血清、アルブミン、ゼラチン、カゼインおよび
他の基質はブロック剤として使用されてきた。このブロ
ック工程は後コート（ｐｏｓｔｃｏａｔ）と呼んでよ
い。一次抗体が固相に適用された場合は、慣用的に後コ
ーティング工程が行われてきた。この場合、単なる一次
抗体のコートおよびブロック剤の後コートを含む２段階
法；または二次抗体の前コート、一次抗体のコート、お
よびブロック剤の後コートからなる３段階法でありう
る。前コート工程およびコート工程を組み合わせれば
（共コート）、２段階工程は二次抗体および一次抗体を
用いる共コートにより第１工程となり、そしてブロック
剤後コートは第２工程となる。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】異なる配置の工程を用
いた優秀なコーティング法が今、発見された。

【００１２】本発明の目的は、最小の工程数と最適に配
置された捕捉抗体を用いた、有効なコーティング法を提
供することである。

【００１３】本発明の他の目的は、ダイナミックレンジ
の増加したイムノアッセイを提供することである。

【００１４】本発明のさらなる目的は、一次抗体の精製
の程度を最小にすることである。一次抗体は、既に基材
上にある二次抗体に直接結合しているため、混入してい
る蛋白質と結合部位に関して競争する必要がない。

【００１５】本発明のさらなる目的は、慣用的コーティ
ング法にまさるようにアッセイ感度を改良することであ
る。慣用的な共コート−後コート法または前コート−コ
ート−後コート法に比べてダイナミックレンジが改良さ
れる。

【００１６】一次抗体の最小限の使用も本発明の他の目
的である。

【００１７】

【課題を解決するための手段】したがって、二次抗体を
コートされた基材を形成するために、二次抗体を結合す
ることができる基材表面に二次抗体を最初に接触させる
ことにより基材上に一次抗体をコートするための方法が
提供される。次に、二次抗体をコートされた基材を、該
二次抗体が特異的な一次抗体、ブロック剤、および必要
であれば、安定剤に接触させ、それによって、非特異的
結合部位がブロックされている、一次抗体に結合した二
次抗体でコートされた安定な基材表面が提供される。

【００１８】有利なことに、そして期待に反して、最小
限の工程を利用し、そして最小量の一次抗体を必要とす
るこの新しいコーティング法は感度が改良されている。
したがって、この方法は特に工業的応用において有用で
ある。

【００１９】本発明のより良い理解のために、具体例を
以下に記載するが、その範囲は特許請求の範囲により指
摘される。

【００２０】本発明は、固相イムノアッセイに使用され
る、抗体をコートされた基材の製造法を提供する。

【００２１】本明細書において以下のことが理解され
る：コーティングは表面への一次抗体の直接の適用であ
る。前コーティング（ｐｒｅｃｏａｔｉｎｇ）は支持体
への二次抗体のコートの適用である。共コーティング
（ｃｏｃｏａｔｉｎｇ）は同時に２つ以上の抗体を同じ
部位に適用することである。後コーティング（ｐｏｓｔ
ｃｏａｔｉｎｇ）は慣用的には分離した工程であり、か
つ、抗体をコートされた表面へのブロック剤の適用であ
る。

【００２２】支持体上にコートされる一次抗体の例とし
ては、興味のある抗原に対するポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体である。ステロイド、例えば、テ
ストステロン、アンドロステロン、プロゲステロン、エ
ストロン、エストラジオール、エストリオール、デオキ
シコルチコステロン、コルチソル、コルチソン、アルド
ステロン等；カルジオトニックグリコシド、例えば、ジ
ゴキシン、ジギトキシン、オウアバイン、デスラノシド
およびそれらのアグリコン；ホルモン、例えば、甲状腺
刺激ホルモン（ＴＳＨ）、Ｔ₄およびＴ₃；ビタミン、例
えば、Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｋおよび葉酸等；生物学的活性分
子、薬剤およびそれらの代謝物；病原体；および毒素ま
たは他の抗原が興味あるものである。通常は競争フォー
マットによりアッセイされる小さい分子（例えば、
Ｔ₄、Ｔ₃吸収（ｕｐｔａｋｅ）、ジゴキシン、テオフィ
リン）、および通常はサンドイッチアッセイによりアッ
セイされる大きい分子（例えば、甲状腺刺激ホルモン）
の両方に本発明の方法が適用されることは、本発明の利
点でもある。

【００２３】二次抗体は一次抗体に対するポリクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体である。

【００２４】一次抗体および二次抗体を生産する方法は
当業界においてよく知られており、さらに説明の必要は
ないであろう。抗体は親和性により精製されたもので
も、未精製のものでもよい。

【００２５】抗体がコートされる表面はさまざまな材料
のいずれかであってよい。当業界においては公知である
とおり、そのような材料にはポリマー、例えば、ポリス
チレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフ
ルオロエチレン、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポ
リビニルクロリド等；ガラス、細菌細胞；イオン交換樹
脂を含む。このような固体キャリアーは当業界において
は公知であり、さらに説明の必要はないであろう。表面
基材はシート、フィルム、固体粒子、チューブ、カップ
または試験管であってよいが、試験管が好ましい。もっ
とも好ましいのはポリプロピレンまたはポリスチレンの
試験管である。

【００２６】緩衝液は分子の生理的活性を維持するため
に用いられ、当業界においては公知である。緩衝液は、
例えば、炭酸塩、ホウ酸塩、トリス（Ｔｒｉｓ）、グリ
シンおよびリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）を含んでよい。

【００２７】二次抗体の濃度は、約０．５−６．０μｇ
／ｍｌ、好ましくは１−４μｇ／ｍｌ、最も好ましくは
１−２μｇ／ｍｌであってよい。二次抗体は精製されて
いないか、またはいくらか精製されているＩｇＧ画分で
ありうる。すべてのクラスのイムノグロブリンを使用で
きるが、ＩｇＧが好ましい。ＩｇＧのＦｃ断片に対する
親和精製された血清がもっとも好ましい。

【００２８】一次抗体は特別な処理を必要とせず、そし
て約５ｎｇ−約２０，０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約
２０−３，０００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２０−
２００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用してよい。

【００２９】ブロック剤は蛋白質、ウシ血清アルブミ
ン、ゼラチン、またはカゼインを含んでよい。好ましい
ブロック剤は約０．１−５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約
０．２５−２５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１−１０ｍ
ｇ／ｍｌの濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液で
ある。

【００３０】ＢＳＡ溶液と共にポリオール溶液を使用す
ることが好ましい。ポリオールは抗体の温度安定性を高
めると信じられている。通常、砂糖、例えば、デキスト
ロースまたはグリコールがこの容量で用いられており、
それらの使用法については他に詳細に説明する必要はな
い。デキストロースのような砂糖は約０．１−１００ｍ
ｇ／ｍｌ、好ましくは約２−１００ｍｇ／ｍｌ、最も好
ましくは１０−５０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用してよい。

【００３１】本発明は、基材に二次抗体を前コートし、
つぎにブロック剤および必要であればポリオールと混合
して一次抗体をコートする２段階コーティング法を利用
する。前コートは、約１８℃から約２４℃、好ましくは
約２０℃から約２２℃において、約６時間から約２４時
間実施してよい。例えばＢＳＡおよびデキストロースを
伴う一次抗体のコーティングは、約１８℃から約２４
℃、好ましくは約２０℃から約２２℃において、約１６
時間から約２４時間実施してよい。３０から６０％の相
対湿度（ＲＨ）が好ましいが、４０±５％が好ましい。
従来のコーティング法と比較して、本発明の方法はより
少ない工程数ですみ、イムノアッセイにおいて改良され
た性能を示す。一次（捕捉）抗体は二次抗体にのみ結合
するので、未占有表面領域に関してブロック剤と競争し
ない。さらに、二次抗体がＦｃ特異的であれば、捕捉抗
体は正確な配置（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で結合す
る。一次抗体は基材の表面に結合できるが、１０００倍
以上過剰のブロック剤、例えば、ＢＳＡとも競争しな
い。

【００３２】上記コーティング法は当業界で公知であ
り、通常は抗体含有溶液と共に基材表面をインキュベー
トすることを含むが、それによって抗体は該表面上に固
定される。これは室温で実施してよいが、室温より高い
温度または低い温度も使用してよい。該コーティング法
は濃度依存性でもある。高い濃度の抗体はコーティング
時間を短縮するが、製造工程においては法外なコストに
なりやすい。

【００３３】一つの態様においては、二次抗体を含有す
る第１溶液をポリプロピレン試験管に適用し、そして約
２４時間インキュベートして前コートしてよい。上記第
１溶液を吸引し、そして５％デキストロースおよび１％
ＢＳＡを含む、一次抗体を含有する第２溶液を導入し、
そして２４時間インキュベートする。インキュベート
後、二次抗体を吸引し、試験管を乾燥させる。

【００３４】本発明は以下の非限定的実施例によりさら
に説明する。

【００３５】

【実施例】実施例１ＩＱＰ／Ｍ ＴＳＨアッセイを用いたコーティング法の
比較 Ｉ．コートされたチューブの製造 このコーティング法においては、ポリプロピレンチュー
ブを使用し、すべてのコーティング溶液は１００ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５０）を用いて作られた。各コー
ティング工程は通常１６から２４時間を必要とした。使
用した溶液は吸引により除去した。このチューブコーテ
ィング法が終了したと同時に、吸湿剤と共にジプロック
バッグ（ｚｉｐｌｏｃｋ ｂａｇ）にチューブを保存し
た。この方法のスケールアップは成功した。

【００３６】Ａ．標準的コーティング法 以下のとおりに、一次抗体を直接チューブにコートし
た：親和精製されたヒツジ抗−ヒトＴＳＨ−β２ポリク
ローナル抗体１．０μｇ／ｍｌでチューブをコートし
た。

【００３７】Ｂ．共コート／後コート 一次抗体および二次抗体を直接チューブに共コートし、
次にブロック剤を後コートして抗体でコートされていな
いチューブの領域をブロックした。ＲＡＧＧＩＧ（ウサ
ギ抗−ヒツジＩｇＧとＦｃ断片に特異的な抗体）２μｇ
／ｍｌと共に親和精製されたヒツジ抗−ヒトＴＳＨ−β
２ポリクローナル抗体０．１μｇ／ｍｌでチューブをコ
ートした。後コートは１％ＢＳＡと５％デキストロース
を含んだ。

【００３８】Ｃ．前コート／共コート／後コート 最初に、２μｇ／ｍｌのＲＡＧＧＩＧ（ウサギ抗−ヒツ
ジＩｇＧとＦｃ断片に特異的）二次抗体でチューブをコ
ートした。次に、親和精製されたヒツジ抗−ヒトＴＳＨ
−β２ポリクローナル抗体０．１μｇ／ｍｌでチューブ
をコートし、次に１％ＢＳＡと５％デキストロースを含
む後コートを行なった。

【００３９】Ｄ．前コート／ブロック剤のコート 最初に、２μｇ／ｍｌのＲＡＧＧＩＧ（ウサギ抗−ヒツ
ジＩｇＧとＦｃ断片に特異的）二次抗体でチューブをコ
ートした。次に、親和精製されたヒツジ抗−ヒトＴＳＨ
−β２ポリクローナル抗体０．１μｇ／ｍｌと１％ＢＳ
Ａブロック剤を共にチューブにコートした。

【００４０】ＩＩ．ＴＳＨに関する非アイソトープリポ
ソームアッセイ アッセイ法の原理 この非アイソトープアッセイはリポソームとして知られ
ている人口膜の使用に基づく。リポソームは蛍光染料を
取り込み、そしてＴＳＨに対する表面−結合モノクロー
ナル抗体で処方される。この試験も異なるＴＳＨ抗原部
位を有する抗体でコートされたプラスチックチューブを
用いる。ＴＳＨの存在下、両方の抗体（即ち、リポソー
ム上の抗体とプラスチックチューブ上の抗体）はＴＳＨ
に結合し、固定化サンドイッチを形成する。インキュベ
ート後、未結合のリポソームを除去し、そして結合した
リポソームを界面活性剤でリンスする。カプセル内の染
料の放出による蛍光は血清中のＴＳＨ濃度に正比例す
る。

【００４１】Ａ．リポソームトレーサーの製造 モノクローナル抗−ヒトＴＳＨ抗体を消化し、該抗体の
Ｆ（ａｂ’）断片をＮ−マレイミドカプロリルリポソー
ム（ＭＣリポソーム）にカップリングさせる。その結果
得られるリポソームストックを次に希釈して、濾過され
た０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中１／１００の
力価にする。該緩衝液は０．８％ ＢＳＡ、６ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．２％アジ化ナトリウム、５％カゼインおよ
び１％グリセロールも含む。リポソームは蛍光染料を取
り込む。

【００４２】Ｂ．アッセイ法 成分／処方の記載 標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）は、３．５％ＢＳＡ、ＮａＣ
ｌおよび防腐剤を含むバルビタール緩衝液から処方され
る。マトリックス中にスパイクされたｈ−ＴＳＨは凍結
乾燥された市販の製品であり、該製品はＷＨＯ／ＭＲＣ
ｈＴＳＨとして検査されている。０．０，０．３，
２．０，８．０，２０．０および５０．０μＩＵ／ＭＬ
ＴＳＨを含む標準を標準曲線の作成に使用する。

【００４３】対照は広く試験されているＲＩＡＴＲＡＣ
７０００シリーズによる。

【００４４】洗浄溶液は０．１５Ｍ塩化ナトリウム、
０．１％アジ化ナトリウム、および０．２％ＢＳＡをリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に含む。

【００４５】溶解溶液は０．１％ｃｉａｌｉｔを含むル
ブロールＰｘの２．１％水性溶液である。

【００４６】上記（Ｉ）においてさまざまなコーティン
グ法により製造されたチューブを以下の方法によるアッ
セイに使用する： １．コートされたチューブに２００μｌの試験試料を加
える。

【００４７】２．コートされたチューブに５００μｌの
トレーサーを加える。

【００４８】３．反応混合物を４５℃において２時間イ
ンキュベートする。

【００４９】４．インキュベートの間、反応混合物を２
４０ｒｐｍで撹拌する。

【００５０】５．インキュベート終了後、反応混合物を
吸引する。

【００５１】６．エッペンドルフピペットを用いて２ｍ
ｌの洗浄溶液をチューブに加える。

【００５２】７．チューブから洗浄溶液を吸引する。

【００５３】８．工程６および７をさらに２回繰り返
す。

【００５４】９．洗浄されたチューブに２ｍｌの溶解溶
液を加える。

【００５５】１０．溶液を含むチューブを激しく撹拌す
る。

【００５６】１１．５分間待ち、再び渦巻き撹拌する。

【００５７】１２．フルオロメーターで蛍光を測定す
る。

【００５８】アッセイの要約 試料サイズ ２００μｌ トレーサー体積 ７５０μｌ インキュベーション時間 ２時間 混合速度 ２４０ｒｐｍ ２０．０μＩＵ／ｍｌの標準の蛍光シグナルを０．０μ
ＩＵ／ｍｌ標準でわった比をダイナミックレンジと規定
する。結果を表１に示す。

【００５９】

【表１】 表１ コーティング法の比較 コート法 ｐＡｂ[μg/mL] ダイナミックレンジ Ａ 標準コート １．０ １．２（２回の実験） Ｂ 共コート／後コート ０．１ ４．９（２回の実験） Ｃ 前コート/共コート/後コート ０．１ １４．２（２回の実験） Ｄ 前コート／ＢＳＡでコート ０．１ ２７．８（３回の実験）定義 標準コート：一次抗体を直接チューブにコートする。

【００６０】共コート：一次抗体および二次抗体を共に
同時にチューブにコートする。

【００６１】後コート：抗体でコートされていない部位
をブロック剤でブロックする。

【００６２】前コート：一次抗体をコートする前に二次
抗体をチューブに予めコートする。

【００６３】コート：一次抗体をチューブの表面に塗
る。

【００６４】リンス：抗体を含まない緩衝液。

【００６５】実施例２ダイナミックレンジに対するブロック剤の連続コーティ
ングの効果 実施例１（Ｉ）に記載された方法にしたがって、１．０
ｍｌの二次抗体（２μｇ／ｍｌのＲＡＧＧＩＧ）で２４
時間チューブを前コートし、次にヒツジ抗−ヒトＴＳＨ
−β２である一次抗体１．０ｍｌをコートした。上記の
とおり、１％ＢＳＡおよび５％デキストロースの存在ま
たは不在下でチューブをコートした。実施例１（ＩＩ）
に記載されたとおりに、このチューブをアッセイに使用
し、そしてダイナミックレンジを測定した。結果を表２
に示す。

【００６６】

【表２】 表２ コート法 ダイナミックレンジ Ａ．前コート／コート／リンス（ＢＳＡなし） １５．１ Ｂ．前コート／コート／後コート １４．２ Ｃ．前コート／コート（ＢＳＡなし） １３．０ Ｄ．前コート／ＢＳＡでコート ２７．８ 結果が示すことは、本発明の２段階工程の一次抗体コー
ティング工程（前コート／コート）におけるＢＳＡの添
加はダイナミックレンジに対して顕著な影響を有するこ
とである。後コートにおけるＢＳＡの添加は、しかしな
がら、ダイナミックレンジの増加にほとんど利益をもた
らさなかった。

【００６７】実施例３ 実施例１（Ｉ）（Ｄ）において記載されたとおりの本発
明の前コート／コート法を使用して作られたチューブ
は、ＩＲＭＡフォーマットによりＲＩＡトレーサーを用
いて評価された。ＲＩＡアッセイ試薬はベクトンディッ
キンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ＴＳＨ
ＭＡｂ Ｉ¹²⁵固相キットから得た。このアッセイは
以下の方法により実施した。

【００６８】甲状腺刺激ホルモンＭＡｂ［Ｉ¹²⁵］固相
成分システム 血清または血漿中のヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）
の定量測定を示す。

【００６９】アッセイ方法 以下のプロトコルにおいては、標準試料および患者試料
を２通りに作成して実施しなければならない。対照血清
は患者試料と共に同時に実施すべきである。標準曲線お
よび臨床的測定は同時に実施しなければならない。

【００７０】すべての試薬および試料は使用前に室温に
しなければならないが、より長い時間この温度に放置す
ることは必要でない。洗浄工程には滅菌蒸留水を使用す
ることが望ましい。

【００７１】１．データ約分（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）技
術が全カウントを必要とするならば、２つのポリスチレ
ンチューブを標識し、そして取っておく。

【００７２】２．標準曲線に関して、１−１４のナンバ
ーを抗体でコートされたチューブに付し、各臨床試料お
よび対照試料に関して２通りをアッセイする。

【００７３】３．２００μｌのＴＳＨ標準および臨床試
料をチューブに加える。

【００７４】４．すべてのチューブに５００μｌのＴＳ
Ｈトレーサー溶液を加える。簡単に渦巻き撹拌する。チ
ューブをカバーする。

【００７５】５．３７±１℃において水中で３．０時間
インキュベートする。

【００７６】６．水浴から全部のチューブを取り出して
カバーを取る。

【００７７】７．吸引またはデカントする。２．０ｍｌ
の蒸留水を加える。

【００７８】８．工程７を繰り返す。最終的に吸引また
はデカントする。

【００７９】９．これらチューブの放射性をカウント
し、そしてガンマカウンターで１分間全チューブをカウ
ントする（必要であれば）。

【００８０】 チューブ 標準 患者の トレーサー番号 （μｌ） 血清（μl） （μｌ） インキュベート 洗浄 １，２ ２００Ａ − ５００ − ３，４ ２００Ｂ − ５００ 全チューブを 全カウント ５，６ ２００Ｃ − ５００ ３７℃において の場合以外 ７，８ ２００Ｄ − ５００ ３．０時間 ２回 ９，10 ２００Ｅ − ５００ 渦巻き撹拌 全チューブ 11，12 ２００Ｆ − ５００ および を吸引 13，14 ２００Ｇ − ５００ インキュベート および洗浄 対照及び する する 患者試料 ２００ ５００ 結果の計算 自動計算 自動データ約分技術を使用することによりＴＳＨの結果
を計算してよい。点対点の書き入れ、４パラメーター算
定曲線適合または他の種の曲線適合プログラムを利用し
てよい。

【００８１】マニュアル計算 １．チューブ１−２に関して平均ｃｐｍを計算する。標
準Ａ。

【００８２】２．他の続くチューブのｃｐｍ各々からチ
ューブ１−２の平均ｃｐｍを差し引いて正確なｃｐｍを
得る。

【００８３】３．対数対対数グラフを用いて、ｙ軸に各
標準レベルの補正されたｃｐｍをとり、ｘ軸に標準濃度
を取って標準曲線をプロットしてよい。

【００８４】この結果を表３に示す。

【００８５】

【表３】 表３ １分あたりのカウント ＴＳＨ濃度［μIU/ml］ ＲＩＡチューブ 新しいチューブ ０．００ ６０２．７ ２５９．７ ０．２２ ７９０．５ ４９０．０ １．０４ １５５８．０ １１３４．０ ３．７１ ４３３０．０ ３５０３．０ ８．３８ ９００５．０ ７６６２．０ ３５．５０ ２３３５０．０ ２４４４５．０ ９７．００ ４０５３６．０ ４２０１４．０精度 ＲＩＡＴＲＡＣ １ ３．８１μＩＵ ３．１
０μＩＵ ＲＩＡＴＲＡＣ ２ ７．８１μＩＵ ７．８
１μＩＵ ＲＩＡＴＲＡＣ ３ ２６．２４μＩＵ ２８．９
７μＩＵＲＩＡアッセイ試薬 ＲＩＡチューブ：ＢＤ ＡＮ １９４８Ａ ＲＩＡトレーサー：ＲＩＡ ＡＮ２２２８ ＲＩＡ標準：ＡＮ１５０５ この結果から、ＲＩＡトレーサーをアッセイに使用して
本発明の方法によりコートされたチューブを利用するこ
とができることが示される。

【００８６】実施例４非精製一次抗体を用いた競争アッセイ 腹水中のモノクローナル一次抗体をポリクローナル一次
抗体の代わりに用い、そして一次抗体をコーティング前
に精製しないこと以外は、実施例１（Ｉ）（Ｄ）に記載
されているとおりにチューブをコートした。

【００８７】このアッセイに使用したチューブは標準コ
ーティング法および新しい２段階法により調製した。標
準コーティング法のコーティング緩衝液は１００ｍＭリ
ン酸（ｐＨ７．５）であり、モノクローナル抗体を含む
腹水液体をこれで希釈した。力価は１／１０，０００で
あった。チューブは加工される前に１．０ｍｌの抗体溶
液で２４時間コートされた。新しいコーティング法にお
いては、１．０ｍｌの１／５００，０００ＭＡｂ含有腹
水液体でコートする前に、チューブを最初に２μｇ／ｍ
ｌのＧＡＭＩｇＧ、Ｆｃ特異的なもので前コートした。

【００８８】競争フォーマットを用いてＴの吸収に関す
る非アイソトープリポソームアッセイにチューブを使用
した。この甲状腺吸収（Ｔ吸収）試験法においては、固
定量のチロキシンおよびチロキシン結合リポソームをア
ッセイ緩衝液中に存在させる。標準コートおよび新しい
前コート−コート法を用いて抗−Ｔ₄モノクローナル抗
体（ＭＡｂ）をアッセイチューブにコートした。ＭＡｂ
はリポソーム結合体およびチロキシンの両方を結合する
ことができる。ＴＢＧを含む結合蛋白質は参考の標準の
血清中に存在し、そして未知のものがチロキシンに結合
するが、チロキシン−リポソームには結合しない。結合
しないまま血清中に残ったチロキシンの量はチューブ上
の抗体に関してリポソームと競争する。未知の血清ＴＢ
Ｇの結合能力が参考の標準のそれより低いならば、チロ
キシンの吸収はリポソームに代わってより高くなる。

【００８９】インキュベート後、チューブを洗浄してあ
らゆる非特異的結合リポソームを除去し、そして界面活
性剤溶液を使用してリポソーム膜をこわし、それにより
蛍光染料を放出した。蛍光はフルオロメーターにより測
定し、そして吸収値は以下の式により測定した： 吸収（未知）＝シグナル（Ｒｅｆ）−シグナル（Ｂｌａｎｋ）＊吸収 （Ｒｅｆ） シグナル（ＵＮＫ）−シグナル（Ｂｌａｎｋ）競争アッセイフォーマットを用いた Ｔ吸収に関する非ア
イソトープリポソームアッセイ アッセイ緩衝液 ０．１Ｍ リン酸、ｐＨ７．４ ０．１４Ｍ 塩化ナトリウム ０．０４％ サリチル酸 ０．０５％ ＢＳＡ ０．２５％ μｇＴ₄スパイク リポソーム ベクトンディッキンソンアドバンスト
ダイアグノスティック（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ ＡｄｖａｎｃｅｄＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ロ
ット＃１０６５−３２−２（力価１／１００）アッセイ法 １．コートされたポリプロピレンチューブに２５μｌの
試料を加える。

【００９０】２．コートされたチューブに１０００μｌ
のトレーサーを加える。

【００９１】３．２から３秒間すべてのチューブを渦巻
き撹拌する。

【００９２】４．４５度において３０分間反応混合物を
インキュベートする。

【００９３】５．インキュベート完了後反応混合物を吸
引する。

【００９４】６．ブリンクマンリピペッター（Ｂｒｉｎ
ｋｍａｎ ｒｅｐｉｐｅｔｔｏｒ）を用いてチューブに
５ｍｌの洗浄溶液を加える。

【００９５】７．チューブから洗浄溶液を吸引する。

【００９６】８．２回以上工程６および７を繰り返す。

【００９７】９．洗浄されたチューブに２ｍｌの溶解溶
液を加える。

【００９８】１０．溶液含有チューブを激しく渦巻き撹
拌する。

【００９９】１１．５分間待ち、再び渦巻き撹拌する。

【０１００】１２．フルオロメーターにより蛍光を測定
する。

【０１０１】アッセイの要約 試料サイズ ２５μｌ トレーサー体積 １０００μｌ インキュベート時間 ３０分間 混合速度 一定 結果を表４に示す。

【０１０２】

【表４】 表４ Ｔ吸収競争アッセイにおいて評価された 前コート／コートチューブおよび標準コートチューブ コーティング法 標準コート 前コート／コート 一次抗体力価 １／１０，０００ １／５００，０００Ｔ₄のμｇ／ｍｌ 蛍光ユニット ０．０ ６２５８．０ ６４１６．５ ０．５ ４４２３．５ ５６６６．０ ２．０ ４２５８．５ ４２８８．０ ４．０ ３５４０．０ ３６６３．０ ８．０ ３１２２．０ ３１９４．０ ３２．０ ２４３８．５ ２７３６．５ この結果が示すことは、等しい応答のために必要な抗体
の量は、新しいコーティング法を用いた場合、５０倍減
少したことである。

【０１０３】実施例５−８ 前コートおよびコート工程の条件は、アッセイの応答へ
の影響を測定するために変更された。条件は各実施例に
おいてまとめられ、そして結論は以下の各実施例に要約
されている。コートされたチューブは実施例１（Ｉ）
（Ｄ）にしたがって調製され、そして実施例１のアッセ
イ法の原理に記載されている方法にしたがってアッセイ
された。アッセイ成分は実施例１に記載されている成分
／処方の記載の部分に記載されている。

【０１０４】実施例５ 異なる二次抗体を用いた前コーティング チューブ上の抗体 源 ＧＡＨ ＴＳＨ 一次抗体 Ｖｅｎｔｒｅｘ ＲＡＧＧＩＧ 二次抗体 Jackson Immunoresearch ＧＡＨ ＴＳＨ 一次抗体 ＯＥＭ（Ａ．Ｐ．） ＲＡＧＧＩＧ 二次抗体 Jackson Immunoresearch ＲＡＨ ＴＳＨ 一次抗体 Ｖｅｎｔｒｅｘ ＧＡＲＧＩＧ 二次抗体 Jackson Immunoresearch ＲＡＨ ＴＳＨ 一次抗体 ＯＥＭ（Ａ．Ｐ．） ＧＡＲＧＩＧ 二次抗体 Jackson Immunoresearch

【表５】 表５ 二次抗体 一次抗体 抗体[μg/ml] ダイナミックレンジ ＲＡＧＧＩＧ Ｖｅｎｔｒｅｘヒツジ ［１．００］ ９．７ 〃 〃 ［０．５０］ ８．７ 〃 〃 ［０．２５］ ９．１ ＧＡＲＧＩＧ Ｖｅｎｔｒｅｘウサギ ［１．００］ ８．５ 〃 〃 ［０．５０］ ８．９ 〃 〃 ［０．２５］ １３．２ ＲＡＧＧＩＧ ＯＥＭヒツジ ［０．２０］ １７．０ 〃 〃 ［０．１０］ １６．０ 〃 〃 ［０．０５］ １３．２ ＧＡＲＧＩＧ ＯＥＭウサギ ［０．２０］ １３．２ 〃 〃 ［０．１０］ １１．０ 〃 〃 ［０．０５］ ８．６ ＲＡＧＧＩＧまたはＧＡＲＧＩＧからなる前コートは２
つの異なる一次抗体に対して各々コートされた。コート
緩衝液は１％ＢＳＡおよび５％デキストロースを含む１
００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４５）からなっ
た。リポソーム上の抗体はベクトンディッキンソン（Ｂ
ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）リサーチセンター、
クローン２９１により供給されるＭＡＨ ＴＳＨであっ
た。

【０１０５】観察 すべての４つの抗体の組み合わせは変位（ｄｉｓｐｌａ
ｃｅｍｅｎｔ）を与えた。

【０１０６】実施例６ 新しい前コート法を用いた低濃度の一次抗体の応答 チューブ上の抗体 記載 種類 ＧＡＨ ＴＳＨ 一次抗体 ＲＡＧＧＩＧ；２μｇ／ｍｌ 二次抗体 リポソーム上の抗体 ＭＡＨ ＴＳＨ

【表６】 表６ ＰＡｂ［μｇ／ｍｌ］ ダイナミックレンジ ０．０５０ １２．５ ０．０２５ １２．０ ０．０２０ １１．５ ０．０１０ １０．７ ０．００５ ６．９観察 １０ｎｇ／チューブの一次抗体で前コートされたチュー
ブは適度の変位を与えた。対象的に、標準コート法によ
りコートされたチューブは１００×高い濃度においてわ
ずかに変位を与えた。

【０１０７】実施例７ Ｉ．一次抗体の濃度、およびコート緩衝液のｐＨおよびイオン強度の変化 チューブ上の抗体 記載 種類 ＧＡＨ ＴＳＨ 一次抗体 ＲＡＧＧＩＧ 二次抗体 リポソーム上の抗体 ＭＡＨ ＴＳＨ 前コート緩衝液 １００ｍＭリン酸（ｐＨ７．４５）中の２μｇ／ｍｌＲＡＧＧＩＧ

【表７】 表７ コート緩衝液ｐＨ ｐＨ８．０ ｐＨ７．４５コート緩衝液 ＰＡｂ［μg/ml］ ダイナミックレンジ ダイナミックレンジ 500mM リン酸 ０．２０ １５．０ １４．７ 250mM リン酸 〃 １７．９ １４．８ 100mM リン酸 〃 １７．４ １７．８ 500mM リン酸 ０．１０ １３．３ ９．５ 250mM リン酸 〃 １７．８ ９．２ 100mM リン酸 〃 ２０．３ １０．７ 500mM リン酸 ０．０５ １７．２ １３．６ 250mM リン酸 〃 １０．１ １０．４ 100mM リン酸 〃 １２．１ １２．４観察 抗体濃度の変化はコート緩衝液のイオン強度およびｐＨ
の変化に非感受性であった。ｐＨ８．０のコート緩衝液
はこれらの条件下でｐＨ７．４５の緩衝液よりも良好な
ダイナミックレンジを与える。

【０１０８】 ＩＩ．コート工程のｐＨ、イオン強度、およびカウンターイオンの変化 チューブ上の抗体 記載 種類 ＧＡＨ ＴＳＨ、［０．２０］ 一次抗体 ＲＡＧＧＩＧ；［２．０］ 二次抗体 リポソーム上の抗体 ＭＡＨ ＴＳＨ

【表８】 表８コート緩衝液 ｍＭ濃度 ｐＨ ダイナミックレンジ リン酸 １０ ７．４５ １４．３ 〃 １００ 〃 １５．１ 〃 ３００ 〃 １７．９ 〃 ５００ 〃 １５．２ リン酸 ３００ ６．７５ １２．４ 〃 〃 ８．５０ １０．１ グリシン ３００ ９．６０ ６．１観察 チューブのダイナミックレンジはコート緩衝液のｐＨ
６．７５からｐＨ８．５０への変化、および１０ｍＭと
５００ｍＭの間のイオン強度の変化には相対的に非感受
性であるらしい。

【０１０９】この抗体には３００ｍＭグリシン（ｐＨ
９．６）は好ましいコート緩衝液ではないが、以下に示
すように他の条件下では他の抗体を用いて満足な結果が
得られる。

【０１１０】実施例８ グリシン前コートにおける二次抗体濃度の変化および 共コートのイオン強度の変化 チューブ上の抗体 記載 種類 ＧＡＨ ＴＳＨ、［０．２０］ 一次抗体 ＲＡＧＧＩＧ；［２．０］ 二次抗体 リポソーム上の抗体 ＭＡＨ ＴＳＨ

【表９】 表９ 前コート 抗体 コート ＰＡｂ ダイナミック緩衝液 ｍＭ ｐＨ [μg/ml] 緩衝液 ｍＭ ｐＨ [μg/ml] レンジ グリシン 300 9.6 [1.0] リン酸 100 7.45 0.2μg/ml 15.3 〃 〃 [2.0] 〃 15.0 〃 〃 [1.0] リン酸 10 7.45 0.2μg/ml 15.5 〃 〃 [2.0] 〃 15.1観察 リン酸緩衝液を用いた標準前コートに加えて、チューブ
の応答は３００ｍＭグリシン（ｐＨ９．６）中の１また
は２μｇ／ｍｌの二次抗体の前コートの使用およびリン
酸コート緩衝液のイオン強度の変化により満足な結果が
得られる。

【０１１１】本発明の好ましい態様が何であると信じら
れているかを記載してきたが、当業者であれば本発明の
精神から離れることなく変化および修飾を行ってよいこ
とは認識できるであろうし、またすべてのそのような変
化および修飾は真に本発明の範囲内のものとして請求さ
れるよう意図される。

フロントページの続き (72)発明者 ルイス・アール・ポーラック アメリカ合衆国ニューヨーク州10471, リヴァーデール，ジョンソン・アベニュ ー 3135 (56)参考文献 特開 昭53−130425（ＪＰ，Ａ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ｉ）二次抗体を、該二次抗体に結合する
   ことができる基材表面に接触させることにより二次抗体
   でコートされた基材を形成し；そして（ii）上記二次抗
   体でコートされた基材を、上記二次抗体が特異的に結合
   する一次抗体にブロック剤と共に接触させる工程からな
   る、基材上への抗体のコーティング法。
2. 【請求項２】基材がプラスチック試験管である、請求項
   １記載の方法。
3. 【請求項３】上記二次抗体が約０．５から約６μｇ／ｍ
   ｌの濃度を有する、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】上記一次抗体が約１０から約５００ナノグ
   ラム／ｍｌの濃度を有する、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】上記ブロック剤が、ウシ血清アルブミン、
   ゼラチンおよびカゼインからなる群から選択される、請
   求項１記載の方法。
6. 【請求項６】上記ブロック剤が約１．０ｍｇ／ｍｌから
   約５０ｍｇ／ｍｌの濃度のウシ血清アルブミンである、
   請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】請求項１に記載の方法により一次抗体に結
   合した二次抗体でコートされた基材からなるイムノアッ
   セイに使用されるのに適した製品。
8. 【請求項８】一次抗体に結合した二次抗体でコートされ
   た基材が競争アッセイに使用するのに適している、請求
   項１記載の方法。
9. 【請求項９】一次抗体に結合した二次抗体でコートされ
   た基材がサンドイッチアッセイに使用するのに適してい
   る、請求項１記載の方法。
10. 【請求項１０】一次抗体に結合した二次抗体でコートさ
    れた基材がＲＩＡに使用するのに適している、請求項１
    記載の方法。