WO2005003155A1 - ブロッキング効率の向上したタンパク質 - Google Patents

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WO2005003155A1
WO2005003155A1 PCT/JP2004/009785 JP2004009785W WO2005003155A1 WO 2005003155 A1 WO2005003155 A1 WO 2005003155A1 JP 2004009785 W JP2004009785 W JP 2004009785W WO 2005003155 A1 WO2005003155 A1 WO 2005003155A1
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WO
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protein
blocking
amino acid
acid sequence
hydrophilic
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Application number
PCT/JP2004/009785
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English (en)
French (fr)
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Toshihiro Kuroita
Atsushi Sogabe
Yutaka Takarada
Naoki Tanaka
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Toyo Boseki Kabushiki Kaisha
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Priority to EP04747253A priority patent/EP1642904A4/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a novel blocking protein or partial sequence protein candidate having a blocking ability based on amino acid sequence information. Furthermore, the present invention provides a method for screening a protein by modifying the amino acid sequence of protein. For proteins with improved locking efficiency. Furthermore, the present invention relates to a blocking reagent, a stabilizing agent, an excipient, a folding auxiliary agent, a refolding auxiliary agent, and a medical coating agent containing the protein. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can improve the blocking efficiency of a protein that can be highly expressed in Escherichia coli, and is useful when a large amount of a protein having excellent blocking efficiency is recombinantly produced. Background art
  • proteins directly extracted from biological components have been often used as blocking agents used in immunoassays and the like.
  • albumin-casein derived from seafood there is a history of the widespread use of albumin-casein derived from seafood.
  • various restrictions have been added due to problems such as mad cow disease.
  • methods for producing them using recombinants have the advantage of eliminating pathogens (substances), but few of them have been put into practical use due to problems such as productivity.
  • FIG. 1 is a diagram showing the concept of measuring the blocking efficiency.
  • FIG. 2 is a diagram showing a protein splitting method.
  • FIG. 3 is a diagram showing a blocking mechanism of a protein exhibiting a blocking ability.
  • FIG. 4 is a diagram showing a three-dimensional structure of DnaK384-607. The ⁇ -sheet corresponds to the ⁇ -terminal, and the helix corresponds to the C-terminal.
  • FIG. 5 is a diagram showing the blocking efficiencies of various Dna ⁇ mutants.
  • Figure 5 is a diagram showing the blocking efficiencies of various Dna ⁇ mutants.
  • FIG. 6 is a diagram showing the structure of the Escherichia coli DnaII protein and the structure of the created mutant.
  • FIG. 7 is a diagram showing the three-dimensional structure of DnaK 381-553.
  • FIG. 8 is a diagram showing a blocking mechanism of a protein having a modified hydrophobic domain.
  • FIG. 9 is a diagram showing the blocking efficiencies of various Dna K mutants.
  • VAV 384-607
  • Dn aK384-607 D479 V, D48 IV
  • FIG. 10 is a diagram showing the correlation between the DnaK mutant concentration and the blocking effect.
  • FIG. 11 is a view showing the blocking rate of the DnaK mutant.
  • FIG. 12 is a diagram showing the application of a DnaK mutant to ELISA blocking.
  • Figure 13 shows the content of hydrophilic and hydrophobic amino acids in proteins frequently used for blocking and proteins with high hydrophobicity.
  • FIG. 14 shows the characteristics of the amino acids contained at the N-terminal side and C-terminal side of BSA, o; casein, lipase, and DnaK384-607.
  • I11 indicates the absolute value of the difference between the hydrophilic and hydrophobic ratios at the N-terminal side and the C-terminal side.
  • FIG. 15 shows a comparison of the blocking effect of the DnaK fragment without the histidine tag (native).
  • BSA (fraction V) was adjusted to a concentration of 0.5 mg / ml for lOmgZml, natiovDnaK419-607 fragment, and this is shown as a comparison at higher concentrations.
  • concentration of BSA (fraction V) was adjusted to 2 mg / m 1, and the value of the naive Dna K419-607 fragment was adjusted to 0.1 mg / m 1, and this is shown as a comparison at a low concentration.
  • FIG. 16 illustrates the data at the high concentration of FIG.
  • FIG. 17 illustrates the data at the low concentration of FIG. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a method for easily finding a protein having a blocking ability from an amino acid sequence, and a protein which can be expressed in large amounts in Escherichia coli or the like and has improved blocking efficiency by amino acid sequence modification. To provide.
  • the present invention has the following configurations.
  • a method for screening a novel blocking protein or partial sequence protein candidate having a blocking ability based on amino acid sequence information comprising screening a protein or partial sequence protein that satisfies the following conditions: How to screen
  • A The amino acid sequence of the protein is divided into two, and each hydrophilic amino acid (D, E, K, H, R, Y) and hydrophobic amino acid (G, A, V, L, I, ⁇ , F, W,
  • D, E, K, H, R, Y hydrophilic amino acid
  • G, A, V, L, I, ⁇ , F, W hydrophobic amino acid
  • the absolute value of the difference between the hydrophilicity / hydrophobicity at each of the two parts calculated from the content of ⁇ ) using the following formula is 0.1 or more
  • the hydrophilic part (the higher value of the hydrophilic Z hydrophobicity) is 0.5 or more
  • a novel blocking protein or partial-sequence protein having blocking ability screened by the method of (1) which can be obtained by the following analysis step D; Protein or partial sequence protein that satisfies the conditions of D 1.
  • Candidate proteins that satisfy the conditions of claim 1 0.5 to lmg / m1: 2 OmM Tr is — Adding HC 1 (diluted to pH 7.0) and similarly prepared serum albumin (Fraction V), blocking at 2 ° C to 10 ° C for 4 to 5 hours, and discarding the solution;
  • Peroxidase for labeling from horseradish was used as a candidate protein solution (0.5- lmg / m 1: diluted in PBS (1)) and dissolved in serum serum albumin (Fraction V) prepared in the same manner to obtain 0.05 mg / m 1;
  • the value measured in the candidate protein is less than 2.5 times the color development of serum albumin.
  • a novel blocking protein or partial sequence protein having blocking ability screened by the method of (1) which can be obtained by the following analysis step H and satisfies the following condition I Protein or partial sequence protein:
  • the measured value of the candidate protein is less than 2.5 times that of the serum of albumin.
  • the amino acid sequence modification is characterized by amino acid substitution, removal, or insertion.
  • a protein having improved blocking efficiency which is derived from “HSP70 family protein”.
  • the protein having improved blocking efficiency according to (8) which is a protein obtained by removing a part of the amino acid sequence of Dna K protein.
  • the protein having an improved blocking efficiency according to item 1.
  • the protein having improved blocking efficiency according to (8) comprising the amino acid sequence at positions 384 to 607 of the DnaK protein, wherein the aspartic acid having amino acid numbers 479 and 481 has been substituted with valine.
  • a blocking protein having one or more hydrophilic domains and one or more hydrophobic domains, wherein the hydrophobic domain can be adsorbed on the vessel wall and the hydrophilic domain is a vessel.
  • a blocking protein capable of covering a hydrophobic domain adsorbed on a wall.
  • MBP maltose binding protein
  • GST daltathione S-transferase
  • F1ag tag F1ag tag
  • My c tag F1ag tag
  • evening dematurity tag The protein according to (20), which is selected from a tag.
  • (22) A method for producing a protein, comprising producing the protein according to any one of (2) to (21) using a prokaryote
  • a method for producing a protein comprising producing the protein according to any one of (2) to (21) using Escherichia coli.
  • a method for producing a protein which comprises producing the protein according to any one of (2) to (21) using a cell-free protein synthesis method
  • the term blocking refers to the prevention of nonspecific adsorption of components to containers, carriers, etc. In particular, preventing non-specific adsorption of proteins to resins such as plastics.
  • non-specific adsorption of a component of a measurement control to a vessel wall interferes with the measurement as a background.
  • the adsorption of the antibody to the polystyrene plate is remarkable, and usually, a protein that easily adsorbs to a resin or the like is added in advance to prevent the non-specific adsorption of the antibody, that is, to perform blocking. That is widely done.
  • immunological measurement is mainly considered, and by measuring non-specific adsorption of IgG in human serum, which is known as an example in which non-specific adsorption is most remarkable, to a polystyrene plate, The blocking effect was measured. That is, the measurement includes the following steps.
  • a lipase derived from Pseudomon as aeruginosa which is known to have a high content of hydrophobic amino acids, for the purpose of examining whether or not highly hydrophobic protein has blocking ability.
  • Lipases are also used in clinical testing applications, etc. It is known that the ability to adsorb to plastic surfaces is so high that it can be problematic. However, as a result of the experiment, it became clear that the blocking effect was hardly observed.
  • the ratio of hydrophilic amino acids to hydrophobic amino acids in each protein is shown in Fig. 13, and a comparison shows that the hydrophobicity of BSA and casein is lower than that of lipase.
  • hydrophilic amino acid and the hydrophobic amino acid referred to herein have various definitions depending on textbooks and the like, but in the present invention, the hydrophilic amino acids are aspartic acid, glutamic acid, lysine, histidine, arginine, and tyrosine.
  • the hydrophobic amino acids were defined as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, triptophan, and proline.
  • hydrophilic amino acids are defined as aspartic acid, glutamic acid, lysine, histidine, arginine, and tyrosine.
  • the hydrophobic amino acids are defined as dalysin, malanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, fenylalanine, tributofan, and proline.
  • Hydrophilic amino acids, His, Tyr, and particularly G 1 y, A 1 a, especially G 1 y are considered to be low hydrophobicity in hydrophobic amino acids, and T yr and G 1 y are excluded for more precise prediction. More preferably, a good result may be obtained if the calculation is performed excluding His, Tyr, Gly, and Ala.
  • the number at the C-terminal side is 0.83, indicating that there is a difference of 0.17.
  • the difference was 0.84 on the N-terminal side and 0.64 on the C-terminal side, and the difference was 0.24.
  • the N-terminal side is 0.39 and the C-terminal side is 0.44, which is 0.05 and the difference is less than 0.1.
  • a condition that a hydrophilic region was required in addition to a relatively hydrophobic region in the protein molecule in order to exhibit the blocking ability.
  • the hydrophilic portion, the hydrophobic portion and the full-length hydrophilic / hydrophobic ratio are preferably in the following ranges.
  • the hydrophilic portion has a hydrophilic Z hydrophobicity of 0.5 to 2.0, more preferably 0.7 to 1.7, and further preferably 0.8 to 1.5.
  • the hydrophilic portion has a hydrophilic Z hydrophobicity of 0.2 to 1.1, more preferably 0.3 to 1.0, and even more preferably 0.4 to 0.9.
  • the hydrophilic / hydrophobic ratio of the whole protein is 0.4 to 2.0, more preferably 0.5 to 1.5, and still more preferably 0.6 to 1.0.
  • the difference (absolute value) of the hydrophilic Z hydrophobicity between the hydrophilic part and the hydrophobic part is preferably 0.1 to 0.6, more preferably 0.15 to 0.5, and still more preferably 0.15 to 0. 4
  • the hydrophilic portion and the hydrophobic portion may each be a bisected portion, for example, the C-terminal side (or the N-terminal side).
  • the present invention assumes that the hydrophilic portion and the hydrophobic portion are present in each of two parts, for example, at the C-terminal side or the N-terminal side.
  • the addition of a sequence that is neither hydrophobic nor hydrophobic is included in the present invention as long as the hydrophilic portion and the hydrophobic portion are present.
  • the present invention provides a hydrophilic part-hydrophobic part-hydrophilic part, a hydrophobic part-hydrophilic part-hydrophobic part, and a hydrophilic part-hydrophobic part-hydrophilic part-hydrophilic part. What has each part in order like a hydrophobic part is also contained in this invention.
  • the hydrophobic part (hydrophobic domain) is adsorbed on the vessel wall, and the hydrophilic part (hydrophilic domain) is overlaid on the vessel wall. It can be inferred that locking is performed.
  • Figure 3 shows the model. Lipase does not show blocking ability because it is adsorbed but the adsorbed protein It is expected that further non-specific adsorption to the protein would have occurred because the quality was too hydrophobic.
  • the ratio of the hydrophobic part adsorbing to the vessel wall and the hydrophilic part covering the hydrophobic part is the hydrophobic part
  • the hydrophilic portion it is 0.3 to 10, preferably 0.5 to 5, and more preferably 0.7 to 2, the hydrophilic portion relative to 1. If the hydrophobic part is too large, it cannot be covered with the hydrophilic part, and other proteins will be further adsorbed on the hydrophobic part adsorbed on the vessel wall. On the other hand, if the hydrophilic portion is too large, the area where the hydrophobic portion is adsorbed on the vessel wall becomes too small, so that it cannot be sufficiently firmly adsorbed or the efficiency of blocking decreases.
  • “dividing into two” does not mean that the entire sequence is divided by about 50%, but merely that it is divided into a hydrophobic part and a hydrophilic part.
  • the hydrophilic / hydrophobic ratio of the plural hydrophilic parts and hydrophobic parts is calculated as an average value.
  • the hydrophilic portion and the hydrophobic portion each have a lump portion, preferably having a domain structure, and each portion has at least 20%, preferably at least 30%, more preferably at least 40% of the entire sequence. % Or more.
  • it is preferable and effective to analyze the amino acid sequence by dividing the amino acid sequence into N-terminal side and C-terminal side.
  • the difference between the hydrophilic domain and the hydrophobic domain in the hydrophilic Z hydrophobicity varies among the proteins, and only the magnitude of the value reflects the blocking ability in detail. It may not be possible. One of the factors seems to be molecular weight.
  • "consisting of more than 100 amino acids” means that the total number of amino acids in the entire amino acid sequence is at least 100 residues, preferably 150 residues. Consisting of more amino acids, more preferably more than 200 residues of amino acids. The upper limit is preferably 2000 amino acid residues, more preferably 1500 amino acid residues, and still more preferably 10000 amino acid residues.
  • the number of amino acids in the hydrophilic portion or domain is preferably at least 30 amino acid residues, more preferably at least 50 amino acid residues, even more preferably at least 60 amino acid residues, particularly preferably at least 80 amino acid residues. It is preferably 100 amino acid residues or less, more preferably 500 amino acid residues or less.
  • the number of amino acids in the hydrophobic portion or domain is preferably at least 30 amino acid residues, more preferably at least 50 amino acid residues, still more preferably at least 60 amino acid residues, particularly preferably at least 80 amino acid residues, and It is preferably at most 1,000 amino acid residues, more preferably at most 500 amino acid residues.
  • the domain as referred to herein means a region having one unit in the structure or function of a molecule.
  • the domain mainly means a unit having a structural unit.
  • DnaK384-607 various deletion mutants of DnaK384-607 were prepared, and it was examined which structure of DnaK plays an important role in blocking.
  • the mutants examined this time are shown in FIG.
  • the five proteins examined were DnaK 384-638, DnaK 384-607, DnaK 384-578, DnaK 384-561, DnaK 508-607, and DnaK 525-607. These proteins can be expressed in large quantities using Escherichia coli as a host, and expressed by adding a histidine fragment to the N-terminal side of each protein, then easily purified using a nickel chelate column, and used in experiments. be able to.
  • the blocking ability is impaired due to the shrinkage of the hydrophilic portion of the protein having the blocking ability or the disruption of the structure.
  • the hydrophilic portion alone does not exhibit blocking ability.
  • the hydrophilic part is important in addition to the hydrophobic part in order to exert the blocking ability, and the protein showing the blocking ability is adsorbed on the plate by the hydrophobic part as shown in Fig. 3, and the hydrophilic part is It is considered that the blocking effect can be considered as a result of covering the plate surface with the part.
  • DnaK it is expected to be exactly as shown in the left diagram of FIG. In general, it is known that the secondary structure collapses due to denaturation or mutation, thereby losing the hydrophilicity of the protein. Thus, it is expected that preparing a partial sequence protein is not appropriate. On the contrary, it seems that it is possible to improve hydrophobicity by disrupting the hydrophobic domain as shown in FIG.
  • the domains are important, and it appears that at least one more domain structure is required. Therefore, 100 amino acids required to construct one structural domain can be used as a guide. Therefore, it can be said that the present invention desirably comprises at least more than 100 amino acids, that is, has more than one domain structure.
  • the present invention provides a method for screening a novel blocking protein or partial sequence protein having a blocking ability based on amino acid sequence information. Specifically, it is a method of screening for a protein or partial sequence protein that satisfies the following conditions.
  • the hydrophilic part (higher value of hydrophilicity / hydrophobicity) is 0.5 or more
  • D is aspartic acid
  • E glutamic acid
  • K is lysine
  • H is histidine
  • R is arginine
  • Y is tyrosine
  • G is glycine
  • A is alanine
  • V is valine
  • L is leucine
  • I is isoleucine
  • M indicates methionine
  • F indicates phenylalanine
  • W indicates tributophan
  • P indicates proline.
  • partial sequence protein refers to a protein consisting of a partial amino acid sequence of a wild type protein, and is preferably a protein having more than one domain structure.
  • the amino acid sequence When the amino acid sequence is divided into, for example, the N-terminal side and the C-terminal side, it is not always necessary to divide exactly, but it is preferable to divide the amino acid sequence so that the numbers of both amino acids are almost equal. If a signal peptide is expected from the amino acid sequence, it is advisable to exclude that part. Actually, in the present invention, the calculation was performed using the mature amino acid sequence from which the signal peptide was removed for both BSA, ⁇ casein and lipase. In addition, a dividing method other than bisecting the ⁇ terminal side and the C terminal side as shown in FIG. 2 is also preferably used. In such a case, a protein whose tertiary structure is known or a protein whose tertiary structure is predicted can be preferably applied.
  • the present invention also relates to a protein or partial sequence protein having blocking ability, which is screened from an amino acid sequence by the above method, and which satisfies the condition of E in the following analysis step D. .
  • Candidate protein that satisfies the conditions of claim 1 (diluted in 50-: L0 Omg / m1: 2 OmM Tris_HC1 (pH 7.0)) in each well of a polystyrene imino plate. And adding serum serum albumin (Fraction V) prepared in the same manner, blocking at 2 ° C to 10 ° C for 4 to 5 hours, and discarding the solution.
  • Fraction V serum serum albumin
  • Color development of the candidate protein is 2.5 times or less, preferably 2 times or less, more preferably 1.5 times or less, still more preferably 1.2 times or less, and especially 1 time of the color development of bovine serum albumin It is as follows.
  • the blocking ability is measured based on the non-specific adsorption of IgG in human serum, which is known to have remarkable non-specific adsorption on a plastic plate.
  • the polystyrene immunonotiter plate (96-well type) used here is a polystyrene 96-well immunonotiter plate generally used for immunoassay.
  • the candidate protein is purified by an appropriate method and diluted with 2 OmMTris_HCl (pH 7.0) to a final concentration of 50 to 50 mg / ml.
  • BSA serum albumin
  • BSA FractiOnV commercially available from SIGMA or the like can be used.
  • the performance is the same, it is not particularly required to be F ractio n V. After blocking for 4-5 hours at 2-8 ° C, completely remove the solution and proceed to the next step without washing.
  • the human serum used here is not particularly limited as long as it is a serum separated from a normal adult. Since the stock solution has a high concentration, it is recommended to use a 25 to 50-fold dilution with PBS (-) before use. Since the amount of IgG in the individual varies, the dilution ratio may be slightly changed. Pre Non-specific adsorption to a batch is performed at 37: for 30 minutes. In addition, in order to accurately measure the amount of serum to be added at this time, it is preferable that the amount be smaller than the amount of the liquid that was initially blocked. For example, when blocking was performed at 100/21, 50 1 Add diluted serum solution from.
  • washing is preferably performed three times or more, and more preferably four times.
  • a dedicated plate washer may be used.
  • the enzyme-labeled anti-human IgG antibody is diluted to an appropriate concentration with an appropriate solution, and added to the above-mentioned well.
  • Appropriate reaction time is 37 ° C for 1 hour.
  • the dilution of the antibody is usually preferably used for immunological detection, and the dilution of the antibody should preferably contain an appropriate blocking agent (BSA or casein), so that the dispersion will be more consistent and more preferably 0. 01M phosphate buffer (pH 7.4), 0.15M NaC 0.5% strength Use zein.
  • peroxidase and alkaline phosphatase are preferably used, and particularly, peroxidase is preferably used.
  • a coloring reagent for oxidase tetramethylbenzidine (TMBZ: 3, 3 ', 5, 5'-Tetramethy1 benzizidine) is preferably used.
  • WT-1 can be used as a chromogenic substrate for alkaline phosphatase. It is desirable that the color development time is such that the absorbance of the target gel does not lose its quantitativeness (0.5 to 1.5). Note that the correct value cannot be obtained if the value exceeds the quantification range. In addition, accurate values cannot be obtained unless the plate is dried as much as possible throughout the entire operation.
  • the novel blocking protein or partial sequence protein having the blocking ability of the present invention satisfies the conditions described in claim 1 and shows a value of 2.5 times or less the value of BSA in this assay, that is, It is a protein having blocking ability.
  • Example 7 a method as shown in Example 7 can be used. That is, after serially diluting peroxidase in the candidate protein solution, apply it to the solid phase, allow it to adsorb for a certain period of time, and measure non-specific adsorption of peroxidase.
  • the as a method for confirming the adsorbed peroxidase a color development method using tetramethylbenzidine (TMBZ: 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine) is preferably used as in the above method. Also in this Atsushi, a value of 2.5 times or less of the BSA value is an index indicating the blocking ability.
  • TMBZ tetramethylbenzidine
  • a non-specific adsorption may be measured by adding a diluted peroxidase solution to a previously blocked solid phase. Even in this case, a value of 2.5 times or less of the BSA value is an indicator of the blocking ability.
  • concentration of the peroxidase solution used here is preferably 0.05 mg / ml, but if adjusted and used so that it can be measured in a common sense range, it will lead to more accurate evaluation.
  • the dilution of peroxidase is preferably performed with PBS (-), but is not particularly limited.
  • the present invention preferably has more than one domain structure, but especially in the case of a hydrophobic domain, even if a part of one of the two domain structures is missing as in this example. good.
  • the number of amino acids of the protein or partial sequence protein of the present invention is 100 or more, preferably 150 or more, and more preferably 180 or more.
  • the present invention is a novel protein in which the amino acid sequence of the protein meeting the above-mentioned claim 1 is modified to further improve the blocking efficiency of the protein or its partial sequence protein.
  • new as used herein means novel at the level of amino acid modification, and may be a known protein. In the case of a partial sequence, a sequence having a previously unknown partial sequence is also regarded as new.
  • the amino acid sequence may be modified by any of amino acid substitution, removal (delivery), insertion (insertion), or overlapping.
  • a mutation that further enhances the hydrophobicity of the hydrophobic region or a mutation that further enhances the hydrophilicity of the hydrophilic region is effective and is preferably used.
  • the protein to be modified may be of prokaryotic or eukaryotic origin, such as E. coli.
  • a prokaryotic protein is preferably used. More preferably, a protein derived from Escherichia coli is used.
  • the protein used may be a partial structure such as a domain, but is preferably used.
  • a blocking agent is often mixed with an enzyme or the like and used as a stabilizer / excipient in many cases, and it can be said that a protein having no special function of enzyme activity is suitable for the present invention. Further, a protein from which a domain having an enzymatic activity has been removed is also preferably used.
  • a protein derived from the HSP70 family protein is preferably used, and more preferably, a protein derived from Escherichia coli DnaK protein is used. Further, preferably, the substrate binding domain of the HSP70 family protein from which the ATPase domain has been removed is used, and more preferably, the substrate binding domain of the DnaK protein from which the ATPase domain of Escherichia coli has been removed is used. Can be The substrate binding domain of the DnaK protein has already been introduced above as an example.
  • the proteins belonging to the HSP70 family used in the present invention are not particularly specified, but include Escherichia coli DnaK, Ssa1p present in yeast cytoplasm, Ssc1p present in yeast mitochondria, and yeast endoplasmic reticulum.
  • Kar2p HSP70 in the mammalian cytoplasm, Bip in the mammalian endoplasmic reticulum, mHsp70 in the mammalian mitochondria, and constitutive expression regardless of heat shock.
  • HSP70 homologues such as HSC70. Many homologs are known in the HSP70 family, some of which are listed above. Naturally, it can be easily predicted that similar effects can be expected for homologs other than those listed above. In particular, since the research on E.
  • This protein is composed of 638 amino acids and consists of the "ATPase (ATP binding) domain" composed of amino acids 1-385 and the amino acid composed of amino acids 386-638 It consists of a “substrate binding domain” ( Figure 6).
  • SEQ ID NO: 1 shows the sequence of the DNA K protein
  • SEQ ID NO: 2 shows the gene sequence.
  • HSP70 binds to nascent polypeptides and partially folded proteins and is known to help refold proteins that cannot be spontaneously folded. Richer groups to work It is known to recognize quality.
  • FIG. 9 A remarkable improvement in the blocking efficiency was observed (FIG. 9).
  • a remarkable improvement in the blocking efficiency was observed in Dna K 419-607.
  • This protein appears to exhibit blocking in the manner shown in FIG. That is, it is considered that the structure of the hydrophobic domain was changed due to the change in the structure of the hydrophobic domain, and the improved hydrophobicity of the hydrophobic domain was linked to the improvement of the blocking ability.
  • improvement in blocking ability means that amino acid substitution, delivery, insertion, and the like are performed on a candidate protein, and the blocking ability is improved as compared with the original protein or partial protein sequence.
  • This improvement in blocking ability is preferably measured by the method described in claim 2.
  • To improve the blocking ability there are a long-term blocking ability and a short-time blocking ability. It is sufficient that the blocking ability is improved in either or both.
  • the present invention is a DnaK protein with improved blocking efficiency, wherein at least the amino acid sequence from the ⁇ terminus to the 387th position, at most up to the 472th position, has been removed. Further, the present invention is a Dna ⁇ protein having improved blocking efficiency, characterized in that at least the amino acid sequence from the ⁇ terminus to the 387th position, at most to the 418th position, has been removed. More preferably, it is a protein comprising the amino acid sequence of positions 419 to 607 of the DnaK protein.
  • the present invention relates to a protein having improved blocking efficiency, wherein a hydrophilic amino acid in the DnaK protein from which the ATPase domain or a part thereof has been removed is partially substituted with a hydrophobic amino acid. is there. More specifically, a protein in which the amino acid sequence of the Dna K protein from which the ATPase domain or a part thereof has been removed has been removed, and aspartic acids at amino acids 479 and 481 have been substituted with valine. It is a protein with improved blocking efficiency. Still more preferably, a protein consisting of the amino acid sequence at positions 384 to 607 of the DnaK protein, in which the aspartic acids of amino acids 479 and 481 are substituted with valine, is used.
  • modified means that the amino acid sequence has been modified by amino acid substitution, deletion, insertion, or the like of the candidate protein. This modification, after selecting the candidate protein or partial sequence of the protein, is based on the considerations shown above, (1) not to destroy the hydrophilic domain, (2) to make the hydrophobic domain more hydrophobic It is preferable to modify amino acids for the purpose of, for example, the following. Although not shown in the present invention, measures to make the hydrophilic domain more hydrophilic should be naturally considered.
  • the present invention also relates to a protein for blocking having one or more hydrophilic domains and one or more hydrophobic domains, wherein the hydrophobic domain can be adsorbed on the vessel wall, and the hydrophilic domain is adsorbed on the vessel wall.
  • Blocking protein capable of covering the hydrophobic domain.
  • the domain as referred to herein is preferably a structural amino acid group consisting of 50 or more amino acids, and a partially deleted or added domain is also regarded as a domain.
  • the present invention also specifies the blocking speed. That is, it is a modified protein characterized in that the blocking rate is higher than that of BSA. More specifically, a modified protein characterized in that the blocking ability in less than 10 minutes is superior to BSA under the same amount of protein so that the blocking efficiency is the same as BSA in blocking for 3 hours. It is.
  • altered indicates that the gene sequence encoding the wild-type protein has been converted by amino acid substitution, deletion, insertion, or the like.
  • the evaluation method is not particularly limited, but the methods shown in Examples 5 and 7 are preferably used, and the measurement is performed using non-specific adsorption of IgG or peroxidase to a polystyrene plate as an index.
  • I g G As an evaluation method using the I g G is 1 to 1 0 minutes, preferably after 2 to 10 minutes blocking, PBS (-) was added human serum diluted in, 3 7 ° C '6 0 min After the incubation, the plate is washed and reacted with an optimal concentration of anti-human IgG antibody (peroxidase-bound). After washing, the amount of non-specifically adsorbed IgG is measured by the color development of TMBZ.
  • peroxidase first, horseradish-derived peroxidase for labeling (PEO_131, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is dissolved in a protein solution whose blocking ability is to be measured at a concentration of 2 mg / ml.
  • a dilution series is prepared with the same solution up to 40 to 320 times that of the peroxidase solution, and each dilution 1001 is dispensed into a 96-well polystyrene microplate. After leaving at room temperature for 1 hour, the solution is removed, and the plate is washed with a PBS buffer containing 0.02% Tween 20. Repeat this washing operation 6 times. After returning, remove the washing solution well. After adding tetramethylbenzidine and incubating at 37 ° C. for exactly 10 minutes, 1N sulfuric acid is added to stop the reaction and develop color. This color development is measured with a microplate reader at a main wavelength of 450 nm and a subwavelength of 650 nm.
  • Example 7 it is also possible to add a diluted peroxidase solution to the previously blocked solid phase and measure its non-specific adsorption.
  • concentration of the peroxidase solution used here is preferably 0.05 mgZm1. However, adjusting and using it so that it can be measured within the common sense will lead to more accurate evaluation.
  • the dilution of peroxidase is preferably performed with PBS (-), but is not particularly limited.
  • BSA Band Absorbent A
  • BSA concentration As the BSA concentration used in this measurement, an amount that shows the same blocking efficiency as that of the sample protein at the third hour is used, but it is necessary to examine the concentration in advance.
  • a buffer for dissolving those proteins 2 OmM Tris-HC1 (pH 7.0) or PBS (-) is preferably used, but is not particularly limited.
  • the protein or protein fragment used in the present invention may have a tag.
  • Tags include histidine tag, GST (daltathione-S-transferase) tag, MBP (mal) binding protein tag, F1ag tag, My c tag, and TAP (tandem affinity pilification) tag. Any tag may be employed, and any protein may be fused and used as necessary. An arbitrary amino acid sequence or the like may be added to a known tag.
  • a tag which is not generally known or an arbitrary amino acid sequence may be added.
  • a tag which is not generally known or an arbitrary amino acid sequence
  • expression enhancement and restriction enzyme The addition of several amino acids is also conceivable from the relation of the weight.
  • four amino acids of MRGS are added to the N-terminus of DnaK419-607N in Example 7.
  • the position to be added may be N-terminal side or C-terminal side.
  • the method for expressing the present protein is not particularly limited, but is preferably a method of expression using a prokaryote, and more preferably a method of expression using Escherichia coli.
  • the expression vector is not particularly limited, and may be any vector that is generally used for expression.
  • the crude purification solution is heated at an appropriate temperature and the centrifuged supernatant is purified, whereby the protein can be purified efficiently. Heating is preferably performed at 50 ° C or higher, more preferably at 70 ° C or higher.
  • the substrate-binding domain of DnaK used in this study is also resistant to heat.
  • the protein of the present invention having improved blocking efficiency can be applied to a blocking agent, an excipient, a stabilizing agent, a refolding aid, a coating agent, a medical coating agent and the like.
  • a blocking agent in particular, it is expected to be used as a blocking agent in a detection system that utilizes an immune reaction, and is expected to be applicable to ELISA, immunohistochemical staining, western blotting, and the like.
  • ELISA Enzyme—Linke d Immuno sorbent Assay
  • One embodiment of the present invention is a blocking agent, excipient, stabilizer, and refolding aid containing .DnaK419-607.
  • One embodiment of the present invention is a blocking agent, excipient, stabilizer, and refolding aid containing DnaK384-607 (D479V, D481V).
  • DnaK384-607 D479V, D481V.
  • hydrophilic amino acids were used as hydrophilic amino acids according to the definition of GENETYX.
  • the hydrophobic amino acids were glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan and proline.
  • the DNA fragment was cloned by amplifying the target gene fragment by PCR using genomic DNA extracted from E. coli K-12 strain as type III.
  • KOD-P 1 us manufactured by Toyobo was used.
  • the reaction buffer, ImM MgS04, the primers shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 were added to 15 pmo 1 e, polymerase 1 unit and
  • the DNA was prepared so as to be 100 ng of Enterobacteriaceae DNA, and the cycle of 94 ° C for 2 minutes, followed by 25 cycles of 15 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 55 and 68 ° C for 1 minute was performed 25 times.
  • DnaK386-586 was carried out using the primers shown in SEQ ID NOS: 3 and 4.
  • the amplified DNA fragment was digested with the restriction enzyme BamHI and cloned into the BamHI-SmaI site of pQE30 (the DNA fragment amplified by KOD-P1us was blunt-ended). Therefore, the downstream side of the amplified fragment was used as it was).
  • the sequence of the cloned gene was confirmed by sequence analysis. Cloning into this vector allows a 6 X His sequence (histidine sequence) to be added to the N-terminus of the target protein. G) can be added.
  • an expression plasmid pQE-DnaK384-638 was prepared.
  • the gene-introduced JM109 was cultured with shaking in LB medium for 16 hours, and the cells were collected by centrifugation and suspended in 20 mM Tris-HCl (pH 7.0). After sonication, the suspension was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes using a high-speed microcentrifuge, and the supernatant was used. Specifically, it was purified using HI S-S elect HC Nickel Affinity Gel (manufactured by SI GMA), and finally purified against 2 OmM Tris-HC 1 (pH 7.0). Dialyzed overnight and used for experiments.
  • Example 3 Preparation of C-terminal-removed DnaK clone and point mutant
  • the C-terminal-removed DnaK clone can be prepared by using the pQE-DnaK384-638 prepared in Example 1 as type ⁇ using the Quick Change method. Was prepared by introducing stop codon into the site.
  • DnaK 384-607 (D 479 V, D 481 V) used pQE-DnaK384-607 as a type III, and mutagenesis was performed using SEQ ID NOS: 11 and 12. After confirming the sequence of each of the prepared mutants by sequence analysis, proteins were prepared according to the method described in Example 1.
  • Example 4 Production of N-terminal-removed Dna K clone
  • PCR amplification was performed using the pQE-DnaK384-607 type III primer prepared in Example 2 and the following primers, and according to the method of Example 1, the BamHI-SmaI site of the pQE30 vector was used. Introduced into Set of clones and primers used are as follows: DnaK 508-607: SEQ ID NOs: 13 and 2, DnaK 525-607: SEQ ID NOs: 14 and 2, DnaK 419-607: SEQ ID NOs: 15 and 2. After confirming the sequence of each of the produced mutants by sequence analysis, proteins were prepared according to the method described in Example 1. Example 5 Blocking effect
  • the blocking efficiency was measured using the following method.
  • the study was performed using non-specific adsorption of human serum IgG on polystyrene plates as an index.
  • BSA Sigma, Fraction on V
  • 20 mM Tris-HCl pH 7.0
  • various mutant Dna K samples 1001 were mixed with a polystyrene 96 ⁇ Elymno plate (Co star product; E.I.A./RI A 8We11 Strip) and allowed to stand at 4 ° C for 4 hours (Basically allowed to stand for 4 hours, but consider the blocking time If you set any time).
  • normal human serum was diluted 50-fold with PBS (-), 50 z1 was added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • each well is washed four times with a washing solution of 201 (PBS (—), 0.05% Tween 20), and the antibody diluent (0.01 M PB (pH 7.4)) is adjusted to the optimal concentration.
  • Peroxidase-labeled anti-human IgG antibody Jacks on ImmunoResearch 50 i1 diluted with 0.15 M NaC 0.5% casein
  • was added to each well and the mixture was added at 37. Time incubated.
  • each well was washed four times with 200 1 of a washing solution (PBS (—), 0.05% Tween 20), and a color reagent (tetramethylbenzidine (TMBZ: 3, 3 ', 5, 5') was used.
  • TMBZ tetramethylbenzidine
  • BSA, DnaK 384—638, DnaK 384—607, DnaK384—578, DnaK508—607, and DnaK 525-607 prepared at 0.7 mg / ml in 4 hours
  • DnaK 384-638, and DnaK 384-607 had low blocking effects.
  • DnaK 384-607 and DnaK 384-578 were used for the ⁇ -helix-cut, DnaK 508-607, and DnaK 525-607 for the / 3 sheet. It was a deleted clone, and it was speculated that 0 was required for blocking using the substrate binding domain of DnaK; both a helical structure and a ⁇ -sheet structure were required.
  • BSA was prepared with the same concentration as DnaK 384-607 (D479 V, D481V) and DnaK 419-607 (7 mg / m 1 each) to improve the hydrophobicity of the ⁇ -sheet part.
  • the blocking effect of 4 hours of blocking was compared with that of DNA 384-607 as a control.
  • both DnaK 384-607 (D479V, D481V) and DnaK 419-607 had higher blocking efficiency than BSA at the same concentration, and were particularly remarkable with DnaK 419-607 (FIG. 9).
  • anti-hCEA MoAb was diluted to 10 ⁇ g / m 1 with 50 mM carbonate buffer (pH 9.6), and 100 ⁇ l of the diluted solution was added to a polystyrene 96 ⁇ Elymno plate (Costar; E.I.A. /R.I.A8We11StriP), and allowed to stand for 37 * 1 hour.
  • the plate was washed four times with a 150/21 washing solution, and then diluted with an optimal concentration of peroxidase-labeled anti-hCEA antibody (Imnoflora: Toyobo) After the reaction at 37 ° C * lh, the wells were further washed three times with 150 il of a washing solution (PBS (—), 0.05% Tween 20) Then, the substrate solution (tetramethylbenzidine (TMB Z: 3, 3 ', 5, 5'-Tetra meth thy 1 benzidine)) 100 1 was added, and the color was developed at 37 ° C for 20 minutes in the absence of light. H2 S04) 100 1 was added, and the yellow color development was measured at 450 nm / 650 nm.
  • TMB Z tetramethylbenzidine
  • Dna K fragments constructed in Examples 2 to 4 all have a histidine tag at the N-terminus derived from the expression vector pQE30, the Dna K fragment The isoelectric point has shifted to neutral pH. Therefore, a DnaK fragment from which the histidine tag had been deleted was constructed so that the original ability of blocking by electrostatic interaction could be maintained.
  • Histidine tag removal DnaK clone was prepared by using the pQE-DnaK4 9-607 prepared in Example 5 as a ⁇ type and using the Quick Change method to remove Dn containing a histidine tag from the start codon. It was prepared by deleting the amino acids up to the aK region. Actually, a BamHI site was introduced upstream of the histidine tag by using Quic kCh e nge sid e ire c ct i ve m u t a ene s e s s ki t (manufactured by s sta tta gen e). The operation was performed according to the instruction manual.
  • the primer sequences used at that time are shown in SEQ ID NOs: 16 and 17.
  • a BamHI site is also provided upstream of the cloned gene. Therefore, a clone from which the histidine tag sequence has been removed can be obtained by digesting and religating the vector obtained with BamHI.
  • This expression vector was named PQE-DnaK419-607N.
  • the native DnaK419-607 fragment was prepared by culturing a transformant obtained by transforming Escherichia coli JM109 with this pQE-DnaK419-607N. That is, E. coli JM109 (pQE-DnaK419-607N) containing 100 mg / L of ampicillin in trophic broth (1.2% polypeptone, 2.4% yeast extract, 0.5% glycerol, 17 mM potassium phosphate 1 mM) , 72 mM dibasic phosphate) and cultured at 32 ° C. for 20 hours.
  • Cells of 1 L of the main culture were collected by centrifugation, suspended in 200 ml of 100 mM Tris-HCl buffer, pH 9.0, and disrupted by a French press. Polyethyleneimine was added to the crushed liquid to a final concentration of 0.1%, and the mixture was heated at 60 ° C for 2 hours, and the supernatant was collected by centrifugation. Then, 50% saturated ammonium sulfate was added, and the precipitate was collected by centrifugation, and then redissolved in 100 mM Tris-HCl buffer, pH 9.0. The mixture was further heated at 64 ° C for 14 hours, and the supernatant was collected by centrifugation.
  • the comparison of the blocking efficiency between BSA and the native DnaK419-607 fragment was measured by the following method.
  • horseradish-derived peroxidase for labeling (TOYOBO (PE-131 made of glue) was dissolved at 2 mg / ml in a PBS buffer containing BSA or native DNA K 419-607 fragment.
  • the commercially available BSA (fraction V) was adjusted to 2 or 1 Omg / m 1
  • the native DnaK419-607 fragment was adjusted to 0.1 or 0.5 mg Zm 1.
  • a dilution series was prepared up to 320 times, and each diluted solution 100 1 was dispensed into a 96-well microplate made of polystyrene, allowed to stand at room temperature for 1 hour, and then the solution was removed, containing 0.02% Tween 20 After washing with PBS buffer 200 u I.
  • the present invention it becomes possible to easily screen a novel protein or partial sequence protein having a blocking ability based on amino acid sequence information.
  • production of a protein with improved blocking efficiency, which can be expressed in a large amount became possible.
  • the protein obtained by the present invention has a high blocking ability, and simple and reliable results can be obtained as compared with the conventional method.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention greatly contributes to fields such as clinical diagnosis and medical treatment to which immunoassay is applied.

Abstract

アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規タンパク質または新規部分配列タンパク質を簡便にスクリーニングする方法、及び大腸菌で大量発現可能なブロッキング効率の向上したタンパク質を提供する。アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規タンパク質または部分配列タンパク質をスクリーニングする方法、及びアミノ酸配列改変によってブロッキング効率の向上したことを特徴とするタンパク質、及び該タンパク質の利用方法。

Description

明細 ブロッキング効率の向上したタンパク質
技術分野
本発明は、ァミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規なブロッキング用 タンパク質または部分配列タンパク質候補をスクリーニングする方法に関し、更には、 本発明は夕ンパク質のアミノ酸配列を改変することにより、プロッキング効率の向上 したタンパク質に関する。 更には、 該タンパク質を含有する、 ブロッキング試薬、 安 定化剤、 賦形剤、 フォールデイング補助剤、 リフォールデイング補助剤、 医療用コー ティング剤にも関する。本発明は、大腸菌での高発現可能なタンパク質のブロッキン グ効率を向上させることができ、ブロッキング効率に優れたタンパク質を組換えで大 量に生産する場合有用である。 背景技術
従来、免疫測定などで用いられるブロッキング剤としては生体成分から直接抽出し たタンパク質が多く使用されてきた。特にゥシ由来のアルブミンゃカゼィンなどが広 く使用されてきた歴史がある。 しかし近年、 狂牛病などの問題から、様々な制限が加 えられている現状である。 一方、 組換え体を用いてそれらを製造する方法は、 病原体 (物質） を排除できる利点はあるが、生産性などの問題点から実用に至っているもの は少ない。
よって、大腸菌などに由来するタンパク質を、代替タンパク質として使用するとい う試みが、 生産性という立場からは好ましいと言える。 しかし、 大量発現できるタン パク質が必ずしもブロッキング効率が良いわけではなく、組換え体で生産できるプロ ッキング効率に優れたタンパク質を見出さなければならないという問題点があった。 近年、様々な生物の遺伝子配列が明らかとなったが、予想されるアミノ酸配列より ブロッキング効率に優れた夕ンパク質を見出す法則は未だ知られておらず、そのよう なタンパク質を探すには非常な手間が掛かる作業であると思われていた。
このような理由から、組換え体で大量生産できるプロッキング効率に優れた代替夕 ンパク質が求められていた。 図面の簡単な説明
図 1は、 ブロッキング効率測定の概念を示す図である。
図 2は、 タンパク質の 2分割法を示す図である。
図 3は、 ブロッキング能を示すタンパク質のブロッキング機構を示す図である。 図 4は、 Dn aK 384- 607の立体構造を示す図である。 βシ一ト部分が Ν 末端、 ひへリックス部分が C末端に相当する。
図 5は、 種々の Dn a Κ変異体の示すブロッキング効率を示す図である。 図 5にお いて、
B l ank :
384-638 Dn aK384-638
384-607 Dn aK384-607
384-578 Dn aK384-578 αヘリックスの一部の構造が除 去された変異体
384-561 DnaK384-561 ひヘリックスの約半分の構造が 除去された変異体
508-607 Dn aK508-607 ； βシ一ト部分が除去された変異 体 （αヘリックスからなる）
525-607 ： Dn aK525-607 ； )3シート部分と《ヘリックスの 一部が除去された変異体 （αヘリックスからなる）
BSA : BSA f r a c t i ο η V
図 6は、 大腸菌 Dn a Κタンパク質の構造、 および作成した変異体の構造を示す図 である。
図 7は、 Dn aK 381— 553の立体構造を示す図である。
図 8は、 疎水ドメインを改変したタンパク質のブロッキング機構を示す図である。 図 9は、 種々の Dn a K変異体の示すブロッキング効率を示す図である。
384-607 ： Dn aK384-607
384- 607 (VAV) ： Dn aK384-607 (D479 V, D48 IV)
419-607 ： Dn aK419-607
B S A : B S A f r a c t i on V
B l ank : ブロッキングなし
図 10は、 Dn aK変異体濃度とブロッキング効果の相関を示す図である。
図 11は、 Dn a K変異体のブロッキング速度を示す図である。
図 12は、 Dn aK変異体の EL I S Aのブロッキングへの応用を示す図である。 図 13は、 ブロッキングに頻繁に使用されるタンパク質と疎水性の高いタンパク質 の親水性、 疎水性アミノ酸の含有率を示す。
図 14は、 BSA、 ο;カゼイン、 リパーゼ、 Dn aK384— 607の N末端側と C末端側の含有アミノ酸の特徴を示す。 I l Iは N末端側と C末端側の親水疎水率の 差の絶対値を示す。
図 15は、 ヒスチジンタグなし (n a t i v e) の Dn a Kフラグメントのプロッ キング効果の比較を示す。 BSA (フラクション V) は l OmgZml, n a t i v e Dn aK419— 607フラグメントは 0. 5 m g/m 1の濃度に調整して、 こ れを高濃度における比較として示す。 また、 BSA (フラクション V) は 2mg/m 1、 n a t i ve Dn aK419— 607フラグメントは 0. lmg /m 1の濃度 に調整して、 これを低濃度における比較として示す。
図 16は、 図 15の高濃度におけるデータを図示したものである。
図 17は、 図 15の低濃度におけるデ一夕を図示したものである。 発明の開示
本発明の目的は、アミノ酸配列からブロッキング能を有するタンパク質を簡便に見 出す方法を提供するとともに、大腸菌等で大量発現可能、かつアミノ酸配列改変によ りプロッキング効率を向上させた夕ンパク質を提供することである。
上のような背景を踏まえ、鋭意検討した結果、 ブロッキング能を有するタンパク質 に特徴的なアミノ酸配列に関する性質を見出すと共に、そのようにして見出された夕 ンパク質のアミノ酸配列を改変することによりブロッキング効率を飛躍的に高める ことが出来ることを見出し、 本発明に至った。 すなわち本発明は、 以下の構成からなる。
(1)アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパ ク質または部分配列夕ンパク質候補をスクリーニングする方法であって、以下の条件 を満たす夕ンパク質もしくは部分配列夕ンパク質をスクリ一二ングする方法
A. タンパク質のアミノ酸配列を 2分し、それぞれの親水性アミノ酸（D， E， K, H, R, Y) と疎水性アミノ酸 （G, A, V, L, I， Μ, F, W, Ρ) の含有率か ら以下の式を用いて算出された 2分された各部分での親水/疎水率の差の絶対値が 0. 1以上である
• (親水 Ζ疎水率） = (親水性アミノ酸含有率) / (疎水性アミノ酸含有率)
Β. 親水性部分 （親水 Z疎水率の高い方の値） が 0. 5以上
C. 100残基より多くのアミノ酸よりなる
(2) (1) の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規なブ ロッキング用夕ンパク質または部分配列夕ンパク質であって、以下 Dの解析工程によ り得ることができる、以下の Eの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク質 D 1.ポリスチレン製ィムノ夕イタ一プレートのそれぞれのゥエルに請求項 1の条 件を満たす候補夕ンパク質 （ 0. 5〜lmg/m 1 ： 2 OmM Tr i s— HC 1 (pH7. 0) に希釈） および同様に調製したゥシ血清アルブミン （F r a c t i o n V) を添加し、 2°C〜10°Cで 4〜5時間ブロッキングし、 液を廃棄する工程；
2. PBS (―) で 25〜100倍希釈した正常ヒト血清を添加し、 37°Cにて 1 時間放置した後に、 プレートを PBS (―) (0. 05%Twe e n 20) にて洗浄 する工程；
3.酵素標識した抗ヒト I gG抗体を用いて非特異的にプレートに吸着した I gG 量を発色法を用いた比色法にて比較する工程；
E 候補タンパク質での発色がゥシ血清アルブミンの発色の 2. 5倍以下である。 (3) (1) の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規なブ ロッキング用タンパク質または部分配列夕ンパク質であって、以下 Fの解析工程によ り得ることができる、 以下の Gの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク 質：
D 1. 西洋ヮサビ由来の標識用ペルォキシダーゼを候補タンパク質溶液（0. 5〜 lmg/m 1 ： PBS (一） に希釈） および同様に調製したゥシ血清アルブミン （F r a c t i on V) に 0. 05mg/m 1になるよう溶解する工程；
2. 上記希釈液をポリスチレン製 96穴マイクロプレートに分注する工程；
3. 1時間、 25 °Cで放置した後に、 溶液を除去し、 0. 02% Twe e n 2 0を含む PBS (―) で洗浄する工程；
4. テトラメチルべンチジン溶液を添加し、 37 °Cでインキュベートした後、 1 Nの硫酸を添加し反応停止並びに発色させる工程；
5. 発色をマイクロプレートリ一ダ一にて測定する工程；
G 候補夕ンパク質での測定値が、ゥシ血清アルブミンの発色の 2. 5倍以下である。
(4) (1) の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規なプ ロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質であって、以下 Hの解析工程によ り得ることができる、 以下の Iの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク 質：
H 1.ポリスチレン製ィムノタイタープレートのそれぞれのゥエルに請求項 1の条 件を満たす候補タンパク質 （0. 5〜lmg/ml ： PBS (一） に希釈） および同 様に調製したゥシ血清アルブミン（F r a c t i on V) を添加し、 2°C〜10°C で 4〜 5時間ブロッキングし、 液を廃棄する工程；
2. 0. 05 mgZm 1に調製したペルォキシダ一ゼ溶液を添加し、 37°Cに て 1時間放置した後に、 プレートを PBS (—） (0. 05%Twe e n 20) にて 洗浄する工程；
3. 1時間、 25°Cで放置した後に、 溶液を除去し、 0. 02% Twe e n 20を含む PBS (—） で洗浄する工程；
4. テトラメチルベンチジン溶液を添加し、 37°Cでインキュベートした後、 1 Nの硫酸を添加し反応停止並びに発色させる工程；
5. 発色をマイクロプレー卜リーダ一にて測定する工程；
I 候補タンパク質での測定値が、ゥシ血清アルブミンの発色の 2. 5倍以下である。
(5) (1) に記載の条件 A， B, Cを満たすタンパク質または部分配列タンパ ク質のアミノ酸配列の改変によりブロッキング効率を向上させた新規なタンパク質
(6) アミノ酸配列改変がアミノ酸置換、 除去、 挿入によるものであることを特徴と する （5) に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
(7) 原核生物もしくは真核生物由来であることを特徴とする （5) に記載のブロッ のブロッキング効率の向上したタンパク質。
(8) 「HS P 70ファミリータンパク質」 由来であることを特徴とするブロッキン グ効率の向上したタンパク質。
(9) Dn aKタンパク質由来であることを特徴とする （8) に記載のブロッキング 効率の向上した夕ンパク質。
(10) Dn a Kタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であること を特徴とする （8) に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
(1 1) Dn aKタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、 少なくとも N末端から 387番目まで、多くとも 472番目までのアミノ酸配列を除 去したことを特徴とする （8) に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
(12) Dn aKタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、 少なくとも N末端から 387番目まで、多くとも 418番目までのアミノ酸配列を除 去したことを特徴とする （8) に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
(13) Dn aKタンパク質の 419〜607番目までのアミノ酸配列からなる（ 8 ) に記載のタンパク質
(14) ATP a s eドメインもしくはその一部を除去した D n a Kタンパク質の一 部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したことを特徴とする （8) に記載のブ ロッキング効率の向上したタンパク質。
(1 5) ATP a s eドメインもしくはその一部を除去した D n a Kタンパク質の一 部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号 479と 48 1のァ スパラギン酸をバリンに置換した（8) に記載のブロッキング効率の向上したタンパ ク質。
(16) Dn aKタンパク質の 384〜607番目のアミノ酸配列からなり、 ァミノ 酸番号 479と 481のァスパラギン酸をバリンに置換した（8) に記載のブロッキ ング効率の向上した夕ンパク質。
(1 7) 1以上の親水性ドメインと 1以上の疎水性ドメインを有するプロッキング用 タンパク質であって、疎水性ドメインが器壁に吸着可能であり、親水性ドメインが器 壁に吸着した疎水性ドメインを覆うことが可能であるブロッキング用タンパク質。
( 18 )ブロッキング速度が B S Aよりも向上していることを特徴とする改変された タンパク質。 ' -
(19) 3時間のブロッキングにおいて B S Aと同等のブロッキング効率を示すよう にタンパク質量を揃えた条件において、 10分未満のブロッキング能が BS Aよりも 優れることを特徴とする （18) に記載の改変されたタンパク質。
(20) タグ配列を有することを特徴とする （2) 〜 （19) のいずれかに記載の夕 ンパク質
(21)タグ配列がヒスチジンタグ、マルトースバインディングプロテイン（MB P) タグ、 ダルタチオン Sトランスフェラ一ゼ （GST) タグ、 F 1 a gタグ、 My cタ グ、夕ンデムァフィニティーピユリフィケーシヨンタグから選択されることを特徴と する （20) に記載のタンパク質
(22) 原核生物を用いて （2) 〜 （21) のいずれかに記載のタンパク質を生産す ることを特徵とするタンパク質の生産方法
(23) 大腸菌を用いて （2) 〜 （21) のいずれかに記載のタンパク質を生産する ことを特徴とするタンパク質の生産方法
(24) 無細胞タンパク質合成法を用いて （2) 〜 （21) のいずれかに記載のタン パク質を生産することを特徴とするタンパク質の生産方法
(25) 加熱工程を経ることを特徴とする （2) 〜 (21) のいずれかに記載のタン パク質の精製方法
(26) (2) 〜 （21) のいずれかに記載のタンパク質をブロッキング、 安定化、 賦形、 フォールデイング補助、 リフォールデイング補助、 コーティング、 医療用に使 用する方法
(27) (2) 〜 （21) のいずれかに記載のタンパク質を含有するブロッキング試 薬、 安定化剤、 賦形剤、 フォールデイング補助剤、 リフォールデイング補助剤、 コー ティング剤または医療用コーティング剤。 発明を実施するための最良の形態
でいうブロッキングとは、容器や担体などへの成分の非特異的吸着を妨げるこ とを言い、特にプラスチックなどの樹脂へのタンパク質の非特異的吸着を妨げること をいう。様々な測定において、測定対照の成分が非特異的に器壁に吸着することによ り、バックグラウンドとして測定を妨げることが問題となる。特に免疫学的測定にお いて、 抗体のポリスチレンプレートへの吸着は顕著であり、 通常、 あらかじめ樹脂等 に吸着しやすいタンパク質を添加して、抗体の非特異的吸着を妨げる操作、すなわち ブロッキングを行うことが広く行われている。免疫的測定には、 タンパク質を器壁に 物理的に吸着させることが必須であることから、ポリスチレン等の樹脂で出来たタン パク質の吸着しやすいプレートが広く使われるが、余分な成分の吸着も顕著であるた め、 より良いブロッキング剤が常に求められているのが現状である。 また、 臨床用診 断薬においても、診断薬用酵素の自動分析機のセルへの非特異吸着が問題となってい るものも多い。
本発明では主に、免疫学的測定を念頭に置き、最も非特異吸着が顕著である例とし て知られているヒト血清中の I gGのポリスチレンプレートへの非特異吸着を測定 することで、 ブロッキング効果を測定した。 すなわち、 測定は以下の工程よりなる。
(1)ポリスチレン製 96穴プレートにブロッキング能を調べたいタンパク質溶液を 加え、 一定時間静置し、 プレートをブロッキングする。
(2) (1) の液を除去し、 希釈したヒ卜血清を添加し、 インキュベートする。
( 3 )プレートを洗浄した後、標識抗ヒト I g G抗体を添加し、ィンキュベ一トする。 (4)プレートを洗浄した後、比色法により非特異的に結合した I g G量を比較する。 詳細な方法については以下で述べるが、この方法は本発明を遂行するにあたり非常に 有効であった。 本方法の概略を図 1に示す。
ブロッキング試薬としては、 従来ゥシ血清アルブミン (BSA)やゥシ乳中のカゼ インなどが広く使われて来た。 しかし、それらの高いブロッキング能がタンパク質の どの性質から来るのか、理論立てた説明は未だなされておらず、一般にはその疎水性 に起因していることが通説のようになつている。
そこで、まず疎水性の高い夕ンパク質にブロッキング能が備わつているのかを調べ る目的で疎水性アミノ酸の含量が高いことが知られている P s e udomon a s ae r ug i no s a由来のリパーゼをブロック剤として使用し、そのブロック能を 調べた。 リパーゼは臨床検査用途などにも使われているが、測定時のセル吸着などが 問題となることがあるほどプラスチック表面への吸着能が高いことが知られている。 しかし、実験の結果、 ブロッキングの効果はほとんど見られないことが明らかとなつ た。それぞれのタンパク質中の親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸の比率等を図 1 3に 示したが、比較してみると B S Aやカゼィンの疎水性はリパーゼの疎水性に較べ低い ことが分かる。 このことから考察される事項としては、 タンパク質がその疎水性で吸 着する現象と、ブロッキング能とは関連はあるが、すべてではないということである。 リパーゼのブ口ッキング能が発揮されなかった理由としては、器壁に吸着したリパー ゼにタンパク質が非特異的に吸着したことに起因していると推察される。
ここでいう親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸は教科書等によっては、様々な定義が あるが、本発明においては、親水性アミノ酸として、ァスパラギン酸、グルタミン酸、 リジン、ヒスチジン、アルギニン、チロシンとした。また、疎水性アミノ酸としては、 グリシン、 ァラニン、 バリン、 ロイシン、 イソロイシン、 メチォニン、 フエ二ルァラ ニン、 トリプ卜ファン、 プロリンと定義した。
本発明では、 親水性アミノ酸として、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 リジン、 ヒ スチジン、 アルギニン、 チロシンと定義した。 また、 疎水性アミノ酸としては、 ダリ シン、マラニン、バリン、 ロイシン、イソロイシン、メチォニン、 フエ二ルァラニン、 トリブトファン、 プロリンと定義したが、 親水性アミノ酸で H i s , T y r、 特に Τ y rは親水性が低く、 疎水性アミノ酸で G 1 y、 A 1 a、 特に G 1 yは疎水性が低い と考えられ、更に厳密に厳密性を持たせて予測するためには、 T y rと G 1 yを除外 して計算し、 更に好ましくは、 H i s、 T y r、 G l y、 A l aを除外して計算する と良い結果が得られることもある。また、後に示すブロッキング能の改変においても、 親水性、 疎水性の強弱を念頭において改変を行うことが好ましい。
そこで次に、様々な切り口からそれぞれのァミノ酸の含有率を計算したところ、 ブ ロッキング能を示す B S A (シグナルペプチドなし) とゥシ由来ひカゼイン （シダナ ルペプチドなし）のアミノ酸配列の 2分された各部分、例えば N末端側と C末端側で、 親水性アミノ酸含有率と疎水性アミノ酸含有率の傾向が異なることが明らかとなつ た （図 1 4 )。 本発明において、 親水性アミノ酸含有率を疎水性アミノ酸含有率で割 つた値を便宜上「親水/疎水率」 と定義するが、 B S Aの N末端側の親水 Z疎水率は 1 . 0 0であるのに対し、 C末端側は 0 . 8 3であり、 0 . 1 7の差があることがわ かる。 ひカゼインでは、 N末端側 0. 88、 C末端側 0. 64となりその差は 0. 2 4であった。一方、 ブロッキング能を示さない P s e u d omo n a s由来のリパー ゼにおいては、 N末端側 0. 39、 C末端側が 0. 44とその差が 0. 05であり 0. 1にも満たないことが分かった。 このことから、 ブロッキング能を示すには、 タンパ ク質分子の中の比較的疎水的な領域に加え、親水的な領域が必要であるということが 条件になっていることが推察された。
本発明のタンパク質において、親水性部分、疎水性部分及び全長の親水ノ疎水率は、 以下の範囲が好ましい。
親水性部分の親水 Z疎水率は 0. 5〜2 . 0、 より好ましくは 0. 7〜1. 7、 さ らに好ましくは 0. 8〜1. 5である。
疎水性部分の親水 Z疎水率は 0. 2〜 1. 1、 より好ましくは 0. 3〜1. 0、 さ らに好ましくは 0. 4〜0. 9である。
夕ンパク質全体の親水/疎水率は 0. 4〜2. 0、より好ましくは 0. 5〜1. 5、 さらに好ましくは 0. 6〜1. 0である。
親水性部分と疎水性部分の親水 Z疎水率の差 （絶対値） は好ましくは 0. 1〜0. 6、 より好ましくは 0. 1 5〜0. 5、 さらに好ましくは 0. 1 5〜0. 4である。 親水性部分と疎水性部分は、 いずれが 2分された各部分、 例えば C末端側（或いは N末端側） であってもよい。
また、 本発明は、 親水性部分と疎水性部分が 2分された各部分、 例えば C末端側或 いは N末端側に存在すると仮定しているが、 N末端側又は C末端側に親水性でも疎水 性でもない配列を追加したものも、親水性部分と疎水性部分が存在する限り、本発明 に含まれる。
さらに本発明は、 図 2に示すように親水性部分一疎水性部分一親水性部分や、疎水 性部分一親水性部分一疎水性部分、さらには親水性部分一疎水性部分一親水性部分一 疎水性部分のような順序で各部分を有するものも本発明に含まれる。
上のことを踏まえると、 疎水部分 （疎水ドメイン） が器壁に吸着し、 親水部分 （親 水ドメイン）がその上にかぶさるような形態をとり、全体でみると親水部分で器壁を 覆うようにして、プロッキングしていることが推察される。そのモデルを図 3に示す。 リパ一ゼがブロッキング能を示さなかつたのは、吸着されるが、 吸着されたタンパク 質が疎水的でありすぎたため、そのタンパク質への更なる非特異的吸着が起きたこと が予想される。
器壁に吸着する疎水性部分と、疎水性部分を覆う親水性部分の比率は、疎水性部分
1に対し親水性部分 0 . 3〜1 0、 好ましくは 0 . 5〜5、 さらに好ましくは 0 . 7 〜 2である。 疎水性部分が大きすぎると親水性部分により覆うことができなくなり、 器壁に吸着された疎水性部分に、さらに他のタンパク質が吸着することになる。また、 親水性部分が大きすぎると、疎水性部分が器壁に吸着する面積が小さくなりすぎ、十 分強固に吸着できなくなったり、 ブロッキングの効率が低下したりする。
なお、 本発明において、 「2分する」 とは、 全配列を約 5 0 %ずつ分けることを意味 するのではなく、 疎水性部分と親水性部分の 2つに分けるというだけの意味である。 親水性部分と疎水性部分の一方又は両方が複数存在する場合、複数存在する親水性部 分 疎水性部分の親水/疎水率は、 平均値として計算される。 また、 親水性部分、 疎 水性部分は、各々ひとかたまりの部分、好ましくはドメイン構造を有するものであり、 各部分は、 全体配列の 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは 4 0 %以 上である。 ただ、 タンパク質の構造が分かっていなかったり、 予測困難な場合には、 アミノ酸配列を N末端側と C末端側に大きく 2分して解析するが好ましく、効果的で ある。
図 1 4を見る限りでは、親水 Z疎水率の親水ドメインと疎水ドメィン間の差は夕ン パク質間では若千ばらつきがあり、その値の大きさのみがブロッキング能力を詳細ま で反映していない可能性もあると思われる。そのファクターの一つは分子量であると 思われる。 本発明において、 「1 0 0残基より多くのアミノ酸よりなる」 とは、 アミ ノ酸配列全体のアミノ酸合計数が 1 0 0残基以上であることを意味し、好ましくは 1 5 0残基より多くのアミノ酸よりなり、より好ましくは 2 0 0残基より多くのァミノ 酸よりなる。 また、 上限は 2 0 0 0アミノ酸残基であることが好ましく、 より好まし い上限は 1 5 0 0アミノ酸残基、さらに好ましい上限は 1 0 0 0アミノ酸残基である。 親水性の部分またはドメインのアミノ酸数は、好ましくは 3 0アミノ酸残基以上、 よ り好ましくは 5 0アミノ酸残基以上、 さらに好ましくは 6 0アミノ酸残基以上、特に 好ましくは 8 0アミノ酸残基以上であり、 また、好ましくは 1 0 0 0アミノ酸残基以 下、 より好ましくは 5 0 0アミノ酸残基以下である。 疎水性の部分またはドメインのアミノ酸数は、 好ましくは 30アミノ酸残基以上、 より好ましくは 50アミノ酸残基以上、 さらに好ましくは 60アミノ酸残基以上、特 に好ましくは 80アミノ酸残基以上であり、 また、好ましくは 1000アミノ酸残基 以下、 より好ましくは 500アミノ酸残基以下である。
ここでいうドメインとは、分子の構造上あるいは機能上一つのまとまりをもつ領域 のことをいうわけであるが、本発明においては主に、構造上のまとまりのある単位の ことをいう。
次に我々は、 この仮定が正しいか否力 単純なタンパク質を用いて証明することと した。この実験には、大腸菌のヒートショックタンパク質の一種である HS P 70 (D n aK) の基質結合ドメインを用いた。 このタンパク質 （Dn aK384— 607) は、 既に NMR解析で構造が明らかとなっており （図 4)、 2つの構造的な領域 （ド メイン）、 すなわち N末端側の ;3シート領域 （ドメイン） と C末端側のひへリックス 領域 （ドメイン） からなつていることが分かっている。 また、 配列の N末端側の親水 /疎水率が 0. 5であり、 C末端側では 0. 89で、 その差は 0. 39と高い値を示 すことが計算によって明らかにされた。
そこでまず、 このタンパク質（Dn aK384— 607) がブロッキング能を示す かを確認したところ、 B S A程ではないがプロッキング能があることが確認され（図 5)、 本発明の方法の有効性が示された。
そこで次に、 Dn aK384-607の種々のデリ一ションミュータントを作製し、 Dn a Kのどの構造がブロッキングに対して重要な役割を果たしているかを調べた。 今回検討した変異体を図 6に示した。検討したタンパク質は、 Dn aK 384-6 38, Dn aK 384-607, Dn aK 384-578, Dn aK 384- 561、 Dn aK 508— 607、 Dn aK 525— 607の 5種類である。 こ れらのタンパク質は大腸菌を宿主として大量発現が可能であり、それぞれのタンパク 質の N末端側にヒスチジン夕グを付加して発現させ、ニッケルキレートカラムを用い て簡便に精製し、実験に用いることができる。今回の実験はヒスチジンタグを付加し たタンパク質を用いて検討を行っているが、 タグが小さいためその影響は無視した。 当然、タグ配列がない場合にも同等の効果が得られることは確認してある（実施例 7)。 実験の結果、 αヘリックス構造の一部を削った Dn aK 384— 578、 Dn a K 384- 561と jSシート部分を除去しひヘリックス構造のみからなると思わ れる Dn aK 508-607, Dn aK 525— 607のブロッキング効率は有 意に低下することが分かった （図 5)。 Dn aK 384— 561に関しては、 既に それに近い Dn aK381— 553の NMRによる立体構造が明らかとなっており (図 7)、 それから類推すると、 ヘリックス構造が壊れていることが予想される。 これらのことから以下のことが示唆される。 すなわち、 （1) ブロッキング能を有す るタンパク質の親水性部分の縮小や構造破壊によってブロッキング能は損なわれる。 (2) 親水性部分だけではブロッキング能を示さない。 これは、 ブロッキング能を発 揮するには、疎水性部分に加えて親水性部分が重要であり、 ブロッキング能を示す夕 ンパク質は図 3に示すように疎水部分でプレートに吸着し、親水性部分でプレート表 面を覆う結果プロッキング効果を発揮していると考えることができるからであると 思われる。 Dn aKにおいては正に図 3の左図のようになっているものと予想される。 一般的に、変性やミューテーシヨンなどにより 2次構造が崩壊することで、 タンパ ク質の親水性が失われることが知られており、上の D n a Kの例からも親水ドメイン を破壊するようにして、部分配列タンパク質を調製することは適切でないことが予想 される。それとは逆に図 8のように疎水ドメインを破壌することにより、疎水性を向 上させることは可能であると思われる。
また、 本発明において、 ドメインが重要であり、 少なくとも 1つより多くのドメイ ン構造が必要であると思われる。そこで、一つの構造ドメインを構成するのに必要と される 100アミノ酸が目安となる。よって、本発明は少なくとも 100残基より多 くのアミノ酸からなる、すなわち一つより多くのドメイン構造を有することが望まし いといえる。
そのような事実を踏まえ、本発明は、 アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有 する新規ブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質をスクリーニングす る方法を提供する。詳しくは、以下に示す条件を満たすタンパク質もしくは部分配列 タンパク質をスクリーニングする方法'である。
Α. タンパク質のアミノ酸配列を 2分し、それぞれの親水性アミノ酸（D, Ε, Κ, Η, R, Υ) と疎水性アミノ酸 (G, A, V, L, I , Μ, F, W, Ρ) の含有率か ら以下の式を用いて算出された 2分された各部分での親水 Ζ疎水率の差の絶対値が 0 . 1以上である
- (親水 Z疎水率） = (親水性アミノ酸含有率） / (疎水性アミノ酸含有率）
B . 親水性部分 （親水/疎水率の高い方の値） が 0 . 5以上
C . 1 0 0残基より多くのアミノ酸よりなる
上記条件中、 Dはァスパラギン酸、 Eはグルタミン酸、 Kはリジン、 Hはヒスチジ ン、 Rはアルギニン、 Yはチロシン、 Gはグリシン、 Aはァラニン、 Vはバリン、 L はロイシン、 Iはイソロイシン、 Mはメチォニン、 Fはフエ二ルァラニン、 Wはトリ ブトファン、 Pはプロリンを示す。 教科書等によっては、 親水性ァミノ酸、 疎水性ァ ミノ酸には様々な定義があるが、 本発明においては、 親水性アミノ酸として、 ァスパ ラギン酸、 グルタミン酸、 リジン、 ヒスチジン、アルギニン、チロシンとした。また、 疎水性アミノ酸としては、 グリシン、 マラニン、 バリン、 ロイシン、 イソロイシン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 トリブトファン、 プロリンとした。 本発明でいう部分配列タンパク質とほ、野生型タンパク質の一部分のアミノ酸配列 からなるタンパク質を示し、好ましくは一つより多くのドメイン構造を有するタンパ ク質である。
アミノ酸配列を例えば N末端側と C末端側に 2分する場合、必ずしも正確に 2分す る必要はないがなるベく双方のアミノ酸の数がほぼ均等になるように分割する方が 好ましい。 また、 アミノ酸配列からシグナルペプチドが予想される場合は、 その部分 は除いて計算すると良い。 実際、 本発明においても、 B S A、 αカゼイン、 リパ一ゼ ともにシグナルぺプチドを除去した成熟型のアミノ酸配列を用いて計算を行つた。 また、 図 2に示したような Ν末端側、 C末端側へ二分する以外の分割方法も好まし く用いられる。 このような場合、立体構造が明らかになつているタンパク質や立体構 造が予測される夕ンパク質の方が好ましく応用されうる。
ァミノ酸一次配列から、各種ァミノ酸含量を算出するには遺伝子 ·ァミノ酸配列解 析ソフトを用いることが効果的である。解析ソフトとしては特に限定されないが、本 発明においては、 G E N E T Y X (ソフトウェア開発株式会社） を用いて行った。 また、 ソフトウェアの疎水性計算機能を用いてタンパク質の疎水性、親水性をダラ フ化することも、スクリーニング作業を効率的に進めるためには効果的である。好ま しくは、 h o p p&wo,o d sの計算式が用いられる。
また本発明は、上記方法によりァミノ酸配列からスクリーニングされたブロッキン グ能を有するタンパク質または部分配列タンパク質であって、以下の Dの解析工程に より、 Eの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク質である。
D 1.ポリスチレン製ィムノ夕イタ一プレートのそれぞれのゥエルに請求項 1の条 件を満たす候補タンパク質（50〜： L 0 Omg/m 1 ： 2 OmM T r i s _HC 1 (pH7. 0) に希釈） および同様に調製したゥシ血清アルブミン （F r a c t i o n V) を添加し、 2°C〜10°Cで 4〜5時間ブロッキングし、 液を廃棄する工程
2. PBS (一） で 25〜 50倍希釈した正常ヒト血清を添加し、 37°Cにて 1時 間放置した後に、 プレートを 0. 05%Twe e n 20/ PBS (—） にて洗浄す る工程
3.酵素標識した抗ヒト I gG抗体を用いて非特異的にプレートに吸着した I gG 量を発色法を用いた比色法にて比較する工程
E. 候補タンパク質での発色がゥシ血清アルブミンの発色の 2. 5倍以下、 好まし くは 2倍以下、 より好ましくは 1. 5倍以下、 さらに好ましくは 1. 2倍以下、 特に 1倍以下である。
ここでは、プラスチックプレートへの非特異吸着が顕著であることが知られている、 ヒト血清中の I gGの非特異的吸着を目安として、 ブロッキング能を測定する。 ここ でいうボリスチレンィムノタイタープレート (96ウェルタイブ） とは一般的に免疫 測定で使用されるポリスチレン製の 96ウェルタイブのィムノタイタ一プレートを 使用する。候補タンパク質は適切な方法で精製したものを用レ 最終的に 2 OmMT r i s _HC l (pH7. 0)で 50〜： L O 0mg/m 1となるように希釈しておく。 同時にゥシ血清アルブミン （BSA) も同様に調製しておく。 BSAは S I GMA社 等から市販されている F r a c t i o nVを用いることができる。また同じ性能であ るのであれば、特に F r a c t i o n Vでなくても良い。ブロッキングは 2〜 8 °C で 4〜5時間行った後、 液を完全に除去し、 洗浄なしで次のステツプへ進む。
ここで使用されるヒト血清は正常成人から分離した血清であれば特に限定されず、 原液は高濃度であるので PBS (—） で 25〜50倍に希釈して使用するのが良レ^ 血清中の I gGの量は個体差があるので、希釈率を多少変更してもかまわない。 プレ 一卜への非特異吸着は 37 ：、 30分間行う。 また、 この時添加する血清の量は正確 に測定するために、最初にブロッキングした液量よりも少ない量にすることが好まし レ^例えば、 ブロッキングを 100 /21で行った場合は、 50 1の希釈血清溶液を 添加する。 最後に、 正確に 1時間反応を行った後、 液を除き、 十分量の 0. 05%T we e η 20/ Ρ Β S (—） にて洗浄を行う。 洗浄は、 3回以上が好ましく、 更に 好ましくは 4回行う。 洗浄は、 専用のプレート洗浄機を用いても良い。
次に、酵素標識した抗ヒト I gG抗体を適切な溶液で適切な濃度にまで希釈し、上 記ゥエルに添加する。 反応時間は 37°C、 1時間が適切である。 抗体の希釈は、 通常 免疫学的検出に用いる程度が好ましく、 また、抗体の希釈には適切なブロッキング剤 (BSAやカゼイン） が含有されていた方がばらつきが無く良く、 更に好ましくは、 0. 01M リン酸バッファ一 （pH 7. 4)、 0. 15M NaC 0. 5 % 力 ゼインを用いると良い。標識に用いる酵素としては、ペルォキシダ一ゼとアルカリホ スファ夕ーゼが好ましく用いられ、特にペルォキシダーゼが好ましく用いられる。ぺ ルォキシダーゼ用の発色試薬としては、 テトラメチルベンジジン （TMBZ ： 3， 3 ' , 5, 5 '— T e t r ame t h y 1 b e n z i d i n e) が好ましく用いられ る。 また、 アルカリホスファタ一ゼの発色基質としては、 WT— 1を用いることが出 来る。発色時間は、目的となるゥエルの吸光度が定量性を失わない程度（0. 5〜1. 5) に来るようにするのが望ましい。 定量域を越えた場合は、 正しい値は得られない ので、 注意する。 また、 全操作を通じてなるべくプレートを乾燥させないようにしな ければ正確な値は得られない。
このようにして得られた値は、低いほどブロッキング効率が高いことを示しており、 本発明においては、 BSAの値の 2. 5倍以下の値を示した場合、 ブロッキング能を 有したと判定した。よって、本発明のブロッキング能を有する新規なブロッキング用 タンパク質または部分配列タンパク質は請求項 1に示した条件を満たし、かつ、本ァ ッセィで BSAの値の 2. 5倍以下の値を示す、すなわちブロッキング能を有する夕 ンパク質である。
また、 このアツセィの代替法として、実施例 7に示したような方法を用いることも 可能である。すなわち、候補タンパク質溶液に段階希釈したペルォキシダーゼを溶解 した後、 固相へ供し、 一定時間吸着させ、 ペルォキシダーゼの非特異的吸着を測定す る。 吸着したペルォキシダーゼの確認法は、 上記の方法と同様、 テトラメチルベンジ ジン （TMBZ : 3, 3 ' , 5, 5 ' -Te t r ame t hy l b e n z i d i n e) の発色法が好ましく用いられる。 本アツセィにおいても、 BSAの値の 2. 5倍 以下の値を示すことがブロッキング能を示す指標となる。 また、 同様に、 あらかじめ ブロッキングした固相に、希釈ペルォキシダーゼ溶液を添加して、その非特異吸着を 測定しても良い。その場合も、 BSAの値の 2. 5倍以下の値を示すことがブロッキ ング能を示す指標となる。 ここで用いるペルォキシダーゼ溶液の濃度は、 0. 05m g/m lが好ましく用いられるが、常識的な範囲で測定できるように、調整して使用 するとより正確な評価に繋がる。 ペルォキシダーゼの希釈は、 PBS (—） で行うこ とが好ましいが、 特に限定されない。
このことから、本発明は一つより多くのドメイン構造を有することが好ましいとい えるが、この例のように特に疎水側ドメインについては二つのドメインのうち一つの ドメイン構造の一部を欠いても良い。本発明のタンパク質又は部分配列タンパク質の アミノ酸の数としては 100以上、 好ましくは 1 50以上、 さらに好ましくは、 18 0以上が好ましい。
さらに、本発明は、上記請求項 1の条件に合うタンパク質のアミノ酸配列を改変す ることにより、タンパク質もしくはその部分配列タンパク質のブロッキング効率を更 に向上させた新規なタンパク質である。 ここでいう新規とは、 アミノ酸改変のレベル で新規ということであり、 既に知られているタンパク質であっても良い。 また、 部分 配列の場合、 今まで知られていない部分配列を有するものも新規とみなされる。 本発明において、 アミノ酸配列の改変は、 アミノ酸置換、 除去 （デリ一シヨン）、 挿入 （インサーシヨン） のいずれか、 もしくは、 重複して行っても良い。 変異の方向 性としては、疎水領域の疎水性をさらに向上させるような変異や親水性領域の親水性 をさらに向上させるような変異が効果的であり、 好適に使用される。 また、 タンパク 質の立体構造を変化させるために、 アミノ酸配列の除去や挿入なども効果的であり、 親水的な領域に埋もれた疎水領域をタンパク質表面に露出されることなどの方法が 考えられる。一方、 上記の例で示したように、 親水ドメインの構造を壊す方のアミノ 酸改変は好ましくないと言える。
改変されるタンパク質は原核生物もしくは真核生物由来のものでも良く、大腸菌な どを用いて大量調製することを考えると、原核生物由来のタンパク質が好ましく用い られる。更に好ましくは、 大腸菌由来のタンパク質が用いられる。用いられるタンパ ク質はドメインなどの一部分の構造体でも良く、 むしろ好適に使用される。
特に、ブロッキング剤は時に酵素等と混合して安定化剤ゃ賦形剤として用いられる ことが多く、酵素活性の特別な機能を有さないタンパク質が本発明には適していると いえる。 また、酵素活性を有するドメインを除去したタンパク質なども好ましく用い られる。
本発明では、 H S P 7 0ファミリータンパク質由来のタンパク質が好ましく用いら れ、更に好ましくは大腸菌の D n a Kタンパク質由来のタンパク質が用いられる。 ま た、好ましくは、 AT P a s eドメインを除去した H S P 7 0ファミリータンパク質 の基質結合ドメインが好ましく用いられ、更に好ましくは大腸菌の AT P a s eドメ インを除去した D n a Kタンパク質の基質結合ドメインが用いられる。 D n a Kタン パク質の基質結合ドメインに関しては、 既に実施例として上で紹介したものである。 本発明に用いる H S P 7 0ファミリーに属するタンパク質としては、特に指定はな いが、 大腸菌の D n a K、 酵母細胞質に存在する S s a 1 p、 酵母ミトコンドリア に存在する S s c 1 p、酵母小胞体に存在する K a r 2 p、哺乳類細胞質に存在す る H S P 7 0 , 哺乳類小胞体に存在する B i p、哺乳類ミトコンドリアに存在する mH s p 7 0 および熱ショックの有無に関わらず恒常的に発現している H S P 7 0のホモログである H S C 7 0などから選択される。 H S P 7 0ファミリーには数多 くのホモログが知られており、 上に挙げたものはそのうちの一部である。 当然、 上に 列挙した以外のホモログにも同様の効果が期待できることは容易に予想可能である。 特に、大腸菌の D n a Kは良く研究が進んでいることから、 アミノ酸改変などの効 果予測が比較的容易であるといえる。このタンパク質は 6 3 8アミノ酸から構成され、 1〜3 8 5番目のアミノ酸より構成される 「AT P a s e (AT P結合） ドメイン」 と 3 8 6〜6 3 8番目のアミノ酸より構成される 「基質結合ドメイン」からなつてい る （図 6 )。 配列番号 1に D n a Kのタンパク質の配列を、 また配列番号 2に遺伝子 配列を示す。 H S P 7 0は新生ポリぺプチドや部分的にフォールドした夕ンパク質に 結合し、自発的にフォールディング出来ないタンパク質のリフォールディングを助け ることが知られており、 また、 タンパク質合成の比較的初期に働くためより豊富な基 質を認識することが知られている。
また、 Dn aKの基質結合ドメイン自体に、変性したタンパク質のリフォ一ルディ ングを促す作用があることも知られており （P r o c. Na t l . Ac ad. S c i . USA (2002) 99, 1 5398— 1 5403)、 この分子を 用いることにより、 様々な用途展開が可能になると考えられる。
今回の本発明を達成するにあたり、我々はこの Dn a Kの基質結合ドメインに着目 し、様々な検討によって、 ブロッキング作用発現のメカニズムに関する様々な知見を 得ることが出来、 本発明に至ることが出来た。
まず我々は、 βシート構造部分に変異を加えることで βシート部分の疎水性を向上 ' させ、 ブロッキング効率に優れたタンパク質を作り出す試みを行った。 その試みは (1) |3シートの Ν末端の一部を除去することで、 j3シートのより疎水的な部分を露 出させる （/3シート構造を破壊して疎水性を向上させる）、 (2) シート上の親水性 アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する、 というものである。 その結果、 j8シート構造 の N末端部分を除去した D n aK 419— 607と、 /3シート上の親水性アミノ酸 を疎水性アミノ酸に置換した Dn aK 384— 607 (D479 V, D 481 V) にブロッキング効率の顕著な向上を認めることができた （図 9)。 今回特に、 Dn a K 419 - 607に顕著なブロッキング効率の向上を認めることが出来た。この夕 ンパク質は、図 8で示したような形でブロッキングを示していると思われる。すなわ ち、 疎水性ドメインの構造が変化したことで、 疎水性ドメインの構造が変化し、 疎水 性ドメインの疎水性が向上したことが、ブロッキング能の向上につながつたと考えら れる。
本発明でいう、 ブロッキング能の向上とは、 候補タンパク質にアミノ酸置換、 デリ ーシヨン、挿入などを行い、 もととなったタンパク質またはタンパク質部分配列より もブロッキング能が向上したことを示す。
このブロッキング能の向上は、好ましくは請求項 2に示した方法で測定されるのが 好ましい。 また、 ブロッキング能の向上には、 長時間のブロッキング能と短時間での プロッキング能があるが、どちらかもしくは両方においてプロッキング能が向上して いれば良い。
Dn aK 419 - 607での効果が顕著であった理由を更に詳しく考察すると、 Dn a K基質結合ドメインのコの字型の構造のヒンジ部分に隣接する βシート部分 を除去したことによりシャペロンの基質としてのぺプチドをトラップするための疎 水性に富んだコの字構造の内側の一部分が外側へ露出したことに起因していること が推察される。
すなわち、本発明は少なくとも Ν末端から 387番目まで、多くとも 472番目ま でのアミノ酸配列を除去したことを特徴とするプロッキング効率の向上した D n a Kタンパク質である。 また、 本発明は少なくとも Ν末端から 387番目まで、 多くと も 418番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とするブロッキング効率の 向上した Dn a Κタンパク質である。 さらに好ましくは、 Dn aKタンパク質の 41 9〜607番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質である。
また、本発明は、 ATP a s eドメインもしくはその一部を除去した D n aKタン パク質の一部の親水性ァミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したことを特徴とするプロ ッキング効率の向上したタンパク質である。更に詳しくは、 ATP a s eドメインも しくはその一部を除去した Dn a Kタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去した夕 ンパク質であって、アミノ酸番号 479と 481のァスパラギン酸をバリンに置換し たブロッキング効率の向上したタンパク質である。 また更に好ましくは、 Dn aK夕 ンパク質の 384〜607番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号 479と 48 1のァスパラギン酸をバリンに置換した夕ンパク質が使用される。
本発明でいう改変されたとは、 候補タンパク質のアミノ酸置換、 デリーシヨン、 挿 入などにより、 アミノ酸配列が改変されたことを指す。 この改変は、候補タンパク質 もしくは夕ンパク質の部分配列を選び出した後、上に示したような考察により、 （ 1 ) 親水ドメインを破壊しないようにする、 （2) 疎水ドメインを更に疎水性にする、 な どを意図してアミノ酸を改変することが好ましい。また、本発明では示さなかったが、 親水性ドメインを更に親水性にするような方策を当然考えるべきである。
また、本発明においてはブロッキングの速度に関する検討も実施し、本発明の有用 性を示した。 すなわち、 5分、 10分、 30分、 3時間ブロッキングした時の、 プロ ッキング効率を測定した。その結果、今回効果が最も顕著であった Dn aK419一 607は、約 5分間のブロッキングで Dn aK384— 638が 58. 8%のブロッ キング効率であるのに対し、 87. 5%の効率でブロッキングが行われていることが 判明した。 この速度は、 3時間後で同等の効果を示す B S Aと比べても速く、 非常に 早い段階でポリスチレンプレートに吸着してブロッキング効果を発揮すると予想さ れる。 よって、 本発明を用いることで、 従来の B SAと同等もしくはそれ以上の性能 を有する、 新規なブロッキング剤を開発できる可能性が考えられる。
また本発明は、 1以上の親水性ドメインと 1以上の疎水性ドメインを有するプロッ キング用タンパク質であって、疎水性ドメインが器壁に吸着可能であり、親水性ドメ ィンが器壁に吸着した疎水性ドメインを覆うことが可能であるプロッキング用タン パク質である。ここでいうドメインとは好ましくは 5 0アミノ酸以上からなる構造的 なアミノ酸のまとまりであり、一部を欠損、付加などされたものについてもドメイン とみなす。
また、 本発明は、 ブロッキング速度についても規定する。 すなわち、 ブロッキング 速度が B S Aよりも向上していることを特徴とする改変されたタンパク質である。ま た詳しくは、 3時間のブロッキングにおいて B S Aと同等のブロッキング効率を示す ようにタンパク質量を揃えた条件において、 1 0分未満のブロッキング能が B S Aよ りも優れることを特徴とする改変されたタンパク質である。 ここで改変されたとは、 野生型のタンパク質をコードする遺伝子配列が、 アミノ酸置換、 デリーシヨン、 挿入 などによって変換されたということを示している。評価方法としては、特に限定され ないが、実施例 5および実施例 7に示した方法が好ましく用いられ、 I g Gやペルォ キシダーゼのポリスチレンプレートへの非特異的な吸着を指標に測定される。 I gG を用いる評価方法としては、 1〜1 0分間、好ましくは 2〜1 0分間ブロッキングを 行った後、 PBS (—） で希釈したヒト血清を添加し、 3 7°C ' 6 0分間インキュべ 一卜した後、 洗浄を行い、 至適濃度の抗ヒト I gG抗体 （ペルォキシダーゼ結合） を 反応させ、洗浄後、 TMB Zの発色により非特異吸着した I g G量を測定する。また、 ペルォキシダーゼを用いる評価法としては、まず西洋ヮサビ由来の標識用ペルォキシ ダーゼ（東洋紡績㈱製 PEO_ 1 3 1) をブロッキング能を測定したいタンパク質溶 液に 2mg/m lになるよう溶解する。次いで、 同溶液によりペルォキシダーゼ溶解 液の 40〜 3 20倍まで希釈系列を作成し、それぞれの希釈液 1 0 0 1をポリスチ レン製 9 6穴マイクロプレートに分注する。室温で 1時間放置した後に溶液を除去し、 0. 0 2% Twe e n 2 0を含む P B S緩衝液で洗浄する。 この洗浄操作を 6回繰 り返した後、 良く洗浄液を取り除く。 テトラメチルベンチジンを添加し、 37°Cで正 確に 10分間インキュべ ^卜した後、 1Nの硫酸を添加し反応停止並びに発色させる。 この発色はマイクロプレートリーダ一にて主波長 450 nm、副波長 650 nmにて 測定する。 詳しくは、 実施例 7に記載する。 また、 同様に、 あらかじめブロッキング した固相に、希釈ペルォキシダーゼ溶液を添加して、その非特異吸着を測定しても良 レ^ ここで用いるペルォキシダーゼ溶液の濃度は、 0. 05mgZm 1が好ましく用 いられるが、常識的な範囲で測定できるように、調整して使用するとより正確な評価 に繋がる。 ペルォキシダーゼの希釈は、 PBS (—） で行うことが好ましいが、 特に 限定されない。
また、 この実施例においては、 0. 7mgZm 1の Dn aK419— 607と 3時間 後に同等のブロッキング能を示す B S Aとして 2. 4mg/m 1の B S A (F r a c t i o n V；シグマ社製 （C o d e : A— 4503 )) を用いた （タンパク質量 はブラッドフォード法にて測定）。 検体タンパク質の量はブロッキング能を測定する 常識的な範囲で用いられればそれで良いが、好ましくは 0. 5〜lmgの範囲で用い られることが好ましい。 また、 本測定に用いる B S Aの濃度は、検体タンパク質の 3 時間目のブロッキング効率と同等のブロッキング効率を示す量を用いるが、これはあ らかじめ濃度の検討が必要である。それらのタンパク質を溶解するバッファーとして は、 2 OmM T r i s— HC 1 (pH7. 0) や PBS (―) が好ましく用いられ るが、 特に限定されない。
本発明に用いるタンパク質もしくはタンパク質フラグメントはタグを有していて も良く、実際、検討にはァミノ末端にヒスチジンタグを付加したものを用いて検討を 行った。 タグとしては、 ヒスチジンタグ、 GST (ダルタチオン一 S—トランスフエ ラーゼ)タグ、 MB P (マル] スバインディングプロティン)タグ、 F 1 a gタグ、 My cタグ、 TAP (タンデムァフィ二ティーピユリフィケーション) タグなど、 ど のタグを採用しても良く、 必要に応じて任意のタンパク質を融合して用いても良い。 また、 既知のタグに任意のアミノ酸配列などを付加しても良い。
さらに当然ではあるが、一般的に知られていないタグや、任意のアミノ酸配列を付 加しても良い。具体的には、 N末端側を削ったタンパク質の部分配列を用いるときは、 当然、 N末端にメチォニン残基を導入する必要がある。 また、 発現向上や制限酵素サ ィ卜の関係から数アミノ酸の付加なども考えられる。.例えば実施例 7の Dn aK41 9— 607 Nの N末端には、 MRGSの 4アミノ酸が付加されている。 また、 当然任 意のタンパク質との融合タンパク質として発現させても良い。付加する位置は、 N末 端側、 C末端側を問わない。
本タンパク質の発現方法は特に限定されないが、原核生物を用いて発現させる方法 が好ましく、 さらには、 大腸菌を用いて発現させる方法がさらに好ましい。 また、 発 現ベクターに関しても特に限定されず、一般的に発現に使用されるものであればよい。 本発明のタンパク質の精製方法は、上記タグを用いた精製方法以外に、粗精製溶液 を適当な温度で加熱して、その遠心上清を精製すると効率よく精製できる場合がある。 加熱は好ましくは 50°C以上、更に好ましくは 70°C以上で行われる。今回用いた D n a Kの基質結合ドメインも熱への耐性があり、 70°C、 30分間という条件では、 凝集が認められず、 遠心上清画分にタンパク質が残ることを確認している。 よって、 精製する場合は、 この加熱遠心上清を、 カラムクロマトすることなどにより、 簡単に タンパク質の精製をすることが出来、 非常に経済的である。 また、 加熱工程を経るこ とにより、 共存している酵素類を失活させる効果も期待できる。
本発明のブロッキング効率の向上したタンパク質は、 ブロッキング剤、 賦形剤、 安 定化剤、 リフォールデイング補助剤、 コーティング剤、 医療用コーティング剤などへ 応用可能である。特に、免疫反応を利用した検出システムでのブロッキング剤として の期待が大きく、 EL I SA、 免疫組織染色、 ウェスタンブロッテイングなどへの使 用が可能であると予想される。 実際、 今回の発明を完成させるにあたり、 EL I S A (En z yme— L i nke d I mm uno s o r b e n t As s ay)への] ¾、 用の可能性を調べたところ、 実際に良好な結果を得ている （図 12)。
本発明の一実施形態は、 .Dn aK419-607を含有するプロッキング剤、賦形 剤、 安定化剤、 リフォールデイング補助剤である。
本発明の一実施形態は、 Dn aK384— 607 (D479V、 D 481 V) を含 有するブロッキング剤、 賦形剤、 安定化剤、 リフォールデイング補助剤である。 以下に、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確な ものとする。 実施例 1 候補タンパク質のスクリーニング
ァミノ酸配列からの候補タンパク質のスクリーニングには、主に核酸 ·ァミノ酸配列 解析ソフト： GENETYX (ソフトウェア開発株式会社） を用いて行った。 このソ フトウェアはタンパク質のアミノ酸一次配列から親水性アミノ酸残基および疎水性 アミノ酸残基の数を算出する機能を有しており便利であった。様々なブロッキング能 を示すことの判明しているタンパク質、および大腸菌由来のタンパク質もしくは部分 配列の N末端側半分と C末端側半分の配列に含有される親水性ァミノ酸と疎水性ァ ミノ酸の数を GENETYXにて算出し、親水性アミノ酸含有率、疎水性アミノ酸含 有率、親水 Z疎水率および、二分したそれぞれの親水/疎水率の差の絶対値等をまと めたのが図 13および図 14である。 ここでは、 GENETYXの定義に従い、 親水 性アミノ酸として、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 リジン、 ヒスチジン、 アルギニ ン、チロシンとした。また、疎水性アミノ酸としては、 グリシン、ァラニン、バリン、 ロイシン、 イソロイシン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 トリプトファン、 プロリ ンとした。 実施例 2 Dn aKフラグメントのクロ一ニング、 発現
Dn aKフラグメントは大腸菌 K— 12株より抽出したゲノム D N Aを鍀型として、 PCR法を用いて目的遺伝子断片を増幅し、 クローニングした。遺伝子の .PC R増幅 には東洋紡製の KOD— P 1 u s一を用いた。具体的に Dn aK 384— 638の 増幅には、 50 1の反応液中、 反応用バッファー、 ImM MgS04、 配列番号 3および 4に示すプライマ一を 15 pmo 1 e、ポリメ一ラーゼ 1 un i tおよび大 腸菌 DNA 100 n gとなるように調製し、 94°C- 2分間の後、 94°C.15秒、 55で · 30秒、 68°C- 1分のサイクルを 25回行った。また同様に、 Dn aK 3 86-586の増幅には配列番号 3および 4に示したプライマーを用いて増幅を行 つた。増幅した DNA断片は制限酵素 B amH Iにて消化し、 pQE 30の B amH I— Sma Iサイトへクローニングした（KOD— P 1 u s一によつて増幅された D NA断片は平滑化されているため、増幅断片の下流側についてはそのまま使用した）。 クローニングした遺伝子の配列はシーケンス解析により確認した。このべクタ一にク ローニングすることにより目的タンパク質の N末端に 6 XH i s配列（ヒスチジン夕 グ） を付加することができる。 このようにして、 発現プラスミド pQE— Dn aK3 84— 638を作製した。
タンパク質の発現'精製は、遺伝子を導入した JM109を LB培地にて 16時間 振とう培養し、 菌体を遠心分離法により回収し、 20 mM Tr i s— HC l (pH 7. 0) へ懸濁、 超音波破砕を行った後、 15, 000 r. p. m. にて 10分間 微量高速遠心機を用いて遠心して得られた上清を用いて行った。具体的には、 HI S -S e l e c t HC N i c ke l Af f i n i t y Ge l (S I GMA社 製） を用いて、 精製し、 最終的に 2 OmM Tr i s -HC 1 (pH7. 0) に対 して一晩透析し、 実験に用いた。 タンパク質濃度の測定は、 BSAをスタンダードと したブラッドフォード法を用いて行った（B I ORAD社、 B i o— R a d P r o t e i n As s ayキット； 500— 0006)。 実施例 3 C末端除去 Dn aKクローンおよびポイントミュータントの作製 C末端除去 Dn aKクローンの作製は、実施例 1で作製した pQE— Dn aK384 - 638を铸型として用い Qu i c k C h a n g e法を用いて任意の場所にストツ プコドンを導入することにより作製した。実際には Qu i c kCh ange s i t e d i r e c t i ve mu t age n e s i s k i t i,s t r a t ag e n e社製） を用い、 その取り扱い説明書に従って実施した。 それぞれの作製クローンと それに使用したプライマー配列の組み合わせを以下に示す。 Dn aK 384-60 7 ：配列番号 5と 6、 Dn aK384— 578 ：配列番号 7と 8、 Dn aK384— 561 ：配列番号 9と 10。 また、 Dn aK 384— 607 (D 479 V， D4 81V)は pQE— Dn aK384- 607を铸型として用い、配列番号 11と 12 を用いて変異導入を実施した。それぞれ作製した変異体はシーケンス解析により配列 を確認した後、 実施例 1に記載の方法に従って、 タンパク質を調製した。 実施例 4 N末端除去 Dn a Kクローンの作製
実施例 2で作成した、 pQE-Dn aK 384-607を铸型として次に示すプライ マーを用いて PC R増幅を行い、実施例 1に方法に従って、 pQE 30ベクターの B amH I— Sma Iサイ卜に導入した。作製したクローンと用いたプライマーのセッ トは以下のとおりである。 Dn aK 508 - 607 ：配列番号 13と 2、 Dn aK 525 - 607：配列番号 14と 2、 Dn aK 41 9 - 607：配列番号 1 5と 2。 それぞれ作製した変異体はシーケンス解析により配列を確認した後、実施例 1に記載 の方法に従って、 タンパク質を調製した。 実施例 5 ブロッキング効果
ブロッキング効率は以下の方法を用いて測定した。
ポリスチレンプレートへのヒト血清 I g Gの非特異吸着を指標として検討を実施し た。
方法としては、 20mMTr i s—HC l (pH7. 0 ) に希釈した B S A (S i g ma社、 F r a c t i on V)および各種変異体 Dn a Kサンプル 100 1を ポリスチレン製 96ゥエルィムノプレート (Co s t a r社製; E. I . A. /R. I. A 8We 1 1 S t r i p) に添加し、 4°Cにて 4時間静置した （基本的には 4時間静置したが、 ブロッキング時間を検討する場合は任意の時間を設定した)。 そ の後、プレートから溶液を除去した後、正常人血清を PBS (—）にて 50倍希釈し、 50 z 1を添加、 37 °Cにて 1時間インキュベートした。 次に、 各ゥエルを 20 0 1の洗浄液 （PBS (—）， 0. 05%Twe e n 20) にて 4回洗浄し、 至適濃 度に抗体希釈液（0. 01M PB (pH7. 4)、 0. 1 5M NaC 0. 5% カゼィン）で希釈したペルォキシダ一ゼ標識抗ヒト I g G抗体（J a c k s on I mmunoRe s e a r c h社製） 50 i 1を各ゥエルに添加し、 37でにて 1時間 インキュベートした。 次に、 各ゥエルを 200 1の洗浄液 （PBS (—）， 0. 05 %Twe e n 20) にて 4回洗浄し、 発色試薬 （テトラメチルベンジジン （TM BZ ： 3, 3 ' , 5, 5 ' — T e t r ame t h y 1 b e n z i d i n e)) を 1 0 0 β \添加、室温で 5分間発色させた後、 1 Ν硫酸 50 1を加え反応を停止させ た。発色は、 EL I S Αリーダーにて主波長 450 nm、 副波長 650 nmにて測定 した。 タンパク質の定量にはブラッドフォード法を用いた。
まず、 0. 7mg/m l に調製した BSA、 Dn aK 384— 638、 Dn a K 384— 607、 Dn aK 384— 578、 Dn aK 508— 607、 Dn aK 525 - 607について、 4時間でのプロッキング効率を測定したところ、 図 5に示すように、 B S A、 Dn aK 384-638, DnaK 384— 607以 外のものについては、 ブロッキング効果が低い結果であった。ブロッキング効果が低 かったクロ一ンは、 Dn aK 384— 607、 Dn aK 384— 578について は、 αヘリックスを削ったクロ一ン、 Dn aK 508— 607、 Dn aK 525 - 607は /3シートを削ったクローンであり、 Dn aKの基質結合ドメインを用いる プロッキングには 0；ヘリックス構造と βシート構造の両方が必要であることが推察 された。 ¾
次に、 βシ一ト部分の疎水性を向上させる目的で作製した、 Dn aK 384-6 07 (D479 V, D481V) と Dn aK 419— 607 (それぞれ 7 m g/m 1 ) と同濃度の B S Aと Dn aK 384— 607をコントロールとして、 ブ ロッキング 4時間でのブロッキング効果を比較した。その結果、 DnaK 384— 607 (D479 V, D481V)、 Dn aK 419— 607ともに、 同濃度の BS Aよりもブロッキング効率が高く、特に Dn aK 419-607で顕著であつ た （図 9)。
更に、上記実験で最も効果の高かった Dn aK 419— 607と Dn aK 38 4— 638、 BSAについて、 ブロッキング濃度とブロッキング 4時間目でのブロッ キング効果について調べた。 その結果、 0. 15mg/mlの Dn aK 419-6 07は 12mgZmlの B S Aよりもブロッキング効果が顕著であり、非常に低濃度 でブロッキング剤として使用可能であることが示唆された （図 10)。
最後に、更に、上記実験で最も効果の高かった Dn aK 419— 607と Dn a K 384— 638、 BSAについて、 ブロッキング時間とブロッキング効果につい て検討を行った。タンパク質濃度は、 Dn aK 419— 607と Dn aK 384 — 638については 0. 7mgZm 1とし、 B S Aは上記検討で 0. 7mg/m lの Dn aK 419 -607と同等のブロッキング効果を示した 2. 4mg/m 1で用 いた。その結果、 Dn aK 419-607のプロッキングに要する時間が飛躍的に 短く約 10分程度で十分効果的なブロッキング効果が得られ、 3時間後に同等の効果 の見られた 2. 4m g/m 1の B S Aより早くブロッキング効果を示すことが分かつ た （図 11)。 実施例 6 ブロッキング効果 (EL I SA)
ヒ卜癌胎児性 ί几原 (Ca r e i no emb r i on i c an t i body : h C EA)の EL I S Aシステムを用いて Dn aKフラグメント C ブロッキング剤として の有用性を検討した。 まず、 抗 hCEA MoAbを 50 mM炭酸緩衝液 （ p H 9. 6)で 10 X g/m 1に希釈後、 100 u 1づっポリスチレン製 96ゥエルィムノ プレート (Co s t a r社製； E. I . A. /R. I . A 8 We 1 1 S t r i P) へ添加後、 37 * 1時間静置した。 静置後、 洗浄液 （PBS (—）， 0. 0 5 %Twe e n 20) 150 ^ 1にて 3回ゥエルを洗浄した後、 ブロック液を 200 II 1づっ添加し、 4 4時間静置した。 ブロック液としては、 一般的に使用される 2. 4mgZm 1の B S A (2 OmM Tr i s— HC 1 (pH7. 0))、 および同 様の緩衝液に溶解した Dn aK 419— 607を用レ ブランクは 2 OmM Tr i s— HC 1 (ρΗ7. 0で行った。 ブロック液廃棄後、 0、 2. 5 n g/m 1 , 5 ng/mlに希釈した hCEA溶液（ィムノフローラ：東洋紡製) を 50 1づっ添 加し、 37 °Cにて 1時間インキュベート後、 150 /21の洗浄液にて 4回洗浄実施し た。 その後、 至適濃度に希釈したペルォキシダーゼ標識抗 hCE A抗体（ィムノフロ ーラ：東洋紡製） を添加、 37°C * l h反応後、 さらに洗浄液（PBS (—）， 0. 05%Twe e n 20) 150 i lにて 3回ゥエルを洗浄した。 次に、 基質溶液 （テ トラメチルベンジジン （TMB Z： 3 , 3 ' , 5, 5 ' -T e t r ame t h y 1 b e n z i d i n e)) 100 1を添加し、 遮光して 37 °C、 20分間発色させ た。 最後に、 反応停止液 （IN H2 S04) 100 1を添加し、 黄色の発色を 450 nm/650 nmで測定した。
その結果、 ブランクでは測定の直線性が失われているのに対し、 Dn aK 419 - 607は B S A同様に直線性の良い結果が得られ、本発明の Dn aK 19-6 07が免疫学的測定にも十分適用し得ることが示された （図 12)。 実施例 7 ヒスチジンタグなし（n a t i v e) の Dn a Kフラグメントのブロッ キング効果の比較
実施例 2〜4で構築した Dn a Kフラグメントはいずれも発現ベクター pQE 3 0に由来するヒスチジンタグを N末端に有している事より、 Dn a Kフラグメン卜の 等電点が中性 pHへシフトしている。そのため、本来の静電相互作用によるブロッキ ング能も維持できるようヒスチジンタグを削除した Dn aKフラグメントを構築し た。
ヒスチジンタグ除去 D n a Kクローンの作製は、実施例 5で作製した p Q E— D n aK41 9-607を铸型として用い Qu i c k C h a n g e法を用いて開始コド ンの後ろからヒスチジンタグを含む Dn aK領域までのアミノ酸を削除して作製し た。実際には Q u i c kCh an ge s i t e d i r e c t i ve mu t a en e s i s k i t ( s t r a t a g e n e社製） を用い、 ヒスチジンタグの上 流に B amH Iサイトを導入した。 操作は、 その取り扱い説明書に従って実施した。 その際の使用したプライマー配列を配列番号 16、 1 7に示す。実施例 2にも示した が、 クロ一ニングした遺伝子の上流側にも B amH Iサイトを設けてある。 よって、 B amH Iで得られたベクターを消化し、再結合することにより、 ヒスチジンタグ配 列を除去したクローンを得ることができる。
この発現ベクターは PQE— Dn aK419-607Nと命名した。また n a t i v eな Dn aK419— 607フラグメントの調製は、この pQE— Dn aK41 9— 607 Nにて大腸菌 J M 109を形質転換した形質転換体を培養して取得した。 すなわち、 大腸菌 JM109 (pQE— Dn aK419— 607N) を100mg /Lのアンピシリンを含むトレフィックブロス （1. 2%ポリペプトン、 2. 4%酵 母エキス、 0. 5%グリセロール、 1 7mMリン酸 1カリウム、 72mMリン酸 2力 リウム） に植菌し 32°Cで 20時間しんとう培養した。本培養液 1 L分の菌体を遠心 分離により集菌し、 200m lの 100 mM T r i s塩酸緩衝液， pH9. 0に懸 濁し、 フレンチプレスにより破砕した。 本破砕液に終濃度 0. 1 %になるようポリェ チレンイミンを添加後 60°Cで 2時間加温し、遠心分離により上清を回収した。次い で 50 %飽和度の硫安を添加し、遠心分離により沈殿物を回収後、 100 mM T r i s塩酸緩衝液、 pH9. 0で再溶解した。 更に、 64 °Cで 14時間加温処理し遠心 分離により上清を回収した。 この粗酵素液を S u p e r d e x 200 (アマシャムバ ィォサイエンス社製)ゲルろ過クロマトグラフィーに供し、次いで 50 %飽和度の硫 安を添加して沈殿を回収後、 l O OmM T r i s塩酸緩衝液、 pH9. 0で再溶解 した。同緩衝液で緩衝化した S e p h a d e X G— 25 (アマシャムバイオサイエ ンス社製）ゲルろ過クロマトグラフィーで脱塩した。次にこの Dn a Kフラグメント を 20 %飽和度硫安を含む 100 mM T r i s塩酸緩衝液、 p H 9. 0で緩衝化し た Pheny l S e p h a r o s e F a s t F 1 o w (アマシャムバイオサイ ェンス社製）カラムクロマトグラフィーに供し 20 %〜0 %飽和度硫安のリニアグラ ジェントによる溶出を行い、精製 Dn aKフラグメント画分を取得した。本精製フラ グメント画分を限外ろ過膜で濃縮した後、蒸留水により脱塩して最終精製 D n a Kフ ラグメントを取得した。
BSAと n a t i ve Dn aK419-607フラグメントのブロッキング効 率の比較は以下の方法により測定した。
まず西洋ヮサビ由来の標識用ペルォキシダーゼ（東洋紡績 (糊製 P E〇— 131 ) を BSAまたは n a t i ve D n a K 419— 607フラグメントを含む P B S緩 衝液に 2 m g/m 1になるよう溶解した。 その際、 市販品 BSA (フラクション V) は 2または 1 Omg/m 1、 n a t i ve Dn aK419— 607フラグメントは 0. 1または 0. 5mgZm 1の濃度に調整した。 次いで、 同溶液によりペルォキシ ダーゼ溶解液の 40〜 320倍まで希釈系列を作成し、それぞれの希釈液 100 1 をポリスチレン製 96穴マイクロプレートに分注した。室温で 1時間放置した後に溶 液を除去し、 0. 02% Twe e n 20を含む PBS緩衝液 200 u Iで洗浄した。 この洗浄操作を 6回繰り返した後、 良く洗浄液を取り除いた。 次いで、 100 1の テトラメチルベンチジン （B i o— Rad社製） を添加し、 37°Cで正確に 10分間 ィンキュベ一トした後、 1 Nの硫酸 100 1を添加し反応停止並びに発色させた。 この発色はマイクロプレートリーダーにて主波長 450 nm、副波長 650 nmにて 測定した。
その結果を図 15〜図 17に示したが、 n a t i ve Dn aK419— 607フ ラグメントは BSAの 1/20の濃度で B S Aと同等の非特異発色抑制を示した事 より、 BSAの約 20倍のブロッキング能を示す事が明らかとなった。 産業上の利用可能性
本発明によれば、アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規タンパク質 または部分配列タンパク質を簡便にスクリーニングできるようになり、 また、大腸菌 で大量発現可能なブロッキング効率の向上したタンパク質の生産が可能となった。本 発明によって得られたタンパク質はブロッキング能が高く、従来法に比べ、簡便かつ 確実な結果が得られる。 本発明は、 免疫的測定を応用する臨床診断や、 医療などの分 野に大きな寄与を与える。

Claims

請求の範囲
1. アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパ ク質または部分配列タンパク質候補をスクリーニングする方法であって、以下の条件 を満たすタンパク質もしくは部分配列タンパク質をスクリーニングする方法：
A. タンパク質のアミノ酸配列を 2分し、 それぞれの親水性アミノ酸 （D，
E, K， H, R, Y) と疎水性アミノ酸 （G， A, V， L, I, M, F, W, P) の 含有率から以下の式を用いて算出された 2分された各部分での親水 Z疎水率の差の 絶対値が 0. 1以上である；
• (親水/疎水率) = (親水性アミノ酸含有率) / (疎水性アミノ酸含有率)
B. 親水性部分の親水/疎水率（親水/疎水率の高い方の値）が 0. 5以上；
C. 100残基より多くのアミノ酸よりなる。
2. 請求項 1の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規な ブロッキング用タンパク質または部分配列夕ンパク質であって、以下 Dの解析工程に より得ることができる、以下の Eの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク 質：
D. (1) ボリスチレン製ィムノタイタープレートのそれぞれのゥエルに請求 項 1の条件を満たす候補タンパク質 （0. 5〜lmg/m 1 ： 2 OmM T r i s— HC 1 (pH7. 0) に希釈） および同様に調製したゥシ血清アルブミン （F r a c t i on V) を添加し、 2°C〜10 °Cで 4〜 5時間ブロッキングし、 液を廃棄す る工程；
(2) PBS (一） で 25〜100倍希釈した正常ヒト血清を添加し、 3 7 °Cにて 1時間放置した後に、 プレートを PBS (—） (0. 05%Twe e n 20) にて洗浄する工程；
(3)酵素標識した抗ヒト I gG抗体を用いて非特異的にプレートに吸着 した I gG量を発色法を用いた比色法にて比較する工程；
E 候補タンパク質での発色がゥシ血清アルブミンの発色の 2. 5倍以下で ある。
3. 請求項 1の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規な ブロッキング用タンパク質または部分配列夕ンパク質であって、以下 Fの解析工程に より得ることができる、以下の Gの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク 質：
D. (1)西洋ヮサビ由来の標識用ペルォキシダーゼを候補タンパク質溶液（0. 5〜lmg/ml ： PBS (一） に希釈） および同様に調製したゥシ血清アルブミン (F r ac t i on V) に 0. 05mg/m 1になるよう溶解する工程；
(2)上記希釈液をポリスチレン製 96穴マイクロプレートに分注するェ 程；
(3) 1時間、 25 で放置した後に、 溶液を除去し、 0. 02% Tw e e n 20を含む PBS' (—） で洗浄する工程；
(4) テトラメチルベンチジン溶液を添加し、 37°Cでインキュベートし た後、 1Nの硫酸を添加し反応停止並びに発色させる工程；
(5) 発色をマイクロプレートリーダーにて測定する工程；
G. 候補タンパク質での測定値が、 ゥシ血清アルブミンの発色の 2. 5倍以下 である。
4. 請求項 1の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規な ブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質であって、以下 Hの解析工程に より得ることができる、以下の Iの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク 質：
H. (1) ポリスチレン製ィムノタイタープレートのそれぞれのゥエルに請求 項 1の条件を満たす候補タンパク質 （0. 5〜lmg/ml ： PBS (一） に希釈） および同様に調製したゥシ血清アルブミン （F r a c t i on V) を添加し、 2°C 〜10°Cで 4〜5時間ブロッキングし、 液を廃棄する工程；
(2) 0. 05mg/m 1に調製したペルォキシダーゼ溶液を添加し、 3 7 °Cにて 1時間放置した後に、 プレートを PBS (―) (0. 05%Twe e n 20) にて洗浄する工程；
(3) 1時間、 25 °Cで放置した後に、 溶液を除去し、 0. 02% Tw e e n 20を含む P B S (一） で洗浄する工程；
(4) テトラメチルベンチジン溶液を添加し、 37 でインキュベートし た後、 1Nの硫酸を添加し反応停止並びに発色させる工程； (5) 発色をマイクロプレートリーダーにて測定する工程；
I. 候補タンパク質での測定値が、 ゥシ血清アルブミンの発色の 2. 5倍以下 である。
5. 請求項 1に記載の条件 A, B, Cを満たすタンパク質または部分配列タンパク 質のアミノ酸配列の改変によりブロッキング効率を向上させた新規なタンパク質。
6. アミノ酸配列改変がアミノ酸置換、 除去、 挿入によるものであることを特徴と する請求項 5に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
7. 原核生物もしくは真核生物由来であることを特徴とする請求項 5に記載のプロ ッキング効率の向上したタンパク質。
8. 「HS P 70ファミリ一タンパク質」 由来であることを特徴とするブロッキン グ効率の向上した夕ンパク質。
9. Dn a Kタンパク質由来であることを特徴とする請求項 8に記載のブロッキン グ効率の向上したタンパク質。
10. Dn aKタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であること を特徴とする請求項 8に記載のプロッキング効率の向上した夕ンパク質。
11. Dn aKタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、 少なくとも N末端から 387番目まで、多くとも 472番目までのアミノ酸配列を除 去したことを特徴とする請求項 8に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
12. Dn aKタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、 少なくとも N末端から 387番目まで、多くとも 418番目までのアミノ酸配列を除 去したことを特徴とする請求項 8に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
13. Dn aKタンパク質の 419〜607番目までのアミノ酸配列からなる請求 項 8に記載のタンパク質
14. ATP a s eドメインもしくはその一部を除去した D n a Kタンパク質の一 部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したことを特徴とする請求項 8に記載 のブロッキング効率の向上したタンパク質。
15. ATP a s eドメインもしくはその一部を除去した D n a Kタンパク質の一 部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号 479と 481のァ スパラギン酸をパリンに置換した請求項 8に記載のブロッキング効率の向上した夕 ンパク質。
16. Dn a Kタンパク質の 384-607番目のアミノ酸配列からなり、 ァミノ 酸番号 479と 481のァスパラギン酸をバリンに置換した請求項 8に記載のプロ ッキング効率の向上したタンパク質。
17. 1以上の親水性ドメインと 1以上の疎水性ドメインを有するブロッキング用 タンパク質であって、 疎水性ドメインが器壁に吸着可能であり、親水性ドメインが器 壁に吸着した疎水性ドメインを覆うことが可能であるブロッキング用タンパク質。
18. ブロッキング速度が BS Αよりも向上していることを特徴とする改変された タンパク質。
19. 3時間のブロッキングにおいて B S Aと同等のブロッキング効率を示すよう にタンパク質量を揃えた条件において、 10分未満のブロッキング能が B S Aよりも 優れることを特徴とする請求項 18に記載の改変された夕ンパク質。
20. タグ配列を有することを特徴とする請求項 2〜19のいずれかに記載のタン パク質。
21. タグ配列がヒスチジンタグ、マル! ^一スバインディングプロテイン（MB P) タグ、 ダルタチオン Sトランスフェラーゼ (GST) タグ、 F 1 a gタグ、 My c夕 グ、タンデムァフィ二ティーピユリフィケーシヨンタグから選択されることを特徴と する請求項 20に記載のタンパク質。
22. 任意のアミノ酸配列が付加されたことを特徴とする請求項 2〜19のいずれ かに記載のタンパク質。
23. 原核生物を用いて請求項 2〜 22のいずれかに記載のタンパク質を生産する ことを特徴とするタンパク質の生産方法。
24. 大腸菌を用いて請求項 2〜 22のいずれかに記載のタンパク質を生産するこ とを特徴とするタンパク質の生産方法。
25. 無細胞タンパク質合成法を用いて請求項 2〜 22のいずれかに記載のタンパ ク質を生産することを特徴とするタンパク質の生産方法。
26. 加熱工程を経ることを特徴とする請求項 2〜 22のいずれかに記載のタンパ ク質の精製方法。
27. 請求項 2〜 22のいずれかに記載のタンパク質をブロッキング、 安定化、 賦 形、 フォールデイング補助、 リフォールデイング補助、 コーティング、 医療用に使用 する方法。
2 8 . 請求項 2〜2 2のいずれかに記載のタンパク質を含有するブロッキング試薬、 安定化剤、 賦形剤、 フォールデイング補助剤、 リフォールデイング補助剤、 コ一ティ ング剤または医療用コーティング剤。
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