JP2007525988A - O6−アルキルグアニン−dnaアルキルトランスフェラーゼの突然変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、野生型ヒトAGTと比較したときに、
(a)DNA相互作用の低下;
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化;
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上;
(d)酸化条件下での安定性の向上;
(e)基質との反応後の細胞内での安定性の向上;
(f)基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上;
(g)試験管内溶解度の向上;
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下;ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下;
より選択される2つ以上の利点を示す、AGT突然変異体に関する。
対象となるタンパク質を、AGT融合タンパク質に組み込み、AGT融合タンパク質を、標識を担持する特定のAGT基質と接触させ、AGT融合タンパク質を、標識を認識および/処理するために設計された系において、標識を使用して検出し、場合により更に操作する、対象となるタンパク質を検出および/または操作するための前に記載の方法において、AGTの性能を、野生型ヒトAGTを突然変異型AGTと置換することによって更に向上できる。突然変異型AGTを包含するこのような向上方法は、本発明の目的である。別の目的は上記方法に特に適したAGT突然変異体であり、AGT融合タンパク質は、このようなAGT突然変異体および少なくとも1種の対象となるタンパク質を含む1種以上の他のタンパク質を含む。対象となるタンパク質は、いかなるタンパク質であってもよい。
(a)DNA相互作用の低下;
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化;
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上;
(d)酸化条件下での安定性の向上;
(e)基質との反応後の細胞内での安定性の向上;
(f)基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上;
(g)試験管内溶解度の向上;
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下;
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下;
より選択される2つ以上の特性を示す突然変異体を含む。
「DNA相互作用の低下」のある本発明の突然変異型AGTは、野生型ヒトAGTまたは「PGEG−hAGT」(Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003)などの既知のAGT突然変異体と比較したときに、20%未満のDNA結合、好ましくは2%未満のDNA結合を示し、最も好ましくは検出可能なDNA結合を示さない。DNAとの相互作用は例えば、低塩およびDNase非存在の条件下でE.coli抽出物から同時精製されたDNAの量を評価することによって定量される。これは野生型(ヒト)および突然変異型AGTの融合タンパク質(例えばGSTへの融合)の並行精製の間で分光法によって比較される(260および280nmでの吸収率の比)。あるいはAGTのDNAとの相互作用は、DNAの存在下での、基質としてのBG−Cy3(Cy3に結合されたO6−(4−アミノエチル−ベンジル)−グアニン)とのAGT反応性の阻害として測定される。この手法は、BG−Cy3のAGTとの反応時におけるCy3蛍光物質の蛍光の著しい増加を利用する。AGTのCy3−標識ベンジルグアニン誘導体との反応動力学には、サケ精子DNAの各種の濃度での数時間に渡る蛍光強度測定が続く。野生型hAGTは、DNAにテトラマーとして結合するのに対して、未結合hAGTタンパク質はモノマーのままであることが示された(Rasimasら、J Biol Chem 278(10): 7973-80,2003)。DNAに結合できないAGT突然変異体もテトラマー化しない。
「もはや核に限定されない局在化」を伴う本発明の突然変異型AGTは、真核細胞、例えば哺乳類細胞での発現時に細胞での突然変異型AGTの実質的に均一な局在化を示す。AGT突然変異体の細胞内局在化は、AGT欠損HeLa細胞またはCHO細胞を構成的発現のための構築物をヒトサイトメガロウィルス前初期プロモータの下で用いて一過性に形質移入することによって調査する。細胞を細胞膜透過性ジアセチルフルオレセイン修飾O6−ベンジルグアニンによって染色して(Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003の物質4)、共焦点レーザ顕微鏡法によって解析する。細胞質および核の蛍光強度を突然変異型AGTと野生型AGTで比較する。野生型ヒトAGTは、核での優先的局在化と、細胞質でのもっぱらわずかな局在化を示す。
「溶解性タンパク質(すなわち細胞溶解後に溶解性画分に見出され、封入体には見出されないタンパク質)としての発現収率の向上」を伴う本発明の突然変異型AGTは、野生型ヒトAGTと比較したときに、溶解タンパク質として3倍を超える発現収率、好ましくは5倍を超える発現収率、最も好ましくは10倍を超える発現収率を示す。この発現収率の向上は、同時に、発現に使用される「宿主での安定性」の尺度となる。発現収率は、E.coliまたは遺伝子組換えタンパク質用の他のいずれかの標準的生産細胞、例えば酵母、あるいは好ましくは昆虫細胞、CHO細胞もしくはHeLa細胞において測定する。発現収率を定量するために、融合パートナーが容易な精製および定量を可能にするように、AGT融合タンパク質を選択できる。例えばE.coliでの発現収率は、E.coliの並行させた発現培養からの溶解性および非溶解性GST野生型AGT融合タンパク質ならびにGST突然変異型AGT融合タンパク質の収率を測定および比較することによって決定する。細胞溶解後の溶解性画分および非溶解性画分(すなわち封入体)のサンプルをSDS−PAGEにかけて、相当するAGT融合タンパク質のバンド染色強度を比較する。溶解性タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィーによる細胞抽出物からの融合タンパク質(例えばグルタチオンセファロースによるGST−AGT融合タンパク質の場合)の精製後、精製した画分にタンパク質濃度のアッセイを行うことによって定量する(Bradford,Anal Biochem 72: 248-54,1976)。溶解性画分中の同様のタンパク質の発現収率(点突然変異での相違)は、精製状態と同様に、未精製状態でのタンパク質安定性の尺度として使用できる(Ohageら、J Mol Biol 291: 1119-1128,1999、Wirzら、Protein Sci 8: 2245-50,1999)。したがって、これは折畳み安定性および凝集傾向の尺度として見なされる。
「酸化条件下での安定性の向上」を伴う本発明の突然変異型AGTは、野生型AGTまたは「PGEG−hAGT」(Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003)などの既知のAGT突然変異体と比較したときに、2倍を超える活性タンパク質の収率、好ましくは5倍を超える活性タンパク質の収率、最も好ましくは10倍を超える活性タンパク質の収率を示し、すなわちAGTタンパク質は、緩衝水溶液(例えば100mM NaCl、10mM HEPES、pH7.4、ジチオスレイトールまたはベータ−メルカプトエタノール無添加)中、酸化条件下で1時間以上のインキュベーション時間の後に、AGT基質に対してその活性を維持する。AGT基質に対する活性は、ジチオスレイトールまたはベータ−メルカプトエタノールなどの還元剤を添加せずに精製後に測定する。あるいは突然変異型AGTおよび野生型ヒトの活性を、適切なシグナル配列へのそれらの融合による酸化性酸化還元電位を有する細胞コンパートメント(例えばE.coliのペリプラズム)内へのエクスポート後に比較する。還元および酸化条件下でのAGT基質に対する活性は、ジチオスレイトールまたはベータ−メルカプトエタノールなどの還元剤の存在下または非存在下で反応を実施することによって比較する。
「細胞内での向上した安定性」を備えた本発明の突然変異型AGTは、野生型AGTまたは「PGEG−hAGT」(Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003)などの既知のAGT突然変異体と比較したときに、細胞(例えば哺乳類細胞)内での細胞透過性基質との反応後に、2倍を超える安定性、好ましくは3倍を超える安定性、最も好ましくは6倍を超える安定性を示す。安定性は、突然変異型AGT融合タンパク質について、AGT基質との反応後に、AGT融合タンパク質の強度および局在化を、共焦点レーザ走査顕微鏡法を用いて解析することによって決定する。
「細胞外部での向上した安定性」を備えた本発明の突然変異型AGTは、野生型AGTまたは「PGEG−hAGT」(Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003)などの既知のAGT突然変異体と比較したときに、2倍を超える安定性、好ましくは4倍を超える安定性、最も好ましくは6倍を超える安定性を示す。反応前の安定性は、突然変異型AGTまたは突然変異型AGT融合タンパク質について、精製サンプルを緩衝水溶液中で4℃にて2週間まで、−20℃にて6ヶ月までインキュベートすることによって決定する。複数の時点にてアリコートを取り、Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003によって記載されているように反応性AGTの濃度を概算する。標識基質との反応後の、そして未反応基質からの続いての分離後の野生型AGTおよびAGT突然変異体の安定性は、4℃にて2週間および−20℃にて3ヶ月に渡って溶解性画分中の標識の濃度を定量することによって決定される。
「試験管内溶解度の向上」を備えた本発明の突然変異型AGTは、野生型ヒトAGTと比較したときに、2倍を超える溶解度、好ましくは5倍を超える溶解度、最も好ましくは10倍を超える溶解度を示す。野生型AGTおよびAGT突然変異体の試験管内溶解度は、適切な緩衝液(例えば100mM NaCl、20mM Tris、pH8.0、20%グリセロール、1mM DTT)にて確立された1つ以上の濃度での4℃または最高37℃での精製サンプルの一晩に渡るインキュベーション後に残存するタンパク質の量を決定することによって測定する。
「向上した反応性」を備えた本発明の突然変異型AGTは、野生型ヒトAGTと比較したときに、3倍を超える反応性、好ましくは5倍を超える反応性、最も好ましくは10倍を超える反応性を示す。O6−ベンジルグアニン基質に対する活性は、Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003によって記載されているように測定する。
「DNAベース基質に対する反応性の低下」を備えた本発明の突然変異型AGTは、野生型ヒトAGTと比較したときに、DNAベース基質に対する10%未満の反応性、好ましくはDNAベース基質に対する1%未満の反応性を示し、最も好ましくはDNAベース基質に対する検出可能な反応性を示さない。野生型AGTまたは突然変異型AGTがアルキル化DNA基質と反応する能力は、O6−ベンジルグアニンを含有する合成オリゴヌクレオチド(配列番号:2、位置14にて修飾)によるその不活性化の反応として測定する。次に反応をビオチン化O6−アルキルグアニンによるインキュベーションにより失活させる。サンプルにウェスタンブロッティングおよびストレプトアビジン誘導体により検出させて、これらの基質の速度定数を得る。あるいは野生型または突然変異型AGTがアルキル化DNA基質と反応する能力をAGT蛍光基質と競合するその標識効率によって測定する。BG−Cy3(Cy3に結合したO6−ベンジルグアニン)によるAGTの反応速度論の後には、O6−ベンジルグアニンを含有する競合する合成オリゴヌクレオチド(配列番号:2、位置14にて修飾)の各種濃度での蛍光強度測定が続く。
「N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下」を備えた本発明の突然変異型AGTは、野生型AGTまたは「PGEG−hAGT」(Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003)などの既知のAGT突然変異体と比較したときに、N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対して10%未満の反応性、好ましくは2%未満の反応性を示し、最も好ましくは検出可能な反応性を示さない。このようなN9−置換O6−アルキルグアニン基質は、野生型AGTの天然基質である。野生型AGTまたは突然変異型AGTがN9−修飾O6−アルキルグアニン基質と反応する能力は、競合実験でのビオチン化N9−非置換O6−アルキルグアニン基質の存在下でのこのような基質との、例えば低分子量N9−シクロペンチル−O6−ベンジルグアニンとのその反応の速度として測定する。次にサンプルにウェスタンブロッティングおよびストレプトアビジン誘導体による検出を受けさせて、これらの基質の速度定数を得る。あるいはこのような基質に対する反応性を、AGTとBG−Cy3との反応の阻害として測定する。AGTのBG−Cy3との反応の後に、プレインキュベーション後の、またはN9−修飾O6−アルキルグアニン基質との直接競合におけるAGTへの結合時のCy3蛍光強度の上昇が続く。
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(d)酸化条件下での安定性の向上、
(g)試験管内溶解度の向上、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(d)酸化条件下での安定性の向上、
(f)基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上、
(g)試験管内溶解度の向上、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(e)基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(e)基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下;
を示す突然変異体である。
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、特にE.coliにおける(c’)ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、特にE.coliにおける(c’)、
(d)酸化条件下での5倍を超える安定性、
(g)5倍を超える試験管内溶解度、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性;
あるいは
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、特にE.coliにおける(c’)、
(d)酸化条件下での5倍を超える安定性、
(f)基質との反応前の、細胞外での4倍を超える安定性、特に基質との反応後の(f’)、
(g)5倍を超える試験管内溶解度、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(a)2%未満のDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、特にE.coliにおける(c’)、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性、ならびに
(i)DNAベース基質に対する1%未満の反応性;
あるいは
(a)2%未満のDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、特にE.coliにおける(c’)、
(e)基質との反応後の細胞内での3倍を超える安定性、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性、ならびに
(i)DNAベース基質に対する1%未満の反応性;
あるいは
(a)2%未満のDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、特にE.coliにおける(c’)、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性、
(i)DNAベース基質に対する1%未満の反応性、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する2%未満の反応性;
あるいは
(a)2%未満のDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、特にE.coliにおける(c’)、
(e)基質との反応後の細胞内での3倍を超える安定性、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性、
(i)DNAベース基質に対する1%未満の反応性、
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する2%未満の反応性;
を示す突然変異体である。
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、特にE.coliにおける(c’)、
(d)酸化条件下での10倍を超える安定性、
(f)基質との反応前の、細胞外での6倍を超える安定性、特に基質との反応後の(f’)、
(g)10倍を超える試験管内溶解度、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性;
あるいは
(a)検出不能なDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、特にE.coliにおける(c’)、
(e)基質との反応後の細胞内での6倍を超える安定性、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性、ならびに
(i)DNAベース基質に対する検出不能な反応性;
あるいは
(a)検出不能なDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、特にE.coliにおける(c’)、
(e)基質との反応後の細胞内での6倍を超える安定性、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性、
(i)DNAベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、特にE.coliにおける(c’)、
(d)酸化条件下での10倍を超える安定性、
(e)基質との反応後の細胞内での6倍を超える安定性、
(f)基質との反応前の、細胞外での6倍を超える安定性、特に基質との反応後の(f’)、
(g)10倍を超える試験管内溶解度、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性、ならびに
(i)DNAベース基質に対する検出不能な反応性;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、特にE.coliにおける(c’)、
(d)酸化条件下での10倍を超える安定性、
(e)基質との反応後の細胞内での6倍を超える安定性、
(f)基質との反応前の、細胞外での6倍を超える安定性、特に基質との反応後の(f’)、
(g)10倍を超える試験管内溶解度、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性、
(i)DNAベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性;
を示す突然変異体である。
(A)E.coliにおける発現収率を上昇させ、タンパク質に酸化をより受けにくくする、AlaまたはValによって、好ましくはAlaによって置換されたCys62。
(B)他のアミノ酸置換、好ましくはCys150−Ser151−Ser152の置換、特にCys150の置換と組合された、E.coliにおける発現を上昇させて、野生型ヒトAGTに匹敵する基質反応性を維持する、Ala−Asn、Asn−Asn、Ser−His、Ser−Ser、Pro−Pro、Pro−Ser、Pro−Thr、またはThr−Ser、好ましくはSer−Hisによって置換されたGln115−Gln116。
(C)他のアミノ酸置換、好ましくはGln115−Gln116/Cys150−Ser151−Ser152の置換またはGly131−Gly132/Met134−Arg135の置換、特にCys62/Gln115−Gln116/Gly131−Gly132/Met134−Arg135/Cys150−Ser151−Ser152の置換および182の後での切断と組合された、E.coliにおける発現収率を上昇させ、DNA結合を減少させて、哺乳類細胞での核局在化を無効にする(Limら、EMBO J 15: 4050-4060,1996)、Alaによって置換されたLys125およびThr−Alaによって置換されたAla127−Arg128。
(D)E.coliのペリプラズムおよび細胞質における発現収率を上昇させ、DNA結合を減少させて、オリゴヌクレオチド(O6−アルキル−N9−デオキシリボシルグアニンを含有する)、O6−アルキル−N9−デオキシリボシルグアニンおよびN9−シクロペンチル−O6−ベンジルグアニンまたは他のN9置換O6−ベンジルグアニンとの反応性を無効にするのに対して、N9位置で置換されていないO6−アルキルグアニン基質に対する反応性を上昇させる、Val−His/Leu−Arg、Lys−Thr/Leu−Ser、Gln−Val/Leu−Ser、またはMet−Thr/Met−Val、好ましくはLys−Thr/Leu−Serによって置換されたGly131−Gly132/Met134−Arg135、あるいはVal−His/Leuによって置換されたGly131−Gly132/Met134。
(E)野生型hAGTと比較してE.coliのペリプラズムにおいてより効率的な発現を可能にして、O6−アルキルグアニン基質に対する反応性を維持し、タンパク質に酸化をより受けにくくして、DNA結合を減少させる、Asn−Ile−Asn、Pro−Leu−Pro、Pro−Arg−Thr、Ser−Phe−Pro−、またはSer−His−Thr−、好ましくはAsn−Ile−Asnによって置換されたCys150−Ser151−Ser152、あるいはPhe−AsnまたはArg−Asnによって置換されたCys150−Ser151、あるいはHis/Thr、Leu/Asn、Leu/Asn、Leu/ProまたはPro/Leuによって置換されたCys150/Ser152、またはSerもしくはThrによって置換されたCys150。
(F)N9位置で置換されていないO6−アルキルグアニン基質に対する反応速度を上昇させる(Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003)のに対して、E.coliのペリプラズムおよび細胞質における発現収率を上昇させ、DNA結合を減少させて、オリゴヌクレオチド(O6−アルキル−N9−デオキシリボシルグアニンを含有する)、O6−アルキル−N9−デオキシリボシルグアニンおよびN9−シクロペンチル−O6−ベンジルグアニンとの反応性を無効にする、他のアミノ酸置換、好ましくはGln115−Gln116/Cys150−Ser151−Ser152の置換またはGly131−Gly132/Met134−Arg135の置換、特にCys62/Gln115−Gln116/Lys125/Ala127−Arg128/Gly131−Gly132/Met134−Arg135/Cys150−Ser151−Ser152の置換および182の後での切断と組合された、Phe/Arg/Gluによって置換されたPro140/Asn157/Ser159、あるいはMet/Trp/Valによって置換されたPro140/Asn157/Gly160、あるいはGly/Glu−Ala、Gly/Asn−Trp、Pro/Gln−CysまたはGly−Gln−Trp、最も好ましくはGly−Glu−Alaによって置換されたAsn157/Ser159−Gly160、あるいはGly/Glu(特に好ましい)によって置換されたAsn157/Ser159、GlyまたはArgによって置換されたAsn157。
(G)発現収率をやや上昇させる、Gly182の後の切断(アミノ酸183−207の欠損)。
E.coliにおける発現収率の上昇、酸化に対する感受性の低下、CHO細胞を通じての細胞質全体への分布、DNA結合の減少、およびO6−ベンジルグアニン基質に対する反応性の上昇を示す、突然変異型Cys62Ala、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断、
E.coliにおける発現収率の上昇、少なくとも1000分の1に減少したDNA結合、O6−ベンジルグアニン基質に対する反応性の上昇、およびO6−アルキル−N9−デオキシリボシルグアニンまたはN9−シクロペンチル−O6−ベンジルグアニンに対する反応性の実質的な低下を示す、突然変異型Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser、Asn157Gly、Ser159Glu、
E.coliにおける発現収率の実質的な上昇を示すが、O6−ベンジルグアニジン基質に対する活性を維持する、突然変異型Gln115Ser、Gln116His、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Asn157Gly、Ser159Glu、
E.coliにおける発現収率の上昇、酸化に対する感受性の低下、CHO細胞における細胞質全体への分布、少なくとも1000分の1に減少したDNA結合、O6−ベンジルグアニン基質に対する反応性の上昇、およびO6−アルキル−N9−デオキシリボシルグアニンまたはN9−シクロペンチル−O6−ベンジルグアニンに対する少なくとも100分の1に減少した反応性を示す、突然変異型Cys62Ala、Gln115Ser、Gln116His、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断、および、
E.coliにおける発現収率の上昇、酸化に対する感受性の低下、CHO細胞における細胞質全体への分布、少なくとも1000分の1に減少したDNA結合、O6−ベンジルグアニン基質に対する反応性の上昇を示すが、O6−アルキル−N9−デオキシリボシルグアニンまたはN9−シクロペンチル−O6−ベンジルグアニンに対する反応性を維持する、突然変異型Cys62Ala、Gln115Ser、Gln116His、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断
である。
Glu115Ser、Gln116His;
Ser150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn;
Lys8Thr、Lys32Ile、Leu33Phe、Thr127Ala、Ser150Asp、Ser151Gly、Ala154Thr;
Lys32Ile、Leu33Phe、Ser150Val、Ser152Arg、Gly153Asp、Ala154Asp;
Lys32Ile、Leu33Phe、Ser150Gly、Ser151Gly、Ser152Asp、Ala154Asp;
Ser150Val、Ala154Asp;
Ser150Glu、Ser151Gly、Ser152Glu、Ala154Arg;
Lys8Thr、Thr127Ala、Ala154Thr;
Lys32Ile、Leu33Phe;
Ala154Thr;
Leu33Phe;
Ser151Gly;
Ser150Asp;
Thr127Ala;ならびに
Lys32Ile、Leu33Phe、およびLeu34の欠損;
より選択される更なる突然変異を有する、AGT突然変異体である。
Lys8Thr、Lys32Ile、Leu33Phe、Thr127Ala、Asn150Asp、Ile151Gly、Ala154Thr;
Lys32Ile、Leu33Phe、Asn150Val、Ile151Ser、Asn152Arg、Gly153Asp、Ala154Asp;
Lys32Ile、Leu33Phe、Asn150Gly、Ile151Gly、Asn152Asp、Ala154Asp;
Asn150Val、Ala154Asp;
Asn150Glu、Ile151Gly、Asn152Glu、Ala154Arg;
Lys8Thr、Thr127Ala、Ala154Thr;
Lys32Ile、Leu33Phe;
Ala154Thr;
Leu33Phe;
Ile151Gly;
Asn150Asp;
Thr127Ala;ならびに
Lys32Ile、Leu33Phe、およびLeu34の欠損;
より選択される更なる突然変異を有する、AGT突然変異体である。
R1−R2は、AGTによって基質として認識される基であり;
Xは、酸素または硫黄であり;
R3は、芳香族またはヘテロ芳香族基、あるいは場合によりCH2に結合された二重結合を有する、置換不飽和アルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクリル基であり;
R4は、リンカーであり;そして
Lは、標識、複数の同じまたは異なる標識、R4をR1に結合して環式基質を生成する結合、または更なる基−R3−CH2−X−R1−R2である。〕
の化合物であり、
R2は、水素、炭素原子1〜10個のアルキル、または糖部分であり;
R5は、水素、ハロゲン、例えばクロロまたはブロモ、トリフルオロメチル、またはヒドロキシであり;そして
R6は、水素、ヒドロキシ、または非置換もしくは置換のアミノである。〕
のプリンラジカルであり、
AGTM=修飾Cys62Ala、Gln115Ser、Gln116His、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断を有するAGT突然変異型
BG−Bt=ビオチンに結合されたO6−(4−アミノメチル−ベンジル)−グアニン
BG−Cy3=Cy3に結合されたO6−(4−アミノメチル−ベンジル)−グアニン
DTT=1,4−ジチオスレイトール
GST=グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(Schistosoma japonicum 由来)
HEPES=2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸
IPTG=イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド
PEG=ポリエチレングリコール
PMSF=フェニルメタンスルホニルフルオリド
SDS−PAGE=ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
突然変異Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Asn157Gly、Ser159Glu
PGEG−hAGT遺伝子の2つの特に重複する領域である、突然変異Asn157Gly、Ser159Gluを含有するAGT(Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003)を配列番号:3、配列番号:6および配列番号:4、配列番号:5のプライマーによって別個の反応にて増幅した。その部分相補性に関して、これらの2つの部分を更なるPCR反応にて構築し、配列番号:3および配列番号:4のプライマーによって増幅して、ここで突然変異Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Alaを更に含有する完全な遺伝子を産生させた。続いて遺伝子を発現ベクターpGEX−2T(Pharmacia)BamHI部位とEcoRI部位との間でクローニングした。これにより遺伝子がベクターによって提供されたGSTタンパク質のC末端融合物として挿入遺伝子の発現が可能となる。
突然変異Cys62Ala、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Asn157Gly、Ser159Glu
実施例1の突然変異型AGT遺伝子を、配列番号:3、配列番号:10および配列番号:4、配列番号:9のオリゴヌクレオチドを用いて実施例1に記載するように増幅およびクローニングすると、PCRによるその取込み時に遺伝子内に更なる突然変異Cys62Alaを引き起こさせた。タンパク質発現、精製および収率の決定は、実施例1に記載するように実施した。突然変異型遺伝子は、ベクターpAK100内の繊維状ファージのg3タンパク質へ融合させて遺伝子をサブクローニングするために、SfiI制限部位を含有する配列番号:11、配列番号:12のプライマーによってPCR増幅した(Krebberら、J Immunol Methods 201: 35-55,1997)。非サプレッサ菌株E.coli BL21内で遺伝子を発現させるときに、アンバー停止コドンは、AGT遺伝子後の翻訳を終止させる。したがって、このベクターからの突然変異型AGTタンパク質のペリプラズム発現を実施例1で記載するように実施した。収穫した細胞を1mM PMSFおよび2μg/mlアプロチニンを添加した、50mMホスフェート、1M NaCl、1mM DTTを含有する緩衝液で再懸濁させて、リゾチームおよび超音波処理によって破壊した。細胞破片を40000xgでの遠心分離によって分離した。実施例1で記載するように、上清をSDS−PAGEによるタンパク質収率の定量および活性アッセイに直接供した。
182での切断、Asn157Gly、Ser159Glu
PGEG−hAGT遺伝子(Asn157Gly、Ser159Glu、Juilleratら、Chem Biol 10:313−317,2003を参照)を配列番号:3、配列番号:13のプライマーによって増幅して、コドン182の後に停止コドンおよびEcoRIを導入して、次に発現ベクターpGEX2T(Pharmacia)のBamHI部位とEcoRI部位との間でクローニングした。タンパク質発現、精製および発現収率の見積りは、実施例1に記載するように実施した。
突然変異Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser、Asn157Gly、Ser159Glu
PGEG−hAGT遺伝子(Asn157Gly、Ser159Glu、Juilleratら、Chem Biol 10:313−317,2003を参照)を、実施例1に記載するように配列番号:11、配列番号:15および配列番号:12、配列番号:14のプライマーでPCR増幅して、構築した。プライマーは、ヌクレオチド混合物NNK(N=A、C、GまたはT;K=GまたはT)をhAGT遺伝子のコドン131、132、134、135に相当する位置に含有する。遺伝子を繊維状ファージのg3タンパク質へ融合させて、SfiI制限部位を介してベクターpAK100内にクローニングした。生じた遺伝子ライブラリをファージ提示に使用した。
突然変異Gln115Ser、Gln116His、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Asn157Gly、Ser159Glu
実施例4に記載したように、3つのPCR断片から配列番号:11、配列番号:17、配列番号:16、配列番号:19および配列番号:12、配列番号:18のプライマーの組合せを使用して、3回の別個のPCR反応で、AGT突然変異体のライブラリを構築した。遺伝子を部分的に重複する断片から構築して、断片のうち2つは、コドン115−116および150−152にそれぞれ対応する位置に、ランダムヌクレオチド混合物NNKを含有している。ファージ提示選択は、Juilleratら, Chem Biol 10: 313-317,2003に記載されているように実施した。選択したタンパク質を実施例1に記載するように、pGEX内にサブクローニングして、発現させ、精製およびキャラクタリゼーションした。ペリプラズム発現は実施例2に記載するように実施した。
突然変異Cys62Ala、GIn115Ser、Gln116His、Lys125Ala、Ala127Thr、Ara128Ala、Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Ara135Ser、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Asn157Gly、Ser159Glu、182での切断、「AGTM」
実施例2、3、4、5による突然変異を組合せた。実施例1からの突然変異型AGT遺伝子の4つの重複断片(Cys62Ala、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Asn157Gly、Ser159Glu)を、配列番号:3、配列番号:23;配列番号:21、配列番号:22;配列番号:20、配列番号:25および配列番号:24、配列番号:13のプライマー組合せを使用して増幅し、遺伝子へと構築して、実施例1に記載するようにpGEX2T内へサブクローニングした。実施例1に記載するように、突然変異型AGT(「AGTM」)を発現させ、精製およびキャラクタリゼーションした。
1つの生体サンプル中に存在する2つの異なるAGTの変異体と2つの異なる基質との反応
実施例6(AGTM)の突然変異型AGTを配列番号:26および配列番号:27のプライマーによってPCR増幅して、NdeIおよびBamHIを介してpET15b内へサブクローニングした。このベクターからの遺伝子発現を実施例1に記載するようにE.coli菌株BL21(DE3)にて実施し、ベクターによってコードされるN末端融合されたHis−タグを有するタンパク質を生じさせた。細胞を収穫して、実施例1に記載するように、0.5M NaCl、10mMイミダゾール、50mMホスフェート、pH8.0を含有する抽出緩衝液中に抽出した。タンパク質を含有する抽出物を事前に平衡にされたNi−NTA−セファロース(Qiagen)に加え、次にこれを、20mMイミダゾールを含有する緩衝液20ベッドボリュームで洗浄した。250mMイミダゾールを含有する緩衝液を用いてHis−タグ化タンパク質を溶出させた。実施例1に記載するように精製したタンパク質を透析し、保存して、後でキャラクタリゼーションした。
化合物Cys62Ala、Gln115Ser、Gln116His、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Asn157Gly、Ser159Glu、182での切断における更なる突然変異
A)エラープローンPCR:ベクターpAK100からの実施例6のAGTMの遺伝子を、配列番号:42のプライマーおよび配列番号:41のビオチン化プライマーによってTaq−ポリメラーゼを使用して、120μM(6−(2−デオキシ−β−D−エリスロ−ペント−フラノシル)−3,4−ジヒドロ−6H,8H−ピリミド[4,5−c][1,2]オキサジン−2−オン)−5’−トリホスフェートおよび480μM 2’−デオキシ−8−オキソ−グアノシン−トリホスフェート(どちらもTrilink Biotechnologiesより)でスパイクしたエラープローンPCR反応によって増幅した。生成物をストレプトアビジンコーティングビーズ(Dynabeads M−280、Dynal)上に捕捉して、次に配列番号:43および配列番号:44のプライマーを用いて標準PCRによって増幅した。
Claims (37)
- O6−アルキルグアニン−DNAアルキルトランスフェラーゼ(AGT)突然変異体であって、
野生型ヒトAGTと比較したときに、
(a)DNA相互作用の低下;
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化;
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上;
(d)酸化条件下での安定性の向上;
(e)基質との反応後の細胞内での安定性の向上;
(f)基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上;
(g)試験管内溶解度の向上;
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下;ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下;
より選択される2つ以上の利点を示す、AGT突然変異体。 - 好都合な特性が
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(d)酸化条件下での安定性の向上、
(g)試験管内溶解度の向上、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(d)酸化条件下での安定性の向上、
(f)基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上、
(g)試験管内溶解度の向上、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(e)基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(e)基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下;
である、請求項1記載のAGT突然変異体。 - 好都合な特性が
(c’)E.coliにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(c’)E.coliにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(d)酸化条件下での安定性の向上、
(g)試験管内溶解度の向上、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(c’)E.coliにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(d)酸化条件下での安定性の向上、
(f’)基質との反応後の、細胞外での安定性の向上、
(g)試験管内溶解度の向上、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c’)E.coliにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c’)E.coliにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(e)基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c’)E.coliにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c’)E.coliにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
(e)基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
(i)DNAベース基質に対する反応性の低下、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下;
である、請求項1記載のAGT突然変異体。 - 好都合な特性が
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、
(d)酸化条件下での5倍を超える安定性、
(g)5倍を超える試験管内溶解度、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性;
あるいは
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、
(d)酸化条件下での5倍を超える安定性、
(f)基質との反応前および後の、細胞外での4倍を超える安定性、
(g)5倍を超える試験管内溶解度、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(a)2%未満のDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性、ならびに
(i)DNAベース基質に対する1%未満の反応性;
あるいは
(a)2%未満のDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、
(e)基質との反応後の細胞内での3倍を超える安定性、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性、ならびに
(i)DNAベース基質に対する1%未満の反応性;
あるいは
(a)2%未満のDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性、
(i)DNAベース基質に対する1%未満の反応性、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する2%未満の反応性;
あるいは
(a)2%未満のDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、
(e)基質との反応後の細胞内での3倍を超える安定性、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性、
(i)DNAベース基質に対する1%未満の反応性、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する2%未満の反応性;
である、請求項1または2記載のAGT突然変異体。 - 好都合な特性が
(c’)E.coliにおける、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(c’)E.coliにおける、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、
(d)酸化条件下での5倍を超える安定性、
(g)5倍を超える試験管内溶解度、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性;
あるいは
(c’)E.coliにおける、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、
(d)酸化条件下での5倍を超える安定性、
(f’)基質との反応後の、細胞外での4倍を超える安定性、
(g)5倍を超える試験管内溶解度、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上;
あるいは
(a)2%未満のDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c’)E.coliにおける、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性、ならびに
(i)DNAベース基質に対する1%未満の反応性;
あるいは
(a)2%未満のDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c’)E.coliにおける、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、
(e)基質との反応後の細胞内での3倍を超える安定性、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性、ならびに
(i)DNAベース基質に対する1%未満の反応性;
あるいは
(a)2%未満のDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c’)E.coliにおける、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性、
(i)DNAベース基質に対する1%未満の反応性、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する2%未満の反応性;
あるいは
(a)2%未満のDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c’)E.coliにおける、溶解性タンパク質としての5倍を超える発現収率および安定性の向上、
(e)基質との反応後の細胞内での3倍を超える安定性、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する5倍を超える反応性、
(i)DNAベース基質に対する1%未満の反応性、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する2%未満の反応性;
である、請求項1または3記載のAGT突然変異体。 - 好都合な特性が
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、
(d)酸化条件下での10倍を超える安定性、
(f)基質との反応前および後の、細胞外での6倍を超える安定性、
(g)10倍を超える試験管内溶解度、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性;
あるいは
(a)検出不能なDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、
(e)基質との反応後の細胞内での6倍を超える安定性、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性、ならびに
(i)DNAベース基質に対する検出不能な反応性;
あるいは
(a)検出不能なDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、
(e)基質との反応後の細胞内での6倍を超える安定性、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性
(i)DNAベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
(j)N9置換O6−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、
(d)酸化条件下での10倍を超える安定性、
(e)基質との反応後の細胞内での6倍を超える安定性、
(f)基質との反応前および後の、細胞外での6倍を超える安定性、
(g)10倍を超える試験管内溶解度、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性、ならびに
(i)DNAベース基質に対する検出不能な反応性;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c)各種の宿主における、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、
(d)酸化条件下での10倍を超える安定性、
(e)基質との反応後の細胞内での6倍を超える安定性、
(f)基質との反応前および後の、細胞外での6倍を超える安定性、
(g)10倍を超える試験管内溶解度、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性、
(i)DNAベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性;
である、請求項1または2記載のAGT突然変異体。 - 好都合な特性が
(c’)E.coliにおける、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、
(d)酸化条件下での10倍を超える安定性、
(f’)基質との反応後の細胞外での6倍を超える安定性、
(g)10倍を超える試験管内溶解度、ならびに
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性;
あるいは
(a)検出不能なDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c’)E.coliにおける、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、
(e)基質との反応後の細胞内での6倍を超える安定性、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性、ならびに
(i)DNAベース基質に対する検出不能な反応性;
あるいは
(a)検出不能なDNA結合、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c’)E.coliにおける、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、
(e)基質との反応後の細胞内での6倍を超える安定性、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性、
(i)DNAベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c’)E.coliにおける、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、
(d)酸化条件下での10倍を超える安定性、
(e)基質との反応後の細胞内での6倍を超える安定性、
(f’)基質との反応後の細胞外での6倍を超える安定性、
(g)10倍を超える試験管内溶解度、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性、ならびに
(i)DNAベース基質に対する検出不能な反応性;
あるいは
(a)DNA相互作用の低下、
(b)もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
(c’)E.coliにおける、溶解性タンパク質としての10倍を超える発現収率および安定性の向上、
(d)酸化条件下での10倍を超える安定性、
(e)基質との反応後の細胞内での6倍を超える安定性、
(f’)基質との反応後の細胞外での6倍を超える安定性、
(g)10倍を超える試験管内溶解度、
(h)O6−アルキルグアニン基質に対する10倍を超える反応性、
(i)DNAベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
(j)N9−置換O6−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性;
である、請求項1または3記載のAGT突然変異体。 - 野生型ヒトAGTの1〜25個のアミノ酸が、他のアミノ酸によって置換され、場合により連続鎖からの1〜5個のアミノ酸が1、2、または3つの位置で欠損または付加され、および/またはN末端の1〜4個のアミノ酸またはC末端の1〜40個のアミノ酸が欠損している、請求項1〜7のいずれか一項記載のAGT突然変異体。
- 2つ以上の修飾が
(A)AlaまたはValによって置換されたCys62;
(B)Ala−Asn、Asn−Asn、Ser−His、Ser−Ser、Pro−Pro、Pro−Ser、Pro−Thr、またはThr−Serによって置換されたGln115−Gln116;
(D)Val−His/Leu−Arg、Lys−Thr/Leu−Ser、Gln−Val/Leu−Ser、またはMet−Thr/Met−Valによって置換されたGly131−Gly132/Met134−Arg135、あるいはVal−His/Leuによって置換されたGly131−Gly132/Met134;
(E)Asn−Ile−Asn、Pro−Leu−Pro、Pro−Arg−Thr、Ser−Phe−Pro−、またはSer−His−Thr−によって置換されたCys150−Ser151−Ser152、あるいはPhe−AsnまたはArg−Asnによって置換されたCys150−Ser151、あるいはHis/Thr、Leu/Asn、Leu/Asn、Leu/ProまたはPro/Leuによって置換されたCys150/Ser152、あるいはSerまたはThrによって置換されたCys150;
(F)Phe/Arg/Gluによって置換されたPro140/Asn157/Ser159、あるいはMet/Trp/Valによって置換されたPro140/Asn157/Gly160、あるいはGly/Glu−Ala、Gly/Asn−Trp、Pro/Gln−CysまたはGly−Gln−Trpによって置換されたAsn157/Ser159−Gly160、あるいはGly/Gluによって置換されたAsn157/Ser159、あるいはGlyまたはArgによって置換されたAsn157;ならびに
(G)Gly182の後の切断;
そして、場合により、1〜10個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項8記載のAGT突然変異体。 - 3つ以上の修飾が
(A)AlaまたはValによって置換されたCys62;
(B)Ala−Asn、Asn−Asn、Ser−His、Ser−Ser、Pro−Pro、Pro−Ser、Pro−Thr、またはThr−Serによって置換されたGln115−Gln116;
(c)Alaによって置換されたLys125およびThr−Alaによって置換されたAla127−Arg128;
(D)Val−His/Leu−Arg、Lys−Thr/Leu−Ser、Gln−Val/Leu−Ser、またはMet−Thr/Met−Valによって置換されたGly131−Gly132/Met134−Arg135、あるいはVal−His/Leuによって置換されたGly131−Gly132/Met134;
(E)Asn−Ile−Asn、Pro−Leu−Pro、Pro−Arg−Thr、Ser−Phe−Pro−、またはSer−His−Thr−によって置換されたCys150−Ser151−Ser152、あるいはPhe−AsnまたはArg−Asnによって置換されたCys150−Ser151、あるいはHis/Thr、Leu/Asn、Leu/Asn、Leu/ProまたはPro/Leuによって置換されたCys150/Ser152、あるいはSerまたはThrによって置換されたCys150;
(F)Phe/Arg/Gluによって置換されたPro140/Asn157/Ser159、あるいはMet/Trp/Valによって置換されたPro140/Asn157/Gly160、あるいはGly/Glu−Ala、Gly/Asn−Trp、Pro/Gln−CysまたはGly−Gln−Trpによって置換されたAsn157/Ser159−Gly160、あるいはGly/Gluによって置換されたAsn157/Ser159、あるいはGlyまたはArgによって置換されたAsn157;ならびに
(G)Gly182の後の切断;
そして、場合により、1〜10個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項8記載のAGT突然変異体。 - 2つ以上の修飾が
(A)Alaによって置換されたCys62;
(B)Ser−Hisによって置換されたGln115−Gln116;
(D)Lys−Thr/Leu−Serによって置換されたGly131−Gly132/Met134−Arg135、またはVal−His/Leuによって置換されたGly131−Gly132/Met134;
(E)Asn−Ile−Asnによって置換されたCys150−Ser151−Ser152、またはSerもしくはThrによって置換されたCys150;
(F)あるいはGly/Gluによって置換されたAsn157/Ser159;ならびに
(G)Gly182の後の切断;
そして、場合により、1〜10個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項8記載のAGT突然変異体。 - 3つ以上の修飾が
(A)Alaによって置換されたCys62;
(B)Ser−Hisによって置換されたGln115−Gln116;
(C)Alaによって置換されたLys125およびThr−Alaによって置換されたAla127−Arg128;
(D)Lys−Thr/Leu−Serによって置換されたGly131−Gly132/Met134−Arg135、またはVal−His/Leuによって置換されたGly131−Gly132/Met134;
(E)Asn−Ile−Asnによって置換されたCys150−Ser151−Ser152、またはSerもしくはThrによって置換されたCys150;
(F)あるいはGly/Gluによって置換されたAsn157/Ser159;ならびに
(G)Gly182の後の切断;
そして、場合により、1〜10個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項8記載のAGT突然変異体。 - 3つ以上の修飾が
(A)Alaによって置換されたCys62;
(B)Ser−Hisによって置換されたGln115−Gln116;
(C)Alaによって置換されたLys125およびThr−Alaによって置換されたAla127−Arg128;
(E)Asn−Ile−Asnによって置換されたCys150−Ser151−Ser152、またはSerもしくはThrによって置換されたCys150;
(F)あるいはGly/Gluによって置換されたAsn157/Ser159;ならびに
(G)Gly182の後の切断;
そして、場合により、1〜10個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項8記載のAGT突然変異体。 - 修飾
Cys62Ala、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断;
Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser、Asn157Gly、Ser159Glu;
Gln115Ser、Gln116His、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Asn157Gly、Ser159Glu;ならびに
Cys62Ala、Gln115Ser、Gln116His、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断;
を有する突然変異体より選択される、請求項8記載のAGT突然変異体。 - 修飾Cys62Ala、Gln115Ser、Gln116His、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断を有する、請求項8記載のAGT突然変異体。
- 修飾Cys62Ala、Gln115Ser、Gln116His、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断および場合により1〜10個の追加のアミノ酸修飾を有する、請求項8記載のAGT突然変異体。
- 修飾Cys62Ala、Glnl15Ser、Gln116His、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断および場合により3〜7個の追加のアミノ酸修飾を有する、請求項16記載のAGT突然変異体。
- 修飾Cys62Ala、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser、Cys150Ser、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断、ならびに場合により
Gln115Ser、Gln116His;
Ser150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn;
Lys8Thr、Lys32Ile、Leu33Phe、Thr127Ala、Ser150Asp、Ser151Gly、Ala154Thr;
Lys32Ile、Leu33Phe、Ser150Val、Ser152Arg、Gly153Asp、Ala154Asp;
Lys32Ile、Leu33Phe、Ser150Gly、Ser151Gly、Ser152Asp、Ala154Asp;
Ser150Val、Ala154Asp;
Ser150Glu、Ser151Gly、Ser152Glu、Ala154Arg;
Lys8Thr、Thr127Ala、Ala154Thr;
Lys32Ile、Leu33Phe;
Ala154Thr;
Leu33Phe;
Ser151Gly;
Ser150Asp;
Thr127Ala;ならびに
Lys32Ile、Leu33Phe、およびLeu34の欠損;
より選択される更なる突然変異を有する、請求項16記載のAGT突然変異体。 - 修飾Cys62Ala、Gln115Ser、Gln116His、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断および場合により1〜10個の追加のアミノ酸修飾を有する、請求項8記載のAGT突然変異体。
- 修飾Cys62Ala、Gln115Ser、Gln116His、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断および場合により3〜7個の追加のアミノ酸修飾を有する、請求項19記載のAGT突然変異体。
- 修飾Cys62Ala、Gln115Ser、Gln116His、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Cys150Ser、Asn157G1y、Ser159G1u、Gly182の後の切断、ならびに場合により
Gln115Ser、Gln116His;
Ser150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn;
Lys8Thr、Lys32Ile、Leu33Phe、Thr127Ala、Ser150Asp、Ser151Gly、Ala154Thr;
Lys32Ile、Leu33Phe、Ser150Val、Ser152Arg、Gly153Asp、Ala154Asp;
Lys32Ile、Leu33Phe、Ser150Gly、Ser151Gly、Ser152Asp、Ala154Asp;
Ser150Val、Ala154Asp;
Ser150Glu、Ser151Gly、Ser152Glu、Ala154Arg;
Lys8Thr、Thr127Ala、Ala154Thr;
Lys32Ile、Leu33Phe;
Ala154Thr;
Leu33Phe;
Ser151Gly;
Ser150Asp;
Thr127Ala;ならびに
Lys32Ile、Leu33Phe、およびLeu34の欠損;
より選択される更なる突然変異を有する、請求項8記載のAGT突然変異体。 - 修飾Cys62Ala、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Cys150Ser、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断を有する、請求項8記載のAGT突然変異体。
- 修飾Cys62Ala、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser、Cys150Ser、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断を有する、請求項8記載のAGT突然変異体。
- 修飾Lys32Ile、Leu33Phe,Cys62Ala、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Cys150Gly、Ser151Gly、Ser152Asp、Ala154Asp、Asn157Gly、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断、ならびに場合により
Gln115Ser、Gln116His;
Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser;および
Leu34の欠損;
より選択される更なる突然変異を有する、請求項8記載のAGT突然変異体。 - 修飾Lys32Ile、Leu33Phe、Cys62Ala、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Cys150Val、Ser152Arg、Gly153Asp、Ala154Asp、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断および場合により
Gln115Ser、Gln116His;
Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser;ならびに
Leu34の欠損;
より選択される更なる突然変異を有する、請求項8記載のAGT突然変異体。 - 修飾Lys32Ile、Leu33Phe、Cys62Ala、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Cys150Asn、Ser151Ile、Ser152Asn、Ala154Thr、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断、ならびに場合により
Gln115Ser、Gln116His;
Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser;ならびに
Leu34の欠損;
より選択される更なる突然変異を有する、請求項8記載のAGT突然変異体。 - 修飾Lys32Ile、Leu33Phe、Cys62Ala、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Cys150Ser、Ala154Thr、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断、ならびに場合により
Gln115Ser、Gln116His;
Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser;および
Leu34の欠損;
より選択される更なる突然変異を有する、請求項8記載のAGT突然変異体。 - 修飾Cys62Ala、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Cys150Val、Ser152Arg、Gly153Asp、Ala154Asp、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断、ならびに場合により
Gln115Ser、Gln116His;
Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser;ならびに
Leu34の欠損;
を有する、請求項8記載のAGT突然変異体。 - 修飾Cys62Ala、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Cys150Gly、Ser151Gly、Ser152Asp、Ala154Asp、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断、ならびに場合により
Gln115Ser、Gln116His;
Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser;および
Leu34の欠損;
より選択される更なる突然変異を有する、請求項8記載のAGT突然変異体。 - 修飾Cys62Ala、Lysl25Ala,Ala127Thr、Arg128Ala、Cys150Glu、Ser151Gly、Ser152Glu、Ala154Arg、Asn157Gly、Ser159Glu、Gly182の後の切断、ならびに場合により
Gln115Ser、Gln116His;
Gly131Lys、Gly132Thr、Metl34Leu、Argl35Ser;および
Leu34の欠損;
より選択される更なる突然変異を有する、請求項8記載のAGT突然変異体。 - 対象となるタンパク質を検出および/または操作する方法であって、対象となるタンパク質を、請求項1〜30のいずれか一項記載のAGT突然変異体を有する融合タンパク質に組み込み、AGT融合タンパク質を、標識を担持する特定のAGT基質と接触させ、AGT融合タンパク質を、標識を認識および/処理するために設計された系において標識を使用して検出し、場合により更に操作する方法。
- 対象となるタンパク質およびAGT突然変異体のAGT融合タンパク質、ならびに更なるAGT融合タンパク質を含有するAGT融合タンパク質混合物を、AGT突然変異体または更なるAGTのいずれかに対して、選択性を有する特定の基質と接触させ、混合物を更なる基質によって処理し、対象となるタンパク質およびAGT突然変異体のAGT融合タンパク質を、標識を認識および/処理するために設計された系において標識を使用して検出し、場合により更に操作する、請求項31記載の方法。
- 混合物と特定の基質との反応終了後に、更なる基質をAGT融合タンパク質混合物に添加する、請求項32記載の方法。
- 更なる基質を、AGT融合タンパク質混合物に特定の基質と共に添加する、請求項32記載の方法。
- 標識を認識および/処理するために設計された系において、特定の基質の標識を、更なる基質の標識と相互作用させる、請求項34記載の方法。
- 特定の基質の標識およびさらなる基質の標識が、蛍光共鳴エネルギー移動対(FRET)の化合物または近接アッセイのための1つの蛍光物質および1つのクエンチャーである、請求項35記載の方法。
- 請求項1〜30のいずれか一項記載のAGT突然変異体および対象となるタンパク質を含む、AGT融合タンパク質。
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