JPH08507686A

JPH08507686A - 遺伝子操作酵素及びそれらの診断アッセイ用結合体

Info

Publication number: JPH08507686A
Application number: JP6520285A
Authority: JP
Inventors: ブレート，エレーン・エム; ブレナン，キヤサリン・エー; ブライドン，ドミニク・ピー; ジヤフエ，キーブ・デイー; クラフト，グラント・エー; マンデクキー，ウラジミール; マーチ，ステイーブン・シー; ラツセル，ジヨン・シー; ユエ，ビンセント・テイー
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-03-09
Filing date: 1994-03-09
Publication date: 1996-08-20
Also published as: AU6550294A; WO1994020636A1; US5843634A; EP0688364A4; CA2157767A1; EP0688364A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、遺伝子操作酵素、そのリガンド結合体、その製造、及びその定性又は定量アッセイでの使用に関する。ＡＰ−エピトープのようなハイブリッド酵素は、出発ＡＰ酵素の活性部位付近に挿入された外来アミノ酸部分（エピトープ）を有する。外来アミノ酸部分は被分析物質と結合し、この結合の結果、ハイブリッド酵素であるＡＰ−エピトープの酵素活性が変性する。酵素活性の変化は、被分析物質の存在又は量に依存する。他の実施態様では、ハイブリッド酵素は、ハイブリッド酵素生成のためにＡＰの活性部位付近に導入されたシステインからなる。ハイブリッド酵素上のシステインは、ハイブリッド酵素−リガンド結合体生成のためのリガンド（例えばテオフィリン、フェリチン、チロキシン又はジゴキシゲニン）の結合点として機能する。リガンドは、抗体、被分析物質又は該被分析物質の結合分子と結合し、この結合の結果、ハイブリッド酵素−リガンド結合体の酵素活性が変化又は変性する。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子操作酵素及びそれらの診断アッセイ用結合体発明の背景アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）は、タンパク質操作に適当となる幾つかの長所を有する酵素である。例えば、野生型タンパク質の配列を維持しつつも（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｎ．，Ｋｕａｎｇ，Ｗ．Ｊ．及びＣｈｅｎ，Ｅ．Ｙ．（１９８６）Ｇｅｎｅ４４，１２１−１２５）、ＤＮＡ配列中に固有の制限部位を有する（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｗ．，Ｓｈａｌｌｃｒｏｓｓ，Ｍ．Ａ．，Ｓｏｗａｄｓｋｉ，Ｊ．及びＴｏｍａｚｉｃ−Ａｌｌｅｎ，Ｓ．（１９９１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ４，８０１−８０４）、“ｐｈｏＡ”の名で知られる合成ＡＰ遺伝子が構築されている。合成ｐｈｏＡ遺伝子からは高レベルのＡＰが発現される。発現は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でｌａｃプロモーター制御下の高コピープラスミドを用いて行われた（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｗ．，Ｓｈａｌｌｃｒｏｓｓ，Ｍ．Ａ．，Ｓｏｗａｄｓｋｉ，Ｊ．及びＴｏｍａｚｉｃ−Ａｌｌｅｎ，Ｓ．（１９９１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ４，８０１−８０４）。ホモダイマータンパク質の結晶構造はＸ線回折によって決定されている（Ｓｏｗａｄｓｋｉ，Ｊ．Ｍ．，Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｍ．Ｄ．，Ｍｕｒｔｈｙ，Ｈ．Ｍ．Ｋ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｂ．Ａ．及びＷｙｃｋｏｆｆ，Ｈ．Ｗ．（１９８５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６，４１７−４３３；Ｋｉｍ，Ｅ．Ｅ．及びＷｙｃｋｏｆｆ，Ｈ．Ｗ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２１８，４４９−４６４）。構造からは、表面ループの位置、タンパク質の領域の構造適合性及び溶剤アクセシビリティー、並びにアミノ酸（ａ．ａ．）残基の触媒活性部位からの距離についての情報が得られる。一般に、活性部位の極めて近傍に点突然変異があってもＡＰ活性は破壊されず、場合によっては触媒速度が増加されることがある（Ｂｕｔｌｅｒ−Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ，Ｊ．Ｅ．，Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｄ．Ａ，及びＫａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５，４２７６−４２７８；Ｃｈａｉｄａｒｏｇｌｏｕ，Ａ．及びＫａｎｔｒｏｗｉｔｚ，Ｅ，Ｒ．（１９８９）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ３，１２７−１３２；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｗ．，Ｓｈａｌｌｃｒｏｓｓ，Ｍ．Ａ．，Ｓｏｗａｄｓｋｉ，Ｊ．及びＴｏｍａｚｉｃ−Ａｌｌｅｎ，Ｓ．（１９９１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ４，８０１−８０４）。最後に、ＡＰの触媒活性は高いが、基質特異性は低い。活性部位周辺領域は広範囲の種々の分子を受容するが、酵素は基質のリン酸部分のみを認識し結合する（Ｓｏｗａｄｓｋｉ，Ｊ．Ｍ，，Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｍ．Ｄ．，Ｍｕｒｔｈｙ，Ｈ．Ｍ．Ｋ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｂ．Ａ．及びＷｙｃｋｏｆｆ，Ｈ．Ｗ．（１９８５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．１８６，４１７−４３３）。高レベルのペプチドホルモンを発現するため（Ｆｒｅｉｍｕｔｈ，Ｐ．Ｉ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．及びＫａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，８９６−９０１；Ｌａｎｇｅｎ，Ｈ．Ｔ．及びＴａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ及びＧｅｎｅｔｉｃs １４，１−９）、抗原表示に及ぼすタンパク質の構成（contex）の作用を試験するため（Ｆｒｅｉｍｕｔｈ，Ｐ．及びＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９０）Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４１，９９５− １００１）、並びに酵素−イムノアッセイ及び酵素−レセプターアッセイに使用するためのレセプターに結合するヘビ神経毒を発現するため（Ｇｉｌｌｅｔ，Ｄ．，Ｄｕｃａｎｃｅｌ，Ｆ．，Ｐｒａｄｅｌ，Ｅ．，Ｌｏｎｅｔｔｉ，Ｍ．，Ｍｎｅｚ，Ａ．及びＢｏｕｌａｉｎ，Ｊ．−Ｃ．（１９９２）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ５，２７３−２７８）のベヒクルとして使用すべくＡＰの内部領域にペプチドを挿入することが記載され、ＡＰの表面適合性及び変動性が示されている（Ｆｒｅｉｍｕｔｈ，Ｐ．Ｉ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．及びＫａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，８９６−９０１）。１５個のアミノ酸からなるホルモンペプチドダイノルフィンの挿入はアミノ酸１６６と１６７の間及び１９０と１９１の間で容認され（Ｆｒｅｉｍｕｔｈ，Ｐ．Ｉ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．及びＫａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，８９６−９０１）、ソマトスタチン−１４を含む１１及び１９個のアミノ酸からなるペプチドは、酵素活性に有意に影響を及ぼすことなくＡＰ中のアミノ酸９２〜９４を置換した（Ｌａｎｇｅｎ，Ｈ．Ｔ．及びＴａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓ１４，１−９）。ＡＰ−ソマトスタチン組換えタンパク質は抗ソマトスタチンポリクローナル抗体及びソマトスタチンレセプターによって結合され、該ペプチドが組換えタンパク質の生の（native）コンホーメーションにおいて表面に露出されることが判る。６２個のアミノ酸からなるヘビ神経毒エラブトキシンはＡＰのアミノ６と７の間に挿入された。融合タンパク質においてＡＰ活性は保持され、神経毒はニコチンアセチルコリンレセプターに結合する生物学的機能を保持する（Ｇｉｌｌｅｔ，Ｄ．，Ｄｕｃａｎｃｅｌ，Ｆ．，Ｐｒａｄｅｌ，Ｅ．，Ｌｏｎｅｔｔｉ，Ｍ．，Ｍｎｅｚ，Ａ．及びＢｏｕｌａｉｎ，Ｊ．−Ｃ．（１９９２）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ５，２７３−２７８）。ＡＰは、診断アッセイ、特に特異的結合アッセイ方式における酵素検出試薬として一般に使用されている。通常、かかる特異的結合アッセイ方式は、結合分子対の第１結合分子が結合分子対の第２結合分子に特異的に結合し得る能力に依存するもので、酵素で標識された結合分子の一方を含む結合体を使用してかかる結合の程度が決定される。例えばかかる結合分子対が被分析物質とかかる被分析物質に対する抗体である場合、被分析物質との結合反応に関与したまたはしなかった結合体中に存在する酵素の量によって結合の程度が決定される。ここで、検出及び測定される酵素の量は検査試料中に存在する被分析物質の量に相関し得る。リガンドの分子への結合は当分野において公知の方法に従って従来から行われているが、かかる方法は非特異的であり、所望の分子のリガンドへの結合の位置、向き及び数を正確に制御することはできない。分子が酵素であるならば、リガンドが非特異的に結合することで望ましい固有の酵素活性が損なわれることがあるし、特異的結合アッセイの場合では、結合が酵素の活性部位からはるか遠くで起こると、結合分子が結合することで形成された結合体の変性は不十分または僅かでしかなく、アッセイの動的範囲は少なく、バックグラウンドシグナルは高くなり得る。発明の要約本発明は、遺伝子操作タンパク質、例えばハイブリッド酵素、その製造、並びに、定性及び定量分析におけるその使用に係わる。かかるハイブリッド酵素の例としてはＡＰ −エピトープ及びハイブリッド酵素−リガンド結合体がある。本発明は更にハイブリッド酵素をコードするＤＮＡ配列を提供する。かかるハイブリッド酵素は新規の特性を有し、被分析物質の定性及び定量両方の分析において新規方法を可能にする。本発明の１つの実施態様に従うハイブリッド酵素は、出発酵素と、出発酵素のアミノ酸配列中に置換または挿入された外来アミノ酸部分とを含んで提供される。出発酵素のアミノ酸配列中に置換または挿入された外来アミノ酸部分は、出発酵素の活性部位近傍の領域に存在し、出発酵素の酵素活性が場合によっては変性されたハイブリッド酵素を与える。外来アミノ酸部分には更に結合分子が結合し得、このような結合により、ハイブリッド酵素の活性は変性または調節され得る。本発明の別の実施態様によれば、ハイブリッド酵素は、外来アミノ酸部分が出発酵素の活性部位近傍のアミノ酸配列に置換または挿入によって導入されている出発酵素からなる。ハイブリッド酵素上の外来アミノ酸部分は、リガンドのカップリングまたは結合のための付着点として作用する。リガンドが酵素と結合したとき、そのリガンドに更に結合分子が結合することができ、ハイブリッド酵素の酵素活性が変性され得る。本発明の更に別の実施態様によれば、かかるハイブリッド酵素を定性または定量分析に使用する方法が提供される。特に本発明方法は、（１）被分析物質を含む検査試料と、本発明のハイブリッド酵素と、被分析物質の結合分子とを接触させ、反応混合物を形成するステップ；（２）前記反応混合物を、出発酵素に対する基質と接触させるステップ；及び（３）反応混合物中に存在する被分析物質の種類または量に従い、ハイブリッド酵素の酵素活性の変化をモニターするステップを含む。ステップ（２）は、反応混合物を定常または平衡状態としてから実施することもできるし、またステップ（１）は順次または同時に実施することができる。本発明によれば、酵素活性の変化は検査試料中の被分析物質の存在または量に依存する。即ちハイブリッド酵素は、（１）抗体の存在または量を直接に、または（２）結合分子への結合の競合によって抗原の存在または量を間接的に検出するアッセイの基礎をなす。図面の簡単な説明図１は、変性のために選択される領域にラベルを付けたＡＰの３次元構造図である。図２Ａ〜図２Ｃは、構築に使用したユニーク制限部位を含む合成ｐｈｏＡ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。図２Ｄ〜２Ｅは、成熟ＡＰのアミノ酸配列を示す。図３Ａ〜３Ｄは、ｐＡＰＩ（ＡＰ−エピトープをコードするプラスミド）の構築に使用されるオリゴデオキシリボヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。図４は、エピトープ挿入または置換領域のＡＰ−エピトープのアミノ酸配列を示す。図５Ａ〜図５Ｂは精製ＡＰ−エピトープのウェスターンブロットを示す。一次抗体は抗ｇｐ１２０ＭＡｂであり、二次抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧであった。図５Ａ．）天然ゲル：レーン１，ヘモグロビンタンパク質マーカー；レーン２，ブランク；レーン３，ＡＰ（１ｍｇ）；レーン４，ＡＰＩ１（１ｍｇ）；レーン５，ＡＰＩ６（１ｍｇ）；レーン６，ＡＰＩ７（１ｍｇ）。図５Ｂ．）ＳＤＳゲル：レーン１，分子量マーカー；レーン２，ＡＰ（０．２ｍｇ）；レーン３，ＡＰＩ１（０．２ｍｇ）；レーン４，ＡＰＩ６（０．２ｍｇ）；レーン５，ＡＰＩ７（０．２ｍｇ）；レーン６，ブランク。図６は、基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）を使用したときの種々の濃度の抗ｇｐ１２０ＭＡｂによるＡＰ−エピトープ酵素活性の変性を示す。ＡＰ−エピトープは５ｎＭ存在し、活性は、抗ｇｐ１２０ＭＡｂの不在下でのＰＮＰＰの加水分解の初速度に対して表わしてある。図７は、基質としてＦＤＰを使用したときの種々の濃度の抗ｇｐ１２０ＭＡｂによるＡＰ−エピトープ酵素活性の変性を示す。ＡＰ−エピトープは５ｎＭ存在し、活性は、抗ｇｐ１２０ＭＡｂの不在下でのＦＤＰの加水分解の初速度に対して表わしてある。図８は、基質として４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）を使用したときの抗ｇｐ１２０ＭＡｂによるＡＰＩ１酵素活性の変性を示す。ＡＰＩ１は０．０５ｎＭ存在し、活性は、抗ｇｐ１２０ＭＡｂの不在下でのＭＵＰの加水分解の初速度に対して表わしてある。図９は、ＰＮＰＰを基質としたときの抗ｇｐ１２０ＭＡｂによるＡＰＩ１酵素活性の変性に及ぼすＨＩＶ−１ｇｐ１２０ペプチドの作用を示す。ＡＰＩ１（５ｎＭ）とペプチドを前混合してから抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（２０ｎＭ）を添加した。活性は、所与の濃度のペプチドの存在下で且つ抗ｇｐ１２０ＭＡｂの不在下でＡＰＩ１をアッセイしたときの活性に対して表わしてある。図１０Ａは、抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（２０ｎＭ）及びペプチド（ｐｅｐ）２４５０１０（４μＭ）の存在下または不在下でのＡＰＩ１（５μＭ）による基質ＰＮＰＰの経時的加水分解速度を示す。ＡＰＩ１及びペプチドを含む反応（記号“ＡＰＩ１＋ｐｅｐ”で示す）においてはＡＰＩ１とペプチドを相互に混合した。ＡＰＩ１、ペプチド及び抗ｇｐ１２０ＭＡｂを含む反応（記号“ＡＰＩ１＋ｐｅｐ＋ＭＡｂ”で示す）においては、ＡＰＩ１とペプチドを前混合してから抗ｇｐ１２０ＭＡｂを添加した。ＡＰＩ１と抗ｇｐ１２０ＭＡｂを含む反応（記号“ＡＰＩ１＋ＭＡｂ”で示す）においては、ＡＰＩ１と抗ｇｐ１２０ＭＡｂを相互に混合した。ＡＰＩ１、抗ｇｐ１２０ＭＡｂ及びペプチドを含む反応（記号“ＡＰＩ１＋ＭＡｂ＋ｐｅｐ”で示す）においては、ＡＰＩ１及び抗ｇｐ１２０ＭＡｂを前混合してからペプチドを添加した。図１０Ｂは、ＡＰＩ１−抗ｇｐ１２０ＭＡｂ複合体の解離速度定数の決定を示す。データポイントは、図１０Ａのごとく実施した２つの独立の試験の結果を表わす。図１１Ａ及び１１Ｂは、ＡＰ１と抗ｇｐ１２０ＭＡｂとの間の複合体形成に対するゲルシフトアッセイを示す。図１１Ａ．）１２．５％天然ゲル：レーン１，ヘモグロビンタンパク質マーカー；レーン２，ＡＰ（１．１μＭ）；レーン３，ＡＰ（１．１μＭ）＋抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（０．６７μＭ）；レーン４，ＡＰＩ１（１，１μＭ）；レーン５，ＡＰＩ１（１．１μＭ）＋抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（０．６７μＭ）。図１１Ｂ．）７．５％天然ゲル：レーン１，ヘモグロビンタンパク質マーカー；レーン２，ＡＰＩ１（０．５μＭ）；レーン３，ＡＰＩ１（０，５μＭ）＋抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（０．１μＭ）；レーン４，ＡＰＩ１（０．５ μＭ）＋抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（０．２μＭ）；レーン５，ＡＰＩ１（０．５μＭ）＋抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（０．３μＭ）；レーン６，ＡＰＩ１（０，５μＭ）＋抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（０．５μＭ）；レーン７，ＡＰＩ１（０．５μＭ）＋抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（１．０μＭ）；レーン８，ＡＰ（０．５μＭ）。図１２は、ＡＰ−エピトープによる、試料中の抗体の存在に対する直接ホモジニアスアッセイの概略図である。図１３は、ＡＰ−エピトープによる、試料中の抗原の存在に対する競合ホモジニアスアッセイの概略図である。図１４は、ハイブリッド酵素−リガンド結合体による、試料中の被分析物質の存在に対する競合ホモジニアスアッセイの概略図である。ハイブリッド酵素−リガンド結合体は図では「触媒−ハプテン」と示されている。図１５Ａ〜１５Ｃは、ＡＰ及び天然残基（下線部）がシステインで置換されているハイブリッド酵素（システイン突然変異体）のアミノ酸配列を示す。図１６Ａ及び１６Ｂは、リガンド誘導体の構造式を示す。Ｔ_nは、リンカーアーム中のメチレンの数が異なるテオフィリン誘導体を指す。Ｔｈｙはチロキシン誘導体を示しており、ＴｈｙＡ、ＴｈｙＢ及びＴｈｙＣはリンカーアーム中のメチレン数が異なるものを表わし、Ｄはジゴキシゲンを表わし、ＤＡ、ＤＢ、ＤＣはリンカーアーム中のメチレン数が異なるものを表わし、ＦＤＰ、ＤＭＦＤＰ及びＰＮＰＰはＡＰの種々の基質を表わす。図１７は、テオフィリンハイブリッド酵素−リガンド結合体の酵素活性を示す。図１８Ａ及び１８Ｂは、テオフィリン誘導体が種々の長さのリンカー基を介してハイブリッド酵素の種々の位置に付着しているハイブリッド酵素−リガンド結合体における飽和量の抗体の存在下での残留酵素活性を示す。図１８Ａはヒツジポリクローナル抗体の作用を示し、図１８Ｂはマウスモノクローナル抗体の作用を示す。図１９は、種々のメチレンリンカー基を有するリガンドとしてチロキシン誘導体を含むハイブリッド酵素−リガンド結合体に、モノクローナル抗体を添加することの作用を示す。Ｔｈｙ−３、ＴｈｙＡ−３、ＴｈｙＢ−３及びＴｈｙＣ−３はＡＰＫＪ３に結合した種々のチロキシン誘導体を指す。図２０は、種々の濃度のヒツジ抗体の存在下で、μｌ量の血清ベースのテオフィリン校正試薬をテオフィリンハイブリッド酵素−リガンド結合体（Ｔ１−３）に添加することの作用を示す。図２１は、テオフィリン試料中に投入された内在ＡＰ試料の相関図を示す。図２２は、ハイブリッド酵素−リガンド結合体、ＣＴＰ−ＡＰＫＪ４、抗体及びｈＣＧ標準を使用したヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の校正曲線を示す。図２３は、フェリチンハイブリッド酵素−リガンド結合体の酵素活性減退を示す。発明の詳細使用する記号は以下の通りとする：ヌクレオチド：ＡアデノシンＣシトシンＧグアニンＴチミンアミノ酸：ＡｌａＡアラニンＡｒｇＲアルギニンＡｓｎＮアスパラギンＡｓｐＤアスパラギン酸ＣｙｓＣシステインＧｌｎＱグルタミンＧｌｕＥグルタミン酸ＧｌｙＧグリシンＨｉｓＨヒスチジンＩｌｅＩイソロイシンＬｅｕＬロイシンＬｙｓＫリシンＭｅｔＭメチオニンＰｈｅＦフェニルアラニンＰｒｏＰプロリンＳｅｒＳセリンＴｈｒＴトレオニンＴｒｐＷトリプトファンＴｙｒＹチロシンＶａｌＶバリンａ．ａ．アミノ酸ＡＰアルカリ性ホスファターゼＡＴＰアデノシン三リン酸ＢＳＡウシ血清アルブミンＢＣＩＰ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸ＤＭＦＤＰジメチル−フルオレセインジホスフェートＤＭＳＯジメチルスルホキシドＤＴＴジチオトレイトールＥＤＴＡエチレンジアミン四酢酸ＦＤＰフルオレセインジホスフェートＨＰＬＣ高速液体クロマトグラフイーＩＰＴＧイソプロピルＤ−チオガラクトピラノシドＭＡｂモノクローナル抗体ＭＵＰ４−メチルウンベリフェリルホスフェートＰＮＰＰｐ−ニトロフェニルホスフェートＳＤＳドデシル硫酸ナトリウムＸ−ｇａｌ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル β−Ｄ−ガラクトピラノシド本発明は広義にはタンパク質に適用可能であるが、特に遺伝子操作タンパク質、例えば酵素並びにその定性及び定量分析における使用に係わる。酵素以外のタンパク質の例としては、ヘムタンパク質、担体及びレセプタータンパク質が挙げられる。挿入または置換外来アミノ酸部分を受容し、遺伝子操作タンパク質の変化に影響する結合分子を結合するよう遺伝子操作し得る任意のタンパク質を使用し得る。本発明によれば、好ましくはタンパク質安定性及び触媒活性が高い酵素を、ハイブリッド酵素に変性するための「出発」酵素として使用し得る。出発酵素は、天然酵素、天然酵素の酵素活性フラグメント、または遺伝子操作酵素とし得る。出発酵素は、ポリペプチド、リボチームまたは触媒性抗体（catalytic antibodies）の形態であり得る。出発酵素としては、限定的ではないが、アデノシンデアミナーゼ；アルカリ性ホスファターゼ；α−アミラーゼ；細菌ルシフェラーゼ；β−ガラクトシダーゼ；β−ガラクトシダーゼフラグメント；β−ラクタマーゼ；カルボニックアンヒドラーゼ；カタラーゼ；ホタルルシフェラーゼ；グルコースオキシダーゼ；グルコース−６ −ホスフェートデヒドロゲナーゼ；グルコシダーゼ；ヘキソキナーゼ；西洋ワサビペルオキシダーゼ；インベルターゼ；イソクエン酸デヒドロゲナーゼ；リゾチーム；リンゴ酸デヒドロゲナーゼ；マイクロペルオキシダーゼ；６−ホスホフラクターゼ；ホスホグルコムターゼ；ホスホリパーゼＣ；ピルビン酸キナーゼ；ウレアーゼ；及びキサンチンオキシダーゼなどが挙げられる。本明細書において使用される「活性部位」なる用語は、特異的基質に結合し、それを触媒的またはその他の方式で生成物に変換する酵素の部分を意味する。酵素の活性部位は触媒中心と基質結合部位とからなる。活性部位は、キモトリプシンのように酵素分子の表面に存在することもあるし、リゾチーム、パパイン、カルボニックアンヒドラーゼまたはリボヌクレアーゼのように裂溝中に存在することもある。活性部位は通常は限定数のアミノ酸残基のみを含む。外来アミノ酸部分は、出発酵素の活性部位の触媒機構に関与する位置にあるアミノ配列中には置換または挿入されないのが好ましい。外来アミノ酸部分は、活性部位の中心から通常は約１〜約５０＝、好ましくは約２〜約２５＝、最も好ましくは約３〜１５＝離れた位置にある配列中に置換または挿入される。タンパク質の表面にあるループ中の位置及び残基は、出発タンパク質のアミノ酸配列中に外来アミノ酸部分を置換または挿入するのによい位置である。更に、活性部位が出発酵素の腔部内にある場合、腔部を取り囲む領域は、出発タンパク質のアミノ酸配列中に外来アミノ酸部分を置換または挿入するのによい位置である。ある酵素に対して、かかる挿入または置換外来アミノ酸部分のために「アロステリック部位」を選択することができる。アロステリック部位は、その部位での結合事象により酵素の酵素活性が調節されるように分子に結合し得る。本明細書において使用される「被分析物質」とは、本発明を使用して検査試料において検出される物質である。被分析物質は、それに対する天然結合分子（例えば抗体）が存在するかまたはそれに対する結合分子を製造し得る任意の物質とし得、被分析物質はアッセイにおいて１つ以上の結合分子に結合し得る。従って被分析物質としては、抗原性物質、ハプテン、抗体及びこれらの組合せを挙げることができる。被分析物質はタンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、ホルモン、ステロイド、ビタミン、脂質、核酸、ペプチド、微量元素、治療目的で投与されたもの及び不正に投与されたものを含む薬剤、細菌、ウイルス、及びこれらの物質の代謝物またはそれに対する抗体であり得る。本明細書において使用される「結合分子」とは、結合分子対、即ち一方の分子が化学的または物理的手段を介して第２の分子に特異的に結合する２種類の異なる分子の一方である。抗原及び抗体結合分子のほか、他の結合分子としては、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、（核酸配列を検出するためにＤＮＡハイブリダイゼーションに使用されるプロープと捕捉される核酸配列を含む）相補的核酸配列、エフェクター分子とレセプター分子、酵素補因子と酵素、酵素阻害物質と酵素などが挙げられる。更に結合分子は、元の結合分子の類縁物であるものを含み得る。例えば、被分析物質と共通の少なくとも１つのエピトープまたは結合部位を有する被分析物質の誘導体またはフラグメントのような被分析物質類縁物を使用することもできる。免疫反応性結合分子としては、抗原、ハプテン、抗体、及び、組換えＤＮＡ法またはペプチド合成によって形成されるものを含むこれらの複合体が挙げられる。本明細書において使用される「結合」なる用語は、一方の部分が他方に化学的にカップリングして結合体を形成することを意味する。タンパク質に共有結合するためのカップリング剤が米国特許第５，０５３，５２０号明細書に記載されており、該明細書の内容は参照により本明細書に包含されるものとする。酵素を抗体にカップリングするためのホモ二官能性剤は、１９９２年４月３０日公開ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ９２／０７２６８号に記載のごとく当分野において公知である。本明細書において使用される「外来アミノ酸配列」とは、１つ以上のアミノ酸またはアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。ペプチドは、ポリペプチド、エピトープまたはエピトープを模倣し得る構造体であり得る。外来アミノ酸部分が出発タンパク質のアミノ酸配列中に置換または挿入され、その結果遺伝子操作タンパク質が得られる場合、外来アミノ酸部分は、被分析物質用の結合表面またはリガンド用の結合部位のいずれかを形成し得る。酵素は遺伝子操作タンパク質の一例である。外来アミノ酸部分が出発酵素のアミノ酸配列中に置換または挿入されるとハイブリッド酵素が与えられる。外来アミノ酸部分はハイブリッド酵素の酵素活性に３種類の態様で影響を及ぼし得る。第１には、外来アミノ酸を出発酵素のアミノ酸配列中に置換または挿入してもハイブリッド酵素の酵素活性にそれほど影響しないが、被分析物質がハイブリッド酵素に結合するとハイブリッド酵素の酵素活性は低下する。第２には、外来アミノ酸部分を出発酵素のアミノ酸配列中に置換または挿入してもハイブリッド酵素の酵素活性にそれほど影響しないが、被分析物質がハイブリッド酵素に結合するとハイブリッド酵素の酵素活性は増強される。第３には、外来アミノ酸部分を出発酵素のアミノ酸配列中に置換または挿入するとハイブリッド酵素の酵素活性に著しく影響し、更に被分析物質がハイブリッド酵素に結合するとハイブリッド酵素の酵素活性が増強される。本明細書において使用される「ハイブリッド酵素」とは、出発酵素のアミノ酸配列中に置換または挿入された外来アミノ酸部分の産物である。外来アミノ酸部分は、１つ以上のアミノ酸またはアミノ酸配列を含むペプチドであり得る。外来アミノ酸部分はエピトープを模倣することもできるし、またはリガンドの結合部位ともなり得る。「リガンド」は、別の化学基または分子に結合し得る化学基または分子と定義される。リガンドは、被分析物質の結合に対して競合するかまたはそれを妨害し得る分子種である。かかるリガンドは小分子でも巨大分子でもよい。リガンドの例としてはテオフィリン、抗生物質、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質及び核酸が挙げられる。好ましいのは、被分析物質のエピトープを提示または模倣する小分子量オリゴペプチドを使用することである。リガンドは、出発酵素のアミノ酸配列中に挿入または置換された外来アミノ酸部分に化学的リンカーを介して共有結合される。ヘテロもしくはホモ二官能性または光反応性リンカーを使用し得る。リンカーの例としてはカルボジイミド、グルタルアルデヒド、ハロホルメート、ヨードアセトアミド、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、イミデート、アジ化アリール、アリール酸ヒドラジド、及びｐ− ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオネートが挙げられる。本明細書において使用される「反応混合物」とは、検査試料と、検査試料中の被分析物質を検出すべく本発明を適用するのに使用される他の物質との混合物を意味する。反応混合物は希釈剤及び緩衝剤を含み得る。本明細書において使用される「検査試料」とは、本発明を使用して検出及び分析される被分析物質を含む試料を意味する。検査試料は、被分析物質以外の他の物質を含み得、液体または固体の物理的特性を有し得、例えば液体移動流を含む、任意のサイズ及び容積のものとし得る。検査試料は結合分子が被分析物質または被分析物質類縁物と特異的に結合するのを妨害しない限りは、被分析物質以外の任意の物質を含み得る。検査試料の例としては、限定的ではないが、血清、血漿、髄液、痰、精液、羊水、尿、唾液、他の体液、並びに、地下水や廃水、土壌抽出物及び殺虫剤残留物といった環境サンプルが挙げられる。本発明の１つの実施態様においては、外来アミノ酸部分はエピトープであり得る。外来アミノ部分は出発酵素の表面に直接挿入することもできるし、出発酵素の表面にあるアミノ酸配列の一部を置換するよう使用することもできる。本明細書において使用される「挿入」なる用語は、Ｎ末端またはＣ末端融合とは逆の、内部融合を意味する。即ち、外来アミノ酸部分が直鎖状ペプチドである場合、ペプチドの２つの末端、即ち両端が、出発酵素の表面にある隣り合う２つのアミノ酸に接続、結合、または融合される。そうすると外来アミノ酸部分は、出発酵素の表面にある隣り合う２つのアミノ酸の間に位置する。この外来アミノ酸部分から形成された結合表面は更に、被分析物質または抗体といった結合分子に結合することができる。ハイブリッド酵素の酵素活性は、（１）外来アミノ酸部分が出発酵素のアミノ酸配列の触媒活性部位の近傍の領域に置換または挿入され、且つ（２）外来アミノ酸部分がその結合分子を結合したときに変性または調節される。即ち、外来アミノ酸部分から形成された結合表面に結合分子が結合したとき、外来アミノ酸部分が出発酵素の活性部位の近傍にあるならば、ハイブリッド酵素の酵素活性は調節される。また、外来アミノ酸部分は活性部位から離れた部位にあり得るが、それでも酵素活性を調節し得る。被分析物質は、テオフィリンのごとき小分子または抗体のごとき巨大分子とし得る。本発明の１つの実施態様におけるハイブリッド酵素が定性または定量分析に適当であるためには、ハイブリッド酵素は以下の基準を満足する必要がある：（１）外来アミノ酸部分が出発酵素のアミノ酸配列中に置換または挿入されているが、得られたハイブリッド酵素の酵素活性はそれほど破壊されていない；（２）得られたハイブリッド酵素内の外来アミノ酸部分が更に結合分子を結合し得る；及び（３）ハイブリッド酵素の結合部位に結合したとき、結合分子がハイブリッド酵素の酵素活性を調節する。エピトープとして作用する外来アミノ酸部分を含むハイブリッド酵素（ハイブリッド酵素−エピトープ）本発明は一般にタンパク質に適用可能であるが、特に遺伝子操作タンパク質、並びに定性及び定量分析におけるそれらの使用に係わる。外来アミノ酸部分が出発タンパク質のアミノ酸配列中に置換または挿入される。外来アミノ酸部分は、結合分子に対する結合部位として作用し、結合分子によって結合されると、遺伝子操作タンパク質の変化が測定される。遺伝子操作タンパク質の一例は酵素であり得る。ペプチド配列が出発酵素のアミノ酸配列中に置換または挿入され得る。抗体を直接検出するための遺伝子操作酵素を構築するためには、抗原のエピトープを出発酵素のアミノ酸配列中に置換または挿入し、ハイブリッド酵素−エピトープを得る。例えばＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２に対するハイブリッド酵素−エピトープを用いたアッセイは、出発酵素のアミノ酸配列中に挿入または置換されたＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２ｇｐ４１ペプチド由来のアミノ酸５８４〜６１４によってコードされるＨＩＶ−１ｇｐ１２０タンパク質のＶ３ループを含む。競合によって抗原を検出するハイブリッド抗原−エピトープを構築するためには、抗原上の既定のエピトープに対する親和性を有する抗体が必要であり、既定エピトープが、出発酵素のアミノ酸配列中に置換または挿入される。一般にエピトープのごとき外来アミノ酸部分は、出発タンパク質のアミノ酸配列中に以下のように置換または挿入される。該タンパク質の遺伝子を発現プラスミド中にクローニングする。これは、ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ” ）を使用し、原核性または真核性微生物たる天然酵素源由来の遺伝子のＤＮＡ配列を増幅することにより行い得る。ＰＣＲ増幅過程には、タンパク質の部分アミノ酸配列、遺伝子の部分ヌクレオチド配列、またはフランキング配列のいずれかの知識が使用される。遺伝子は、該タンパク質をコードするＤＮＡを直接化学合成して得ることもできる。これには、全タンパク質配列または遺伝子の全ヌクレオチド配列のいずれかの知識が必要である。一旦遺伝子をプラスミド中にクローニングしたならば、ＤＮＡ配列決定により全ヌクレオチド配列を得ることができ、該プラスミドを相容性宿主、例えば細菌、酵母または哺乳動物細胞中に導入することによりタンパク質を発現させる。酵素の３次元構造が既知であるならば、出発酵素のアミノ酸配列中に置換または挿入されたエピトープの部位は、出発酵素の活性部位近傍にある表面ループの領域であるように選択されるのが好ましい。遺伝子のヌクレオチド配列から、所望のハイブリッド酵素−エピトープをコードする遺伝子を構築するように制限フラグメントの置換を設計する。ハイブリッド酵素−エピトープの構造が既知でないならば、エピトープを出発酵素のアミノ酸配列中に、タンパク質全体にランダムに置換または挿入し、得られたハイブリッド酵素−エピトープを酵素活性の保持についてスクリーニングする。出発酵素のアミノ酸配列中に置換または挿入されたランダムなエピトープは、遺伝子中の制限部位に適当なＤＮＡフラグメントを用いて作製し得る。タンパク質をより完全に走査するためには、構築物ごとにエピトープを酵素の各アミノ酸中に置換または挿入した一連のハイブリッド酵素−エピトープ遺伝子を構築することができる。そして最終的に、酵素活性を維持しているハイブリッド酵素−エピトープの抗体結合及び調節を試験する。本発明の１つの実施態様においては、ＡＰが、結合分子に結合すると共に結合分子の存在及び量を示すシグナルを生成するハイブリッド酵素−エピトープ（以降はこれをＡｐ−エピトープと記す）に変性される。結合分子はタンパク質または抗体のごとき被分析物質であり得る。この方法に基づく診断アッセイはホモジニアスであり、単純に実施され、別個のステップを必要としない１ステップアッセイである。ＡＰ−エピトープはＥ．ｃｏｌｉ中で産生し、そのあとの化学的変性を必要としない均一試薬に精製するのが好ましい。ＡＰ−エピトープは、エピトープをコードするＤＮＡ配列を出発ＡＰのアミノ酸配列中に置換または挿入することにより生成される。得られたタンパク質ＡＰ −エピトープは表面にエピトープを提示し、結合分子として作用する。結合分子の例としては該エピトープに対する抗体がある。ＡＰ−エピトープと結合分子との複合体は、未結合のＡＰ−エピトープの活性に対する複合体の酵素活性の量を測定することにより検出される。上記実施態様においては、ＡＰは、ＡＰ遺伝子中で、エピトープをコードするＤＮＡ配列を出発ＡＰのアミノ酸配列中に置換または挿入することにより、抗体に対する結合タンパク質に構築された。ＡＰのアミノ酸配列中に置換または挿入されたエピトープは、触媒部位の近傍で且つＡＰの表面にあることが既知の部位に作製された。このようなエピトープの例としてはＨＩＶ−１ｇｐ１２０タンパク質のＶ３ループがある。ＡＰ−エピトープをＥ．ｃｏｌｉ中で発現及び精製した。本発明の１つの実施態様から、（１）ｇｐ１２０ペプチドは、酵素活性またはタンパク質安定性を有意に変化させることなく出発ＡＰのアミノ酸配列中の２つの領域に置換または挿入することができ、挿入はＡＰのアミノ酸４０７と４０８の間に、置換はアミノ酸９１〜９３で行うことができる；（２）ＡＰ−エピトープの表面に提示されたとき、エピトープはｇｐ１２０タンパク質に対する抗体に更に結合され；及び（３）抗ｇｐ−１２０モノクローナル抗体（ＭＡｂ）のＡＰ−エピトープ，ＡＰＩ１への結合によりＡＰＩ１の酵素活性が阻害されることが判る。総合すると、巨大分子に結合すると共に複合体を検出するためのシグナルを生成するＡＰベースの結合タンパク質を形成するためにＡＰ−エピトープが使用されることが判る。ＡＰ−エピトープと抗体とで形成される複合体を検出するには複合体形成時にＡＰ−エピトープの酵素活性が変化される必要があることから、触媒部位近傍にあるＡＰ領域を、結合表面挿入用の部位として選択した。リガンド結合部位として作用する外来アミノ酸部分を含むハイブリッド酵素（ハイブリッド酵素−リガンド結合体）本発明の別の実施態様においては、単一の外来アミノ酸を、出発酵素のアミノ酸配列中の出発酵素の活性部位近傍にある特定の位置に置換または挿入したハイブリッド酵素が形成される。次いでリガンドを、ハイブリッド酵素中の外来アミノ酸部分に適当なリンカーによって結合または付着させ、「ハイブリッド酵素−リガンド結合体」を形成する。単純化のため、以下の説明はタンパク質が酵素である場合について行うが、説明は他のタンパク質及びハイブリッドタンパク質にも適用され得る。リガンドは、活性部位近傍に突然変異によって誘導された部位特異的結合を介してハイブリッド酵素に結合または付着される。部位特定突然変異誘発を使用することにより官能基、例えばリガンドを出発酵素のポリペプチド鎖に沿って正確なアミノ酸残基に付着または導入し得る。付着したリガンドはハイブリッド酵素−リガンド結合体の触媒機能に悪影響を及ぼさないのが好ましい。他方で、付着したリガンドはハイブリッド酵素−リガンド結合体の触媒機能を増加し得る。付着部位が出発酵素の活性部位または触媒中心の近傍にあるよう設計すると、結合分子が付着リガンドに結合したとき、ハイブリッド酵素 −リガンド結合体による基質の触媒速度は調節、即ち増加、低下または停止される。一般には触媒速度は低下される。幾つかの方法により、単一リガンドを用いて酵素を慎重に誘導体化し得る：（１）該酵素をコードする対応遺伝子を点突然変異し、in vivo翻訳によって外来アミノ酸部分を導入する；（２）該酵素をコードする対応遺伝子を点突然変異し、in vitro翻訳によって外来アミノ酸部分を導入する（Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ａｎｔｈｏｎｙ −Ｃａｈｉｌｌ，Ｓ．，Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄs ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０２，３０１− ３３７）；及び（３）出発酵素のアミノ酸配列中に置換または挿入された外来アミノ酸部分によって補因子または補因子の誘導体を出発酵素にリンクする。補因子、阻害物質または基質は、被分析物質、反応性リンカーまたは光ラベルを担い得る（ＭａｃＬｅａｎ，Ａ，Ｉ．，Ｃｙｎｋｏｗｓｋｉ，Ｔ．及びＢａｃｈａｓ，Ｌ．Ｇ．，（１９９２）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８，１２８３−８５）。反応性リンカーは、リガンドの酵素への付着部位を与える。 in vivo翻訳法に使用し得る外来アミノ酸部分はシステイン、ヒスチジンまたはアルギニンとし得るが、好ましいのはシステインである。in vitro翻訳法は、アミノ酸、アジド、ビシナルジオール、ケトン、アルデヒド、アセタール、ケタール、オルトエステルなどの炭水化物誘導体のごとき外来アミノ酸部分を使用することにより、より多様となり得る。酵素活性に変化をもたらす結合事象は幾つかの方法で実現し得る。１つの方法においては、固有の反応性を示す外来アミノ酸部分を、リガンドを結合されるかまたはリガンドによって誘導体化されても酵素活性に大きくは影響しないように活性部位近傍に導入する。結合分子がリガンドに結合すると基質ターンオーバーが変化することにより、酵素活性が低下する。別の方法においては、固有の反応性を示す外来アミノ酸部分を、リガンドを結合されるかまたはリガンドによって誘導体化されても酵素活性に大きくは影響しないように補因子の結合部位近傍に導入する。結合リガンドに結合分子が結合すると、補因子とハイブリッド酵素− リガンド結合体との会合が低減されることにより酵素活性は低下される。更に別の方法においては、外来アミノ酸部分を、リガンドを結合されるかまたはリガンドによって誘導体化されても四次構造に大きくは影響しないようにダイマーまたはマルチマー酵素の境界面近傍に導入し、結合しているリガンドに結合分子が結合すると、ダイマーまたはマルチマー構造を解離したり、四次構造の再形成を阻害することにより、酵素活性が低下される。後者の場合、酵素はホモ−もしくはヘテロダイマーまたはマルチマーであり得る。上記以外の方法も考えられる。例えば活性部位または補因子結合部位の近傍に固有の反応性を示す外来アミノ酸部分を結合すると、ハイブリッド酵素−リガンド結合体の活性が阻害され得る。結合しているリガンドに結合分子が結合すると、リガンドを活性部位または補因子結合部位から引き離すことにより、酵素活性が増加される。被分析物質の存在下では負のシグナル応答があり、即ち酵素活性が低下する結果となる。出発酵素の誘導体化の場所は幾つかの方法で決定し得る。出発酵素の結晶構造が既知であるならば、モデルを画像及び数式により調査し、溶剤にアクセス可能な活性部位または補因子結合部位またはマルチマー形態であれば境界結合に関与するものの近傍の残基を示すことができる。構造は判っていないがアミノ酸配列は既知であるならば、構造予測プログラムによるかまたはランダムに突然変異を誘発し、次いで突然変異体を試験し、所望のハイブリッド酵素−リガンド結合体に到達し得る。上記ハイブリッド酵素−リガンド結合体は定性または定量分析に有用である。そのような例としては、（１）外来アミノ酸部分が出発酵素の表面にあるアミノ酸配列中に置換または挿入されているものの、得られたハイブリッド酵素の酵素活性は破壊されておらず；（２）得られたハイブリッド酵素中の外来アミノ酸部分が更にリガンドを結合し、ハイブリッド酵素−リガンド結合体を形成することができ；（３）結合したリガンドが更に、レセプター、抗体または他のタンパク質分子といった結合分子を結合することができ；（４）被分析物質が結合しているリガンドと、結合分子について競合し得；及び（５）結合分子が結合リガンドに結合すると、ハイブリッド酵素−リガンド結合体の酵素活性が変性されるハイブリッド酵素−リガンド結合体が挙げられる。実施例実施例１：ＡＰ−エピトープの設計ＡＰの結晶構造を使用し、活性部位セリン１０２の近傍にあること（典型的には２０＝以内の）、構造内のアミノ酸残基の適合性に影響を及ぼす平均温度因子、アミノ酸残基の表面アクセシビリティー、活性部位を取り囲む腔部内の位置に基づき、ペプチドを置換または挿入すべき潜在的部位として酵素の領域を選択した。ＳｉｌｉｃｏｎＧｒａｐｈｉｃコンピューターにおいてＩｎｓｉｇｈｔIIソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｍ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、ＡＰの３次元構造を画像化及びモデル化した。更に、Ｅ．ｃｏｌｉＡＰと哺乳動物源、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ及び酵母由来の他のＡＰとのアミノ酸相同性（Ｈｕｌｅｔｔ，Ｆ．Ｍ．，Ｋｉｍ，Ｅ．Ｅ．，Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｋａｐｐ，Ｎ．Ｖ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃ．Ｗ．，及びＷｙｃｋｏｆｆ，Ｈ．Ｗ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１０７−１０８４）を使用し、種々のタンパク質間であまり保存されていない領域を同定した。全てのＡＰタンパク質は同じ一般３次元構造を有すると仮定すると、この比較により、エピトープを出発ＡＰのアミノ酸配列中に置換または挿入することで欠失または変更され得るＥ．ｃｏｌｉＡＰ内の領域が同定された。出発ＡＰ中でのペプチド置換または挿入に選択した３つの領域はアミノ酸９１〜９３、１６７〜１７７及び４０７〜４０８であった（図１）。アミノ酸１６７と４０７〜４０８とは、活性部位を取り囲む腔部内に突出する小ループの一部であり、セリン１０２から１５＝以内にある。ダイマー境界面の近傍に活性部位とは逆に向いた小ループを形成するアミノ酸９１〜９３にはホルモンペプチドが受容されていた（Ｌａｎｇｅｎ，Ｈ．Ｔ．及びＴａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓ１４，１−９）。Ｅ．ｃｏｌｉＡＰのアミノ酸１６９〜１７７は、システイン１６８とシステイン１７７の間のジスルフィド橋によってリンクされるα螺旋内にあるが、この構造は他のＡＰタンパク質にはない。ＡＰのアミノ酸３７３〜４１０（３８アミノ酸）の領域は他のＡＰタンパク質より３２〜６８アミノ酸大きい。ＨＩＶ−１抗体に対する結合分子としてＡＰ−エピトープを使用し得る可能性を示すため、ＨＩＶ−１IIIＢｇｐ１２０タンパク質のＶ３ループ由来のエピトープをＡＰ中に置換または挿入した。Ｖ３ループ（アミノ酸３０３〜３３８）はｇｐ１２０の免疫優勢領域であり、ジスルフィド橋を形成するシステイン残基がフランキングする３４個のアミノ酸からなる（ＬａＲｏｓａ，Ｊ．Ｊ．ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９，９３２−９３５）。エピトープは、それがＡＰ−エプトープ内に位置するごとく、ｇｐ１２０の表面にあるループ内に位置するが故に、このエピトープに対する抗体はＡＰ−エピトープ内のエピトープを更に認識すると思われる。ＡＰ− エピトープにおいて、Ｖ３ループの中央の１３個のアミノ酸、２つのシステイン残基がフランキングした１３個のアミノ酸、３４個のアミノ酸または３６個全部のアミノ酸をＡＰ中に置換または挿入した。Ｖ３ループのアミノ酸配列は以下の通りである（中央の１３個のアミノ酸には下線を引いてある）： Cys-Thy-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro- Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr- Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys （配列番号２５）。ＡＰはダイマータンパク質であるので、各機能性ＡＰ−エピトープ中に置換または挿入された２つのエピトープが存在する。実施例２：ＡＰ−エピトープの構築及び発現固有の制限部位を有するように合成したｐｈｏＡ遺伝子を使用して制限フラグメントを置換することにより、ＡＰ−エピトープをコードする遺伝子を構築した（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｗ．，Ｓｈａｌｌｃｒｏｓｓ，Ｍ．Ａ．，Ｓｏｗａｄｓｋｉ，Ｊ．及びＴｏｍａｚｉｃ−Ａｌｌｅｎ，Ｓ．（１９９１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ４，８０１−８０４）。図２Ａ〜２Ｃはそれぞれ合成ｐｈｏＡ遺伝子のＤＮＡ配列と得られるアミノ酸配列を示す（配列番号１及び２）。ａ．合成ＤＮＡフラグメント図３Ａ〜３Ｄは制限フラグメント置換体として使用した合成ＤＮＡフラグメントを示しており、その結果得られたＡＰ−エピトープの外来アミノ酸部分を図４に示す。図３Ａ〜３Ｄはａｐｉ１ａ（配列番号３としても列挙）；ａｐｉ１ｂ（配列番号４）；ａｐｉ２ａ（配列番号５）；ａｐｉ２ｂ（配列番号６）；ａｐｉ３ａ（配列番号７）；ａｐｉ３ｂ（配列番号８）；ａｐｉ５ａ（配列番号９）；ａｐｉ５ｂ（配列番号１０）；ａｐｉ６ａ（配列番号１１）；ａｐｉ６ｂ（配列番号１２）；ａｐｉ７ａ（配列番号１３）；ａｐｉ７ｂ（配列番号１４）；ａｐｉ８ａ（配列番号１５）；ａｐｉ８ｂ（配列番号１６）；ａｐｉ８ｃ（配列番号１７）；ａｐｉ８ｄ（配列番号１８）を示す。図４はＡＰ−エピトープの外来アミノ酸部分ＡＰＩ１（配列番号１９）；ＡＰＩ２（配列番号２０）；ＡＰＩ３（配列番号２１）；ＡＰＩ５（配列番号２２）；ＡＰＩ１６（配列番号２３）；ＡＰＩ７（配列番号２４）；ＡＰＩ８（配列番号２５）を示す。合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ３９４及び３８０Ｂ合成装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を使用して合成した。オリゴヌクレチドを１０％アクリルアミド，７Ｍ尿素，ＴＢＥ（８９ｍＭＴｒｉｓホウ酸塩，８９ｍＭホウ酸，２ｍＭＥＤＴＡ）中のゲル電気泳動によって精製し、ＢｅｃｋｍａｎＤＵ７５００分光光度計（ＢｅｃｋｍａｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）で２６０ｎｍにおける紫外光吸収を測定し、９４００Ｍ^-1ｃｍ^-1／アデノシン、５０００Ｍ^-1ｃｍ^-1／シチジシン、８０００Ｍ^-1ｃｍ^-1／チミジン、及び１００００Ｍ^-1ｃｍ^-1／グアノシンを加算することにより算出した消衰係数値を使用して定量した。５ｐｍｏｌのＤＮＡを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，１０ｍＭＭｇＣｌ₂，５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ），１ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中３７℃で１時間インキュベートすることにより、オリゴヌクレオチドの５’末端をリン酸化した。リン酸化後、それぞれ１．２５ｐｍｏｌ（５μｌ）の各オリゴヌクレオチドを当量の相補的配列と、混合物を９５℃に加熱してからゆっくり室温まで冷却することによりアニーリングした。これらのアニーリングしたフラングメントを結合反応に直接使用した。ＡＰＩ８をコードするプラスミドｐＡＰＩ８を構築するため、４種のオリゴヌクレオチドから制限フラグメント置換物を合成した（図３Ａ〜３Ｄ；配列番号１５〜１８）。オリゴヌクレオチドａｐｉ８ｂ及びａｐｉ８ｃのみの５′末端をリン酸化した。次いで前述したように、ａｐｉ８ｂをａｐｉ８ｄにアニーリングし、ａｐｉ８ｃをａｐｉ８ａにアニーリングした。アニーリングしたフラグメントａｐｉ８ａ：ａｐｉ８ｃ（４ｐｍｏｌ）及びａｐｉ８ｂ：ａｐｉ８ｄ（４ｐｍｏｌ）を混合し、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を添加することにより連結し、室温で一晩インキュベートした。２つのフラグメントを連結した後、リガーゼを６５℃で５分間熱失活させ、１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを添加し、ａｐｉ８ａ及びａｐｉ８ｄの５′末端をリン酸化した。キナーゼを熱失活（６５℃，５分間）させてから、フラグメントを後述のごとき線状化したｐＣＢ１００に連結した。ｂ．ベクターの制限酵素消化合成ｐｈｏＡ遺伝子を含む２つのプラスミドを使用した；ｐＵＣｐｈｏＡは、多重クローニング部位（ＭＣＳ）のＢａｍＨ１及びＨｉｎｄIII部位中にクローニングされているｐｈｏＡを含むｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，Ｖｉｅｒａ，Ｊ．及びＭｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８８）Ｇｅｎｅ３３，１０３）であり；ｐＣＢ１００は、Ｓｐｅ１部位が除去され且つ多重クローニング部位（ＭＣＳ）にＢａｍＨ１／ＨｉｎｄIIIフラグメントとしてｐｈｏＡを含むｐＷＭ５２８ベクター（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｍ．，Ｈａｙｄｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｓｈａｌｌｃｒｏｓｓ，Ｍ．Ａ．及びＳｔｏｔｌａｎｄ，Ｅ．（１９９０）Ｇｅｎｅ９４，１０３−１０７）である。ｐＡＰＩ１及びｐＡＰＩ８を構築するためには、５０μｌのＮＥ緩衝液２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）及び０．１ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）中でＫａｓ１（９単位，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）及びＳｐｈ１（１０単位，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を用いてｐＣＢ１００（１５μｇ）を切断した。ｐＡＰＩ２、ｐＡＰＩ３及びｐＡＰＩ５を構築するためには、１００μｌのＲＥａｃｔ５緩衝液（ＧＩＢＣＯＢＲＬ），１ｍＭＤＴＴ中でＲｓｒII（１００単位，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を用いてｐＵＣｐｈｏＡ（６μｇ）を切断し、次いでＤＮＡをエタノールで沈殿させた。ＲｓｒIIで切断したＤＮＡを１００μｌのＲＥａｃｔ４緩衝液（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）中に再度溶解し、Ｓｐｅ１（２０単位，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）で消化した。ｐＡＰＩ６及びｐＡＰＩ７を構築するためには、５０μｌのＮＥ緩衝液４及び０．１ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）中でＳｎａＢ１（８単位，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）及びＨｐａｌ（５単位，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を用いてｐＵＣｐｈｏＡ（１０μｇ）を消化した。線状化したベクターを１単位のウシ腸ホスファターゼを用いて３７℃で１５分間処理してから、フェノール／ＣＨＣｌ₃で抽出し、エタノールで沈殿させた。次いで線状化したベクターをｄＨ₂Ｏ中に再度溶解した。ｃ．連結反応ＡＰ−エピトープ遺伝子（ＡＰ−エピトープをコードする遺伝子）を構築するために相互に連結したベクターとフラグメントの組合せを表１に示す。線状化した脱リン酸化ベクターを５′ リン酸化した合成二本鎖ＤＮＡフラグメントに以下のように連結した。０．２μｇのベクターを０．２５ｐｍｏｌの合成ＤＮＡフラグメントと一緒に１０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）、１ｍＭＤＴＴ及び１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）中で１６℃で一晩インキュベートした。連結混合物をエタノール沈殿させ、ＤＮＡを１０μｌのｄＨ₂Ｏ中に再度溶解した。連結したベクター（５μｌ）を５０μｌのコンピテントＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１細胞（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）中に形質転換した（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８２）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。形質転換細胞を、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２００μｇの５−ブロモ−４−クロロ −３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）を含むＬＢ（ルリアブロス）（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８２）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）プレート上で平板培養した。アンピシリンの存在により、プラスミドを含む細胞のみが増殖し得た。またＢＣＩＰは活性ＡＰの存在の呈色指示薬である。ｄ．ＡＰ−エピトープ構築物の特性分析ＡＰ活性を示す青色を呈する形質転換反応から得たコロニーを特性分析のために選択した。プラスミドＤＮＡを単離するため、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌ中でコロニーを飽和するまで増殖させた。遠心することにより細胞をペレット化し、１００μｌの２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，１０ｍＭＥＤＴＡ及び５０ｍＭグルコース中に再懸濁させた。２倍容（２００μｌ）の０．２ＭＮａＯＨ，１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を混合物に添加し、氷上で１０分間インキュベートし、１５０μｌの３Ｍ酢酸カリウムｐＨ４．８を添加し、更に混合物を氷上で５分間インキュベートした。混合物をマイクロ遠心機において１５分間遠心し、上清を取り出した。上清に３００μ ｌの２−プロパノールを添加し、混合物を室温で３０〜６０分間インキュベートし、先のステップと同様に遠心した。ペレットをＴＥ溶液（１００μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）中に再度溶解した。等量の５Ｍ酢酸アンモニウムを添加し、混合物を氷上で２０分間インキュベートしてから遠心した。上清を取り出し、それに４００μｌの１００％エタノールを添加し、氷上で２０分間インキュベートし、遠心した。ペレットを、２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを含むＴＥ溶液中に再度溶解し、３７ ℃で１５分間インキュベートした。ＲＮａｓｅＡで処理したあと、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）を終濃度０．１Ｍまで添加し、混合物をフェノールで２回、ＣＨＣｌ₃：イソアミルアルコール（２４：１）で１回抽出し、２倍容のエタノールを用いてＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを０．３Ｍ酢酸ナトリウム中に再度溶解し、エタノールを用いて再度沈殿させた。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、５０μｌのｄＨ₂Ｏ中に再度溶解した。或いは、アルカリ溶解法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８２）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）によってプラスミドＤＮＡを単離した。ｐｈｏＡ制限フラグメントが合成ＤＮＡフラグメントで置換されていることを検証するため、単離したプラスミドを、上述のごとき（実施例２ｂ）クローニング用ベクターの線状化に使用したのと同じ制限酵素を用いて消化した。ＤＮＡ産物をＴｒｉｓ −ホウ酸緩衝液（ＴＢＥ）中１．５％アガロースまたは１０％アクリルアミドゲル上で電気泳動することにより分離した。エチジウムブロミドで染色することによりフラグメントを可視化し、ＤＮＡ分子量基準（ΦＸ１７４ＤＮＡ／Ｈａｅ IIIフラグメント，ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に対して移動した距離に基づいてサイズを決定した。各構築物に対して、適正サイズの制限フラグメント置換物を含む幾つかのコロニーから得たＤＮＡの配列を、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２．０Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ配列決定キット及び７−デアザ−ｄＧＴＰ試薬（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を使用し、二本鎖ジデオキシ法（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｓｃｈｏｌｌ，Ｒ．，Ｂｒｏｗｓｅ，Ｊ．及びＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｃ．ＮＡＲ（１９８８）１６，１２２０）によって決定した。各ベクターの配列は、一方の鎖の置換または挿入ＤＮＡフラングメントとその両側を含む領域のみを決定した。ｅ．ＡＰ−エピトープの構築及び発現表２には、得られたＡＰ−エピトープを挙げ、ＡＰにおいて修飾された部位、修飾の種類（置換または挿入）、ＡＰ中に挿入または置換されたエピトープのサイズ，該タンパク質をコードするプラスミドを含むコロニー（Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１またはＭＺ１３ｂ）の色、該タンパク質がペリプラズムタンパク質抽出物中に存在するか否かを示す。ＡＰ−エピトープ、ＡＰＩ１はＡＰのアミノ酸４０７と４０８の間に挿入されたＶ３ループの中央の１３個のアミノ酸（配列番号１９）を含む。ＡＰＩ２はＡＰのアミノ酸１６７と１６８の間に挿入されたＶ３ループ由来の１３個のアミノ酸（配列番号２０）を含み、ＡＰＩ３はアミノ酸１６８と１６９の間に挿入された１３個のアミノ酸（配列番号２１）を含む。ＡＰＩ５においては、Ｃｙｓ１６８とＣｙｓ１７８によって形成されるジスルフィド橋の間のアミノ酸１６９〜１７７が、Ｖ３ループのシステイン残基間の３４個のアミノ酸（配列番号２２）で置換されている。ＡＰＩ６においては、ＡＰのアミノ酸９１〜９３がＶ３ループ由来の１３個のアミノ酸（配列番号２３）で置換されている。ＡＰＩ７はＡＰＩ６と同様であるが、但し、１３個のアミノ酸置換の両側にシステイン残基が付き、全部で１５個のアミノ酸（配列番号２４）で置換されている。ＡＰＩ８では、ＡＰのアミノ酸４０７と４０８の間に全Ｖ３ループ（３６アミノ酸）（配列番号２５）が挿入されている。表２のタンパク質発現はＢＣＩＰを使用して決定した。ＡＰＩ１、ＡＰＩ６、ＡＰＩ７及びＡＰＩ８をコードするプラスミドを含む細胞コロニーの青色は、ＡＰ−エピトープが発現され、酵素活性を有することを示している。各プラスミドを含むＭＺ１３ｂ（プラスミドのＭＺ１３ｂへの形質転換は実施例３に記載する）由来のペリプラズム抽出物は、各ＡＰ−エピトープの推定分子量でＳＤＳアクリルアミドゲル上を移動したタンパク質を含んだ。ＡＰＩ２、ＡＰＩ３及びＡＰＩ５をコードする構築物を含む株ＭＺ１３ｂは薄青色のコロニーを形成し（プラスミドを含まないコロニーは白色）、ペリプラズム抽出物は推定分子量のタンパク質の存在を示さなかった。ＳＤＳゲル−ウェスターンブロットを抗ＡＰ抗体でプローブしたが、ペリプラズム抽出物中にＡＰＩ２、ＡＰＩ３及びＡＰＩ５は検出されなかった。ＡＰＩ２及びＡＰＩ３をコードする構築物に対しては、ポリミキシンＢスルフェート処理してペリプラズムタンパク質を放出させた後にペレット化した細胞材料のブロットを抗ＡＰ抗体でプローブすると、推定分子量のＡＰ−エピトープが検出された。しかしながら、ＡＰ反応性材料の大部分は低分子量であり、これらのタンパク質が正常に輸送されず、分解されたことが判る。ＡＰＩ１、ＡＰＩ６、ＡＰＩ７及びＡＰＩ８の粗抽出物のＡＰ−エピトープ酵素活性を、ＡＰ−エピトープを天然ゲル上で電気泳動し、ＡＰ活性に対してゲル５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）で染色することにより検査した。全てのＡＰ−エピトープは検出可能な酵素活性を有し、ＡＰ−エピトープのアミノ酸配列の変化と一致したＡＰとは別の態様で移動した。これらのＡＰ−エピトープが抗ｇｐ１２０ＭＡｂに結合し得る能力を天然ゲル中で電気泳動させた粗抽出物を使用して決定した。ゲルは、一次抗体として抗ｇｐ −１２０ＭＡｂを使用してウェスターンブロットした。ＡＰＩ１、ＡＰＩ６、ＡＰＩ７及びＡＰＩ８は抗ｇｐ１２０ＭＡｂによって検出されたが、ＭＺ１３ｂペリプラズムタンパク質及びＡＰは検出されなかった。このことから、ＡＰ−エピトープの天然コンホーメーションにおいてはエピトープが表面に露出しており、抗ｇｐ１２０ＭＡｂが認識し結合するコンホーメーションにおいてもそうであることが判る。実施例３：ＡＰ−エピトープの発現及び特性分析ＡＰ−エピトープの発現ＡＰ−エピトープを発現及び単離するため、ｐＡＰＩプラスミドを、ｐｈｏＡが欠失された株であるＥ．ｃｏｌｉＭＺ１３ｂ細胞（Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，Ｐｒａｔｔ，Ｃ．，Ｂｅｃｋｗｉｔｈ，Ｊ．及びＴｏｒｉａｎｉ，Ａ．Ｊ．（１９７７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１０，７５−８７）中に形質転換した。ＭＺ１３ｂ細胞を以下の方法によって形質転換コンピテントとした。ＭＺ１３ｂの培養物をＬＢ培地中で一晩増殖させ、細胞を遠心によってペレット化し、冷たい形質転換緩衝液（４０ｍＭ酢酸カリウムｐＨ６．２，４０ｍＭＭｎＣｌ₂，６０ｍＭＣａＣｌ₂，１００ｍＭ塩化ルビジウム，１５％スクロース）中に元の容積の１／４で再懸濁した。細胞を氷上で２０分間インキュベートしてから、遠心によってペレット化した。細胞を、０．０４％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む形質転換緩衝液中に元の培養物容積の１／４０で再懸濁し、−７０℃で保存した。形質転換及びコロニー選択は実施例２ｃのごとく行った。タンパク質単離のために、ｐＡＰＩプラスミドを含むＭＺ１３ｂを、１００μ ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＳＯＢ培地（２０ｇ／ｌバクト−トリプトン，５ｇ／ｌ酵母抽出物，０．５ｇ／ｌＮａＣｌ，ＫＯＨでｐＨ７．５に調整し、オートクレーブ処理後ＭｇＳＯ₄を５ｍＭまで添加した）中で増殖させた。細胞を遠心によってペレット化し、６ｍｇ／ｍｌのポリミキシンＢスルフェート（Ｓｉｇｍａ）を含む０．１５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５４ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ６．６中に元の容積の１／４０で再懸濁させた。細胞懸濁液を３７℃で１０分間インキュベートしてから１３０００×ｇで３０分間遠心した。上清は、ポリミキシン処理によって細胞周辺腔から放出されたタンパク質を含んでおり、ＡＰ−エピトープの粗抽出物であった。ＡＰ−エピトープの発現は、ペリプラズム抽出物中のタンパク質をゲル電気泳動によって分離することにより決定した。ペリプラズム抽出物のアリコートを、等量の１２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．８，２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，１％β−メルカプトエタノール及び０．０１％ブロモフェノールブルー中で煮沸することにより変性した。試料を、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍにおいてＰｈａｓｔＧｅｌＨｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ１２．５ゲル及びＰｈａｓｔＧｅｌＳＤＳ緩衝液ストリップ（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用するか、または標準ＬａｅｍｍｌｉＳＤＳ１０％または１２％アクリルアミドゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ２２７，６８０−６８５）上で電気泳動した。タンパク質バンドを可視化するために、ゲルを５０％メタノール、７％酢酸、０．２％クーマシーＲ０２５０中で染色し、次いで２５％メタノール及び７％酢酸中で脱色した。タンパク質バンドの見掛けのサイズは、それらの移動距離をタンパク質分子量基準（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）の移動と比較することにより決定した。ｂ．ウェスターンブロット法ウェスターンブロットのために、ＰｈａｓｔＴｒａｎｓｆｅｒ装置（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してタンパク質をＰｈａｓｔＧｅｌゲルからＰｒｏｂｌｏｔ膜（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に移した（転移緩衝液：２５ｍＭＴｒｉｓ基剤，１９２ｍＭグリシン，ｐＨ８．３，２０％メタノール）。転移後、膜をブロット（blotto）［ＴＢＳ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．５）中の５％脱脂粉乳］中で３０分間ブロックした。次いで膜を、ブロットで１／１０００に希釈した一次抗体ウサギ抗細菌ＡＰ（ＢＡＰ）（５Ｐｒｉｍｅｔｏ３ＰｒｉｍｅＩｎｃ．）と一緒に室温で１〜２時間インキュベートし、ブロットで５分間ずつ４回洗浄した。次いで、ブロットで１／１０００に希釈した二次抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｎａ）を膜に添加し、上記のごとくインキュベート及び洗浄した。１５ｍｌの冷たいメタノール中に溶解した３０ｍｇの４−クロロ −１−ナフトール（Ｓｉｇｍａ）を０．０４％過酸化水素を含むＴＢＳ６０ｍｌと混合することにより、現像液を作製した。膜を現像液中で室温で３０分間インキュベートした後、膜を水中に移すことにより反応を停止させた。ｃ．天然ゲル中でのＡＰの活性染色ペリプラズム抽出物中のタンパク質を天然ゲル中で電気泳動し、ＡＰ活性に対してゲルを染色することにより、ＡＰ−エピトープの酵素活性を示した。ペリプラズム抽出物のアリコートをＰｈａｓｔＧｅｌ均一１２．５ゲル上にＰｈａｓｔＧｅｌＮａｔｉｖｅ緩衝液ストリップ（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して直接添加した。電気泳動後、ゲルを、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ₂，１ｍｇ／ｍｌＢＣＩＰ，ｐＨ８．５中に発色するまで（２〜６０分間）浸漬した。ゲルを脱色溶液（２５％メタノール，７％酢酸）中に移すことにより反応を停止させた。活性ＡＰ−エピトープがＢＣＩＰ基質をＢＣＩに切断すると、ゲル中のそれが生成された場所に青色の沈殿物が形成され、活性ＡＰ−エピトープの位置が染色された。抗ＢＡＰを使用して同一のゲルをウェスターンブロットし、ＡＰ−エピトープの位置を独立に検証した。ｄ．抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体を使用した天然ゲルにおけるＡＰ−エピトープのウェスターンブロットＡＰ−エピトープ中のＨＩＶ−１ｇｐ１２０エピトープは更に、ｇｐ１２０エピトープに対する抗体によって認識された。このことは、ペリプラズム抽出物または精製ＡＰ−エピトープを（上述のごとく）ＰｈａｓｔＧｅｌ天然ゲル上で分離することにより示された。上述のごとくタンパク質をＰｒｏｂｌｏｔ膜に移し、ウェスターンブロットを実施した。一次抗体は、ブロットで１／１０００に希釈した抗ｇｐ１２０（ＨＩＶ−１）モノクローナル抗体（ＡｍｅｒｉｃａｎＢｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）であり、二次抗体は、ブロットで１／１０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）であった。同一の膜を抗ＢＡＰ抗体を用いて前述のごとくプローブした。実施例４：ＡＰ−エピトープの精製及び特性分析ａ．タンパク質精製ＡＰＩプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉＭｚ１３ｂを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＳＯＢ培地中で増殖させ、ペルプラズム抽出物を前述のごとく（実施例３ａ）作製した。抽出物を、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ８．５で１０倍に希釈するか、またはこの緩衝液中に透析してから、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上でＦＰＬＣ系（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用したクロマトグラフィーにかけた。２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ８．５中の０→ＩＭＮａＣｌの直線濃度勾配を使用してＡＰ−エピトープを溶出した。ＡＰ活性を含むフラクションをプールし、ＹＮ−３０膜を備えたＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎセル（Ａｍｉｃｏｎ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を使用して濃縮し、１０ｍＭＮａ₃ＰＯ₄，１ｍＭＭｇＣｌ₂，０．０２５％アジ化ナトリウム，ｐＨ６．８中に透析した。プールをＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅＵｌｔｒｏｇｅｌカラム（ＩＢＦＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓＩｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）上でクロマトグラフィーにかけ、ＡＰ−エピトープを、１０ｍＭＮａ₃ＰＯ₄，１ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ６．８→５００ｍＭＮａ₃ ＰＯ₄，１０ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ６．６の直線濃度勾配を使用して溶出した。ＡＰ活性を含むフラクションをプールし、濃縮し、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ８．５中に透析した。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ及びＨＡＵｌｔｒｏｇｅｌカラム処理後にＡＰ−エピトープが（ＳＤＳゲル電気泳動によって判断して）純粋でないならば、ＰｏｒｏｓＲ／Ｈカラム（ＰｅｒｃｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において５０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸，２ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ８．０中２→８０％アセトニトリルの直線濃度勾配を有するＢｅｃｋｍａｎ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）系（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用し、調製物を更に精製した。最終的なタンパク質調製物は、０．０２％アジ化ナトリウムを含む２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ８．５中に４℃で保存した。ＡＰ活性に対するアッセイは、２．５ｍＭのＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート）（Ｓｉｇｍａ）を含む１ｍｌの１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ₂，０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ，ｐＨ８．０中で実施した。ＢｅｃｋｍａｎＤＵ７５００分光光度計（ε＝１．６２×１０⁴Ｍ^-1ｃｍ^-1）（Ｂｅｃｋｍａｎ）において４１０ｎｍの吸収の変化を追跡することにより、ＰＮＰＰのｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）への変換をモニターした。Ａ₄₁₀対時間のプロットの最初の線形部分を使用し、初速度を計算した。ＡＰ−エピトープの純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルのクーマシー染色によって判定した。全てのタンパク質調製物が、全染色タンパク質の９５％以上を占める単一バンドを含んだ。ＡＰは、推定モノマーサイズと一致する４６０００ダルトンの見掛けの分子量で移動した。ＡＰ− エピトープは、ペプチドを付加したことから推定されるサイズ増加と一致する僅かに大きなタンパク質として移動した。タンパク質濃度は、Ｂｉｏ−ＲａｄＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙキット（Ｂｉｏ−ＲａｄＣｈｅｍｉｃａｌＤｉｖ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）により、ＢＳＡをタンパク質標準として使用して決定した。ＡＰの酵素活性形態は、各サブユニットが活性部位を含むダイマーである。ＡＰ−エピトープでは活性形態において２つのエピトープ挿入物が存在する。アッセイにおいて、存在するＡＰ及びＡＰ−エピトープの濃度は、存在する活性部位及びエピトープの数、即ち存在するモノマーサブユニットの濃度に関して表わされる。ｂ．ＡＰ−エピトープの速度定数ＡＰ−エピトープのミカエリス−メンテン速度定数Ｋ_m及びＶ_maxを、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ₂，０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ，ｐＨ８．０中で基質としてＰＮＰＰを使用して決定した。酵素濃度は５ｎｍｏｌ（ｎＭ）（モノマー）であり、ＰＮＰＰ濃度は５〜９０μＭとした。合計で２００μｌをアッセイに使用し、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいてアッセイを実施した。ＰＮＰＰのＰＮＰへの変換を、Ｂｉｏ−ＲａｄＭｏｄｅｌ３５５０ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＲｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において４０５ｎｍで測定し、ＫｉｎｅｔｉｃＣｏｌｌｅｃｔｏｒ２．０ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してデータ分析した。既知濃度のＰＮＰの吸収を測定し、１．６２×１０⁴Ｍ^-1ｃｍ^-1のＰＮＰに対する消衰定数を使用することにより、経路長は経験的に０．６ｃｍと決定された。Ａ₄₀₅対時間の最初の線形部分から初速度を決定した。ＥａｄｉｅＨｏｆｓｔｅｅプロットからＫ_m及びＶ_maxの値を決定した。表３の値は、少なくとも３回の独立した実験から得られた平均±１標準偏差である。タンパク質調製物における値を表３にまとめて示す。ＡＰＩ８は粗精製物において安定であるが、精製の際に一部分解されている。ＡＰ−エピトープのＫ_m及びＶ_max値をＡＰの値と比較すると、いずれの値も有意には変化していないことが判る。これらの結果は、エピトープをＡＰ中に置換または挿入しても、基質とＡＰ−エピトープの相互作用及び基質ターンオーバー速度とにほとんど影響しないことを示している。ｃ．ＡＰ−エピトープの熱安定性０．５μＭ（モノマー）の各ＡＰ−エピトープを１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ８．０中で２４〜９２℃の温度で１５分間インキュベートし、次いで氷上で急冷することにより、ＡＰ−エピトープの熱安定性を評価した。各ＡＰ−エピトープの残留活性を、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ８．０，２．５ｍＭＰＮＰＰ中の５ｎＭタンパク質で前述のごとくアッセイした。ＡＰ−エピトープの熱安定性から、エピトープの置換または挿入がＡＰの全体構造にほとんど影響しないことが判る。表３には、１５分間で酵素活性の５０％が失われた温度（Ｔ_1/2）が与えられている。ＡＰ−エピトープＡＰＩ６及びＡＰＩ７は野生型酵素（７８℃）と同様のＴ_1/2値（それぞれ７９℃及び７７℃）を示したが、ＡＰＩ１の熱安定性は若干低下した（６７℃）。総合すると、速度及び熱安定性データから、アミノ酸４０７と４０８の間に１３個のアミノ酸を挿入しても、３個のアミノ酸（９１〜９３）を１３または１５個のアミノ酸で置換しても、ＡＰの酵素活性または一般構造にはほとんどまたは全く影響しないことが判る。別のアミノ酸配列をＡＰのループ中に収容しても、ＡＰの全体的な折り畳み及び構造に局所的な乱れ以上のものは生じない。ＡＰ−エピトープは活性であることから、ダイマー構造は妨害されていないはずである。実施例５：抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体によるＡＰ−エピトープ酵素活性の変性抗ｇｐ１２０（ＨＩＶ−１）モノクローナル抗体（抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（ＡｍｅｉｃａｎＢｉｏ−ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を付加することにより、ＡＰ−エピトープの活性の変性を調査した。ａ．抗ｇｐ１２０ＭＡｂの透析リン酸緩衝塩類溶液中に供給した抗ｇｐ１２０ＭＡｂを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０マイクロ濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ）を使用してＴＢＳ（５０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．５）中に透析した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０は製造業者指示に従ってＢＳＡで予めブロックした。ＴＢＳ中１％ＢＳＡ２ｍｌをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ３０に加え、室温で数時間インキュベートした。ＢＳＡを排出し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０をｄＨ₂Ｏで濯いだ。水を添加し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎを５０００×ｇ，４℃で１５分間遠心させ、更にこれを繰り返した。２回目の回転の後、保持液（retentate）を排出した。抗ｇｐ１２０ＭＡｂをＴＢＳで２〜３倍に希釈し、上記のごとく遠心した。２００μｌのＴＢＳを保持液に添加し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎを再度遠心し、これを４〜５回繰り返した後、保持液を取り出した。保持液の容積を測定し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルゲル上で電気泳動させた既知濃度のＭＡｂのクーマシー染色濃度に対する同じゲル上の染色バンドの濃度から、抗ｇｐ１２０ＭＡｂの濃度を決定した。ＭＡｂ調製物においてＢＳＡは検出されなかった。ｂ．変性アッセイ５ｎＭ（モノマー）のＡＰ−エピトープを、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ₂，０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ，ｐＨ８．０中の０〜５０ｎＭの抗ｇｐ１２０ＭＡｂと一緒に室温で５〜１０分間インキュベートすることにより、酵素活性の阻害を測定した。ＡＰＩ−抗ｇｐ１２０ＭＡｂ複合体における酵素活性の量は、ＰＮＰＰを終濃度１００〜２００μＭまで添加し、分光光度計で４１０ｎｍにおける吸収の経時的変化をモニターすることにより測定した。ＭＡｂ添加によって阻害された酵素活性の割合を、各抗ｇｐ１２０ＭＡｂ濃度でのｖ₀を抗ｇｐ１２０ＭＡｂ不在下でのｖ₀で除算することで算出した。図６は典型的な実験を示しており、ＰＮＰＰを基質として使用し、０〜１０ｎＭの抗ｇｐ１２０ＭＡｂの存在下で５ｎＭ（モノマー濃度）のＡＰ−エピトープ（ＡＰＩ１，ＡＰＩ６及びＡＰＩ７）及びＡＰを評価した。野生型ＡＰ、ＡＰＩ６及びＡＰＩ７の活性は抗ｇｐ１２０ＭＡｂによって有意に阻害されることはなかった。実際、ＡＰＩ６は抗ｇｐ１２０ＭＡｂの存在下で僅かな活性増加を示した。これに対して、ＡＰＩ１の酵素活性は抗ｇｐ１２０ＭＡｂによって阻害された。阻害量は抗ｇｐ１２０ＭＡｂの濃度の上昇と共に最高４０％まで増加した。未関連抗体（Ｈ１１０，癌胎児性抗原に対するモノクローナル抗体）を添加した場合ではＡＰＩ１の活性は有意に阻害されることはなかった（約１０％の阻害）。基質の特性に阻害が依存するかどうか調査するため、ＡＰの他の基質を使用して変性アッセイを実施した。分光光度計で４９０ｎｍ（ε＝７．５×１０⁴Ｍ^-1 ｃｍ^-1）において、フルオレセインジホスフェート（９３ｍＭＦＤＰ，Ｍｇ塩）のフルオレセインへの変換を測定した。Ｓｐｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ）蛍光光度計を使用し、４−メチルウンベリフェリルホスフェート（１２μＭＭＵＰ）を用いてアッセイを実施した。励起波長３６２ｎｍでＭＵＰのＭＵ（メチルウンベリフェリル）への変換を測定し、４４７ｎｍで放射強度を測定した。図７は、基質としてＦＤＰを使用した場合で、ＰＮＰＰのときと同様にＡＰ、ＡＰＩ６及びＡＰＩ７は抗ｇｐ１２０ＭＡｂによって阻害されないが、ＡＰＩ１は約５０％阻害されたことを示している。基質としてＦＤＰを用いた場合のＡＰＩ１の阻害は、ＰＮＰＰの場合より僅かに高いだけであり、抗ｇｐ１２０ＭＡｂ濃度を（最高５０ｎＭまでに）高めても阻害は増加しなかった。蛍光性基質ＭＵＰを使用し、抗ｇｐ１２０ＭＡｂによるＡＰＩ１酵素活性の阻害を検出した（図８）。このアッセイにおいては、シグナル検出感度がより高く、より少ない量の酵素活性を検出することができた。ＡＰＩ１はｎＭ濃度の抗ｇｐ１２０ＭＡｂによって最高３２％まで阻害された。ＭＵＰアッセイにおいては、分光光度計アッセイの１００分の１である５０ｐＭのＡＰＩ１を使用した。分光光度計アッセイにおけるＰＮＰＰ及びＦＤＰ並びに蛍光アッセイにおけるＭＵＰにより、ｐＭからｎＭの濃度のＡＰＩ１を使用してｎＭ濃度の抗体を検出することができる。存在する抗体の量は、一定範囲内で、酵素活性の低下に比例した。即ち、０．５〜約１０ｎＭの範囲で反応混合物中に存在する抗体を定量することができる。アッセイは、混合と読取りという単純で且つホモジニアスな方式で行われる。天然ゲル及びＳＤＳアクリルアミドゲル上で電気泳動し、抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体（一次抗体）でプローブしたＡＰＩ１、ＡＰＩ６及びＡＰＩ７のウェスターンブロットから、天然及び変性コンホーメーションの両方においてエピトープは認識され、抗ｇｐ１２０ＭＡｂによって結合されたことが判った（図５Ａ〜５Ｂ）。ＡＰは抗ｇｐｌ２０ＭＡｂによって結合されないという事実から、ＡＰ−エピトープにおけるエピトープの存在はＡＰ上の機能的結合部位であったことが検証された。ＨＩＶｇｐ１２０タンパク質の天然部分から取り出され、ＡＰの外来部分に与えられたエピトープは抗体に対する結合親和性を保持していた。ＡＰが阻害されなかったということは、抗ｇｐ１２０ＭＡｂによる阻害は、ＡＰ−エピトープのエピトープへの結合によるものであったことを示している。更に、ＡＰＩ６とＡＰＩ７はエピトープを含んでおり、ウェスターンブロット分析によると抗ｇｐ１２０ＭＡｂを結合するが、それらの酵素活性は抗ｇｐ１２０ＭＡｂによって阻害されなかった。このことは、阻害が、エピトープがＡＰ中に置換または挿入された場所に依存することを示している。ｃ．ペプチド競合抗ｇｐ１２０ＭＡｂによるＡＰＩ１の変性が抗ｇｐ１２０ＭＡｂと、ＡＰ中に挿入されたｇｐ１２０エピトープとの相互作用に因るものであることを判定するため、該エピトープ配列を含むペプチドの阻害をブロックする能力を試験した。ＡｍｅｒｉｃａｎＢｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から得たペプチドは＃２４５０１０ｇｐ１２０（アミノ酸３０２〜３２４）（配列番号２７）： Thy-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-G1y- Arg-Ala-Phe-Val-Thr ；及び＃２４４０１０ｇｐ１２０（アミノ酸３１２〜３２７）（配列番号２８）；Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val- Thr -Ile-Gly-Lysであった。下線を引いた配列はＡＰＩ１中に挿入されたペプチドである。ペプチドが抗ｇｐ１２０ＭＡｂによるＡＰＩ１の阻害を防止できるかどうか判定するため、ＡＰＩ１（５ｎＭ）をペプチド（０〜２００ｎＭ）と混合し、次いで抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（２０ｎＭ）を添加し、混合物を１０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＮＰＰを添加し、酵素活性を測定した。ＡＰＩ１（５ｎＭ）を抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（２０ｎＭ）と一緒に５〜１０分間インキュベートし、次いでペプチド（４μＭ）を複合体に添加し、０〜６時間インキュベートしてからＰＮＰＰを添加し、活性を評価することにより、予め形成したＡＰＩ１−抗ｇｐ１２０ＭＡｂ複合体にペプチドを添加することでＡＰＩ１酵素活性が回復されることを判定した。反応は変性アッセイ緩衝液中で実施し、酵素活性は分光光度計において前述のごとく測定した（実施例５ｂ）。ＡＰＩ１と前混合してから抗ｇｐ１２０ＭＡｂと混合したペプチドは、抗ｇｐ１２０ＭＡｂによるＡＰＩ１の活性の阻害をブロックした（図１０Ａ）。ＡＰＩ１とペプチドとが抗ｇｐ１２０ＭＡｂを結合することにおいて競合することは、エピトープが誘導された抗原性タンパク質を競合によって検出し得るアッセイの基礎となる。存在する抗原の量は、一定範囲内で、酵素活性の増加に比例した。予め形成したＡＰＩ１−抗ｇｐ１２０ＭＡｂ複合体にモル過剰量のペプチドを添加すると、ＡＰＩ１の酵素活性の一部がゆっくり回復された（図１０Ａ）。活性は５〜６時間で完全に回復され、ＡＰＩ１−抗ｇｐ１２０ＭＡｂ複合体が安定であることが示された。抗ｇｐ−１２０ＭＡｂを添加する前に４ｍＭのペプチドを混合すると、抗ｇｐ１２０ＭＡｂによるＡＰＩ１の変性が避けられた。また、このペプチド濃度は、一旦複合体が解離したならば抗ｇｐ１２０ＭＡｂがＡＰＩ１へ再結合するのを防止するのに十分であることも判った。複合体の解離速度定数は、酵素活性の量は抗ｇｐ１２０ＭＡｂが結合したＡＰＩ１の割合に正比例すると仮定し、上記データから計算した（即ち、ＡＰＩ１の１００％に抗ｇｐ１２０ＭＡｂが結合すると６０％の活性が得られ、０％のＡＰＩ１に結合すると１００％の活性が得られた）。Ｉｎ（変性率）対時間のプロットは、解離速度定数（ｋ_d）が負であることに相当する傾斜を有した（図１０Ｂ）。複合体のｋ_dは１．７×１０^-4秒^-1（複合体の半減期は６８分）であることが判った（図１０Ｂ）。実施例６：ＡＰＩ−抗ｇｐ１２０複合体検査用の天然ゲルＡＰ−エピトープと抗ｇｐ１２０ＭＡｂとの複合体形成を天然ゲル電気泳動によって調査した。ＡＰＩと抗ｇｐ１２０ＭＡｂとを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ７．５で希釈し、種々の濃度で混合した。室温で１０〜１５分間インキュベートした後、試料（２μｌ）をＰｈａｓｔＧｅｌ均一７．５％または１２．５％ゲル上でＰｈａｓｔＧｅｌ天然緩衝液ストリップ（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を使用して電気泳動した。電気泳動後、ＡＰ活性に対してゲルを発色するまで染色した（実施例３ｃ）。ＡＰＩ１は最高４０〜５０％まで阻害され、ＡＰＩ６及びＡＰＩ７は１０倍モル過剰量の抗ｇｐ１２０ＭＡｂでさえ阻害されなかった。タンパク質調製物中に存在する全てのＡＰ−エピトープに結合する抗ｇｐ１２０ＭＡｂの能力が天然ゲルを使用して示された。図１１Ａは、抗ｇｐ１２０ＭＡｂを含んでまたは含まずにプレインキュベートし、ＡＰ及びＡＰＩ１の酵素活性に対して染色した天然ゲルを示す。ＡＰの移動は抗ｇｐ１２０ＭＡｂによって変化されておらず、これは安定な複合体が形成されなかったことを示している。これに対して、ＡＰＩ１（１．１μＭ）を０．６７μＭの抗ｇｐ１２０ＭＡｂと一緒にインキュベートすると、ＡＰＩ１の一部は移動のより遅い種にシフトする結果となった。このゲルのシフトは、ＡＰＩ１が抗ｇｐ１２０ＭＡｂとの複合体であったことを示している。図１１Ｂは、０．５μＭのＡＰＩ１を０〜１μＭの抗ｇｐ１２０ＭＡｂを用いて滴定したものを示す。抗ｇｐ１２０ＭＡｂ濃度が増加するにつれて、全てのＡＰＩ１は複合体にシフトした（少なくとも３種類の複合体がゲル上に見ることができる）。抗マウスＩｇＧ結合体でプローブした同様のゲルのウェスターンブロットは、抗ｇｐ１２０ＭＡｂが複合体で存在することを示した。この結果から、調製物中の全てのＡＰＩ１タンパク質は、活性が４０〜５０％阻害されていてさえ、抗ｇｐ１２０ＭＡｂによって結合され得ることが判る。抗ｇｐ１２０ＭＡｂの存在下でのＡＰＩ６及びＡＰＩ７の天然ゲルは、全てのＡＰＩ６が抗ｇｐ１２０ＭＡｂと複合体を形成したが、ＡＰＩ７は安定な複合体を形成しなかったことを示した。ＡＰＩ７は抗ｇｐ１２０ＭＡｂを使用したウェスターンブロットにおいて検出されたが、その活性は抗ｇｐ１２０ＭＡｂによって阻害されなかった。天然ゲルは、抗ｇｐ１２０ＭＡｂ存在下でＡＰＩ７は不安定な複合体となることを示していた。実施例７：ホモジニアスアッセイにおけるＡＰ−エピトープの適用ＡＰ−エピトープに基づくアッセイのための結合分子は、抗体、タンパク質抗原、またはペプチド配列によって模倣され得る任意の抗原といった巨大分子とし得る。ＡＰ−エピトープは、反応混合物中のエピトープに対する抗体の存在または量を検出するための直接アッセイに使用し得る。このようなアッセイでは、抗体が存在すると酵素活性は低下する（図１２）。或いは、反応混合物中に存在する抗体を結合することにおいてＡＰ−エピトープと競合させることにより、エピトープ配列を含む抗原性タンパク質を検出することもできる。このようなアッセイでは、反応混合物中に抗原が存在するとＡＰ−エピトープに結合する抗体をブロックまたは低減し、酵素活性が増加する結果となる（図１３）。ａ．抗体検出抗体結合によって変性されるＡＰ−エピトープは、定性及び定性ホモジニアスアッセイに使用し得る。エピトープに対する抗体を検出する定性分析においては、検査試料の存在下でのＡＰ−エピトープの活性を、試料不在下での活性と比較する。酵素活性が低下すればそれはエピトープに対する抗体が検査試料中に存在することを示している（図１２及び図６〜８）。定量分析においては、検査試料中の抗体の量、即ち所与の量の検査試料による酵素活性の低下を、校正曲線と比較する。校正曲線は、既定量の抗体をＡＰ−エピトープに添加し、阻害の程度を抗体濃度の関数として測定することにより生成された。検査試料中の抗体の量は、同レベルの阻害を与える校正目盛り内の抗体の濃度に等価であった。ｂ．抗原検出エピトープを含む抗原の検出は、ＡＰ−エピトープと検査試料とが反応混合物中に存在する抗体を結合することにおいて競合する競合アッセイである。定性分析おいては、検査試料の存在下及び不在下で抗体を添加した時のＡＰ−エピトープの阻害レベルを比較する。抗原が検査試料中に存在するならば、それは抗体を結合し、ＡＰ −エピトープに結合し得る抗体の量を減らし、従って酵素活性レベルは高くなる。抗原が試料中に存在しないならば、全ての抗体はＡＰ−エピトープに結合し得、酵素活性レベルは低くなる。抗原の定量分析においては、試料中の抗原のレベルを校正曲線と比較することにより決定する。校正曲線は、既定濃度の抗原を反応混合物に添加し、ＡＰ−エピトープの酵素活性レベルを存在する抗原の量の関数として測定することによる生成される。ｃ．ホモジニアスアッセイ方式ホモジニアスアッセイにＡＰ−エピトープを使用するのは、結合した抗体がＡＰ−エピトープの酵素活性を変性し得ることによる。ＡＰ−エピトープは更に、酵素活性の変性を必要としない方法でヘテロジニアスアッセイに使用することもできる。例えばＡＰＩ６及びＡＰＩ７は抗体を結合するが、変性はされない。ヘテロジニアスアッセイ方式においては、ＡＰ−エピトープを使用して抗体を酵素標識する。試料中の抗体を固相上に捕捉し、ＡＰ−エピトープを添加して抗体に結合させ、固相を洗浄し、結合しなかったＡＰ−エピトープを除去する。エピトープに対する抗体が試料中に存在するならば、ＡＰ−エピトープは捕捉され、洗浄ステップ後にＡＰ活性が検出される。エピトープに対する抗体が試料中に存在しないならば、ＡＰ−エピトープは捕捉されず、酵素活性は検出されない。同様に、試料中の抗原を競合によって検出し得る。固相上の抗体を使用して抗原またはＡＰ−エピトープを捕捉する。試料中に抗原が存在すると抗体によって捕捉されるＡＰ−エピトープの量は低減し、検出される酵素活性は低下する。試料中に抗原が存在しなければ全ての抗体は自由にＡＰ−エピトープを結合し得、酵素活性は高くなる。両タイプのヘテロジニアスアッセイは、ホモジニアスアッセイに対して記載したように定性または定量分析であり得る。実施例８：システイン突然変異によるハイブリッド酵素の調製突然変異誘発に用いるベクターｐＵＣｐｈｏＡは先に述べたのと同じものとする。簡単に言えばこのプラスミドは、やはりスクリーニング用のβ−ラクタマーゼを発現する高コピープラスミド（５０〜２００／細胞）である市販のプラスミドｐＵＣ１８のマルチクローニング領域に挿入されたＡＰ遺伝子（ｐｈｏＡ）から成る。ｐｈｏＡ遺伝子は発現のための天然リボソーム結合部位と、細胞質ゾルからペリプラズム中への送出の間にタンパク質分解によって切断される先導配列とを有する。遺伝子全体（１４５４塩基対）を、ｐＵＣ１８マルチクローニング領域のＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIの制限エンドヌクレアーゼ部位間に挿入した。ｐＵＣ１８ベクターのＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII制限部位間に挿入したＡＰ遺伝子の配列を、前記配列の上側に示す。また、脱字記号（Λ）で示した成熟タンパク質の第１残基から始まるアミノ酸配列も、右手に残基数を付して示してある。調製した突然変異体は、いずれの場合もシステインに変化した天然残基に下線を引くことによって示す。（図１５Ａ〜１５Ｃ；配列番号２６はヌクレオチド配列、配列番号３１はアミノ酸配列）。システイン突然変異体の調製には二つの方法、即ち断片置換による突然変異誘発とＭ１３突然変異誘発とを用いた。前者の方法で突然変異体ｐＫＪ１〜ｐＫＪ７（ハイブリッド酵素ＫＪ１〜ＫＪ７をコードするプラスミド）を調製し、一方後者の方法では突然変異体ｐＫＪ８〜ｐＫＪ１２（ハイブリッド酵素ＫＪ８〜ＫＪ１２をコードするプラスミド）を調製した。断片置換法はｐＫＪ３の調製に関して詳述し、Ｍ１３突然変異誘発はｐＫＪ９に関して詳述する。制限エンドヌクレアーゼ及びその他の酵素はいずれも、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓから購入した。形質転換用のコンピテント細胞はＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ＤＮＡオリゴマーはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒａｍｓｅｙ，ＮＪ）から入手可能な３９４型または３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置で、標準的な化学操作を用いて合成した。突然変異体の特徴解明は、ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｅｑｕｅｎａｓｅＶ２．０配列決定キットと、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な電気泳動装置Ｓ２型とで行なうＳａｎｇｅｒ配列決定法を用いて実施した。Ｍ１３突然変異誘発は、Ｂｉｏ−Ｒａｄから入手可能なＭｕｔａ−ＧｅｎｅＭ１３ＩｎＶｉｔｒｏ突然変異誘発キットと、このキットにおいて説明されている操作手順とを用いるＫｕｎｋｅｌ法（Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，ｐｐ．４８８−４９２，１９８５）によって行なった。ａ．断片置換による突然変異（ｉ）制限酵素ＳｐｅＩ及びＭｌｕＩでのｐＵＣｐｈｏＡの二重消化４μｇのプラスミドｐＵＣｐｈｏＡをＲｅａｃｔ＃３緩衝液（ＢＲＬ）中で制限エンドヌクレアーゼＳｐｅｌ（１０Ｕ）及びＭｌｕＩ（１０Ｕ）で処理し、総量４０μｌとして３７℃で２時間インキュベートした。反応混合物を濃縮し、これを１％低融点アガロースゲルに適用して電気泳動させた。切断されたベクターに対応するバンドをゲルから切り出し、Ｐｒｅｐ−ａ−Ｇｅｎｅキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。（ii）突然変異ＬＹＳ１６７ＣＹＳを有する２本鎖置換体の調製ＤＮＡオリゴマー５′−ＣＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＧＣＧＴＣＣＧＡＧＣＧＣＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＣＣＧＧＧＴＡＡ−３′ （点突然変異に下線）（配列番号３２）、及びその突出末端部を含めた相補的オリゴマー５′−ＣＧＣＧＴＴＡＣＣＣＧＧＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＧＣＧＣＴＣＧＧＡＣＣＧＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡ−３′（配列番号３３）をアクリルアミドゲル電気泳動法で精製し、次のようにリン酸化した。オリゴマー（４００ｐｍｏｌ）、ＡＴＰ（１０ｍＭ）及びＴ４オリゴヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ）を４０μｌの連結緩衝液（ＢＲＬ）中で３７℃で１時間インキュベートし、その後６５℃で２分間熱失活させた。溶液を濃縮し、１００ｐｍｏｌの各オリゴマーを取り出して共に２０μｌの連結緩衝液（ＢＲＬ）中に存在させ、７０℃に加熱し、２時間にわたってアニールさせた。（iii）消化したベクター中への断片置換体の連結、形質転換、及び突然変異体プラスミドの単離消化したベクター（０．２ｐｍｏｌ）、アニールさせた置換体（１０ｐｍｏｌ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ）を共に２０μｌの連結緩衝液中に存在させ、１６℃で１６時間インキュベートした。アニールさせたオリゴマー以外の上記物質を総て含む陰性対照もインキュベートした。連結混合物（５μｌ）を、熱ショックによるＨＢ１０１コンピテント細胞の形質転換に直接用いた。形質転換細胞を、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２００μｇのＢＣＩＰを伴ったＬＢ寒天培養プレート上に様々な濃度で植え付け、３７℃で一晩インキュベートした。青色コロニーの幾つかのクローンを採取して、１５０ μｇ／ｍｌのアンピシリンを伴った５ｍ＝のＬＢ培地に接種し、３７℃で６時間増殖させた。突然変異体プラスミドを、標準的なプラスミド単離操作（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，１９８９）で単離した。（iv）所望の突然変異の特徴解明プラスミドを突然変異の領域において配列決定して、所望の突然変異が存在すること、及びオリゴマー置換体の領域内に他の突然変異は存在しないことを確認した。突然変異確認後、所望のプラスミドで、ＡＰを欠く大腸菌株であるＭＺ１３ｂ細胞を形質転換し、これをタンパク質単離のために増殖させた。ｂ．Ｍ１３突然変異誘発（ｉ）制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIでのｐＵＣｐｈｏＡの二重消化４μｇのプラスミドｐＵＣｐｈｏＡをＲｅａｃｔ＃３緩衝液（ＢＲＬ）中で制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（１０Ｕ）及びＨｉｎｄIII（１０Ｕ）で処理し、総量４０μｌとして３７℃で２時間インキュベートした。反応混合物を濃縮し、これを１％低融点アガロースゲルに適用して電気泳動させた。切断されたＡＰ遺伝子（１４５４ｂｐ）に対応するバンドをゲルから切り出し、Ｐｒｅｐ− ａ−Ｇｅｎｅキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。（ii）制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIでのＭ１３ｍｐ１８の二重消化４μｇのプラスミドＭ１３ｍｐ１８をＲｅａｃｔ＃３緩衝液（ＢＲＬ）中で制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（１０Ｕ）及びＨｉｎｄIII（１０Ｕ）で処理し、総量４０μｌとして３７℃で２時間インキュベートした。反応混合物を濃縮し、これを１％低融点アガロースゲルに適用して電気泳動させた。切断されたベクターに対応するバンドをゲルから切り出し、Ｐｒｅｐ−ａ−Ｇｅｎｅキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。（iii）消化したＭ１３ｍｐ１８ベクター中へのｐｈｏＡ遺伝子の連結、及び形質転換消化したベクター（０．５μｇ）、ｐｈｏＡ遺伝子（１μｇ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１Ｉ０Ｕ）を共に１０μｌの連結緩衝液（ＢＲＬ）中に存在させ、１６℃で１６時間インキュベートした。連結混合物を４０μｌの水で稀釈し、１μ ｌの稀釈した連結混合物を用いてコンピテントＤＨ５ａＦ′細胞を形質転換した。形質転換細胞を、１０μｌのＩＰＴＧ（１００ｍＭ）、５０μｌの５−ブロモ −４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘｇａｌ；ＤＭＦ中に２％）及び５０μｌのＤＨ５ａＦ′ローン細胞を伴った寒天上に植え付け、３７℃で一晩ィンキュベートした。（１）ｐｈｏＡ遺伝子を含まない消化ベクター、及び（２）ベクターに組み込んでいないｐｈｏＡ遺伝子から成る陰性対照も連結し、かつ形質転換に用いた。その結果、連結の成功を示す多くの無色のＭ１３ｍｐ１８／ｐｈｏＡプラークが得られた一方、陰性対照ではプラークは生じなかった。（iv）Ｍ１３ｍｐ１８／ｐｈｏＡファージ及びＲＦＤＮＡの単離及び特徴解明二つの無色プラークを採取し、５ｍ＝の２ＸＹＴ（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，１９８９）培地中で３７℃で１６時間、１０μｌのＤＨ５ａＦ′ローン細胞と共に増殖させた。細胞と上清（ファージ）とを遠心によって分離し、その後細胞からＲＦプラスミドを標準的操作（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，１９８９）で調製した。２ｍｌのファージ上清を取り置いた。ＲＦＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで上述の実施例と同様に消化したところ、Ｍ１３ベクター中にｐｈｏＡ遺伝子が存在することが判明した。ファージ上清をＤＨ５ａＦ′ローン細胞に対して滴定して、該上清が５×１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌを有することが明らかとなった。（ｖ）ウラシル含有Ｍ１３ｍｐ１８／ｐｈｏＡファージ（ｓｓＤＮＡ）の調製及び単離３００ｍｌのＣＪ２３６細胞（Ｂｉｏ−Ｒａｄから入手可能なＭｕｔａ−ＧｅｎｅＭ１３ＩｎＶｉｔｒｏ突然変異誘発キット）の増殖培養物に１μｌのＭ１３ｍｐ１８／ｐｈｏＡファージ上清を、感染の多重度（ｍｏｉ）０．１の場合のＯＤ₆₀₀＝０．３で添加し、３７℃で６時間増殖させた。上清を取り置き、この上清からファージ及び対応するｓｓＤＮＡを、標準的な操作（Ｍａｎｉａｔｉｓ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒiｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，１９８９）を用いて単離した。２ｍｌのファージ上清を取り置き、これをＣＪ２３６細胞とＤＨ５ａＦ′ローン細胞との両方に対して滴定した。力価に、ウラシル含量が高い場合に特徴的である１０⁵の差を測定した。このように得られたｓｓＤＮＡを総ての突然変異プライマー反応に用いた。（vi）突然変異体ｐＫＪ９の調製；突然変異鎖の合成突然変異ＧＬＵ４０７ＣＹＳ（下線部）（“ＧＬＵ４０７ＣＹＳ”は残基４０７のグルタミン酸がシステインによって置換されることを示す）に対応するＤＮＡオリゴマー５′−ＧＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＡＴＣＧＣＡＴＴＣＧＧＡＧＴＴＣＣＣＧ−３′（配列番号３４）を先に述べたようにリン酸化し、最終濃度を４ｐｍｏｌ／μｌとするべく１００μｌに稀釈した。１μｌのオリゴマーと０．０８ｐｍｏｌのウラシル含有鋳型とをアニールさせ、これをＭｕｔａ−Ｇｅｎｅマニュアルに従ったポリメラーゼ反応に添加した。ポリメラーゼ反応混合物を用いてＤＨ５ａＦ′コンピテント細胞を、ＸｇａｌをＢＣＩＰに替えた以外は先に述べたようにして形質転換した。陰性対照（鋳型であるが、突然変異プライマーではない）は四つの青色プラークの形成を実現し、一方突然変異反応混合物は幾多の青色プラークをもたらした。（vii）突然変異体ファージ及びＲＦＤＮＡの単離及び配列決定幾つかの青色プラークを採取し、３ｍｌの２ＸＹＴ培地中で３７℃で６時間、２０μｌのＤＨ５ａＦ′ローン細胞と共に増殖させ、その後上清からｓｓＤＮＡを、また細胞からＲＦＤＮＡを標準的操作で単離した。ｓｓＤＮＡの配列決定によって、所望の突然変異を有するクローンを同定した。当該突然変異体に対応するＲＦＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、突然変異体ｐｈｏＡ遺伝子を先に述べたように単離した。（viii）突然変異体ｐｈｏＡ遺伝子のｐＵＣ１８中への連結プラスミドｐＵＣ１８を、先に述べたのと同様の操作でＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、かつ精製した。切断したベクター中に突然変異体ｐｈｏＡ遺伝子を、既述の操作を用いて連結した。連結混合物を用いてＭＺ１３ｂ細胞を、タンパク質発現のために直接形質転換した。実施例９：ハイブリッド酵素の生成及び抽出突然変異体プラスミドを導入した大腸菌株ＭＺ１３ｂを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを伴った２＝のＬＢ培地中で３７℃で一晩増殖させた。細胞を遠心によって回収し、２０ｍｌの緩衝液（０．１５ＭトリスＨＣｌ，０．９％ＮａＣｌ；ｐＨ６．６）中に再懸濁させた。ハイブリッド酵素がペリプラズム中へ送出されたため、スフェロプラスト化によってペリプラズムタンパク質が放出された。懸濁細胞を１２０ｍｇのポリミキシンＢ（６ｍｇ／ｍｌ）で処理し、３７℃で１５分間インキュベートした。上清を遠心によって細胞破片から分離し、０．２ｍｍフィルターで濾過した。実施例１０：ハイブリッド酵素の精製ａ）表面スルフヒドリル基の保護もしくは“キャッピング” ハイブリッド酵素粗抽出物中では結合に関与するべきスルフヒドリル基が露出し、従って酸化または他の望ましくない反応を被った。ハイブリッド酵素の表面に位置する、導入されたシステインはジスルフィドとして酸化されて、多くの異なる硫黄含有細胞成分となった。これらの付加物を均質な状態で生成させるべく、ハイブリッド酵素を還元し、その後別のスルフヒドリル基と反応させた。細胞抽出物を室温で２０分間ＤＴＴ（最終濃度２ｍＭ）で処理した。システインを最終濃度１０ｍＭとなるように添加し、混合物に酸素を２〜６時間通気した。システアミン、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロピオン酸、グルタチオンまたはチオサリチル酸等といった他のスルフヒドリル保有化合物にも同様の条件を用いた。あるいはまた、還元後に活性チオールを導入することも可能である。還元した混合物を室温で１時間、エルマン試薬［または２，２′−ジチオピリジン、５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）もしくはジチオサリチル酸等］で処理した。ｂ）ハイブリッド酵素の精製キャッピングしたハイブリッド酵素を含有する抽出物を脱イオン水で１ｌに稀釈し、これを蠕動ポンプによって、２５ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ₂ 、ｐＨ８．０で平衡させたＤＥＡＥセファローズのカラムに適用した。カラムを２５ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ₂、ｐＨ８．０中の５０ｍＭＮａＣｌで平衡するまで洗浄した。活性タンパク質の溶離を２５ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ₂、ｐＨ８．０中の、濃度勾配５０→２００ｍＭのＮａＣｌで行なった。活性画分を８０→１２０ｍＭ塩で溶離した。精製したハイブリッド酵素の特徴を、標準的な技術を用いてタンパク質に関するＡ₂₈₀ｎｍと酵素に関するＡ₄ ₁₀ ｎｍとの両方によって解明した。活性画分を一つに合わせ、限外濾過を用いて濃縮した。この時点で、ハイブリッド酵素は化学的誘導体生成に十分な純度を有した。比活性測定のために均質性を得るべく、ＨＰＬＣを用いて更に精製した。濃縮溶液（タンパク質１〜２ｍｇ／ｍｌ）をＰＯＲＯＳＲ／Ｈ逆相ＨＰＬＣカラム上に注ぎ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ₂、ｐＨ８．０中の、濃度勾配０→８０％のアセトニトリルで２０分にわたり溶離した。１１分経過時点でハイブリッド酵素を、約３０％のアセトニトリルで溶離した。同じ条件を用いて、化学的に結合させたハイブリッド酵素を精製した。このようにして１２種のハイブリッド酵素を調製した。ハイブリッド酵素の比活性及び減衰（化学結合後の抗体結合に際しての活性損失率）を測定した。得られたデータを表４に示す。小文字の“ｐ”はプラスミドを示すのに用いてあり、一方“ＫＪ”は任意のアルファベットである。“ＫＪ”に続く数字は突然変異体の逐次調製を表わしている。略号“ｐＵＣ”は、発現遺伝子挿入前の初期ベクターの市販フラスミドｐＵＣ１８を意味する。例えば、ｐＫＪ３．ｐＵＣは市販プラスミドｐＵＣ１８に挿入された、ハイブリッド酵素３をコードするプラスミドを示す。例えばｐＫＪ３．ｐＵＣから得られる、対応するハイブリッド酵素はＡＰＫＪ３である。標準的な慣例は“Ｌｙｓ１６７Ｃｙｓ”などの記号にも適用され、前記記号はＡＰの残基１６７のリシンがＡＰＫＪ３のシステインによって置換される突然変異を意味する。実施例１１：ハイブリッド酵素にリガンドを結合させる一般的方法結合反応のための諸条件は用いる架橋剤次第であった。好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基及びヨードアセトアミド基を各一方の末端に有するヘテロ二官能性架橋剤を用いることによってリガンドを活性化する。リガンドを最初にアルカリ性緩衝液中で上記架橋剤で処理し、それによってＮ−ヒドロキシスクシンイミド基と、ペプチドの１個以上のアミノ官能基との反応を生起させた。クロマトグラフィーまたは結晶化による精製後、得られた活性リガンドを、好ましくはその活性部位近傍にシステイン（Ｃｙｓ）置換基を有するハイブリッド酵素と中性ｐＨにおいて反応させた。得られたハイブリッド酵素−リガンド結合体を、脱塩カラムに通して過剰な、及び未反応のリガンド並びに他の望ましくない塩及びイオンを除去することにより大体精製した。この物質は、固定化された抗リガンド抗体を収容したアフィニティーカラムに通すことによって更に精製可能である。未結合のハイブリッド酵素はカラムをそのまま通過したが、ハイブリッド酵素−リガンド結合体は保持された。保持されたハイブリッド酵素−リガンド結合体を後に、カオトロピック溶媒または他の特異的溶離剤でカラムから溶離した。ハイブリッド酵素−リガンド結合体を、アッセイにおけるその性能について評価した。基本的には、ハイブリッド酵素−リガンド結合体と、特異的抗体と、分析対象を含有する標本とから成る混合物をインキュベートした。上記成分は逐次または同時に混合し得ると理解されるべきである。次に、酵素基質を添加し、酵素反応に関連する光度変化を測定した。基質濃度は総じて１μＭから５０ｍＭとしたが、０．２〜１０ｍＭが好ましかった。結合体の濃度は総じて１０ｎｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌとし、その際好ましいのは１〜１０μｇ／ｍｌであった。抗体濃度は総じて１ｎｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌとし、その際好ましいのは１〜５０μｇ／ｍｌであった。適当な緩衝液は用いる酵素、及び酵素活性にとって最適な諸条件に依存する。インキュベーション温度は、基質添加前のインキュベーションに室温を用い、また酵素反応のために３７℃の温度を用いる以外は典型的には約１０〜約４５℃とする。インキュベーション時間は、免疫化学結合のためには１分から一晩までとし得、酵素反応のためには３０分以下とし得る。好ましいインキュベーション時間は、免疫化学結合のためでも酵素反応のためでも１０分間である。用いる基質は、紫外線検出、可視光検出、蛍光検出、燐光検出、発光検出または電気化学的検出用であり得る。ハイブリッド酵素へのリガンドの結合は、脱保護した酵素の水溶液を、スルフヒドリル基の硫黄と共有結合する官能基を有するリガンドの誘導体に暴露することによって実現した。最も好ましいのは、上記リガンドのヨードアセトアミドまたはマレイミド誘導体であった。これらの誘導体のうちの幾つかの構造を図１６Ａ及び図１６Ｂに示す。反応性基は、有効に配置されたスルフヒドリル基の位置でハイブリッド酵素に結合し、安定な共有結合を構成した。結合操作では大過剰量の活性リガンドを、リガンド誘導体を維持する溶媒、好ましくはジメチルホルムアミドに溶解させた。活性リガンドはハイブリッド酵素及び脱保護剤に比較してモル過剰量で存在させなければならない。次に、作製した溶液を、新たに脱保護したハイブリッド酵素の溶液に添加した。反応完了までに必要な時間は主として、いずれのハイブリッド酵素を用いるかに依存した。ＡＰＫＪ３では反応は１５分以内に完了したが、ＡＰＫＪ４の場合は６時間にも及ぶ時間が必要なことも有った。得られた混合物をゲル濾過カラムに通して、有機溶媒及び余分のリガンド誘導体を除去した。タンパク質濃度をクーマシーブルー（Ｐｉｅｒｃｅ）タンパク質試薬で測定した。精製したハイブリッド酵素をヨードアセトアミド−リガンドに室温で結合させた。１ｍｌの精製ハイブリッド酵素に１０μｌの１００ｍＭＤＴＴを添加した。ＤＴＴは０．１Ｍトリス（ｐＨ７．５）に溶解させた。この混合物を３〜４時間反応させ、反応後に１００μｌの、リガンド−ヨードアセトアミド成分（例えばアミノメチルテオフィリンヨードアセトアミドまたはアミノプロピルテオフィリンヨードアセトアミド）の５００ｍＭＤＭＦ溶液を添加した。結合腕（ｌｉｎｋｅｒａｒｍ）の長さは、突然変異の活性部位からの距離に応じて様々となり得る。典型的には、上記反応には室温で約３０分掛かり、その後反応混合物を脱塩カラムに通して余分のリガンド−ヨードアセトアミドを除去した。上記カラム内に用いる緩衝液は通常５０ｍＭトリス及び１ｍＭＭｇＣｌ₂（ｐＨ７．５）とした。高タンパク質画分を一つに合わせてタンパク質濃度を、クーマシーアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いるＡ₅₉₄ｎｍ読み取りによって測定した。得られた結合体を濃度０．１５μｇ／ｍｌ（またはＣｏｂａｓＭｉｒａ，ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍｏｎｔｃｌａｉｒ，ＮＪなどの分析機において０．１の吸光単位）で用いた。稀釈緩衝液は、０．１Ｍトリス、１ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭＺｎＣｌ₂及び０．５％ＢＳＡ（ｐＨ７．５）とした。実施例１２：ハイブリッド酵素−リガンドを評価する一般的方法結合体調製したハイブリッド酵素−リガンド結合体を特異的抗体で試験して、前記抗体が酵素活性に影響する程度を測定した。図１７に、テオフィリン誘導体Ｔ１及びＴ４に結合させたハイブリッド酵素ＡＰＫＪ３に関する結果を示す。ハイブリッド酵素−リガンド結合体を、テオフィリンに対するヒツジポリクローナル抗体及びマウスモノクローナル抗体の両方で試験した。抗体がハイブリッド酵素−リガンド結合体の活性を減衰させる一般的傾向が認められたが、異なるハイブリッド酵素−リガンド結合体間、及び同じハイブリッド酵素−リガンド結合体に対して用いられた異なる抗体間の著しい相違が明らかとなった。酵素活性は抗体の添加と共に、抗体濃度がハイブリッド酵素−リガンド結合体の濃度とほぼ等しくなるまで低下し、それ以後は活性低下は起こらなかった。抗体もハイブリッド酵素−リガンド結合体も二価であるので、観察された化学量論的に１：１の反応は予測されていた。抗体飽和時の酵素活性の減衰度は、抗体とハイブリッド酵素−リガンド結合体との両方の構造的特徴に依存する一特性であった。図１８Ａ及び図１８Ｂに、ハイブリッド酵素の三つの異なる部位にテオフィリン誘導体が様々な長さの結合基（ｌｉｎｋｅｒｇｒｏｕｐ）を介して結合したハイブリッド酵素−リガンド結合体の、飽和量の抗体の存在下に残留する酵素活性を示す。ハイブリッド酵素ＡＰＫＪ５では、結合基は活性部位凹部内に最も深く位置する。ハイブリッド酵素ＡＰＫＪ３では結合基は中くらいの深さに位置し、ハイブリッド酵素ＡＰＫＪ４では凹部の開口付近に位置する。図１８Ａには、ヒツジポリクローナル抗体及びマウスモノクローナル抗体に関する結果を示す。図示のグラフから、結合基がテオフィリン基を活性部位から十分隔てて配置した場合にのみ抗体がハイブリッド酵素−リガンド結合体活性を減衰させることが明らかとなった。ハイブリッド酵素ＡＰＫＪ３−リガンド結合体は中くらいの長さの結合基を必要とし、ハイブリッド酵素ＡＰＫＪ４−リガンド結合体は最も短い結合基の下で抗体による活性減衰を示した。興味深いことに、ヒツジポリクローナル抗体はハイブリッド酵素−リガンド結合体の活性を、マウスモノクローナル抗体よりも短い結合基の下で減衰させた。このことは、用いたモノクローナル抗体の特殊性の影響ではなく、抗体を取得した種の影響であると考えられ、なぜなら他のリガンド及び様々な抗体に関して同じ依存性が観察されたからである。結合基長に関する結果は本発明の系のモデルと整合した。上記モデルによれば、嵩高な抗体の立体干渉は基質が酵素の活性部位に近づくことを妨げる。リガンドが活性部位凹部内にあまりに深く配置された時、抗体は該抗体自体の嵩高さが原因で結合し得なかった。リガンドが活性部位凹部からあまりに遠く配置された時には抗体も、基質の接近を大幅に制限するにはあまりにハイブリッド酵素から離れた位置で結合することになった。抗体の結合を可能にし、かつ最大の減衰を実現する最適の距離が見いだされた。ＰＮＰＰ以外の様々な基質、小型分子、及びＡＰにとっての普通の基質に関して得られた結果を比較することによって、上記モデルは更に支持された。ハイブリッド酵素−リガンド結合体に対する抗体結合の制限的な作用は、基質が大型であるほど顕著となろう。表５に、様々な基質、即ち４−ニトロ−フェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、フルオレセインジホスフェート（ＦＤＰ）及びジメチル−フルオレセインジホスフェート（ＤＭＦＤＰ）を用いて測定した、飽和抗体濃度におけるテオフィリンハイブリッド酵素−リガンド結合体（リガンドとしてテオフィリンを使用）の残留活性を示す。ＰＮＰＰより大型のＦＤＰの場合にはるかに大幅な減衰が実現したことが明らかとなった。最大の基質ＤＭＦＤＰの場合に最も大幅な減衰が実現した。表５中に掲げた数字は対照（抗体結合せず＝１）を基準とした比率である。活性変化が常に減衰であるとは限らない。図１９に、様々な結合基を有するリガンドとしてのチロキシン誘導体を伴ったハイブリッド酵素ＡＰＫＪ３（２０ｐＭ）に付加したモノクローナル抗体の、ｐＨ８．０におけるＰＮＰＰの存在下での作用を示す。最も短い結合基を有するハイブリッド酵素−リガンド結合体Ｔｈｙ−３は、抗体を付加すると通常の活性低下を示した。より長い結合基を有するハイブリッド酵素−リガンド結合体ＴｈｙＡ−３、ＴｈｙＢ−３、ＴｈｙＣ−３は、抗体を付加すると活性の上昇を示した。抗体によるこのような活性上昇は、ＡＰＫＪ３とリガンドとしてのフルオレセインとの結合体に関しても、フルオレセインに対するモノクローナル抗体を用いて確認した。幾つかのハイブリッド酵素−リガンド結合体の酵素活性は、先の試験で酵素活性の低下を招いた抗体の存在下でよりも不在下での方が低かった。このことは、チロキシン（またはフルオレセイン）リガンド自体がハイブリッド酵素−リガンド結合体の活性部位に干渉したこと、及び抗体がリガンドに結合することによって前記干渉が除去されたことを示すものであった。試験したリガンドのうちでチロキシン及びフルオレセインのみがフェノール性ヒドロキシル基を有した。フェノール性ヒドロキシル基と、触媒中心に位置する反応性基との水素結合は低活性の原因となり得た。イムノアッセイでは、抗体によって惹起される酵素活性の減衰は分析対象の存在によって影響されるはずである。図２０に、様々な濃度のヒツジ抗体の存在下にテオフィリンハイブリッド酵素−リガンド結合体（Ｔ１−３；２０ｍＭ）にμ ｌ量の、血清主体のテオフィリン検量物質を添加することの影響を示す。Ｔ１− ３とは、Ｔ１（アミノメチルテオフィリン）に結合したハイブリッド酵素ＡＰＫＪ３のことである。抗体不在下では、酵素活性はテオフィリン濃度と無関係に高かった。抗体を付加すると、テオフィリン濃度０の時の活性は飽和抗体濃度に達するまで低下した。テオフィリンの付加によって酵素活性は、テオフィリン量に応じて回復し、その際回復した最高活性は抗体不在下にみられた活性に類似した。アッセイフォーマットでの使用のために、試料量並びに抗体及びハイブリッド酵素−リガンド結合体の濃度を所望の感度が得られるように選択した。成分同士を好ましくは次のように混合した。試料と結合分子とを合わせて０〜３０分間インキュベートし、その後ハイブリッド酵素−リガンド結合体を添加して混合物を０〜３０分間インキュベートした。基質を添加し、反応を５秒間から３０分間監視した。アッセイを、既知濃度の分析対象を含有する溶液で検量した。未知物質の試料を上記アッセイ操作で扱い、その分析対象濃度は、シグナルを検量物質に関する結果から決定した曲線と比較することによって決定した。実施例１３：結合基を有するリガンドの一般的な調製リガンドのハイブリッド酵素への結合には通常、ヨードアセトアミド官能基が適当であった。リガンドの適当なアミン誘導体から出発して対応するヨードアセトアミドを、好ましくはメタノールまたは水性メタノール中で基本条件下に行なうヨード酢酸無水物への、またはヨード酢酸の活性エステル（好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）への暴露により容易に調製した。リガンドのヨードアセトアミドは通常アミンほど水溶液に易溶でないので、生成物はしばしば沈澱によって反応混合物から単離可能であるが、場合によってはクロマトグラフィーでの精製が必要となることも有る。単純なヨードアセトアミドを用いた場合よりも、結合基を有効アミンから離して配置したリガンドを調製するには、ヨードアセトアミド活性エステルの拡張形態を用い得た。上記のような拡張結合基の一つを調製するべく、ヨード酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをグリシンに暴露してグリシンのＮ− ヨードアセトアミドを調製した。次に、化合物のカルボキシレート基を同じＮ− ヒドロキシスクシンイミドで再エステル化した。グリシンの相同体（例えばβ− アラニン、γ−アミノ酪酸）またはそのダイマーもしくはマルチマーを用いることによって、より長い結合腕を得ることができた。加えて、結合基分子に特徴的な何等かの所望の溶解性または活性を実現する側鎖を有する他のアミノ酸を用いることも可能であった。これらの活性リガンドの調製に用いる反応は単純であるので、ほとんどの生成物の同等性及び純度の確認には薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）が適当であった。実施例１４Ａ：８−アミノエチルテオフィリンヨードアセトアミド（Ｔ２）の調製ａ．８−Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−アミノエチルテオフィリン３．４ｇ（２０ｍｍｏｌ）の５，６−ジアミノ−１，３−ジメチルウラシルヒドレートと５．０ｇ（２６ｍｍｏｌ）のＮ−ｔ−ＢＯＣ−β−アラニンとをフラスコ内で混合し、これを、３０分を越える時間加熱して１５５℃とした油浴に入れた。４０℃で固体が融解し、１００℃より高温で発砲が生起した。この反応プロセスに続いて、クロロホルム：メタノール：酢酸溶媒（５０：４：２）を用いるシリカゲル上での薄層クロマトグラフィーを行なった。１５５℃で２０分経過後、反応は完了したと思われた。混合物を冷却し、１０ｍｌの６ＮＮａＯＨを加えた３５ｍｌの水に溶解させ、２０分間加熱して還流させた。ＴＬＣによってテオフィリン誘導体への変換の完了を確認した。溶液を６ＮＨＣｌで滴定した。６ｍｌのＨＣｌの添加によって重い沈澱物を生じさせ、５０ｍｌの水を添加した。更に３ｍｌのＨＣｌを添加してｐＨを５．８５とした。固体を濾過によって回収し、３ｍｌの６ＮＮａＯＨを加えた５０ｍｌの水に溶解させ、３ｍｌの６ＮＨＣｌで再沈澱させた。固体を濾過によって回収し、かつ乾燥して３．８ｇの淡黄色の粉末を得た。ｂ．８−アミノエチルテオフィリン塩酸塩３．２３ｇの上記生成物を１２０ｍｌの還流エタノールに溶解させた。少量の物質が溶解せず、これは廃棄した。３ｍｌの濃縮ＨＣｌを添加し、混合物を約６０分間加熱してほぼ還流温度とし、その後室温まで冷ました。固体を濾過によって回収し、２０ｍｌのエタノールで洗浄し、かつ乾燥して２．１１ｇのオフホワイトの結晶を得た。ｃ．８−アミノエチルテオフィリンヨードアセトアミド１２５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）の上記結晶の大部分を１．０ｍｌの水、４．０ｍｌのメタノール及び０．１２ｍｌの６ＮＮａＯＨ（ｐＨ１０．１８）に溶解させた。１３０ｍｇのヨード酢酸無水物を急速攪拌下に添加した。５分掛かってｐＨが５．６に低下し、その間に溶液は透明となり、新たな沈澱物が生じた。ＮａＯＨを添加してｐＨを７．０〜７．５に維持しながら、さらに６４ｍｇのヨード酢酸無水物を添加した。１０ｍｌの水を添加し、固体を濾過によって回収し、１０ｍｌの水で洗浄し、かつ乾燥して１２３ｍｇの固体を得た。実施例１４Ｂ：８−アミノメチルテオフィリンヨードアセトアミド（Ｔ１）の調製ａ．８−Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−アミノメチルテオフィリン８．５ｇのＮ−ｔ−ＢＯＣグリシンと８．５ｇの５，６−ジアミノ−１，３− ジメチルウラシルとを一緒に乳鉢内で粉砕した。粉末をフラスコに移し、このフラスコを油浴に入れて回転しつつ温度を徐々に１３０℃まで高めた。１３０℃で３０分経過後、得られた濃厚シロップを冷却して脆性ガラスとした。２０ｍｌの６ＮＮａＯＨを添加し、加熱還流によって固体を溶解させた。冷却によって生じた、厚く堆積した沈澱物を、８０ｍｌの水を添加して溶解させた。１０ｍｌの濃縮ＨＣｌでｐＨを６．４に調節した（ｐＨ９．８において沈澱物生成）。固体を濾過によって回収し、１５０ｍｌの水で洗浄し、かつ減圧デシケーターで乾燥して８．３７ｇの淡黄色の粉末を得た。他の８−Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−アミノアルキルテオフィリンを同じ操作で調製した。変更した条件は、１５５℃に高めた反応温度、及び６０分に延長した加熱時間などであった。場合によっては、より稀薄なＮａＯＨをより大量に用いた。この反応の収量は、理論値の約６０％をけっして上回らなかった。ｂ．８−アミノメチルテオフィリン塩酸塩７．７３ｇの８−Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−アミノメチルテオフィリンを５０ｍｌのエタノール、６ｍｌの濃縮ＨＣｌ及び１５ｍｌの水に加え、これを３０分間加熱して還流させ、その際時折フラスコ頂部からの蒸気を吹き散らした。５０ｍｌのエタノールを添加して沈澱物を生じさせ、これを５ｍｌの水の添加によって溶解させた。混合物を室温まで冷まし、次いで氷浴中で０℃に冷却した。５０ｍｌのエタノールを添加して混合物を、注げるように稀釈した。固体を濾過によって回収し、５０ｍｌのエタノールで洗浄し、かつ乾燥して５．５０ｇの白色の結晶を得た。他の８−アミノアルキルテオフィリン塩酸塩を同じ操作で調製した。Ｔ４に対応する生成物はエタノール／ＨＣｌから析出しないので、水酸化アンモニウムの添加により混合物を塩基性とした。生じた固体を濾過によって回収した。ｃ．ヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液１９０ｍｇのヨード酢酸及び１２０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを６００μｌのジメチルホルムアミドに溶解させた。得られた溶液に、２１０ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミドを４００μｌのジメチルホルムアミドに溶解させた溶液を添加した。混合物を渦巻き混合によって攪拌し、その後室温で６０分間インキュベートした。混合物を遠心してジクロヘキシルウレア（ｄｉｃｌｏｈｅｘｙｌｕｒｅａ）を沈降させた。上清をこれ以上精製せずに用いた。ｄ．８−アミノメチルテオフィリンヨードアセトアミド１１７ｍｇの８−アミノメチルテオフィリン塩酸塩を１０ｍｌのメタノールに溶解させ、約１７０μｌの６ＮＮａＯＨの添加によってｐＨを１１．２５に調節した。急速攪拌下に７００μｌのヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液を添加し、ｐＨを急速に８．２５まで低下させた。１００μｌの６ＮＨＣｌを溶液に添加した。量い沈澱物が生じ、これを濾過によって回収し、水及びメタノールで洗浄し、かつ乾燥して１０７ｍｇの白色の固体を得た。他の８−アミノアルキルテオフィリンヨードアセトアミドを同じ方法で調製し、ただし場合によってはヨード酢酸無水物を用いた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの方が反応条件下でソルボリシスを受けにくいと考えられるので好ましかった。生成物がメタノール／水洗液から析出しない場合も有ったが、メタノールを蒸発させることによって固体を回収した。これらの反応は総て、反応物及び生成物の極性に応じて５０：４：２または５０：８：２のクロロホルム：メタノール：酢酸から成る溶媒系を用いるシリカゲルプレート上でのＴＬＣによって好ましく監視した。実施例１５Ａ：チロキシン−Ｎ−ヨードアセトアミド（Ｔｈｙ）の調製７８ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のＬ−チロキシンを１．０ｍｌのメタノールに、３４ｍｌ（０．２ｍｍｏｌ）の６ＮＮａＯＨの添加と、浴音波処理装置での音波処理とによって溶解させた。４８ｍｇのヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを添加し、混合物を渦巻き攪拌（ｖｏｒｔｅｘ）した。８．５ｍｌの６ＮＮａＯＨを添加し、混合物を渦巻き攪拌した。ＴＬＣ（シリカゲル上で５０：６：２のクロロホルム：メタノール：酢酸による）によって反応の完了を確認した。５０ｍｌの６ＮＨＣｌ、次いで４ｍｌの水を添加して沈澱物を生成させた。沈澱物を遠心によって回収し、１ｍｌのメタノール及び４ｍｌの水で洗浄した。遠心後、ペレットを真空下に乾燥して８２ｍｇのオフホワイトの固体を得た。実施例１５Ｂ：チロキシン−Ｎ−（グリシル−Ｎ−ヨードアセトアミド）（ＴｈｙＡ）の調製ａ．Ｎ−グリシルチロキシン３８０ｍｇのＬ−チロキシンを２．０ｍｌのメタノールに、１７４．５μｌの６ＮＮａＯＨの添加及び音波処理によって溶解させた。１４０ｍｇのＮ−ｔ− ＢＯＣ−グリシン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを添加し、混合物を渦巻き攪拌した。ＴＬＣによって、反応が１０分以内に完了したことを確認した。１９０μｌの６ＮＨＣｌ及び５ｍｌの水を添加し、混合物を渦巻き攪拌した。混合物から粘着質の沈澱物を、３ｍｌのクロロホルムでの抽出を３回行なって分離した。有機画分を無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を蒸発させると４７０ｍｇのオフホワイトの固体が残った。これを２ｍｌの塩化メチレン及び２ｍｌのトリフルオロ酢酸に溶解させた。１０分後に溶媒を蒸発させ、残留物を５ｍｌのメタノールに溶解させた。溶媒を蒸発させて５００ｍｇの淡褐色の固体を得た。ｂ．チロキシン−Ｎ−（グリシル−Ｎ−ヨードアセトアミド）９５ｍｇのＮ−グリシルチロキシンを、５１μｌの６ＮＮａＯＨを加えた１．０ｍｌのメタノールに溶解させた。（上記ＮａＯＨは予測より１モル当量多く、このことは用いたＮ−グリシルチロキシンがトリフルオロ酢酸塩として存在することを示した）。６１ｍｇのヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及び８．５μｌの６ＮＮａＯＨを添加した。ＴＬＣによって反応の完了を確認した。６０ｍｌの６ＮＨＣｌ，次いで４ｍｌの水を添加した。遠心後、上清を廃棄し、沈澱物を１ｍｌのメタノール中に分散させ、４ｍｌの水で洗浄した。混合物を再び遠心し、ペレットを減圧デシケーターで乾燥して７９ｍｇの白色の固体を得た。ＴｈｙＢ及びＴｈｙＣに対応するリガンドをＴｈｙの場合と同様に、ただしヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの替わりにＮ−ヨードアセチル−β−アラニンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びＮ−ヨードアセチル−γ−アミノ酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて調製した。同じ反応条件下に類似の収量を達成した。実施例１６Ａ：ヨードアセトアミド−β−アラニンアミド−３−アミノジゴキシゲニン（ＤＡ）の調製９２ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）の３−アミノジゴキシゲニンを１．０ｍｌのメタノールに溶解させた。９１ｍｇのＮ−ヨードアセトアミド−β−アラニンＮ− ヒドロキシスクシンイミドエステル及び１５ｍｌのトリエチルアミンを添加し、２０分後に薄層クロマトグラフィーを行なって反応の完了を確認した。混合物を、３０ｍｌの１０％炭酸ナトリウム及び３×１０ｍｌのクロロホルム（第一の抽出ステップでは粘着質油の生成を防止するべく５ｍｌのメタノールを添加）間に分配した。クロロホルム層を一つに合わせ、無水硫酸ナトリウムで脱水し、かつ蒸発させてフラスコ面上に１５０ｍｇの膜を得た。これを０．２ｍｌのメタノール及び２ｍｌのクロロホルムに溶解させ、クロロホルム：メタノール：酢酸（１００：１２：２）溶媒中でＴＬＣプレートに適用した。ｒｆ＝０．５において所望の生成物を含有するバンドをプレートから掻き取ってメタノールで溶離し、溶媒を蒸発させて１００ｍｇの蝋質固体を得た。実施例１６Ｂ：ジゴキシゲニンリガンドの調製ａ．３−ケトジゴキシゲニン１．０ｇのジゴキシゲニンに酸化白金（IV）（０．５ｇ）を加え、これを１００ｍｌの水及び１５０ｍｌのアセトンに溶解させた。混合物を加圧して酸素２気圧とし、７２時間振盪した。触媒を濾過によって除去し、溶媒を蒸発させると１．０１ｇの白色の固体が残った。これを１００ｍｌの塩化メチレンに溶解させ、７０ｍｌの水で抽出した。水を５０ｍｌの塩化メチレンで２回逆洗浄（ｂａｃｋ −ｗａｓｈ）した。有機画分を集め、無水硫酸ナトリウムで脱水し、かつ溶媒を蒸発させて０．７５ｇの白色の固体を得た。ｂ．３−アミノジゴキシゲニン穏やかな加熱下に、３００ｍｇの３−ケトジゴキシゲニンを２０ｍｌのメタノールに溶解させた。２．０ｇの酢酸アンモニウムを添加し、溶液を氷浴中で冷却し、攪拌下に９０ｍｇのシアノホウ水素化ナトリウムを添加した。ＴＬＣによって、反応が５分以内に完了したことを確認した。混合物を氷中で冷却しながら、１０２滴の濃縮ＨＣｌを添加して混合物をｐＨ紙に従い酸性化した。６００ｍｇの固体を濾過によって除去し、濾液のｐＨを２０％水酸化カリウム（ＫＯＨ）で１０．５に調節した。混合物を３０ｍｌのクロロホルムで３回抽出した。有機画分を無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を蒸発させて３０４ｍｇの黄白色の固体を得た。ｃ．３−ヨードアセトアミドジゴキシゲニン（Ｄ）１８０ｍｇの３−アミノジゴキシゲニン及び７０μｌのトリエチルアミンを８ｍｌのメタノールに溶解させた。急速攪拌下に１３５ｍｇのヨード酢酸無水物を添加した。ＴＬＣによって、出発物質のより移動性の生成物への変換が完了したことを確認した。溶媒を蒸発させて残留物を、幾分かのメタノールを含有する３０ｍｌのクロロホルムに溶解させた。クロロホルム溶液を３０ｍｌの０．１ＮＨＣｌで洗浄し、水性層を３０ｍｌのクロロホルムで２回逆洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を蒸発させると２４０ｍｇの油状残留物が得られた。油状残留物を３ｍｌのテトラヒドロフランに溶解させ、３０ｍｌのヘキサンを添加し、沈澱物を濾過によって回収し、かつ乾燥して１１０ｍｇのオフホワイトの粉末を得た。実施例１６Ｃ：３−（ヨードアセトアミド−β−アラニル）−アミノジゴキシゲニン（ＤＢ）の調製９２ｍｇの３−アミノジゴキシゲニン及び１５ｍｌのトリエチルアミンを１．０ｍｌのメタノールに溶解させた。９１ｍｇのヨードアセトアミド−β−アラニンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを添加した。ＴＬＣによって、反応が２０分以内に完了したことを確認した。混合物を、３０ｍｌの１０％炭酸ナトリウム、及び５ｍｌのメタノールを加えた３×１０ｍｌのクロロホルム間に分配した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を蒸発させると１５０ｍｇの残留物が得られた。残留物を２００μｌのメタノール及び２ｍｌのクロロホルムに溶解させ、これをシリカゲル分取ＴＬＣプレートに適用した。プレートをクロロホルム：メタノール：酢酸（１００：１２：２）中で展開した。所望の生成物に対応するバンドを掻き取り、メタノールで溶離し、溶媒を蒸発させて１００ｍｇの蝋質固体を得た。ａ．４′，５′−ジメチルフルオレセイン５．９２ｇの無水フタル酸及び９．９２ｇの２−メチルレゾルシノールを一緒に粉砕した。５．３ｍｌの濃硫酸を添加し、混合物を３０分間加熱して１３５℃ とした。得られた黄赤色（ｙｅｌｌｏｗ−ｒｅｄ）の固体を水に、破砕によって溶解させ、全部で２１ｇの５０％ＮａＯＨを添加した。溶液を水で稀釈して９００ｍｌとし、その後２０ｍｌの酢酸で酸性化した。厚く堆積した橙色の沈澱物を２０分間沸騰させた。混合物を室温まで冷却してから濾過し、１１．９ｇの乾燥固体を得た。ｂ．４′，５′−ジメチルフルオレセインジホスフェート（ＤＭＦＤＰ）３６ｍｇの４′，５′−ジメチルフルオレセイン（ＤＭＦ）を１００ｍｌのピリジンに溶解させた。溶液を、１００μｌのピリジン中の５０μｌのオキシ塩化リンに添加し、５分間攪拌した。溶液を１０ｍｌの、急速に渦巻く水に添加した。３ｍｌの２Ｍ塩化マグネシウムを７ｍｌの溶液に添加した。１２滴の６ＮＮａＯＨを添加してｐＨを８．０に調節し、混合物を遠心して沈澱物を沈降させた。上清の公称４′，５′−ジメチルフルオレセインジホスフェート濃度は７ｍＭであった。稀釈（２８０μＭ）と、ＡＰ添加後の５００ｎｍにおける吸光度の監視とによって生成物の特徴を解明した。表６に、調製したハイブリッド酵素−リガンド結合体を掲げる。リガンドはハイブリッド酵素に、先に述べたようにして結合させた。括弧内の数字は、対照（抗体結合せず＝１００）に基づくパーセンテージとして表わした、過剰なモノクローナル抗体の存在下での正規化残留活性である。１００未満の数字はハイブリッド酵素−リガンド結合体活性の、抗体によって惹起された減衰を示す。１００より大きい数字は活性化を示す。本明細書では、表６のＴ１に結合させたハイブリッドＡＰＫＪ３をＴ１−３と呼称し、またＡＰＫＪ４に結合させたＴ２をＴ２−４と呼称しており、このような分類法は他の結合体にも同様に適用してある。Ｔ１とはリガンドとしてのアミノメチルテオフィリンであり、Ｔ２とはリガンドとしてのアミノエチルテオフィリンであり、Ｔ３とはリガンドとしてのアミノプロピルテオフィリンであり、Ｔ４とはリガンドとしてのアミノブチルテオフィリンであり、Ｔ６とはリガンドとしてのアミノヘキシルテオフィリンである。Ｔｈｙとはリガンドとしてのチロキシンのヨード酢酸性アミドであり、ＴｈｙＡとは結合基のグリシンと結合させたチロキシンであり、ＴｈｙＢとは結合基のβ−アラニンと結合させたチロキシンであり、ＴｈｙＣとは結合基のγ−アミノ酪酸と結合させたチロキシンである。Ｄとはリガンドとしてのジゴキシゲニンのヨード酢酸性アミドであり、ＤＡとは結合基のグリシンと結合させたジゴキシゲニンであり、ＤＢとは結合基のβ−アラニンと結合させたジゴキシゲニンであり、ＤＣとは結合基のγ−アミノ酪酸と結合させたジゴキシゲニンである。実施例１７：システイン突然変異を有する酵素ハイブリッドの保護及び精製２５０ｍｌのＡＰＫＪ３を１０ｍＭのＬ−システインと共に１時間インキュベートした。次いで、試料をエルマン試薬を用いたスルフヒドリル試験陰性になるまで混合物中の空気をバブリングした。次いで、この混合物をＤＥＡＥカラムに導入し、０→５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で溶離した。８．４３Ｕ／ｍｇの特異的ＡＰ活性を示すタンパク質を１．８８６ｍｇ／ｍｌ含んでいる１２０ｍｌの溶離液を収集した。実施例１８：ハイブリッド酵素の脱保護及びテオフィリンリガンドとの結合システインで保護したＡＰＫＪ３及びＡＰＫＪ４それぞれ７．０ｍｌを窒素と共に短時間バブリングし、次いで３５ｍｌの２００ｍＭＤＴＴと混合し、室温で６０分間インキュベートした。１８ｍｇのリガンド誘導体Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４又はＴ６を１２×７５ｍｍの試験管内の４００ｍｌのＤＭＦに溶解した。若干の誘導体を溶解するには短時間の加熱が必要であった。脱保護したハイブリッド酵素溶液１．０ｍｌを２００ｍｌのＤＭＦ溶液に添加した。９０分後、この混合物を、１ｇ／Ｌのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）と共に、５ｍｌのＰｉｅｒｃｅＫｗｉｋカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に通過させた。２．０ｍｌのタンパク質溶液を収集し、これを１００ｍＭの塩化マグネシウム及び１０ｍＭの塩化亜鉛を含む２０μｌの溶液と混合した。誘導体Ｔ１〜Ｔ６を用いてハイブリッド酵素−リガンド結合体を調製した。標準ＢＳＡ溶液で検量したＰｉｅｒｃｅクーマシーブルータンパク質試薬を用いて、タンパク質濃度を決定した。実施例１９：ハイブリッド酵素−リガンド結合体の評価ハイブリッド酵素−リガンド結合体の試料Ｔ１−３及びＴ４−３（表５）を５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ，５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中で４３ｕｇ／ｍｌに希釈した。酵素の分子量を８６ｋＤと想定すると、濃度は０．５ｍＭであるテオフィリンに対するヒツジポリクローナル抗体及びマウスモノクローナル抗体の溶液を１．０ｍＭで調製した。ＶＰ（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬ）マルチキュベットに、５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを２０ μｌ→０μｌ、１．０ｍＭの抗体を０μ ｌ→２０μｌ導入し、各ポジションの総容量を２０μｌに維持した。抗体は、テオフィリンに特異的なヒツジポリクローナル又はマウスモノクローナルからなっており、その濃度は、既知濃度の蛍光テオフィリン誘導体溶液内での滴定により決定されている。０．５ｍＭハイブリッド酵素−リガンド結合体Ｔ１−３又はＴ４−３１０μｌを各ポジションのマルチキュベットに添加した。マルチキュベットをＶＰ機器（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｓ）上に置き、５ｍｇ／ｍｌのＰＮＰＰ，５０ｍＭトリス，１．０ｍＭＭｇＣｌ₂，０．１ｍＭＺｎＣｌ₂（ｐＨ８．０）からなる基質を用い、４１５／４５０ｎｍのフィルターの組み合わせにより３７℃で処理した。吸光度値を時間＝０（キュベットへの基質添加時）との差として収集した。１０分後の結果を図２０に示す。実施例２０：アッセイ方法本発明は、分光光度分析能力を有する多数のランダムアクセス及び臨床化学アナライザーに適応可能である。例としては、ＣｏｂａｓＭｉｒａ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）、Ｈｉｔａｃｈｉ（ＨｉｔａｃｈｉＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）、Ｍｏｎａｒｃｈ（ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）又はＥＰｘ／Ｓｐｅｃｔｒｕｍ^(R)（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が挙げられる。これらのアナライザーでは容量の少ない試料を使用することができ、測時はアナライザーによって４〜２０分の間で変動し得る。３種の混合物（基質、結合体及び抗血清（又は抗体））を使用することができる。アッセイでは、被分析物質は、結合分子に対する酵素−リガンド結合体と競合する。反応混合物中に被分析物質が存在しなければ、吸光度のようなシグナルは低い。それは、結合分子がハイブリッド酵素−リガンド結合体と相互反応して、基質−ハイブリッド酵素リガンド結合体の相互作用によるシグナルの生成が少なくなるからである。被分析物質が存在すれば、結合分子と被分析物質が相互作用して、ハイブリッド酵素−リガンド結合体上の活性部位は有効なままである。これにより、より多くの基質が活性部位内に入って相互作用し、吸光度の上昇に見られるようにより多くのシグナルが生成し、またハイブリッド酵素−リガンド結合体の特異活性が高くなる。被分析物質の濃度が増すと、シグナルも増す。これにより、試験試料中の被分析物質濃度を決定できる曲線が得られる。減衰（attenuation）量は、基質量、結合分子の量や種類、ハイブリッド酵素−リガンド結合体で使用するリンカーアーム、使用する発現ハイブリッド酵素、及び存在する被分析物質の量によって調整される。この技術がうまく適用されているもののひとつは、ＣｏｂａｓＭｉｒａ上のテオフィリンハイブリッド酵素−リガンド結合体である。ジゴキシン及びフェニトインのような他の小さな被分析物質もこの技術に適応し得る。ＴＳＨａｎｈＣＧのような大きな分子をこのアッセイ方式で使用することもできる。本発明の一アッセイを、Ｔ１−３及びテオフィリンポリクローナルヒツジ抗血清＃６６４−４３（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、３試薬の形態でＣｏｂａｓＭｉｒａで実施した。アッセイ実施時に、ＣｏｂａｓＭｉｒａ機器は２試薬又は３試薬の形態を使用することができる。この機器は、２つのプローブ（試薬プローブ及び試料プローブ）で作動する。試薬プローブが試薬＃１を吸収し、試料プローブが試験試料を吸収する。試薬＃１及び試料の両方をキュベット内に分配する。次に、試薬プローブが試薬＃２を吸収してキュベット内に分配する。（３試薬アッセイでは）試薬プローブが試薬＃３を吸収して、キュベット内に分配する。ＣｏｂａｓＭｉｒａアッセイの構成を以下に示す：試薬＃１：１ｍＭＭｇＣｌ₂，０．１ｍＭＺｎＣｌ₂及び０．５％ＢＳＡを含む０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中の５ｍｇ／ｍｌのＰＮＰＰ２５０μ ｌ。試料：９８μｌの蒸留水で洗浄した、（ＴＤｘ^(R)テオフィリンキャリブレーター及びコントロールを用いる）試料２μｌ。試薬＃２：２μｌの蒸留水で洗浄した、１×１０^-6Ｍのポリクローナルヒツジ抗血清３５μｌ。試薬＃３：２μｌの蒸留水で洗浄した、（Ａ４５０ｎｍが０．１の０．１ｍＭＺｎＣｌ₂及び１ｍＭＭｇＣｌ₂を含む０．１Ｍトリス緩衝液に溶解した）Ｔ１ −３１０μｌ。アッセイはＣｏｂａｓＭｉｒａ機器で以下の方法により実施した。試薬＃１を試薬プローブで吸収し、次いで試験試料及び洗浄水を試料プローブで吸収した。試薬＃１をキュベット内に分配し、次いで試験試料及び洗浄水を分配した。次いで、この混合物を試薬プローブと混合した。次いで、試薬プローブで試薬＃２を吸収して、キュベット内に分配し、混合した。約２０秒後に、試薬＃３を試薬プローブで吸収して、キュベット内に分配して混合した。次いで、全混合物を計４〜１０分間インキュベートした。ＣｏｂａｓＭｉｒａ機器で検量曲線が得られ、次いでこの曲線から試料を読み取った。ＣｏｂａｓＭｉｒａ機器で更に以下のような２試薬系を試験した。試薬＃１：前述と同一緩衝液中のＰＮＰＰ／テオフィリンポリクローナルヒツジ抗血清混合物２８０μｌ。試料：１０ｍｌの水で洗浄した試料２μｌ。試薬＃２：２ｍｌの蒸留水で洗浄したＴ１−３１０μｌ。試薬＃３を使用しないことを除いて、前述の方法で２試薬系を実施した。内因性ＡＰ試料では、８０ｍＭのＬ−フェニルアラニン及び３ｍＭのレバミゾールを５ｍｇ／ｍｌのＰＮＰＰ基質に添加した。ＣｏｂａｓＭｉｒａで判明した２つの相関関係を以下に示す。図２１は、テオフィリン試料内にスパイクされた内因性ＡＰ試料のスパイクド試料の相関を示す。この相関は前述のＣｏｂａｓＭｉｒａアッセイ対ＴＤｘテオフィリンＩＩアッセイ（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を示している。図２１に示す阻害剤を用いるデータの線形回帰では、相関係数０．９９７、傾き０．９７１、ｙ切片０．３７３が得られた。このアッセイの精度は、１．０に非常に近い傾き値及び相関係数で示されるようなテオフィリンレベルを明示している。阻害剤を用いないデータの線形回帰の相関係数は０．９７０、傾きは１．１９９、ｙ切片は−０．６９３であった。これらのデータの傾きの増加は、阻害剤が存在しなければ内因性ＡＰが積極的な干渉（positive interference）を生じることを示している。感受性も、２０個の同型のヒト血清非含有テオフィリン試料を用いてＣｏｂａｓＭｉｒａアッセイで試験し、吸光度及び曲線あてはめプログラムを用いて平均−２標準偏差を決定した。感受性は０．７９ｍｇ／ｍｌであり、これは、ＴＤｘテオフィリンの規定値０．８２ｍｇ／ｍｌに匹敵していた。回収もＣｏｂａｓＭｉｒａ機器で実施した。１組のキャブレーターを血漿及びＴＤｘ緩衝液礎質の両方で作成した。試料を並行処理すると、互いに＋／−１０％であった。内因性患者試料を１：２又は１：４に希釈したときも、試料は＋／−１０％で回収された。実施例２１：ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）ハイブリッド酵素−リガンド結合体の調製ＧＦ５脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を０．１Ｍトリス，１ｍＭＤＴＴ（ｐＨ８．０）を含む脱ガス緩衝液で平衡化した。カラムを使用する直前に、エルマン反応による溶出液の試験が陰性になるまで、０．１Ｍトリス（ｐＨ８．０）を含む脱ガス緩衝液で洗浄した（Ｅｌｌｍａｎ，Ｇ．Ｌ．（１９５８）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７４，４４３）。ＢｉｏＧｅｌＰ−２カラム（０．９×７．５ｃｍ）を、０．１Ｍトリス（ｐＨ７．０）で平衡化した。０．６９ｍｌの５０ｍＭトリス，１００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中の２ｍｇ（２０ｎｍｏｌ）の精製ＡＰＪＫ４及び１ｍＭＤＴＴ溶液を室温で３０分間インキュベートした。反応混合物をＧＦ５カラムのクロマトグラフィーで処理した。空隙容量（void volume）の画分をプールした。３００ μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１ｍｇ（０．２４μｍｏｌ）のＣＴＰペプチド（配列番号２９）（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（Ｂｉｄａｒｔ，Ｊ．Ｍ．等（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３４，４５７）溶液を、同一緩衝液中の３０μｌの２８ｍＭスルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（Ｐｉｅｒｃｅ）で処理した。この混合物を３０℃ で３０分間反応させた。次いで、この混合物をＰ−２カラムに通した。空隙容量の画分をプールした。各カラムからプールした２種の画分を合わせた。得られた溶液のｐＨを１ＮＮａＯＨでｐＨ８．０に調整した。混合物を２〜８℃で一晩、次いで室温で３時間転倒式に回転させた。全反応混合物を、０．１Ｍトリス，１ｍＭＭｇＣｌ₂，０．１ｍＭＺｎＣｌ₂（ｐＨ８．０）に対して完全に透析した。透析した物質を２〜８℃ で保存した。実施例２２：ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のアッセイアッセイで使用した抗体は、固定したＣＴＰペプチドを含むカラムでヤギ抗β −ヒト絨毛膜ゴナドトロピンから親和性精製した。０．１Ｍトリス，１ｍＭＭｇＣｌ₂，０．１ｍＭＺｎＣｌ₂（ｐＨ８．０）中の１％ウシ血清アルブミンにより、抗体試薬及び結合体をそれぞれ０．１７μｇ／μｌ及び５．４μｇ／μｌの処理濃度に希釈した。ウシ血清中に０、２５、５０、１００及び２００ｍＩＵ／ｍｌのｈＣＧを含む検量標準液を、Ａｂｂｏｔｔ β−ＨＣＧ１５／１５ＴｅｓｔＫｉｔ^TM（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から得た。それぞれ２５ｍｌの標準液を５０μｌの抗体及び５０μｌの結合体と混合した。混合物を室温で約１０分間放置した。その後、１Ｍトリス（ｐＨ８．５）中の０．２ｍＭＰＮＰＰ２５０μｌを添加した。８分後、ＡｂｂｏｔｔＶＰ^TMアナライザー（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により二色ＯＤ読み取り値（４１５／４５０ｎｍ）を測定した。別のアッセイでは、１７μｇ／ｍｌの抗体濃度を使用することを除き、実験方法は殆ど同じであった。両アッセイで観察されたＯＤ値を標準液の既知濃度に対してプロットした（図２２参照）。実施例２３：ＡＰハイブリッド酵素−リガンド結合体のフェリチン結合体の調製ＧＦ５脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を、０．１Ｍトリス，１ｍＭＤＴＴ（ｐＨ８．０）を含む脱ガス緩衝液で平衡化した。カラムを使用する前に、エルマン反応による溶出液の試験が陰性になるまで、０．１Ｍトリス（ｐＨ８．０）を含む脱ガス緩衝液で洗浄した（Ｅｌｌｍａｎ，Ｇ．Ｌ．（１９５８）Ａｒｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７４，４４３）。ＢｉｏＧｅｌＰ−２カラム（０．９×７．５ｃｍ）を、０．１Ｍトリス（ｐＨ７．０）で平衡化した。０．５１ｍｌの５０ｍＭトリス，１００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中の１ｍｇ（１０ｎｍｏｌ）の精製ＡＰＪＫ４及び１ｍＭＤＴＴ溶液を室温で３０分間インキュベートした。反応混合物をＧＦ５カラムのクロマトグラフィーで処理した。空隙容量の画分をプールした。３００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１ｍｇ（０．２４μｍｏｌ）のノナペプチド（配列番号３０）（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、ヒト脾臓アポフェリチンのａ．ａ．８３〜９１）（Ａｄｄｉｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．等（１９８４）ＦｅｂｓＬｅｔｔｅｒｓ１７５，３３３）溶液を、同一緩衝液中の４０ｍＭスルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（Ｐｉｅｒｃｅ）５０μｌで処理した。混合物のｐＨを１ＮＮａＯＨで７．０に調整した。この溶液を３０℃で３０分間放置した。次いで、混合物をＰ−２カラムに通した。空隙容量の画分をプールした。各カラムからプールした２種の画分を合わせた。得られた溶液を室温で３０分間放置し、その後２〜８℃で一晩転倒式に回転させた。全反応混合物を０．１Ｍトリス，１ｍＭＭｇＣｌ₂，０．１ｍＭＺｎＣｌ₂ （ｐＨ８．０）に対して完全に透析した。約２ｍｌの透析物質を回収し、これを２〜８℃で保存した。実施例２４：ＡＰハイブリッド酵素−リガンド結合体のフェリチン結合体の活性の抗体誘導変性モノクローナル抗フェリチン抗体試薬（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍトリス，１ｍＭＭｇＣｌ₂，０．１ｍＭＺｎＣｌ₂（ｐＨ８．０）中の１％ウシ血清アルブミンで１：１０、１：３０、１：１００、１：３００及び１：１０００に希釈した。ハイブリッド酵素−リガンド結合体（０．５ｍｇ／ｍｌ）を同一の希釈剤で１：２００に希釈した。それぞれ５０μｌの希薄抗体溶液を同一容量のハイブリッド酵素−リガンド結合体と混合した。この混合物を室温で約１０分間ィンキュベートした。その後、１Ｍトリス（ｐＨ８．５）中の０．２ｍＭＰＮＰＰ２５０μｌを添加した。１０分後、ＡｂｂｏｔｔＶＰ^TMアナライザーにより、二色ＯＤ測定（４１５：４５０ｎｍ）を実施した。ＯＤ観測値を既知濃度の抗体に対してプロットした（図２３参照）。本発明の好ましい実施態様に関する上記記載は例示的なものであって、添付のクレーム及びその同等内容によって限定される本発明の範囲を制限するものではない。前述の内容から好ましい実施態様には様々な変形や変更が可能であり、これは当業者には自明であろう。このような変形及び変更は、本発明の範囲を逸脱するものではなく、従って本発明の範囲は、あらゆる同等内容を包含する添付のクレームによって限定されるものとする。配列表（１）一般情報：（i）出願人：Brate，E.M. Brennan，C.A. Bridon，D.P. Jaffe，K.D. Krafft，G.A. Mandecki，W. March，S.C. Russell，J.R. Yue，V.T. （ii）発明の名称：遺伝子操作酵素及びそれらの診断アッセイ用結合体（iii）配列の数：34 （iv）連絡住所：（A）住所：ABBOTT LABORATORIES （B）通り：One Abbott Park Road （C）市：Abbott Park （D）州：Illinois （E）国：USA. （F）郵便番号（ZIP）：60064-3500 （v）コンピューターの読取り可能形態（A）媒体の型：フロッピーディスク（B）コンピューター：IBM PCコンパチブル（C）オペレーティングシステム：PC-DOS/ MS-DOS （D）ソフトウェア：SoftPC （vi）現出願データ：（A）出願番号：（B）出願日：（C）分類：（viii）弁理士/代理人情報：（A）氏名：Wong，Wean Khing （B）登録番号：33,561 （C）参照/事件整理番号：5324.PC.01 （ix）電気通信情報：（A）電話：（708）938-3517 （B）ファックス：（708）938-2623 （C）テレックス：（２）配列番号１の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：1454ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：Escherichia coli （xi）配列番号１の配列：（２）配列番号２の情報（i）配列の特徴：（A）長さ：449アミノ酸残基（B）型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：不明（ii）配列の種類：タンパク質（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号２の配列：（２）配列番号３の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：132ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号３の配列：（２）配列番号４の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：124ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号４の配列：（２）配列番号５の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：57ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号５の配列：（２）配列番号６の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：56ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号６の配列：（２）配列番号７の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：57ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号７の配列：（２）配列番号８の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：56ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号８の配列：（２）配列番号９の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：127ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号９の配列：（２）配列番号10の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：127ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号10の配列：（２）配列番号11の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：85ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号11の配列：（２）配列番号12の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：85ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号12の配列：（２）配列番号13の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：91ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号13の配列：（２）配列番号14の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：91ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号14の配列：（２）配列番号15の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：98ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号15の配列：（２）配列番号16の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：103ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号16の配列：（２）配列番号17の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：88ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号17の配列：（２）配列番号18の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：105ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号18の配列：（２）配列番号19の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：13アミノ酸残基（B）型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：不明（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号19の配列：（２）配列番号20の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：13アミノ酸残基（B）型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：不明（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号20の配列：（２）配列番号21の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：13アミノ酸残基（B）型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：不明（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号21の配列：（２）配列番号22の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：34アミノ酸残基（B）型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：不明（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号22の配列：（２）配列番号23の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：13アミノ酸残基（B）型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：不明（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号23の配列：（２）配列番号24の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：15アミノ酸残基（B）型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：不明（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号24の配列：（２）配列番号25の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：36アミノ酸残基（B）型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：不明（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号25の配列：（２）配列番号26の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：1455ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号26の配列：（２）配列番号27の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：23アミノ酸残基（B）型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：不明（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号27の配列：（２）配列番号28の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：16アミノ酸残基（B）型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：不明（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号28の配列：（２）配列番号29の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：39アミノ酸残基（B）型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：不明（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号29の配列：（２）配列番号30の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：9アミノ酸残基（B）型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：不明（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号30の配列：（２）配列番号31の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：471アミノ酸残基（B）型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：不明（ii）配列の種類：タンパク質（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号31の配列：（２）配列番号32の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：53ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号32の配列：（２）配列番号33の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：53ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号33の配列：（２）配列番号34の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：31ヌクレオチド（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：（vi）起源：（A）生物名：（xi）配列番号34の配列：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｑ 1/42 6807−4ＢＧ０１Ｎ 33/566 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 9/16 ＢＣ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ (72)発明者ブレナン，キヤサリン・エーアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイービル、イースト・リンカーン・アベニユー・634 (72)発明者ブライドン，ドミニク・ピーアメリカ合衆国、イリノイ・60053、モートン・グローブ、カプリナ・5717 (72)発明者ジヤフエ，キーブ・デイーアメリカ合衆国、ウイスコンシン・53179、トレバー、トウー・ハンドレツド・セブンテイ・フアースト・アベニユー・9761 (72)発明者クラフト，グラント・エーアメリカ合衆国、イリノイ・60025、グレンビユー、サラナク・コート・2433 (72)発明者マンデクキー，ウラジミールアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイービル、ヘムロツク・レーン・516 (72)発明者マーチ，ステイーブン・シーアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイービル、ウインチエスター・ロード・ 1307 (72)発明者ラツセル，ジヨン・シーアメリカ合衆国、ウイスコンシン・53221、グリーンフイールド、ウエスト・イオナ・テラス・3925 (72)発明者ユエ，ビンセント・テイーアメリカ合衆国、イリノイ・60015、デイアフイールド、サミツト・ドライブ・870

Claims

【特許請求の範囲】１．出発酵素と、該出発酵素のアミノ酸部分の置換又は該出発酵素中に挿入される外来アミノ酸部分とを含んでなるハイブリッド酵素であって、前記置換又は挿入によってハイブリッド酵素が得られ、ハイブリッド酵素が出発酵素の酵素活性を示し、結合分子が挿入又は置換された外来アミノ酸部分と結合すると、ハイブリッド酵素の酵素活性が変性することを特徴とするハイブリッド酵素。２．外来アミノ酸部分が、出発酵素の活性部位に十分近い領域にある出発酵素のアミノ酸配列中に置換又は挿入されるために、結合分子が挿入又は置換された外来アミノ酸部分と結合し、ハイブリッド酵素による基質の触媒反応速度が変化する請求項１に記載のハイブリッド酵素。３．挿入又は置換された外来アミノ酸部分がエピトープである請求項１に記載のハイブリッド酵素。４．結合分子が高分子である請求項１に記載のハイブリッド酵素。５．結合分子が抗体である請求項１に記載のハイブリッド酵素。６．出発酵素がアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）である請求項１に記載のハイブリッド酵素。７．エピトープが、ＨＩＶ−１ＩＩＩＢｇｐ１２０タンパク質のＶ３ループである請求項３に記載のハイブリッド酵素。８．挿入又は置換された外来アミノ酸部分が、（ａ）出発酵素ＡＰのアミノ酸４０７−４０８間に挿入されたＩｌｅ−Ａｒｇ− Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ− Ｖａｌ−Ｔｈｒ；（ｂ）出発酵素ＡＰのアミノ酸１６７−１６８間に挿入されたＩｌｅ−Ａｒｇ− Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ− Ｖａｌ−Ｔｈｒ；（ｃ）出発酵素ＡＰのアミノ酸１６８−１６９間に挿入されたＩｌｅ−Ａｒｇ− Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ− Ｖａｌ−Ｔｈｒ；（ｄ）出発酵素ＡＰのアミノ酸１６９−１７７と置換されたＴｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ− Ｉｌｅ− Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ− Ｈｉｓ；（ｅ）出発酵素ＡＰのアミノ酸９１−９３と置換されたＩｌｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ −Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ −Ｔｈｒ；（ｆ）出発酵素ＡＰのアミノ酸９１−９３と置換されたＣｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ −Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ −Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ；及び（ｇ）出発酵素ＡＰのアミノ酸４０７−４０８間に挿入されたＣｙｓ−Ｔｈｒ− Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ− Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ− Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ− Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓからなる群の中から選択されるアミノ酸配列を含んでなる請求項６に記載のハイブリッド酵素。９．組換えＤＮＡ分子が、請求項８に記載の挿入又は置換された外来アミノ酸部分をコードする合成ＤＮＡ断片を含んでいる組換えＤＮＡ分子。１０．前記の挿入された合成配列が、からなる群の中から選択される、挿入された合成配列を含むｐｈｏＡ遺伝子。１１．前記合成配列が、からなる群の中から選択される、置換された合成配列を含むｐｈｏＡ遺伝子。１２．からなる群の中から選択される配列を含んでいるＤＮＡ断片。１３．出発酵素と、該出発酵素の表面上のアミノ酸配列中に置換又は挿入されてハイブリッド酵素を生成する外来アミノ酸部分とを含んでなるハイブリッド酵素であって、該ハイブリッド酵素が出発酵素の酵素活性を示し、被分析物質が外来アミノ酸部分と結合すると、ハイブリッド酵素の酵素活性が変性するハイブリッド酵素と、被分析物質を含む試験試料とを接触させて、反応混合物を生成し、反応混合物を順次又は同時にハイブリッド酵素の基質と接触させ、反応混合物中の被分析物質の存在又は量に依存するハイブリッド酵素による基質の触媒反応速度の変化を監視することからなる試験試料中の被分析物質の存在又は量を決定する方法。１４．被分析物質を含む試験試料；被分析物質の結合分子；及び出発酵素と、該出発酵素の表面上のアミノ酸配列中に置換又は挿入されてハイブリッド酵素を生成する外来アミノ酸部分とを含んでなるハイブリッド酵素であって、該ハイブリッド酵素が出発酵素の酵素活性を示し、被分析物質が外来アミノ酸部分と結合すると、ハイブリッド酵素の酵素活性が変性するハイブリッド酵素を反応混合物中で定常状態又は免疫平衡せしめ、反応混合物を順次又は同時にハイブリッド酵素の基質と接触させ、反応混合物中の被分析物質の存在又は量に依存するハイブリッド酵素による基質の触媒反応速度の変化を監視することからなる試験試料中の被分析物質の存在又は量を決定する方法。１５．出発酵素の表面上のアミノ酸配列中に置換又は挿入される外来アミノ酸部分を含み、かつリガンドと共有結合してハイブリッド酵素−リガンド結合体を生成するための手段を有するハイブリッド酵素であって、ハイブリッド酵素−リガンド結合体が出発酵素の酵素活性を示し、外来アミノ酸部分に結合したリガンドに結合分子が結合すると、ハイブリッド酵素−リガンド結合体の酵素活性が変性することを特徴とするハイブリッド酵素。１６．出発酵素がＡＰである請求項１５に記載のハイブリッド酵素。１７．外来アミノ酸部分がヒスチジン、システイン及びアルギニンからなる群の中から選択される請求項１６に記載のハイブリッド酵素。１８．出発酵素の表面上のアミノ酸配列中に置換又は挿入される外来アミノ酸部分が、出発酵素の活性部位に十分近い領域にあるため、外来アミノ酸部分に共有結合したリガンドが、ハイブリッド酵素による基質の触媒反応速度を変化させる請求項１５に記載のハイブリッド酵素。１９．出発酵素がＡＰであり、ハイブリッド酵素が出発酵素ＡＰの酵素活性を示し、ハイブリッド酵素中では、（ａ）出発酵素ＡＰの２６１位のアミノ酸アスパラギンがシステインで置換されるか、（ｂ）出発酵素ＡＰの２６３位のアミノ酸アスパラギン酸がシステインで置換されるか、（ｃ）出発酵素ＡＰの１６７位のアミノ酸リシンがシステインで置換されるか、（ｄ）出発酵素ＡＰの１７７位のアミノ酸リシンがシステインで置換されるか、（ｅ）出発酵素ＡＰの２０９位のアミノ酸リシンがシステインで置換されるか、（ｆ）出発酵素ＡＰの３２８位のアミノ酸リシンがシステインで置換されるか、（ｇ）出発酵素ＡＰの２９１位のアミノ酸グルタミンがシステインで置換されるか、（ｈ）出発酵素ＡＰの２９４位のアミノ酸アスパラギン酸がシステインで置換されるか、（ｉ）出発酵素ＡＰの４０７位のアミノ酸グルタミン酸がシステインで置換されるか、（ｊ）出発酵素ＡＰの４０８位のアミノ酸アスパラギン酸がシステインで置換されるか、（ｋ）出発酵素ＡＰの３８０位のアミノ酸アスパラギン酸がシステインで置換されるか、又は（ｈ）出発酵素ＡＰの１１７位のアミノ酸アスパラギンがシステインで置換される請求項１５に記載のハイブリッド酵素。２０．請求項１９に記載のハイブリッド酵素をコードする合成ＤＮＡ断片配列を含み、ＡＰをコードする組換えＤＮＡ分子。２１．出発酵素と、該出発酵素の表面上のアミノ酸配列中に置換又は挿入されてハイブリッド酵素を生成する外来アミノ酸部分と、外来アミノ酸部分と共有結合してハイブリッド酵素−リガンド結合体を生成するリガンドとを含んでなるハイブリッド酵素−リガンド結合体であって、該ハイブリッド酵素−リガンド結合体が出発酵素の酵素活性を示し、外来アミノ酸部分に結合したリガンドに結合分子が結合すると、ハイブリッド酵素−リガンド結合体の酵素活性が変性することを特徴とするハイブリッド酵素−リガンド結合体。２２．出発酵素がＡＰである請求項２１に記載のハイブリッド酵素−リガンド結合体。２３．外来アミノ酸部分がヒスチジン、アルギニン及びシステインからなる群の中から選択される請求項２１に記載のハイブリッド酵素−リガンド結合体。２４．出発酵素の表面上のアミノ酸配列中に置換又は挿入される外来アミノ酸部分が、出発酵素の活性部位に十分近い領域にあるため、外来アミノ酸部分に共有結合したリガンドが、ハイブリッド酵素−リガンド結合体による基質の触媒反応速度を変化させる請求項２１に記載のハイブリッド酵素−リガンド結合体。２５．外来アミノ酸部分を出発酵素の表面上のアミノ酸配列中に置換又は挿入して、リガンドと共有結合する手段を有するハイブリッド酵素を調製し、リガンドを外来アミノ酸部分と共有結合して、ハイブリッド酵素−リガンド結合体を生成することからなり、該ハイブリッド酵素−リガンド結合体が出発酵素の酵素活性を示し、外来アミノ酸部分に結合したリガンドに結合分子が結合すると、ハイブリッド酵素−リガンド結合体の酵素活性が変性するハイブリッド酵素−リガンド結合体の製造方法。２６．被分析物質を含む試験試料；被分析物質の結合分子；及び出発酵素と、該出発酵素の表面上のアミノ酸配列中に置換又は挿入されてハイブリッド酵素を生成する外来アミノ酸部分と、外来アミノ酸部分と共有結合してハイブリッド酵素−リガンド結合体を生成するリガンドとを含んでなるハイブリッド酵素−リガンド結合体であって、該ハイブリッド酵素−リガンド結合体が出発酵素の酵素活性を示し、外来アミノ酸部分に結合したリガンドに結合分子が結合すると、ハイブリッド酵素−リガンド結合体の酵素活性が変性するハイブリッド酵素−リガンド結合体とを得られた反応混合物中で定常状態又は免疫平衡せしめ、反応混合物を順次又は同時にハイブリッド酵素−リガンド結合体の基質と接触させ、反応混合物中に存在する被分析物質に依存するハイブリッド酵素−リガンド結合体による基質の触媒反応速度の変化を監視することからなる試験試料中の被分析物質の存在を決定する方法。