JP2004500848A - 新しいモータータンパク質とその使用法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＨｓＫｉｆ１５の単離された核酸配列およびアミノ酸配列、ＨｓＫｉｆ１５に対する抗体、生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５を用いるＨｓＫｉｆ１５調節因子のスクリーニング法、ならびにＨｓＫｉｆ１５調節因子のスクリーニング用のキットを提供する。
Description
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のために全体が参照として本明細書に組み入れられる、２０００年５月１７日に出願された、米国特許出願第０９／５７２，１９１号の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＨｓＫｉｆ１５の単離された核酸配列およびアミノ酸配列、ＨｓＫｉｆ１５を検出する方法、および生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５を用いるＨｓＫｉｆ１５調節因子のスクリーニング法、ならびにＨｓＫｉｆ１５調節因子のスクリーニングに用いるキットを提供する。
【０００３】
発明の背景
キネシンは、一次アミノ酸配列、ドメイン構造、運動速度、および細胞機能を元に少なくとも８つのサブファミリーに分類可能な５０を越えるタンパク質の遍在性の保存されたファミリーである。キネシンスーパーファミリーは、関連性のある微小管モータータンパク質の大規模なファミリーである。このファミリーは、小胞およびオルガネラの順行性の軸索輸送に役割を果たしていると考えられる、ヤリイカの軸索原形質から最初に単離された「真の」キネシンで例示される（例えば、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２７：３１９〜３５１ （１９９３）を参照）。キネシンはＡＴＰを用いて力を発生し、微小管と結合して一方向に動く（微小管のマイナス端からプラス端に向かうことからキネシンは「プラス端指向性」モーターである）。キネシンスーパーファミリーの分子は、大きさが約３４０アミノ酸からなり、約３５〜４５％（またはそれ以上）の同一性を「真の」キネシンモータードメインと共有するキネシン様モーターをもつ分子と定義される。モーターは通常、さまざまなキネシンスーパーファミリーの分子に異なる結合活性をもたらす、さまざまなテールドメインに結合している。
【０００４】
マウスのＫｉｆ１５ （ゲンバンクアクセッション番号ＡＢ００１４３２）は当初、ＰＣＲをベースとした新規マウスキネシンについての検索で同定された（Ｎａｋａｇａｗａら、１９９７． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：９６５４〜９）。ＭｍＫｉｆ１５モータードメインの断片をコードするＭｍＫｉｆ１５ ｃＤＮＡの一部はクローニングされており、配列が決定されている。また４週齢マウスの複数の組織におけるＭｍＫｉｆ１５のｍＲＮＡの発現が調べられている。
【０００５】
ＸＫｌｐ２は、紡錘体集合に重要な役割を果たすことが明らかにされているアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）のキネシンである。ＸＫｌｐ２は当初バーノス（Ｖｅｒｎｏｓ）らにより、新規のツメガエルキネシンをコードするｃＤＮＡ断片をクローニングするためのＰＣＲをベースとした方法で同定された（Ｖｅｒｎｏｓら、１９９３． Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １５７：２３２〜９）。ＸＫｌｐ２完全長の配列はボレティ（Ｂｏｌｅｔｉ）らにより報告されている（Ｂｏｌｅｔｉら、１９９６． Ｃｅｌｌ ８４：４９〜５９）（ゲンバンクアクセッション番号Ｂ４８８３５、ＡＡＢ２６４８６、１５８７１８１、およびＣＡＡ６３８２６）。以上の著者らはまた、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合させたＸＫｌｐ２のモータードメインを含む組換え融合タンパク質が、微小管に依存して運動可能であり、微小管のプラス端方向に移動することも報告している。ボレティらは、ＸＫｌｐ２が紡錘体の極および動原体に結合していること、またＣ末端のテールドメインを延長するＸＫｌｐ２の組換え断片の付加が、インビトロの紡錘体集合反応における二極性の紡錘体集合の用量依存的な抑制を生じることを明らかにしている。ＸＫｌｐ２のＣ末端のテールドメインに対する抗体は、紡錘体集合を同様に損なう。
【０００６】
ウィットマン（Ｗｉｔｔｍａｎ）らは、ＸＫｌｐ２ のＣ末端のテールドメインが、間期細胞抽出物ではなく有糸分裂細胞抽出物中に集合した星状体の局在化に必要かつ十分であることを示している（Ｗｉｔｔｍａｎｎら、１９９８． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４３：６７３〜８５）。このような局在化には、テールドメインの二量体化が必要とされた。また、細胞質に存在するダイニンおよびダイナクチン（ｄｙｎａｃｔｉｎ）の機能が、有糸分裂細胞抽出物中で集合状態の星状体へのＸＫｌｐ２の局在化に重要な役割を果たすことが判明している。ウィットマンらはまた、組換えＸＫｌｐ２のテールドメインと純粋微小管の結合を大きく促進するタンパク質ＴＰＸ２を同定した。ＴＰＸ２は、微小管との相互作用に関与するＸＫｌｐ２のテールドメインの受容体であることが示唆されている。
【０００７】
ウォルザック（Ｗａｌｃｚａｋ）らは、有糸分裂細胞抽出物とＤＮＡでコーティングした磁気ビーズを用いて、ＸＫｌｐ２が二極性の有糸分裂紡錘体の形成に果たす役割を検討している（Ｗａｌｃｚａｋら、１９９８． Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ８：９０３〜１３）。ボレティらによる観察とは対照的にウォルザックらは、ＸＫｌｐ２のＣ末端のテールドメインに対する抗体添加時に有糸分裂紡錘体機能の大きな変動を確認していない。
【０００８】
新しいキネシンモータータンパク質、およびそれをコードするポリヌクレオチドが発見されれば、癌、神経疾患、および小胞輸送障害の診断、予防、および治療に有用な新しい組成物が提供されることになり、当技術分野におけるニーズが満たされる。
【０００９】
発明の概要
本発明は、新しいヒトキネシンモータータンパク質ＨｓＫｉｆ１５、ＨｓＫｉｆ１５をコードするポリヌクレオチド、およびこのような組成物による癌、神経疾患、および小胞輸送障害の診断、治療、または予防における用途の発見に基づく。
【００１０】
一つの局面では、本発明は、キネシンスーパーファミリーの、以下の特性を有するモータータンパク質をコードする、単離された核酸配列を提供する：（ｉ）タンパク質の活性が微小管によって活性化されＡＴＰアーゼ活性を含む；および（ｉｉ）配列比較アルゴリズムで測定時に、タンパク質が配列番号：２に対するアミノ酸配列同一性が７０％より大きい配列を有する。一つの態様では、タンパク質はさらに、配列番号：２に対するポリクローナル抗体に特異的に結合する。
【００１１】
一つの態様では、核酸はＨｓＫｉｆ１５またはその断片をコードする。別の態様では、核酸は配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６をコードする。別の態様では、核酸は配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５のヌクレオチド配列を有する。
【００１２】
一つの局面では、核酸は以下の一つまたは複数の特性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含む：
配列番号：２に対する配列同一性が７０％を上回る、好ましくは８０％を上回る、より好ましくは９０％を上回る、より好ましくは９５％を上回る、または別の態様では、配列番号：２に対して９８〜１００％の配列同一性を有する。
【００１３】
一つの態様では、核酸は、以下の一つまたは複数の特性を有する配列を含む：配列番号：１に対する配列同一性が５５％または６０％を上回る、好ましくは７０％を上回る、より好ましくは８０％を上回る、より好ましくは８５％、９０％、９５％を上回る、または別の態様では、配列番号：１に対して９８〜１００％の配列同一性を有する。本明細書で提供される別の態様では、核酸は、配列番号：１の配列または相補的配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する。
【００１４】
別の局面では、本発明は、キネシンスーパーファミリーの、以下の特性を有するモータータンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する：（ｉ）タンパク質の活性が微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性を含む；および（ｉｉ）タンパク質が、配列比較アルゴリズムで測定時に配列番号：２に対するアミノ酸配列同一性が７０％より大きい配列を有する。本発明はさらに、このベクターをトランスフェクトさせた宿主細胞を提供する。
【００１５】
別の局面では、本発明は、単離されたキネシンスーパーファミリーの、上述の一つまたは複数の特性を有するモータータンパク質を提供する。一つの態様では、タンパク質は、ＨｓＫｉｆ１５のモータードメイン、テールドメイン、または他の断片に対して作製されたポリクローナル抗体に特異的に結合する。別の態様では、タンパク質は配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
一つの局面では、本明細書で提供されるタンパク質は、以下の一つまたは複数の特性を有するアミノ酸配列を含む：
配列番号：２に対する配列同一性が７０％を上回る、好ましくは８０％を上回る、より好ましくは８５％または９０％を上回る、より好ましくは９５％を上回る、または別の態様では、配列番号：２に対して９８％〜１００％の配列同一性を有する。
【００１７】
本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列、またはその断片、またより具体的には、配列番号：２のアミノ酸配列のモータードメインを含む実質的に精製されたポリペプチドを特徴とする。
【００１８】
別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、ＨｓＫｉｆ１５の調節因子をスクリーニングする方法を提供する：（ｉ）上記特性の少なくとも一つを有する生物学的に活性のあるモータータンパク質を試験濃度および対照濃度において少なくとも１種の候補薬剤と接触させる段階、ならびにモータータンパク質の活性の変化が、試験濃度と対照濃度の間で生じるか否かを検出する段階であって、変化がモータータンパク質の調節因子の存在を示す段階。一つの態様では、このような活性は、微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性、および微小管結合活性からなる群より選択される。一つの態様では、この方法はさらに、生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５を細胞試料から単離する段階を含む。別の態様では、生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５は組換え体である。
【００１９】
別の局面では、本発明は、以下を含む、ＨｓＫｉｆ１５の調節因子のスクリーニングに用いるキットを提供する：（ｉ）生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５を収める容器；および（ｉｉ）微小管結合活性または微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性であるＨｓＫｉｆ１５活性のアッセイ法を実施する際の説明書。
【００２０】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で用いる「農業用化合物」は、農業分野に有用で、食用作物もしくは繊維性作物の防護の強化または収量改善に機能する化学的化合物および生物学的化合物を意味する。例えば、１つのこのような化合物は、雑草を選択的にコントロールする除草剤として、植物の病気の拡散をコントロールする殺菌剤として、昆虫およびダニ類を寄せ付けず、また駆除する除虫剤として作用する可能性がある。また、１つのこのような化合物は、植物の調節因子または活性化因子として、発芽中の種子、芽生え、または若い植物の生育環境を改善するための種子の処理に有用性を示す場合がある。
【００２１】
「増幅」用プライマーは、選ばれた核酸配列の増幅の基礎として作用しうる天然ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のいずれかを含むオリゴヌクレオチドである。これには例えば、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマー、およびリガーゼ連鎖反応に用いるオリゴヌクレオチドなどが含まれる。
【００２２】
「抗体」は、分析物（抗原）と特異的に結合して認識する免疫グロブリン遺伝子（群）またはその断片に実質的にコードされたポリペプチドを意味する。これまで認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、δ、ε、およびμの定常領域遺伝子群、ならびに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子群がある。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥをそれぞれ決めるγ、μ、α、δ、またはεに分類される。抗体という用語には、抗体全体の修飾、または組換えＤＮＡ法によるデノボ合成によって作製される抗体断片も含まれる。
【００２３】
「抗ＨｓＫｉｆ１５」抗体は、ＨｓＫｉｆ１５遺伝子、ｃＤＮＡ、またはそのサブ配列にコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片である。
【００２４】
「生物学的に活性のある」ＨｓＫｉｆ１５とは、例えばＡＴＰアーゼアッセイ法、微小管滑走アッセイ法、または微小管結合アッセイ法で検討される、微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性を有するＨｓＫｉｆ１５を意味する。「ＡＴＰアーゼ活性」は、ＡＴＰを加水分解する能力を意味する。
【００２５】
本明細書で用いる「生物試料」は、ＨｓＫｉｆ１５もしくはその断片、またはＨｓＫｉｆ１５タンパク質をコードする核酸を含む生体組織または体液の試料である。生物試料はまた、組織学的実験に用いるために採取された凍結切片などの組織切片も含む場合がある。生物試料は少なくとも１個の細胞を含み、好ましくは植物体または脊椎動物である。態様には、真核生物、好ましくは真菌、植物、昆虫、原虫、鳥類、魚類、爬虫類などの真核生物、また好ましくはラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、またはウサギなどの哺乳類、また最も好ましくはチンパンジーまたはヒトなどの霊長類から得られる細胞が含まれる。
【００２６】
「比較ウィンドウ」は、ある配列と同じ数の隣接した位置の参照配列を最適にアライメントして両配列を比較する、２５〜６００個、通常は約５０〜約２００個、より一般的には約１００〜約１５０個からなる群より選択される隣接した位置の数のいずれかの一つのセグメントを参照することを含む。比較目的の配列のアライメントの方法は当技術分野で周知である。比較のための最適なアライメントは例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１）に記載された局所相同性アルゴリズム、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８）の類似性検索法、以上のアルゴリズムのコンピュータを用いた実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、またはマニュアルによるアライメントおよび目視判定（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌらの前記論文を参照）で実施することができる。
【００２７】
有用なアルゴリズムの一例がＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ対アライメントを用いて一群の関連配列から複数の配列アライメントを作成する。アライメント作成に用いられるクラスター形成の関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、フェン（Ｆｅｎｇ）およびドリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３５：３５１〜３６０ （１９８７）のプログレッシブアライメント法を単純化している。使用される方法は、ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３ （１９８９）に記載された方法に似ている。このプログラムでは最長５，０００の最大３００個の配列をアライメントすることができる。多重アライメントの手順は、二つの最も類似した配列の対アライメントから始め、二つのアライメントされた配列のクラスターを形成する。次にこのクラスターを、次に最も関連性の大きい配列、またはアライメントされた配列のクラスターとアライメントする。配列の二つのクラスターは、二つの各配列の対アライメントを単純に拡大することでアライメントすることができる。最終的なアライメントは、一連のプログレッシブ対アライメントで達成される。このようなプログラムを用いて、クラスター形成関係の樹状図やツリー表示にプロットすることができる。
【００２８】
配列同一性のパーセンテージの決定（実質的な類似か、または同一かの判定）に適したアルゴリズムの別の例が、アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３〜４１０ （１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するソフトウェアは、生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を通して入手することができる。このアルゴリズムでは、データベース配列の同じ長さのワードとアライメントさせたときにマッチするか、またはある程度の正の値をとる閾値スコアＴをある程度満たす、問合わせ配列中の短いワードの長さＷの同定による高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）の同定段階が最初に行われる。Ｔは近傍のワードスコアの閾値を意味する（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前記）。初期の近傍ワードのヒットは、それを含む、より長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシード（ｓｅｅｄ）となる。ワードのヒットを次に、累積アライメントスコアが増加する限り、各配列に沿って両方向に拡張してゆく。累積スコアは、ヌクレオチド配列、パラメータＭ （マッチング残基のペアのリワード（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に＞０）およびＮ （ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列の場合は、スコア行列を用いて累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの拡張は以下の時点で終了する：累積アライメントスコアが最大達成値から量Ｘに低下した場合；一つまたは複数の負のスコアリング残基アライメントが蓄積したために累積スコアがゼロまたはそれ以下となったとき；またはいずれかの配列の末端に達したとき。核酸またはポリペプチドが本発明の範囲にあるか否かを判定する場合は、ＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトパラメータが適している。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、デフォルトのワード長（Ｗ）として１１、期待値（Ｅ）として１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４を用い、双方の鎖の比較を行う。アミノ酸配列の場合は、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトのワード長（Ｗ）として３、期待値（Ｅ）として１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を用いる。ＢＬＡＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対するタンパク質配列を用いる）では、デフォルトのワード長（Ｗ）として３、期待値（Ｅ）として１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を用いる（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５ （１９８９）を参照）。
【００２９】
配列同一性パーセンテージの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、二つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３〜５７８７ （１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムで提供される類似性の一つの尺度は、二つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間でマッチングが偶然生じる確率の指標となる最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば核酸は、被験核酸と標準核酸との比較時の最小和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、また最も好ましくは約０．００１未満の場合に、参照配列と類似しているとみなされる。
【００３０】
「保存的に修飾された異型」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された異型は、同一または本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸を意味するか、または核酸が本質的に同一な配列に対するアミノ酸配列をコードしていない核酸を意味する。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の複数のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはいずれもアミノ酸アラニンをコードする。したがってアラニンがコドンで特定されるどの位置においても、このコドンはコードされたポリペプチドを変化させることなく任意の対応コドンに変更することができる。このような核酸の変異は、保存的に修飾された変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書に記載されたどの核酸配列も、可能なあらゆる核酸のサイレント変異を含む。核酸の各コドン（通常メチオニンのみを示すコドンＡＵＧを除く）が修飾されても機能的に同一な分子を生じることがあることを当業者であれば理解すると思われる。したがって、あるポリペプチドをコードする核酸の個々のサイレント変異は、個々に記載された配列上明らかにならない。
【００３１】
アミノ酸配列に関しては、コード配列中の１個のアミノ酸または少ないパーセンテージのアミノ酸を変化、付加、または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、そのような変化によって、あるアミノ酸と、化学的に類似したアミノ酸との置換を生じる「保存的に修飾された異型」であることを当業者であれば理解すると思われる。機能的に似たアミノ酸についてまとめられた保存的置換の表は当技術分野で周知である。
【００３２】
以下の６つのグループはそれぞれ、相互に保存的置換の関係にあるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （１９８４）を参照）。
【００３３】
「細胞骨格成分」とは、細胞骨格の構造的完全性の維持または調節に重要な役割を果たしたり、または細胞骨格が関与する運動を仲介したり調節したりする、細胞骨格と関連して見出される任意の分子を意味する。これには細胞骨格重合体（例えば、アクチンフィラメント、微小管、ミオシン断片、フィラメント）、分子モーター、および細胞骨格関連調節タンパク質（例えば、トロポミオシン、α−アクチニン）が含まれる。
【００３４】
細胞骨格の「細胞骨格機能」は、構造（例えば、微絨毛、紡錘体）をもたらす、また、細胞内における運動（例えば、筋収縮、有糸分裂時の収縮環、偽足性移動（ｐｓｅｕｄｏｐｏｄａｌ ｍｏｖｅｍｅｎｔ）、活発細胞の表面変形、小胞形成、およびトランスロケーション）を仲介する生物学的な役割を意味する。
【００３５】
本明細書で用いる「診断的化合物」は、健康状態または疾患状態の同定および特性解析の一助となる化合物である。診断的化合物は、当技術分野で周知の標準的なアッセイ法で使用することができる。
【００３６】
「発現ベクター」は、組換え的、または合成的に、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能とする一連の特定の核酸配列とともに作られる核酸コンストラクトである。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部、または核酸断片の場合がある。典型的には発現ベクターは、プロモーターに使用可能に連結されて転写される核酸を含む。
【００３７】
「ＨｓＫｉｆ１５」は、微小管モータータンパク質のキネシンスーパーファミリーの分子である。ＨｓＫｉｆ１５は、微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性、および微小管結合活性などの活性をもつ。
【００３８】
核酸の一部分に関して用いられる「異種」という表現は、核酸が、天然の状態で相互に同じ関連性で見出されない２個またはそれ以上のサブ配列を含むことを意味する。例えば核酸は典型的には、無関係に配置された遺伝子から新しい機能性核酸を作るように２個またはそれ以上の配列を有するように組換え的に作製される。
【００３９】
「ストリンジェンシーの高い条件」は例えば以下のような条件である：（１）洗浄段階に低イオン強度および高温、例えば０．０１５ Ｍ 塩化ナトリウム／０．００１５ Ｍ クエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で用いる条件；（２）ハイブリダイゼーション段階で、ホルムアミドなどの変性剤、例えば５０％ （ｖ／ｖ） ホルムアミド＋０．１％ ウシ血清アルブミン／０．１％ フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）／０．１％ ポリビニルピロリドン／５０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ６．５、および７５０ ｍＭ 塩化ナトリウム、７５ ｍＭ クエン酸ナトリウムを４２℃で用いる条件；または（３）５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ （０．７５ Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５ Ｍ クエン酸ナトリウム）、５０ ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ ６．８）、０．１％ ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ （５０ μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ、および１０％ 硫酸デキストランを４２℃で用いる処理、０．２×ＳＳＣ （塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）を４２℃に用いる洗浄、５０％ ホルムアミド中で５５℃における処理に続き、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣを５５℃で用いる処理を含むストリンジェンシーの高い洗浄段階を用いる条件。
【００４０】
本明細書で用いる「高スループットのスクリーニング」は、同時にスクリーニング対象となる複数の候補薬剤または試料を提供するアッセイ法を意味する。詳しく後述するように、これらのアッセイ法の例には、多数のアッセイ法を少量の試薬および試料を用いて同時に実施可能とするために特に便利なマイクロタイタープレート、および核酸またはタンパク質のアレイの使用が含まれる。
【００４１】
「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、同ベクターの複製または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞の場合や、植物細胞、ＣＨＯ、ＨｅＬａなどの酵母、昆虫、両生類、または哺乳類の細胞などの真核細胞の場合がある。細胞および組織の初代培養物は、この定義に含まれる。
【００４２】
「〜と特異的にハイブリッドを形成する」という表現は、配列が複合混合物（例えば全細胞）のＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合に、ストリンジェントな条件下で分子が特定のヌクレオチド配列に結合すること、２本鎖を形成すること、またはハイブリッドを形成することを意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、環境が違えば異なることがある。長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリッドを形成する。一般にストリンジェントな条件は、特定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定配列の融点（Ｔｍ）より約５℃低い温度になるように選択される。Ｔｍは、（特定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度において）標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡時に標的配列とハイブリッドを形成する温度である。典型的にはストリンジェントな条件は、塩濃度がナトリウムイオンが約１．０ Ｍ未満、典型的にはｐＨ ７．０〜８．３における約０．０５〜１．０ Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）の濃度、および温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃、また長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドを超える）について少なくとも約６０℃という条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することでも達成することができる。
【００４３】
２個またはそれ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して「同一」または「同一性」パーセンテージという用語は、以下の配列比較アルゴリズムの一つを用いるか、またはマニュアルアライメントおよび目視で測定した場合、比較ウィンドウで最大の一致となるように比較してアライメントさせた際に、アミノ酸残基またはヌクレオチド残基が同じか、または同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する２個またはそれ以上の配列またはサブ配列を意味する。この定義は、被験配列が指定されているか、または参照配列と実質的な同一性を有する場合に、指定の配列またはサブ配列の相補性のパーセンテージで表される被験配列の相補物も意味する。好ましくは同一性パーセンテージは、長さが少なくとも２５アミノ酸の配列領域、より好ましくは長さが５０〜１００アミノ酸の領域についていう。
【００４４】
配列同一性パーセンテージをタンパク質またはペプチドに関して用いる場合、同一でない残基の位置は、アミノ酸残基が化学的特性（例えば電荷や疎水性）が似た他のアミノ酸残基と置換されることによって分子の機能的特性を変化させない保存的アミノ酸置換と異なる場合があることが認識される。保存的置換で配列が異なる場合、配列同一性パーセンテージは、上方に調整されて、置換の保存的な性質に補正されることがある。このような調整を行う手段は当技術分野で周知である。保存的置換のスコアリングは例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ （Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などで実行される、マイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラーズ（Ｍｉｌｌｅｒｓ）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ． ４：１１〜１７ （１９８８）に記載されたアルゴリズムで計算される。
【００４５】
「免疫アッセイ法」という用語は、抗原に特異的に結合する抗体を用いるアッセイ法である。免疫アッセイ法は、抗原の単離用、標的化用、および／または定量用の特定抗体の特異的な結合特性を使用することを特徴とする。
【００４６】
「インビボ」という表現は、生物体の細胞内で生じる適用を意味する。「インビトロ」という表現は、生物体外における適用を意味し、細胞内または無細胞環境における適用を意味する。「インサイチュー」とは、例えば細胞を操作した後に生物体に移すというような、環境を組み合わせる適用を意味する。
【００４７】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という表現は、天然の状態で見出されるように通常伴う成分を実質的または本質的に含まない材料を意味する。純度および均質度は、典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学的手法で決定される。調製物中に存在する支配的な種であるタンパク質は実質的に精製される。単離されたＨｓＫｉｆ１５では、核酸は、ＨｓＫｉｆ１５遺伝子に隣接してＨｓＫｉｆ１５以外のタンパク質をコードする読み枠から分離している。「精製された」という表現は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル上に本質的に１本のバンドを生じることを意味する。具体的には、この表現は核酸またはタンパク質の純度が少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、また最も好ましくは少なくとも９９％であることを意味する。
【００４８】
「標識」は、分光光度的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段で検出可能な組成物である。例えば有用な標識には、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡで通常使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに抗血清またはモノクローナル抗体に使用されるタンパク質などがある（例えば配列番号：２のポリペプチドは、例えば放射標識をペプチドに取り込ませ、そのペプチドに特異的に反応する抗体の検出に用いることで検出可能とすることができる）。
【００４９】
「標識された核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、共有結合的に、またはリンカーを介して、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、もしくは水素結合を介して標識に結合していて、プローブの存在が、プローブに結合した標識の存在の検出によって検出される分子である。
【００５０】
「中程度にストリンジェントな条件」は、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９に記載された手順で決めることが可能であり、上述の条件と比べてストリンジェンシーが弱い洗浄液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の一例は、以下の組成の溶液中で一晩３７℃におけるインキュベーション：２０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ （１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１５ ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％ 硫酸デキストラン、および２０ μｇ／ｍＬ 変性サケ精子ＤＮＡによる処理と、それに続く、約３７〜５０℃で１×ＳＳＣ中におけるフィルターの洗浄である。プローブ長などの因子を配慮する必要に応じて、温度やイオン強度などを調整する方法を当業者であれば理解すると思われる。
【００５１】
「調節因子」、「阻害性物質」、および「ＨｓＫｉｆ１５の活性化因子」は、ＨｓＫｉｆ１５の活性を調べるインビトロおよびインビボのアッセイ法で同定される調節性分子を意味する。このようなアッセイ法では、ＡＴＰアーゼ活性、微小管滑走活性、微小管解重合活性、および微小管結合活性などの結合活性、またはヌクレオチド類似体の結合などを調べる。試料または分析対象物は、試験濃度および対照濃度で候補薬剤で処理される。対照濃度はゼロとすることができる。両濃度間でＨｓＫｉｆ１５活性に変化がみられる場合、そのような変化は、調節因子の存在が認められたことを意味する。上昇または低下することがある活性の変化は、対象に比較して好ましくは少なくとも２０〜５０％の変化であり、より好ましくは少なくとも５０〜７５％の変化であり、より好ましくは少なくとも７５〜１００％の変化であり、より好ましくは１５０〜２００％の変化であり、また最も好ましくは少なくとも２〜１０倍の変化である。また変化は結合特異性または基質の変化によって示される場合がある。
【００５２】
「分子モーター」は、化学的エネルギーから物理的な力を発生し、細胞骨格の運動特性を誘導する細胞骨格分子を意味する。
【００５３】
「モータードメイン」という表現は、真のキネシンのモータードメインに対する約３５〜４５％の配列同一性によって、モータータンパク質のキネシンスーパーファミリーへ分類する指標となるＨｓＫｉｆ１５のドメインを意味する。
【００５４】
「核酸」という用語は、１本鎖または２本鎖の形状をとるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびこれらの重合体を意味する。具体的に制限しない限り、この用語は、標準核酸と類似の結合を有して天然ヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知類似体を含む核酸を含む。特に明記しない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾された異型そのもの（例えば縮重コドン置換）、および相補的配列、ならびに明瞭に指示された配列を暗黙のうちに含む。具体的には、縮重コドン置換は一つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置がミックスドアーゼ（ｍｉｘｅｄ−ａｓｅ）、および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生じることで達成される場合がある（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：５０８１ （１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５〜２６０８ （１９８５）；Ｃａｓｓｏｌら、１９９２；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１〜９８ （１９９４））。核酸という用語は遺伝子、遺伝子にコードされるｃＤＮＡ、およびｍＲＮＡと互換的に用いられる。
【００５５】
「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、相補的配列をもつ標的核酸に、一つまたは複数の種の化学結合、通常は相補的な塩基対形成、通常は水素結合の形成を介して結合可能な核酸と定義される。本明細書で用いるように、プローブは天然の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、もしくはＴ）、または修飾型塩基を含む場合がある。またプローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションに干渉しない限りは、ホスホジエステル結合を除く結合で連結される場合がある。したがって例えばプローブは、構成される塩基がホスホジエステル結合以外のペプチド結合で連結されるペプチド性核酸の場合がある。プローブが、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じてプローブ配列と完全な相補性をもたない標的配列に結合可能であることは当業者であれば理解すると思われる。プローブは好ましくは、放射性同位元素、発色団、ルミフォア、色素原で直接標識されるほか、後にビオチンにストレプトアビジン複合体が結合するように間接的に標識される。プローブの有無を調べることで、選択される配列またはサブ配列の有無を検出することができる。
【００５６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書ではアミノ酸残基重合体と互換的に用いられる。この用語は、１個または複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工の化学的類似体であるアミノ酸重合体、ならびに天然のアミノ酸重合体に適用される。ＨｓＫｉｆ１５ポリペプチドは、少なくとも微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性をもつことと、ＨｓＫｉｆ１５に対する抗体と結合することが明らかにされたポリペプチドを含む。本明細書では、アミノ酸は一般に知られている、または命名委員会（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって決められた３文字の記号のいずれかによって表記される。同様にヌクレオチドは、一般に受け入れられている１文字コード（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌによって推奨されている１文字記号）で表される。
【００５７】
「プロモーター」は、核酸の転写を誘導する一連の核酸対照配列と定義される。本明細書で用いるように、プロモーターは転写部位の近傍に必要な核酸配列を含む（ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合はＴＡＴＡ配列）。プロモーターは、転写開始部位から数千塩基対離れて位置することが可能な遠位のエンハンサー配列またはリプレッサー配列も選択的に含む。「構成的」プロモーターは、大部分の環境条件および発生条件で活性を示すプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的または発生的な調節を受けるプロモーターである。「使用可能に連結される」という表現は、核酸の発現対照配列（プロモーター、または一連の転写因子結合部位など）と、第２の核酸配列との間における機能的な連結を意味し、発現対照配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を誘導する。
【００５８】
抗体に「特異的（または選択的）に結合する」という表現、またはタンパク質またはペプチドに関して「特異的（または選択的）に免疫反応する」という表現は、タンパク質および他の生物製剤の不均一集団におけるタンパク質の存在に決定的な結合反応を意味する。したがって指定の免疫アッセイ条件で特定の抗体は、特定のタンパク質とバックグラウンドの少なくとも２倍結合し、試料中に存在する他のタンパク質に対しては有意な量で実質的に結合しない。特定の結合部分は典型的には、少なくとも互いに１０６Ｍ−１の親和性を有する。診断または治療に用いられる好ましい抗体は１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１などの高い親和性をもつ場合がある。このような条件下における抗体に対する特異的な結合は、特定のタンパク質に対する特異性から選択される抗体を必要とする場合がある。例えば、配列番号：２にコードされたアミノ酸配列を有するＨｓＫｉｆ１５に対する抗体は、ＨｓＫｉｆ１５と特異的に免疫反応して他のタンパク質とは反応しない抗体のみを得るように選択することができる（ＨｓＫｉｆ１５の多型異型、相同分子種、対立遺伝子、および関連性の強い相同体は除く）。このような選択は、線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）のｕｎｃ−１０４および哺乳類のＫｉｆ１などの分子と交差反応する抗体を差引くことで達成することができる。さまざまな免疫アッセイのフォーマットを用いることで、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体の選択にルーチンに用いられている（例えば、特異的な免疫反応性の決定に使用可能な免疫アッセイのフォーマットおよび条件についてはＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「抗体、実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８８）の記述を参照）。典型的には、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドのシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であるか、より典型的にはバックグラウンドの１０〜１００倍である。
【００５９】
「選択的に結びつく」という表現は、核酸が上述の他の分子と「選択的にハイブリッドを形成する」能力、または抗体が上述のようにタンパク質に「選択的（または特異的）に結合する」能力を意味する。
【００６０】
「遺伝子産物をコードする配列」という表現は、配列情報を含む核酸を意味する。この表現は具体的には、天然配列、または特定の宿主細胞に導入してコドンの使用頻度を確認することができる配列の縮重コドン（一つのアミノ酸をコードする異なるコドン）を含む。
【００６１】
（本明細書で「候補薬剤」および「被験化合物」ならびに「被験薬剤」と互換的に用いられる）「被験組成物」は、２種またはそれ以上の細胞骨格成分間における相互作用に及ぼす作用がアッセイされる分子または組成物を意味する。「被験組成物」は、選択的に含む分子または分子混合物の場合がある。
【００６２】
本明細書で用いる「治療用物質」は、ヒトと動物の疾患の両方に適用可能な細胞骨格系をインビボで調節する能力があると考えられている化合物を意味する。細胞骨格系の調節は、以下を含むがこれらに限定されないいくつかの条件で望ましい場合がある：内皮細胞の異常な刺激（例えばアテローム硬化症）、固形腫瘍および造血系腫瘍ならびに腫瘍転移、良性腫瘍、例えば、血管腫、聴神経腫瘍、神経線維腫、化膿性肉芽腫、血管機能不全、創傷治癒異常、炎症性疾患および免疫疾患（慢性関節リウマチ、ベーチェット病など）、痛風または通風性関節炎、血管形成異常（慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症、および、網膜色素変性症、角膜移植拒絶、角膜過成長、緑内障などの目の血管原性疾患を伴うもの）、オスラー・ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ Ｗｅｂｂｅｒ）症候群、心血管疾患（高血圧症、心筋虚血、ならびに収縮能障害および拡張能障害など）、ならびに真菌疾患（アスペルギルス症、カンジダ症、および局所真菌疾患）。
【００６３】
ＩＩ．はじめに
本発明は、ＨｓＫｉｆ１５をコードする核酸を初めて提供する。このタンパク質は、モータータンパク質のキネシンスーパーファミリーの分子で、微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性を示す。ＨｓＫｉｆ１５は紡錘体の形成に不可欠なことがわかっている。
【００６４】
一つの局面では、ＨｓＫｉｆ１５は、以下の機能特性および構造特性の少なくとも一つまたは好ましくは複数を有する分子と定義することができる。機能的にはＨｓＫｉｆ１５は、微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性、およびＡＴＰに依存した微小管モーター活性をもつ。ＨｓＫｉｆ１５活性は、結合活性に関して説明することもできる。
【００６５】
本明細書に記載されている新しいヌクレオチド配列は、ＨｓＫｉｆ１５またはその断片をコードする。したがって一つの局面では、本明細書に記載された核酸は、本明細書に記載された新しいタンパク質と定義される。本明細書に記載されたタンパク質は、以下の一つまたは複数の特性を有するアミノ酸配列を含む：配列番号：２との配列同一性が７０％を上回る、好ましくは８０％を上回る、より好ましくは９０％を上回る、より好ましくは９５％を上回る、または別の態様では配列番号：２と９８〜１００％の配列同一性を有する。上述した通り、ヌクレオチドが配列番号：１に関するという場合は、配列同一性は、同じパーセンテージか、または遺伝子コードの縮重のためにわずかに低い場合がある。本発明はまた配列番号：１に由来する少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、１００、１０００、または２０００の隣接ヌクレオチド、またはその縮重した分子を有する図１に示すヌクレオチド配列の断片も含む。断片の一部は、図２のアミノ酸配列の３２〜３９１位あたりにあるモータードメインを含む。このような断片の一部は、ハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして用いることができる。文脈から明らかでない限り、図に示すヌクレオチド配列または配列をいう場合は、この示される配列、つまり２本の鎖の完全な相補物または２重鎖を意味する場合がある。
【００６６】
ＨｓＫｉｆ１５の推定構造は、アミノ末端にあるキネシン様の微小管「モーター」ドメインを含む（図４および６を参照）。
【００６７】
ＨｓＫｉｆ１５ヌクレオチド配列の一部は、ＨｓＫｉｆ１５の多型異型、相同分子種、対立遺伝子、および相同体の同定に使用することができる。同定は例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および配列決定によりインビトロで行われるか、または他のヌクレオチド配列との比較用のコンピュータシステム上の配列情報を用いて行われる。配列比較は、後述する任意の配列比較アルゴリズムを用いて実施することができる。好ましいアルゴリズムはＰＩＬＥＵＰである。
【００６８】
本明細書に記載されたいずれかのペプチドの活性は、ＡＴＰアーゼ活性または微小管結合活性を調べる、本明細書に記載されたアッセイ法でルーチンの手法で確認することができる。一つの態様では、ＨｓＫｉｆ１５の多型異型、対立遺伝子、および相同分子種、相同体を、当技術分野の周知のＡＴＰアーゼまたは微小管結合のアッセイ法で確認する。
【００６９】
生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５の最初の単離は、このキネシンスーパーファミリーのタンパク質の調節因子を調べるための手段となる。生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５は、微小管滑走アッセイ法、ＡＴＰアーゼアッセイ法 （Ｋｏｄａｍａら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９９：１４６５〜１４７２ （１９８６）；Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５２０９〜５２１３ （１９９３））、および微小管結合アッセイ法（Ｖａｌｅら、Ｃｅｌｌ ４２：３９〜５０ （１９８５））を含む結合アッセイ法などのインビトロアッセイ法による、ＨｓＫｉｆ１５およびその断片、ならびにキネシンスーパーファミリーの分子の調節因子の同定に有用である。インビボアッセイ法およびその用途についても本明細書で提供される。ＨｓＫｉｆ１５に結合する候補薬剤およびその部分を同定する方法も本明細書で提供される。
【００７０】
ＨｓＫｉｆ１５のいくつかの部分または断片は、図２に示す配列に由来する少なくとも７残基、１０残基、１５残基、２０残基、３５残基、５０残基、１００残基、２５０残基、３００残基、３５０残基、５００残基、または１０００残基の隣接アミノ酸を含む。一部の断片は、図２に示す配列に由来する１０００残基、５００残基、２５０残基、１００残基、または５０残基未満の隣接アミノ酸を含む。例えば、例示的な断片には、１５〜５０アミノ酸、または１００〜５００アミノ酸を有する断片が含まれる。一部の断片はモータードメインを含む。このような断片は典型的には、図２のアミノ酸残基の３２〜３９１位の範囲、またはその活性部分を含む。一部の断片はＨｓＫｉｆ１５のリガンド結合ドメインを含む。
【００７１】
後に詳述するように、本明細書に記載された新しい化合物を用いるさまざまなアッセイ法、治療法および診断法が本明細書に記載されている。後に詳述する、本明細書に記載された用途および方法は、インビボ、インサイチュー、およびインビトロにおける適用があり、医学、獣医学、農学、および研究を基礎とした分野の応用に使用することができる。
【００７２】
ＩＩＩ．ＨｓＫｉｆ１５をコードする遺伝子の単離
Ａ．一般的な組換えＤＮＡ法
本発明は、組換え遺伝学分野におけるルーチンの手法に基づく。本発明における用途の一般的な方法を説明した基本的なテキストには、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第２版、１９８９）；クリーガー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ）、「遺伝子移入と発現：実験マニュアル（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９９０）；および「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）などがある。
【００７３】
核酸については、その大きさはキロ塩基対（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）で表される。これは、アガロースゲルもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸の配列決定、または論文に記載されたＤＮＡ配列から得られる推定値である。タンパク質については、その大きさはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で表される。タンパク質の大きさは、ゲル電気泳動、質量分析、タンパク質の配列決定、由来するアミノ酸配列、または論文に記載されたタンパク質配列から推定される。
【００７４】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、べーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびカルザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ． ２２：１８５９〜１８６２ （１９８１）によって最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法にしたがって、デバンテール（Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：６１５９〜６１６８ （１９８４）に記載された自動合成装置を用いて化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、天然のアクリルアミドゲル電気泳動法か、またはピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびレーニエ（Ｒｅａｎｉｅｒ）、Ｊ． Ｃｈｒｏｍ． ２２５：１３７〜１４９ （１９８３）に記載されている陰イオン交換ＨＰＬＣによって行われる。
【００７５】
クローニングされた遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、クローニングした後に、例えばウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら、Ｇｅｎｅ １６：２１〜２６ （１９８１）の２本鎖鋳型の配列決定の鎖停止法で確認することができる。
【００７６】
Ｂ．ＨｓＫｉｆ１５をコードするヌクレオチド配列を単離するためのクローニング法
一般に、ＨｓＫｉｆ１５および関連する核酸配列の相同体をコードする核酸配列は、ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムＤＮＡライブラリーからクローニングされ、またはオリゴヌクレオチドプライマーを用いた増幅法で単離される。または発現ライブラリーを用いて、ＨｓＫｉｆ１５相同体をも認識して選択的に結合するＨｓＫｉｆ１５に対して作製された抗血清または精製抗体によって免疫学的に検出された発現された相同体によってＨｓＫｉｆ１５およびＨｓＫｉｆ１５相同体をクローニングすることができる。最後に、プライマーを用いた増幅法で、ＨｓＫｉｆ１５をＤＮＡまたはＲＮＡから増幅および単離することができる。縮重プライマーを用いた増幅法で、ＨｓＫｉｆ１５相同体を増幅および単離することもできる。プライマーを用いた増幅法でＨｓＫｉｆ１５をコードする核酸を単離することもできる。このようなプライマーは例えば、数百ヌクレオチドからなるプローブの増幅と、それに続く完全長のＨｓＫｉｆ１５を求めるライブラリーのスクリーニングに用いることができる。
【００７７】
他の種のＨｓＫｉｆ１５をコードする遺伝子の同定に用いられる適切なプライマーおよびプローブは、本明細書に記載された配列との比較を元に作製される。上述した通り、抗体を用いてＨｓＫｉｆ１５相同体を同定することができる。例えば、ＨｓＫｉｆ１５のモータードメイン、またはタンパク質全体に対して作製された抗体は、ＨｓＫｉｆ１５相同体の同定に有用である。
【００７８】
ｃＤＮＡライブラリーを作製する際には、対象となるｍＲＮＡ （例えばＨｓＫｉｆ１５のｍＲＮＡ）に富む供給源を選択すべきである。例えばＨｓＫｉｆ１５のｍＲＮＡは、精巣、骨髄、また胎児の肝臓に極めて豊富に含まれ、脳、唾液腺、心臓、甲状腺、腎臓、副腎、脾臓、膵臓、肝臓、卵巣、結腸、子宮、肺、前立腺、小腸、皮膚、筋肉、末梢血リンパ球、胃、胎盤で比較的低く発現している。次に逆転写酵素を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを作り、組換えベクターに連結し、組換え宿主に導入して増殖させ、スクリーニングおよびクローニングを行う。ｃＤＮＡライブラリーの作製およびスクリーニングの方法は当技術分野で周知である（例えば、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ ２５：２６３〜２６９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記；Ａｕｓｕｂｅｌら、前記を参照）。
【００７９】
ゲノムライブラリーについては、ＤＮＡを組織から抽出し、機械的に剪断するか酵素を用いて消化して約１２〜２０ ｋｂの断片を得る。次にこの断片を、勾配遠心法で望ましくない大きさの断片と分離し、バクテリオファージλのベクターに組み込む。ベクターおよびファージのパッケージングはインビトロで行う。組換えファージを、ベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）およびデイビス（Ｄａｖｉｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０〜１８２ （１９７７）に記載されているプラークハイブリダイゼーションで分析する。コロニーハイブリダイゼーションの一般的な記述は、グランステイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７２：３９６１〜３９６５ （１９７５）にある。
【００８０】
ＨｓＫｉｆ１５の核酸およびその相同体を単離する別の方法では、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用とＲＮＡまたはＤＮＡの鋳型の増幅を組み合わせる（米国特許第４，６８３，１９５号、および第４，６８３，２０２号；「ＰＣＲプロトコール：方法と応用についての手引き（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）を参照）。ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応などの方法で、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリー、またはｃＤＮＡライブラリーからＨｓＫｉｆ１５の核酸配列を直接増幅することができる。縮重したオリゴヌクレオチドを設計して、本明細書に記載された配列を用いてＨｓＫｉｆ１５相同体を増幅することができる。また制限エンドヌクレアーゼ切断部位をプライマーに組み込むことができる。ポリメラーゼ連鎖反応、または他のインビトロ増幅法も、例えば発現させるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングする際に、核酸を作製してｍＲＮＡをコードするＨｓＫｉｆ１５の存在を生理学的試料中における検出、核酸の配列決定、または他の目的に使用する際に有用である。ＰＣＲ反応で増幅された遺伝子をアガロースゲルから精製して、適切なベクターにクローニングすることができる。
【００８１】
ＨｓＫｉｆ１５の遺伝子発現は、当技術分野で周知の手法、例えばｍＲＮＡの逆転写および増幅、全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡの単離、ノーザンブロット、ドットブロット、インサイチューハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクション、定量的ＰＣＲなどで分析することもできる。
【００８２】
合成オリゴヌクレオチドを用いて、プローブとして、またはタンパク質の発現に用いる組換えＨｓＫｉｆ１５遺伝子を構築することができる。この方法は、一連の重複した、遺伝子のセンスとアンチセンスの両鎖を示す通常は４０〜１２０ ｂｐの長さのオリゴヌクレオチドを用いて行われる。このようなＤＮＡ断片を次にアニーリングし、連結してクローニングする。または正確なプライマーを用いた増幅法により、ＨｓＫｉｆ１５遺伝子の特定のサブ配列を増幅することができる。続いて、特定のサブ配列を発現ベクターに連結する。
【００８３】
ＨｓＫｉｆ１５の遺伝子を典型的には中間体ベクターにクローニングしてから、原核細胞または真核細胞を形質転換して複製および／または発現させる。中間体ベクターは典型的には、原核細胞のベクターまたはシャトルベクターである。
【００８４】
Ｃ．原核細胞および真核細胞における発現
ＨｓＫｉｆ１５をコードするｃＤＮＡなどの、クローニングされた遺伝子を高レベルで発現させるためには、転写を誘導する強いプロモーター、転写／翻訳のターミネーター、またタンパク質をコードする核酸の場合は、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクターを構築することが重要である。細菌由来の適切なプロモーターは当技術分野で周知であり、例えばサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの文献、およびアウシュベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの文献に記載されている。ＨｓＫｉｆ１５タンパク質を発現させるための細菌発現系は例えば、大腸菌、枯草菌、およびサルモネラ菌で使用することができる（Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ ２２：２２９〜２３５ （１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ ３０２：５４３〜５４５ （１９８３））。このような発現系に使用されるキットは市販されている。哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞の真核発現系は当技術分野で周知であり、これも市販されている。好ましい原核生物発現系の一つがｐＥＴ発現系（Ｎｏｖａｇｅｎ）である。
【００８５】
異種核酸の発現誘導に用いられるプロモーターは特定の応用によって変わる。プロモーターは、天然の状態で転写開始部位から離れている距離とほぼ等距離に異種転写開始部位から離れて位置することが好ましい。しかし当技術分野で周知のように、ある程度の距離の変化は、プロモーターの機能を失うことなく許容される。
【００８６】
プロモーターに加えて、発現ベクターは通常、核酸をコードするＨｓＫｉｆ１５の宿主細胞における発現に必要な付加的な配列すべてを含む転写単位または発現カセットを含む。したがって典型的な発現カセットは、ＨｓＫｉｆ１５をコードする核酸配列に使用可能に連結されたプロモーター、および転写物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、および翻訳終結に必要なシグナルを含む。ＨｓＫｉｆ１５をコードする核酸配列には典型的には、切断可能なシグナルペプチド配列を結合させて、コードされたタンパク質が形質転換細胞から容易に分泌されるようにすることができる。このようなシグナルペプチドには、組織プラスミノーゲンアクチベーター、インスリン、および神経成長因子、ならびにオオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の幼若ホルモンエステラーゼに由来するシグナルペプチドなどが含まれる場合がある。カセットの他の因子にはエンハンサーなどが含まれ、ゲノムＤＮＡを構造遺伝子として用いる場合は、機能性のドナー部位およびアクセプター部位をもつイントロンが含まれる。
【００８７】
プロモーター配列に加えて、発現カセットは、効率的な終結をもたらすために構造遺伝子の下流に転写終結領域も含むべきである。終結領域はプロモーター配列と同じ遺伝子から得られるほか、別の遺伝子からも得られる。
【００８８】
細胞への遺伝情報の輸送に用いられる特定の発現ベクターは特に重要ではない。真核細胞または原核細胞における発現に使用される従来のベクターを使用することができる。標準的な細菌発現ベクターには、ｐＢＲ３２２をベースとしたプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現系などのプラスミドが含まれる。エピトープタグ（例えばｃ−ｍｙｃ）を組換えタンパク質に付け加えることで、単離を簡便化することもできる。
【００８９】
真核細胞に感染するウイルスの調節配列を含む発現ベクターは典型的には、真核発現ベクター（例えば、ＳＶ４０ベクター、サイトメガロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタインバーウイルスに由来するベクター）中で用いられる。他の例示的な真核ベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスのｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効な他のプロモーターの支配下にあるタンパク質の発現を可能とする他の任意のベクターがある。
【００９０】
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼなどの、遺伝子増幅をもたらすマーカーをもつ。または、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーター支配下にＨｓＫｉｆ１５コード配列を含む、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターを用いた系などの、遺伝子増幅を行わない高収量の発現系も適している。
【００９１】
発現ベクターに典型的に含まれる因子には、大腸菌で機能するレプリコン、組換えプラスミドをもつ細菌の選択を可能とする抗生物質耐性をコードする遺伝子、およびプラスミドの非本質的領域にあり、真核生物由来の配列の挿入を可能とする固有の制限酵素切断部位も含まれる。選択される特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当技術分野で周知の多くの任意の耐性遺伝子のいずれかが適している。原核細胞由来の配列は、好ましくは必要に応じて、真核細胞におけるＤＮＡの複製に干渉しないように選択される。
【００９２】
標準的なトランスフェクション法または形質転換法を用いて、ＨｓＫｉｆ１５タンパク質を大量に発現する細菌、哺乳類、酵母、または昆虫細胞の系列を作製する。発現されたタンパク質は後で標準的な手法で精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１７６１９〜１７６２２ （１９８９）；「タンパク質精製の手引き、酵素学における方法（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、第１８２巻、（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０）を参照）。
【００９３】
真核細胞および原核細胞の形質転換は標準的な手法で行う（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ． Ｂａｃｔ．、１３２：３４９〜３５１ （１９７７）；Ｃｌａｒｋ−ＣｕｒｔｉｓｓおよびＣｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１：３４７〜３６２ （Ｗｕら編、１９８３）を参照）。
【００９４】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する、既知の任意の手順を用いることができる。このような手順には、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ポリブレン、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、プラズマベクター、ウイルスベクター、およびクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入する他の任意の既知の方法の使用などが含まれる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前記を参照）。用いられる特定の遺伝子工学的手法が、少なくとも１種の遺伝子を、ＨｓＫｉｆ１５を発現可能な宿主細胞に良好に導入できることだけが必要である。
【００９５】
発現ベクターを細胞に導入後、トランスフェクトした細胞をＨｓＫｉｆ１５の発現に望ましい条件で培養し、後述する標準的な手法で培養物から回収する。
【００９６】
ＩＶ．ＨｓＫｉｆ１５タンパク質の精製
天然のＨｓＫｉｆ１５、または組換えＨｓＫｉｆ１５のいずれかを、機能アッセイ法用に精製して使用することができる。ＨｓＫｉｆ１５は、硫酸アンモニウムなどの基質を用いる選択的沈殿法；カラムクロマトグラフィー、免役沈殿法などを含む標準的な手段で実質的に純粋になるまで精製することができる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、「タンパク質精製：原理と実際（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（１９８２）；米国特許第４，６７３，６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌら、前記；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前記を参照）。好ましい精製法ではＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する。
【００９７】
組換えＨｓＫｉｆ１５を精製する際には、いくつかの手順を用いることができる。例えば分子吸着特性を有することがわかっているタンパク質は、ＨｓＫｉｆ１５に可逆的に融合させることができる。適切なリガンドを用いることで、ＨｓＫｉｆ１５を精製用カラムに吸着させた後にカラムから比較的純粋な状態で遊離させることで選択することができる。次に融合状態のタンパク質を酵素活性を用いて除く。最後にイムノアフィニティカラムを用いてＨｓＫｉｆ１５を精製することができる。
【００９８】
Ａ．組換え細菌からのＨｓＫｉｆ１５の精製
組換えタンパク質は、通常はプロモーター誘導後に形質転換細菌で大量に発現されるが、発現は構成的とすることができる。ＩＰＴＧによるプロモーター誘導は好ましい発現法である。細菌は当技術分野の標準的な手順で増殖させる。新鮮な細菌細胞または凍結細菌細胞をタンパク質の単離に用いる。
【００９９】
または、細菌のペリプラズムからＨｓＫｉｆ１５を精製することができる。細菌を溶解後、ＨｓＫｉｆ１５を細菌のペリプラズムに輸送し、細菌のペリプラズムフラクションを、当技術分野で周知の他の方法に冷却浸透圧ショックを加えた方法で単離することができる。組換えタンパク質をペリプラズムから単離する際には、細菌細胞を遠心してペレットを得る。このペレットを、２０％ ショ糖を含む緩衝液に再懸濁する。細胞を溶解させるためには、細菌を遠心してペレットを５ ｍＭの冷ＭｇＳＯ４に再懸濁し、氷浴に約１０分間維持する。この細胞懸濁液を遠心し、上清をデカントして保存する。上清に含まれる組換えタンパク質は、当技術分野で周知の標準的な手法で宿主タンパク質と分離することができる。
【０１００】
ＨｓＫｉｆ１５またはその断片は、参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第０９／２９５，６１２号に記載された手順で調製することもできる。
【０１０１】
Ｂ．ＨｓＫｉｆ１５を精製するための標準的なタンパク質分離法
溶解度による分画
初期の段階では、特にタンパク質混合物が複雑な場合、初期の塩分画で、望ましくない多くの宿主細胞タンパク質（または細胞用培地に由来するタンパク質）を対象組換えタンパク質と分離することができる場合がある。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物に含まれる水の量を効率的に減少させることでタンパク質を沈殿させる。その後、タンパク質は溶解性に応じて沈殿する。疎水性が大きいタンパク質ほど、低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿を生じる可能性が高い。典型的なプロトコルには、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加して、結果として生じる硫酸アンモニウム濃度を２０〜３０％とする段階が含まれる。この濃度では、疎水性の最も高いタンパク質が沈殿する。次に沈殿を廃棄し（対象タンパク質が疎水性でない場合に限る）、対象タンパク質の沈殿が生じることがわかっている濃度まで硫酸アンモニウムを上清に添加する。次に沈殿を緩衝液に溶解し、過剰な塩を必要に応じて透析またはダイアフィルトレーションで除く。冷エタノール沈殿法などの、タンパク質の可溶性を利用する他の方法は当技術分野で周知であり、複雑なタンパク質混合物の分画に用いることができる。
【０１０２】
大きさの差に基づく濾過
ＨｓＫｉｆ１５の分子量を利用して、さまざまな孔の大きさの膜（例えばＡｍｉｃｏｎ製またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製の膜）を通す限外濾過法で、大きな、または小さなタンパク質から単離することができる。第１段階ではタンパク質混合物を、対象タンパク質の分子量より低分子量のカットオフ値をもつ孔径の膜を通して限外濾過する。次に限外濾過の保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を、対象タンパク質の分子量より大きい分子カットオフ値をもつ膜で限外濾過する。組換えタンパク質は膜を通過して濾液に移動する。次に濾液を対象に、後述するクロマトグラフィーを行う。
【０１０３】
カラムクロマトグラフィー
ＨｓＫｉｆ１５は、その大きさ、正味の表面電荷、疎水性、およびリガンドに対する親和性を元に他のタンパク質と分離することもできる。また、タンパク質に対する抗体をカラムマトリックスに結合させ、タンパク質を免疫精製することができる。以上すべての方法は当技術分野で周知である。クロマトグラフィー法を任意の規模で、またさまざまな業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）による装置を用いて実施することができることは当業者には明らかと思われる。
【０１０４】
Ｖ．ＨｓＫｉｆ１５の免疫学的検出法
核酸ハイブリダイゼーション法によるＨｓＫｉｆ１５遺伝子の検出、および遺伝子発現に加えて、免疫アッセイでＨｓＫｉｆ１５を検出することもできる。免疫アッセイ法では、ＨｓＫｉｆ１５を量的または質的に分析することができる。適用可能な手法に関する一般的な概説は、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８８）に記載されている。
【０１０５】
Ａ．ＨｓＫｉｆ１５に対する抗体
ＨｓＫｉｆ１５に特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は当技術分野で周知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、「免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（１９９１）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前記；Ｇｏｄｉｎｇ「モノクローナル抗体：原理と実際（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（第２版、１９８６）；およびＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７ （１９７５）を参照）。このような手法には、ファージまたは同様のベクター上における組換え抗体のライブラリーの抗体選択による抗体の調製、ならびにウサギまたはマウスの免疫化によるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製が含まれる（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１ （１９８９）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６ （１９８９）を参照）。
【０１０６】
ヒト化状態のマウス抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体の定常領域に組換えＤＮＡ技術で連結することで作製することができる。この手法については、クイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６、１００２９〜１００３３ （１９８９）および参照として組み入れられる国際公開公報第９０／０７８６１号を参照されたい。
【０１０７】
ヒト抗体はファージディスプレイ法で得られる。これについては例えば、ダワー（Ｄｏｗｅｒ）ら、国際公開公報第９１／１７２７１号；マッカファティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、国際公開公報第９２／０１０４７号を参照されたい。この方法では、ファージのライブラリーを、ライブラリーの構成分子が異なる抗体を外表面に提示するように作製する。抗体は通常Ｆｖ断片またはＦａｂ断片として提示される。所望の特異性を保持してファージにより提示される抗体は、ＨｓＫｉｆ１５またはその断片に対するアフィニティ濃縮で選択される。ＨｓＫｉｆ１５に対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位および不活性化された内因性免疫グロブリン座位の少なくとも一つのセグメントをコードする導入遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック哺乳類から作製することもできる。この手法については例えば、いずれも参照として全体が本明細書に組み入れられるロンボーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら、国際公開公報第９３／１２２２７号（１９９３）；クチェルラパティ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）、国際公開公報第９１／１０７４１号（１９９１）を参照されたい。ヒト抗体は、競合結合実験で、またそれ以外では特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有するものを選択することができる。このような抗体は特に、マウス抗体の有用な機能的特性を共有している可能性が高い。ヒトのポリクローナル抗体は、免疫原性物質で免疫化されたヒトの血清の状態でも提供される。選択的に、このようなポリクローナル抗体は、アフィニティ試薬としてＨｓＫｉｆ１５を用いたアフィニティ精製により濃縮することができる。
【０１０８】
免疫原を含むいくつかのＨｓＫｉｆ１５を用いて、ＨｓＫｉｆ１５と特異的に反応する抗体を作製することができる。例えば、組換えＨｓＫｉｆ１５またはモータードメインなどの抗原断片を本明細書に記載された手順で単離する。組換えタンパク質を真核細胞または原核細胞で上述の通りに発現させ、上述の一般的な手順で精製することができる。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生させるための好ましい免疫原である。または、本明細書に開示された配列に由来し、担体タンパク質に結合させた合成ペプチドを免疫原として使用することができる。天然のタンパク質は、純粋な状態、または不純な状態のいずれの状態でも用いることができる。次にこの産物を、抗体を産生可能な動物に注入する。モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体のいずれかを作製し、続く免疫アッセイで使用してタンパク質を測定することができる。
【０１０９】
ポリクローナル抗体を作製する方法は当技術分野で周知である。近交系のマウス（例えばＢＡＬＢ／Ｃマウス）またはウサギを同タンパク質で、フロインドアジュバントなどの標準的なアジュバントを用いて、また標準的な免疫化プロトコルで免疫化する。免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、採血を行ってＨｓＫｉｆ１５に対する反応性の力価を決定することでモニタリングする。免疫原に対して適切に高い力価の抗体が得られる場合は、動物から血液を採取して抗血清を調製する。望ましいならば、対象タンパク質に反応する抗体を濃縮するために、さらに抗血清の分画を行う（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅによる前記論文を参照）。
【０１１０】
モノクローナル抗体は、当業者になじみのあるさまざまな手法で得られる。簡単に説明すると、所望の抗原で免疫化した動物の脾臓細胞を、通常はミエローマ細胞と融合させることで不死化する（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１〜５１９ （１９７６）を参照）。または、不死化する方法には、エプスタインバーウイルス、癌遺伝子、もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当技術分野で周知の方法もある。不死化した細胞１個から生じるコロニーを、抗原に対する所望の特異性および親和性を有する抗体を産生するものについてスクリーニングを行い、このような細胞によって作製されるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹腔への注入を含むさまざまな手法で高めることができる。またはモノクローナル抗体またはその結合断片をコードするＤＮＡ配列を、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１ （１９８９）で概説されている一般的なプロトコルにしたがって、ヒトＢ細胞に由来するＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行うことで単離することができる。
【０１１１】
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清を回収し、例えば固相支持体上に固定された免疫原を用いる固相免疫アッセイなどの免疫アッセイで免疫原タンパク質に対する力価を測定する。典型的には、力価が１０４またはそれ以上のポリクローナル抗血清を選択し、非ＨｓＫｉｆ１５タンパク質、さらには他の生物に由来する他の相同タンパク質（例えば線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）のｕｎｃ−１０４または哺乳類のＫｉｆ１）に対する交差反応性を競合結合免疫アッセイで検討する。特異的なポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は通常ＫＤが少なくとも約０．１ ｍＭ、より一般的には少なくとも約 １ μＭ、好ましくは少なくとも約０．１ μＭまたはそれ以上、また最も好ましくは０．０１ μＭまたはそれ以上で結合する。
【０１１２】
ＨｓＫｉｆ１５に特異的な抗体が得られたら、さまざまな免疫アッセイ法でＨｓＫｉｆ１５を検出することができる。免疫学的手法および免疫アッセイの手順に関する総説は、「基礎臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照されたい。また本発明の免疫アッセイは、「酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」（Ｍａｇｇｉｏ編、１９８０）；およびハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、前記論文で広範囲に概説されている、任意の複数の構成で実施することができる。
【０１１３】
Ｂ．結合アッセイ法
抗体は、治療に使用できるほか、上述の配列同一性の特性を有するＨｓＫｉｆ１５の存在を確認する際に使用することができる。また抗体を用いて、後に詳述するように抗体とＨｓＫｉｆ１５との間における相互作用の調節因子を同定することができる。以下の考察は、結合アッセイ法における用途における抗体の使用を意図しているが、「非競合的な」アッセイ法または「競合的な」アッセイ法について記載されたフォーマットなどの同様の一般的なアッセイ法のフォーマットが、微小管または米国特許出願第６０／０７０，７７２号に記載された化合物などのＨｓＫｉｆ１５に結合する任意の化合物とともに使用できることは言うまでもない。
【０１１４】
好ましい態様では、ＨｓＫｉｆ１５は、任意の複数の十分に認められた免疫学的結合アッセイ法で検出および／または定量される（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；４，３７６，１１０号；第４，５１７，２８８号；および第４，８３７，１６８号を参照）。一般的な免疫アッセイの総説は、「細胞生物学における方法、３７巻：細胞生物学における抗体（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ａｓａｉ編、１９９３）；「基礎臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照されたい。免疫学的結合アッセイ法（免疫アッセイ法）では、典型的には、選択用のタンパク質または抗原（この場合はＨｓＫｉｆ１５またはその抗原性サブ配列）に特異的に結合する抗体が用いられる。抗体（例えば抗ＨｓＫｉｆ１５）は、当技術分野で周知の、また上述の任意のいくつかの手段で作製することができる。
【０１１５】
免疫アッセイでは、標識薬剤を用いて、抗体と抗原で形成される複合体に特異的に結合させて標識することもある。標識試薬は、そのものが抗体／抗原複合体を含む部分の一つである。したがって標識薬剤は、標識されたＨｓＫｉｆ１５ポリペプチド、または標識された抗ＨｓＫｉｆ１５抗体の場合がある。または標識試薬は、抗体／ＨｓＫｉｆ１５複合体に特異的に結合する二次抗体などの第３の部分の場合がある（二次抗体は通常、一次抗体が由来する種の抗体に特異性をもつ）。免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合可能な他のタンパク質（タンパク質Ａやタンパク質Ｇなど）も標識薬剤として使用することができる。これらのタンパク質は、さまざまな種の免疫グロブリンの定常領域に強い非免疫原性反応を示す（一般的には、クロンバル（Ｋｒｏｎｖａｌ）ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１１：１４０１〜１４０６ （１９７３）；アカーストーム（Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ）ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５：２５８９〜２５４２ （１９８５）を参照）。標識薬剤は、ストレプトアビジンなどの別の分子が特異的に結合するビオチンなどの検出用部分で修飾することができる。さまざまな検出用部分が当技術分野で周知である。
【０１１６】
アッセイ法を通して、試薬をそれぞれ混合した後にインキュベーション段階および／または洗浄段階が必要とされる場合がある。インキュベーション段階は約５秒間〜数時間を変動する場合があり、好ましくは約５分間〜約２４時間である。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ法のフォーマット、抗原、溶液の容量、濃度などによって変わる。通常、アッセイ法は外界温度で実施されるが、１０〜４０℃などの温度範囲で実施される場合がある。
【０１１７】
非競合的なアッセイ法のフォーマット
試料に含まれるＨｓＫｉｆ１５を検出する免疫アッセイ法は、競合的または非競合的なアッセイ法とすることができる。非競合的な免疫アッセイ法では抗原量を直接測定する。一つの好ましい「サンドイッチ」アッセイ法では、例えば抗ＨｓＫｉｆ１５抗体を、固定化用の固体基質に直接結合させることができる。固定化された抗体は次に、被験試料に含まれるＨｓＫｉｆ１５を捕捉する。したがってＨｓＫｉｆ１５は固定化された後に、標識を含む二次ＨｓＫｉｆ１５抗体などの標識薬剤と結合する。または、二次抗体は標識を含まない場合があるが、二次抗体が由来する種の抗体に特異的な標識された三次抗体に順に結合する場合がある。二次抗体または三次抗体は典型的には、ストレプトアビジンなどの別の分子が特異的に結合して検出用部分となる、ビオチンなどの検出用部分で修飾される。
【０１１８】
競合的アッセイ法のフォーマット
競合的なアッセイ法では、試料に含まれるＨｓＫｉｆ１５の量は、試料に含まれる未知のＨｓＫｉｆ１５による抗ＨｓＫｉｆ１５抗体と置換された（競合された）既知の添加された（外因性の）ＨｓＫｉｆ１５の量を測定することで、間接的に測定される。一つの競合的なアッセイ法では、既知量のＨｓＫｉｆ１５を試料に添加した後に、ＨｓＫｉｆ１５に特異的に結合する抗体を試料に接触させる。抗体に結合した外因性ＨｓＫｉｆ１５の量は、試料に含まれるＨｓＫｉｆ１５の濃度に反比例する。特に好ましい態様では、抗体は固体基質に固定される。抗体に結合したＨｓＫｉｆ１５の量は、ＨｓＫｉｆ１５／抗体複合体に含まれるＨｓＫｉｆ１５量を測定することによって、またはその代わりに複合体を形成していない残りのタンパク質量を測定することによって決定される場合がある。ＨｓＫｉｆ１５の量は、標識されたＨｓＫｉｆ１５分子を提供することで検出することができる。
【０１１９】
もう一つの好ましい競合的なアッセイ法がハプテン阻害アッセイ法である。このアッセイ法では、既知のＨｓＫｉｆ１５を固体基質上に固定する。既知量の抗ＨｓＫｉｆ１５を試料に添加した後に、固定されたＨｓＫｉｆ１５を試料に接触させる。既知の固定化されたＨｓＫｉｆ１５に結合した抗ＨｓＫｉｆ１５抗体の量は、試料に含まれるＨｓＫｉｆ１５の量に反比例する。また固定化抗体量は、固定化された抗体フラクションか、溶液中に残存する抗体のフラクションのいずれかを検出することで決定することができる。検出は、抗体が標識されている場合に直接的なものとなり、上述の抗体に特異的に結合する標識部分の後の添加によって間接的なものとなる。
【０１２０】
交差反応性の判定
競合的な結合フォーマットにおける免疫アッセイは、交差反応性の判定にも用いることができる。例えば、少なくとも配列番号：２により部分的にコードされたタンパク質を固相支持体に固定することができる。タンパク質（例えば線虫のｕｎｃ−１０４または哺乳類のＫｉｆ１）を、固定化抗原に対する抗血清との結合と競合するアッセイ系に添加する。添加されたタンパク質のもつ、固定化タンパク質に対する抗血清の結合と競合する能力を、配列番号：２にコードされたＨｓＫｉｆ１５がもつ、その自身と競合する能力と比較する。上記のタンパク質に関する交差反応性のパーセンテージは標準的な計算法で算出することができる。上述の添加された個々のタンパク質との交差反応性が１０％未満の抗血清を選択してプールする。交差反応する抗体は、プールされた抗血清から、添加された対象タンパク質（例えば遠縁の相同体）と免疫吸着させることで選択的に除去する。
【０１２１】
免疫吸着されてプールされた抗血清を次に、上述の通りに競合的な結合免疫アッセイに用いて、本発明のタンパク質と考えられる第２のタンパク質と、免疫原タンパク質（配列番号：２のＨｓＫｉｆ１５）との比較を行う。この比較を行うためには、二つのタンパク質をそれぞれ広い濃度範囲で検討し、固定されたタンパク質に対する抗血清との結合を５０％阻害するのに必要な各タンパク質量を決定する。５０％阻害に必要な第２のタンパク質の量が、結合を５０％抑制するのに必要な配列番号：２にコードされたタンパク質量の１０分の１に満たない場合は、第２のタンパク質は、ＨｓＫｉｆ１５免疫原に対するポリクローナル抗体に特異的に結合するといえる。
【０１２２】
他のアッセイ法のフォーマット
ウェスタンブロット（イムノブロット）分析で、試料に含まれるＨｓＫｉｆ１５の存在を検出および定量する。この手法は一般的に、試料タンパク質をゲル電気泳動で分子量を元に分離する段階、分離したタンパク質を（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化されたナイロンフィルターなどの）適切な固相支持体に移す段階、およびＨｓＫｉｆ１５に特異的に結合する抗体と試料をともにインキュベートする段階を含む。抗ＨｓＫｉｆ１５抗体は、固相支持体上のＨｓＫｉｆ１５に特異的に結合する。このような抗体は直接標識されたり、または抗ＨｓＫｉｆ１５抗体に特異的に結合する標識抗体（例えば標識されたヒツジ抗マウス抗体）を用いて後に検出される場合がある。
【０１２３】
他のアッセイ法のフォーマットには、特定の分子（例えば抗体）に結合して内部の試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを用いるリポソーム免疫アッセイ法（ＬＩＡ）などがある。放出された化学物質は、後に標準的な手法で検出される（Ｍｏｎｒｏｅら、Ａｍｅｒ． ｄｉｎ． Ｐｒｏｄ． Ｒｅｖ． ５：３４〜４１ （１９８６）を参照）。
【０１２４】
非特異的な結合の低下
免疫アッセイにおける非特異的な結合を極めて小さくすることが望ましい場合があることを当業者であれば理解すると思われる。特にアッセイ法に、固体基質上に固定化された抗原または抗体がかかわる場合は、基質に対する非特異的な結合の量を極めて少なくすることが望ましい。非特異的な結合を低下させる手段は当技術分野で周知である。典型的には、このような手法には、基質をタンパク質性組成物でコーティングする段階が含まれる。特にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳、およびゼラチンなどのタンパク質組成物は広く用いられており、なかでも粉末乳が最も好ましい。
【０１２５】
標識
アッセイ法に用いられる特定の標識、または検出用官能基は、アッセイ法で使用される抗体との特定の結合に大きく干渉しない限り、本発明の重要な局面ではない。検出用官能基は、検出用の物理的特性または化学的特性を有する任意の材料とすることができる。検出用標識は免疫アッセイの分野で開発が進んでおり、一般に、このような方法に有用な大部分の任意の標識を本発明に適用することができる。したがって標識は、分光光度的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段で検出される任意の組成物である。本発明の有用な標識には、磁気ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアナート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般的に用いられる他の酵素）、ならびに金コロイドもしくは色ガラスなどの比色性標識、またはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）がある。
【０１２６】
標識は、当技術分野で周知の方法で、アッセイ系の所望の成分に直接または間接的に結合させることができる。上述の通り、さまざまな標識を使用することが可能であり、標識の選択は要求される感度、化合物との結合の容易さ、安定性に関する要件、使用可能な器具、および廃棄規定に依存する。
【０１２７】
非放射性標識は間接的な手段で結合させることが多い。一般的に、リガンド分子（例えばビオチン）は共有結合で分子に結合される。次にリガンドは別の分子（例えばストレプトアビジン）に結合し、本質的に検出されるか、または検出用酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物などのシグナル系に共有結合させることができる。リガンドとその標的は、ＨｓＫｉｆ１５を認識する抗体、または抗ＨｓＫｉｆ１５を認識する二次抗体の任意の適切な組み合わせで使用することができる。
【０１２８】
このような分子は、シグナル発生化合物に、例えば酵素やフルオロフォアと結合させることで直接結合させることもできる。標識となる対象酵素の主なものは、加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼ、または酸化酵素、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物には、フルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどがある。化学発光化合物には、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールがある。使用可能なさまざまな標識またはシグナルの発生系に関する総説は、米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
【０１２９】
標識を検出する手段は当技術分野で周知である。したがって例えば、標識が放射性標識の場合、検出手段には、シンチレーションカウンターやオートラジオグラフィにおける写真フィルムなどが含まれる。標識が蛍光標識の場合、蛍光色素を適切な波長の光で励起させて結果として生じる蛍光を検出して標識を検出することができる。蛍光は、写真フィルムを用いる手段によって、電荷結合素子（ＣＣＤ）などの電子検出器または光電子増倍管などを使用することで視覚的に検出することができる。同様に酵素標識は、酵素に対する適切な基質を提供して結果として生じる反応物を検出することで検出することができる。最後に単純な比色標識は、標識に関連する色を単に観察することで検出することができる。したがって、さまざまなディップスティックアッセイ法では、結合状態の金が桃色になることがあるが、結合状態のさまざまなビーズがビーズの色を示すことがある。
【０１３０】
一部のアッセイ法のフォーマットでは標識化合物の使用は必要とされない。例えば凝集アッセイ法では、標的抗体の有無を判定することができる。この場合、抗原でコーティングされた粒子は、標的抗体を含む試料と凝集する。このフォーマットでは、どの成分も標識される必要はなく、標的抗体の有無は目視で単純に判定される。
【０１３１】
ＶＩ．ＨｓＫｉｆ１５の調節因子のアッセイ法
生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５の活性は、さまざまなインビトロアッセイ法およびインビボアッセイ法、例えば微小管滑走アッセイ法、微小管結合アッセイ法などの結合アッセイ法、微小管解重合アッセイ法、およびＡＴＰアーゼアッセイ法で評価することができる（Ｋｏｄａｍａら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９９：１４６５〜１４７２ （１９８６）；Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５２０９〜５２１３ （１９９３）；Ｌｏｍｂｉｌｌｏ ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２８：１０７〜１１５ （１９９５）；Ｖａｌｅら、Ｃｅｌｌ ４２：３９〜５０ （１９８５））。高スループットスクリーニングの好ましいアッセイ法は、例えばエンドポイント検出用のマラカイトグリーン、または連続的な速度モニタリング用の結合型ＰＫ／ＬＤＨなどの比色を検出するＡＴＰアーゼアッセイである。このアッセイ法では、ＨｓＫｉｆ１５活性の上昇または低下のいずれかを検出することができる。活性を上昇させる化合物は作用物質と呼び、活性を低下させる化合物は拮抗物質と呼ぶことができる。
【０１３２】
このようなアッセイ法では、内因性供給源、または組換え体供給源から単離されたＨｓＫｉｆ１５の活性を調べることができる。また、このようなアッセイ法でＨｓＫｉｆ１５の調節分子を検討することができる。
【０１３３】
運動性に関するアッセイ法を実施する方法は当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｌｌら、１９９６、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．、７１：３４６７〜３４７６、Ｔｕｒｎｅｒら、１９９６、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４２ （１）：２０〜５；Ｇｉｔｔｅｓら、１９９６、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７０（１）：４１８〜２９；Ｓｈｉｒａｋａｗａら、１９９５、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． １９８：１８０９〜１５；Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎら、１９９５、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ６８：２４４４〜５３；Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎら、１９９５、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ６８：７２Ｓなどを参照）。
【０１３４】
ＡＴＰアーゼ活性を決定する際には、当技術分野で周知のさまざまな方法を用いることができる。例えば、キネシンからのＰｉの放出を定量することができる。一つの好ましい態様では、ＡＴＰアーゼ活性のアッセイ法では０．３ Ｍ ＰＣＡ （過塩素酸）およびマラカイトグリーン試薬 （８．２７ ｍＭ モリブデン酸ナトリウムＩＩ、０．３３ ｍＭ シュウ酸マラカイトグリーン、および０．８ ｍＭ トライトン Ｘ−１００） を使用する。このアッセイ法を行う際には、１０ Ｌの反応を９０ Ｌの冷０．３ Ｍ ＰＣＡ中で急冷する。リン酸の標準を用いることで、データをｍＭ単位の放出無機リン酸に換算することができる。すべての反応物および標準がＰＣＡ中で急冷されたら、１００ Ｌのマラカイトグリーン試薬を、例えばマイクロタイタープレートの該当ウェルに添加する。この混合物を１０〜１５分間反応させ、プレートを６５０ ｎｍの吸光度で読み取る。リン酸標準を使用した場合は、吸光度の読み値を、ｍＭ Ｐｉに換算して経時的にプロットする。また、当技術分野で周知のＡＴＰアーゼアッセイ法にはルシフェラーゼアッセイ法も含まれる。
【０１３５】
例示的なアッセイ法は、以下の二つの特定の溶液を用いて実施することができる。溶液Ａの組成は、１ ｍＭ ＡＴＰ、２ ｍＭ ホスホエノールピルビン酸（溶媒はワーキング緩衝液；２５ ｍＭ Ｐｉｐｅｓ ｐＨ ６．８、２ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ ｍＭ ＥＧＴＡ、１ ｍＭ ＤＴＴ、５ Ｍタキソール、２５ ｐｐｍ 泡止め剤、ｐＨ ６．８）であり、溶液Ｂの組成は０．６ ｍＭ ＮＡＤＨ、０．２ ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１：１００ ＰＫ／ＬＤＨ希釈混合液（Ｓｉｇｍａ）、２００ μｇ／ｍｌ 微小管、１００ ｎＭ ＨｓＫｉｐ１５（〜２．５ ｇ／ｍｌ）である。
【０１３６】
実験を開始するにあたり、被験化合物の１ ｌのＤＭＳＯストックを９６ウェルのハーフエリアプレートの最下列の各ウェルに添加する。対照のウェルにはＤＭＳＯのみを添加する。次に５０ ｌの溶液Ａを各ウェルに添加する。溶液を繰り返しピペッティングして混合した後に、５０ ｌの溶液の一連の希釈液を列の間に繰り返し移す。反応は、５０ ｌの溶液Ｂを添加して開始する。次にプレートをリーダーに挿入し、３４０ ｎＭにおける吸光度を５分間モニタリングする。ハーフエリアプレートで５０ ｌの溶液Ａ＋５０ ｌの溶液Ｂについて認められた速度は約１００ ｍＯＤ／分となるはずである。選択的に一連の希釈液を調製して吸光度を同様に測定する。同様の手順を用いて、被験化合物がＨｓＫｉｆ１５の基礎（すなわち微小管に依存しない）ＡＴＰアーゼ活性に及ぼす阻害作用を調べることができる。以上のアッセイ法では、微小管は溶液Ｂに含めず、ＨｓＫｉｆ１５濃度は少なくとも２ ｍＭまで上昇させる。
【０１３７】
一部の方法では分子モーター活性を、全体が参照として本明細書に組み入れられる「タンパク質修飾物質検出のためにＡＤＰまたはホスフェートを用いた組成物またはアッセイ法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓａｙ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ＡＤＰ ｏｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）」と題して１９９９年５月１８日に申請された米国特許出願第０９／３１４，４６４号に開示された手順で測定する。より具体的には、このアッセイ法では、微小管との相互作用からＡＴＰの加水分解までの範囲におけるキネシンモーター機能の任意の局面の調節因子を検出する。ＡＤＰまたはリン酸をタンパク質活性の読み出された情報として使用する。
【０１３８】
他の方法には、ＨｓＫｉｆ１５タンパク質と候補薬剤を組み合わせる段階、および候補薬剤とＨｓＫｉｆ１５タンパク質との結合を判定する段階が含まれる。一般に複数のアッセイ混合物を、異なる薬剤濃度で平行して実行することで、さまざまな濃度に対する異なる反応が得られる。典型的には、濃度の一つが負の対照、すなわちゼロ濃度または検出レベル以下となる。
【０１３９】
一部の方法では、ＨｓＫｉｆ１５タンパク質に結合可能な候補薬剤を最初に検出するようにスクリーンを設計し、このような薬剤、およびＨｓＫｉｆ１５を調節することが既知である薬剤を、候補薬剤がＨｓＫｉｆ１５活性を調節する能力を評価するアッセイ法に用いる。
【０１４０】
候補薬剤は数多くの化学的クラスを含むが、典型的には有機分子であり、好ましくは１００ダルトン以上で約２，５００ダルトン未満の分子量を有する低分子量の有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、具体的には水素結合に必要な機能性官能基を含み、典型的には少なくとも一つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも二つの機能性官能基を含む。候補薬剤は、上記の機能性官能基の一つまたは複数が置換された環状炭素構造または複素環構造、および／または芳香族または多芳香族の構造を含むことがある。候補薬剤はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体、構造類似物、または組み合わせを含む生体分子中にも見出される。特に好ましいのはペプチドである。
【０１４１】
コンビナトリアルライブラリーを、段階的に合成可能な多くの種類の化合物について作製することができる。このような化合物には、ポリペプチド、タンパク質、核酸、βターン模倣体、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーのＮ−置換グリシン、およびオリゴカルバミン酸などが含まれる。化合物の大規模コンビナトリアルライブラリーは、いずれも参照として全体が本明細書に組み入れられる、アフィマックス（Ａｆｆｙｍａｘ）による国際公開公報第９５／１２６０８号、アフィマックスによる国際公開公報第９３／０６１２１号、コロンビア大学による国際公開公報第９４／０８０５１号、薬局方、国際公開公報第９５／３５５０３、およびスクリプス（Ｓｃｒｉｐｐｓ）による国際公開公報第９５／３０６４２号に記載されているコード合成ライブラリー（ＥＳＬ）法で構築することができる。ペプチドライブラリーもファージディスプレイ法で作製することができる。これについては例えば、デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ）による国際公開公報第９１／１８９８０号を参照されたい。スクリーニングの対象となる化合物は、例えば米国立癌研究所（ＮＣＩ）の自然物貯蔵所（Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、ＮＣＩ公開合成化合物コレクション（ＮＣＩ Ｏｐｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、ＮＣＩの発生薬物療法学プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）などを含む政府または民間の提供先からも得られる。
【０１４２】
候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含むさまざまな供給源から得られる。好ましい態様では、候補薬剤は有機化合物の一部分であり、文献に記載されたさまざまな分子を使用できる。
【０１４３】
提供されるアッセイ法では、本明細書に記載されているようにＨｓＫｉｆ１５タンパク質が用いられる。一つの態様では、ＨｓＫｉｆ１５タンパク質の一部が使用され、好ましい態様では、本明細書に記載されているＨｓＫｉｆ１５活性を有する部分が用いられる。また本明細書に記載されたアッセイ法は、単離されたＨｓＫｉｆ１５タンパク質、またはＨｓＫｉｆ１５タンパク質を含む細胞もしくは動物モデルのいずれかを用いる場合がある。
【０１４４】
他のさまざまな試薬をスクリーニングアッセイ法に含めることができる。これらには、最適なタンパク質間結合の促進、および／または非特異的な相互作用もしくはバックグラウンド相互作用の抑制に使用可能な塩類、中性タンパク質（例えばアルブミン）、または界面活性剤などの試薬が含まれる。それ以外ではアッセイ法の効率を高める試薬（プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤など）が使用される場合もある。化合物の混合物は、必要とされる結合がもたらされるように任意の順序で添加することができる。
【０１４５】
ＶＩＩ．診断アッセイ法およびキット
上述した通り、ＨｓＫｉｆ１５およびその相同体はインビトロにおける有用な診断ツールでもある。このアッセイ法では、ＨｓＫｉｆ１５の核酸に特異的にハイブリッドを形成する、ＨｓＫｉｆ１５に特異的な試薬（ＨｓＫｉｆ１５のプローブおよびプライマーなど）、およびＨｓＫｉｆ１５タンパク質に特異的に結合する、ＨｓＫｉｆ１５に特異的な試薬（例えばＨｓＫｉｆ１５抗体）を使用する。
【０１４６】
試料に含まれるＨｓＫｉｆ１５のＤＮＡおよびＲＮＡの有無を調べる核酸アッセイ法は、有用な診断アッセイ法である。サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクション、Ｓ１分析、ＰＣＲおよびＬＣＲなどの増幅法、ならびにインサイチューハイブリダイゼーションを含む数多くの手法が当技術分野で周知である。インサイチューハイブリダイゼーションでは、例えば標的核酸を細胞環境から解放して、後の解釈および分析のために細胞形態を保ちつつ、細胞内でハイブリダイゼーションに使用できるようにする。以下の記事でインサイチューハイブリダイゼーションについて概説されている：シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２３０〜２５０ （１９８６）；ハーセ（Ｈａａｓｅ）ら、「ウイルス学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」、ｖｏｌ． ＶＩＩ、１８９〜２２６ （１９８４）；および「核酸ハイブリダイゼーション：実際のアプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（Ｈａｍｅｓら編、１９８７）。またＨｓＫｉｆ１５タンパク質を上述のさまざまな免疫アッセイ法で検出することができる。被験試料は典型的には、正の対照（例えば組換えＨｓＫｉｆ１５を発現する試料）と負の対照（例えば酵母に由来する負の試料）の両方と比較する。
【０１４７】
本発明は、Ｈｓｋｉｆ１５の調節因子のスクリーニングに用いるキットも提供する。このようなキットは、容易に入手できる材料および試薬から調製することができる。例えば、このようなキットは、任意の一つまたは複数の以下の材料を含む場合がある：生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５、反応チューブ、およびＨｓＫｉｆ１５活性の検討法を記載した説明書。好ましくはキットは、生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５を含む。さまざまなキットおよび成分は、意図されたキット使用者、および使用者の特定のニーズに応じて本発明で調製することができる。例えばキットは、ＡＴＰアーゼアッセイ法、微小管滑走アッセイ法、または微小管結合アッセイ法に仕様を合わせることができる。
【０１４８】
本発明のキネシン、および特にそのモータードメインを、スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）による米国特許第５，８３０，６５９号に記載された手順で水溶液中の異種混合物からの特定のリガンドの分離に使用することができる。スチュワートによって記載された系では、キネシンモータードメインが、ストレプトアビジンなどのリガンド結合部分に連結されている。キメラのキネシンモータードメインを、固定化されて並べられた微小管をもつチャンネルによって受入チャンバーに連結した、異種混合物を含むローディングチャンバー内に配置させる。ＡＴＰをローディングチャンバーに添加すると、所望のリガンドにリガンド結合部分を介して非共有結合で結合した状態にあるキネシンモータードメインがローディングチャンバーから受入チャンバーへ移動する。したがって、キネシンモータードメインのＡＴＰ駆動性の運動活性によって、所望のリガンドと異種混合物が分離される。スチュワートはさらに、すべてのキネシンモータードメインがこの分離系における使用に適していると述べている。
【０１４９】
本明細書に記載された例および態様は、すべて説明目的であって、それに関してさまざまな変形形態または変更が当業者に示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれることは言うまでもない。本明細書で引用された全ての出版物、特許、および特許出願は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨｓＫｉｆ１５をコードする核酸配列の一つの態様を示す（開始コドンおよび終止コドンを下線および太字で示す）。
【図２】ＨｓＫｉｆ１５の推定アミノ酸配列を示す。
【図３】ＨｓＫｉｆ１５のモータードメイン断片ＨｓＫｉｆ１５Ｍ１Ａ３６７をコードする核酸配列の一つの態様を示す（開始コドンおよび終止コドンを下線および太字で示し、非天然残基を太い字体で示す）。このコンストラクトの産物は、細菌培養物１ Ｌあたり２０ ｍｇを上回るレベルで発現され、精製して微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性のアッセイ時に活性が認められた。
【図４】ＨｓＫｉｆ１５のモータードメイン断片ＨｓＫｉｆ１５Ｍ１Ａ３６７の推定アミノ酸配列を示す。精製を容易に行うために付加された残基は太い字体で示す。
【図５】ＨｓＫｉｆ１５のモータードメイン断片ＨｓＫｉｆ１５Ｍ１Ｐ４０１をコードする核酸配列の一つの態様を示す（開始コドンおよび終止コドンを下線および太字で示し、非天然残基を太い字体で示す）。このコンストラクトの産物は、細菌培養物１ Ｌあたり２０ ｍｇを上回るレベルで発現され、精製して微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性のアッセイ時に活性が認められた。
【図６】ＨｓＫｉｆ１５のモータードメイン断片ＨｓＫｉｆ１５Ｍ１Ｐ４０１の推定アミノ酸配列を示す。
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のために全体が参照として本明細書に組み入れられる、２０００年５月１７日に出願された、米国特許出願第０９／５７２，１９１号の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＨｓＫｉｆ１５の単離された核酸配列およびアミノ酸配列、ＨｓＫｉｆ１５を検出する方法、および生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５を用いるＨｓＫｉｆ１５調節因子のスクリーニング法、ならびにＨｓＫｉｆ１５調節因子のスクリーニングに用いるキットを提供する。
【０００３】
発明の背景
キネシンは、一次アミノ酸配列、ドメイン構造、運動速度、および細胞機能を元に少なくとも８つのサブファミリーに分類可能な５０を越えるタンパク質の遍在性の保存されたファミリーである。キネシンスーパーファミリーは、関連性のある微小管モータータンパク質の大規模なファミリーである。このファミリーは、小胞およびオルガネラの順行性の軸索輸送に役割を果たしていると考えられる、ヤリイカの軸索原形質から最初に単離された「真の」キネシンで例示される（例えば、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２７：３１９〜３５１ （１９９３）を参照）。キネシンはＡＴＰを用いて力を発生し、微小管と結合して一方向に動く（微小管のマイナス端からプラス端に向かうことからキネシンは「プラス端指向性」モーターである）。キネシンスーパーファミリーの分子は、大きさが約３４０アミノ酸からなり、約３５〜４５％（またはそれ以上）の同一性を「真の」キネシンモータードメインと共有するキネシン様モーターをもつ分子と定義される。モーターは通常、さまざまなキネシンスーパーファミリーの分子に異なる結合活性をもたらす、さまざまなテールドメインに結合している。
【０００４】
マウスのＫｉｆ１５ （ゲンバンクアクセッション番号ＡＢ００１４３２）は当初、ＰＣＲをベースとした新規マウスキネシンについての検索で同定された（Ｎａｋａｇａｗａら、１９９７． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：９６５４〜９）。ＭｍＫｉｆ１５モータードメインの断片をコードするＭｍＫｉｆ１５ ｃＤＮＡの一部はクローニングされており、配列が決定されている。また４週齢マウスの複数の組織におけるＭｍＫｉｆ１５のｍＲＮＡの発現が調べられている。
【０００５】
ＸＫｌｐ２は、紡錘体集合に重要な役割を果たすことが明らかにされているアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）のキネシンである。ＸＫｌｐ２は当初バーノス（Ｖｅｒｎｏｓ）らにより、新規のツメガエルキネシンをコードするｃＤＮＡ断片をクローニングするためのＰＣＲをベースとした方法で同定された（Ｖｅｒｎｏｓら、１９９３． Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １５７：２３２〜９）。ＸＫｌｐ２完全長の配列はボレティ（Ｂｏｌｅｔｉ）らにより報告されている（Ｂｏｌｅｔｉら、１９９６． Ｃｅｌｌ ８４：４９〜５９）（ゲンバンクアクセッション番号Ｂ４８８３５、ＡＡＢ２６４８６、１５８７１８１、およびＣＡＡ６３８２６）。以上の著者らはまた、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合させたＸＫｌｐ２のモータードメインを含む組換え融合タンパク質が、微小管に依存して運動可能であり、微小管のプラス端方向に移動することも報告している。ボレティらは、ＸＫｌｐ２が紡錘体の極および動原体に結合していること、またＣ末端のテールドメインを延長するＸＫｌｐ２の組換え断片の付加が、インビトロの紡錘体集合反応における二極性の紡錘体集合の用量依存的な抑制を生じることを明らかにしている。ＸＫｌｐ２のＣ末端のテールドメインに対する抗体は、紡錘体集合を同様に損なう。
【０００６】
ウィットマン（Ｗｉｔｔｍａｎ）らは、ＸＫｌｐ２ のＣ末端のテールドメインが、間期細胞抽出物ではなく有糸分裂細胞抽出物中に集合した星状体の局在化に必要かつ十分であることを示している（Ｗｉｔｔｍａｎｎら、１９９８． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４３：６７３〜８５）。このような局在化には、テールドメインの二量体化が必要とされた。また、細胞質に存在するダイニンおよびダイナクチン（ｄｙｎａｃｔｉｎ）の機能が、有糸分裂細胞抽出物中で集合状態の星状体へのＸＫｌｐ２の局在化に重要な役割を果たすことが判明している。ウィットマンらはまた、組換えＸＫｌｐ２のテールドメインと純粋微小管の結合を大きく促進するタンパク質ＴＰＸ２を同定した。ＴＰＸ２は、微小管との相互作用に関与するＸＫｌｐ２のテールドメインの受容体であることが示唆されている。
【０００７】
ウォルザック（Ｗａｌｃｚａｋ）らは、有糸分裂細胞抽出物とＤＮＡでコーティングした磁気ビーズを用いて、ＸＫｌｐ２が二極性の有糸分裂紡錘体の形成に果たす役割を検討している（Ｗａｌｃｚａｋら、１９９８． Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ８：９０３〜１３）。ボレティらによる観察とは対照的にウォルザックらは、ＸＫｌｐ２のＣ末端のテールドメインに対する抗体添加時に有糸分裂紡錘体機能の大きな変動を確認していない。
【０００８】
新しいキネシンモータータンパク質、およびそれをコードするポリヌクレオチドが発見されれば、癌、神経疾患、および小胞輸送障害の診断、予防、および治療に有用な新しい組成物が提供されることになり、当技術分野におけるニーズが満たされる。
【０００９】
発明の概要
本発明は、新しいヒトキネシンモータータンパク質ＨｓＫｉｆ１５、ＨｓＫｉｆ１５をコードするポリヌクレオチド、およびこのような組成物による癌、神経疾患、および小胞輸送障害の診断、治療、または予防における用途の発見に基づく。
【００１０】
一つの局面では、本発明は、キネシンスーパーファミリーの、以下の特性を有するモータータンパク質をコードする、単離された核酸配列を提供する：（ｉ）タンパク質の活性が微小管によって活性化されＡＴＰアーゼ活性を含む；および（ｉｉ）配列比較アルゴリズムで測定時に、タンパク質が配列番号：２に対するアミノ酸配列同一性が７０％より大きい配列を有する。一つの態様では、タンパク質はさらに、配列番号：２に対するポリクローナル抗体に特異的に結合する。
【００１１】
一つの態様では、核酸はＨｓＫｉｆ１５またはその断片をコードする。別の態様では、核酸は配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６をコードする。別の態様では、核酸は配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５のヌクレオチド配列を有する。
【００１２】
一つの局面では、核酸は以下の一つまたは複数の特性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含む：
配列番号：２に対する配列同一性が７０％を上回る、好ましくは８０％を上回る、より好ましくは９０％を上回る、より好ましくは９５％を上回る、または別の態様では、配列番号：２に対して９８〜１００％の配列同一性を有する。
【００１３】
一つの態様では、核酸は、以下の一つまたは複数の特性を有する配列を含む：配列番号：１に対する配列同一性が５５％または６０％を上回る、好ましくは７０％を上回る、より好ましくは８０％を上回る、より好ましくは８５％、９０％、９５％を上回る、または別の態様では、配列番号：１に対して９８〜１００％の配列同一性を有する。本明細書で提供される別の態様では、核酸は、配列番号：１の配列または相補的配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する。
【００１４】
別の局面では、本発明は、キネシンスーパーファミリーの、以下の特性を有するモータータンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する：（ｉ）タンパク質の活性が微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性を含む；および（ｉｉ）タンパク質が、配列比較アルゴリズムで測定時に配列番号：２に対するアミノ酸配列同一性が７０％より大きい配列を有する。本発明はさらに、このベクターをトランスフェクトさせた宿主細胞を提供する。
【００１５】
別の局面では、本発明は、単離されたキネシンスーパーファミリーの、上述の一つまたは複数の特性を有するモータータンパク質を提供する。一つの態様では、タンパク質は、ＨｓＫｉｆ１５のモータードメイン、テールドメイン、または他の断片に対して作製されたポリクローナル抗体に特異的に結合する。別の態様では、タンパク質は配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
一つの局面では、本明細書で提供されるタンパク質は、以下の一つまたは複数の特性を有するアミノ酸配列を含む：
配列番号：２に対する配列同一性が７０％を上回る、好ましくは８０％を上回る、より好ましくは８５％または９０％を上回る、より好ましくは９５％を上回る、または別の態様では、配列番号：２に対して９８％〜１００％の配列同一性を有する。
【００１７】
本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列、またはその断片、またより具体的には、配列番号：２のアミノ酸配列のモータードメインを含む実質的に精製されたポリペプチドを特徴とする。
【００１８】
別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、ＨｓＫｉｆ１５の調節因子をスクリーニングする方法を提供する：（ｉ）上記特性の少なくとも一つを有する生物学的に活性のあるモータータンパク質を試験濃度および対照濃度において少なくとも１種の候補薬剤と接触させる段階、ならびにモータータンパク質の活性の変化が、試験濃度と対照濃度の間で生じるか否かを検出する段階であって、変化がモータータンパク質の調節因子の存在を示す段階。一つの態様では、このような活性は、微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性、および微小管結合活性からなる群より選択される。一つの態様では、この方法はさらに、生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５を細胞試料から単離する段階を含む。別の態様では、生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５は組換え体である。
【００１９】
別の局面では、本発明は、以下を含む、ＨｓＫｉｆ１５の調節因子のスクリーニングに用いるキットを提供する：（ｉ）生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５を収める容器；および（ｉｉ）微小管結合活性または微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性であるＨｓＫｉｆ１５活性のアッセイ法を実施する際の説明書。
【００２０】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で用いる「農業用化合物」は、農業分野に有用で、食用作物もしくは繊維性作物の防護の強化または収量改善に機能する化学的化合物および生物学的化合物を意味する。例えば、１つのこのような化合物は、雑草を選択的にコントロールする除草剤として、植物の病気の拡散をコントロールする殺菌剤として、昆虫およびダニ類を寄せ付けず、また駆除する除虫剤として作用する可能性がある。また、１つのこのような化合物は、植物の調節因子または活性化因子として、発芽中の種子、芽生え、または若い植物の生育環境を改善するための種子の処理に有用性を示す場合がある。
【００２１】
「増幅」用プライマーは、選ばれた核酸配列の増幅の基礎として作用しうる天然ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のいずれかを含むオリゴヌクレオチドである。これには例えば、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマー、およびリガーゼ連鎖反応に用いるオリゴヌクレオチドなどが含まれる。
【００２２】
「抗体」は、分析物（抗原）と特異的に結合して認識する免疫グロブリン遺伝子（群）またはその断片に実質的にコードされたポリペプチドを意味する。これまで認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、δ、ε、およびμの定常領域遺伝子群、ならびに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子群がある。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥをそれぞれ決めるγ、μ、α、δ、またはεに分類される。抗体という用語には、抗体全体の修飾、または組換えＤＮＡ法によるデノボ合成によって作製される抗体断片も含まれる。
【００２３】
「抗ＨｓＫｉｆ１５」抗体は、ＨｓＫｉｆ１５遺伝子、ｃＤＮＡ、またはそのサブ配列にコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片である。
【００２４】
「生物学的に活性のある」ＨｓＫｉｆ１５とは、例えばＡＴＰアーゼアッセイ法、微小管滑走アッセイ法、または微小管結合アッセイ法で検討される、微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性を有するＨｓＫｉｆ１５を意味する。「ＡＴＰアーゼ活性」は、ＡＴＰを加水分解する能力を意味する。
【００２５】
本明細書で用いる「生物試料」は、ＨｓＫｉｆ１５もしくはその断片、またはＨｓＫｉｆ１５タンパク質をコードする核酸を含む生体組織または体液の試料である。生物試料はまた、組織学的実験に用いるために採取された凍結切片などの組織切片も含む場合がある。生物試料は少なくとも１個の細胞を含み、好ましくは植物体または脊椎動物である。態様には、真核生物、好ましくは真菌、植物、昆虫、原虫、鳥類、魚類、爬虫類などの真核生物、また好ましくはラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、またはウサギなどの哺乳類、また最も好ましくはチンパンジーまたはヒトなどの霊長類から得られる細胞が含まれる。
【００２６】
「比較ウィンドウ」は、ある配列と同じ数の隣接した位置の参照配列を最適にアライメントして両配列を比較する、２５〜６００個、通常は約５０〜約２００個、より一般的には約１００〜約１５０個からなる群より選択される隣接した位置の数のいずれかの一つのセグメントを参照することを含む。比較目的の配列のアライメントの方法は当技術分野で周知である。比較のための最適なアライメントは例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１）に記載された局所相同性アルゴリズム、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８）の類似性検索法、以上のアルゴリズムのコンピュータを用いた実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、またはマニュアルによるアライメントおよび目視判定（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌらの前記論文を参照）で実施することができる。
【００２７】
有用なアルゴリズムの一例がＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ対アライメントを用いて一群の関連配列から複数の配列アライメントを作成する。アライメント作成に用いられるクラスター形成の関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、フェン（Ｆｅｎｇ）およびドリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３５：３５１〜３６０ （１９８７）のプログレッシブアライメント法を単純化している。使用される方法は、ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３ （１９８９）に記載された方法に似ている。このプログラムでは最長５，０００の最大３００個の配列をアライメントすることができる。多重アライメントの手順は、二つの最も類似した配列の対アライメントから始め、二つのアライメントされた配列のクラスターを形成する。次にこのクラスターを、次に最も関連性の大きい配列、またはアライメントされた配列のクラスターとアライメントする。配列の二つのクラスターは、二つの各配列の対アライメントを単純に拡大することでアライメントすることができる。最終的なアライメントは、一連のプログレッシブ対アライメントで達成される。このようなプログラムを用いて、クラスター形成関係の樹状図やツリー表示にプロットすることができる。
【００２８】
配列同一性のパーセンテージの決定（実質的な類似か、または同一かの判定）に適したアルゴリズムの別の例が、アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３〜４１０ （１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するソフトウェアは、生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を通して入手することができる。このアルゴリズムでは、データベース配列の同じ長さのワードとアライメントさせたときにマッチするか、またはある程度の正の値をとる閾値スコアＴをある程度満たす、問合わせ配列中の短いワードの長さＷの同定による高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）の同定段階が最初に行われる。Ｔは近傍のワードスコアの閾値を意味する（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前記）。初期の近傍ワードのヒットは、それを含む、より長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシード（ｓｅｅｄ）となる。ワードのヒットを次に、累積アライメントスコアが増加する限り、各配列に沿って両方向に拡張してゆく。累積スコアは、ヌクレオチド配列、パラメータＭ （マッチング残基のペアのリワード（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に＞０）およびＮ （ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列の場合は、スコア行列を用いて累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの拡張は以下の時点で終了する：累積アライメントスコアが最大達成値から量Ｘに低下した場合；一つまたは複数の負のスコアリング残基アライメントが蓄積したために累積スコアがゼロまたはそれ以下となったとき；またはいずれかの配列の末端に達したとき。核酸またはポリペプチドが本発明の範囲にあるか否かを判定する場合は、ＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトパラメータが適している。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、デフォルトのワード長（Ｗ）として１１、期待値（Ｅ）として１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４を用い、双方の鎖の比較を行う。アミノ酸配列の場合は、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトのワード長（Ｗ）として３、期待値（Ｅ）として１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を用いる。ＢＬＡＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対するタンパク質配列を用いる）では、デフォルトのワード長（Ｗ）として３、期待値（Ｅ）として１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を用いる（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５ （１９８９）を参照）。
【００２９】
配列同一性パーセンテージの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、二つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３〜５７８７ （１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムで提供される類似性の一つの尺度は、二つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間でマッチングが偶然生じる確率の指標となる最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば核酸は、被験核酸と標準核酸との比較時の最小和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、また最も好ましくは約０．００１未満の場合に、参照配列と類似しているとみなされる。
【００３０】
「保存的に修飾された異型」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された異型は、同一または本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸を意味するか、または核酸が本質的に同一な配列に対するアミノ酸配列をコードしていない核酸を意味する。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の複数のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはいずれもアミノ酸アラニンをコードする。したがってアラニンがコドンで特定されるどの位置においても、このコドンはコードされたポリペプチドを変化させることなく任意の対応コドンに変更することができる。このような核酸の変異は、保存的に修飾された変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書に記載されたどの核酸配列も、可能なあらゆる核酸のサイレント変異を含む。核酸の各コドン（通常メチオニンのみを示すコドンＡＵＧを除く）が修飾されても機能的に同一な分子を生じることがあることを当業者であれば理解すると思われる。したがって、あるポリペプチドをコードする核酸の個々のサイレント変異は、個々に記載された配列上明らかにならない。
【００３１】
アミノ酸配列に関しては、コード配列中の１個のアミノ酸または少ないパーセンテージのアミノ酸を変化、付加、または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、そのような変化によって、あるアミノ酸と、化学的に類似したアミノ酸との置換を生じる「保存的に修飾された異型」であることを当業者であれば理解すると思われる。機能的に似たアミノ酸についてまとめられた保存的置換の表は当技術分野で周知である。
【００３２】
以下の６つのグループはそれぞれ、相互に保存的置換の関係にあるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （１９８４）を参照）。
【００３３】
「細胞骨格成分」とは、細胞骨格の構造的完全性の維持または調節に重要な役割を果たしたり、または細胞骨格が関与する運動を仲介したり調節したりする、細胞骨格と関連して見出される任意の分子を意味する。これには細胞骨格重合体（例えば、アクチンフィラメント、微小管、ミオシン断片、フィラメント）、分子モーター、および細胞骨格関連調節タンパク質（例えば、トロポミオシン、α−アクチニン）が含まれる。
【００３４】
細胞骨格の「細胞骨格機能」は、構造（例えば、微絨毛、紡錘体）をもたらす、また、細胞内における運動（例えば、筋収縮、有糸分裂時の収縮環、偽足性移動（ｐｓｅｕｄｏｐｏｄａｌ ｍｏｖｅｍｅｎｔ）、活発細胞の表面変形、小胞形成、およびトランスロケーション）を仲介する生物学的な役割を意味する。
【００３５】
本明細書で用いる「診断的化合物」は、健康状態または疾患状態の同定および特性解析の一助となる化合物である。診断的化合物は、当技術分野で周知の標準的なアッセイ法で使用することができる。
【００３６】
「発現ベクター」は、組換え的、または合成的に、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能とする一連の特定の核酸配列とともに作られる核酸コンストラクトである。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部、または核酸断片の場合がある。典型的には発現ベクターは、プロモーターに使用可能に連結されて転写される核酸を含む。
【００３７】
「ＨｓＫｉｆ１５」は、微小管モータータンパク質のキネシンスーパーファミリーの分子である。ＨｓＫｉｆ１５は、微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性、および微小管結合活性などの活性をもつ。
【００３８】
核酸の一部分に関して用いられる「異種」という表現は、核酸が、天然の状態で相互に同じ関連性で見出されない２個またはそれ以上のサブ配列を含むことを意味する。例えば核酸は典型的には、無関係に配置された遺伝子から新しい機能性核酸を作るように２個またはそれ以上の配列を有するように組換え的に作製される。
【００３９】
「ストリンジェンシーの高い条件」は例えば以下のような条件である：（１）洗浄段階に低イオン強度および高温、例えば０．０１５ Ｍ 塩化ナトリウム／０．００１５ Ｍ クエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で用いる条件；（２）ハイブリダイゼーション段階で、ホルムアミドなどの変性剤、例えば５０％ （ｖ／ｖ） ホルムアミド＋０．１％ ウシ血清アルブミン／０．１％ フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）／０．１％ ポリビニルピロリドン／５０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ６．５、および７５０ ｍＭ 塩化ナトリウム、７５ ｍＭ クエン酸ナトリウムを４２℃で用いる条件；または（３）５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ （０．７５ Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５ Ｍ クエン酸ナトリウム）、５０ ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ ６．８）、０．１％ ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ （５０ μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ、および１０％ 硫酸デキストランを４２℃で用いる処理、０．２×ＳＳＣ （塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）を４２℃に用いる洗浄、５０％ ホルムアミド中で５５℃における処理に続き、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣを５５℃で用いる処理を含むストリンジェンシーの高い洗浄段階を用いる条件。
【００４０】
本明細書で用いる「高スループットのスクリーニング」は、同時にスクリーニング対象となる複数の候補薬剤または試料を提供するアッセイ法を意味する。詳しく後述するように、これらのアッセイ法の例には、多数のアッセイ法を少量の試薬および試料を用いて同時に実施可能とするために特に便利なマイクロタイタープレート、および核酸またはタンパク質のアレイの使用が含まれる。
【００４１】
「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、同ベクターの複製または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞の場合や、植物細胞、ＣＨＯ、ＨｅＬａなどの酵母、昆虫、両生類、または哺乳類の細胞などの真核細胞の場合がある。細胞および組織の初代培養物は、この定義に含まれる。
【００４２】
「〜と特異的にハイブリッドを形成する」という表現は、配列が複合混合物（例えば全細胞）のＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合に、ストリンジェントな条件下で分子が特定のヌクレオチド配列に結合すること、２本鎖を形成すること、またはハイブリッドを形成することを意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、環境が違えば異なることがある。長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリッドを形成する。一般にストリンジェントな条件は、特定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定配列の融点（Ｔｍ）より約５℃低い温度になるように選択される。Ｔｍは、（特定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度において）標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡時に標的配列とハイブリッドを形成する温度である。典型的にはストリンジェントな条件は、塩濃度がナトリウムイオンが約１．０ Ｍ未満、典型的にはｐＨ ７．０〜８．３における約０．０５〜１．０ Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）の濃度、および温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃、また長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドを超える）について少なくとも約６０℃という条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することでも達成することができる。
【００４３】
２個またはそれ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して「同一」または「同一性」パーセンテージという用語は、以下の配列比較アルゴリズムの一つを用いるか、またはマニュアルアライメントおよび目視で測定した場合、比較ウィンドウで最大の一致となるように比較してアライメントさせた際に、アミノ酸残基またはヌクレオチド残基が同じか、または同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する２個またはそれ以上の配列またはサブ配列を意味する。この定義は、被験配列が指定されているか、または参照配列と実質的な同一性を有する場合に、指定の配列またはサブ配列の相補性のパーセンテージで表される被験配列の相補物も意味する。好ましくは同一性パーセンテージは、長さが少なくとも２５アミノ酸の配列領域、より好ましくは長さが５０〜１００アミノ酸の領域についていう。
【００４４】
配列同一性パーセンテージをタンパク質またはペプチドに関して用いる場合、同一でない残基の位置は、アミノ酸残基が化学的特性（例えば電荷や疎水性）が似た他のアミノ酸残基と置換されることによって分子の機能的特性を変化させない保存的アミノ酸置換と異なる場合があることが認識される。保存的置換で配列が異なる場合、配列同一性パーセンテージは、上方に調整されて、置換の保存的な性質に補正されることがある。このような調整を行う手段は当技術分野で周知である。保存的置換のスコアリングは例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ （Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などで実行される、マイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラーズ（Ｍｉｌｌｅｒｓ）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ． ４：１１〜１７ （１９８８）に記載されたアルゴリズムで計算される。
【００４５】
「免疫アッセイ法」という用語は、抗原に特異的に結合する抗体を用いるアッセイ法である。免疫アッセイ法は、抗原の単離用、標的化用、および／または定量用の特定抗体の特異的な結合特性を使用することを特徴とする。
【００４６】
「インビボ」という表現は、生物体の細胞内で生じる適用を意味する。「インビトロ」という表現は、生物体外における適用を意味し、細胞内または無細胞環境における適用を意味する。「インサイチュー」とは、例えば細胞を操作した後に生物体に移すというような、環境を組み合わせる適用を意味する。
【００４７】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という表現は、天然の状態で見出されるように通常伴う成分を実質的または本質的に含まない材料を意味する。純度および均質度は、典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学的手法で決定される。調製物中に存在する支配的な種であるタンパク質は実質的に精製される。単離されたＨｓＫｉｆ１５では、核酸は、ＨｓＫｉｆ１５遺伝子に隣接してＨｓＫｉｆ１５以外のタンパク質をコードする読み枠から分離している。「精製された」という表現は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル上に本質的に１本のバンドを生じることを意味する。具体的には、この表現は核酸またはタンパク質の純度が少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、また最も好ましくは少なくとも９９％であることを意味する。
【００４８】
「標識」は、分光光度的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段で検出可能な組成物である。例えば有用な標識には、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡで通常使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに抗血清またはモノクローナル抗体に使用されるタンパク質などがある（例えば配列番号：２のポリペプチドは、例えば放射標識をペプチドに取り込ませ、そのペプチドに特異的に反応する抗体の検出に用いることで検出可能とすることができる）。
【００４９】
「標識された核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、共有結合的に、またはリンカーを介して、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、もしくは水素結合を介して標識に結合していて、プローブの存在が、プローブに結合した標識の存在の検出によって検出される分子である。
【００５０】
「中程度にストリンジェントな条件」は、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９に記載された手順で決めることが可能であり、上述の条件と比べてストリンジェンシーが弱い洗浄液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の一例は、以下の組成の溶液中で一晩３７℃におけるインキュベーション：２０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ （１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１５ ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％ 硫酸デキストラン、および２０ μｇ／ｍＬ 変性サケ精子ＤＮＡによる処理と、それに続く、約３７〜５０℃で１×ＳＳＣ中におけるフィルターの洗浄である。プローブ長などの因子を配慮する必要に応じて、温度やイオン強度などを調整する方法を当業者であれば理解すると思われる。
【００５１】
「調節因子」、「阻害性物質」、および「ＨｓＫｉｆ１５の活性化因子」は、ＨｓＫｉｆ１５の活性を調べるインビトロおよびインビボのアッセイ法で同定される調節性分子を意味する。このようなアッセイ法では、ＡＴＰアーゼ活性、微小管滑走活性、微小管解重合活性、および微小管結合活性などの結合活性、またはヌクレオチド類似体の結合などを調べる。試料または分析対象物は、試験濃度および対照濃度で候補薬剤で処理される。対照濃度はゼロとすることができる。両濃度間でＨｓＫｉｆ１５活性に変化がみられる場合、そのような変化は、調節因子の存在が認められたことを意味する。上昇または低下することがある活性の変化は、対象に比較して好ましくは少なくとも２０〜５０％の変化であり、より好ましくは少なくとも５０〜７５％の変化であり、より好ましくは少なくとも７５〜１００％の変化であり、より好ましくは１５０〜２００％の変化であり、また最も好ましくは少なくとも２〜１０倍の変化である。また変化は結合特異性または基質の変化によって示される場合がある。
【００５２】
「分子モーター」は、化学的エネルギーから物理的な力を発生し、細胞骨格の運動特性を誘導する細胞骨格分子を意味する。
【００５３】
「モータードメイン」という表現は、真のキネシンのモータードメインに対する約３５〜４５％の配列同一性によって、モータータンパク質のキネシンスーパーファミリーへ分類する指標となるＨｓＫｉｆ１５のドメインを意味する。
【００５４】
「核酸」という用語は、１本鎖または２本鎖の形状をとるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびこれらの重合体を意味する。具体的に制限しない限り、この用語は、標準核酸と類似の結合を有して天然ヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知類似体を含む核酸を含む。特に明記しない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾された異型そのもの（例えば縮重コドン置換）、および相補的配列、ならびに明瞭に指示された配列を暗黙のうちに含む。具体的には、縮重コドン置換は一つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置がミックスドアーゼ（ｍｉｘｅｄ−ａｓｅ）、および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生じることで達成される場合がある（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：５０８１ （１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５〜２６０８ （１９８５）；Ｃａｓｓｏｌら、１９９２；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１〜９８ （１９９４））。核酸という用語は遺伝子、遺伝子にコードされるｃＤＮＡ、およびｍＲＮＡと互換的に用いられる。
【００５５】
「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、相補的配列をもつ標的核酸に、一つまたは複数の種の化学結合、通常は相補的な塩基対形成、通常は水素結合の形成を介して結合可能な核酸と定義される。本明細書で用いるように、プローブは天然の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、もしくはＴ）、または修飾型塩基を含む場合がある。またプローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションに干渉しない限りは、ホスホジエステル結合を除く結合で連結される場合がある。したがって例えばプローブは、構成される塩基がホスホジエステル結合以外のペプチド結合で連結されるペプチド性核酸の場合がある。プローブが、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じてプローブ配列と完全な相補性をもたない標的配列に結合可能であることは当業者であれば理解すると思われる。プローブは好ましくは、放射性同位元素、発色団、ルミフォア、色素原で直接標識されるほか、後にビオチンにストレプトアビジン複合体が結合するように間接的に標識される。プローブの有無を調べることで、選択される配列またはサブ配列の有無を検出することができる。
【００５６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書ではアミノ酸残基重合体と互換的に用いられる。この用語は、１個または複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工の化学的類似体であるアミノ酸重合体、ならびに天然のアミノ酸重合体に適用される。ＨｓＫｉｆ１５ポリペプチドは、少なくとも微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性をもつことと、ＨｓＫｉｆ１５に対する抗体と結合することが明らかにされたポリペプチドを含む。本明細書では、アミノ酸は一般に知られている、または命名委員会（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって決められた３文字の記号のいずれかによって表記される。同様にヌクレオチドは、一般に受け入れられている１文字コード（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌによって推奨されている１文字記号）で表される。
【００５７】
「プロモーター」は、核酸の転写を誘導する一連の核酸対照配列と定義される。本明細書で用いるように、プロモーターは転写部位の近傍に必要な核酸配列を含む（ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合はＴＡＴＡ配列）。プロモーターは、転写開始部位から数千塩基対離れて位置することが可能な遠位のエンハンサー配列またはリプレッサー配列も選択的に含む。「構成的」プロモーターは、大部分の環境条件および発生条件で活性を示すプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的または発生的な調節を受けるプロモーターである。「使用可能に連結される」という表現は、核酸の発現対照配列（プロモーター、または一連の転写因子結合部位など）と、第２の核酸配列との間における機能的な連結を意味し、発現対照配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を誘導する。
【００５８】
抗体に「特異的（または選択的）に結合する」という表現、またはタンパク質またはペプチドに関して「特異的（または選択的）に免疫反応する」という表現は、タンパク質および他の生物製剤の不均一集団におけるタンパク質の存在に決定的な結合反応を意味する。したがって指定の免疫アッセイ条件で特定の抗体は、特定のタンパク質とバックグラウンドの少なくとも２倍結合し、試料中に存在する他のタンパク質に対しては有意な量で実質的に結合しない。特定の結合部分は典型的には、少なくとも互いに１０６Ｍ−１の親和性を有する。診断または治療に用いられる好ましい抗体は１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１などの高い親和性をもつ場合がある。このような条件下における抗体に対する特異的な結合は、特定のタンパク質に対する特異性から選択される抗体を必要とする場合がある。例えば、配列番号：２にコードされたアミノ酸配列を有するＨｓＫｉｆ１５に対する抗体は、ＨｓＫｉｆ１５と特異的に免疫反応して他のタンパク質とは反応しない抗体のみを得るように選択することができる（ＨｓＫｉｆ１５の多型異型、相同分子種、対立遺伝子、および関連性の強い相同体は除く）。このような選択は、線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）のｕｎｃ−１０４および哺乳類のＫｉｆ１などの分子と交差反応する抗体を差引くことで達成することができる。さまざまな免疫アッセイのフォーマットを用いることで、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体の選択にルーチンに用いられている（例えば、特異的な免疫反応性の決定に使用可能な免疫アッセイのフォーマットおよび条件についてはＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「抗体、実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８８）の記述を参照）。典型的には、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドのシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であるか、より典型的にはバックグラウンドの１０〜１００倍である。
【００５９】
「選択的に結びつく」という表現は、核酸が上述の他の分子と「選択的にハイブリッドを形成する」能力、または抗体が上述のようにタンパク質に「選択的（または特異的）に結合する」能力を意味する。
【００６０】
「遺伝子産物をコードする配列」という表現は、配列情報を含む核酸を意味する。この表現は具体的には、天然配列、または特定の宿主細胞に導入してコドンの使用頻度を確認することができる配列の縮重コドン（一つのアミノ酸をコードする異なるコドン）を含む。
【００６１】
（本明細書で「候補薬剤」および「被験化合物」ならびに「被験薬剤」と互換的に用いられる）「被験組成物」は、２種またはそれ以上の細胞骨格成分間における相互作用に及ぼす作用がアッセイされる分子または組成物を意味する。「被験組成物」は、選択的に含む分子または分子混合物の場合がある。
【００６２】
本明細書で用いる「治療用物質」は、ヒトと動物の疾患の両方に適用可能な細胞骨格系をインビボで調節する能力があると考えられている化合物を意味する。細胞骨格系の調節は、以下を含むがこれらに限定されないいくつかの条件で望ましい場合がある：内皮細胞の異常な刺激（例えばアテローム硬化症）、固形腫瘍および造血系腫瘍ならびに腫瘍転移、良性腫瘍、例えば、血管腫、聴神経腫瘍、神経線維腫、化膿性肉芽腫、血管機能不全、創傷治癒異常、炎症性疾患および免疫疾患（慢性関節リウマチ、ベーチェット病など）、痛風または通風性関節炎、血管形成異常（慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症、および、網膜色素変性症、角膜移植拒絶、角膜過成長、緑内障などの目の血管原性疾患を伴うもの）、オスラー・ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ Ｗｅｂｂｅｒ）症候群、心血管疾患（高血圧症、心筋虚血、ならびに収縮能障害および拡張能障害など）、ならびに真菌疾患（アスペルギルス症、カンジダ症、および局所真菌疾患）。
【００６３】
ＩＩ．はじめに
本発明は、ＨｓＫｉｆ１５をコードする核酸を初めて提供する。このタンパク質は、モータータンパク質のキネシンスーパーファミリーの分子で、微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性を示す。ＨｓＫｉｆ１５は紡錘体の形成に不可欠なことがわかっている。
【００６４】
一つの局面では、ＨｓＫｉｆ１５は、以下の機能特性および構造特性の少なくとも一つまたは好ましくは複数を有する分子と定義することができる。機能的にはＨｓＫｉｆ１５は、微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性、およびＡＴＰに依存した微小管モーター活性をもつ。ＨｓＫｉｆ１５活性は、結合活性に関して説明することもできる。
【００６５】
本明細書に記載されている新しいヌクレオチド配列は、ＨｓＫｉｆ１５またはその断片をコードする。したがって一つの局面では、本明細書に記載された核酸は、本明細書に記載された新しいタンパク質と定義される。本明細書に記載されたタンパク質は、以下の一つまたは複数の特性を有するアミノ酸配列を含む：配列番号：２との配列同一性が７０％を上回る、好ましくは８０％を上回る、より好ましくは９０％を上回る、より好ましくは９５％を上回る、または別の態様では配列番号：２と９８〜１００％の配列同一性を有する。上述した通り、ヌクレオチドが配列番号：１に関するという場合は、配列同一性は、同じパーセンテージか、または遺伝子コードの縮重のためにわずかに低い場合がある。本発明はまた配列番号：１に由来する少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、１００、１０００、または２０００の隣接ヌクレオチド、またはその縮重した分子を有する図１に示すヌクレオチド配列の断片も含む。断片の一部は、図２のアミノ酸配列の３２〜３９１位あたりにあるモータードメインを含む。このような断片の一部は、ハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして用いることができる。文脈から明らかでない限り、図に示すヌクレオチド配列または配列をいう場合は、この示される配列、つまり２本の鎖の完全な相補物または２重鎖を意味する場合がある。
【００６６】
ＨｓＫｉｆ１５の推定構造は、アミノ末端にあるキネシン様の微小管「モーター」ドメインを含む（図４および６を参照）。
【００６７】
ＨｓＫｉｆ１５ヌクレオチド配列の一部は、ＨｓＫｉｆ１５の多型異型、相同分子種、対立遺伝子、および相同体の同定に使用することができる。同定は例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および配列決定によりインビトロで行われるか、または他のヌクレオチド配列との比較用のコンピュータシステム上の配列情報を用いて行われる。配列比較は、後述する任意の配列比較アルゴリズムを用いて実施することができる。好ましいアルゴリズムはＰＩＬＥＵＰである。
【００６８】
本明細書に記載されたいずれかのペプチドの活性は、ＡＴＰアーゼ活性または微小管結合活性を調べる、本明細書に記載されたアッセイ法でルーチンの手法で確認することができる。一つの態様では、ＨｓＫｉｆ１５の多型異型、対立遺伝子、および相同分子種、相同体を、当技術分野の周知のＡＴＰアーゼまたは微小管結合のアッセイ法で確認する。
【００６９】
生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５の最初の単離は、このキネシンスーパーファミリーのタンパク質の調節因子を調べるための手段となる。生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５は、微小管滑走アッセイ法、ＡＴＰアーゼアッセイ法 （Ｋｏｄａｍａら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９９：１４６５〜１４７２ （１９８６）；Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５２０９〜５２１３ （１９９３））、および微小管結合アッセイ法（Ｖａｌｅら、Ｃｅｌｌ ４２：３９〜５０ （１９８５））を含む結合アッセイ法などのインビトロアッセイ法による、ＨｓＫｉｆ１５およびその断片、ならびにキネシンスーパーファミリーの分子の調節因子の同定に有用である。インビボアッセイ法およびその用途についても本明細書で提供される。ＨｓＫｉｆ１５に結合する候補薬剤およびその部分を同定する方法も本明細書で提供される。
【００７０】
ＨｓＫｉｆ１５のいくつかの部分または断片は、図２に示す配列に由来する少なくとも７残基、１０残基、１５残基、２０残基、３５残基、５０残基、１００残基、２５０残基、３００残基、３５０残基、５００残基、または１０００残基の隣接アミノ酸を含む。一部の断片は、図２に示す配列に由来する１０００残基、５００残基、２５０残基、１００残基、または５０残基未満の隣接アミノ酸を含む。例えば、例示的な断片には、１５〜５０アミノ酸、または１００〜５００アミノ酸を有する断片が含まれる。一部の断片はモータードメインを含む。このような断片は典型的には、図２のアミノ酸残基の３２〜３９１位の範囲、またはその活性部分を含む。一部の断片はＨｓＫｉｆ１５のリガンド結合ドメインを含む。
【００７１】
後に詳述するように、本明細書に記載された新しい化合物を用いるさまざまなアッセイ法、治療法および診断法が本明細書に記載されている。後に詳述する、本明細書に記載された用途および方法は、インビボ、インサイチュー、およびインビトロにおける適用があり、医学、獣医学、農学、および研究を基礎とした分野の応用に使用することができる。
【００７２】
ＩＩＩ．ＨｓＫｉｆ１５をコードする遺伝子の単離
Ａ．一般的な組換えＤＮＡ法
本発明は、組換え遺伝学分野におけるルーチンの手法に基づく。本発明における用途の一般的な方法を説明した基本的なテキストには、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第２版、１９８９）；クリーガー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ）、「遺伝子移入と発現：実験マニュアル（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９９０）；および「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）などがある。
【００７３】
核酸については、その大きさはキロ塩基対（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）で表される。これは、アガロースゲルもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸の配列決定、または論文に記載されたＤＮＡ配列から得られる推定値である。タンパク質については、その大きさはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で表される。タンパク質の大きさは、ゲル電気泳動、質量分析、タンパク質の配列決定、由来するアミノ酸配列、または論文に記載されたタンパク質配列から推定される。
【００７４】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、べーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびカルザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ． ２２：１８５９〜１８６２ （１９８１）によって最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法にしたがって、デバンテール（Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：６１５９〜６１６８ （１９８４）に記載された自動合成装置を用いて化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、天然のアクリルアミドゲル電気泳動法か、またはピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびレーニエ（Ｒｅａｎｉｅｒ）、Ｊ． Ｃｈｒｏｍ． ２２５：１３７〜１４９ （１９８３）に記載されている陰イオン交換ＨＰＬＣによって行われる。
【００７５】
クローニングされた遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、クローニングした後に、例えばウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら、Ｇｅｎｅ １６：２１〜２６ （１９８１）の２本鎖鋳型の配列決定の鎖停止法で確認することができる。
【００７６】
Ｂ．ＨｓＫｉｆ１５をコードするヌクレオチド配列を単離するためのクローニング法
一般に、ＨｓＫｉｆ１５および関連する核酸配列の相同体をコードする核酸配列は、ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムＤＮＡライブラリーからクローニングされ、またはオリゴヌクレオチドプライマーを用いた増幅法で単離される。または発現ライブラリーを用いて、ＨｓＫｉｆ１５相同体をも認識して選択的に結合するＨｓＫｉｆ１５に対して作製された抗血清または精製抗体によって免疫学的に検出された発現された相同体によってＨｓＫｉｆ１５およびＨｓＫｉｆ１５相同体をクローニングすることができる。最後に、プライマーを用いた増幅法で、ＨｓＫｉｆ１５をＤＮＡまたはＲＮＡから増幅および単離することができる。縮重プライマーを用いた増幅法で、ＨｓＫｉｆ１５相同体を増幅および単離することもできる。プライマーを用いた増幅法でＨｓＫｉｆ１５をコードする核酸を単離することもできる。このようなプライマーは例えば、数百ヌクレオチドからなるプローブの増幅と、それに続く完全長のＨｓＫｉｆ１５を求めるライブラリーのスクリーニングに用いることができる。
【００７７】
他の種のＨｓＫｉｆ１５をコードする遺伝子の同定に用いられる適切なプライマーおよびプローブは、本明細書に記載された配列との比較を元に作製される。上述した通り、抗体を用いてＨｓＫｉｆ１５相同体を同定することができる。例えば、ＨｓＫｉｆ１５のモータードメイン、またはタンパク質全体に対して作製された抗体は、ＨｓＫｉｆ１５相同体の同定に有用である。
【００７８】
ｃＤＮＡライブラリーを作製する際には、対象となるｍＲＮＡ （例えばＨｓＫｉｆ１５のｍＲＮＡ）に富む供給源を選択すべきである。例えばＨｓＫｉｆ１５のｍＲＮＡは、精巣、骨髄、また胎児の肝臓に極めて豊富に含まれ、脳、唾液腺、心臓、甲状腺、腎臓、副腎、脾臓、膵臓、肝臓、卵巣、結腸、子宮、肺、前立腺、小腸、皮膚、筋肉、末梢血リンパ球、胃、胎盤で比較的低く発現している。次に逆転写酵素を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを作り、組換えベクターに連結し、組換え宿主に導入して増殖させ、スクリーニングおよびクローニングを行う。ｃＤＮＡライブラリーの作製およびスクリーニングの方法は当技術分野で周知である（例えば、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ ２５：２６３〜２６９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記；Ａｕｓｕｂｅｌら、前記を参照）。
【００７９】
ゲノムライブラリーについては、ＤＮＡを組織から抽出し、機械的に剪断するか酵素を用いて消化して約１２〜２０ ｋｂの断片を得る。次にこの断片を、勾配遠心法で望ましくない大きさの断片と分離し、バクテリオファージλのベクターに組み込む。ベクターおよびファージのパッケージングはインビトロで行う。組換えファージを、ベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）およびデイビス（Ｄａｖｉｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０〜１８２ （１９７７）に記載されているプラークハイブリダイゼーションで分析する。コロニーハイブリダイゼーションの一般的な記述は、グランステイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７２：３９６１〜３９６５ （１９７５）にある。
【００８０】
ＨｓＫｉｆ１５の核酸およびその相同体を単離する別の方法では、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用とＲＮＡまたはＤＮＡの鋳型の増幅を組み合わせる（米国特許第４，６８３，１９５号、および第４，６８３，２０２号；「ＰＣＲプロトコール：方法と応用についての手引き（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）を参照）。ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応などの方法で、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリー、またはｃＤＮＡライブラリーからＨｓＫｉｆ１５の核酸配列を直接増幅することができる。縮重したオリゴヌクレオチドを設計して、本明細書に記載された配列を用いてＨｓＫｉｆ１５相同体を増幅することができる。また制限エンドヌクレアーゼ切断部位をプライマーに組み込むことができる。ポリメラーゼ連鎖反応、または他のインビトロ増幅法も、例えば発現させるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングする際に、核酸を作製してｍＲＮＡをコードするＨｓＫｉｆ１５の存在を生理学的試料中における検出、核酸の配列決定、または他の目的に使用する際に有用である。ＰＣＲ反応で増幅された遺伝子をアガロースゲルから精製して、適切なベクターにクローニングすることができる。
【００８１】
ＨｓＫｉｆ１５の遺伝子発現は、当技術分野で周知の手法、例えばｍＲＮＡの逆転写および増幅、全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡの単離、ノーザンブロット、ドットブロット、インサイチューハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクション、定量的ＰＣＲなどで分析することもできる。
【００８２】
合成オリゴヌクレオチドを用いて、プローブとして、またはタンパク質の発現に用いる組換えＨｓＫｉｆ１５遺伝子を構築することができる。この方法は、一連の重複した、遺伝子のセンスとアンチセンスの両鎖を示す通常は４０〜１２０ ｂｐの長さのオリゴヌクレオチドを用いて行われる。このようなＤＮＡ断片を次にアニーリングし、連結してクローニングする。または正確なプライマーを用いた増幅法により、ＨｓＫｉｆ１５遺伝子の特定のサブ配列を増幅することができる。続いて、特定のサブ配列を発現ベクターに連結する。
【００８３】
ＨｓＫｉｆ１５の遺伝子を典型的には中間体ベクターにクローニングしてから、原核細胞または真核細胞を形質転換して複製および／または発現させる。中間体ベクターは典型的には、原核細胞のベクターまたはシャトルベクターである。
【００８４】
Ｃ．原核細胞および真核細胞における発現
ＨｓＫｉｆ１５をコードするｃＤＮＡなどの、クローニングされた遺伝子を高レベルで発現させるためには、転写を誘導する強いプロモーター、転写／翻訳のターミネーター、またタンパク質をコードする核酸の場合は、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクターを構築することが重要である。細菌由来の適切なプロモーターは当技術分野で周知であり、例えばサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの文献、およびアウシュベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの文献に記載されている。ＨｓＫｉｆ１５タンパク質を発現させるための細菌発現系は例えば、大腸菌、枯草菌、およびサルモネラ菌で使用することができる（Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ ２２：２２９〜２３５ （１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ ３０２：５４３〜５４５ （１９８３））。このような発現系に使用されるキットは市販されている。哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞の真核発現系は当技術分野で周知であり、これも市販されている。好ましい原核生物発現系の一つがｐＥＴ発現系（Ｎｏｖａｇｅｎ）である。
【００８５】
異種核酸の発現誘導に用いられるプロモーターは特定の応用によって変わる。プロモーターは、天然の状態で転写開始部位から離れている距離とほぼ等距離に異種転写開始部位から離れて位置することが好ましい。しかし当技術分野で周知のように、ある程度の距離の変化は、プロモーターの機能を失うことなく許容される。
【００８６】
プロモーターに加えて、発現ベクターは通常、核酸をコードするＨｓＫｉｆ１５の宿主細胞における発現に必要な付加的な配列すべてを含む転写単位または発現カセットを含む。したがって典型的な発現カセットは、ＨｓＫｉｆ１５をコードする核酸配列に使用可能に連結されたプロモーター、および転写物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、および翻訳終結に必要なシグナルを含む。ＨｓＫｉｆ１５をコードする核酸配列には典型的には、切断可能なシグナルペプチド配列を結合させて、コードされたタンパク質が形質転換細胞から容易に分泌されるようにすることができる。このようなシグナルペプチドには、組織プラスミノーゲンアクチベーター、インスリン、および神経成長因子、ならびにオオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の幼若ホルモンエステラーゼに由来するシグナルペプチドなどが含まれる場合がある。カセットの他の因子にはエンハンサーなどが含まれ、ゲノムＤＮＡを構造遺伝子として用いる場合は、機能性のドナー部位およびアクセプター部位をもつイントロンが含まれる。
【００８７】
プロモーター配列に加えて、発現カセットは、効率的な終結をもたらすために構造遺伝子の下流に転写終結領域も含むべきである。終結領域はプロモーター配列と同じ遺伝子から得られるほか、別の遺伝子からも得られる。
【００８８】
細胞への遺伝情報の輸送に用いられる特定の発現ベクターは特に重要ではない。真核細胞または原核細胞における発現に使用される従来のベクターを使用することができる。標準的な細菌発現ベクターには、ｐＢＲ３２２をベースとしたプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現系などのプラスミドが含まれる。エピトープタグ（例えばｃ−ｍｙｃ）を組換えタンパク質に付け加えることで、単離を簡便化することもできる。
【００８９】
真核細胞に感染するウイルスの調節配列を含む発現ベクターは典型的には、真核発現ベクター（例えば、ＳＶ４０ベクター、サイトメガロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタインバーウイルスに由来するベクター）中で用いられる。他の例示的な真核ベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスのｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効な他のプロモーターの支配下にあるタンパク質の発現を可能とする他の任意のベクターがある。
【００９０】
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼなどの、遺伝子増幅をもたらすマーカーをもつ。または、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーター支配下にＨｓＫｉｆ１５コード配列を含む、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターを用いた系などの、遺伝子増幅を行わない高収量の発現系も適している。
【００９１】
発現ベクターに典型的に含まれる因子には、大腸菌で機能するレプリコン、組換えプラスミドをもつ細菌の選択を可能とする抗生物質耐性をコードする遺伝子、およびプラスミドの非本質的領域にあり、真核生物由来の配列の挿入を可能とする固有の制限酵素切断部位も含まれる。選択される特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当技術分野で周知の多くの任意の耐性遺伝子のいずれかが適している。原核細胞由来の配列は、好ましくは必要に応じて、真核細胞におけるＤＮＡの複製に干渉しないように選択される。
【００９２】
標準的なトランスフェクション法または形質転換法を用いて、ＨｓＫｉｆ１５タンパク質を大量に発現する細菌、哺乳類、酵母、または昆虫細胞の系列を作製する。発現されたタンパク質は後で標準的な手法で精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１７６１９〜１７６２２ （１９８９）；「タンパク質精製の手引き、酵素学における方法（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、第１８２巻、（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０）を参照）。
【００９３】
真核細胞および原核細胞の形質転換は標準的な手法で行う（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ． Ｂａｃｔ．、１３２：３４９〜３５１ （１９７７）；Ｃｌａｒｋ−ＣｕｒｔｉｓｓおよびＣｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１：３４７〜３６２ （Ｗｕら編、１９８３）を参照）。
【００９４】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する、既知の任意の手順を用いることができる。このような手順には、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ポリブレン、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、プラズマベクター、ウイルスベクター、およびクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入する他の任意の既知の方法の使用などが含まれる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前記を参照）。用いられる特定の遺伝子工学的手法が、少なくとも１種の遺伝子を、ＨｓＫｉｆ１５を発現可能な宿主細胞に良好に導入できることだけが必要である。
【００９５】
発現ベクターを細胞に導入後、トランスフェクトした細胞をＨｓＫｉｆ１５の発現に望ましい条件で培養し、後述する標準的な手法で培養物から回収する。
【００９６】
ＩＶ．ＨｓＫｉｆ１５タンパク質の精製
天然のＨｓＫｉｆ１５、または組換えＨｓＫｉｆ１５のいずれかを、機能アッセイ法用に精製して使用することができる。ＨｓＫｉｆ１５は、硫酸アンモニウムなどの基質を用いる選択的沈殿法；カラムクロマトグラフィー、免役沈殿法などを含む標準的な手段で実質的に純粋になるまで精製することができる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、「タンパク質精製：原理と実際（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（１９８２）；米国特許第４，６７３，６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌら、前記；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前記を参照）。好ましい精製法ではＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する。
【００９７】
組換えＨｓＫｉｆ１５を精製する際には、いくつかの手順を用いることができる。例えば分子吸着特性を有することがわかっているタンパク質は、ＨｓＫｉｆ１５に可逆的に融合させることができる。適切なリガンドを用いることで、ＨｓＫｉｆ１５を精製用カラムに吸着させた後にカラムから比較的純粋な状態で遊離させることで選択することができる。次に融合状態のタンパク質を酵素活性を用いて除く。最後にイムノアフィニティカラムを用いてＨｓＫｉｆ１５を精製することができる。
【００９８】
Ａ．組換え細菌からのＨｓＫｉｆ１５の精製
組換えタンパク質は、通常はプロモーター誘導後に形質転換細菌で大量に発現されるが、発現は構成的とすることができる。ＩＰＴＧによるプロモーター誘導は好ましい発現法である。細菌は当技術分野の標準的な手順で増殖させる。新鮮な細菌細胞または凍結細菌細胞をタンパク質の単離に用いる。
【００９９】
または、細菌のペリプラズムからＨｓＫｉｆ１５を精製することができる。細菌を溶解後、ＨｓＫｉｆ１５を細菌のペリプラズムに輸送し、細菌のペリプラズムフラクションを、当技術分野で周知の他の方法に冷却浸透圧ショックを加えた方法で単離することができる。組換えタンパク質をペリプラズムから単離する際には、細菌細胞を遠心してペレットを得る。このペレットを、２０％ ショ糖を含む緩衝液に再懸濁する。細胞を溶解させるためには、細菌を遠心してペレットを５ ｍＭの冷ＭｇＳＯ４に再懸濁し、氷浴に約１０分間維持する。この細胞懸濁液を遠心し、上清をデカントして保存する。上清に含まれる組換えタンパク質は、当技術分野で周知の標準的な手法で宿主タンパク質と分離することができる。
【０１００】
ＨｓＫｉｆ１５またはその断片は、参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第０９／２９５，６１２号に記載された手順で調製することもできる。
【０１０１】
Ｂ．ＨｓＫｉｆ１５を精製するための標準的なタンパク質分離法
溶解度による分画
初期の段階では、特にタンパク質混合物が複雑な場合、初期の塩分画で、望ましくない多くの宿主細胞タンパク質（または細胞用培地に由来するタンパク質）を対象組換えタンパク質と分離することができる場合がある。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物に含まれる水の量を効率的に減少させることでタンパク質を沈殿させる。その後、タンパク質は溶解性に応じて沈殿する。疎水性が大きいタンパク質ほど、低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿を生じる可能性が高い。典型的なプロトコルには、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加して、結果として生じる硫酸アンモニウム濃度を２０〜３０％とする段階が含まれる。この濃度では、疎水性の最も高いタンパク質が沈殿する。次に沈殿を廃棄し（対象タンパク質が疎水性でない場合に限る）、対象タンパク質の沈殿が生じることがわかっている濃度まで硫酸アンモニウムを上清に添加する。次に沈殿を緩衝液に溶解し、過剰な塩を必要に応じて透析またはダイアフィルトレーションで除く。冷エタノール沈殿法などの、タンパク質の可溶性を利用する他の方法は当技術分野で周知であり、複雑なタンパク質混合物の分画に用いることができる。
【０１０２】
大きさの差に基づく濾過
ＨｓＫｉｆ１５の分子量を利用して、さまざまな孔の大きさの膜（例えばＡｍｉｃｏｎ製またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製の膜）を通す限外濾過法で、大きな、または小さなタンパク質から単離することができる。第１段階ではタンパク質混合物を、対象タンパク質の分子量より低分子量のカットオフ値をもつ孔径の膜を通して限外濾過する。次に限外濾過の保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を、対象タンパク質の分子量より大きい分子カットオフ値をもつ膜で限外濾過する。組換えタンパク質は膜を通過して濾液に移動する。次に濾液を対象に、後述するクロマトグラフィーを行う。
【０１０３】
カラムクロマトグラフィー
ＨｓＫｉｆ１５は、その大きさ、正味の表面電荷、疎水性、およびリガンドに対する親和性を元に他のタンパク質と分離することもできる。また、タンパク質に対する抗体をカラムマトリックスに結合させ、タンパク質を免疫精製することができる。以上すべての方法は当技術分野で周知である。クロマトグラフィー法を任意の規模で、またさまざまな業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）による装置を用いて実施することができることは当業者には明らかと思われる。
【０１０４】
Ｖ．ＨｓＫｉｆ１５の免疫学的検出法
核酸ハイブリダイゼーション法によるＨｓＫｉｆ１５遺伝子の検出、および遺伝子発現に加えて、免疫アッセイでＨｓＫｉｆ１５を検出することもできる。免疫アッセイ法では、ＨｓＫｉｆ１５を量的または質的に分析することができる。適用可能な手法に関する一般的な概説は、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８８）に記載されている。
【０１０５】
Ａ．ＨｓＫｉｆ１５に対する抗体
ＨｓＫｉｆ１５に特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は当技術分野で周知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、「免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（１９９１）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前記；Ｇｏｄｉｎｇ「モノクローナル抗体：原理と実際（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（第２版、１９８６）；およびＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７ （１９７５）を参照）。このような手法には、ファージまたは同様のベクター上における組換え抗体のライブラリーの抗体選択による抗体の調製、ならびにウサギまたはマウスの免疫化によるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製が含まれる（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１ （１９８９）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６ （１９８９）を参照）。
【０１０６】
ヒト化状態のマウス抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体の定常領域に組換えＤＮＡ技術で連結することで作製することができる。この手法については、クイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６、１００２９〜１００３３ （１９８９）および参照として組み入れられる国際公開公報第９０／０７８６１号を参照されたい。
【０１０７】
ヒト抗体はファージディスプレイ法で得られる。これについては例えば、ダワー（Ｄｏｗｅｒ）ら、国際公開公報第９１／１７２７１号；マッカファティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、国際公開公報第９２／０１０４７号を参照されたい。この方法では、ファージのライブラリーを、ライブラリーの構成分子が異なる抗体を外表面に提示するように作製する。抗体は通常Ｆｖ断片またはＦａｂ断片として提示される。所望の特異性を保持してファージにより提示される抗体は、ＨｓＫｉｆ１５またはその断片に対するアフィニティ濃縮で選択される。ＨｓＫｉｆ１５に対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位および不活性化された内因性免疫グロブリン座位の少なくとも一つのセグメントをコードする導入遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック哺乳類から作製することもできる。この手法については例えば、いずれも参照として全体が本明細書に組み入れられるロンボーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら、国際公開公報第９３／１２２２７号（１９９３）；クチェルラパティ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）、国際公開公報第９１／１０７４１号（１９９１）を参照されたい。ヒト抗体は、競合結合実験で、またそれ以外では特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有するものを選択することができる。このような抗体は特に、マウス抗体の有用な機能的特性を共有している可能性が高い。ヒトのポリクローナル抗体は、免疫原性物質で免疫化されたヒトの血清の状態でも提供される。選択的に、このようなポリクローナル抗体は、アフィニティ試薬としてＨｓＫｉｆ１５を用いたアフィニティ精製により濃縮することができる。
【０１０８】
免疫原を含むいくつかのＨｓＫｉｆ１５を用いて、ＨｓＫｉｆ１５と特異的に反応する抗体を作製することができる。例えば、組換えＨｓＫｉｆ１５またはモータードメインなどの抗原断片を本明細書に記載された手順で単離する。組換えタンパク質を真核細胞または原核細胞で上述の通りに発現させ、上述の一般的な手順で精製することができる。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生させるための好ましい免疫原である。または、本明細書に開示された配列に由来し、担体タンパク質に結合させた合成ペプチドを免疫原として使用することができる。天然のタンパク質は、純粋な状態、または不純な状態のいずれの状態でも用いることができる。次にこの産物を、抗体を産生可能な動物に注入する。モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体のいずれかを作製し、続く免疫アッセイで使用してタンパク質を測定することができる。
【０１０９】
ポリクローナル抗体を作製する方法は当技術分野で周知である。近交系のマウス（例えばＢＡＬＢ／Ｃマウス）またはウサギを同タンパク質で、フロインドアジュバントなどの標準的なアジュバントを用いて、また標準的な免疫化プロトコルで免疫化する。免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、採血を行ってＨｓＫｉｆ１５に対する反応性の力価を決定することでモニタリングする。免疫原に対して適切に高い力価の抗体が得られる場合は、動物から血液を採取して抗血清を調製する。望ましいならば、対象タンパク質に反応する抗体を濃縮するために、さらに抗血清の分画を行う（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅによる前記論文を参照）。
【０１１０】
モノクローナル抗体は、当業者になじみのあるさまざまな手法で得られる。簡単に説明すると、所望の抗原で免疫化した動物の脾臓細胞を、通常はミエローマ細胞と融合させることで不死化する（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１〜５１９ （１９７６）を参照）。または、不死化する方法には、エプスタインバーウイルス、癌遺伝子、もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当技術分野で周知の方法もある。不死化した細胞１個から生じるコロニーを、抗原に対する所望の特異性および親和性を有する抗体を産生するものについてスクリーニングを行い、このような細胞によって作製されるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹腔への注入を含むさまざまな手法で高めることができる。またはモノクローナル抗体またはその結合断片をコードするＤＮＡ配列を、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１ （１９８９）で概説されている一般的なプロトコルにしたがって、ヒトＢ細胞に由来するＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行うことで単離することができる。
【０１１１】
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清を回収し、例えば固相支持体上に固定された免疫原を用いる固相免疫アッセイなどの免疫アッセイで免疫原タンパク質に対する力価を測定する。典型的には、力価が１０４またはそれ以上のポリクローナル抗血清を選択し、非ＨｓＫｉｆ１５タンパク質、さらには他の生物に由来する他の相同タンパク質（例えば線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）のｕｎｃ−１０４または哺乳類のＫｉｆ１）に対する交差反応性を競合結合免疫アッセイで検討する。特異的なポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は通常ＫＤが少なくとも約０．１ ｍＭ、より一般的には少なくとも約 １ μＭ、好ましくは少なくとも約０．１ μＭまたはそれ以上、また最も好ましくは０．０１ μＭまたはそれ以上で結合する。
【０１１２】
ＨｓＫｉｆ１５に特異的な抗体が得られたら、さまざまな免疫アッセイ法でＨｓＫｉｆ１５を検出することができる。免疫学的手法および免疫アッセイの手順に関する総説は、「基礎臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照されたい。また本発明の免疫アッセイは、「酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」（Ｍａｇｇｉｏ編、１９８０）；およびハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、前記論文で広範囲に概説されている、任意の複数の構成で実施することができる。
【０１１３】
Ｂ．結合アッセイ法
抗体は、治療に使用できるほか、上述の配列同一性の特性を有するＨｓＫｉｆ１５の存在を確認する際に使用することができる。また抗体を用いて、後に詳述するように抗体とＨｓＫｉｆ１５との間における相互作用の調節因子を同定することができる。以下の考察は、結合アッセイ法における用途における抗体の使用を意図しているが、「非競合的な」アッセイ法または「競合的な」アッセイ法について記載されたフォーマットなどの同様の一般的なアッセイ法のフォーマットが、微小管または米国特許出願第６０／０７０，７７２号に記載された化合物などのＨｓＫｉｆ１５に結合する任意の化合物とともに使用できることは言うまでもない。
【０１１４】
好ましい態様では、ＨｓＫｉｆ１５は、任意の複数の十分に認められた免疫学的結合アッセイ法で検出および／または定量される（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；４，３７６，１１０号；第４，５１７，２８８号；および第４，８３７，１６８号を参照）。一般的な免疫アッセイの総説は、「細胞生物学における方法、３７巻：細胞生物学における抗体（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ａｓａｉ編、１９９３）；「基礎臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照されたい。免疫学的結合アッセイ法（免疫アッセイ法）では、典型的には、選択用のタンパク質または抗原（この場合はＨｓＫｉｆ１５またはその抗原性サブ配列）に特異的に結合する抗体が用いられる。抗体（例えば抗ＨｓＫｉｆ１５）は、当技術分野で周知の、また上述の任意のいくつかの手段で作製することができる。
【０１１５】
免疫アッセイでは、標識薬剤を用いて、抗体と抗原で形成される複合体に特異的に結合させて標識することもある。標識試薬は、そのものが抗体／抗原複合体を含む部分の一つである。したがって標識薬剤は、標識されたＨｓＫｉｆ１５ポリペプチド、または標識された抗ＨｓＫｉｆ１５抗体の場合がある。または標識試薬は、抗体／ＨｓＫｉｆ１５複合体に特異的に結合する二次抗体などの第３の部分の場合がある（二次抗体は通常、一次抗体が由来する種の抗体に特異性をもつ）。免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合可能な他のタンパク質（タンパク質Ａやタンパク質Ｇなど）も標識薬剤として使用することができる。これらのタンパク質は、さまざまな種の免疫グロブリンの定常領域に強い非免疫原性反応を示す（一般的には、クロンバル（Ｋｒｏｎｖａｌ）ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１１：１４０１〜１４０６ （１９７３）；アカーストーム（Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ）ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５：２５８９〜２５４２ （１９８５）を参照）。標識薬剤は、ストレプトアビジンなどの別の分子が特異的に結合するビオチンなどの検出用部分で修飾することができる。さまざまな検出用部分が当技術分野で周知である。
【０１１６】
アッセイ法を通して、試薬をそれぞれ混合した後にインキュベーション段階および／または洗浄段階が必要とされる場合がある。インキュベーション段階は約５秒間〜数時間を変動する場合があり、好ましくは約５分間〜約２４時間である。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ法のフォーマット、抗原、溶液の容量、濃度などによって変わる。通常、アッセイ法は外界温度で実施されるが、１０〜４０℃などの温度範囲で実施される場合がある。
【０１１７】
非競合的なアッセイ法のフォーマット
試料に含まれるＨｓＫｉｆ１５を検出する免疫アッセイ法は、競合的または非競合的なアッセイ法とすることができる。非競合的な免疫アッセイ法では抗原量を直接測定する。一つの好ましい「サンドイッチ」アッセイ法では、例えば抗ＨｓＫｉｆ１５抗体を、固定化用の固体基質に直接結合させることができる。固定化された抗体は次に、被験試料に含まれるＨｓＫｉｆ１５を捕捉する。したがってＨｓＫｉｆ１５は固定化された後に、標識を含む二次ＨｓＫｉｆ１５抗体などの標識薬剤と結合する。または、二次抗体は標識を含まない場合があるが、二次抗体が由来する種の抗体に特異的な標識された三次抗体に順に結合する場合がある。二次抗体または三次抗体は典型的には、ストレプトアビジンなどの別の分子が特異的に結合して検出用部分となる、ビオチンなどの検出用部分で修飾される。
【０１１８】
競合的アッセイ法のフォーマット
競合的なアッセイ法では、試料に含まれるＨｓＫｉｆ１５の量は、試料に含まれる未知のＨｓＫｉｆ１５による抗ＨｓＫｉｆ１５抗体と置換された（競合された）既知の添加された（外因性の）ＨｓＫｉｆ１５の量を測定することで、間接的に測定される。一つの競合的なアッセイ法では、既知量のＨｓＫｉｆ１５を試料に添加した後に、ＨｓＫｉｆ１５に特異的に結合する抗体を試料に接触させる。抗体に結合した外因性ＨｓＫｉｆ１５の量は、試料に含まれるＨｓＫｉｆ１５の濃度に反比例する。特に好ましい態様では、抗体は固体基質に固定される。抗体に結合したＨｓＫｉｆ１５の量は、ＨｓＫｉｆ１５／抗体複合体に含まれるＨｓＫｉｆ１５量を測定することによって、またはその代わりに複合体を形成していない残りのタンパク質量を測定することによって決定される場合がある。ＨｓＫｉｆ１５の量は、標識されたＨｓＫｉｆ１５分子を提供することで検出することができる。
【０１１９】
もう一つの好ましい競合的なアッセイ法がハプテン阻害アッセイ法である。このアッセイ法では、既知のＨｓＫｉｆ１５を固体基質上に固定する。既知量の抗ＨｓＫｉｆ１５を試料に添加した後に、固定されたＨｓＫｉｆ１５を試料に接触させる。既知の固定化されたＨｓＫｉｆ１５に結合した抗ＨｓＫｉｆ１５抗体の量は、試料に含まれるＨｓＫｉｆ１５の量に反比例する。また固定化抗体量は、固定化された抗体フラクションか、溶液中に残存する抗体のフラクションのいずれかを検出することで決定することができる。検出は、抗体が標識されている場合に直接的なものとなり、上述の抗体に特異的に結合する標識部分の後の添加によって間接的なものとなる。
【０１２０】
交差反応性の判定
競合的な結合フォーマットにおける免疫アッセイは、交差反応性の判定にも用いることができる。例えば、少なくとも配列番号：２により部分的にコードされたタンパク質を固相支持体に固定することができる。タンパク質（例えば線虫のｕｎｃ−１０４または哺乳類のＫｉｆ１）を、固定化抗原に対する抗血清との結合と競合するアッセイ系に添加する。添加されたタンパク質のもつ、固定化タンパク質に対する抗血清の結合と競合する能力を、配列番号：２にコードされたＨｓＫｉｆ１５がもつ、その自身と競合する能力と比較する。上記のタンパク質に関する交差反応性のパーセンテージは標準的な計算法で算出することができる。上述の添加された個々のタンパク質との交差反応性が１０％未満の抗血清を選択してプールする。交差反応する抗体は、プールされた抗血清から、添加された対象タンパク質（例えば遠縁の相同体）と免疫吸着させることで選択的に除去する。
【０１２１】
免疫吸着されてプールされた抗血清を次に、上述の通りに競合的な結合免疫アッセイに用いて、本発明のタンパク質と考えられる第２のタンパク質と、免疫原タンパク質（配列番号：２のＨｓＫｉｆ１５）との比較を行う。この比較を行うためには、二つのタンパク質をそれぞれ広い濃度範囲で検討し、固定されたタンパク質に対する抗血清との結合を５０％阻害するのに必要な各タンパク質量を決定する。５０％阻害に必要な第２のタンパク質の量が、結合を５０％抑制するのに必要な配列番号：２にコードされたタンパク質量の１０分の１に満たない場合は、第２のタンパク質は、ＨｓＫｉｆ１５免疫原に対するポリクローナル抗体に特異的に結合するといえる。
【０１２２】
他のアッセイ法のフォーマット
ウェスタンブロット（イムノブロット）分析で、試料に含まれるＨｓＫｉｆ１５の存在を検出および定量する。この手法は一般的に、試料タンパク質をゲル電気泳動で分子量を元に分離する段階、分離したタンパク質を（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化されたナイロンフィルターなどの）適切な固相支持体に移す段階、およびＨｓＫｉｆ１５に特異的に結合する抗体と試料をともにインキュベートする段階を含む。抗ＨｓＫｉｆ１５抗体は、固相支持体上のＨｓＫｉｆ１５に特異的に結合する。このような抗体は直接標識されたり、または抗ＨｓＫｉｆ１５抗体に特異的に結合する標識抗体（例えば標識されたヒツジ抗マウス抗体）を用いて後に検出される場合がある。
【０１２３】
他のアッセイ法のフォーマットには、特定の分子（例えば抗体）に結合して内部の試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを用いるリポソーム免疫アッセイ法（ＬＩＡ）などがある。放出された化学物質は、後に標準的な手法で検出される（Ｍｏｎｒｏｅら、Ａｍｅｒ． ｄｉｎ． Ｐｒｏｄ． Ｒｅｖ． ５：３４〜４１ （１９８６）を参照）。
【０１２４】
非特異的な結合の低下
免疫アッセイにおける非特異的な結合を極めて小さくすることが望ましい場合があることを当業者であれば理解すると思われる。特にアッセイ法に、固体基質上に固定化された抗原または抗体がかかわる場合は、基質に対する非特異的な結合の量を極めて少なくすることが望ましい。非特異的な結合を低下させる手段は当技術分野で周知である。典型的には、このような手法には、基質をタンパク質性組成物でコーティングする段階が含まれる。特にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳、およびゼラチンなどのタンパク質組成物は広く用いられており、なかでも粉末乳が最も好ましい。
【０１２５】
標識
アッセイ法に用いられる特定の標識、または検出用官能基は、アッセイ法で使用される抗体との特定の結合に大きく干渉しない限り、本発明の重要な局面ではない。検出用官能基は、検出用の物理的特性または化学的特性を有する任意の材料とすることができる。検出用標識は免疫アッセイの分野で開発が進んでおり、一般に、このような方法に有用な大部分の任意の標識を本発明に適用することができる。したがって標識は、分光光度的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段で検出される任意の組成物である。本発明の有用な標識には、磁気ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアナート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般的に用いられる他の酵素）、ならびに金コロイドもしくは色ガラスなどの比色性標識、またはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）がある。
【０１２６】
標識は、当技術分野で周知の方法で、アッセイ系の所望の成分に直接または間接的に結合させることができる。上述の通り、さまざまな標識を使用することが可能であり、標識の選択は要求される感度、化合物との結合の容易さ、安定性に関する要件、使用可能な器具、および廃棄規定に依存する。
【０１２７】
非放射性標識は間接的な手段で結合させることが多い。一般的に、リガンド分子（例えばビオチン）は共有結合で分子に結合される。次にリガンドは別の分子（例えばストレプトアビジン）に結合し、本質的に検出されるか、または検出用酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物などのシグナル系に共有結合させることができる。リガンドとその標的は、ＨｓＫｉｆ１５を認識する抗体、または抗ＨｓＫｉｆ１５を認識する二次抗体の任意の適切な組み合わせで使用することができる。
【０１２８】
このような分子は、シグナル発生化合物に、例えば酵素やフルオロフォアと結合させることで直接結合させることもできる。標識となる対象酵素の主なものは、加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼ、または酸化酵素、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物には、フルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどがある。化学発光化合物には、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールがある。使用可能なさまざまな標識またはシグナルの発生系に関する総説は、米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
【０１２９】
標識を検出する手段は当技術分野で周知である。したがって例えば、標識が放射性標識の場合、検出手段には、シンチレーションカウンターやオートラジオグラフィにおける写真フィルムなどが含まれる。標識が蛍光標識の場合、蛍光色素を適切な波長の光で励起させて結果として生じる蛍光を検出して標識を検出することができる。蛍光は、写真フィルムを用いる手段によって、電荷結合素子（ＣＣＤ）などの電子検出器または光電子増倍管などを使用することで視覚的に検出することができる。同様に酵素標識は、酵素に対する適切な基質を提供して結果として生じる反応物を検出することで検出することができる。最後に単純な比色標識は、標識に関連する色を単に観察することで検出することができる。したがって、さまざまなディップスティックアッセイ法では、結合状態の金が桃色になることがあるが、結合状態のさまざまなビーズがビーズの色を示すことがある。
【０１３０】
一部のアッセイ法のフォーマットでは標識化合物の使用は必要とされない。例えば凝集アッセイ法では、標的抗体の有無を判定することができる。この場合、抗原でコーティングされた粒子は、標的抗体を含む試料と凝集する。このフォーマットでは、どの成分も標識される必要はなく、標的抗体の有無は目視で単純に判定される。
【０１３１】
ＶＩ．ＨｓＫｉｆ１５の調節因子のアッセイ法
生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５の活性は、さまざまなインビトロアッセイ法およびインビボアッセイ法、例えば微小管滑走アッセイ法、微小管結合アッセイ法などの結合アッセイ法、微小管解重合アッセイ法、およびＡＴＰアーゼアッセイ法で評価することができる（Ｋｏｄａｍａら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９９：１４６５〜１４７２ （１９８６）；Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５２０９〜５２１３ （１９９３）；Ｌｏｍｂｉｌｌｏ ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２８：１０７〜１１５ （１９９５）；Ｖａｌｅら、Ｃｅｌｌ ４２：３９〜５０ （１９８５））。高スループットスクリーニングの好ましいアッセイ法は、例えばエンドポイント検出用のマラカイトグリーン、または連続的な速度モニタリング用の結合型ＰＫ／ＬＤＨなどの比色を検出するＡＴＰアーゼアッセイである。このアッセイ法では、ＨｓＫｉｆ１５活性の上昇または低下のいずれかを検出することができる。活性を上昇させる化合物は作用物質と呼び、活性を低下させる化合物は拮抗物質と呼ぶことができる。
【０１３２】
このようなアッセイ法では、内因性供給源、または組換え体供給源から単離されたＨｓＫｉｆ１５の活性を調べることができる。また、このようなアッセイ法でＨｓＫｉｆ１５の調節分子を検討することができる。
【０１３３】
運動性に関するアッセイ法を実施する方法は当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｌｌら、１９９６、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．、７１：３４６７〜３４７６、Ｔｕｒｎｅｒら、１９９６、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４２ （１）：２０〜５；Ｇｉｔｔｅｓら、１９９６、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７０（１）：４１８〜２９；Ｓｈｉｒａｋａｗａら、１９９５、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． １９８：１８０９〜１５；Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎら、１９９５、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ６８：２４４４〜５３；Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎら、１９９５、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ６８：７２Ｓなどを参照）。
【０１３４】
ＡＴＰアーゼ活性を決定する際には、当技術分野で周知のさまざまな方法を用いることができる。例えば、キネシンからのＰｉの放出を定量することができる。一つの好ましい態様では、ＡＴＰアーゼ活性のアッセイ法では０．３ Ｍ ＰＣＡ （過塩素酸）およびマラカイトグリーン試薬 （８．２７ ｍＭ モリブデン酸ナトリウムＩＩ、０．３３ ｍＭ シュウ酸マラカイトグリーン、および０．８ ｍＭ トライトン Ｘ−１００） を使用する。このアッセイ法を行う際には、１０ Ｌの反応を９０ Ｌの冷０．３ Ｍ ＰＣＡ中で急冷する。リン酸の標準を用いることで、データをｍＭ単位の放出無機リン酸に換算することができる。すべての反応物および標準がＰＣＡ中で急冷されたら、１００ Ｌのマラカイトグリーン試薬を、例えばマイクロタイタープレートの該当ウェルに添加する。この混合物を１０〜１５分間反応させ、プレートを６５０ ｎｍの吸光度で読み取る。リン酸標準を使用した場合は、吸光度の読み値を、ｍＭ Ｐｉに換算して経時的にプロットする。また、当技術分野で周知のＡＴＰアーゼアッセイ法にはルシフェラーゼアッセイ法も含まれる。
【０１３５】
例示的なアッセイ法は、以下の二つの特定の溶液を用いて実施することができる。溶液Ａの組成は、１ ｍＭ ＡＴＰ、２ ｍＭ ホスホエノールピルビン酸（溶媒はワーキング緩衝液；２５ ｍＭ Ｐｉｐｅｓ ｐＨ ６．８、２ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ ｍＭ ＥＧＴＡ、１ ｍＭ ＤＴＴ、５ Ｍタキソール、２５ ｐｐｍ 泡止め剤、ｐＨ ６．８）であり、溶液Ｂの組成は０．６ ｍＭ ＮＡＤＨ、０．２ ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１：１００ ＰＫ／ＬＤＨ希釈混合液（Ｓｉｇｍａ）、２００ μｇ／ｍｌ 微小管、１００ ｎＭ ＨｓＫｉｐ１５（〜２．５ ｇ／ｍｌ）である。
【０１３６】
実験を開始するにあたり、被験化合物の１ ｌのＤＭＳＯストックを９６ウェルのハーフエリアプレートの最下列の各ウェルに添加する。対照のウェルにはＤＭＳＯのみを添加する。次に５０ ｌの溶液Ａを各ウェルに添加する。溶液を繰り返しピペッティングして混合した後に、５０ ｌの溶液の一連の希釈液を列の間に繰り返し移す。反応は、５０ ｌの溶液Ｂを添加して開始する。次にプレートをリーダーに挿入し、３４０ ｎＭにおける吸光度を５分間モニタリングする。ハーフエリアプレートで５０ ｌの溶液Ａ＋５０ ｌの溶液Ｂについて認められた速度は約１００ ｍＯＤ／分となるはずである。選択的に一連の希釈液を調製して吸光度を同様に測定する。同様の手順を用いて、被験化合物がＨｓＫｉｆ１５の基礎（すなわち微小管に依存しない）ＡＴＰアーゼ活性に及ぼす阻害作用を調べることができる。以上のアッセイ法では、微小管は溶液Ｂに含めず、ＨｓＫｉｆ１５濃度は少なくとも２ ｍＭまで上昇させる。
【０１３７】
一部の方法では分子モーター活性を、全体が参照として本明細書に組み入れられる「タンパク質修飾物質検出のためにＡＤＰまたはホスフェートを用いた組成物またはアッセイ法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓａｙ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ＡＤＰ ｏｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）」と題して１９９９年５月１８日に申請された米国特許出願第０９／３１４，４６４号に開示された手順で測定する。より具体的には、このアッセイ法では、微小管との相互作用からＡＴＰの加水分解までの範囲におけるキネシンモーター機能の任意の局面の調節因子を検出する。ＡＤＰまたはリン酸をタンパク質活性の読み出された情報として使用する。
【０１３８】
他の方法には、ＨｓＫｉｆ１５タンパク質と候補薬剤を組み合わせる段階、および候補薬剤とＨｓＫｉｆ１５タンパク質との結合を判定する段階が含まれる。一般に複数のアッセイ混合物を、異なる薬剤濃度で平行して実行することで、さまざまな濃度に対する異なる反応が得られる。典型的には、濃度の一つが負の対照、すなわちゼロ濃度または検出レベル以下となる。
【０１３９】
一部の方法では、ＨｓＫｉｆ１５タンパク質に結合可能な候補薬剤を最初に検出するようにスクリーンを設計し、このような薬剤、およびＨｓＫｉｆ１５を調節することが既知である薬剤を、候補薬剤がＨｓＫｉｆ１５活性を調節する能力を評価するアッセイ法に用いる。
【０１４０】
候補薬剤は数多くの化学的クラスを含むが、典型的には有機分子であり、好ましくは１００ダルトン以上で約２，５００ダルトン未満の分子量を有する低分子量の有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、具体的には水素結合に必要な機能性官能基を含み、典型的には少なくとも一つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも二つの機能性官能基を含む。候補薬剤は、上記の機能性官能基の一つまたは複数が置換された環状炭素構造または複素環構造、および／または芳香族または多芳香族の構造を含むことがある。候補薬剤はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体、構造類似物、または組み合わせを含む生体分子中にも見出される。特に好ましいのはペプチドである。
【０１４１】
コンビナトリアルライブラリーを、段階的に合成可能な多くの種類の化合物について作製することができる。このような化合物には、ポリペプチド、タンパク質、核酸、βターン模倣体、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーのＮ−置換グリシン、およびオリゴカルバミン酸などが含まれる。化合物の大規模コンビナトリアルライブラリーは、いずれも参照として全体が本明細書に組み入れられる、アフィマックス（Ａｆｆｙｍａｘ）による国際公開公報第９５／１２６０８号、アフィマックスによる国際公開公報第９３／０６１２１号、コロンビア大学による国際公開公報第９４／０８０５１号、薬局方、国際公開公報第９５／３５５０３、およびスクリプス（Ｓｃｒｉｐｐｓ）による国際公開公報第９５／３０６４２号に記載されているコード合成ライブラリー（ＥＳＬ）法で構築することができる。ペプチドライブラリーもファージディスプレイ法で作製することができる。これについては例えば、デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ）による国際公開公報第９１／１８９８０号を参照されたい。スクリーニングの対象となる化合物は、例えば米国立癌研究所（ＮＣＩ）の自然物貯蔵所（Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、ＮＣＩ公開合成化合物コレクション（ＮＣＩ Ｏｐｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、ＮＣＩの発生薬物療法学プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）などを含む政府または民間の提供先からも得られる。
【０１４２】
候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含むさまざまな供給源から得られる。好ましい態様では、候補薬剤は有機化合物の一部分であり、文献に記載されたさまざまな分子を使用できる。
【０１４３】
提供されるアッセイ法では、本明細書に記載されているようにＨｓＫｉｆ１５タンパク質が用いられる。一つの態様では、ＨｓＫｉｆ１５タンパク質の一部が使用され、好ましい態様では、本明細書に記載されているＨｓＫｉｆ１５活性を有する部分が用いられる。また本明細書に記載されたアッセイ法は、単離されたＨｓＫｉｆ１５タンパク質、またはＨｓＫｉｆ１５タンパク質を含む細胞もしくは動物モデルのいずれかを用いる場合がある。
【０１４４】
他のさまざまな試薬をスクリーニングアッセイ法に含めることができる。これらには、最適なタンパク質間結合の促進、および／または非特異的な相互作用もしくはバックグラウンド相互作用の抑制に使用可能な塩類、中性タンパク質（例えばアルブミン）、または界面活性剤などの試薬が含まれる。それ以外ではアッセイ法の効率を高める試薬（プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤など）が使用される場合もある。化合物の混合物は、必要とされる結合がもたらされるように任意の順序で添加することができる。
【０１４５】
ＶＩＩ．診断アッセイ法およびキット
上述した通り、ＨｓＫｉｆ１５およびその相同体はインビトロにおける有用な診断ツールでもある。このアッセイ法では、ＨｓＫｉｆ１５の核酸に特異的にハイブリッドを形成する、ＨｓＫｉｆ１５に特異的な試薬（ＨｓＫｉｆ１５のプローブおよびプライマーなど）、およびＨｓＫｉｆ１５タンパク質に特異的に結合する、ＨｓＫｉｆ１５に特異的な試薬（例えばＨｓＫｉｆ１５抗体）を使用する。
【０１４６】
試料に含まれるＨｓＫｉｆ１５のＤＮＡおよびＲＮＡの有無を調べる核酸アッセイ法は、有用な診断アッセイ法である。サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクション、Ｓ１分析、ＰＣＲおよびＬＣＲなどの増幅法、ならびにインサイチューハイブリダイゼーションを含む数多くの手法が当技術分野で周知である。インサイチューハイブリダイゼーションでは、例えば標的核酸を細胞環境から解放して、後の解釈および分析のために細胞形態を保ちつつ、細胞内でハイブリダイゼーションに使用できるようにする。以下の記事でインサイチューハイブリダイゼーションについて概説されている：シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２３０〜２５０ （１９８６）；ハーセ（Ｈａａｓｅ）ら、「ウイルス学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」、ｖｏｌ． ＶＩＩ、１８９〜２２６ （１９８４）；および「核酸ハイブリダイゼーション：実際のアプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（Ｈａｍｅｓら編、１９８７）。またＨｓＫｉｆ１５タンパク質を上述のさまざまな免疫アッセイ法で検出することができる。被験試料は典型的には、正の対照（例えば組換えＨｓＫｉｆ１５を発現する試料）と負の対照（例えば酵母に由来する負の試料）の両方と比較する。
【０１４７】
本発明は、Ｈｓｋｉｆ１５の調節因子のスクリーニングに用いるキットも提供する。このようなキットは、容易に入手できる材料および試薬から調製することができる。例えば、このようなキットは、任意の一つまたは複数の以下の材料を含む場合がある：生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５、反応チューブ、およびＨｓＫｉｆ１５活性の検討法を記載した説明書。好ましくはキットは、生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５を含む。さまざまなキットおよび成分は、意図されたキット使用者、および使用者の特定のニーズに応じて本発明で調製することができる。例えばキットは、ＡＴＰアーゼアッセイ法、微小管滑走アッセイ法、または微小管結合アッセイ法に仕様を合わせることができる。
【０１４８】
本発明のキネシン、および特にそのモータードメインを、スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）による米国特許第５，８３０，６５９号に記載された手順で水溶液中の異種混合物からの特定のリガンドの分離に使用することができる。スチュワートによって記載された系では、キネシンモータードメインが、ストレプトアビジンなどのリガンド結合部分に連結されている。キメラのキネシンモータードメインを、固定化されて並べられた微小管をもつチャンネルによって受入チャンバーに連結した、異種混合物を含むローディングチャンバー内に配置させる。ＡＴＰをローディングチャンバーに添加すると、所望のリガンドにリガンド結合部分を介して非共有結合で結合した状態にあるキネシンモータードメインがローディングチャンバーから受入チャンバーへ移動する。したがって、キネシンモータードメインのＡＴＰ駆動性の運動活性によって、所望のリガンドと異種混合物が分離される。スチュワートはさらに、すべてのキネシンモータードメインがこの分離系における使用に適していると述べている。
【０１４９】
本明細書に記載された例および態様は、すべて説明目的であって、それに関してさまざまな変形形態または変更が当業者に示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれることは言うまでもない。本明細書で引用された全ての出版物、特許、および特許出願は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨｓＫｉｆ１５をコードする核酸配列の一つの態様を示す（開始コドンおよび終止コドンを下線および太字で示す）。
【図２】ＨｓＫｉｆ１５の推定アミノ酸配列を示す。
【図３】ＨｓＫｉｆ１５のモータードメイン断片ＨｓＫｉｆ１５Ｍ１Ａ３６７をコードする核酸配列の一つの態様を示す（開始コドンおよび終止コドンを下線および太字で示し、非天然残基を太い字体で示す）。このコンストラクトの産物は、細菌培養物１ Ｌあたり２０ ｍｇを上回るレベルで発現され、精製して微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性のアッセイ時に活性が認められた。
【図４】ＨｓＫｉｆ１５のモータードメイン断片ＨｓＫｉｆ１５Ｍ１Ａ３６７の推定アミノ酸配列を示す。精製を容易に行うために付加された残基は太い字体で示す。
【図５】ＨｓＫｉｆ１５のモータードメイン断片ＨｓＫｉｆ１５Ｍ１Ｐ４０１をコードする核酸配列の一つの態様を示す（開始コドンおよび終止コドンを下線および太字で示し、非天然残基を太い字体で示す）。このコンストラクトの産物は、細菌培養物１ Ｌあたり２０ ｍｇを上回るレベルで発現され、精製して微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性のアッセイ時に活性が認められた。
【図６】ＨｓＫｉｆ１５のモータードメイン断片ＨｓＫｉｆ１５Ｍ１Ｐ４０１の推定アミノ酸配列を示す。
Claims (19)
- 以下の特性を有する微小管モータータンパク質をコードする単離された核酸配列：（ｉ）タンパク質の活性が微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性を含み；および（ｉｉ）配列比較アルゴリズムによる測定時に、タンパク質配列が配列番号：２に対して７０％を上回るアミノ酸配列の同一性を有する。
- タンパク質が配列番号：２を含むタンパク質に対するポリクローナル抗体に特異的に結合する、請求項１記載の単離された核酸配列。
- 配列番号：２をコードする、請求項 １記載の単離された核酸配列。
- 配列番号：１のヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の単離された核酸配列。
- ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１と選択的にハイブリッドを形成する、請求項１記載の単離された核酸配列。
- 以下の特性を有する微小管モータータンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター：（ｉ）タンパク質の活性が微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性を含み；および（ｉｉ）配列比較アルゴリズムによる測定時に、タンパク質配列が配列番号：２に対して７０％を上回るアミノ酸配列の同一性を有する。
- 請求項６記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 配列比較アルゴリズムによる測定時に、配列番号：４または配列番号：６に対して７０％を上回るアミノ酸配列の同一性をもつ、単離された微小管モータータンパク質。
- ＨｓＫｉｆ１５に対するポリクローナル抗体に特異的に結合する、請求項８記載の単離されたタンパク質。
- ＨｓＫｉｆ１５である、請求項８記載の単離されたタンパク質。
- 配列番号：２のアミノ酸配列を有する、請求項８記載の単離されたタンパク質。
- ＨｓＫｉｆ１５のモータードメインに対して作製されたポリクローナル抗体に特異的に結合する、請求項８記載の単離されたタンパク質。
- 配列番号：２、または配列番号：４、または配列番号：６のＨｓＫｉｆ１５のモータードメインのアミノ酸配列を含む、請求項８記載の単離されたタンパク質。
- 以下の段階を含む、ＨｓＫｉｆ１５の調節因子をスクリーニングする方法：
（ｉ）以下の特徴をもつ、生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５を提供する段階：（ｉ）微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性を含む活性；および（ｉｉ）配列比較アルゴリズムによる測定時に、配列番号：２のＨｓＫｉｆ１５に対するアミノ酸配列の同一性が７０％を上回る配列；
（ｉｉ）生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５を試験濃度および対照濃度で候補薬剤に接触させる段階；および
（ｉｉｉ）結合活性またはＡＴＰアーゼ活性からなる群より選択されるＨｓＫｉｆ１５の活性レベルをアッセイする段階であって、試験濃度と対照濃度間における活性の変化が調節因子の存在を示す段階。 - スクリーニングが、高スループットスクリーニングの一部としてマルチウェルプレートで行われる、請求項１４記載の方法。
- 生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５が、配列番号：４または配列番号：６記載のＨｓＫｉｆ１５モータードメインのアミノ酸配列を含む、請求項１４記載の方法。
- 請求項１４記載の方法で同定される、ＨｓＫｉｆ１５を調節する化合物。
- 以下を含む、ＨｓＫｉｆ１５の調節因子のスクリーニング用のキット；
（ｉ）生物学的に活性のあるＨｓＫｉｆ１５を収容する容器；および
（ｉｉ）ＨｓＫｉｆ１５活性（微小管結合活性、または微小管によって活性化されるＡＴＰアーゼ活性）のアッセイ法について記載した説明書。 - ヌクレオチドの配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：５との配列同一性が６０％を上回る配列を含む、単離された核酸。
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