JP2002513289A

JP2002513289A - チロシンホスファターゼ関連疾患の診断および治療および関連する方法

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Publication number: JP2002513289A
Application number: JP54724498A
Authority: JP
Inventors: プローマン，グレッグ・ディー; クラリー，ダグラス; ジャラル，バイジャ; ペレス，エリオール; オンラスト，スーザン; マークビー，デイブ; コートネイジ，サラ・エイ; アップ，ハラルド; ヒューイ，テレンス・エイチ
Original assignee: Sugen LLC
Current assignee: Sugen LLC
Priority date: 1997-04-28
Filing date: 1998-04-27
Publication date: 2002-05-08
Also published as: AU7260098A; WO1998049317A2; WO1998049317A3; EP0979288A2; CA2288221A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ホスファターゼおよびキナーゼ、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含有する細胞、組織および動物、そのようなポリペプチドに対する抗体、そのようなポリペプチドを用いるアッセイ、および上述のすべてに関連する方法に関する。ホスファターゼまたはキナーゼとその結合相手との間の異常な相互作用により特徴づけられるホスファターゼまたはキナーゼ関連疾患または状態を治療、診断、およびスクリーニングするための方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】チロシンホスファターゼ関連疾患の診断および治療および関連する方法発明の分野本発明は、蛋白質チロシンホスファターゼに関する。詳細には、本発明は、我々がＰＴＰ０４，ＳＡＤ，ＰＴＰ０５，ＰＴＰ１０，ＡＬＰ，およびＡＬＫ−７と命名した蛋白質、これらの蛋白質をコードするヌクレオチド配列、および種々の産物、およびこれらの蛋白質に関連する種々の疾患および状態、例えば細胞増殖性疾患の診断および治療に有用な化合物を同定するために用いることができるアッセイ方法に関する。発明の背景以下の記述は、理解を助けるためにのみ提供されるものであり、本発明に対する先行技術であると認めるものではない。細胞シグナル伝達は、多様な細胞過程を調節する外部刺激が細胞内部へ中継される基本的機構である。シグナル伝達の生化学的機構の鍵となるものの一つは蛋白質の可逆的リン酸化を含み、これは成熟蛋白質の構造および機能を変化させることにより成熟蛋白質の活性の制御を可能とする。真核生物において最もよく特徴づけされている蛋白質キナーゼは、セリン、トレオニンおよびチロシン残基のアルコール部分で蛋白質をリン酸化する。これらのキナーゼは、おおまかに２つの群に分けられる。すなわち、セリンおよびトレオニンのリン酸化に特異的なキナーゼ、およびチロシンのリン酸化に特異的なキナーゼである。ある基質のリン酸化状態はまた、蛋白質キナーゼによりある基質に付加されたリン酸基の除去を行う一群の蛋白質により制御される。蛋白質ホスファターゼはまた、セリン／トレオニンまたはチロシンのいずれかに特異的であるものとして分類することができる。既知の酵素は、２つの群、すなわちレセプターおよび非レセプタータイプ蛋白質に分けることができる。ほとんどのレセプタータイプ蛋白質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）は、２つの保存された触媒チロシンホスファターゼドメインを含有し、その各々は、２４０アミノ酸残基のセグメントを包含する（Saito et al,Cell Growth and Diff.2:59-65,1991）。ＲＰＴＰは、その細胞外ドメインのアミノ酸配列の相違に基づいてさらに細分類することができる（Saito,et al,上掲;Krueger,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7417-74 21,1992）。両方のタイプの既知のＰＴＰａｓｅの一次ペプチド配列のアライメントは、触媒ドメインにおけるある程度の配列コンセンサスを示し、このことによりチロシンリン酸化活性を有する蛋白質をコードするｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により同定することが可能となった。多くのキナーゼおよびホスファターゼは、制御カスケードに関与しており、ここでは、その基質は、活性がそのリン酸化状態により制御される他のキナーゼおよびホスファターゼを含む。最終的には、そのような経路の活性化に起因するリン酸化によりいくつかの下流のエフェクターの活性が調節される。チロシンキナーゼおよび／またはチロシンホスファターゼの異常なまたは不適切な活性が、細胞増殖性疾患、例えば癌，繊維症疾患、免疫系の疾患、および糖尿病等の代謝疾患を含む種々のヒトの疾患において役割を果たしていることはよく確立されている。したがって、疾患プロセスを理解し、次に疾患を治療するための治療薬を同定する最初の工程として、新規なチロシンキナーゼおよびホスファターゼを同定する必要が存在する。発明の概要本発明は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡｌｐおよびＡＬＫ−７ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含有する細胞、組織および動物、ポリペプチドに対する抗体、ポリペプチドを用いるアッセイ、および上述のすべてに関連する方法に関する。本発明の第１の観点は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドをコードする、単離された、濃縮された、または精製された核酸分子を特徴とする。核酸に関連して”単離された”とは、互いにコンジュゲートされた１４，１７，２１またはそれ以上のヌクレオチドのポリマーを意味し、天然起源から単離されたまたは合成されたＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。本発明の単離された核酸は、純粋なまたは分離された状態で天然に見いだされないという意味においてユニークである。用語”単離された”とは、天然に生ずる配列がその通常の細胞環境（例えば染色体）から除去されていることを示す。すなわち、配列は、無細胞溶液中にあってもよく、異なる細胞環境中に置かれていてもよい。この用語は、配列が存在する唯一のヌクレオチド配列であることを意味するものではなく、天然にこれに関連している非ヌクレオチド物質が本質的になく（少なくとも約９０−９５％の純度）、したがって単離された染色体とは区別されることを意味する。核酸に関して"濃縮された"との用語を使用することは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、正常のまたは疾患細胞におけるより、またはその配列が由来する細胞におけるより、目的とする細胞または溶液中に存在する全ＤＮＡまたはＲＮＡの顕著に高い割合（２−５倍）を占めることを意味する。これは、存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡの量の優先的減少により、または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の優先的増加により、またはこれら２つの組み合わせにより、人により引き起こすことができる。しかし、"濃縮された"とは、他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味するものではなく、目的とする配列の相対的な量が顕著に増加していることを意味することに注意すべきである。本明細書において、" 顕著に"との用語は、増加のレベルがそのような増加をもたらした者にとって有用であることを示し、一般に他の核酸に対する相対的な増加が少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも５−１０倍またはそれ以上であることを意味する。この用語はまた、他の起源からのＤＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味するものではない。他の起源のＤＮＡとは、例えば、酵母または細菌のゲノム、またはｐＵＣ１９等のクローニングベクターからのＤＮＡを含む。この用語は、配列を１つのｍＲＮＡのレベルが他のｍＲＮＡ種と比較して自然に増加する天然に生ずる濃縮事象、例えばウイルス感染または腫瘍タイプの成長と区別する。すなわち、この用語は、人が介在して所望の核酸の比率を上昇させる状況のみをカバーすることを意味する。ある目的のためには、ヌクレオチド配列が精製された形態であることが有用である。核酸に関して、"精製された"との用語は、絶対的な純度（例えば均質な調製物）を必要とするものではなく、配列が天然の環境におけるよりも比較的純粋であることを示す（このレベルは天然のレベルと比較して少なくとも２−５倍（例えばｍｇ／ｍＬで）高くあるべきである）。ｃＤＮＡライブラリから単離された個々のクローンを精製して電気泳動的に均質にすることができる。これらのクローンから得られた本発明のＤＮＡ分子は、全ＤＮＡまたは全ＲＮＡから直接得ることができる。ｃＤＮＡクローンは、天然に生じないが、好ましくは部分的に精製した天然に生ずる物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作を介して得る。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの構築は、合成物質（ｃＤＮＡ）の作成を含み、純粋な個々のｃＤＮＡクローンは、ｃＤＮＡライブラリを有する細胞のクローン選択により合成ライブラリから単離することができる。すなわち、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの構築および別々のｃＤＮＡクローンの単離を含むプロセスにより、天然のメッセンジャーが約１０⁶倍に精製される。すなわち、少なくとも１桁、好ましくは２−３桁、より好ましくは４−５桁の精製が明示的に意図される。この用語はまた、既に存在する、ＰＴＰ０４，ＳＡＤ，ＰＴＰ０５，ＰＴＰ１０，ＡＬＰ，またはＡｌｋ−７をコードするかもしれないが、クローンのライブラリ中の他のクローンから単離されていないクローンを区別するためにも選択される。すなわち、この用語は、他の非ＰＴＰ０４，非ＳＡＤ，非ＰＴＰ０５，非ＰＴＰ１０，非ＡＬＰまたは非ＡＬＫ−７クローンから単離された、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７をコードするクローンをカバーする。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドは、全長核酸配列または全長核酸配列の任意の部分によりコードされることができる。好ましい態様においては、単離された核酸は、配列番号：１，配列番号：２，配列番号：３，配列番号：４，配列番号：５，配列番号：６，配列番号：７，または配列番号：８に記載される核酸配列、配列番号：１，配列番号：２，配列番号：３，配列番号：４，配列番号：５，配列番号：６，配列番号：７，または配列番号：８に記載される核酸配列にハイブリダイズする核酸配列、またはこれらのいずれかの機能的誘導体（以下に定義される）を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。核酸は、ｃＤＮＡクローニングまたは差異ハイブリダイゼーションにより天然起源から単離することができ、天然起源は哺乳動物（ヒト）血液、精液、または組織であってもよく、核酸は、トリエステルまたは他の方法により、または自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより合成してもよい。 "ハイブリダイズ"との用語は、核酸配列を、溶液中でまたは固体支持体（例えばセルロースまたはニトロセルロース）上で、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子と相互作用させる方法を表す。核酸配列がＤＮＡまたはＲＮＡ分子に高い親和性をもって結合する場合、これはＤＮＡまたはＲＮＡ分子に"ハイブリダイズ"すると言われる。探索配列とその標的との間の相互作用の強度は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させることにより評価することができる。所望の特異性および選択性に応じて種々の低または高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を用いることができる。ストリンジェンシーは、塩または変性剤の濃度を変化させることにより調節する。一般的ガイドラインとして、約９０％より高い相補性を有する領域を有する核酸配列の間のハイブリダイゼーションを得るために、高ストリンジェンシー条件（５０−６５℃、５ＸＳＳＰＣ、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、５０−６５℃、０．５ＸＳＳＰＣでの洗浄）を用いることができる。３５− ４５％より高い相補性を有する領域を有する配列をプローブにハイブリダイズさせるためには、低ストリンジェンシー条件（３５−３７℃、５ＸＳＳＰＣ、４０ −４５％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、４２℃、ＳＳＰＣでの洗浄）を用いることができる。これらの条件はストリンジェンシー条件の例にすぎず、当業者は、これらの条件は特定の実施モードに応じて変更しうることを認識するであろう。ハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、以下の実施例に示される。当業者は、特異性および選択性を変化させるためにどのようにしてそのような条件を変更しうるかを認識するであろう。よりストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件においては、高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは、そのような条件は、２０個の連続するヌクレオチド中に１つまたは２つのミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防ぐ。さらに別の好ましい態様においては、核酸は単離された保存もしくはユニーク領域、例えば、追加のポリペプチドの同定およびクローニングを容易にするハイブリダイゼーションプローブの設計に、または追加のポリペプチドのクローニングを容易にするＰＣＲプローブの設計に有用なものである。 "保存核酸領域"とは、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドをコードする２つまたはそれ以上の核酸中に存在する領域であって、特定の核酸配列が低いストリンジェンシーの条件下でこの領域にハイブリダイズすることができる領域を意味する。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドをコードする核酸のスクリーニングに適した低いストリンジェンシーの条件の例は、Ａｂｅ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９：１３３６１（１９９２）に提供される。好ましくは、保存領域は２０個の連続するヌクレオチド中５個以下で異なる。 "ユニーク核酸領域"とは、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドをコードする全長核酸中に存在し、天然に生ずる他の既知のポリペプチドのいずれをコードする配列中にも存在しない配列を意味する。そのような領域は、好ましくは、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドをコードする全長核酸中に存在する１４，１７，２１またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含む。特に、ユニーク核酸領域は好ましくはヒト起源のものである。本発明はまた、試料中の、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドをコードする核酸を検出するための核酸プローブを特徴とする。核酸プローブは、配列番号：１に記載される少なくとも１４、好ましくは１７，２０または２２個の連続するヌクレオチドの配列に特異的にハイブリダイズするであろう核酸またはその機能的誘導体を含有する。プローブは、好ましくは少なくとも１４，１７またはそれ以上の塩基の長さであり、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７をコードする核酸のユニーク領域に特異的にハイブリダイズするように選択される。好ましい態様においては、核酸プローブは、配列番号：１配列番号：２，配列番号：３，配列番号：４，配列番号：５，配列番号：６，配列番号：７，または配列番号：８に記載される全長配列またはその機能的誘導体の少なくとも１４個の連続するアミノ酸をコードする核酸にハイブリダイズする。所望の特異性および選択性に応じて、種々の低または高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を用いることができる。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においては、高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは、そのような条件は、２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防ぐ。プローブを用いる方法には、ハイブリダイゼーションが生じる条件下で、試料を核酸プローブと接触させ、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ＲＮＡに結合したプローブの存在または量を検出することにより、試料中のＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ＲＮＡの存在または量を検出することを含む。プローブとＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドをコードする核酸配列との間に形成される核酸デュープレックスを、検出された核酸の配列の同定において用いることができる（例えば、Nelson et al.,Noniso topic DNA Probe Techniques,p.275 Academic Press,San Diego(Kricka,ed.,199 2)を参照）。そのような方法を実施するキットは、核酸プローブをその中に置いた容器手段を含むように構築することができる。本発明はまた、組換え核酸、好ましくは細胞または生物中の組換え核酸を特徴とする。組換え核酸は、配列番号：１配列番号：２，配列番号：３，配列番号：４，配列番号：５，配列番号：６，配列番号：７，または配列番号：８に記載される配列またはその機能的誘導体、および宿主細胞において転写を開始するのに有効なベクターまたはプロモーターを含むことができる。あるいは、組換え核酸は、細胞において機能的な転写開始領域、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドをコードするＲＮＡ配列に相補的な配列および細胞中において機能的な転写終結領域を含有することができる。本発明の別の観点は、単離された、濃縮された、または精製されたＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドを特徴とする。 ”ＰＴＰ０４ポリペプチド”とは、配列番号：９に示される配列またはそのフラグメントに実質的に類似するアミノ酸配列を意味する。”ＳＡＤポリペプチド ” とは、配列番号：１０に示される配列またはそのフラグメントに実質的に類似するアミノ酸配列を意味する。"ＰＴＰ０５ポリペプチド"または"ＰＴＰ１０ポリペプチド"とは、配列番号：１１，配列番号：１２，配列番号：１３，または配列番号：１４に示される配列またはそのフラグメントに実質的に類似するアミノ酸配列を意味する。"ＡＬＰポリペプチド"とは、配列番号：１５に示される配列またはそのフラグメントに実質的に類似するアミノ酸配列を意味する。"ＡＬＫ −７ポリペプチド"とは、配列番号：１６に示される配列またはそのフラグメントに実質的に類似するアミノ酸配列を意味する。２つの実質的に類似する配列は、好ましくは互いに少なくとも９０％の同一性（より好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは９９−１００％）を有する。 "同定する"とは、その類似性または関連性を測る配列の特性を意味する。同一性は、２つの配列中の同一の残基の数を残基の総数で割り、その商に１００を乗ずることにより測ることができる。すなわち、正確に同じ配列の２つのコピーは１００％の同一性を有するが、より低い程度に保存され、欠失、付加または置換を有する配列は、より低い程度の同一性を有する。当業者は、配列同一性を決定するいくつかのコンピュータプログラムが利用可能であることを認識するであろう。ポリペプチドに関して”単離された”とは、互いにコンジュゲートした６，１２，１８またはそれ以上のアミノ酸のポリマーを意味し、天然起源から単離されたまたは合成されたポリペプチドを含む。本発明の単離されたポリペプチドは、純粋なまたは分離された形態で自然に見いだされないという意味においてユニークである。"単離された"との用語の使用は、天然に生ずる配列がその通常の細胞環境から除去されていることを表す。すなわち、配列は無細胞溶液中にあってもよく、または異なる細胞環境中に置かれていてもよい。この用語は、配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味するものではなく、これに天然に関連する物質から本質的に遊離していること（少なくとも約９０−９５％の純度）を意味する。ポリペプチドに関して”濃縮された”との用語の使用は、特定のアミノ酸配列が、正常のまたは疾患細胞におけるより、またはその配列が由来する細胞におけるより、目的とする細胞または溶液中に存在する全アミノ酸の顕著に高い割合( ２−５倍)を占めることを意味する。これは、存在する他のアミノ酸の量の優先的減少により、または特定のアミノ酸配列の優先的増加により、またはこれら２つの組み合わせにより、人により引き起こすことができる。しかし、"濃縮された"とは、他のアミノ酸配列が存在しないことを意味するものではなく、目的とする配列の相対的量が顕著に増加していることを意味することに注意すべきである。本明細書において、"顕著に"との用語は、増加のレベルがそのような増加をもたらした者にとって有用であることを示し、一般に他のアミノ酸に対する相対的な増加が少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも５−１０倍またはそれ以上であることを意味する。この用語はまた、他の起源からのアミノ酸が存在しないことを意味するものではない。他の起源のアミノ酸とは、例えば、酵母または細菌のゲノムまたはｐＵＣ１９等のクローニングベクターによりコードされるアミノ酸を含む。この用語は、人が介在して所望の核酸の比率を上昇させる状況のみをカバーすることを意味する。ある目的のためには、アミノ酸配列が精製された形態であることが有用である。ポリペプチドに関して、"精製された"との用語は、絶対的な純度（例えば均質な調製物）を必要とするものではなく、配列が天然の環境におけるよりも比較的純粋であることを示す（このレベルは天然のレベルと比較して少なくとも２−５倍（例えばｍｇ／ｍＬで）高くあるべきである）。少なくとも１桁、好ましくは２−３桁、より好ましくは４−５桁の精製が明示的に意図される。この物質は、好ましくは機能的に有意なレベルの夾雑物を含まず、例えば９０％，９５％または９９％の純度である。別の観点においては、本発明は、単離された、濃縮された、または精製されたＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドフラグメントを特徴とする。 ”ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドフラグメント”とは、配列番号：２に示される全長ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７アミノ酸配列より短いアミノ酸配列を意味する。フラグメントの例としては、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ドメイン，ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７変異体およびＰＴＰ０４−，ＳＡＤ−，ＰＴＰ０５−，ＰＴＰ１０−，ＡＬＰ−，またはＡＬＫ−７− 特異的エピトープが挙げられる。 ”ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ドメイン”とは、１つまたはそれ以上の既知の蛋白質からのアミノ酸配列にホモロジーを有する、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドの部分を意味し、ここで配列はある共通の機能、相互作用または活性を予測させる。ドメインのよく知られた例は、ＳＨ２（Ｓｒｃホモロジー２）ドメイン（Sadowski,et al,Mol.Cell.Biol.6:4396,1986;Pawson and Schlessinger,Curr.Biol.3:434,1993）、ＳＨ３ドメイン（Mayer,et al,Nature 332:272,1988;Pawson and Schlessinger,Curr.Biol.3:434,1993）、およびプレクストリン（ＰＨ）ドメイン（Ponting,TIBS 21:245,1996;Haslam,et al,Nature 363:309,1993）（これらはすべて蛋白質：蛋白質相互作用を媒介するドメインである）、およびキナーゼ触媒ドメイン（Hanks and Hunter,FASEB J 9:576-595 ,1995）である。そのようなホモロジーを検出するよう設計されたコンピュータプログラムが当該技術分野においてよく知られている。相対的ホモロジーは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも３５％である。 "ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７変異体"とは、１つまたはそれ以上のアミノ酸が変更、付加または欠失されている点において天然の配列と異なるＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドを意味する。アミノ酸の変化は、保存的であっても非保存的であってもよい。"保存的"とは、アミノ酸が類似の性質、例えば電荷、疎水性、構造等を有するアミノ酸で置換されていることを意味する。この用語に包含されるポリペプチドの例は、（１）非ＰＴＰ０４、非ＳＡＤ、非ＰＴＰ０５、非ＰＴＰ１０、非ＡＬＰまたは非ＡＬＫ−７ポリペプチド配列、例えばヘマグルチニン（ＨＡ）のポリペプチド配列に融合された、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチド配列の一部を含むキメラ蛋白質、（２）特異的ドメイン、例えば触媒ドメインを欠失した、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７蛋白質および（３）点突然変異を有するＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７蛋白質であるが、これらに限定されない。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７変異体は、いくつかの有用な機能、例えば、天然の結合相手への結合、触媒活性またはＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７特異的抗体（以下に定義される）に結合する能力を保持しているであろう。 ”ＰＴＰ０４−、ＳＡＤ−、ＰＴＰ０５−、ＰＴＰ１０−、ＡＬＰ−またはＡＬＫ−７−特異的エピトープ”とは、抗原性がありかつＰＴＰ０４，ＳＡＤ，ＰＴＰ０５，ＰＴＰ１０，ＡＬＰ，またはＡＬＫ−７にユニークであるアミノ酸の配列を意味する。以下により詳細に記載するように、ＰＴＰ０４−、ＳＡＤ−、ＰＴＰ０５−、ＰＴＰ１０−、ＡＬＰ−またはＡＬＫ−７−特異的エピトープを用いて、ＰＴＰ０４−、ＳＡＤ−、ＰＴＰ０５−、ＰＴＰ１０−、ＡＬＰ−またはＡＬＫ−７−特異的抗体を生成することができる。特に好ましいエピトープは、以下の実施例に示される。 ”組換えＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチド”とは、その存在場所（例えば、天然に見いだされるものとは異なる細胞または組織中に存在する）、純度または構造のいずれかにおいて天然に生ずるポリペプチドと区別されるように、組換えＤＮＡ技術により生成されるポリペプチドを含むことを意味する。一般に、そのような組換えポリペプチドは、天然に通常観察される量とは異なる量で細胞中に存在するであろう。さらに別の観点においては、本発明は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントに対して特異的結合親和性を有する抗体（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）を特徴とする。"特異的結合親和性"とは、特定の条件下で抗体が他のポリペプチドに結合するよりも高い親和性をもって標的ポリペプチドに結合することを意味する。抗体または抗体フラグメントは、他のポリペプチドに結合しうる領域を含有するポリペプチドである。"特異的結合親和性"との用語は、特定の条件下で、他のポリペプチドに結合するよりも高い親和性をもってＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドに結合する抗体を表す。 ”ポリクローナル”との用語は、抗原またはその抗原性機能的誘導体で免疫感作した動物の血清から得られる抗体分子の異種集団である抗体を表す。ポリクローナル抗体の生成のためには、抗原を注射することにより種々の宿主動物を免疫感作することができる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を増加させることができる。 ”モノクローナル抗体”は、特定の抗原に対する抗体の実質的に均質な集団である。これは、連続培養細胞株により抗体分子の生成を与える任意の技術により得ることができる。モノクローナル抗体は、当業者に知られた方法により得ることができる。例えば、Kohler,et al.,Nature 256:495-497(1975),および米国特許4,376,110を参照されたい。 "抗体フラグメント"との用語は、特定の分子に対する特異的結合親和性を発揮する抗体の部分、しばしば超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の一部を表す。超可変領域は、ポリペプチド標的に物理的に結合する抗体の一部である。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントは、抗体とＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドとの間に免疫複合体を形成するのに適当な条件下で試料を抗体で探索し、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ− ７ポリペプチドにコンジュゲートされた抗体の存在および／または量を検出することにより、試料中のＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドの存在および／または量を検出する方法において用いることができる。そのような方法を実施するための診断キットは、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７に特異的な抗体または抗体フラグメント、ならびに抗体の結合相手または抗体それ自身のコンジュゲートを含むように構築することができる。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントは、原核生物または真核生物から単離、濃縮または精製することができる。当業者に知られる日常的な方法により、原核生物および真核生物の両方において抗体または抗体フラグメントを製造することが可能である。ポリペプチド分子である抗体の精製、濃縮および単離は上に記載される。別の観点においては、本発明は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマを特徴とする。"ハイブリドーマ"とは、抗体、例えばＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７抗体を分泌しうる不死化細胞株を意味する。好ましい態様においては、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７抗体は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドに特異的に結合しうるアミノ酸の配列を含む。別の態様においては、本発明はＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−ポリペプチドをコードする精製された核酸を含有する組換え細胞または組織を包含する。そのような細胞においては、核酸はその遺伝的制御要素の制御下にあってもよく、または外来性プロモーターを含む外来性制御要素の制御下にあってもよい。”外来性”とは、その天然の状態では通常はＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドのコード配列に転写的にカップリングしていないプロモーターを意味する。本発明は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７ポリペプチドまたは関連する配列を含むヒト細胞を同定する方法を特徴とする。該方法は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７の同定について本明細書に記載されるような、当該技術分野において日常的かつ標準的な技術（例えば、クローニング、サザンまたはノザンブロット分析、インサイチオハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅等）を用いて、ヒト細胞において新規なポリペプチドを同定することを含む。本発明はまた、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドの天然の結合相手について細胞をスクリーニングする方法を特徴とする。 "天然の結合相手"との用語は、細胞中で目的とする蛋白質に結合する分子またはそれらの分子の部分を表す。天然の結合相手は、ポリペプチドまたは脂質であってもよいが、グルタチオンは含まれない。天然の結合相手は、蛋白質シグナル伝達プロセスにおいてシグナルを伝搬する役割を果たすことができる。蛋白質と天然の結合相手との間の相互作用の変化は、相互作用が形成される増加したまたは減少した可能性、または蛋白質／天然の結合相手の複合体の増加したまたは減少した濃度として表される。蛋白質の天然の結合相手は、高い親和性をもって蛋白質の細胞内領域に結合することができる。高い親和性とは、平衡結合定数が１０^-6Ｍまたはそれより低いことを表す。さらに、天然の結合相手はまた過渡的に蛍白質の細胞内領域と相互作用し、これを化学的に修飾することができる。蛋白質の天然の結合相手は、ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）または３（ＳＨ３）ドメイン、他のホスホリルチロシン結合（ＰＴＢ）ドメイン、グアニンヌクレオチド交換因子、蛋白質ホスファターゼ、および他の蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼを含む群より選択されるが、これらに限定されない。蛋白質とその天然の結合相手との間の相互作用の変化を判定する方法は、当該技術分野において容易に入手可能である。別の観点においては、本発明はＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７の活性を調節しうる物質を同定するためのアッセイを提供する。このようなアッセイはインビトロまたはインビボで実施することができる、既存のアッセイ、例えばＷＯ９６／４０２７６（１９９６年１２月１９日公開）およびＷＯ９６／１４４３３（１９９６年５月１７日公開）に記載されるアッセイを改良することにより、得ることができる。他の可能性としては、標準的基質、例えばＳｒｃキナーゼまたは合成アミノ酸基質に対するホスファターゼ活性の試験がある。このようにして同定された物質は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７活性の増強剤または阻害剤であるかもしれず、ペプチド、天然産物（例えばカビ株から単離されたもの）または小分子量の化学化合物でありうる。好ましい物質は、分子量が５，０００未満、より好ましくは１，０００未満、最も好ましくは５００未満の化合物であろう。本発明により企図されるアッセイおよび物質は、以下により詳細に記載される。好ましい態様においては、本発明は、インビトロでＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７機能の調節剤である化合物を投与することにより、異常な状態を治療または予防する方法を提供する。異常な状態は好ましくは、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７シグナル伝達経路の異常を含み、最も好ましくは癌である。そのような化合物は、好ましくは問題とする疾病または疾患の治療に対応する活性についての１つまたはそれ以上のインビトロアッセイ（例えば、以下の実施例５，１０，１５，２０，および２１に記載されるアッセイ）において陽性の結果を示す。望ましい活性についてスクリーニングすることができる物質の例は、以下のＸＩＶ節に提供される。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７活性の調節剤として同定される物質は、細胞増殖性疾患の動物モデルにおいて、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７の調節の影響を研究するために用いることができる。例えば、マウスの皮下異種移植モデルを用いて、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７活性の阻害剤を、細胞増殖性疾患、例えば白血病またはリンパ腫の治療薬として試験することができる。さらに別の観点においては、本発明は、蛋白質活性の調節剤を同定する方法を提供する。該方法は、以下の工程を含む：ａ）蛋白質を天然の結合相手と接触させることにより捕獲蛋白質を形成し；ｂ）捕獲蛋白質を試験化合物と接触させ；そしてｃ）蛋白質活性を測定する。好ましくは、該方法はまた、蛋白質活性を工程（ａ）の蛋白質と同じアミノ酸配列を有するが天然の結合相手のない対照蛋白質の活性と比較して、調節の程度を判定する工程を含む。 "調節剤"との用語は、蛋白質の活性を変化させる能力を有する化合物を表す。調節剤は、蛋白質の活性を活性化させてもよく、蛋白質に暴露される化合物の濃度に依存して蛋白質の活性を活性化または阻害してもよく、または蛋白質の活性を阻害してもよい。 "調節剤"との用語はまた、蛋白質と天然の結合相手との間に複合体が形成される可能性を増加または減少させることにより、蛋白質の機能を変化させる化合物を表す。調節剤は、好ましくは、蛋白質と天然の結合相手との間にそのような複合体が形成される可能性を増加させ、より好ましくは、蛋白質に暴露される化合物の濃度に応じて蛋白質と天然の結合相手との間に複合体が形成される可能性を増加または減少させ、最も好ましくは、蛋白質と天然の結合相手との間に複合体が形成される可能性を減少させる。本発明の文脈において、”蛋白質の活性”との用語は、細胞内における蛋白質の天然の機能を規定する。蛋白質機能の例としては、触媒活性および天然の結合相手への結合が挙げられるが、これらに限定されない。 "活性化する"との用語は、蛋白質の天然の機能を増加することを表す。蛋白質機能は、好ましくは天然の結合相手との相互作用であり、より好ましくは触媒活性である。 "阻害する"との用語は、蛋白質の細胞性機能を低下させることを表す。蛋白質機能は、好ましくは天然の結合相手との相互作用であり、より好ましくは触媒活性である。本発明の文脈において、"触媒活性"との用語は、蛋白質が基質と反応する速度を規定する。触媒活性は、例えば、生成物に変換された基質の量を時間の関数として決定することにより測定することができる。蛋白質が蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼである場合、基質との反応は、それぞれ基質のリン酸化または脱リン酸化である。基質のリン酸化または脱リン酸化は、蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼの活性部位で生ずる。活性部位は、通常は空洞であり、ここで基質が蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼに結合してリン酸化される。本明細書において用いる場合、"基質"との用語は、酵素により作用される分子を表す。酵素が蛋白質キナーゼである場合、基質は蛋白質キナーゼによりリン酸化される。酵素が蛋白質ホスファターゼである場合、基質は蛋白質ホスファターゼにより脱リン酸化される。 "化合物"との用語は、少なくとも２つのタイプの原子をその構成中に有する分子を表す。分子は小有機分子であってもよい。"有機分子"との用語は、その構造中に少なくとも１つの炭素原子を有する分子を表す。 "複合体"との用語は、互いに結合した少なくとも２つの分子の集合を表す。シグナル伝達複合体はしばしば互いに結合した少なくとも２つの蛋白質分子を含有する。例えば、蛋白質チロシンレセプター蛋白質キナーゼ、ＧＲＢ２，ＳＯＳ，ＲＡＦおよびＲＡＳは、有糸分裂促進リガンドに応答して、集合してシグナル伝達複合体を形成する。本明細書において用いる場合、"接触させる"との用語は、化合物と蛋白質との間の任意の接触を表し、好ましくは化合物を含有する溶液をこの方法の蛋白質が入っている液体媒体と混合することを表す。接触は化合物と蛋白質との間の相互作用を含んでもよい。化合物を含有する溶液を、輸送装置、例えばピペット系装置またはシリンジ系装置を用いることにより、蛋白質が入っている媒体に加えてもよい。本明細書において用いる場合、"蛋白質"とは、独特の二次および三次構造を有する、天然に生ずるまたは化学的に修飾されたポリペプチド鎖を表す。化学的修飾は点突然変異であってもよい。本明細書において用いる場合、"蛋白質"との用語は、人の介在により別の独特のポリペプチド鎖と共有結合で融合するかまたは他の方法で結合しているポリペプチド鎖を含まない。例えば、ＧＳＴ−融合蛋白質は、本明細書において用いられる”蛋白質”との用語に含まれない。本明細書において用いる場合、"捕獲蛋白質"との用語は、その天然の結合相手の１つと接触して、天然の結合相手と複合体を形成した蛋白質を表す。天然の結合相手は、溶液中で遊離であってもよく、固体支持体に結合していてもよく、または固体支持体に結合する能力を有しているが溶液中で遊離であってもよい。 "試験化合物"との用語は、蛋白質の触媒活性に及ぼすその潜在的影響について研究されている化合物を表す。 "対照蛋白質"との用語は、捕獲蛋白質と同じアミノ酸配列を有するが、試験化合物により調節されておらず、試験化合物と接触しておらず、または天然の結合相手と結合していない蛋白質を表す。対照蛋白質の活性は、本発明の技術を用いて測定することができ、そのような活性を、調節された蛋白質の活性と比較することができる。２つの測定された活性のレベルの相違により、調節剤による調節の程度が決定される。本発明は、蛋白質活性の調節剤を同定する方法を提供する。該方法は、好ましくは非放射性の方法である。蛋白質は好ましくは融合蛋白質ではない。最も好ましくは、蛋白質はＧＳＴ−融合蛋白質ではない。蛋白質は、好ましくは酵素、レセプター酵素または非レセプター酵素、より好ましくは蛋白質キナーゼ、最も好ましくは蛋白質チロシンキナーゼである。蛋白質チロシンキナーゼは、好ましくはＺａＰ７０またはＳｙｋである。別の好ましい態様においては、蛋白質は蛋白質チロシンホスファターゼであり、好ましくは蛋白質はＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７である。 "融合蛋白質"との用語は、２つの別々のポリペプチドの共有結合により形成された異種蛋白質を表す。"ＧＳＴ−融合蛋白質"との用語は、ポリペプチドとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の共有結合により形成された異種蛋白質を表す。 "酵素"との用語は、生物学的反応の触媒として作用することができる蛋白質を表す。触媒される生物学的反応の例には、新規結合の形成、水の付加、ホスホリル基の付加、および有機分子の異性体化が含まれるが、これらに限定されない。 "触媒"との用語は、反応中に消費されずに化学反応の速度を増加させる化合物または溶解金属イオンを表す。 "レセプター酵素"との用語は、そのアミノ酸配列の一部が細胞膜中にある酵素を表す。 "非レセプター酵素"との用語は、そのアミノ酸配列のいずれも細胞膜中にない酵素を表す。非レセプター酵素は相互作用、例えば膜の脂肪酸との共有結合を介して膜と会合していてもよい。 "蛋白質キナーゼ"との用語は、アデノシン三リン酸の高エネルギーリン酸を、蛋白質標的中に存在するチロシン、セリンまたはトレオニンのアミノ酸残基に転移する酵素を表す。 "蛋白質チロシンキナーゼ"もしくはＰＴＫとの用語は、アデノシン三リン酸の高エネルギーリン酸を蛋白質標的中に存在するチロシン残基に転移する酵素を表す。 "Ｚａｐ７０"および"Ｓｙｋ"は、Ｓｙｋファミリーの蛋白質チロシンキナーゼであり、２つのタンデムに配置されたＳｒｃ−ホモロジ−２（ＳＨ２）ドメインが存在しかつ膜局在モティーフがないことにより特徴付けられる。これらの蛋白質は、おそらく、蛋白質チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーによりＩＴＡＭモティーフ中の２つのチロシン残基でリン酸化される。 "ＩＴＡＭモティーフ"との用語は、"免疫レセプターチロシンに基づく活性化モティーフ"を表し、Ｔ−細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）(Chan,et al.(1995)The EMBO Journal,14:11,2499-2508)のシグナル伝達サブユニットのすべてにおいて保存されている１６アミノ酸のモティーフ（ＹＸＸＬＸ_6-8ＹＸＸＬ）を表す。 "蛋白質チロシンホスファターゼ"との用語は、蛋白質標的中のホスホチロシンからリン酸基を除去する酵素を表す。好ましい態様においては、上述の蛋白質の１つの天然の結合相手は、固体支持体に結合することができる。天然の結合相手は、好ましくはペプチドであり、より好ましくはホスホペプチドであり、最も好ましくはホスホペプチドはＩＴＡＭモティーフを含む。別の好ましい態様においては、天然の結合相手は脂質を含む。本明細書において用いる場合、"固体支持体"との用語は、分子がそこに結合しうる不溶性表面を表す。固体支持体の例には、ウエルプレート（例えば９６ウエルプレート）、ガラスビーズまたは樹脂（例えばセルロース、アガロース、ポリプロピレン、ポリスチレン等）が含まれるが、これらに限定されない。天然の結合相手は、蛋白質に結合する前にまたは後に、共有結合または非共有結合相互作用のいずれかにより固体支持体に結合させることができる。非共有結合相互作用の例には、水素結合、静電的相互作用および疎水的相互作用が含まれるが、これらに限定されない。 "ペプチド"との用語は、一方のアミノ酸のカルボキシル末端と他方のアミノ末端との間のアミド結合を介して互いに結合している２つまたはそれ以上のアミノ酸の集合を表す。 "ホスホペプチド"との用語は、そのアミノ酸残基の１つに化学的に結合したリン酸基を有するペプチドを表す。 "脂質"との用語は、細胞から低極性有機溶媒により抽出することができる水不溶性物質を表す。脂質の例には、グリセリド、ステロイド、およびテルペンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法により同定される蛋白質活性の調節剤は、好ましくは自己触媒活性、触媒活性または第２の天然の結合相手との結合を調節する。酵素の活性は、酵素とその基質が同一である場合"自己触媒活性"である。いくつかのレセプター蛋白質チロシンキナーゼは、自己触媒活性を示すことができる。好ましい態様においては、本発明は、蛋白質活性の調節剤を同定する方法を提供し、該方法は、捕獲蛋白質を、基質、第２の天然の結合相手および抗体からなる群より選択される１つまたはそれ以上の成分と接触させる工程を含む。該方法は、好ましくは、捕獲蛋白質を形成する前に細胞を溶解させる工程をさらに含む。最も好ましくは、該方法は、蛋白質を捕獲し、蛋白質：天然の結合相手複合体を固体支持体に結合した後、蛋白質活性を測定する前に、固体支持体を洗浄する工程を含む。別の観点においては、本発明は非レセプター酵素活性の調節剤を同定するためのキットを提供し、該キットは、ａ）天然の結合相手；ｂ）固体支持体；およびｃ）基質、第２の天然の結合相手および抗体からなる群より選択される１つまたはそれ以上の成分を含む。上述のキット中の天然の結合相手は、好ましくはペプチドであり、より好ましくはホスホペプチドである。さらに好ましくは、ホスホペプチドはＩＴＡＭモティーフを含む。別の好ましい態様においては、天然の結合相手は脂質を含む。上述した本発明の概要は、非限定的なものであり、本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。図面の簡単な説明図１は、ヒトＰＴＰ０４のアミノ酸配列とそれが最も密接に関連する蛋白質であるネズミＺＰＥＰのアミノ酸配列の比較を示す。２つの配列の間の相対的ホモロジー（約７０％）は、２つの蛋白質が同じＰＴＰファミリーのメンバーであるが、種オルソロガスではないことを示唆する。発明の詳細な説明本発明は、我々がＰＴＰ０４，ＳＡＤ，ＰＴＰ０５，ＰＴＰ１０，ＡＬＰ，およびＡＬＫ−７と名付けた新規蛋白質の単離および特徴付け、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７をコードするヌクレオチド配列、種々のＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７関連疾患および状態、例えば癌の診断および治療に有用な化合物を同定するために用いることができる種々の生成物およびアッセイ方法に関する。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７に由来するポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に開示される配列が与えられれば、よく知られる標準的な合成技術を用いて製造することができる。Ｉ．本発明のポリペプチドＡ．ＰＴＰ０４ＰＴＰ０４は、見かけ上の分子量が約１００ｋＤａのチロシンホスファターゼである。一次配列分析は、ＰＴＰ０４が３つのドメイン、すなわちＮ末端ドメイン、触媒ドメインおよびＣ末端ドメインから構成されることを示す。一般に膜貫通領域に特徴的な疎水性アミノ酸のストレッチがないことは、ＰＴＰ０４が非レセプターチロシンホスファターゼであることを示す。全長ＰＴＰ０４は、元々、ヒト白血病細胞株から単離された。続く正常組織および癌細胞株の両方での発現分析（以下に詳細に示す）は、ＰＴＰ０４がヒト胸腺で発現されており、他の正常細胞では非常に発現が低いが、多くの腫瘍、特に白血病およびリンパ腫において顕著に過剰発現されていることを明らかにした。このことは、ＰＴＰ０４がこれらの癌の成長および維持に重要な役割を果たすことを示唆する。Ｂ．ＳＡＤＳＡＤは、見かけ上の分子量約５５ｋＤａのチロシンキナーゼである。一次配列分析は、ＳＡＤが４つのドメイン、すなわちいずれの既知の配列ともホモロジーを示さないＮ末端のドメイン（ユニークドメイン）、ＳＨ３ドメイン、ＳＨ２ドメインおよび触媒ドメインから構成されることを示す。一般に膜貫通領域に特徴的な疎水性アミノ酸のストレッチがないことは、ＳＡＤが非レセプターチロシンキナーゼであることを示す。アミノ酸配列の比較は、ＳＡＤがＦｒｋファミリーのメンバーであることを示唆する。このファミリーのいくつかの他のメンバーと同様に、ＳＡＤはＳｒｃファミリーのメンバーに特徴的なＮ末端ミリスチル化部位およびＣ末端制御チロシンを欠失している。これはネズミNR-TK Srm（Kohmu ra,et al,Mol.Cell.Bio.14(10):6915,1994）と最も密接に関連しており、触媒ドメインにおいて約８５％の配列ホモロジーを有する（以下の実施例において詳細に議論する）。ＳＡＤは、元々、ヒト乳癌細胞株から単離された。続く正常組織および癌細胞株の両方での発現分析（以下に詳細に示される）は、ＳＡＤが正常細胞で非常に限定的にしか発現されないが、多くの腫瘍において顕著に過剰発現されていることを明らかにした。このことは、ＳＡＤがこれらの癌の成長および維持に重要な役割を果たすことを示唆する。Ｃ．ＰＴＰ０５およびＰＴＰ１０ＰＴＰ０５は、見かけ上の分子量約４９ｋＤａのチロシンホスファターゼである。２つの追加のアイソフォームが同定されており、一方はより大きく（約５４ｋＤａ）および一方はより小さい（約４７ｋＤａ）。一次配列分析は、ＰＴＰ０５が３つのドメイン、すなわちＮ末端ドメイン、触媒ドメインおよびＣ末端ドメインから構成されることを示す。一般に膜貫通領域に特徴的な疎水性アミノ酸のストレッチがないことは、ＰＴＰ０５が非レセプターチロシンホスファターゼであることを示す。ＰＴＰ１０もまたチロシンホスファターゼであり、ＰＴＰ０５と顕著なホモロジーを有する。これらは、一緒にＰＴＰの新規なファミリーを規定する。Ｄ．ＡＬＰＡＬＰは、見かけ上の分子量約１６０−２００ｋＤａのチロシンホスファターゼである。一次配列分析は、ＡＬＰが３つのドメイン、すなわちプロリン残基( ３０．６％)に富み、リン酸化されることができるいくつかのチロシンを含有するＮ末端のドメイン、触媒ドメイン、およびＰＥＳＴモティーフ（Rogers,et al,S cience 234:364,1986）に類似するプロリンおよびセリンに富む領域（４５．６％）を含有するＣ末端ドメインから構成されることを示す。これらのプロリンリッチ領域は、ＳＨ３ドメインがプロリンリッチ領域に結合することが示されているため(Morton and Campbell,Curr.Biol.4:614,1994;Ren,et al,Science 259:11 57,1993)、蛋白質：蛋白質相互作用部位であるかもしれない。一般に膜貫通領域に特徴的な疎水性アミノ酸のストレッチがないことは、ＡＬＰが非レセプターチロシンホスファターゼであることを示す。全長ＡＬＰは、元々ヒト脳癌細胞株から単離された。続く正常組織および癌細胞株の両方での発現分析（以下に詳細に示される）は、ＡＬＰが正常細胞において発現が低いが、多くの腫瘍において顕著に過剰発現されていることを明らかにした。このことは、ＡＬＰがこれらの癌の成長および維持に重要な役割を果たすことを示唆する。Ｅ．ＡＬＫ−７ＡＬＫ−７は、タイプＩレセプターセリン／トレオニンキナーゼ（ＳＴＫレセプター）である。ラットにおいて若干のホモロジーを有する蛋白質が記載されているが(Ryden,et al.J.Biol.Chem.271:30603,1996;Tsuchida,et al.Molec.Cell. Neurosci.7:467,1996）、ヒトＡＬＫ−７は、ラット蛋白質とは異なり、脳のより限定された領域、特に海馬、視床下部核、黒質、下垂体で発現される。この非常に限定された発現パターンは、ニューロンの成長および／または生存におけるヒトＡＬＫ−７の役割、およびパーキンソン病、ハンチントン病、およびアルツハイマー病等の疾患の治療との関連性を強く示唆する。したがって、本発明のポリペプチドおよびヌクレオチド配列は、種々の細胞増殖性疾患および状態、特に不適切なＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７活性に関連する癌の治療薬を開発する上で有用な、細胞成長および生存の調節剤を同定するために用いることができる。細胞内でＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７活性を増強または阻害するよう作用する化合物を同定するためのアッセイは、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ヌクレオチド配列を発現する遺伝子工学処理した細胞株を作成することにより開発することができ、以下により詳細に説明する。ＩＩ．本発明のポリペプチドをコードする核酸本発明の第１の観点は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を特徴とする。本発明の範囲に含まれるものは、本明細書に記載される単離された核酸分子の機能的等価物である。機能的等価物または誘導体は、いくつかの方法により得ることができる。遺伝コードの縮重により、あるコドンを同じアミノ酸を特定する他のコドンで置換し、したがって同じ蛋白質を生成することが可能である。メチオニンとトリプトファンを除いて、既知のアミノ酸は２以上のコドンによりコードされることができるため、核酸配列は実質的に変更することができる。すなわち、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７遺伝子の一部または全部を合成して、配列番号：１配列番号：２，配列番号：３，配列番号：４，配列番号：５，配列番号：６，配列番号：７，または配列番号：８に示される配列とは顕著に異なる核酸配列を得ることができる。しかし、コードされるアミノ酸配列は保存される。さらに、核酸配列は、配列番号：１，配列番号：２，配列番号：３，配列番号：４，配列番号：５，配列番号：６，配列番号：７，または配列番号：８に示される核酸の５’末端および／または３’末端への少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失または置換により生ずるヌクレオチド配列、またはその誘導体を含んでいてもよい。この点に関して、その付加、欠失または置換がヌクレオチド配列によりコードされる配列番号：９，配列番号：１０，配列番号：１１，配列番号：１２，配列番号：１３，配列番号：１４，配列番号：１５，または配列番号：１６のアミノ酸配列を変更しない限り、任意のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いることができる。例えば、本発明は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７核酸配列またはその機能的誘導体の５’末端に開始コドンとしてＡＴＧを付加することにより、または本発明のヌクレオチド配列またはその誘導体の３’末端に終止コドンとしてＴＴＡ，ＴＡＧまたはＴＧＡを付加することにより生ずる任意の核酸配列を含むことを意図する。さらに本発明の核酸分子は、必要な場合には、その５’末端および／または３’末端に付加された制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有していてもよい。ある核酸配列のそのような機能的変更は、それに融合された外来核酸配列によりコードされる異種蛋白質の分泌および／またはプロセシングを促進する機会を与える。したがって、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７遺伝子およびそのフラグメントの、遺伝コードにより許容されるヌクレオチド配列のすべての変種は本発明に含まれる。さらに、コドンを欠失させるかまたは１つまたはそれ以上のコドンを縮重コドン以外のコドンで置換して、構造的に改変されているが、改変されていない核酸分子により生成されるポリペプチドと実質的に同じ用途または活性を有するポリペプチドを生成することが可能である。当該技術分野において認識されるように、核酸分子間の相違が遺伝コードの縮重に関係していない場合でも、２つのポリペプチドは機能的に等価であり、それらを生成する２つの核酸分子も機能的に等価である。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７の機能的等価物または誘導体はまた、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドの１つまたはそれ以上の機能的ドメインをコードする核酸分子を用いることにより得ることができる。ＰＴＰ０４の触媒ドメインは、チロシンアミノ酸上に結合したリン酸分子の酵素的除去剤として機能し、触媒ドメインをコードする核酸配列は、単独でまたは他の異種核酸配列と結合して、ＰＴＰ０４の機能的誘導体であると考えることができる。ＰＴＰ０４の他の機能的ドメインには、Ｎ末端ドメイン中のプロリンリッチ領域およびＣ末端ドメインが含まれるが、これらに限定されない。これらのドメインをコードする核酸配列は配列番号：１に示される：Ｎ末端ドメインは５３−１９６；触媒ドメインは１９７−９３４，Ｃ末端ドメインは９３５−２４７３。ＳＡＤのＳＨ２ドメインは、リン酸化されたチロシンの結合ドメインとして機能し、ＳＨ２ドメインをコードする核酸配列は、単独でまたは他の異種核酸配列と結合して、ＳＡＤの機能的誘導体であると考えられる。ＳＡＤの他の機能的ドメインには、ユニークドメイン、ＳＨ３ドメインおよび触媒ドメインが含まれるが、これらに限定されない。これらのドメインをコードする核酸配列は配列番号：２に示される：Ｎ末端ユニークドメインはおよそ４９−２１３；ＳＨ３ドメインはおよそ２１４−３７５；ＳＨ２ドメインはおよそ４０６−６８４；触媒ドメインはおよそ７３６−１４８８。ＰＴＰ０５の触媒ドメインは、チロシン残基上に結合したリン酸分子を除去するよう機能し、触媒ドメインをコードする核酸配列は、単独でまたは他の異種核酸配列と結合して、ＰＴＰ０５の機能的誘導体であると考えられる。これらの蛋白質の他の機能的ドメインには、Ｎ末端ドメイン中のプロリンリッチ領域およびＣ末端ドメインが含まれるが、これらに限定されない。これらのドメインをコードする核酸配列は配列番号：３に示される：Ｎ末端ドメインはおよそ１９９−７５９；触媒ドメインはおよそ７６０−１４５８，Ｃ末端ドメインはおよそ１４５９−１４７６。ＡＬＰのＮ末端プロリンリッチドメインは、ＳＨ３結合ドメインとして機能し、Ｎ末端プロリンリッチドメインをコードする核酸配列は、単独でまたは他の異種核酸配列と結合して、ＡＬＰの機能的誘導体であると考えることができる。ＡＬＰの他の機能的ドメインには、Ｎ末端プロリンリッチドメイン中のプロリンリッチ領域、Ｃ末端プロリン／セリンリッチドメイン、Ｃ末端プロリン／セリンリッチドメイン中のプロリン／セリンリッチ領域、および触媒ドメインが含まれるが、これらに限定されない。これらのドメインをコードする核酸配列は、配列番号：７に示される：Ｎ末端ドメインは３１３−２８８３；プロリンリッチ領域は１３６９−２６４３；触媒ドメインはおよそ２８８４−３６００；Ｃ末端プロリン／セリンリッチドメインは３６０１−４１３４；プロリン／セリンリッチ領域は３６１３−４４５６。ＡＬＫ−７の細胞外ドメインは、リガンドまたは共レセプター結合ドメインとして機能し、細胞外ドメインをコードする核酸配列は、単独でまたは他の異種核酸配列と結合して、ＡＬＫ−７の機能的誘導体であると考えることができる。ＡＬＫ−７の他の機能的ドメインには、シグナル配列、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインおよび触媒ドメインが含まれるが、これらに限定されない。これらのドメインをコードする核酸配列は、配列番号：８に示される：シグナル配列は１５５ −２２９;細胞外ドメインは１５５−４９３;膜貫通ドメインは４９４−５６８；細胞内ドメインは５６９−１６３３；触媒ドメインはおよそ７３１−１６０９。成熟蛋白質においては、細胞外ドメインからシグナル配列が切断されることに注意すべきである。ＩＩＩ．本発明の蛋白質を検出するための核酸プローブ本発明の核酸プローブは、通常のハイブリダイゼーション方法により適当な染色体またはｃＤＮＡライブラリを探索して、本発明の別の核酸分子を得るために用いることができる。染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは、当該技術分野において認識されている方法にしたがって、適当な細胞から調製することができる（例えば"ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ"，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ編集，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９を参照）。別法においては、目的とするポリペプチのアミノ酸配列のＮ−末端およびＣ− 末端部分に対応するヌクレオチド配列を有する核酸プローブを得るために化学合成を実施する。すなわち、合成された核酸プローブをプライマーとして用いて、認識されているＰＣＲ技術にしたがって、本質的にＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，"ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ｍｉｃｈａｅｌｅｔａｌ．編集，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９９０にしたがって、適当な染色体またはｃＤＮＡライブラリを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施し、本発明のフラグメントを得ることができる。当業者は、本明細書に開示される配列に基づいて、当該技術分野において知られるコンピュータアライメントおよび配列分析の方法を用いて、そのようなプローブを容易に設計することができる（例えば、"ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ"，第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ編集，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９を参照）。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、標準的な標識技術、例えば放射性標識、酵素標識、蛍光標識、ビオチン−アビジン標識、化学発光等を用いて標識することができる。ハイブリダイゼーションの後、既知の方法を用いてプローブを可視化することができる。本発明の核酸プローブは、ＲＮＡならびにＤＮＡプローブ、およびプローブが本明細書に記載される条件下で特異的にハイブリダイズする能力を保持するかぎり、糖、リン酸、または塩基部分で修飾された核酸を含む。このようなプローブは当該技術分野において知られる技術を用いて生成することができる。核酸プローブは、固体支持体上に固定化することができる。そのような固体支持体の例には、ポリカーボネート等のプラスチック、アガロースおよびセファロース等の複合炭水化物およびポリアクリルアミドおよびラテックスビーズ等のアクリル樹脂が含まれるが、これらに限定されない。核酸プローブをこのような固体支持体にカップリングさせる技術は、当該技術分野においてよく知られている。本発明の核酸探索方法に適した試験試料としては、例えば、細胞または細胞の核酸抽出物、または生物学的液体が含まれる。上述の方法において用いられる試料は、アッセイフォーマット、検出方法、およびアッセイすべき組織、細胞または抽出物の性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は、当該技術分野においてよく知られており、用いられる方法に適合した試料を得るために容易に適用することができる。ＩＶ．本発明の蛋白質を検出するための、プローブに基づく方法およびキット試料中におけるＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７の存在を検出する１つの方法は、次の工程を含む：（ａ）ハイブリダイゼーションが生ずるような条件下で、試料を上述の核酸プローブと接触させ、そして（ｂ）核酸分子に結合したプローブの存在を検出する。当業者は、上述したように、当該技術分野において知られる技術にしたがって核酸プローブを選択することができる。試験すべき試料には、ヒト組織のＲＮＡ試料が含まれるが、これに限定されない。試料中におけるＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７の存在を検出するためのキットは、上述の核酸プローブがその中に置かれた少なくとも１つの容器手段を含む。キットはさらに、以下のものの１つまたはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい：洗浄剤および結合した核酸プローブの存在を検出しうる試薬。検出試薬の例としては、放射性標識プローブ、酵素標識プローブ（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、およびアフィニティー標識プローブ（ビオチン、アビジンまたはストレプトアビジン）が挙げられるが、これらに限定されない。詳細には、区画化されたキットには、試薬が別々の容器に入れられている任意のキットが含まれる。そのような容器には、小さいガラス容器、プラスチック容器またはプラスチックもしくは紙のストリップが含まれる。そのような容器は、試料および試薬が相互夾雑しないように、かつ各容器の薬剤または溶液を定量的様式で１つの区画から他の区画に加えられるように、試薬を１つの区画から他の区画に効率的に移すことを可能とする。このような容器には、試験試料を受け取る容器、アッセイにおいて用いられるプローブまたはプライマーを含む容器、洗浄試薬（リン酸緩衝食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液等）を含む容器、およびハイブリダイズしたプローブ、結合した抗体、増幅された産物等を検出するために用いられる試薬を含む容器が含まれるであろう。当業者は、本発明において記載される核酸プローブを、当該技術分野においてよく知られている確立されたキットフォーマットの１つに、アッセイにおいてそのような試薬を用いることに関する一組の指示とともにまたは指示なしで、容易に取り込ませることができることを容易に認識するであろう。Ｖ．ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰまたはＡＬＫ−７核酸分子を含むＤＮＡ構築物およびこれらの構築物を含有する細胞本発明はまた、宿主細胞において転写を開始するのに有効なプロモーターおよび上述の核酸分子を５’から３’方向に含む組換えＤＮＡ分子に関する。さらに、本発明は、ベクターおよび上述の核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。本発明はまた、細胞において機能的な転写領域、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドまたはその機能的誘導体に対応するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列、および前記細胞において機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は、単離されたおよび／または精製されたＤＮＡ分子でありうる。本発明はまた、本明細書に記載されるＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７核酸分子を含み、このことによりペプチドを発現しうる細胞または生物に関する。ポリペプチドは、ポリペプチドを発現するよう変更されている細胞から精製することができる。細胞が、遺伝的操作によって、この細胞が通常は産生しない蛋白質または通常は低いレベルで産生する蛋白質を産生するように作成されるとき、細胞は、"所望のポリペプチドを発現するよう変更される"と言われる。当業者は、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成配列を真核生物または原核生物細胞内に導入し発現させる方法を容易に適用することができる。核酸分子、例えばＤＮＡは、転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチド配列を含有し、かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に "動作可能なように連結"されている場合、ポリペプチドを"発現しうる"と言われる。動作可能な連結とは、制御ＤＮＡ配列および発現が求められるＤＮＡ配列が、遺伝子配列の発現を許容するように接続されている連結である。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異なるであろうが、一般には、プロモーター領域を含み、原核生物においてはプロモーター（これはＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびにＲＮＡに転写されたときに合成開始を指示するＤＮＡ配列を含む。そのような領域は、通常は、転写および翻訳の開始に関与する５’−非コード配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャピング配列、ＣＡＡＴ配列等を含む。所望ならば、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７遺伝子をコードする配列の３’側の非コード領域を上述のクローニング方法により得ることができる。この領域は、終止およびポリアデニル化等の転写終止制御配列を保持していてもよい。すなわち、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７遺伝子をコードするＤＮＡ配列に天然に連続する３’−領域を保持することにより、転写終止シグナルを与えることができる。転写終止シグナルが発現宿主細胞において十分に機能的ではない場合、宿主細胞において機能的な３’領域で置き換えることができる。２つのＤＮＡ配列（例えばプロモーター領域配列およびＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７配列）は、２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異を導入しない、（２）プロモーター領域配列がＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７遺伝子配列の転写を指示する能力を妨害しない、または（３）ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７遺伝子配列がプロモーター領域配列により転写される能力を妨害しない、である場合、動作可能なように連結されていると言われる。すなわち、プロモーター領域は、プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を行うことができる場合、ＤＮＡ配列に動作可能なように連結されている。すなわち、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７遺伝子を発現させるためには、適当な宿主により認識される転写および翻訳のシグナルが必要である。本発明は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７遺伝子（またはその機能的誘導体）を原核生物または真核生物細胞のいずれかにおいて発現させることを包含する。原核生物宿主は一般に、組換え蛋白質の製造に非常に有効かつ便利であり、したがって、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７遺伝子について好ましい発現系の１種である。原核生物は、非常にしばしばＥ．ｃｏｌｉの種々の株で代表される。しかし、他の細菌株を含む他の微生物株も用いることができる。原核生物系においては、宿主と適合性のある種に由来する複製部位および制御配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクターの例には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等が含まれ；適当なファージまたはバクテリオファージベクターには、ラムダｇｔ１０、ラムダｇｔ１１等が含まれ、適当なウイルスベクターには、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ、ｐＫＲＣ等が含まれる。好ましくは、本発明の選択されたベクターは、選択された宿主細胞中において複製する能力を有する。認められている原核生物宿主には、Ｅ．ｃｏｌｉ、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ等の属からの細菌が含まれる。しかし、このような条件下で、ペプチドはグリコシル化されないであろう。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプリコンおよび調節配列と適合性がなければならない。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７（またはその機能的誘導体）を原核生物細胞中で発現させるためには、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７配列を機能的原核生物プロモーターに動作可能なように連結することが必要である。そのようなプロモーターは、構成的であってもよく、より好ましくは制御可能である（すなわち、誘導可能または脱抑制可能）。構成的プロモーターの例には、バクテリオファージラムダのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のベータ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター、およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のＣＡＴプロモーター等が含まれる。誘導可能な原核生物プロモーターの例には、バタテリオファージラムダの主要右および左プロモーター（Ｐ_LおよびＰ_R）、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃＩ、およびｇａｌプロモーター、α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎｅｔａｌ．，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２（１９８５））およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのシグマ−２８−特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＳｅｑｕｅｎｃｅ３２：１１−２０（１９８４））、バチラスのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＢａｃｉｌｌｉ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９８２））、および放線菌プロモーター（Ｗａｒｄｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８（１９８６））が含まれる。原核生物プロモーターは、Ｇｌｉｃｋ（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ．１：２７７−２８２（１９８７））；Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ６８：５０５−５１６（１９８６））；およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５− ４４２（１９８４））により論評されている。原核生物細胞における正しい発現にはまた、遺伝子配列をコードする配列の上流に、リボソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位は、例えば、Ｇｏｌｄｅｔａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５−４０４（１９８１））に開示されている。調節配列、発現ベクター、トランスフォーメーション方法等の選択は、遺伝子を発現させるために用いられる宿主細胞のタイプに依存する。本明細書において用いられる場合、"細胞"、"細胞株"、および"培養細胞"は、互いに交換可能なように用いられ、すべてのそのような呼称は子孫を含む。すなわち、"トランスフォーマント"または"トランスフォームされた細胞"との用語は、移動（ｔｒａｎｓｆｅｒ）の数に関わらず、初代対象細胞およびそれに由来する培養物を含む。すべての子孫は、意図的なまたは偶然の変異のため、ＤＮＡ含有物が精密に同一ではないかもしれないことが理解されるであろう。しかし、定義されるように、変異体子孫は、最初にトランスフォームされた細胞と同じ機能性を有する。本発明の発現系において用いられる宿主細胞は、厳密に限定されるものではないが、ただし所望のＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ペプチドの発現に適したものである。適当な宿主は、しばしば、真核生物細胞を含む。好ましい真核生物宿主には、例えば、インビボまたは組織培養中の、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞が含まれる。宿主として有用でありうる哺乳動物細胞には、ＨｅＬａ細胞、繊維芽細胞起源の細胞、例えばＶＥＲＯ、３Ｔ３またはＣＨＯ−Ｋ１、またはリンパ球起源の細胞（例えば３２Ｄ細胞）およびそれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿主細胞には、ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ、ならびに神経芽細胞種細胞株、例えばＩＭＲ３３２およびＰＣ１２が含まれ、これらは正しい翻訳後プロセシングに関してよりよい能力を提供するであろう。さらに、植物細胞もまた宿主として利用可能であり、植物細胞に適合可能な調節配列、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ、およびノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能である。別の好ましい宿主は、昆虫細胞、例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｌａｒｖａｅである。昆虫細胞を宿主として用いる場合、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１４５３−１４５９（１９８８））。あるいは、バキュロウイルスベクターを遺伝子操作して、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７を昆虫細胞中で大量に発現させることができる（Ｊａｓｎｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１６５３(１９８７)；Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９８６），Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２７７−２９７）。酵母をグルコースの豊富な培地中で成長させるときに大量に産生される解糖系酵素をコードする、活発に発現される遺伝子配列からのプロモーターおよび終止要素を取り込んだ一連の酵母遺伝子配列発現系のいずれも用いることができる。既知の解糖系遺伝子配列はまた非常に効率的な転写制御シグナルを提供することができる。酵母は、翻訳後ペプチド修飾をも実施することができる点において、実質的な利点を提供する。強いプロモーター配列および高いコピー数のプラスミドを用いる多数の組換えＤＮＡ戦略が存在し、所望の蛋白質を酵母中で発現させるためにこれらを用いることができる。酵母は、クローン化された哺乳動物遺伝子配列産物中のリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレ−ペプチド）を分泌する。哺乳動物宿主については、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７の発現のために、いくつかの可能なベクター系が利用可能である。特に好ましい酵母発現系は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｏｃｙｃｅｓｐｏｍｂｅを用いる系である。この系は、Ｓｒｃファミリー（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，ｅｔａｌ，ＥＭＢＯＪ．１２：２６２５，１９９３）のメンバーおよび他のＮＲ−ＴＫの活性を研究するのに有用である。宿主の性質に依存して、広範な種類の転写および翻訳制御配列を用いることができる。転写および翻訳制御シグナルは、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス、サルウイルス等の、ウイルス起源に由来するものでもよい。この場合、制御シグナルは、高いレベルの発現を有する特定の遺伝子配列と関連している。あるいは、哺乳動物発現産物、例えばアクチン、コラーゲン、ミオシン等からのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは、遺伝子配列の発現を調節しうるように、抑制または活性化を可能とするように選択することができる。興味あるものは、温度を変化させることにより発現を抑制または開始させるような温度感受性、または化学的に（代謝物等）制御される制御シグナルである。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７の真核生物宿主における発現には、真核生物制御領域の使用が必要である。このような領域は、一般に、ＲＮＡ合成の開始を指示するのに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターには、例えば、マウスメクロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２））；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ３１：３５５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０（１９８１））；酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５(１９８２)；Ｓｉｌｖｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５（１９８４））が含まれる。真核生物ｍＲＮＡの翻訳は、最初のメチオニンをコードするコドンで開始される。この理由のため、真核生物プロモーターと、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７（またはその機能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の結合が、メチオニンをコードしうる介在コドン（すなわちＡＵＧ）を含まないことを確実にすることが好ましい。そのようなコドンの存在は、融合蛋白質（ＡＵＧコドンがＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７コード配列と同じリーディングフレームにある場合）またはフレームシフト変異（ＡＵＧコドンがＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７コード配列と同じリーディングフレームにない場合）のいずれかを引き起こす。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７核酸分子および動作可能なように連結されたプロモーターは、非複製ＤＮＡ（またはＲＮＡ）分子として、受容原核生物または真核生物細胞に導入することができ、これは線状分子であってもよく、または好ましくは閉じた共有環状分子（プラスミド）であってもよい。このような分子は自動複製をすることができないため、遺伝子の発現は導入された配列の過渡的発現により生ずるであろう。あるいは、導入されたＤＮＡ配列の宿主染色体中へのインテグレーションにより、永久発現が生ずるかもしれない。所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中にインテグレートしうるベクターを用いることができる。その染色体中に導入されたＤＮＡを安定にインテグレートして有する細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１つまたはそれ以上のマーカーをも導入することにより、選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主への栄養、抗生物質等の殺生物剤または銅等の重金属に対する耐性を与えることができる。選択マーカー遺伝子配列は、発現すべきＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよく、またはコトランスフェクションにより同じ細胞に導入してもよい。一本鎖の結合蛋白質ｍＲＮＡの最適な合成にはさらなる要素が必要であろう。これらの要素には、スプライシングシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルが含まれる。このような要素を取り込んだｃＤＮＡ発現ベクターには、Ｏｋａｙａｍａ（Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９８３））により記載されたものが含まれる。導入された核酸分子は、受容宿主において自動複製可能なプラスミドまたはウイルスベクター中に取り込むことができる。広範な種類のベクターの任意のものをこの目的に用いることができる。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する上で重要な因子には、ベクターを含む受容細胞をベクターを含まない受容細胞から認識し選択することの容易さ；特定の宿主中において所望されるベクターのコピー数；およびベクターを異なる種の宿主細胞間で"シャトル"しうることが望ましいか否かが含まれる。好ましい原核生物ベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製可能なプラスミド等のプラスミドが含まれる（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＶＸ）。このようなプラスミドは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（例えば"ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ"，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ編集，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）を参照）により開示されている。バチラスプラスミドには、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７等が含まれる。このようなプラスミドは、Ｇｒｙｃｚａｎ（ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＢａｃｉｌｌｉ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８２），ｐｐ．３０７−３２９）により開示されている。適当な放線菌プラスミドには、ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌｅｔａｌ．，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３（１９８７）），およびｆＣ３１（Ｃｈａｔｅｒｅｔａｌ．，ＳｉｘｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓＢｉｏｌｏｇｙ，ＡｋａｄｅｍｉａｉＫａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ（１９８６），ｐｐ．４５−５４）等の放線菌バクテリオファージが含まれる。シュードモナスプラスミドは、Ｊｏｈｎｅｔａｌ．（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４（１９８６））、およびＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２（１９７８））により論評されている。好ましい真核生物プラスミドには、例えば、ＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、２−ミクロン環等、またはこれらの誘導体が含まれる。このようなプラスミドは当該技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，ＭｉａｍｉＷｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４（１９８２）；Ｂｒｏａｃｈ，"ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：ＬｉｆｅＣｙｃｌｅａｎｄＩｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ"，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０（１９８１）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ２８：２０３−２０４（１９８２）；Ｂｏｌｌｏｎｅｔａｌ．，ＪＣｔｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９−４８（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＴｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，ＧｅｎｅＳｅｑｕｅｎｃｅＥｘｐｒｅｓｓｉｓｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．５６３−６０８（１９８０）。構築物を含有するベクターまたは核酸分子が一旦発現用に調製されたら、種々の適当な手段のいずれか、例えばトランスフォーメーション、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション等により、ＤＮＡ構築物を適当な宿主細胞中に導入する。ベクターを導入した後、ベクターを含有する細胞の成長を選択する選択培地中で受容細胞を成長させる。クローン化遺伝子分子の発現は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７またはそのフラグメントもしくは機能的誘導体の生成を引き起こす。これはトランスフォームした細胞においてそのまま起こりうるが、これらの細胞を誘導して分化させた後に行うこともできる（例えば、神経芽細胞種の細胞にブロモデオキシウラシルを投与することによる等）。本発明のペプチドを形成するために、種々のインキュベーション条件を用いることができる。最も好ましい条件は、生理学的条件を模倣するものである。ＶＩ．本発明のポリペプチドまた、本発明は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドを特徴とする。当該技術分野において知られる種々の方法論を用いて、本発明のペプチドを得ることができる。ペプチドは、天然にペプチドを産生する組織または細胞から精製してもよい。あるいは、上述の単離された核酸配列を用いて、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７蛋白質を組換え的に発現させることができる。起源生物が天然に本発明のペプチドを含有する限り、任意の真核生物を本発明のペプチドの起源として用いることができる。本明細書において用いられる場合、"起源生物"とは、その中で蛋白質が発現される生物、および最終的にその生物から単離される生物にかかわらず、アミノ酸配列がその生物に由来する元の生物を表す。当業者は、天然の夾雑物を含まないペプチドを得るために、蛋白質を単離するための既知の方法に容易にしたがうことができる。これらには、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、およびイムノアフィニティークロマトグラフィーが含まれるが、限定されるものではない。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７蛋白質は、すべての蛋白質と同様に、異なる機能的ユニットもしくはドメインから構成される。真核生物においては、いわゆる小胞経路（バルクフロー）を介して区分けされる蛋白質は、通常Ｎ末端にシグナル配列（リーダーペプチドとも称される）を有し、これは、ＥＲ（小胞体）膜を通る移動の後に切断除去される。いくつかのＮ末端シグナル配列は切断除去されず、膜貫通セグメントとして残るが、このことはこれらの蛋白質がＥＲ中に残ることを意味しない。これらの蛋白質はさらに区分けされベヒクル中に取り込まれることができる。ＳＡＤ蛋白質は、疎水的シグナル配列を欠失しており、非レセプター蛋白質として分類される。蛋白質を特定の細胞の位置に標的化することに関与する他のモティーフには、ミトコンドリアマトリックス（Gavel and von Heijne,Prot Eng4 :33,1990）、核（Robbins,et al,Cell 64:615,1991）、ペルオキシゾーム、小胞体（Jackson,et al,EMBO J 9:3253,1990）、小胞性経路（Bendiak,Biophys Res Comm 170:879,1990）、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）脂質アンカー、およびリソソームオルガネラに選択的なモティーフ、および標的蛋白質を脂質膜、例えばミリスチル化（Towler,et al,Annu Rev Biochem 57:69,19 88）およびファルネシル化部位に標的化するモティーフがある。ＳＡＤ蛋白質のＮ末端の１５アミノ酸は、膜標的化に関与するアルギニン含有量の高いＮ末端ストレッチ、および続くミトコンドリア膜内空間への移動のシグナルを与える無極配列の二部構造を有する、ミトコンドリア膜蛋白質を規定する特徴に適合している。非レセプター蛋白質は、一般に、蛋白質：蛋白質相互作用の部位を提供するか、またはある触媒活性（触媒ドメイン中に含有される）を有するか、しばしばその両方により、細胞中にシグナルを伝達するよう機能する。これらの種々のドメインの存在を予測する方法は、当該技術分野においてよく知られている。蛋白質：蛋白質相互作用ドメインは、他の蛋白質と比較することにより同定することができる。ＳＨ２ドメインは、例えば、蛋白質ＳｒｃとＦｐｓの間の保存配列領域として最初に同定された約１００アミノ酸の蛋白質ドメインである（Sadowski,e t al,Mol.Cell.Bio.6:4396,1986）。同様の配列は後に多くの他の細胞内シグナル伝達蛋白質において見いだされている。ＳＨ２ドメインは、配列特異的様式でかつ厳格にリン酸化依存様式で高い親和性をもってホスホチロシン−含有蛋白質と相互作用することにより、細胞内シグナリングカスケードの制御モジュールとして機能する（Mayer and Baltimore,Trends Cell.Biol.3:8,1993）。キナーゼまたはホスファターゼ触媒ドメインは、キナーゼまたはホスファターゼ活性を有する他の既知の触媒ドメインと比較することにより同定することができる。例えば、Hanks and Hunter,FASEB J.9:5761-595,1995を参照されたい。レセプター蛋白質はまた、膜中でαヘリックスであると考えられる疎水的膜貫通セグメントを有し、ある程度このことにより定義される。膜蛋白質はまた、２つの側面に関して特異的様式で（細胞質／細胞内または細胞質外／細胞外）細胞膜中に一体化され、これは膜トポロジーと称される。一体化膜蛋白質の細胞外部分はしばしばリガンド結合ドメインとして機能するが、一方、細胞内部分は一般に、蛋白質：蛋白質相互作用の部位を提供することにより、またはある程度の触媒活性を有することにより（触媒ドメイン中に含有される）、またはしばしばその両方により、シグナルを細胞内に伝達するよう機能する。これらの種々のドメインの存在を予測する方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、シグナル配列に関しては、D.J.McGeoch,Virus Research 3:271,1985,またはG. von Heijne,Nucl.Acids Res.14:4683,1986を、膜貫通ドメインに関しては、P.Kl ein,et al.,Biochim.Biophys.Acta 815:468,1985を、膜トポロジーの予測に関しては、S.J.Singer,Ann.Rev.Cell Biol.6:247,1990またはE.Hartmann,et al.,Pro c.Natl.Acad.Sci.USA,86:5786,1989を参照されたい。キナーゼ触媒ドメインは、キナーゼ活性を有する他の既知の触媒ドメインと比較することにより同定することができる。例えば、Hanks and Hunter,FASEB J.9:576-595,1995を参照されたい。ＰＴＰ０４アミノ酸配列（配列番号：９に示される）の一次配列分析は、これがシグナル配列または膜貫通ドメインを有さず、したがって、細胞内蛋白質であることを明らかにした。既知の蛋白質配列との比較は、ＰＴＰ０４がいくつかのユニークドメインから構成されることを明らかにした。これらには、４８アミノ酸のＮ末端ドメイン（配列番号：９のアミノ酸番号１−４８に示される）、２４５アミノ酸の触媒ドメイン（配列番号：９のアミノ酸番号４９−２９４に示される）および５１２アミノ酸のＣ末端ドメイン（配列番号：９のアミノ酸番号２９５−８０７に示される）が含まれる。ＳＡＤアミノ酸配列（配列番号：１０に示される）の一次配列分析は、これが４つの異なるドメインを含有することを明らかにした。これらには、およそ５５アミノ酸のＮ末端ユニークドメイン（配列番号：１０のアミノ酸番号１−５５に示される）、およそ５４アミノ酸のＳＨ３ドメイン（配列番号：１０のアミノ酸番号５６−１０９に示される）、およそ９３アミノ酸のＳＨ２ドメイン（配列番号：１０のアミノ酸番号１２０−２１２に示される）、およそ２５１アミノ酸の触媒ドメイン（配列番号：１０のアミノ酸番号２３０−４８０）および８アミノ酸のＣ末端テール（配列番号：１０のアミノ酸４８１−４８８に示される）が含まれる。ＰＴＰ０５アミノ酸配列（配列番号：１１に示され、そのアイソフォームは配列番号：１２および配列番号：１３に示される）の一次配列分析は、この蛋白質およびそのアイソフォームがシグナル配列または膜貫通ドメインを含有せず、したがって、細胞内蛋白質であることを明らかにした。既知の蛋白質配列との比較は、ＰＴＰ０５がいくつかのユニークドメインから構成されることを明らかにした。これらには、１８７アミノ酸のＮ末端ドメイン（配列番号：１１のアミノ酸番号１−１８７に示される）、２４２アミノ酸の触媒ドメイン（配列番号：１１のアミノ酸番号１８８−４２０に示される）および５アミノ酸のＣ末端ドメイン（配列番号：１１のアミノ酸番号４２１−４２６に示される）が含まれる。ＰＴＰ０５の２つの追加のアイソフォームも同定された："長い"型（配列番号：１２）および"Ｃ切断"型（配列番号：１３）。"長い"型は、Ｎ末端ドメインに３７アミノ酸の挿入部（配列番号：１２のアミノ酸４４−８０）を有し、これはこのドメインを２２４アミノ酸に延長する。触媒ドメインは配列番号：１２のアミノ酸２２５−４５７に延び、Ｃ末端ドメインは配列番号：１２のアミノ酸４５８−４６３に延びる。"Ｃ切断"型は、配列番号：３のヌクレオチド１４１５−１５０７の欠失により生じ、これはおそらく代替エクソンスプライシングによるものであろう。この欠失により、Ｃ末端２１アミノ酸がユニークな７アミノ酸配列に置き換わっている。この変化は、触媒ドメインの保存Ｃ末端部分を除去しており、このことは酵素活性に影響を与えるかもしれない。"Ｃ切断"型のＮ末端ドメインは、配列番号：１３のアミノ酸１−８７に、触媒ドメインは配列番号：１３のアミノ酸１８８−４０５に、およびユニークＣ末端ドメインは配列番号：１３の４０６−４１２に延びる。ＡＬＰアミノ酸配列（配列番号：１５に示される）の一次配列分析は、これがシグナル配列または膜貫通ドメインを含有せず、したがって、細胞内蛋白質であることを明らかにした。既知の蛋白質配列との比較は、ＡＬＰがいくつかのユニークドメインから構成されることを明らかにした。これらには、８５７アミノ酸のＮ末端プロリンリッチドメイン（配列番号：15のアミノ酸番号１−８５７に示される）、この中のプロリンリッチ領域（配列番号：１５のアミノ酸番号３５３ −７７７）、２３８アミノ酸の触媒ドメイン（配列番号：１５のアミノ酸番号８５８−１０９６に示される）、および１７７アミノ酸のＣ末端プロリン／セリンリッチドメイン（配列番号：１５のアミノ酸番号１０９７−１２７４に示される）、この中のプロリン／セリンリッチ領域（配列番号：１５のアミノ酸番号１１０１−１２１４に示される）が含まれる。ＡＬＫ−７アミノ酸配列（配列番号：１６に示される）の一次配列分析は、これがタイプＩＳＴＫレセプターに特徴的なすべてのモティーフを含むことを明らかにした。これには、２５アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号：１６のアミノ酸番号１−２５に示される）、８８アミノ酸のシステインリッチ細胞外領域（配列番号：１６のアミノ酸番号２６−１１３に示される）、１つの２５アミノ酸の膜貫通ドメイン（配列番号：１６のアミノ酸番号１１４−１３６に示される）、およびＧＳドメインおよび触媒ドメイン（配列番号：１６のアミノ酸番号１９３−４８５）を含む３５５アミノ酸細胞質ドメイン（配列番号：１６のアミノ酸番号１３７−４９３に示される）が含まれる。細胞外ドメインは、すべてのタイプＩＳＴＫレセプター（ten Dijke,et al. ,Oncogene 8:2879,1993;Bassinge,et al.,Science 263:87,1994;Massague,Trend s Cell Biol.4:172,1994）中に存在する１０個のシステインを保存しており、また３つの潜在的Ｎ−＝結合グリコシル化部位を含む。ＡＬＫ−７の分岐した細胞外ドメイン配列（ＡＬＫ−４およびＡＬＫ−５に対して２８−３０％の同一性）は、これがユニークリガンド／タイプＩＩＳＴＫレセプター特異性を有するかもしれないことを示唆する。ラットＡＬＫ−７−様蛋白質は、タイプＩＩＴＧＦベータレセプターおよびＡＣＴＲＩＩとの複合体中でＴＧＦ−ベータおよびアクチビンに結合することが見いだされている。しかし、これらのリガンドはヒトＡＬＫ−７と同じ細胞タイプでは発現されず、このことは代替のリガンドを示唆する。ＡＬＫ−７−特異的リガンドの候補には、他のＴＧＦ−ベータ、例えばＴＧＦ−ベータ２、ＧＤＦ−１およびＧＤＮＦの相同体、例えばニュートリン（ｎｅｕｔｕｒｉｎ）が含まれ、これらは、ＡＬＫ−７と同様のパターンでニューロンにおいて発現されることが示されている。細胞内ドメインは、他のＡＬＫ蛋白質に対していくぶんより相同性があり、特に触媒ドメインにおいて他のタイプＩＳＴＫレセプターに対して８３％の同一性を示す。しかし、膜貫通ドメイン（膜近傍ドメイン）の最もＮ末端の４０アミノ酸は、他のＡＬＫとの比較においてきわめてユニークである。これらのＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ドメインは種々の用途を有する。そのような用途の例は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７触媒ドメインおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等の異種蛋白質から構成されるポリペプチドを作成することである。このようなポリペプチドは、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７基質特異性を研究するのに、またはＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７触媒活性を調節しうる物質を同定するのに有用な、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７触媒活性の生化学的アッセイにおいて用いることができる。あるいは、当業者は、３つの主要なドメインの少なくとも１つを欠失したＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドを作成することができる。そのようなポリペプチドは、細胞内で発現された場合、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７の天然の結合相手と複合体を形成することができるが、シグナルを細胞内の下流にさらに伝達することができない。すなわち、これはシグナリング不全であり、したがって、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７活性の生物学的関連性を研究するのに有用であろう（例えば、Gishizky,et al,PNAS:10889,1995を参照）。ＶＩＩ．本発明のポリペプチドに対する結合親和性を有する抗体および抗体を含有するハイブリドーマ本発明はまた、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体に関する。ポリペプチドは、配列番号：２に記載されるアミノ酸配列を有していてもよく、またはそのフラグメントであってもよく、またはその少なくとも６個の連続するアミノ酸であってもよい。このような抗体は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドに対する抗体の結合親和性を他のポリペプチドに対するその結合親和性と比較することにより同定することができる。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７に選択的に結合するものが、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７と他のポリペプチドとを区別することを必要とする方法において用いるために選択されるであろう。このような方法としては、他のポリペプチドを含む組織における変化したＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７発現の分析および全細胞を用いるアッセイ系を挙げることができるが、これに限定されるべきではない。本発明のＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ペプチドを用いて、抗体またはハイブリドーマを製造することができる。当業者は、抗体が望まれる場合、そのようなペプチドを本明細書に記載されるように生成し、免疫原として用いることができることを認識するであろう。この目的のために好ましいＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ペプチドは、以下の実施例４に示される。本発明の抗体には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体のフラグメント、およびヒト化形態が含まれる。本発明の抗体のヒト化形態は、キメラ化またはＣＤＲグラフト等の、当該技術分野において知られる方法の１つを用いて生成することができる。本発明はまた、上述のモノクローナル抗体またはその結合フラグメントを産生するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマは特定のモノクローナル抗体を分泌することができる不死化細胞株である。一般に、モノクローナル抗体およびハイブリドーマを調製する技術は当該技術分野においてよく知られている(Ｃａｍｐｂｅｌｌ、"ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ"，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４）；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３５：１−２１（１９８０）)。抗体を産生することが知られている任意の動物（マウス、ウサギ等）を、選択されたポリペプチドで免疫感作することができる。免疫感作の方法は当該技術分野においてよく知られている。このような方法には、ポリペプチドの皮下または腹膜内注射が含まれる。当業者は、免疫感作に用いるポリペプチドの量が、免疫感作される動物、ポリペプチドの免疫原性、および注射部位により様々であることを認識するであろう。ポリペプチドは、ペプチドの抗原性を増加させるために、修飾するかまたはアジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法は当該技術分野においてよく知られている。このような方法には、抗原を異種蛋白質（例えばグロビンまたはβ−ガラクトシダーゼ）とカップリングさせること、または免疫感作の間にアジュバントを含有させることが含まれる。モノクローナル抗体については、免疫した動物からの牌臓細胞を除去し、ミエローマ細胞、例えばＳＰ２／０−Ａｇｌ４ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞となるようにする。当該技術分野においてよく知られている多くの方法の任意のものを用いて、所望の特性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定することができる。これらには、ハイブリドーマをＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイ（Ｌｕｔｚｅｔａｌ．，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．１７５：１０９−１２４（１９８８））でスクリーニングすることが含まれる。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、当該技術分野において知られる方法を用いてクラスおよびサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ"，上掲（１９８４））。ポリクローナル抗体については、免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し、上述の方法の１つを用いて、所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングする。上述の抗体は、検出可能なように標識することができる。抗体は、放射性同位体、アフィニティー標識（例えば、ビオチン、アビジン等）、酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等）、常磁性原子等を用いることにより、検出可能なように標識することができる。このような標識を行う方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、以下のものを参照されたい（Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）；Ｂａｙｅｒｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８，１９７９；Ｅｎｇｖａｌ，ｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｍｎｏ１．１０９：１２９（１９７２）；Ｇｏｄｉｎｇ，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６））。標識された本発明の抗体は、インビトロ、インビボおよびインサイチオアッセイにおいて用いて、特定のペプチドを発現する細胞または組織を同定することができる。上述の抗体はまた、固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例には、ポリカーボネート等のプラスチック、アガロースおよびセファロースのような複合炭水化物、ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズなどのアクリル樹脂が含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術は、当該技術分野においてよく知られている（Ｗｅｉｒｅｔａｌ．，"ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"４ｔｈＥｄ．，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ．Ｃｈａｐｔｅｒ１０（１９８６）；Ｊａｃｏｂｙｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９７４））。本発明の固定化された抗体は、インビトロ、インビボおよびインサイチオアッセイ、ならびに免疫クロマトグラフィーにおいて用いることができる。さらに、当業者は、現在利用可能な方法ならびに抗体に関して上述した技術、方法およびキットを容易に適用して、合理的に設計された抗ペプチド−ペプチドを生成するために、特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを生成することができる。例えば、Ｈｕｒｂｙｅｔａｌ．，"ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓ：ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＰｅｐｔｉｄｅｓ"，ＩｎＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓ，ＡＵｓｅｒ’ｓＧｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，ｐｐ．２８９−３０７（１９９２），およびＫａｓｐｃｚａｋｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：９２３０−８（１９８９）を参照されたい。ＶＩＩＩ．本発明のポリペプチドを検出するための、抗体に基づく方法およびキット本発明は、（ａ）試料を免疫複合体が形成するような条件下で上述の抗体と接触させ、そして（ｂ）ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検出することにより、試料中のＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドを検出する方法を包含する。詳細には、該方法は、試験試料を１つまたはそれ以上の本発明の抗体とともにインキュベートし、抗体が試験試料に結合するか否かをアッセイすることを含む。試料中のＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７の、正常レベルと比較して変化した（増加または減少）レベルは、疾患を表すであろう。抗体を試験試料とともにインキュベートする条件は様々である。インキュベート条件は、アッセイにおいて用いられるフォーマット、用いられる検出方法、およびアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質に依存する。当業者は、慣用的に利用可能な免疫学的アッセイフォーマット（例えばラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ、拡散系オクタロニー、またはロケット免疫蛍光アッセイ）の任意のものを容易に適用して、本発明の抗体を用いることができることを認識するであろう。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ， "ＡｎＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙａｎｄＲｅｌａｔｅｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋｅｔａｌ．，"ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬＶｏｌ．１（１９８２），Ｖｏｌ．２（１９８３），Ｖｏｌ．３（１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，"ＰｒａｃｔｉｃｅａｎｄＴｈｅｏｒｙｏｆＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ"，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）に見られる。本発明の免疫学的アッセイ試験試料には、細胞、蛋白質または細胞の膜抽出物、または血液、血清、血漿、または尿等の生物学的液体が含まれる。上述の方法において用いられる試験試料は、アッセイフォーマット、検出方法、およびアッセイすべき試料として用いられる組織、細胞または抽出物の性質により様々であろう。細胞の蛋白質抽出物または膜抽出物を調製する方法は当該技術分野においてよく知られており、用いられる系に適合しうる試料を得るために、容易に適用することができる。キットは、先に記載した検出の方法を実施するために必要な試薬のすべてを含む。キットは、（ｉ）上述の抗体を含む第１の容器手段、および（ｉｉ）抗体の結合パートナーおよび標識を含むコンジュゲートを含む第２の容器手段を含むことができる。別の好ましい態様においては、キットはさらに、洗浄試薬および結合した抗体の存在を検出しうる試薬の１つまたはそれ以上を含む１つまたはそれ以上の他の容器を含む。検出試薬の例には、標識二次抗体が含まれるが、これに限定されるものではなく、あるいはまた、一次抗体が標識されている場合、標識された抗体と反応することができる発色団、酵素、または抗体結合試薬が含まれる。区画化されたキットは、核酸プローブキットについて上述したとおりである。当業者は、本発明において記載される抗体を、当該技術分野においてよく知られた確立されたキットフォーマットの１つの中に容易に取り込ませることができることを容易に認識するであろう。ＩＸ．本発明のポリペプチドの天然の結合相手の単離本発明はまた、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドに結合しうる天然の結合相手を検出する方法に関する。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７の天然の結合相手は、例えば、シグナリングカスケードの一部として脱リン酸化される基質蛋白質でありうる。結合相手は、複雑な混合物、例えば血清、体液または細胞抽出物中に存在していてもよい。一般に、天然の結合相手を同定する方法は、物質をＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７とともにインキュベートし、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７に結合した物質の存在を検出することを含む。好ましい方法は、Flelds and Song（上掲）の２−ハイブリッド系および共免疫沈殿を含む。Ｘ．本発明のポリペプチドの活性を調節しうる物質の同定および使用本発明はまた、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７活性を調節しうる物質を検出する方法に関する。そのような物質は、活性を増強するか（アゴニスト）または活性を阻害する（アンタゴニスト）ことができる。アゴニストおよびアンタゴニストは、ペプチド、抗体、天然起源（例えば真菌または植物抽出物）からの産物、または小分子量有機化合物でありうる。一般に、小分子量有機化合物が好ましい。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７の調節活性について試験することができる化合物群の例は、チアゾール類（例えば継続中の米国特許出願６０／０３３，５２２，０８／６６０，９００）およびナフトピロン類（米国特許５，６０２，１７１）であるが、これらに限定されない。一般に、該方法は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７を産生する細胞を試験物質の存在下でインキュベートし、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７活性またはＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７結合相手の活性のレベルの変化を検出することを含む。活性の変化は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドの増加したまたは減少したリン酸化、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７基質の増加したまたは減少したリン酸化、または細胞における増加したまたは減少した生物学的応答により表すことができる。人工的基質のリン酸化を用いてＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７活性の調節を検出する方法が以下の実施例に示される。生物学的応答には、例えば、増殖、分化、生存または運動性が含まれうる。このようにして同定された物質は、物質のアゴニスト性またはアンタゴニスト性を示す活性の変化を生成するであろう。いったん物質が同定されれば、精製された形態で既に利用可能でない場合には、当該技術分野においてよく知られた技術を用いてこれを単離することができる。本発明はまた、哺乳動物においてＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７関連活性をアゴナイズ（刺激）またはアンタゴナイズする方法を包含する。該方法は、前記哺乳動物にＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７に対するアゴニストまたはアンタゴニストを、前記アゴニズムまたはアンタゴニズムをもたらすのに十分な量で投与することを含む。また、本願発明は、哺乳動物において、ＰＴＰ０４−、ＳＡＤ−、ＰＴＰ０５−、ＰＴＰ１０−、ＡＬＰ− またはＡＬＫ−７−関連活性のアゴニストまたはアンタゴニストで疾患を治療する方法を包含する。該方法は、哺乳動物に、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７関連機能をアゴナイズまたはアンタゴナイズするのに十分な量でアゴニストまたはアンタゴニストを投与することを含む。特定の化合物を、それ自身でまたは化合物が適当な担体または賦形剤と混合物されている医薬組成物中で患者に投与することができる。患者の治療においては、治療的に有効な用量の化合物が投与される。治療的に有効な用量とは、患者において症状の改善または生存の延長をもたらす化合物の量を表す。そのような化合物の毒性および治療的有効性は、例えば、ＬＤ₅₀（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ₅₀（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するために、培養細胞または実験動物における標準的薬理学的方法により決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比は治療の指標であり、ＬＤ₅₀／ＥＤ₅ ₀ の比率で表すことができる。高い治療指標を示す化合物が好ましい。これらの培養細胞アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトにおいて用いるための用量の範囲の処方に用いることができる。そのような化合物の用量は、好ましくは毒性がほとんどないか全くないＥＤ₅₀を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、用いられる投与形態および用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化しうる。本発明の方法において用いられるいずれの化合物についても、治療上有効な用量は、最初に培養細胞アッセイから見積もることができる。例えば、動物モデルにおいてある用量を処方して、培養細胞において決定されたＩＣ₅₀を含む循環血漿濃度範囲（すなわち、蛋白質複合体の最大の破壊の半分または細胞レベルおよび／または複合体成分の活性の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を達成することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定する。血漿中のレベルは、例えば、ＨＰＬＣにより測定することができる。実際の処方、投与の経路および用量は、個々の医師により、患者の状態に基づいて選択される（例えば、Fingl et al.,1975,in"The Pharmacological Basis o f Therapeutics",Ch.1 p1を参照）。担当の医師は、毒性または臓器不全のために、いつどのようにして投与を終了、中断または調節すべきかがわかることに注意すべきである。逆に、担当の医師はまた、臨床応答が適当でない場合には（除外毒性）、治療をより高いレベルに調節することがわかる。投与される用量の程度は、問題とする癌疾患の管理において、治療されるべき状態の重篤度および投与の経路により変化するであろう。？？？状態の重篤度は、例えば、標準的な予後評価方法により部分的に評価することができる。さらに、用量、およびおそらくは投与頻度もまた、個々の患者の年齢、体重、および応答により様々であろう。上で議論したことに適合するプログラムを獣医薬において用いることができる。治療されるべき特定の状態に応じて、そのような薬剤を処方し、全身または局所的に投与することができる。処方および投与の技術は、"Remingtons Pharmaceutical Sciences,"1990,18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA.に見いだすことができる。適当な経路としては、若干の例を挙げると、経口、直腸、経皮、経膣、経粘膜、または腸内投与；筋肉内、皮下、随内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、腹膜内、鼻腔内、または眼内注射等の非経口輸送がある。注射用には、本発明の薬剤は、水性溶液、好ましくは生理学的に適合性のある緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的緩衝化食塩水中で処方することができる。そのような経粘膜投与のためには、障壁を透過させるのに適当な透過剤が処方中に用いられる。そのような透過剤は一般に当該技術分野において知られている。本明細書に開示される化合物を、薬学的に許容しうる担体を用いて本発明の実施のために全身投与に適当な用量に処方することは、本発明の範囲内である。担体の適切な選択および適当な製造の実施により、本発明の組成物、特に溶液として処方されたものは、例えば静脈内注射により非経口投与することができる。化合物は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体を用いて、経口投与に適当な用量に容易に処方することができる。そのような担体は、本発明の化合物を、治療されるべき患者による経口摂取のための錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することを可能とする。細胞内に投与することが意図される薬剤は、当業者によく知られる技術を用いて投与することができる。例えば、そのような薬剤は、リポソーム中に封入し、次に上述するように投与する。リポソームは水性の内部を有する球状の脂質二重層である。リポソーム形成時に水性溶液中に存在するすべての分子は、水性内部に取り込まれる。リポソーム成分は、外部微小環境から保護され、かつ、リポソームが細胞膜と融合するために効率的に細胞質内に運搬される。さらに、その疎水性のため、小有機分子は直接細胞内に投与することができる。本発明において用いるのに適した医薬組成物には、活性成分がその意図される目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。有効量の決定は、特に本明細書に提供される開示に基づいて、当業者の能力の範囲内である。活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物を薬学的に用いることができる製剤にするプロセシングを容易にする賦形剤および補助剤を含む薬学的に許容しうる適当な担体を含んでいてもよい。経口投与用に処方された製剤は、錠剤、糖衣錠、カプセルまたは溶液の形態であろう。本発明の医薬組成物は、それ自体知られる方法、例えば、慣用の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠形成、すりつぶし、乳化、封入、取り込み、または凍結乾燥の工程により製造することができる。非経口投与のための医薬処方には、水溶性形態の活性化合物の水性溶液が含まれる。さらに、活性化合物の懸濁液を適当に油性の注射懸濁液として調製することができる。適当な親油性溶媒またはベヒクルには、脂肪油（例えばゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド）、またはリポソームが含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含んでいてもよい。懸濁液はまた任意に、適当な安定化剤または化合物の溶解性を増加させて高度に濃縮された溶液を調製することを可能とする試薬を含んでいてもよい。経口使用のための医薬調製物は、活性化合物を固体賦形剤と混合し、得られた混合物を任意にすりつぶし、所望の場合には適当な補助剤を加えた後に顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得ることにより得ることができる。適当な賦形剤は、特に、糖等の充填剤であり、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトール；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が挙げられる。所望の場合には、分散剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム等のアルギン酸塩を加えてもよい。糖衣錠コアは、適当なコーティングを施して提供される。この目的のために、濃縮した糖溶液を用いることができ、これは任意に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含んでいてもよい。確認のために、または活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴づけるために、色素または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに加えてもよい。経口的に用いることができる医薬調製物としては、ゼラチンから形成されるプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤から形成される軟質の密封カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、および任意に、安定化剤の混合物中に活性成分を含むことができる。軟質カプセルにおいては、活性化合物は脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコール等の適当な液体に溶解するかまたは懸濁することができる。さらに安定化剤を加えてもよい。ＸＩ．トランスジェニック動物本発明はまた、インビボ系での複合体中のＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７活性の研究に有用なトランスジェニック動物を企図する。本発明に関連したトランスジェニック動物の生産には種々の方法が利用可能である。ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７をコードするＤＮＡ配列を、オスおよびメス前核融合の前に、受精卵の前核内に注入でき、または細胞分割後の胚細胞の前核（例えば、二細胞胚の前核）内に注入できる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４４３８−４４４２（１９８５））。胚は、本発明の無機イオンレセプターヌクレオチド配列を運ぶように修飾されたウイルス（特にレトロウイルス）で感染することができる。胚の内部細胞塊から誘導され、培養で安定化された多分化能性幹細胞は培養物中で本発明のヌクレオチド配列を取り込むように操作できる。そのような細胞を胚盤胞内へ移植し、それを偽母内へ移植して出産させることによりトランスジェニック動物が生産できる。トランスジェニック実験に適した動物はＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）、ＨａｒｌａｎＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）その他の普通の商業的供給源から入手可能である。齧歯類胚の操作および接合体の前核内へのＤＮＡのマイクロインジェクションの方法は当業者にはよく知られている（Ｈｏｇａｎｅｔａｌ．，前記文献）。魚、両生類卵および鳥類のためのマイクロインジェクション法はＨｏｕｄｅｂｉｎｅａｎｄＣｈｏｕｒｒｏｕｔ，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ４７：８９７ −９０５（１９９１）に詳述されている。動物の組織内へＤＮＡを導入する他の方法が米国特許第４，９４５，０５０号（Ｓａｎｄｆｏｒｄら、１９９０年７月３０日）に記載されている。例示のためのみに示すのであるが、トランスジェニックマウスを製造するにはメスを過排卵に誘導する。メスをオスとともに置き、交尾したメスをＣＯ₂窒息または断頭により殺して切除した卵管から胚を回収する。取り囲んでいる卵丘細胞を取り除く。前核胚は次に洗浄し、インジェクションの時まで保存する。不定周期の成体メスマウスを精管切除したオスと対にする。受容メスは供与メスと同じ時に交尾させる。胚は手術により移される。トランスジェニックラットを発生させる方法はマウスと同様である。Ｈａｍｒｎｅｒｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ６３：１０９９−１１１２（１９９０）を参照されたい。胚幹（ＥＳ）細胞を培養し、続いてエレクトロポレーション、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈殿および直接的注入のような方法を用いたＥＳ細胞内へのＤＮＡ導入によるトランスジェニック動物の製造も当業者にはよく知られている。例えば、ＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓａｎｄＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ（１９８７）。ランダム遺伝子インテグレーションが関与する場合、本発明の配列を含むクローンは耐性をコードしている遺伝子とともにコトランスフェクトされる。もしくは、ネオマイシン耐性をコードしている遺伝子が本発明の配列に物理的に連結される。所望のクローンのトランスフェクションおよび単離は、当業者にはよく知られているいくつかの方法の一つにより実施される（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、上記文献）。ＥＳ細胞内へ導入されたＤＮＡ分子は相同的組換えの過程を通して染色体内へ組込むこともできる。Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８８− １２９２（１９８９）。組込みの陽性選択（即ちｎｅｏ耐性）および二重陽性− 陰性選択（即ちｎｅｏ耐性およびガンシクロビル耐性）および続いてのＰＣＲによる所望のクローンの同定のための方法はＣａｐｅｃｃｈｉ（前記文献）およびＪｏｙｎｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３８：１５３−１５６（１９８９）に記載されており、それらの教示は本明細書において援用される。本方法の最後の段階は胚盤胞内への標的化されたＥＳ細胞の注入および偽妊娠メスへの胚盤胞の移送である。得られたキメラ動物を繁殖させ、子孫をサザンブロッティングにより分析してトランスジンを運んでいる個体を同定する。非齧歯類哺乳類および他の動物生産のための方法は別のところに記載されている。ＨｏｕｄｅｂｉｎｅａｎｄＣｈｏｕｒｒｏｕｔ（前記文献）；Ｐｕｒｓｅｌｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８１−１２８８（１９８９）およびＳｉｍｍｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１７９−１８３（１９８８）を参照されたい。すなわち、本発明はＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドをコードしているトランスジン、またはＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドの発現に影響している遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳類を提供する。そのようなトランスジェニック非ヒト哺乳類は、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドを導入する、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドの発現を調節する（即ち、追加の遺伝子、アンチセンス核酸またはリボザイムの導入を通して）影響を研究するためのインビボ試験系として特に有用である。 ”トランスジェニック動物”とは、人工的に細胞内へ挿入され、動物のゲノムの一部となり、細胞から発現されるＤＮＡを含む細胞を持っている動物である。好適なトランスジェニック動物は霊長類、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡは、ヒトＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドをコードしていてもよい。動物における天然の発現は、レセプターの発現を減少させるのに有効量のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを提供することにより減少するであろう。ＸＩＩ．遺伝子治療ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７、またはその遺伝的配列（変異したものも変異していないものも含む）はまた、遺伝子治療（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３５７：４５５-４６０、（１９９２）に概説されている）にも有用であろう。Ｍｉｌｌｅｒは実用的な最初の結果を示したヒト遺伝子治療へ実際に応用されるまでに進歩したことを述べている。遺伝子治療の基本的科学はＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：９２６− ９３１，（１９９３）に記載されている。一つの好適な態様において、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７をコードする配列または上述のＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７変異体をコードする配列を含む発現ベクターが細胞内へ挿入され、細胞はインビトロで増殖され、多数の細胞が患者に注入される。別の好適な態様においては、選択されたプロモーター（例えば、強力なプロモーター）を含んでいるＤＮＡセグメントが、内在性ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７を含んでいる細胞内へ、プロモーターセグメントが内在性ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７遺伝子の発現を促進するような様式で細胞内へ導入される（例えば、プロモーターセグメントは内在性ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７遺伝子へ直接連結する様に細胞へ導入される）。遺伝子治療は、適当な細胞タイプを標的としたＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ｃＤＮＡを含有するアデノウイルスの使用、遺伝子工学処理した細胞の移植によるＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７の全身的増加、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ウイルスの注射，または裸のＰＴＰ０４，ＳＡＤ，ＰＴＰ０５，ＰＴＰ１０，ＡＬＰ，ｏｒＡＬＫ−７ＤＮＡの適当な細胞または組織、例えばニューロンへの注射を含むであろう。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、いくつかのＲＮＡウイルス、またはウシパピローマウイルスのようなウイルスから誘導される発現ベクターは、組換えＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７蛋白質をコードしているヌクレオチド配列（例えば、ｃＤＮＡ）を標的細胞集団（例えば、腫瘍細胞またはニューロン）内へ送達するために使用することができる。当業者によく知られる方法を用いて、コード配列を含有する組換えウイルスベクターを構築することができる。例えば、Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989),およびAusubel et al.,Current Pr otocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Inte rscience,N.Y.(1989)に記載されている技術を参照されたい。もしくは、蛋白質配列をコードしている組換え体核酸分子は裸のＤＮＡとして、または再構築系（例えば、標的細胞へ送達するためのリポソームまたはその他の脂質系）で使用できる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３７：３８７ −８，１９８９を参照されたい）。ヒト遺伝子治療で使用するための、蛋白質へのプラスミドＤＮＡの複合体化による細胞上のレセプターへのＤＮＡの標的化を含む、細胞内へのプラスミド直接送達のためのいくつかの他の方法が存在する。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ、前記文献、を参照されたい。その最も単純な形において、遺伝子導入はマイクロインジェクション法により、単に微量のＤＮＡを細胞の核内へ注入することにより実施できる。ＣａｐｅｃｃｈｉＭＲ，Ｃｅｌｌ２２：４７９−８８（１９８０）。組換え体遺伝子が一度細胞内へ導入されたら、転写および翻訳のための細胞の通常機構により認識でき、遺伝子産物が発現されるであろう。多数の細胞にＤＮＡを導入するための他の方法も試みられた。これらの方法には以下のものが含まれている：ＤＮＡはＣａＰＯ₄と沈殿され、ピノサイトーシスにより細胞内へ取り込まれるトランスフェクション（ＣｈｅｎＣ．ａｎｄＯｋａｙａｍａＨ，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．７：２７４５−５２（１９８７））；膜内に穴をあけるために細胞が高電圧パルスに曝されるエレクトロポレーション（ＣｈｕＧ．ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１５：１３１１−２６（１９８７））；ＤＮＡが親油性ベシクル内へ包み込まれ、それが標的細胞と融合するリポフェクション／リポソーム融合（ＦｅｌｇｎｅｒＰＬ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４１３−７（１９８７））；および小さな弾丸に結合されているＤＮＡを用いる粒子衝撃法（ＹａｎｇＮＳ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：９５６８−７２（１９９０））。細胞内へＤＮＡを導入する別の方法は、ＤＮＡを化学的に修飾した蛋白質に結合させるものである。アデノウイルス蛋白質はエンドソームを不安定化して細胞内へのＤＮＡの取り込みを促進させることも示されている。ＤＮＡ複合体を含んでいる溶液へのアデノウイルスの混合、または蛋白質架橋剤を用いるアデノウイルスへ共有結合で結合されているポリリジンへのＤＮＡの結合は実質的に組換え体遺伝子の取り込みおよび発現を改良する。ＣｕｒｉｅｌＤＴｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６：２４７−５２（１９９２）。本明細書で使用される場合、”遺伝子導入”とは細胞内へ外来核酸分子を導入する過程を意味している。遺伝子導入は通常、遺伝子によりコードされている特定の生成物の発現を可能にするために実施される。生成物には蛋白質、ポリペプチド、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡまたは酵素的に活性なＲＮＡが含まれる。遺伝子導入は培養細胞または動物への直接投与で実施できる。一般的に、遺伝子導入は非特異的またはレセプター媒介相互作用による標的細胞と核酸の接触過程、膜を通してのまたはエンドサイトーシスによる細胞内への核酸の取り込み、および原形質膜またはエンドソームから細胞質内への核酸の放出を含んでいる。加えて発現は、細胞核内への核酸の移動および転写のための適当な核因子への結合を必要とするであろう。本明細書で使用される場合、”遺伝子治療”とは遺伝子導入の一つの形であり、本明細書で使用される遺伝子導入の定義内に含まれており、特に、インビボまたはインビトロにおいて細胞から治療的生成物を発現するための遺伝子導入を指している。遺伝子導入は細胞にエクスビボでも実施でき、それは次に患者に移植されるか、または患者への核酸または核酸−蛋白質複合体の直接投与により実施できる。別の好ましい態様においては、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７をコードする核酸配列を有するベクターが提供され、そこでは核酸配列は特定の組織でのみ発現される。組織特異的遺伝子発現を達成するための方法は例えば、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０９２３６に示されている。上に示した前記ベクターのすべてにおいて、本発明の別の観点は、ベクターに含まれている核酸配列が、前に定義されたように核酸の配列のいくつかまたはすべてに付加、欠失または修飾を含んでいてもよいことである。別の好ましい態様においては、遺伝子置換の方法が記載される。本明細書で使用される場合、”遺伝子置換”とは動物でインビボ発現させることができる核酸配列を供給し、それにより動物に失われているまたは欠損している内在性遺伝子機能を提供または増大させることを意味している。ＸＩＩＩ．ＰＴＰ０４，ＳＡＤ，ＰＴＰ０５，ＰＴＰ１０，ＡＬＰ，またはＡＬＫ−７蛋白質の機能を調節する化合物疾患の新規な治療を開発するために、生物医学の研究者および化学者は、蛋白質キナーゼの機能を阻害する分子を設計し、合成し、試験してきた。いくつかの小有機分子は、蛋白質キナーゼの機能を調節する一群の化合物を形成する。蛋白質キナーゼの機能を阻害すると報告されている分子の例としては、ビス一環、二環または複素環芳香族化合物（ＰＣＴＷＯ９２／２０６４２（Ｍａｇｕｉｒｅ、１９９２年１１月２６日公開））、ビニレン−アザインドール誘導体（ＰＣＴＷ０９４／１４８０８（Ｂａｌｌｉｎａｒｉら、１９９４年７月７日公開））、１−シクロプロピル−４−ピリジルキノロン類（米国特許５，３３０，９９２）、スチリル化合物（米国特許５，２１７，９９９），スチリル置換ピリジル化合物（米国特許５，３０２，６０６）、ある種のキナゾリン誘導体（欧州特許出願０５６６２６６Ａ１）、セレノインドール類およびセレニド類（ＰＣＴＷＯ９４／０３４２７（Ｄｅｎｎｙら、１９９４年２月１７日公開））、三環ポリヒドロキシ化合物（ＰＣＴＷＯ９２／２１６６０（Ｄｏｗ、１９９２年１０月１０日公開））、およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴＷＯ９１／１５４９５（Ｄｏｗら、１９９１年１０月１７日公開））が挙げられるが、これらに限定されない。細胞膜を横切ることができ、かつ酸加水分解に耐性である化合物は、患者に経口投与された後に生物学的利用性が高くなるため、利点がある可能性がある。しかし、これらの蛋白質キナーゼ阻害剤の多くは、蛋白質キナーゼの機能を弱くしか阻害しない。さらに、多くのものは種々の蛋白質キナーゼを阻害し、したがって、疾患の治療剤として多くの副作用を引き起こすであろう。しかし、いくつかのインドリノン化合物は、酸耐性かつ膜透過性有機分子の一群を形成する。ＢａｌｌｉｎａｒｉらのＰＣＴＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開）は、オキシインドール環に縮合したテトラリン、ナフタレン、キノリンおよびインドール置換基を有する水溶性インドリノン化合物を記載する。これらの二環置換基は、さらに水酸化アルキル、リン酸、およびエーテル部分等の極性部分で置換されている。Ｂａｌｌｉｎａｒｉらの国際公開ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開）は、オキシインドール環に縮合した他の二環部分ならびに一環部分を有するインドリノン化合物のインドリノン化学ライブラリを記載する。ＢａｌｌｉｎａｒｉらのＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開）は、インドリノンを合成する方法、細胞におけるインドリノン化合物の生物学的活性を試験する方法、およびインドリノン誘導体の阻害パターンを教示する。ＰＴＰ０４，ＳＡＤ，ＰＴＰ０５，ＰＴＰ１０，ＡＬＰ，またはＡＬＫ−７活性を調節しうる物質の別の例としては、チロホスチン，キナゾリン，キノキソリン，およびキノリンが挙げられるが、これらに限定されない。上述したキナゾリン，チロホスチン，キノリン，およびキノキソリンには、文献に記載されるもののようなよく知られた化合物が含まれる。例えば、キナゾリンを記載する代表的な刊行物には、Barker 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al.,Blood 82:12:3524-3529(1993);Baker et al.,J.Cell Sci.102:543-555(19 92);Bilder et al.,Amer.Physiol.Soc.pp.6363-6143:C721-C730(1991);Brunton et al.,Proceedings of Amer.Assoc.Cancer Rsch.33:558(1992);Bryckaert et a l.,Experimental Cell Research 199:255-261(1992);Dong et al.,J.Leukocyte Biology 53:53-60(1993);Dong et al.,J.Immunol.151(5):2717-2724(1993);Gazi t et al.,J.Med.Chem.32:2344-2352(1989);Gazit et al.,"J.Med.Chem.36:3556- 3564(1993);Kaur et al.,Anti-Cancer Drugs 5:213-222(1994);Kaur et al.,Kin g et al.,Biochem.J.275:413-418(1991);Kuo et al.,Cancer Letters 74:197-20 2(1993);Levitzki,A.,The FASEB J.6:3275-3282(1992);Lyall et al.,J.Biol.Ch em.264:14503-14509(1989);Peterson et al.,The Prostate 22:335-345(1993);P illemer et al.,Int.J.Cancer 50:80-85 (1992);Posner et al.,Molecular Pharmacology 45:673683(1993);Rendu et al. ,Biol.Pharmacology 44(5):881-888(1992);Sauro and Thomas,Life Sciences 53 :371-376(1993);Sauro and Thomas,J.Pharm.and Experimental Therapeutics 26 7(3):119-1125(1993);Wolbring et al.,J.Biol.Chem.269(36):22470-22472(1994 );およびYoneda et al.,Cancer Research 51:4430-4435(1991)に記載されている。調節剤として用いることができる他の化合物にはオキシインドリノンが含まれる。実施例下記実施例は限定を目的とするものではなく、本発明の種々の局面と特徴を示すためだけのものである。下記実施例は新規タンパク質の単離と特性化、正常細胞および腫瘍細胞中でのタンパク質発現、タンパク質特異抗体の生成、および哺乳動物と酵母系における組換え発現について示す。また、タンパク活性を調整する化合物の同定に有用なアッセイ法について示す。実施例1：ＰＴＰ04をエンコードするｃＤＮＡクローンの単離下記実施例は原発性癌組織からの新規ＰＴＰ配列の単離と同定および引き続いてのヒトＰＴＰ04の全長クローニングについて記載する。また、細胞または組織中でのＰＴＰ04の検出に有用なプローブにつき記載する。材料と方法ポリＡ＋ＲＮＡをヒトの原発性肺癌および結腸癌の凍結サンプル30μＭ低温維持切片から単離した（マイクロ−ファーストトラック、インビトロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア）。このＲＮＡはスーパースクリプト・プリアンプリフィケーション・システム（ギブコＢＲＬ、ゲイザーズバーグ、メリーランド；ジェラード（Gerard，GF）ら（1989）、ＦＯＣＵＳ 11、66）を用い、製造業者推奨の条件下で一本鎖ｃＤＮＡを産生させるのに用いた。代表的な反応では60μＬの反応容量中、全量ＲＮＡ 10μｇまたはポリ（Ａ）ＲＮＡ2μｇをオリゴ(ｄＴ)₁₂ _〜18 1．5μｇとともに使用した。生成物をＲＮアーゼＨで処理し、Ｈ₂Ｏで希釈して100μＬとした。次工程ＰＲＣ増幅のために、このｓｓｃＤＮＡ1〜4μ Ｌを各反応に用いた。変性オリゴヌクレオチドを、確立されたホスファーアミダイトの化学に従い、アプライド・バイオシステムズ394ＤＮＡシンセサイザーにより合成し、エタノールで沈殿させ、未精製のままＰＣＲに用いた。変性オリゴヌクレオチド・プライマーの配列は以下のとおりである：これらのプライマーはペプチド配列DFWXMXW(E/D)（配列番号19）（ＰＴＰ触媒ドメインからのセンス鎖）およびHCXAGXG(ＰＴＰ触媒ドメインからのアンチセンス鎖)（配列番号20）からそれぞれ誘導した。変性ヌクレオチド残基の指定は：Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；また、Ｙ＝ＣまたはＴ、である。ＰＣＲ反応は上に掲げた一本鎖ｃＤＮＡに適用した変性プライマーを用い実施した。プライマーはそれぞれ最終濃度５μＭとして、10ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ 8．3)、50ｍＭＫＣｌ、1．5ｍＭＭｇＣｌ₂、200μＭ各デオキシヌクレオシド三リン酸、0．001％ゼラチン、1．5ＵアンプリタックＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマ−/シータス）、およびｃＤＮＡ1〜4μＬからなる混合物に加えた。95℃、３分間の変性に続き、サイクル条件を94℃30秒、50℃1分、および72℃1 分45秒を35サイクルとした。350〜400ｂｐ間に移入するＰＣＲフラグメントは、ジーンクリーン・キット（バイオ101）を用いて2％アガロースゲルから単離し、Ｔ−Ａを製造業者のプロトコールに従いｐＣＲIIベクター（インビトロゲン・コープ、米国）にクローン化した。キアゲン（Qiagen）カラムを用い、コロニーをミニプラスミドＤＮＡ調製用に選択し、プラスミドＤＮＡはサイクル配列決定色素ターミネーターキットを用い、アンプリタックＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（ＡＢＩ、フォスターシティ、カリフォルニア）により配列決定した。配列決定反応生成物はＡＢＩプリズム377ＤＮＡシーケンサーにかけ、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）アラインメント・アルゴリズム（アルツシュル、Ｓ．Ｆ．ら、J．MOl．Biol．215：403〜10）を用い分析した。新規クローン１種（Ｇ77−4ａ−117）（ＰＴＰ04と命名）をヒトＨＬＴ370原発性肺癌サンプルから単離した。新規のホスファターゼをエンコードする全長ｃＤＮＡを得るために、当初ＰＣＲフラグメントから誘導したセンスまたはアンチセンス・オリゴヌクレオチドにより、レース（ＲＡＣＥ：迅速ｃＤＮＡ末端増幅）を実施した。ヒト・ＭＯＬＴ４白血病細胞から作製したヒト・マラソン−レディ（Marathon−Ready）ｃＤＮＡ（クロンテック、パロアルト、カリフォルニア）を以下のプライマーとともにレース反応に使用した。レース・プライマー：ＡＰ−1およびＡＰ−2（クロンテック）。ＰＴＰ04用ＲＴ−ＰＣＲプライマー：ＰＴＰ04をエンコードする単離ｃＤＮＡフラグメントをＤＮＡ配列決定により確認し、次いでヒト白血球ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング用プローブとして用いた。ヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー（1トリプレックス、クロンテック）およびＭＯＬＴ4白血病細胞ライブラリー(1ｇ t11、クロンテック）を次いでスクリーニングし、ＰＴＰ04をエンコードする全長転写物を単離した。5'−または3'−レースフラグメントをランダム・プライミングにより³²Ｐ−標識し、ライブラリースクリーニングの標準技法に従い、2×10⁶ｃｐｍ/ｍＬでハイブリッド形成プローブとして用いた。5×ＳＳＣ、5×デンハート溶液、2．5％硫酸デキストラン、 50ｍＭＮａ₂ＰＯ₄/ＮａＨＰＯ₄［ｐＨ7．0］、50％ホルムアミド中、変性サケ精子ＤＮＡ100ｍｇ/ｍＬとともに、42℃で前ハイブリッド形成（3時間）およびハイブリッド形成（一夜）を実施した。緊縮洗浄を0．1×ＳＳＣおよび0．1％ＳＤＳ中65℃で実施した。数種のオーバラップ・クローンを単離し、それがＰＣＲフラグメント（Ｇ77−4ａ−117）の配列に及んでいることを見出した。最終配列はサイクル配列決定色素ターミネーターキットを用い、アンプリタックＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（ＡＢＩ、フォスターシティ、カリフォルニア）による両系統の配列決定により正しいことを確認した。配列決定反応産物はＡＢＩプリズム377ＤＮＡシーケンサーにかけた。結果： 3，580ｂＰのヒトＰＴＰ04ヌクレオチド配列は807のアミノ酸からなるポリペプチドをエンコードする。ＰＴＰ04コード配列には52のヌクレオチド5−非翻訳領域とポリ（Ａ）尾部で終結する1086のヌクレオチド3−非翻訳領域が隣接している。フレーム停止コドンには上流がないが、ヌクレオチド53位置で始まる最初のＡＴＧは開始メチオニンのコザック共通配列に一致する。この予測された最初の６アミノ酸はマウスＺＰＥＰ（スイスプロット：Ｐ29352、ジーンバンク：Ｍ9 0388）のアミノ酸に一致し、これはさらにこのものが真の翻訳開始部位であることを支持している。ｃＤＮＡクローンの一つは、5'ＵＴＲのヌクレオチド30位の後に挿入断片を有していたが、他は配列に差がなかった。 807アミノ酸の配列はシグナル配列も膜透過ドメインも示さず、従って、ＰＴＰ04は細胞内タンパクである。ＰＴＰ04はアミノ酸1〜48位からのＮ−末端領域、アミノ酸49〜294位からの触媒ドメイン、およびアミノ酸295〜807位からのＣ −末端尾部を有する。ＰＴＰ04はマウスＺＰＥＰにもっとも関係があり、全体の相同性は70％である。ＺＰＥＰはＰＴＰ類亜科の一員であり、ＰＴＰ亜科はＰＴＰ−ＰＥＳＴ、ＨＳＣ、ＢＤＰ1およびＰＴＰ20を含み、そのすべてが単一の触媒ドメインとPro、Glu、SerおよびThr残基に富む領域（ＰＥＳＴドメイン）をもつ細胞質ＰＴＰである。また、ＰＴＰ04はアミノ酸495〜807のＣ−末端ＰＥＳＴドメインを有し、そこには57個のセリン残基（18％）および35個のプロリン残基がある。ＰＴＰ04およびＺＰＥＰのアミノ酸配列を比較して図１に示す。ＰＴＰ04およびＺＰＥＰの相同性は該タンパク質のＮ−末端とＣ−末端終末に集中しているが、中間部でも有意な差がある。ＰＴＰ04のＮ−末端領域、アミノ酸1〜48位はマウスＺＰＥＰに81％相同である。ＰＴＰ04の触媒ドメイン、アミノ酸49〜294位はマウスＺＰＥＰに89％相同である。ＰＴＰ04の領域294〜600 位はマウスＺＰＥＰに約50％相同である。ＰＴＰ04のＣ−末端領域、アミノ酸68 0〜817位はマウスＺＰＥＰに80％相同である。ヒトＳｕＰＴＰ04配列はＰＴＰ類のＰＴＰ−ＰＥＳＴ亜科の新メンバーと定義する。実施例2：ＰＴＰ04の発現下記実施例は正常ヒト組織および癌細胞系におけるＰＴＰ04発現の評価について示す。材料と方法以下より単離した全ＲＮＡを１レーンあたり20μｇ付加し、ノーザンブロットを作製した：成人22人の正常組織（胸腺、肺、十二指腸、結腸、精巣、脳、小脳、唾液腺、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、胃、子宮、前立腺、骨格筋、胎盤、乳腺、膀胱、リンパ節、脂肪組織）、ヒト胎児２検体正常組織（胎児肝臓、胎児脳）、およびヒト24検体腫瘍細胞系（ＨＯＰ−92、ＥＫＶＸ、ＮＣＩ−Ｈ23、ＮＣＩ−Ｈ226、ＮＣＩ−Ｈ322M、ＮＣＩ−Ｈ460、Ａ549、ＨＯＰ−62、ＯＶＣＡＲ−3、ＯＶＣＡＲ−4、ＯＶＣＡＲ−5、ＯＶＣＡＲ−8、ＩＧＲＯＶ1、ＳＫ− ＯＶ−3、ＳＮＢ−19、ＳＮＢ−75、Ｕ25ＬＳＦ−268、ＳＦ−295、ＳＦ−539、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＳＲ、ＤＵ−145、ＰＣ−3）（入手先：ニック・スクイデロ（Nick Scuidero）、国立癌研究所、開発促進治療プログラム、ロックビル、メリーランド）。全ＲＮＡサンプルを変性ホルムアルデヒド１％アガロースゲル上走行させ、ニトロセルロース膜（バイオラッド、カリフォルニア）に移入した。さらなるヒト正常組織ノーザンブロットは、レーンあたり２μｇの８種の異なるヒト癌細胞系（ＮＣＩ−Ｈ522、Ｋ−562、ＭＯＬＴ−４、ＨＬ−60、Ｓ3、Ｒａｊｉ、ＳＷ480、Ｇ361）のポリＡ＋ｍＲＮＡを電荷修飾ナイロン膜（ヒト癌細胞系ブロット＃7757、クロンテック、パロアルト、カリフォルニア）上に含んでおり、これをハイブリッド形成させた。全ＲＮＡサンプルのために、ニトロセルロース膜を、ｐＣＲ2．1ミニ298の579 ｂｐ・Ｓｔｕｌ−ＢｓｔＸＩフラグメントから合成したランダム・プライマー［ａ−³²Ｐ］ｄＣＴＰ−標識プローブとハイブリッド形成させた。4×ＳＳＰＥ、 2．5×デンハート溶液、50％ホルムアミド、変性サケ精子ＤＮＡ0．2ｍｇ/ｍＬ、酵母ｔＲＮＡ（ベーリンガーマンハイム、インディアナ）0．1ｍｇ/ｍＬ、0． 2％ＳＤＳ中、［ａ−³²Ｐ］ｄＣＴＰ−標識ＤＮＡプローブ５×10⁶ｃｐｍ/ｍＬとともに、テタネ・ハイブリダイザーＨＢ−１上42℃で一夜ハイブリッド形成を実施した。ブロットを2×ＳＳＣ、0．1％ＳＤＳにより65℃で20分間２回洗浄し、次いで、0．5×ＳＳＣ、0．1％ＳＤＳにより65℃で20分間洗浄した。ブロットをリン画像スクリーンに24時間露光し、モレキュラー・ダイナミック・ホスホイメージャーＳＦ上走査した。Ｇ77-4ａ−117の351ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントを用い、クロンテック・ナイロン膜上、ポリＡ＋ｍＲＮＡサンプル2μｇ用プローブを生成させた。5×ＳＳＣ、2％ＳＤＳ、10×デンハート溶液、50％ホルムアミド、変性サケ精子ＤＮＡ100μｇ/ｍＬ中、［ａ−³²Ｐ］ｄＣＴＰ−標識ＤＮＡプローブ1 〜2×10⁶ｃｐｍ/ｍＬとともに、42℃で一夜ハイブリッド形成を実施した。膜を2 ×ＳＳＣ/0．05％ＳＤＳにより室温で30分間洗浄し、次いで、0．2×ＳＳＣ/0． 1％ＳＤＳにより50℃で30分間２回洗浄し、コダックＸＡＲ−2フィルム上48時間露光した。新規ＰＴＰ類のＲＴ−ＰＣＲ検出全ＲＮＡを種々の細胞系または新鮮な凍結組織から塩化セシウムクッションによる遠心により単離した。全ＲＮＡ20μｇをランダム・ヘキサマーおよびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（スーパー−スクリプトII、ギブコＢＲＬ、ゲイザーズバーグ、メリーランド）により逆転写した。ＳｕＰＴＰ04をエンコードするｃＤＮＡを増幅するために、次いでＰＣＲを用いた。逆転写酵素のみを欠如するＲＴ−ＰＣＲを対照として実施した。ＰＣＲ産物を3％アガロースゲル上電気泳動し、臭化エチジウム染色により可視化し、ＵＶライトボックス上写真撮影した。ＰＴＰ04に特異的な270ｂｐフラグメントの吸光度を異なるＲＮＡサンプル間で比較した。結果約4.5ｋｂの単−ＳｕＰＴＰ04ｍＲＮＡ転写産物をノーザン分析により同定し、専ら胸腺に存在することを見出した。23種のヒト正常組織の残部（胎児脳、胎児肝臓、肺、十二指腸、結腸、精巣、脳、小脳、唾液腺、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、胃、子宮、前立腺、骨格筋、胎盤、乳腺、膀胱、リンパ節、脂肪組織）はすべて陰性であった。ヒト腫瘍細胞系の６種（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｋ−562 、ＭＯＬＴ−4、ＨＬ−60、ＳＲ、Ｒａｊｉ）は陽性であった。26種のヒト腫瘍細胞系の残部は陰性であった。遺伝子特異プライマー対でのＲＴ−ＰＣＲは、ＳｕＰＴＰ04をエンコードする転写産物の発現がノーザン分析の結果を確認するものであり、以下の組織においては検出レベルも低いことを示した：脂肪、腎臓、小腸、造血組織および種々の細胞型（脾臓、胸腺、リンパ節、骨髄、末梢白血球およびリンパ球）。ヒト正常胸腺および数種の白血病細胞系を含む造血系起源の細胞におけるＰＴＰ04の選択的発現は、Ｔ細胞とＢ細胞の生存、分化または共刺激、および/または炎症、免疫抑制または自己免疫疾患を含む免疫調整に強く関わっていることを示唆する。さらに、脂肪組織での発現は糖尿病などの代謝異常においての可能な役割を示唆する。実施例3：ＰＴＰ04の組換え発現以下の実施例は、組換えＰＴＰ04の発現用ベクターの構築とＰＴＰ04を発現する組換え細胞系の創製につき説明する。発現ベクターの構築発現構築物はＰＣＲ介助変異誘発により生成させたが、ここではＰＴＰ04の全コードドメインの、そのカルボキシ末端末尾にインフルエンザ菌の赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープYPYDVPDYAS（配列番号55）（パティ（Pati）、1992）を付加した。構築物は２種の哺乳動物発現ベクター、すなわち、ウイルス生産系統生成用ｐＬＸＳＮ（ミラーおよびロスマン（Miller,AD.& Rosman,G.J.）、Biotechni ques 7、980〜988、1989）および哺乳動物での一過性発現用ｐＲＫ5に導入した。また、優性陰性（シグナル送達不全）ＰＴＰ04構築物は、保存配列HCSAG（配列番号56）モチーフの非変異体CysをＰＣＲ変異誘発によりAlaに変異することによってｐＬＸＳＮおよびｐＲＫ５に導入した。開始メチオニンを除く全ＰＴＰ04オープン読み枠（ＨＡ付加なし）をＰＣＲにより生成させ、抗体生産用ウサギの免疫に使用するＧＳＴ−融合タンパクのバクテリア生産用ｐＧＥＸベクター（ファルマシア・バイオテック、ウプサラ、スウェーデン）に結合した。開始メチオニンを除く全ＰＴＰ04オープン読み枠をＰＣＲにより生成させ、抗体生産用ウサギの免疫に使用するＧＳＴ−融合タンパクのバクテリア生産用ｐＧＥＸベクターに結合した。このベクターはグルタチオン− Ｓ−トランスフェラーゼのコード配列と、その後に続く組換え融合タンパク質を産生するポリリンカーを含んでいる。ＧＳＴ部分は融合タンパク質のＮ−末端部位を含んでなる。哺乳動物細胞での一過性発現ＨＡ−付加ＰＴＰ04遺伝子を含むｐＲＫ５発現プラスミド（10μｇＤＮＡ/100 ｍｍプレート）はＣＯＳ細胞およびリポフェクタミンをもつ293の細胞（ギブコＢＲＬ）に導入することができる。72時間後、細胞を0．5ｍＬ可溶化バッファー（20ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ7．35、150ｍＭＮａＣｌ、10％グリセリン、1％トリトンＸ−100、1．5ｍＭＭｇＣｌ₂、1ｍＭＥＧＴＡ、2ｍＭ弗化フェニルメチルスルホニル、1μｇ/ｍＬアプロチニン）中に採取した。サンプルの一部を15％アクリルアミド/0．5％ビスアクリルアミドゲル上ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分割し、電気泳動的にニトロセルロースに移動させた。非特異結合をブロット（Blotto；5％w/v非脂肪ドライミルクおよび0．2％v/ vノニデットＰ-40（シグマ）含有リン酸緩衝塩溶液）中でのブロット予備培養によりブロックし、組換えタンパク質はＨＡデカペプチド付加マウスＭａｂを用い検出した。別法として、組換えタンパク質は種々のＰＴＰ04−特異抗血清を用い検出することもできる。ウイルス産生細胞系の生成ＰＴＰ04遺伝子を含むｐＬＸＳＮ組換え構築物は、ＣａＣｌ₂介在トランスフェクションを用い、両種性ヘルパー細胞系ＰＡ317に移入した。Ｇ418上選択した後、細胞をＧ418不含正常培地に張り付けた（500μｇ/ｍＬ）。抵抗性細胞からの上清を用い、エコトロピック・ヘルパー細胞系ＧＰ＋Ｅ86に感染させ、細胞を再度Ｇ418上で選択した。抵抗性細胞を再度Ｇ418から離し、その上清を8〜12時間ごとに採取し、ウイルス原液としてプールした。レデマン（Redemann）ら、19 92、Mol.Cell Biol.12：491〜498。ウイルス原液の力価は一般に〜10⁶/ｍＬであった。哺乳動物細胞での安定な発現ＮＩＨ−3Ｔ3およびＢＡＬＢ/3Ｔ3細胞を10％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＤＭＥＭ（ギブコ）保持100ｍｍプレートで増殖させた。該細胞はウイルス上清約3 ｍＬを培地15ｍＬに加えることにより、ＰＴＰ04レトロウイルスで約24時間重感染させた。レトロウイルス構築物を発現する細胞は、次いで500μｇ/ｍＬＧ418 添加ＤＭＥＭ/10％ＦＣＳ中増殖することにより選択した。実施例4：抗−ＰＴＰ04抗体の生成ＰＴＰ04−特異免疫試薬はヒトＰＴＰ04に存在するユニーク配列に相当する３種のＫＬＨ−結合合成ペプチド混合物に対してウサギで作製した。ペプチド類（下記参照）はそのＣ−末端残基をＫＬＨと結合させた。他の免疫試薬はＧＳＴ−融合タンパク質として発現されるＰＴＰ04のバクテリア発現全コード領域によりウサギを免疫することによって生成させた。ＧＳＴ融合タンパク質はスミス（Smith）らがGene 67：31、1988に記載のとおりにＤＨ5 −アルファ大腸菌バクテリア中で産生させた。バクテリアタンパク質溶解物はスミス（上記）ら記載のとおりに、グルタチオン−セファロース・マトリックス上で精製した。実施例5：ＰＴＰ04活性のアッセイ材料と方法：組換え野生型および優性陰性（シグナル送達不全）ＰＴＰ04（上記実施例３参照）をＧＳＴ−融合タンパク質としてバクテリアから精製した。溶解液をグルタチオン−セファロース・マトリックスに結合させ、1×ＨＮＴＧにて２度洗浄し、次いで100ｍＭ 2−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ｐＨ6．8 、150ｍＭＮａＣｌ、および1ｍＭＥＤＴＡ含有バッファーにて１度洗浄した。ホスファターゼ活性のアッセイは一般のＰＴＰ基質としてｐ−ニトロフェノールリン酸エステル（ＰＮＰＰ）を用い、実質的にペイ（Pei）らの記載（1993）に従い実施した。簡単には、最終洗浄工程の後に、マトリックス結合タンパクにアッセイバッファー50ｍＬ（100ｍＭＭＥＳｐＨ6．8、150ｍＭＮａＣｌ、10 ｍＭＤＴＴ、2ｍＭＥＤＴＡ、および50ｍＭＰＮＰＰ）を加え、反応を開始した。サンプルを23℃にて20分間培養した。反応は各サンプル40μＬと1ＮＮａＯＨ960μＬとを混合することにより終結させ、ｐ−ニトロフェノールの吸収を450 ｎｍで定量した。沈殿中に存在するＰＴＰ04を制御するために、ＳＤＳサンプルバッファー中にて沈殿を煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＰＴＰ04の存在は抗−ＰＴＰ04抗体による免疫ブロット分析により検出した。実施例6：ＳＡＤの単離および特性化この実施例は非レセプター・チロシンキナーゼＳＡＤの単離と特性化について記載する。当初、我々はＳｒｃ族の新メンバーを同定することから着手した。このものは９種の関連する細胞質チロシンキナーゼの一群であり、数種のシグナル導入経路において重要な役割を果たしている。すべての既知チロシンキナーゼを比較することによって、我々はＳｒｃ族メンバーと、さらに３種のより遠い関係にあるタンパク質、Ｓｒｍ、ＢｒｋおよびＭＫＫ3またはＦｒｋ（Ｓｒｍ/Ｂｒｋ /Ｆｒｋ群という）を特異的に認識する一対の変性オリゴヌクレオチドプライマーを企画した。配列ＦＧＥ/ＤＶＷ（配列番号30）はキナーゼドメインのアミノ端末近辺に位置し、Ｓｒｃ族メンバーとＳｒｍ/Ｂｒｋ/Ｆｒｋ群にユニークである。配列WTAPE（配列番号31）はチロシンキナーゼの高度保存DVWSモチーフの末端アミノそのものに位置しており、Ｓｒｃ族およびＳｒｍ/Ｂｒｋ/Ｆｒｋ群ならびにＥｐｈ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、およびＦｅｓ族に含まれている。我々はＦＧＥ/ＤＶＷおよびWTAPEプライマーをＰＣＲ増幅反応に鋳型としてのＨＭＥ（ヒト乳房上皮）細胞ss ｃＤＮＡとともに用いたとき、既知Ｓｒｃ関連物と、他のキナーゼに相同性を有する483ｂｐの新規ＤＮＡフラグメント(ＨＭＥ 1264)とを単離した。新規配列はマウスＳｒｍ（ジーンバンク受け入れ番号＃Ｄ2 6186）に非常によく似ており、そのクローンをヒトＳＡＤと命名した。ＳＡＤプローブを使用し、ヒト乳癌細胞系ｍＲＮＡから構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーンして、２種の重なり合った独立クローンを単離した；このものはキナーゼドメインに及んでいるが、見掛け上のイントロンを含んでおり、恐らく不完全にプロセッシングを受けた転写産物から生じたものである。次いで、連続的なレース反応によりＭＣＦ7 ＲＮＡからコーディング領域の5'端末を単離し、全コーディング領域をＨＭＥｃＤＮＡからＰＣＲにより再単離した。材料と方法総ＲＮＡはコムジンスキーとサッキー（P.Chomczynski and N.Sacchi,Anal.Bi ochem.162、156(1987)）のグアニジン塩/フェノール抽出プロトコールを用いて、ＨＭＥ（ヒト乳房上皮）細胞から単離した。このＲＮＡを鋳型として用い、ギブコＢＲＬから購入した第一鎖合成キット用スーパースクリプト・プリアンプリフィケーション・システムにより（ライフ・テクノロジー、米国；ジェラード（ Gerard，GF）ら、ＦＯＣＵＳ 11：66(1989)）、製造業者推奨の条件下で一本鎖ｃＤＮＡを産生させた。代表的な反応では、60μＬの反応容量中、総ＲＮＡ10μ ｇまたはポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ2μｇをオリゴ（ｄＴ）₁₂ _〜181．5μｇとともに使用した。生成物をＲＮアーゼＨで処理し、Ｈ₂Ｏで希釈して100μＬとした。次工程ＰＲＣ増幅のために、これらのss ｃＤＮＡ 1〜4μＬを各反応に用いた。オリゴヌクレオチドを、確立されたホスファーアミダイトの化学に従い、アプライド・バイオシステムズ394ＤＮＡシンセサイザーにより合成し、エタノールで沈殿させた後、未精製のまま用いた。変性オリゴヌクレオチド・プライマーは以下のとおりである：（センス）および（アンチセンス）。これらのプライマーはペプチド配列GQFG(E/D)VW（配列番号32）（センス鎖）およびWTAPEALL（配列番号32）（アンチセンス鎖）からそれぞれ誘導した。変性ヌクレオチド残基の指定は：Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；また、Ｙ＝ＣまたはＴ、である。Ｓｒｃを鋳型として用い、これらのプライマーは480 ｂｐの産物を産生する。ＰＣＲ反応はＨＭＥ細胞ｃＤＮＡに適用したプライマーＦＧＥ/ＤＶＷおよびＷＴＡＰＥを用い実施した。プライマーはそれぞれ最終濃度0．5μＭとして、10 ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ8．3）、50ｍＭＫＣｌ、1．5ｍＭＭｇＣｌ₂、200μＭ各デオキシヌクレオシド三リン酸、0．001％ゼラチン、1．5ＵアンプリタックＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー/シータス）、およびｃＤＮＡ1〜4μＬからなる混合物に加えた。94℃、３分間の変性に続き、サイクル条件を94℃30秒、37℃1分、72℃での２分間のランプ、および72℃1分を最初の３サイクルとし、その後、94℃30秒、60℃1分、そして72℃1分を35サイクルとした。450〜550ｂｐ間に移入するＰＣＲフラグメントは2％アガロースゲルから単離し、リン酸化し、Ｔ4ポリヌクレオチド・キナーゼとクレノウフラグメントで処理することにより修復し、平滑末端をベクター・ｐブルースクリプトＳＫ＋（ストラータジーン、米国）のＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。キアゲン（Qiagen）カラムを用い、ＤＮＡミニ調製により単一コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、サイクル配列決定色素ターミネーターキットを用い、アンプリタックＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（ＡＢＩ、フォスターシティ、カリフォルニア）により配列決定した。配列決定反応生成物はＡＢＩプリズム377ＤＮＡシーケンサーにかけ、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）アラインメント・アルゴリズム（アルツシュル、Ｓ．Ｆ．ら、J.Mol.Biol.215：403〜10、1990）を用い分析した。新規クローン１種（ＨＭＥ1264）はＨＭＥ細胞からの鋳型としての一本鎖ｃＤＮＡ上、プライマーＦＧＥ/ＤＶＷおよびＷＴＡＰＥでのＰＣＲにより単離した。次いで、このクローンをヒトＳＡＤフラグメントとした。ラムダＺａｐII（ストラータジーン・クローニング・システム、ラホーラ、カリフォルニア）cDNAライブラリーは、オリゴ（ｄＴ）およびランダムプライムによる第一鎖ｃＤＮＡ合成用の鋳型として乳癌細胞系プールからのｍＲＮＡを用い構築した（ライブラリーはクロンテック・カスタム・ライブラリー合成部門（パロアルト、カリフォルニア）が創製した）。プールに使用した細胞系はＭＣＦ7 、ＨＢＬ100、ＭＤＡ−ＭＢ231、ＭＤＡ−ＭＢ175IIV、ＭＤＡ−ＭＢ435、ＭＤＡ−ＭＢ453、ＭＤＡ−ＭＢ468、ＢＴ20、Ｔ47ＤおよびＳＫＢＲ3であり、そのそべてがＡＴＣＣから入手可能である。ファージはニトロセルロースフィルター上、ＨＭＥ1264からのランダムプライマー³²Ｐ−標識挿入産物２×10⁶ｃｐｍ/ｍＬにより、６×ＳＳＰＥ、50％ホルムアミド、2×デンハート試薬、0．1％ＳＤＳ、変性断片化サケ精子ＤＮＡ0．05ｍｇ/ｍＬを含むハイブリッド形成バッファー中でスクリーンした。42℃でのハイブリッド形成一夜後、フィルターを1×ＳＳＣと0．1％ＳＤＳ中65℃で洗浄した。2つの重なり合った部分クローンを単離し、Ｔ7ポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドプライマーによる手動配列決定により、コーディング領域を経て配列決定した（テイバーおよびリチャードソン（Tabor and Richardson）、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:4767〜71、1987）。これらの単離体はＳＡＤのキナーゼドメインを包含し、見掛け上イントロン5'内からキナーゼドメインに伸長しており、3'では枠内終止コドンに伸長しているが、さらに４つの見掛け上イントロンにより中断されている。２つの連続した5'レース（ＲＡＣＥ；ｃＤＮＡ末尾の迅速増幅）反応（フローマン（Frohman）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：8998、1988）を次いで用い、コーディング領域の5'末尾を単離した。一本鎖ｃＤＮＡをスーパースタリプト・プリアンプリフィケーション・システム（ギブコＢＲＬ）を用い、上記のとおりに調製したが、その際、逆転写を開始するために鋳型としてＭＣＦ７からの総ＲＮＡ６μｇとレース１用遺伝子特異プライマー5556（5'- AGTGAGCTTCATGTTGGCT−3'（配列番号34））またはレース２用5848（5'−GGTAGAG GCTGCCATCAG−3'（配列番号35））を使用した。ＲＮアーゼＨでの処理後、ss ｃＤＮＡを２度連続の酢酸アンモニウムとエタノール沈殿により回収し、デオキシ末端トランスフェラーゼ（ギブコＢＲＬ）での処理によりｄＡの担体グリコーゲン・ホモポリマー尾部を添加し、２つの反応混合物をＴＥで希釈し50μＬとした。アンプリタックＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー/シータス）による第二鎖ｃＤＮＡ合成は、鋳型として尾部ｃＤＮＡ1〜5μＬおよび上記のバッファー条件を用い、0．2μＭＰＥＮＮ（ｄＴ）₁₇（5−GACGATCGGAATTCGCGA（ｄＴ）₁₇ −3'）（配列番号36）で開始した。94℃5分間の変性、50℃1分間のアニーリング、および72℃40分間の拡張に続き、プライマーＰＥＮＮ（5'−GACGATCGGAATTC GCGA−3'）（配列番号37）および5555（5'−CCCAGCCACAGGCCTTC−3'）（配列番号38）を1μＭの濃度で加え、ＰＣＲは94℃30秒、49℃1分、および72℃1分、45 秒40サイクルのサイクル条件で実施した。第二のネストＰＣＲは鋳型として当初ＰＣＲ反応物0．2μＬおよびプライマーＰＥＮＮ（配列番号37参照）と5554（5' −CCACACCTCCCCAAAGTA−3'）（配列番号39）1μＭで使用して初期３分間の変性を94℃で実施し、次いで94℃30秒、49℃1分、および72℃1分、45秒35サイクルのサイクル条件とした。ＰＣＲ産物を1％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色および³²Ｐ−末端標識したオリゴヌクレオチド5557（5'−TGGGAGCGGCCA CA CTCCGAATTCGCCCTT−3'）（配列番号40）を用いサザーンハイブリッド形成して可視化した。500〜700ｂｐの反応生成物をｐブルースクリプトＳＫ＋（ストラータジーン、米国）のＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、陽性クローンをプローブとしてのオリゴヌクレオチド5557によるコロニーハイブリッド形成により同定した。クローン16Ａ1（配列番号10のヌクレオチド195〜783を包含する）を単離し、ＡＢＩと手動配列決定の組合わせにより配列決定した。第二セットの5'レース反応は、記載した場合は別として、上記の手法を用いクローン16Ａ1の配列に基づき実施した。遺伝子特異プライマーは第一鎖合成のための5848（配列番号35）、第一ＰＣＲのための6118（5'−GCCTG CGTGCGAAGATG−3'）（配列番号41）、および第二ＰＣＲのための6119（5'−CTTC GAGGGCACAGAGCC−3'）（配列番号42）であり、サザーンおよびコロニーハイブリッド形成のためのプローブは16Ａ1からのランダムプライマー32Ｐ−標識挿入産物であった。250〜450ｂｐ間に移入するＰＣＲフラグメントは２％アガロースゲルから単離し、リン酸化し、Ｔ4ポリヌクレオチド・キナーゼとクレノウフラグメントで処理することにより修復し、平滑末端をベクター・ｐブルースクリプトＳＫ＋（ストラータジーン、米国）のＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。クローン20Ｅ2（配列番号10のヌクレオチド1〜267を包含する）を単離し、ＡＢＩと手動配列決定の組合わせにより配列決定した。次いで、ＳＡＤのコーディング領域を２つの重なり合ったＰＣＲフラグメントとしてＨＭＥｃＤＮＡから単離した。一本鎖ｃＤＮＡはＨＭＥ細胞からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡから、上記のようにスーパースクリプト・プリアンプリフィケーション・システム（ギブコＢＲＬ）を用い調製した。アンプリタックＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー/シータス）でのＰＣＲは、鋳型としてのｃＤＮＡ1〜2μＬを用い、初期３分間の変性を94℃で実施し、次いで94℃30秒、55℃1 分、および72℃1分、45秒30サイクルのサイクル条件および上記バッファー条件とした。プライマー6642（5'−ATGGAGCCGTTCCT CAGGAGG−3'）（配列番号43）および6644（5'−TCACCCAGCTTCCTC CCAAGG−3'）（配列番号44）はＳＡＤの約710 ｂＰ5'フラグメントの増幅に使用し、プライマー6643（5'−AGGCCAACTGGAAGCTGA TCC−3'）（配列番号45）および6645（5'−GCTGGAGCCCAGAGCGTTGG−3'）（配列番号46）はＳＡＤの約860ｂｐ3'フラグメントの増幅に使用した。ＰＣＲフラグメントは1％アガロースゲルから単離し、リン酸化し、Ｔ4ポリヌクレオチド・キナーゼとクレノウフラグメントで処理することにより修復し、平滑末端をベクター・ｐブルースクリプトＳＫ＋（ストラータジーン、米国）のＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。陽性クローンはプローブとしての16Ａ1からのランダムプライム32Ｐ−標識挿入産物（5'フラグメント用）およびＨＭＥ1264からのランダムプライム32Ｐ−標識挿入産物または32Ｐ−標識オリゴヌクレオチド5557（3'フラグメント用）とのコロニーハイブリッド形成により同定した。重なり合う5'および 3'ＰＣＲフラグメントはユニークＥｃｏＲＩ部位を介してともに結合させ、全長ＳＡＤコーディング領域とした。ヒトＳＡＤコーディング領域の完全配列は、ＨＭＥ細胞から調製したｃＤＮＡを増幅し、得られる重なり合う5'および3'ＰＣＲクローンから決定した。5' 非コーディング配列は重なり合うレースフラグメント16Ａ1から決定した。配列はサイクル配列決定色素ターミネーターキットを用い、アンプリタックＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（ＡＢＩ、フォスターシティ、カリフォルニア）により両鎖上、手動で決定した。結果配列番号10に示した1，548ｂＰヒトＳＡＤ（ＳＡＤ_ｈ）ヌクレオチド配列は、488アミノ酸のポリペプチドをエンコードする単一オープン読み枠を含む。ＳＡＤ_ｈコーディング領域は、開始メチオニン４コドン前の枠内終止コドンを含む48ヌクレオチド5'−非翻訳領域と、２つの枠内終止コドンを含む33ヌクレオチド3'−非翻訳領域が先行している。ＳＡＤｃＤＮＡの配列は、正常ＨＭＥ細胞ｃＤＮＡからの重なり合うＰＣＲ −増幅フラグメント（ヌクレオチド49〜1548）、乳癌細胞ラムダｃＤＮＡライブラリーからのクローン（ヌクレオチド694〜1548）、およびＭＣＦ７ｃＤＮＡからの重なり合う5'レース産物（ヌクレオチド1〜783）から決定したが、これらは恐らくある多形部位を含む以下の配列差異を有している。曖昧さはヌクレオチド 636（配列番号10参照）においてＨＭＥＰＣＲクローンのＣがＭＣＦとレース( ＲＡＣＥ)産物のＴに変わっていること、ヌクレオチド1477においてＨＭＥＰＣＲクローンのＴが乳癌ライブラリーのＣに変わっていること、乳癌ライブラリーの919〜920位でヌクレオチドＧＴが欠失していること、および乳癌ライブラリーの694、995、1117、および1334位置（配列番号10に関して）に挿入された見掛け上のイントロンがあることなどである。ＳＡＤのドメイン構造はＮ−末端ユニークドメインとそれに続くＳＨ3ドメイン、ＳＨ2ドメインおよびキナーゼドメインからなる。この全体のトポロジーはＳｒｃ、Ｓｒｍ/Ｂｒｋ/Ｍｋｋ3、およびＣｓｋの系統群が分担している。ＳＡＤはマウスＳｒｍにもっとも近似しているが（ジーンバンク受け入れ番号＃Ｄ 26186）（コームラ（Kohmura）ら、Mol.Cell.Biol.14:6915〜6925、1994）、これは機能未知の遠隔ＳＲＣ類縁体である。ＳＡＤおよびＳｒｍは個々のドメインにおける配列同一性を分け持っており、それぞれ55％（ユニーク領域）、72％（ＳＨ3ドメイン）、78％（ＳＨ2ドメイン）、および85％（キナーゼドメイン）である。真のＳｒｃ族メンバーと違って、ＳＡＤおよびＳｒｍはＮ−末端膜付着配列および潜在的なＣ−末端陰性調整チロシンの両方を欠いている。さらに、Ｓｒｃ族キナーゼドメインに特徴的なHRDLRXAN（配列番号47）は、ＳＡＤおよび他のＳｒｍ/Ｂｒｋ/Ｍｋｋ3グループメンバーにおいてはHRDLAXRN（配列番号48）である。殆どの他のチロシンキナーゼ同様、ＳＡＤおよびＳｒｍ両方ともに潜在的な自己リン酸化部位（ＳＡＤの380Ｙ）を含んでいる。ＳＡＤおよびＳｒｍのＮ −末端配列は最初の22個のアミノ酸の内20残基が同一であって類似しているが、Ｃ−最末端は全く異なっている。入手可能な証拠は、ＳＡＤ_ｈおよびＳｒｍ_ｍが種オルトログー(orthologue) というよりもむしろ異なる遺伝子であることを示唆している。全体として、上に掲げたＳＡＤ_ｈおよびＳｒｍ_ｍ間の相同性レベルは緊密なＳｒｃ族メンバーのものに匹敵する（例えば、Ｓｒｃ_ｈとＹｅｓ_ｈ）が、種対象物のものよりも低い。また、ＳＡＤ_ｈおよびＳｒｍ_ｍは異なる発現パターンを示し、ＳＡＤ_ｈの発現はＰＣＲにより十二指腸および多分精巣に検出されるが、他の試験した組織には検出されず、他方、Ｓｒｍ_ｍの発現はノーザンにより肺、肝臓、脾臓、腎臓および精巣に最高レベルで検出された(コームラ(Kohmura)ら、Mol.Cell.Bio l.14：6915〜6925、1994）。最後に、マウスのＳｒｍ遺伝子を分断しても検出し得る表現型を示さないが（コームラ（Kohmura）ら、Mol.Cell.Biol.14:6915）、このことは他の関連タンパク質がその機能を補っていることを示唆している。実施例7：ＳＡＤ発現分析材料と方法ＲＮＡは種々のヒト細胞系および新鮮な凍結正常組織から単離した。（腫瘍細胞系はニック・スクイデロ（Nick Sculdero）、国立癌研究所、開発促進治療プログラム、ロックビル、メリーランドから入手した）。一本鎖ｃＤＮＡはスーパースクリプト・プリアンプリフィケーション・システム（ギブコＢＲＬ）を使用し、上記のよに各ＲＮＡ10μｇから合成した。これらの一本鎖鋳型はアニーリング温度65℃として35サイクルのＰＣＲ反応に使用した；その際２種のＳＡＤ−特異オリゴヌクレオチド（5284：5'−TCGCCAAGGAGATCCAGACAC−3'（配列番号49）および5285：5−GAAGTCAGCCACCTTGCAGGC−3'（配列番号50））を使用した。反応生成物を2％アガロースゲル上電気泳動し、臭化エチジウムにより染色、ＵＶライトボックス上で写真撮影した。約320ｂｐのＳＡＤ−特異バンドの相対強度をサンプルごとに評価した。結果は４を最高相対発現とし、０を最低として数値で見積った。結果正常ヒト組織および多様な新生物性起源の複数細胞系におけるＳＡＤ発現プロフィールを、キナーゼドメインの配列からのプライマーを使用し、準定量的ＰＣＲアッセイにより決定した。表１および２はその結果を示す。正常組織サンプルにおいて（表1）、中程度のＳＡＤ発現が十二指腸に、また多分低レベルでは精巣にも検出されたが、他のすべてのサンプルでは陰性であった。はるかに高い発現がサブセットの癌細胞系（表2）に認められたが、ある種ヒト結腸腫瘍細胞系（ＨＣＴ−15、ＳＷ480、およびＨＴ−29）、卵巣癌（IGROV1）、および腸癌（ＳＮＵ−Ｃ2Ｂ）では最高レベルで認められた。表２に示すように、より弱いＳＡＤの発現も幾つかの他の腫瘍細胞系、例えば、結腸、乳房、肺、卵巣、および腎臓から誘導された細胞系に見られた。実施例8： SAD に特異的な免疫試薬の作成 SADのＣ末端（SEQ ID No:35のアミノ酸配列478から488）で、ジェントリーとロートン（Gentry and Lawston）がウイルス学雑誌(Virology)152巻421ページ、 1984年に記載しているように、486番目のＣをＳに置換したものに由来する合成アミノ酸をKLHに結合してウサギを免疫し、SADに特異的な抗血清を作成した。実施例9： SAD の組換え発現ベクターの構築発現コンストラクトはPCRによる突然変異誘発を使って作成し、5'非翻訳配列が5'-GGATCCCCGGACC-3'(SEQ ID NO:51)になるように開始メチオニンの上流にBam HIサイトを導入した。Ｎ末端にヘキサヒスチジンでタグを付けたコンストラクトも、SADコード配列の２番目のヌクレオチド（グルタミン酸）を後につけたMRGSH HHHHH(SEQ ID NO:52)(ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCAC,SEQ ID NO:53)に対するコード配列によるPCRを用いて作成した。この配列でタグを付けられたタンパクはRGS-HIS抗体（キアゲン社）で認識でき、Ni-NTA樹脂（キアゲン社）でアフィニティ精製できる。これらのコンストラクトはpBluescriptSK+（ストラタジーン USA）の5'-BamHIと3'-EcoRIサイト、および哺乳類の発現ベクターpcDNA3（インビトロゲン）の5'BamHIと3'XhoIサイトにクローニングし、一過性の発現の分析に用いた。 SpeI-XhoI完全長のSADコンストラクトもpBluescriptSK+(ストラタジーンUSA) から酵母の発現ベクターpRSPにクローニングした(Superti-Furgaらエンボジャーナル12巻2625-2634ページ)。このベクターは分裂酵母ポンベにおける誘導発現のためのシャトルベクターでチアミン抑制性のプロモーターを含んでいる。このシステムは、CSKによる負の調節を調べるためにSRCファミリーメンバーを研究するのに、調節因子を更にスクリーニングするために、あるいは組換えタンパクを生成するのに役立ってきた（Superti-Furgaらエンボジャーナル12巻2625-2634ページ；Superti-Furgaらネイチャーバイオテクノロジー14巻600-605ページ）。哺乳類細胞におけるSADの一過性の発現修飾していない、ヘキサヒスチジンでタグをつけたSAD遺伝子を含むpcDNA3発現プラスミド(5μg DNA/60mmプレート)をリポフェクトアミン（ギブコBRL）で29 3細胞に導入した。48時間後、0.25mLのRIPA（20mM Tris-Cl pH 7.5,150mM NaCl, 1％トリトンX-100,1％デオキシコール酸エステル、1％SDS、１mM DTT,１mMバナジン酸ナトリウム、１mMフェニルメチルフッ化スルホン酸、２μg/mLアプロチニン,１μg/mLリューペプチンおよび25μg/mLトリプシン阻害剤）で回収した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により10％アクリルアミドゲル上で試料を展開し、ニトロセルロース膜に電気的に移した。非特異的な結合はBlotto（5％ w/vの脱脂粉乳と0.1％ v/vのツイーン20を含むトリス緩衝生理食塩水）に膜を事前に浸すことによって阻止した。組換えタンパクはアフィニティ精製したSADに特異的なポリクローナル抗体とペルオキシターゼを結合した二次抗体をECLキット（アマシャムライフサイエンス）と共に用いて検出した。ヘキサヒスチジンのタグを付けたタンパクはRGS-His抗体（キアゲン社）を用いて検出した。リン酸化チロシンを含むタンパクは非特異的結合阻止試薬として3％ BSAを用い、モノクローナル抗体4G10でウエスタンブロッティングを行うことにより検出した。 SADのC末端（実施例８参照）に対して作製し、アフィニティ精製した抗ペプチド抗体は、遺伝子導入した293細胞の〜55kDaのタンパクを認識したが、発現しているタンパクの90％以上がRIPA不溶性であった。この分子量はSADの一次構造から予測された分子量（54.510kD）に一致していた。SAD遺伝子を導入した細胞はチロシンがリン酸化された約55kDaタンパクを顕著に含んでいるが、それは対照ベクターには存在しないものである。抗SADのみでは免疫沈降できないものの、プロテインAに結合した抗SADとブロッティング抗体としての4D10を用いたIP-ウエスタンでバンドが明瞭に検出されるため、リン酸化されたタンパクは、多分SA Dそのものである。分裂酵母ポンベにおける組換えSADの発現分裂酵母ポンベは、このシステムがサークファミリーメンバーを研究するのに有用であることが判っているので、組換えSADを発現させその機能と調節を研究するために用いた（Superti-Furga et al.,エンボジャーナル12巻、2625-2634ページ；Superti-Furga et al.,ネイチャーバイオテクノロジー 14巻、600-605 ページ）。分裂酵母ポンベのSP200株（h-s leul.32 ura4 ade210）は文献記載に従って増殖させ、酢酸リチウム法によってpRSP発現プラスミドで形質転換を行った(モレノMorenoら、1991;Superti-Furga et al.,エンボジャーナル12巻、2625- 2634ページ)。細胞はnmtlプロモーターからの発現を抑制するために１μM のチアミン存在下で、また発現を誘導するためにはチアミンの非存在下で増殖させた。抑制的な条件下では、SADを発現している株は液体培養でも固相培養でも対照ベクターに比べて増殖に欠陥は見られない。この結果はSrcやFrkを含むそのほかのチロシンキナーゼの発現によって毒性を誘発することとは対照的である。この株ではSADタンパクはＣ末端に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングによって弱いバンドとして検出することができる。抗リン酸化チロシンを用いたウエスタンブロッティングではSADそのものだけがリン酸化チロシンを含むタンパクとして検出されるが、パーバナデイトの存在下では細胞性のタンパクもリン酸化される。この結果は、SrcやMKK3がホスファターゼ阻害剤の非存在下でも多くの酵母タンパクをリン酸化するというものと対照的である。このような知見は、 SADが比較的限られた基質特異性を持ち、自身を自己リン酸化することを示唆している。このような結果は293細胞における一過性発現実験とは矛盾しない。実施例10： SAD キナーゼ活性の測定以下の実施例ではSADキナーゼ活性の試験管内での測定について記載する。測定はSAD活性の調節因子を同定するのに有用である。材料と方法ヘキサヒスチジンでタグを付けたSADを発現している分裂酵母ポンベを遠心分離によって回収し、ガラスビーズ法によってNP40溶解緩衝液中（50mM Tris-Cl pH 7.5，150mM NaCl,1％ NP40,５mM 2-メルカプトエタノール、１mMバナジン酸ナトリウム、１mMフェニルメチルフッ化スルホン酸、２μg/mLアプロチニン、１ μg/mLリューペプチンおよび25μg/mLトリプシン阻害剤）で溶解した（Superti- Furgaetal.,エンボジャーナル12巻、2625-2634ページ）。酵母抽出物（100μL N P40溶解緩衝液中で100μgの全タンパク）と0.6μgのRGS His抗体（キアゲン社）および10μLのプロテインA/Gアガロース（アップステートバイオテクノロジー）を混合し、４℃で３時間反応することによって免疫沈降を行った。IP複合体は１mLの溶解緩衝液で４回洗浄し、１mLのキナーゼ緩衝液（20mM Na-HEPES pH 7.5,10mM MnCl₂,2mM 2-メルカプトエタノールおよび10μMバナジン酸ナトリウム）で１回洗浄した。キナーゼ活性の測定は15μM A TP,0.5μCig-³²P-ATPを含む40μLのキナーゼ緩衝液に基質として３μgの変性エノラーゼあるいは10μgのポリ−Glu-Tyr(4:1)を加え30℃で10分間行った。抽出物の測定には反応当たり2-10μgの全タンパクを用い、IP複合体の測定には測定当たり５μLのプロテインA/Gビーズを用いた。反応はSDS試料緩衝液を加えることによって止め、10％SDSポリアクリルアミドゲルで展開し、オートラジオグラフィで観察した。結果 SADは試験管内で変性エノラーゼおよびポリ-Glu-Tyrの両方をリン酸化することができた。両基質のリン酸化はSADを発現している酵母の粗溶解物で検出されたが、対照のベクター株の溶解物では検出されなかった。さらに、SADを発現している株からの抗His IP複合体は変性エノラーゼおよびポリ-Glu-Tyrの両方をリン酸化したが、対照株由来の抗His IP複合体はリン酸化しなかった。実施例11： PTP05 およびPTP10をコードしているcDNAクローンの単離以下の実施例で、主としてマウス脂肪、およびラットの前脳基部からの新しい PTP配列およびそれに続く完全長のPTP05配列のクローニングに関する単離と同定を記載する。また細胞や組織におけるPTP05および／あるいはPTP10を検出するのに有用なプローブも記載する。材料と方法 ob/obマウスの脂肪およびそれとは別にラットの前脳基部からの全RNAは、Chom czynskiとSacchiのグアニジン塩／フェノール抽出プロトコールを用いて単離した（P.ChomczynskiおよびN.SacchiアナリティカルバイケミストリーAnal Bioh em 162巻156ページ1987年）。これらのRNAを用いてスーパースクリプト事前増幅システム（ギブコBRL,ゲーサースバーグ,MD;Gerard らフォーカス11巻66ページ1989年）により取り扱い説明書の条件に従って１本鎖 cDNAを作成した。標準的な反応には反応用量60μLに対し10μgの全RNAを1.5μg のオリゴ(dT)_12-18と共に用いた。産物はRnaseHで処理し、水で100μLに希釈した。次のPCRの増幅については各反応に1-4μLのこのsscDNAを用いた。変性オリゴヌクレオチドはできあがっているホスホラミダイト化合物を用いてアプライドバイオシステム394 DNAシンセサイザーで台成し、エタノールで沈殿させ、精製せずにPCRに用いた。変性オリゴヌクレオチドプライマーの配列は以下の通りである：およびこれらのプライマーはそれぞれ、ペプチド配列DFWXMXW(E/D)(SEQ ID NO:19)(P TPの触媒ドメインからのセンス鎖)およびHCXAGXG(SEQ ID NO:20)（PTPの触媒ドメインからのアンチセンス鎖）に由来した。変性残基の呼称に関する標準UIPAC 名はN=A,C,G,あるいはT;R=AあるいはG;Y:CあるいはT;V=A,C,あるいはG;W=CあるいはT;S=CあるいはG;M=AあるいはC;およびH=A,CあるいはTである。 PCR反応は上述した１本鎖cDNAに適用した変性プライマーを用いて行った。10m M Tris HCl(pH 8.3),50mM KCl,1.5mM MgCl₂,200μMの各デオキシヌクレオシド３リン酸、0.001％のゼラチン、1.5UのアンプリタックDNAポリメラーゼ（パーキンエルマー/シータス）および1-4μLのDNAを含む各混合物に最終濃度が５μMになるようにプライマーを加えた。続いて95℃で３分間変性し、サイクル条件は94℃ で30秒、50℃で１分、72℃で１分45秒を35サイクルで行った。ジーンクリーンキット（バイオ101）を用いて２％アガロースゲルによって分離するとPCR断片は35 0-400塩基対のところに移動し、説明書に従ってT-AをpCRIIベクター(インビトロゲン社USA)にクローニングした。ミニプラスミドDNA調製のためにキアゲンカラムを用いてクローンを選抜し、アンプリタックDNAポリメラーゼFS（ABI フォスターシティCA）を用い、サイクル配列決定色素停止キットによってプラスミドDNAの配列を決めた。配列決定反応はABIプリズム377DNAシーケンサーで実行し、BLAST調整アルゴリズム（Altsch ul,S.F.らJ.Mol.Biol.215巻403-410ページ）で分析した。SuPTP05と名付けた新規のPTP(R90-2-22)をコードするクローンの数コピーをマウスの脂肪組織から単離し、関連したクローンPTP10をラットの前脳基部から単離した。新規のホスファターゼPTP05をコードする完全長のcDNAを得るために、元々のP CR断片に由来するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にRACE（cD NA末端の迅速増幅）を行った。マウスの精巣から作成したマラソンレディcDNA( クロノテック、パロアルトCA)を以下のプライマーと共にRACE反応に用いた。 RACEプライマー：AP-1およびAP-2(クロノテック) PTP05の配列決定をするためのRT-PCRのプライマー単離されたSuPTP05をコードしているcDNA断片はDNAの配列によって確認し、続いてマウス精巣のcDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。 PTP05をコードしている完全長の転写物を単離するために、２つのマウス精巣c DNAライブラリー(lZapII,ストラタジーン、ラホヤ、CAおよびlgt10、クロノテック)をスクリーニングした。5'あるいは3'-RACE断片をランダムプライムによって³² P標識し、２x10⁶cpm/mLでハイブリッド形成のプローブとして用い、標準的方法にてライブラリーをスクリーニングした。事前ハイブリッド形成（３時間）およびハイブリッド形成（一晩）は、5 x SCC,5xデンハーツ溶液、2.5％硫酸デキストラン、50mM Na₂PO₄/NaHPO₄(pH 7.0),50％ホルムアミドおよび100μg/mLの変性サーモン精子DNAの中で42℃にて行った。0.1 x SSCおよび0.1％ SDSにて65℃ で洗浄を十分行った。重複する数個のクローンを単離し、PCR断片(R90-2-22)とR ACE産物の共通の配列を補うことが判った。最終的な配列は、アンプリタックDNA ポリメラーゼ，FS（ABI、フォスターシティCA）と共にサイクル配列決定色素停止キットを用いて両方の株の配列により確認した。配列決定反応はABIプリズム3 77DNAシーケンサーにより実行した。完全長のPTP10も同じ方法で得ることができる。結果：マウスのPTP05主な転写産物は、1785個のヌクレオチドで、予測された分子量494 22ダルトン（SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:11）で予測された426個のアミノ酸ペプチドをコードしている。PTP05をコードしている配列には198ヌクレオチドの5' 側非翻訳領域があり、3'側には279ヌクレオチドの非翻訳領域があり、ポリAで終了している。主要なオープンリーディングフレームの上流の３つのフレームにはすべてインフレーム停止コドンがある。199番目のヌクレオチドがATGで始まっているのは開始コドンがメチオニンであるというコザックのコンセンサスに一致している。あるクローン(#6.1)は328番目の塩基で111塩基対の挿入があり、コード配列に37個のアミノ酸をインフレームで付加している。２番目のクローン(#10.1 )は1415番目から93塩基対の欠失があり、フレームシフトが起きて読み取りは早期に終了している。198番目の5'UTRの上流では多数のクローンが２つのグループに分かれ、5'UTRをさらに98-153塩基対に伸ばしている。さらにあるクローン（#15.3）では1758番目でポリＡ配列を欠き、他の300のヌクレオチドで3'UTRを伸ばしている。アミノ酸配列にはシグナル配列も膜貫通ドメインも見当たらず、PTP05は細胞内タンパクであろうと思われる。マウスのPTP05のN末端ドメインはアミノ酸配列の１から187までで独特のものである、すなわち重複しないタンパクのデータベースでどのタンパクとも十分な相同性を持たない。重複しないタンパクのデータベースとはGenBank Genpept,PIRおよびスイスプロットからのペプチド配列で構成されているものである。アミノ酸配列188-420番目でタンパクチロシンホスファターゼの触媒ドメインが１つある。触媒ドメインは５つのほかのファミリーにおけるPTPとの間にアミノ酸レベルで相対的には低いけれども同一性（40-47％）がある：すなわちZPEP（マウス）（46.7％）,PTP-BAS（ヒト）（45.6％）,DEP（ヒト）（40.5％）,PTP-g（ヒト）（40.6％）で、このことはそれが新しいPTPファミリーであることを示唆している。触媒ドメインを越えた421-426番目がPTP05 のC末端配列になるが、ほかのタンパクチロシンホスファターゼとの相同性はない。PTP05には存在しない、ほかの哺乳類PTPの細胞質ドメインで見つかったモチーフにはSH2,タリン/エゼリン様、PEST,GLGFおよびレチナールデハイド結合タンパクドメインがある。ほかとは異なった触媒ドメインであり、良く知られた非触媒モチーフが存在しないことから、我々はPTP05を新しい別のタンパクチロシンホスファターゼと呼ぶことにした。マウスPTP05で別のタイプのものではN末端コード領域に111塩基対の挿入があり、37個のアミノ酸を増やしている(SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:12)。この189 6塩基対の“長い”型のマウスPTP05は463個のアミノ酸をコードし、予想分子量は53716ダルトンである。挿入はアミノ酸配列の44-80番目にあり、重複しないタンパクのデータベースのどのタンパクとも十分な相同性はない。 PTP05の第三の型は、1415-1507塩基対で欠失があり、その結果フレームシフトが起きC末端で切断されて406-412番目のアミノ酸が変わっている(SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:13)。1692塩基対の“C端が短い”マウスのPTP05は412個のアミノ酸をコードし、予想分子量は47233ダルトンである。ラットのPTP10クローンはマウスのPTP05との間でＤＮＡレベルで92％(320個のヌクレオチド)およびアミノ酸レベルで85％（107個のアミノ酸）の同一性を持っている（図１参照）。２つの触媒ドメインの相同性レベルによってPTP05とPTP10 は別のしかし関連ある遺伝子であることが示唆され、PTP10は新しいPTPファミリーの第二のメンバーであると見なされる。ラットPTP10配列の一部をSEQ ID NO:6 (核酸)およびSEQ ID NO:14（アミノ酸）に示す。実施例12： PTP05 の発現以下の実施例では正常なマウスの組織におけるPTP05およびPTP10の発現の評価を示す。ヒトのPTP05あるいはPTP10を用いてヒトの組織で同様の分析を行うことができる。材料と方法：成獣マウスの８つの組織（肺、精巣、脳、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、骨格筋）で、レーン当たり２μgのポリA+mRNAを用いた、電荷を修飾したナイロン膜上でのノーザンブロット法はクロノテック（#7762-1、パロアルト、CA）から入手した。 R90-2-22（上記参照）のEcoRI断片241塩基対から合成し、ランダムプライムで [a³²P]dCTPを標識したプローブと膜をハイブリッド形成させた。５ x SCC,2％ S DS,10xデンハーツ溶液，1-2 x 10⁶cpm/mLの³²Ｐを標識したＤＮＡプローブと共に100μg/mLの変性サーモン精子DNA、50％ホルムアミドを含む中でハイブリッド形成は42℃にて一晩かけて行った。膜は室温にて2 x SSC/0.05％ SDSで30分間洗浄し、さらに50℃にて0.2 x SSC/0.1％ SDSで30分洗浄してコダックXAR-2フィルムに一晩感光した。同様の分析としてラットの正常組織を用い、ラットのPTP10断片320塩基対をプローブとしてノーザンブロットを行った。新規PTPのRT-PCRによる検出新鮮に凍結したマウスあるいはラット（別々に）の組織から塩化セシウム層を介した遠心分離によって全RNAを単離した。20μgの全RNAはランダムヘキサマーとモロニーマウス白血病ウイルスの逆転写酵素(スーパースクリプトIIギブコBRL ，ゲーサーズバークMD)によって逆転写した。SuPTP05をコードしているcDNAを増幅するためにPCRを用いた。逆転写酵素だけを欠いているRT-PCRを対照として行った。PCR産物は3％アガロースゲル上で電気泳動を行い、臭化エチジウム染色により観察し、UV光箱の中で写真を撮影した。マウスのPTP05に特異的な161塩基対断片の濃度をほかのRNA試料と比較した。３というランク付けはノーザンブロット分析で確認されたPTP05の転写物が多量にあることを示し、０というランクでは転写物がほとんどないか、まったくないことを示す。結果ノーザン分析ではおよそ3.4kbの単一のマウスPTP05 mRNA転写物が確認され、もっぱら精巣に発現していることが判明した。肺、脳、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、骨格筋には発現していなかった。PTP10はやや小さいサイズのバンドとハイブリッド形成したが、この分析でもやはり精巣にだけ発現していた。ノーザン分析によればラットPTP10は２つのmRNA転写物およそ3.3kbと1.8kbが確認され、精巣にのみ発現していた。ラットの心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋および腎臓からの試料には発現していなかった。プライマー対に特異的な遺伝子を用いたRT-PCRによれば、PTP05をコードしている転写物の発現はノーザン分析の結果を裏付け、また低いレベルではあるが、脂肪、腎臓、小腸および造血系や免疫系の細胞や組織でも検出された。造血系と免疫系には脾臓、胸腺、リンパ節、骨髄、および末梢血リンパ球が含まれる。プライマーに特異的なラットPTP10遺伝子を用いたRT-PCRでは、ノーザン分析の結果が確認され、ラットの精巣sscDNAのみに強いシグナルが検出され、ラットの骨格筋、心臓、腎臓、脾臓、副腎、肺、腸、子宮、脊髄、脳、外皮および卵巣に相当するテンプレートには検出されなかった。 PTP05が造血系や免疫系の細胞に相対的な選択的発現を示したということは、Ｔ細胞やＢ細胞の生存、分化、共刺激、および/あるいは炎症、免疫抑制または自己免疫疾患にこれが含まれる可能性を示唆している。さらに脂肪組織(PTP05が元々単離された組織でもある)における発現は、これが糖尿病のような代謝性疾患に関わる可能性を示唆している。実施例13： PTP05 の組換え発現以下の実施例では組換えPTP05発現のためのベクター構築とPTP05を発現している組換え細胞株の作成を示す。同様のベクターと組換え細胞株はここに記載する方法とPTP10を用いても作成することができる。発現ベクターの構築発現コンストラクトは、PCRを用いた突然変異誘発法によって作成し、カルボキシ末端にインフルエンザ菌の血球凝集素(HA)エピトープYPYDVPDYAS(SEQ ID NO :55)（Pati,上記）をタグとしてPTP05全体のコードドメインに目印をつけた。このコンストラクトを２つの哺乳類発現ベクターに導入した：ウイルス産生株の作成にはpLXSN（MillaerA.D.& Rosman G.J.Biotechniques 7巻、980-988ページ，1 989年）；および哺乳類細胞における一過性の発現のためにはpRK5である。保守的なHis-Cys-Ser-Ala-Glyモチーフで変異のないCysをPCRの突然変異誘発法によりAlaに変えることによる顕性不活性PTP05コンストラクトをpLXSNとpRK5 の両方で作成した。開始メチオニンを除くPTPO5の全オープンリーディングフレームをPCRで作成し、ウサギに免疫して抗体を取る目的で、GST融合タンパクの細菌産生のためにpGE Xベクターに結合した。このベクターはグルタチオンSトランスフェラーゼのコード配列とそれに続く組換え融合タンパクを生成するためのポリリンカーを含んでいる。GST部分は融合タンパクのＮ末端部を構成している。哺乳類細胞における一過性の発現 HAでタグを付けたPTP05遺伝子を含むpRK5発現プラスミド(10μgDNA/100mmプレート)をリポフエクトアミン(ギブコ BRL)によってCOS細胞と293細胞に導入した。72時間後、細胞は0.5mLの溶解緩衝液（20mM HEPES pH 7.35,150mM NaCl,10％グリセロール、1％トリトンX-100,1.5mM MgCl₂，１mM EGT A,2mMフェニルメチルフッ化スルホン酸、１μg/mlアプロチニン）中に回収した。試料溶液は15％アクリルアミド/0.5％ビスアクリルアミドのSDSポリアクリルアミドゲル(PAGE)電気泳動で展開し、電気的にニトロセルロースに移した。非特異的な結合はBlotto(5％ w/v脱脂粉乳および0.2％v/vノニデットP-40を含むリン酸緩衝液生理食塩水)に事前に浸すことによって阻止し、組換えタンパクはHAデカペプチドタグに対するマウスのモノクローナル抗体を用いることによって検出した。別の方法としてはPTP05に特異的な抗血清を用いて組換えタンパクを検出することもできる。ウイルス産生細胞株の作成 PTP05遺伝子を含んでいるpLXSN組換えコンストラクトを塩化カルシウム法によって広宿主性ヘルパー細胞株PA317に形質移入した。G418（500μg/mL）で選抜したのち、G418を含まない通常の培養液に細胞を入れた。抵抗性細胞の培養上清を狭宿主性のヘルパー細胞株GP+E86に感染させ、再び細胞をG418で選抜した。抵抗性の細胞からG418を除き、培養上清を8-12時間毎に回収し、ウイルスストックとして集めた。Redemannら1992年、Mol.Cell.Biol.12巻491-498ページ。ウイルスストックの力価は通常〜10⁶/mLである。哺乳類細胞における安定的な発現 NIH-3T3およびBAL/3T3を100mmプレートにて10％牛胎児血清(FCS)を含むDMEM（ギブコ）培地で培養した。15mLの培養液に３mLのウイルス培養上清をおよそ24時間加えることによってPTP05レトロウイルスを細胞に感染させた。500μg/mLのG4 18を添加したDMEM中で増殖させることによってレトロウイルス由来のコンストラクトを発現している細胞を選抜した。実施例14：抗PTP05抗体の作成ヒトPTP04にあるユニーク配列に相当する３種の合成ペプチドにKLHを結合してプールしたものに対してウサギでPTP05特異的な免疫試薬を作成した。ペプチド（下記参照）はC末端残基でKLHと結合した。ウサギを免疫するのに用いたペプチド PTP05: PTP05のコード領域全体を含む融合タンパクを精製したものでウサギを免疫して別の免疫試薬も作成した。GST融合タンパクはSmithら、Gene 67巻31ページ1988 年にあるように大腸菌株DH5αで作った。細菌タンパク溶解物は上記Smithらに従ってグルタチオン-セファロース樹脂で精製した。実施例15： PTP05 活性の測定材料と方法：組換え野生型と顕性不活性型（シグナル伝達不能）のPTP05（上記の実施例13 参照）はGST融合タンパクとして細菌から精製した。溶解物をグルタチオン-セファロース樹脂に結合させ、1 x HNTGで２回洗浄したのち、100mM 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)、pH 6.8,150mM NaClおよび１mM EDTAを含む緩衝液で１回洗浄した。ホスファターゼ活性の測定は一般的なPTPの基質としてp-ニトロフェノールリン酸(PNPP)を用いて、Peiら（1993）に従って行った。手短に言えば、最終洗浄の段階ののち、50mLの測定緩衝液（100mM MES pH 6.8,150mM NaCl,10mM DTT,2mM EDTAおよび50mM PNPP）を樹脂に結合したタンパクに加えることによって反応を開始させた。試料は23℃にて20分反応させた。40μLの各試料に960μLの1N NaOH を混合することにより反応を停止し、p-ニトロフェノールの吸収を450nmで測定した。沈殿物にPTP05があることを確かめるためには、沈殿物をSDS試料緩衝液中で煮沸し、SDS-PAGEで分析した。PTP05の存在は抗PTP05抗体を用いた免疫ブロット分析で検出した。実施例16： ALP をコードしているcDNAクローンの単離以下の実施例ではマウスの組織からの新しいPTP配列の単離と同定およびそれにつづく完全長のヒトALPのクローニングを記載する。また、細胞や組織でALPを検出するために有用なプローブについても記載する。材料と方法：正常マウスの脂肪およびラットの下垂体からの全RNAは、一般に知られているグアニジン塩／フェノール抽出プロトコールを用いて単離した。 ChomczynskiおよびSacchi 1987年アナリティカルバイケミストリーAnal Bio hem 162巻156ページ。これらのRNAを用いてスーパースクリプト事前増幅システム(ギブコBRL,ゲーサースバーグ,MD;Gerardらフォーカス11巻66ページ 1989年) により取り扱い説明書の条件に従って１本鎖cDNAを作成した。標準的な反応には反応用量60μLに対し10μgの全RNAを1.5μgのオリゴ(dT)_12-18と共に用いた。産物はRnaseHで処理し、水で100μLに希釈した。次のPCRの増幅については各反応に1-4μLのこのsscDNAを用いた。変性オリゴヌクレオチドはできあがっているホスホラミダイト化合物を用いてアプライドバイオシステム394 DNAシンセサイザーで合成し、エタノールで沈殿させ、精製せずにPCRに用いた。変性オリゴヌクレオチドプライマーの配列は以下の通りである：これらのプライマーはそれぞれ、ペプチド配列DFWXMXW(EID)(SEQ ID NO:19)(P TPの触媒ドメインからのセンス鎖)およびHCXAGXG(SEQ ID NO:20)(PTPの触媒ドメインからのアンチセンス鎖)、およびIPGSDYI(N/H)A(SEQ ID NO:61)に由来した。変性残基の呼称に関する標準UIPAC名はN=A,C,G,あるいはT;R=AあるいはG;Y=CあるいはT;V=A,C,あるいはG;W=CあるいはT;S=CあるいはG; M=AあるいはC;およびH=A,CあるいはTである。 PCR反応は上述した１本鎖cDNAに適用した変性プライマーを用いて行った。10m M Tris HCl(pH8.3),50mM KCl,1.5mM MgCl₂,200μMの各デオキシヌクレオシド３リン酸、0.001％のゼラチン、1.5UのアンプリタックDNAポリメラーゼ（パーキンエルマー/シータス）および1-4μLのＤＮＡを含む各混合物に最終濃度が５μMになるようにプライマーを加えた。続いて95℃で３分間変性し、サイクル条件は94 ℃で30秒、50℃で１分、72℃で１分45秒を35サイクルで行った。ジーンクリーンキット（バイオ101）を用いて２％アガロースゲルによって分離するとPCR断片は 350-400塩基対のところに移動し、説明書に従ってT-AをpCRIIベクター（インビトロゲン社）にクローニングした。ミニプラスミドDNA調製のためにキアゲンカラムを用いてクローンを選抜し、アンプリタックDNAポリメラーゼFS（ABI フォスターシティCA）を用い、サイクル配列決定色素停止キットによってプラスミドＤＮＡの配列を決めた。配列決定反応はABIプリズム377DNAシーケンサーで実行し、BLAST調整アルゴリズムで分析した。Altschul,S.F.らJ.Mol.Biol.215巻403-410ページ。新規PTP(s50-151)をコードしている１つのクローンをマウスALPと名付け、変性オリゴヌクレオチドPTP DFW(SEQ ID NO:17)とPTPHCSA(SEQ ID NO:18)を用いてマウスの脂肪組織から単離し、関連したラットのALPクローンは変性オリゴヌクレオチドPTPYINA(SEQ ID NO :60)とPTPHCSA(SEQ ID NO:18)を用いてラット下垂体から単離した。完全長のヒトのALPを単離するために、ヒト神経芽細胞腫IMR32から得たポリA+ RNAからラムダZapII(ストラタジーン、ラホヤ、CA)にヒトcDNAライブラリーを構築した。ALPをコードしている転写物を単離するためにライブラリーをスクリーニングした。マウスのALP断片を³²Pで標識し、2 x 10⁶cpm/mLでハイブリッド形成のプローブとして、以下のような標準的な方法でライブラリーをスクリーニングした。事前ハイブリッド形成と（3時間）とハイブリッド形成（一晩）は５ x SSC,５xデンハーッ溶液、2.5％硫酸デキストラン、50mM Na₂PO₄/NaHPO₄[pH7.0 ],100mg/mLの変性サーモン精子DNA、50％ホルムアミド中で42℃にて行った。0.1% SDSを含む0.1 x SSCで65℃にて十分洗浄した。複数のクローンを単離した。ひとつは4.5kbのクローンで、ALPの全コード領域を含んでいた。最終的な配列は、アンプリタックDNAポリメラーゼ,FS(ABI、フォスターシティCA）と共にサイクル配列決定色素停止キットを用いて両方の鎖の配列により確認した。配列決定反応はABIプリズム377DNAシーケンサーにより実行した。結果： 4,456塩基対のヒトALPヌクレオチドは1,274個のポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列にはシグナル配列や膜貫通ドメインは見られないので、細胞内タンパクである。N末端はアミノ酸の1-857番目でチロシンのリン酸化部位と思われる部位が数個あり、プロリン−リッチ領域(30.6％がプロリン)は353-777番目である。このプロリン−リッチ領域は、遠く離れた植物の進展タンパクと関連があり(スミス−ウオーターマンアライメントによればトウモロコシの進展様タンパクGB:z34465と30.2％の同一性がある。)、SH3モチーフに含まれているタンパク相互作用のための部位と同様にタンパク相互作用のドメインを意味しているのかも知れない。ALPのC末端領域はアミノ酸の1097-1274番目にあたり、PESTモチーフに似たプロリンｌセリンリッチ領域を含んでいる（アミノ酸配列の1101-1 214番目でセリンとプロリンは45.6％）。この領域はまたSH3モチーフを介した結合タンパクの標的として働きうる。触媒ドメインはアミノ酸配列858-1096番目で複数のサブファミリーのPTPと32- 37％の同一性があり:TC-PTP(P17706:37.1％)PTP-BAS(D21209:32.9％),PTPα(M34 668:34.2％),PTPβ(P23467:34.2％),PTPδ(A49104:33.2％),PTPIB(P20417:34.9 ％)、これがPTPの新しいファミリーであることを示唆している。ほかのすべての細胞質PTPではその触媒ドメインはＮ末端部分かＣ末端部分のどちらかにあるのに対して、ALPの触媒ドメインは中央部にあり大きなＮ末端とＣ末端に挟まれている。触媒ドメインではほかのPTPにあるようにほとんどの残基は変異なく保存されているが、いくつか非定型のものもある。ALPでは、アミノ酸配列HCSAG(SEQ ID NO:56)はHCSSG(SEQ ID NO:75)に変わっている（アミノ酸配列番号1029-1033）。このモチーフはPTP1BおよびPTPaの結晶構造の触媒部位にあり、AlaからSerへの変換は触媒活性や特異性に影響するかも知れない。触媒ドメインでは表面ループと予想される部位でALPではWPDからWP Eへの変換がある（アミノ酸配列993-995番目）。PTP1Bではこのアスパラギンは塩橋に関わり、特異的なペプチド基質と結合するという点で触媒ドメインに入る。このAspからGluへの変換はほかにも３つの哺乳類PTP(PTPD1,PCP2,PTPS31)で認められる。実施例 17： ALP の発現以下の実施例では正常なヒト組織および数多くの種類の癌におけるALP発現の評価を示す。材料と方法: 60種の腫瘍細胞株（HOP-92,EKVX,NCI-H23,NCI-H226,NCI-H322M,NCI-H522,A549 ,HOP-62,OVCAR-3,OVCAR-4,OVCAR-5,OVCAR-8,IGROV1,SK-OV-3,SNB-19,SNB-75,U25 1,SH268,SF-295,SF-539,CCFR-CEM K562,MOLT-4,HL-60,RPMI 8226,SR,DU-145,PC- 3,HT-29,HCC-2998,HCT-116,SW620,CoLo 205,HTC15,KM-12,UO-31,SN12C,A498,CaK il,RXF-393,ACHN,786-0,TK-10,LOX IMVI,Malme-3M,SK-MEL-2,SK-MEL-5,SK-MEL-2 8,UACC-62,UACC-257,M14,MCF-7,MCF-7/ADR,RES,Hs578T,MDA-MB-231,MDA-MB-435, MDA-N,BT-549,T47D）（NickScuidero，米国国立ガン研究所、開発治療プログラム、ロックビル，MDから入手した。）を用い、レーン当たり20μgの全RNAを使ってノーザンブロットを行った。全RNA試料を変性ホルムアルデヒド１％アガロースゲル上で展開し、ニトロセルロース膜（バイオラッドCA）上に移した。さらにヒトの16種の正常組織（胸腺、肺、大腸、精巣、脳、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、子宮、前立腺、骨格筋、末梢血白血球、胎盤、小腸）を用い、レーン当たり２μgのポリA+mRNAで、荷電を修飾したナイロン膜（多臓器ブロット#7760-1および#7766-1、クロノテック、パロアルト、CA）上にてノーザンブロットを行った。 ALPのEco-RI-NotIの１kb断片から合成し、ランダムプライムで[γ-³²P]dCTP標識したプローブと全RNA試料が乗ったニトロセルロース膜をハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成は、4 x SSPE,2.5 x デンハーツ溶液、50％ホルムアミド、200μg/mL変性サーモン精子DNA,100μg/mL酵母tRNA（ベーリンガーマンハイムIN）、0.2％ SDS,および５ x 10⁶cpm/mLの[γ-³²P]dCTP標識DNAプローブに入れてTechneハイブリダイザーH-1上で42℃にて行った。ブロットは2 x SSC,0.1 ％ SDSで65℃にて20分間２回洗浄し、さらに0.5 x SSC 0.1％ SDSで65℃にて20 分間洗浄した。ブロットを写真画像画面に24時間感光し、モレキュラーダイナミクスフォトイメージャーSFにて観察した。クロノテックのナイロン膜のブロットについては、ハイブリッド形成は5 x SS C，2％ SDS,10xデンハーツ溶液,50％ホルムアミド、100μg/mLの変性サーモン精子DNAおよび1-2 x 10⁶cpm/mLの[γ-³²P]dCTP標識ＤＮＡプローブ中で42℃にて行った。ブロットは室温にて2 x SSC/0.05％ SDSで30分間洗浄し、続いて0.2 x SS C/0.1％ SDSで50℃にて30分間洗浄し、コダッタXAR-2フィルムに48時間感光した。逆転写酵素を用いたPCRによる発現の分析については、様々な細胞株および新鮮凍結組織から塩化セシウム層を介した遠心分離によって全RNAを単離した。ランダムヘキサマーとモロニー白血病ウイルスの逆転写酵素（スーパースクリプト II、ギブコBRL、ゲーサーズバーグ、MD）によって20μgの全RNAを逆転写した。それからALPをコードしているcDNAを増幅するためにPCRを用いた。逆転写酵素だけを欠いた逆転写PCR(RT-PCR)を対照として行った。PCR産物は３％アガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで染色して観察し、UV光箱にて写真を撮影した。 ALPに特異的な断片の濃さをいろいろなRNA試料で比較した。４というランク付けはALPの転写物が大量にあることを示し、０というランクは検出できる転写物がほとんどないかないことを示す。RT-PCRでは全RNAを用いるのに対してノーザンブロット分析は濃縮したRNA(mRNA)をもとにするために、RT-PCRで検出されるタンパクの方がノーザンブロットよりも相対的に量が多くなることに注意すべきである。結果ノーザンブロットでおよそ5.0kbの単一のALPmRNA転写物が観察された。この転写物は調べた正常組織試料のほとんどで同定された。しかしながら、表１に示したノーザン分析の結果によれば、ALPのmRNAの相対的な量は極めて様々である。正常組織では、膵臓に続いて心臓、精巣および骨格筋で高いレベルのALPが検出された。低いレベルのALP転写物は胎盤、胸腺、肺、脳、肝臓、脾臓、子宮、前立腺および小腸で確認された。ALP転写物が検出されなかったのは大腸、腎臓および末梢血白血球であった。ALPの発現はRT-PCR法で正常ヒト脂肪細胞でも検出された。ヒト腫瘍細胞株から得た全RNAのノーザンブロットではALPのRNA転写物は、NCI -H226（肺癌）、SK-OV-3（卵巣癌）、およびRPMI8226(白血病)細胞株で最も多く検出された。転写物のレベルが低かったのは、SNB-19(CNS腫瘍)、SF-268(CNS腫瘍)、SN12C(腎臓癌)、SK-MEL-2（メラノーマ）、UACC-62（メラノーマ）、およびUACC-257（メラノーマ）だった。残りの44のヒト腫瘍細胞株ではALP転写物は検出されなかった。ALP発現の要約を以下の表１に示す＊ノーザンブロットmRNA ALPは腫瘍細胞における発現の方が、相当する正常組織に比べて増えることを示している。発現にこのような差があるということは、形質転換の発生や維持にAL Pが含まれる、あるいはそこでALPが調節できなくなるという可能性を示唆している。実施例18： ALP の組換え体発現以下の実施例は組換え体ALPの発現のためのベクターの構造およびALPを発現する組換え体細胞系の創造を説明する。発現ベクターの構造発現構造物はPCR支援突然変異生成により生成され、その場合にALPの全体の遺伝暗号を指定する領域が一時的発現分析のために哺乳類の発現ベクターpcDN AIII（インビトロゲン）に導入された。別のALP構造物はオリゴヌクレオチドに基づくPCR突然変異生成により造られ、PTP関連ドメインの非定型残基を他の触媒的に活性なPTPにもっと普通に存在するアミノ酸に変換する。これらの変換は次の通りである：アミノ酸861の位置でHisをTyrへ変換（配列ID番号２参照）；アミノ酸902でAlaをGlyへ変換；アミノ酸941でPheをtrpへ変換；アミノ酸995でGlu をAspへ変換；およびアミノ酸1032でSerをAlaへ変換。上記のように対の突然変異を有する別の構造物はアミノ酸の位置941/1032および602/1032に対して生成された。これらの構造体はCMVプロモーターの後ろにあるpcDNAII哺乳類発現ベクターの中に結紮された。イニシエーションのメチオニンを除く全ALP読みとり枠はPCRにより生成され、抗体生成のためウサギの免疫感作用GST融合タンパク質のバクテリアによる製造のためにpGEXベクター（スエーデン、ウプサラ、ファーファシア・バイオテック社）に結紮された。このベクターはグルタチオン-S-トランスフェラーゼの遺伝暗号を指定する配列を有し、その後に組換え体融合タンパク質を生成するためのポリリンカーを有する。GST部分は融合タンパク質のN-末端部分を有する。様々なALP突然変異体がまた組換え体タンパク質反応物の生成のためにpGEXベクターの中に挿入された。哺乳類細胞における一時的発現 ALP遺伝子の野生型および突然変異形を有するpcDNAIII発現プラスミド（10μg のDNA/100mmのプレート）がリポフェクタミン(Gibco BRL)と共に293細胞中に導入された。72時間後に、その細胞が0.5mLの可溶化緩衝液（20mMのHEPES・pH7.35 、150mMのNaCl、10％グリセロール、1％トリトンX-100、1.5mMのMgCl₂、１mMのE GTA、2mMのフェニルメチルスルホニルフッ化物、1g/mLのアプロチニン）中に採取された。試料のアプリコートが15％アクリルアミド／0.5％ビスアクリルアミドのゲル上にSDSポリアクリルアミドゲル電子泳動により分離され、電子泳動によりニトロセルロースへ運ばれた。非特定の結合がブロット(Blotto:5％w/vの脱脂乾燥ミルクと0.2％v/vのノニデットP -40を含有する燐酸塩緩衝食塩水（シグマ社）)中でブロットを予め培養することにより阻止され、組換え体タンパク質がアミノ末端352残基に特定の抗血清を使って検出された（下記参照）。組換え体ALPタンパク質が約180kDa移動し、1274 アミノ酸タンパク質の予測された分子量と一致した。内生的なALPが、ヒト神経膠芽細胞種(U87MG,ATCC HTB 14;U118MG,ATCC HTB 15 ;U138MG,ATCC HTB 16;A172,ATCC CRL 1620;Hs683,ATCC HTB 138)、齧歯類動物神経膠腫(C6、ATCC 107)、齧歯類動物下垂体腫瘍（ATT20,ATCC CCL 89;GH3,ATCC C CL 82.1)、ヒト神経芽腫(SKNMC、ATCC HTB 10;IMR 32,ATCC CCL 127)および齧歯類動物の副腎の褐色細胞腫(PC12,ATCC CRL 1721)を含む様々な腫瘍細胞系から由来する溶解物のウエスターンブロットにおいて200kDタンパク質として検出された。ALPタンパク質は非形質転換細胞系NIH3T3(ATCC CRL 1658)から免疫沈降できなかった。本来のALPタンパク質(200kDa)がトランスフェクション293細胞（180kDa）において検出された組換え体ALPより大きいように見える理由は不明である。その差は代わりのRNAスプライシングの結果であるか、または内生的に発現される場合の細胞系における翻訳後の変更の結果である。予備実験は、ALPは血清上で燐酸化され、トランスフェクションされた293細胞においてはトレオニン残基であることを示している。さらに、いくつかのチロシン燐酸化タンパク質は、抗ホスホチロシン抗体を使用し、その後でホスファターゼ阻害剤過バナジウム酸塩で処理した後で例えばIMR32などのヒト腫瘍細胞系から内生的ALPを免疫沈降させることによりウエスターンブロット法で検出されるので、ALPと関連がある。ウイルス生成細胞系の発生 ALP遺伝子を含むpLXSN組換え体構造物はCaCl₂媒介トランスフェクションを使って両性酸ヘルパー細胞系PA317の中にトランスフェクトされる。G418上での選択の後で、その細胞はG418なしで通常の媒体上で培養される(500μg/mL)。耐性細胞からの上澄み液が使用されて外生性ヘルパー細胞系GP+E86に感染させ、細胞は再びG418上で選ばれる。耐性細胞は再びG418から採取され、その上澄み液は8-12時間ごとに採取され、ウイルスの原料としてプールされる。レデマンら、1992年、Mol.Cell.Biol.12:491-498.。ウイルス原料の滴定濃度は、典型的には10⁶/ml以下である。哺乳類細胞における安定な発現 NIH-3T3、BALB13T3または他の適当な細胞を10％の子牛の血清(FCS)を含むDMEM （ギブコ）を入れた100mmのプレートで培養する。細胞は約3mLのウイルスの上澄み液を15mLの培養地に加えることにより約24時間にわたりALPレトロウイルスで重感染される。レトロウイルス構造物を発現する細胞は次にDMEM／500μg／mLの G418を補った10％FCSにおける成長により選択される。実施例19：抗Alp抗体の発生 ALP特定免疫反応物は、GST-融合タンパク質として発現されたALPのバクテリアにより発現されたN-末端352アミノ酸部分でウサギを免疫化することにより生成された。融合タンパク質はグルタチオン−セファロースのカラムを使って親和力精製された（ファーマシア）。ALPのN-末端部分に対する多クローン性抗血清は精製されたGST融合タンパク質でウサギを繰り返し免疫化することにより生成された。親和力精製されたALP抗体はグルタチオンーセファロース上で固定されたA LP-GST融合タンパク質に血清IgGを結合し、低いpHおよび高塩で溶離することにより得られた。実施例20：触媒活性のモジュレーター用のALP活性検定のための検定材料と方法：組換え体野生型および突然変異ALPタンパク質はバクテリアからGST融合タンパク質として精製される。溶解物はグルタチオン−セファロース・マトリックスに結合され、グルタチオンで溶離される。精製されたタンパク質は次に２ｘ1mLのH NTGで洗浄され、その後で100mMの2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)、p H6.8、150mMのNaCl、および1mMのEDTAを含有する緩衝液1mLで１回洗浄する。ホスファターゼ活性についての検定は一般的PTP基質としてp-ニトロフェノール燐酸塩(PNPP)を使ってペイら(1993年)により説明されるように本質的に行われる。要するに、最後の洗浄工程の後で、反応は50mLの検定緩衝液（100mMのMES、pH6.8、150mMのNaCl、10mMのDTT、2mMのEDTA、および50 mMのp-ニトロフェニル燐酸塩）を沈降物に加えることにより開始される。試料は 23℃で20分間培養される。反応は各試料（ビーズなし）の40μLを1NのNaOH 960 μLと混合することにより終了され、p-ニトロフェノールの吸光度は450nmで測定された。沈降物中にALPの存在を制御するために、沈降物はSDS試料緩衝液中で沸騰され、SDS-PAGEにより分析される。ALPの存在は次にALP抗体で免疫ブロット分析により検出された。実施例21： ZAP70 キナーゼ活性の首尾一貫した測定方法下記の議定書は、読み出されたようにバンドIII-GSTのホスホリル化を測定するZap70タンパク質キナーゼ活性を決定するために使用された反応物と方法を説明している。この検定はZap70の抑制剤を求める場合に使用される。材料と反応物１．Zap70の突然変異により活性化された形について遺伝暗号を指定するバキュロウイルス（ファーミンゲン社、カリフォルニア）の場合、492の位置のチロシン残基がフェニルアラニン残基(Y492F)と置き換えられ、C-末端HAタグおよびN -末端GSTタグ（GST-Zap70-HA)を含有するものが使用されている。変性タンパク質はGZHと名付けられている(すなわち、Y492F GST-Zap70-HA=GZH)。２．細胞溶解物；SF9細胞は96時間にわたり10のMOIでGZHウイルスに感染された。その細胞は次に１回PBSで洗浄され、溶解緩衝液において溶解された。不溶解性材料は遠心分離により除去された（10000 ｘｇで５分）。溶解物のアリコートは乾燥した氷／エタノール上に凍結され、使用するまで-80℃で貯蔵された。３．バンドIII-GST：バンドIII-GAT融合タンパク質（アミノ酸配列：MEELQDYE DMMEEN(配列ID番号:62)）はpGEX-2TK-バンドIIIで形質転換されたXLIブルー細胞において発現された。タンパク質発現は25℃で18時間にわたりバクテリア培養基を振動させながら0.5mMのIPTGを添加することにより引き起こされた。バンドIII-GST byはカリフォルニア州アラメダにあるファーマシア社のグルタチオン親和カクロマトグラフィにより精製された。４．ビオチニル化ITAMペプチド242(ZETA-pY)、配列：YQQGQNQLpYNELNLGRREEpYDVLDKRRGRD(配列ID番号：63)（タンパク質化学研究所、カリフォルニア州レッドウッド市のスゲン社）。５．DMSO、ミズーリ州セントルイスのシグマ社。６．96個のくぼみを有するELISAプレート：コーニング96くぼみ付きイージイ洗浄、変形平底プレート。カタログ番号25805-96。７．NUNC、96個のくぼみを有するＶ字形底のポリプロピレン製プレート、化合物の希釈用、適用化学カタログ番号AS-72092。８．ストレプトアビジン：シグマS-8276 ９．精製されたウサギ抗GST抗血清。AMRADカタログ番号9001605 10．山羊抗ウサギ−IgG-HRP。アメルシャムカタログ番号V010301緩衝溶液：溶解物緩衝液：キナーゼ緩衝液： 10mMトリス、pH7.5 10mM MgCl₂ 150mM NaCl 10mM MnCl₂ 1％NP40 10mM DTT 1mM PMSF 20mM HEPES/Cl,pH7.5 0.4mM Na₃VO₄ 20mM β-グリセロ燐酸塩 2mg/mlロイペプチン 100mM Na₃VO₄ 2mg/mlアプロチニン阻止緩衝液：洗浄緩衝液(TBST): 10mMトリスpH7.5 50mMトリスpH7.5 100mM NaCl 150mM NaCl 0.1％ツイーン20 0.1％ツイーン20 方法：ストレプトアビジン被覆ELISAプレートの調製： 0.1Mの硼酸を0.1Mのホウ酸ナトリウムと共に滴定することにより硼酸塩緩衝液をpH8.7に調整する。アジ化ナトリウムを加えて最終濃度を0.05％とし、４℃で貯蔵する。硼酸塩緩衝液１ml当たり1mgのストレプトアビジンを調製し、-80℃で 100μＬのアリコートで貯蔵する。100μＬの硼酸塩緩衝液中で１つのくぼみ当たり0.1μgのストレプトアビジンを室温で18時間にわたり被覆する。くぼみを200 μＬの低温TBSTで２回洗浄する。そのプレートを逆さにしてフィルターに吸着させて乾燥させ、パラフィルムで覆い、４℃で１週間ほど貯蔵する。さらに長期間貯蔵するために、プレートは-80℃で貯蔵されるべきである。ホスホチロシン抗体被覆ELISAプレートの調製：４℃で一晩100μLのPBSにおいて4G10（ニューヨーク州のアップステート・バイオテクノロジー）を１つのくぼみ当たり１μｇを被覆し、少なくとも時間にわたり200μLの阻止緩衝液で阻止する。キナーゼ検定方法ビオチン化ペプチド242は、100μLのPBS中でくぼみ当たり１μgを一晩４℃でストレプトアビジン被覆ELISAプレートで培養することによりELISAプレートに結合された（上記参照）。くぼみは室温で30分間にわたり200μＬの阻止緩衝液で阻止され、その後で阻止緩衝液が吸引により除去された。Zap70融合タンパク質( GZH)を含有する昆虫細胞溶解物が加えられ（１つのくぼみ当たり30μg、溶解物緩衝液でくぼみ当たり100μLになるように容量を調節し）、４℃で２時間にわたり培養させた。溶解物は吸引により除去され、くぼみはTBSTで洗浄された。基質および試験化合物（もしあれば）が加えられ、15分間放置された（GST-バンドII I、90μLの最終容量中でくぼみ当たり５μｇ）。キナーゼ反応は最終濃度10μL となるようにくぼみ当たり0.1mMのATPの10μLを加えることにより開始された。9 6個のくぼみを有するプレートは室温で（振動させながら）30分間放置された後、90μＬの反応液が予め抗ホスホチロシン抗体（UB40 、アップステート・バイオテクノロジ、ニューヨーク州）で被覆された96個のくぼみプレートのくぼみに移された。このプレートは室温で30分間放置された後、その液体は除去され、そのくぼみはTBSTで洗浄された。山羊抗ウサギIgG-HRPが室温で30分間、100μLの阻止緩衝液に加えられ、1:40,000の割合で希釈された後、除去され、くぼみがTBSTで洗浄され、ABTSで現像された。次に、プレートは41 0nmでELISAプレート読みとり装置で読みとられる。試験されるタンパク質が補足されたタンパク質である場合は、ELISAプレート読みとり装置から読みとられたデータは、対照タンパク質の活性と比較すると、試験化合物の調節活性に関連しているはずである。実施例22：ＡＬＫ−７の単離および特徴づけＡＬＫ−７を単離するため、本発明者らは、全ての既知の哺乳類ＳＴＫリセプターに共通しているキナーゼサブドメインIIおよびVI内のアミノ酸モチーフをコード化している変性オリゴヌクレオチドを設計した（HanksおよびHunter,FASEB J.9：576-595,1995）。サブドメインIIはキナーゼドメインのＮ末端にあり、酵素活性に必須でありかつ構造が明らかにされている全てのキナーゼのａ−およびｂ−リン酸塩と相互作用することでＡＴＰ結合に必要とされる、不変のリジン残基を含んでいる。サブドメインVIは触媒ループと呼ばれており、一致するモチーフＨＲＤＬＫＸＸＮ（ＳＥＱＩＤＮＯ：64）を含む。アスパラギン酸残基は、全てのプロテインキナーゼの鍵となるリン酸基転位プロセスの間に、ヒドロキシル基からプロトンを受け取ることに深く関わっている。全てのＳＴＫリセプターの比較を基に、本発明者らはＩ型およびII型の両ＳＴＫリセプターを認識すると考えられるこれらのサブドメインに対する変性オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。このＰＣＲ戦術を、鋳型としてのヒト神経芽腫細胞系（ＳＹ5Ｙ）のｓｓｃＤＮＡに適用した場合、他のＳＴＫリセプターと有意な相同性を示す新規なＤＮＡフラグメント（ＡＬＫ−7）の多数のコピーが単離された。この新規な配列はＡＬＫ−4（Franzenら、Cell 75(4)：681,1993）およびＡＬＫ−5（t en Dijkeら、Oncogene 8(10)：2879,1993）に最も類似しており、ＡＬＫ−7と名付けた。材料および方法正常なヒトの組織、ヒト脳の局所切片、培養されたヒトの腫瘍細胞系、および原発性の新生児ラットの交感、運動、および感覚ニューロン細胞、ならびに視床中間部のドーパミン作動性ニューロンから、ChomczynskiおよびSacchiのグアニジンソルツ／フェノール（Guanidine Salts／phenol）抽出プロトコール(P．Cho mczynskiおよびN.Sacchl,Anal.Biochem.162,156（1987）を用いて全ＲＮＡを単離した。これらのＲＮＡを鋳型として用い、ギブコBRL（GibcoBRL）より購入したファーストストランドシンセシス（First Strand Synthesis）キット用のスーパースクリプトプレアンプリフィケイションシステム（Superscript Preamplification System）（Life Technologies,U.S.A.；Gerard,G.F.ら、（1989）,FOCUS 11,66 ）を用いて、製造業者により推奨された条件下で一本鎖ｃＤＮＡを産生した。典型的な反応は、60μLの反応容積中で、10μｇの全ＲＮＡかまたは２μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを1．5μｇのオリゴ（dT）_12-18と共に用いた。産生物をＲＮアーゼＨで処理し、Ｈ₂Ｏを用いて希釈し100μLとした。その後のＰＣＲ増幅には、これらのｓｓＤＮＡの1〜4μＬを各々の反応に用いた。オリゴヌクレオチドは、確立されたホスホロアミダイド化学を用い、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）394ＤＮＡシンセサイザーで合成し、エタノールで沈殿させた後に精製せずに用いた。変性オリゴヌクレオチドプライマーは：ＳＴＫ1=5'-GARRGRGT6GC6GT6AARRT6TT-3'（ＳＥＱＩＤＮＯ：65）（センス）ＳＴＫ3−=5'-TTRATRTC6CKRTG6GM6AT6GM6GGYTT-3'（ＳＥＱＩＤＮＯ：66 ）（アンチセンス）である。これらのプライマーは、ペプチド配列E（K／E）VAVK（V／I）F（ＳＥＱＩＤＮＯ：67）（キナーゼサブドメインIIからのセンス鎖）およびＫＰ（A／S）I（A／S）ＨＲＤＩＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：68）（キナーゼサブドメインVIからのアンチセンス鎖）から各々由来したものである。変性ヌクレオチドの名称は：Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｋ＝ＧまたはＴ；および6＝イノシンである。鋳型としてＡＬＫ1を用いると、これらのプライマーは321ｂｐの産生物を生じる。ＰＣＲ反応は、前文にリストした、一本鎖の供給源に対して適用されたＳＴＫ 1およびＳＴＫ3−を用いて行なった。当該プライマーを、10mMトリスＨＣｌ（ｐＨ8．3）、50mM ＫＣｌ、1．5mM MgCl₂、200μMの各デオキシヌクレオチド三リン酸、0．001％ゼラチン、および1．5ＵのAmpIiTaqＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー／シータス（Perekin-Elmer／Cetus））、および1〜4μlのｃＤＮＡを含んでいる混合物に対して加え、各々最終濃度を5μMとした。95℃にて３分間の変性に続く繰り返しの条件は、最初の３サイクルについては、94℃で30秒、37 ℃で１分、72℃への傾斜２分、および72℃で１分であり、それに続く94℃30秒、 50℃1分、および ℃45秒の35サイクルである。〜320ｂｐに移動したＰＣＲフラグメントをジーンクリーン（GeneClean）(Bio101)を用いて2％アガロースゲルより単離し、Ｔ−Ａを、ｐＣＲIIベクター（インヴィトロジェン社（Invltrogen Corp.）米国）内に、製造業者のプロトコールに従ってクローン化した。 Qiagcnカラムを用いてミニプラスミドＤＮＡ標品からコロニーを選択し、サイクルシーケンシングダイターミネーター（Cycle sequencing dyeterminator）キットをAmpliTaqＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（ABI、フォレスターシティ、カリフォルニア州）と共に用いて当該プラスミドＤＮＡをシークエンスした。シークエンス反応の産生物をＡＢＩプリズム（Prism）377ＤＮＡシークエンサーに流し、ＢＬＡＳＴアラインメントアルゴリズム（Altschul,S.F.ら、J.Mol.Biol.215.403-10）を用いて分析した。プライマーＳＴＫ1およびＳＴＫ3−を用いたＰＣＲにより、新規なクローン（ＳＴＫＲ6．22 ）が、鋳型としてのヒトＳＹ5Ｙ細胞からの一本鎖ｃＤＮＡについて単離された。このクローンはその後、ヒトＡＬＫ−7のフラグメントと名付けられた。ラムダｇｔ１１（クロンテック(Clontcch)、パロウアルトウ(Palo Altou)、カリフォルニア州）ｃＤＮＡライブラリーを、９個のヒト全脳下垂体のプールからのｍＲＮＡを用いて構築した。ファージは、ニトロセルロースフィルター上にて、ヒトＡＬＫ−7をコード化しているＳＴＫＲ6．22からのランダムにプライムした³²Ｐ標識インサートを用い、6 x ＳＳＣ、1x Denhardt's試薬、0．1％ＳＤＳ、および0．1mg／mLの変性し、フラグメント化したサケ精子ＤＮＡを含んでいるハイブリダイゼイションバッファー中で、2x10⁶ｃｐｍ／ｍＬにてスクリーニングした。65℃にて一晩のハイブリダイゼーションの後、フィルターを0．1 x ＳＳＣ、0．1％ＳＤＳ中で65℃にて洗浄した。Ｔ7ポリメラーゼとオリゴヌクレオチドプライマーとを用いたマニュアルのシークエンシング法(TaborおよびRichar dson,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：4767-71）を用い、完全な長さのｃＤＮＡクローンを両方の鎖についてシークエンスした。結果 1794ヌクレオチドにおよぶ二つの重複するｃＤＮＡクローン(Ｐ6およびＰ7)が、ヒト脳下垂体のライブラリーから単離された。この配列は156位に、翻訳開始のためのコザッタコンセンサスに適合するＡＴＧを含んでおり、493アミノ酸から成るポリペプチドをコード化する収容能力のある、1482ヌクレオチドのオープンリーディングフレームがこれに続いている。156位に位置するＡＴＧの5'には、他の開始コドンはない。ヒトＡＬＫ−7をコード化している領域は、155個および157個の非翻訳領域にそれぞれ5'および3'を接している。ポリアデニル化された領域はないが、ＳＥＱＩＤＮＯ：8に示した配列の3'末端は著しくＡＴに富む（3'の非翻訳領域からの配列に特徴的）。付加的なｃＤＮＡクローン（Ｐ4）は、この配列の3'に付加的な１ｋｂを伸長していた。配列2．0．を用いて、ジデオキシターミネーターによるＤＮＡ配列決定を行なった。両鎖についてプライマーウォーキング戦略を用い、完全なヌクレオチド配列を確認した。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＡＢＩ348ＤＮＡシンセサイザーを用いて作成した。公開非重複核酸およびＥＳＴデータベースから成るヒトＡＬＫ−7遺伝子配列についてのスミスーウォーターマン検索は、全く同一の適合配列がないことを明らかにし、これが新規なヒト遺伝子であることを確証している。ヒトＡＬＫ−7 配列に最もよく適合するもの（85％核酸の同一性）は、最近登録されたもの（Ge nBank ACC：U69702）であり、ヒトＡＬＫ−７についてのラットのオルソロガス遺伝子であるらしい。 493アミノ酸のヒトＡＬＫ−７配列は、1〜25および114〜138の二つの疎水性領域を含む（ＳＥＱＩＤＮＯ：16参照）。最初の疎水領域はシグナルペプチドドメインの基準に合致し、マクジーオック（MacGeoch）法（D.J.MacGeoch,Virus Research,3,271,1985）を用いた判別スコアは5.76であり、フォンハイジンアルゴリズム（von Heljne、Ｎucl.Acids Res.,14,4683,1986）を用いたウェイトマトリックススコアは＋6．75（閾値＝3．5）であった。二番目の疎水領域は、クライン（Klein）らのＡＬＯＭ法（P.Klein,M.Kanehisa、およびC.DeLisi,Diochi m.Biophys.Acta,815,468,1985）を用いてスコアー9．34の尤度を生じ、トランスメンブランドメインが予想される。このアルゴリズムは、トランスメンブランドメインの最大範囲が108〜138のアミノ酸であると予想している。この分析を基に、ＡＬＫ−７はＮ末端のシグナルペプチドの開裂後に52．35ｋＤの分子量を有するＩａ型の内在性膜タンパク質であることが予想される。実施例23：ＡＬＫ−7の発現元々はプローブとして上記のＳＹ5Ｙ細胞よりクローン化した新規なフラグメントについてのノーザンブロットおよびＰＣＲ分析を用いて、本発明者らは、多数の腫瘍細胞系および多くのヒト組織からのＲＮＡをスクリーニングし、脳下脳下垂体および黒質からのニューロン細胞におけるＡＬＫ−7発現の明らかな選択性を証明した。材料および方法ノーザンブロット分析成人の16の異なる組織（脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸粘膜、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、および末梢血白血球）と、４つの異なるヒト胎児組織（脳、肺、肝臓、および腎臓）からの２μｇのポリＡ⁺ ＲＮＡを電荷を変えたナイロン膜上に含んでいるノーザンブロットを、クロンテック（Clontech）(パロウアルトウ、カリフォルニア州)より入手した。追加のノーザンブロットでは、20μｇの全ＲＮＡを、ホルムアルデヒド1．2％アガロースゲル上に流し、ナイロン膜に移すことにより調製した。フィルターを、ヒトＡＬＫ−7のクローンＳＴＫＲ6．22からの320ｂｐのインサートから合成したランダムプライム［³²Ｐ］ｄＣＴＰ標識プローブとハイブリダイズした。ハイブリダイセイションは、6 x ＳＳＣ、0．1％ＳＤＳ、1 x Ｄｅｎｈａｒｄ'ｓ溶液、100mg／mLの変性したニシン精子ＤＮＡ中で、1〜2x10⁶ｃｐｍ／ｍＬの³²P標識ＤＮＡプローブと共に、60℃にて一晩行なった。フィルターを65℃にて0．1 x ＳＳＣ／0．1％ＳＤＳ中で洗浄し、コダック（Kodak）ＸＡＲ −2フィルム上に一晩露出した。半定量的なＲＴ−ＰＣＲ検出法ＡＬＫ−７の発現パターンもＰＣＲ技術を用いて研究し、前文に詳しく述べた通り、種々のヒト細胞系、新鮮な凍結組織、および原発腫瘍からＲＮＡを単離した。一本鎖ｃＤＮＡは、10ｕｇの上記のような各ＲＮＡから、スーパースクリプトプレアンプリフィケイションシステム（Superscript Preamplification Syste m）（ギブコBRL）を用いて合成した。次いでこれらの一本鎖の鋳型を、ヒトＡＬＫ−7に特異的な二つのオリゴヌクレオチドを用いた35サイクルのＰＣＲ反応に使用した：ＡＬＫ−7ａ：5'-AACTTTGGCTGGTATCTGAATATC-3'（ＳＥＱＩＤＮＯ：69 ）、およびＡＬＫ−7ｂ：5'-CCTTGTGTACCAACAATCTCCATA-3'（ＳＥＱＩＤＮＯ：70 ）。反応産物を2％アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロミドで染色し、ＵＶライトボックス上で写真撮影した。ＡＬＫ−7に特異的な−150ｂｐのバンドの相対的な強さを各々の試料について算定した。ラットのＡＬＫ−7の検出のために、同様のオリゴヌクレオチドのペアを設計した： 4076：5'-CTCCAGAGATGAGAGATCTTGG-3'（ＳＥＱＩＤＮＯ：71）、および 4077：5'-TTCCAGCCACGGTCACTATGTT-3'（ＳＥＱＩＤＮＯ：72）であり、ラット遺伝子の−210ｂｐ領域を含んでいる。結果ノーザン分析では、ＡＬＫ−7ｍＲＮＡの転写物は多くのヒト組織の供給源からは検出することができず、その発現が高度に限定されていることを示唆している。さらに感度のよいＰＣＲに基づく検出法を用いて、ＡＬＫ−7はヒトの黒質、脳下垂体前葉、およびＣａｌｕ−6肺癌細胞系に発現されることがわかった（以下参照）。全脳、小脳、および前立腺を含む他のいくつかの部位に弱い発現が検出された。他の多数の正常なヒトの組織ならびに腫瘍細胞系は、ＡＬＫ−7の検出可能な発現を示さなかった。ヒトＡＬＫ−7ＲＮＡの発現分析中程度（＋＋）陰性黒質 IMR-32（神経芽腫）脳下垂体前葉 SY5Y（神経芽腫）Ｃａｌｕ−6（肺癌） SK-N-SH（神経芽腫） SWI763（星状細胞腫） SW1388（星状細胞腫）弱い（＋） U-138（グリア芽腫） U87MG（グリア芽腫）脳 Menirigioma（1°の腫瘍）脳下垂体後葉 SKOV-3（卵巣癌）小脳 ASPC（膵臓癌）卵巣 CAPAN-1（膵臓癌）前立腺 HS766T（膵臓癌）胎児腸管 PANC（膵臓癌）十二指腸 HOS（骨肉腫）Ｔ48（大腸癌） KHOS（骨肉腫） HTB227（乳癌） HTB131（乳癌） LS123（大腸癌） LS147T（大腸癌） SkC04（大腸癌） SW11E（大腸癌） HTC15（大腸癌） SW403（大腸癌） HT29（大腸癌） SW627（大腸癌） SW948（大腸癌） HUVEC（ｈ．内皮系）線維芽細胞（原発）膵臓精巣胸腺肝臓心臓胎盤肺骨格筋腎臓脾臓卵巣大腸白血球ラットＡＬＫ−7のインシトウでの発現プロフィールラットＡＬＫ−7の細胞外ドメインのフラグメントをプローブとして用いて、ニューロンにおけるＡＬＫ−7の発現を、新生児および成体ラットの脳からの矢状および冠状断面におけるインシトゥでの分析により査定した。この領域が選ばれたのは、関連するＡＬＫ−4およびＡＬＫ−5との不同性からである。他のグループは、ラットＡＬＫ−7の触媒ドメインについてインシトウで行なっており、新生児組織（小脳、海馬、および脳幹核）、腎臓、精巣、肺、側背および腹側前立腺、および脂肪組織における特異的な発現を証明している。しかしながら、これらの研究で使用されたプローブは、関連するＡＬＫ−4およびＡＬＫ−5とも交差反応してよいＡＬＫ−7触媒ドメイン含んでおり（ラットＡＬＫ−7に対し27／ 29および25／26のｂｐの同一性のある範囲をもち、ヌクレオチド配列の77％が同一）、それにより発現プロフィールの範囲が広げられている。発明者らの分析は、より選択的なＡＬＫ−7プローブを用いることにより、さらに限定された発現を明らかにした。矢状断面では、中程度の粒子の帯が、海馬のＣＡ2およびＣＡ3 領域、歯状ダイラス（dyrus）、嗅結節、皮質の背側外層、および前頭皮質領域2 を外側から脳梁にかけて横切る帯の中に見られた。尾状被殻および視床核中には、中程度のシグナルが検出された。さらに、外側視床下部の大細胞核および内側灰白隆起核の領域に、中程度のシグナルが検出された。同様のシグナルが、小脳の前縁上の楔状核領域に観察された。小脳にはＡＬＫ−7のハイブリダイズが全くなかった。冠状断面は、海馬のＣＡ2およびＣＡ3領域、歯状回、尾状被殻、および皮質外側の下にある領域においての発現の所見を支持する。さらに、視床下部腹内側核の背内側部には、中程度のシグナルが検出された。扁桃梨状移行部には、さらに弱い分散した核のシグナルが検出された。実施例24：ＡＬＫ−7に特異的な抗体ＡＬＫ−7に特異的な免疫試薬を、ＫＬＨをコンジュゲイトした、ＡＬＫ−7の細胞質ドメインの膜近接部位に由来する合成ペプチドYRKKKRPNVEEPL（ＳＥＱＩＤＮＯ：76）に対し、ウサギで産生した。この領域は、他のＩ型ＳＴＫリセプターと比較して独特であり、それによりＡＬＫ−7に特異的な抗血清の産生が可能になる。ＧＳＴ融合物として発現されたＡＬＫ−7のＮ末端細胞外ドメインも、ウサギにおいてポリクローナル抗体を産生させるため、およびマウスにおいて前文に述べた技術を用いてモノクローナル抗体を産生させるための免疫原として用いた。これらの抗体を用いて内在性の、および以下に述べるような組換えタンパク質の発現を局在化した。実施例25：組換えＡＬＫ−7の発現以下の実施例は、哺乳類の細胞における一過性および安定発現のためのベクターの構築について述べている。発現構築物を産生して、野性型ＡＬＫ−7ならびに、シグナリング不能なＡＬＫ−7（ＡＬＫ−7ＤＮ）と、構造的に活性化されたＡＬＫ−7（ＡＬＫ−7ＴＡ）とを作成した。材料および方法ベクターの構築発現構築物は、ＰＣＲに補助された突然変異誘発法によって産生したが、その中でＡＬＫ−7の全コーディングドメインには、そのカルボキシ末端にヘモフィルスインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープYPYDVPDYAS（ＳＥＱＩＤＮＯ：77）(Patl,Gene 114：285,1992)でタグをつけた。この構築物を二つの哺乳類の発現ベクターに導入した：ｐＡｄＲＳＶＯＥＳ−、組換えタンパク質を産生するウイルスの産生のためのアデノウイルスベクター、および一過性発現の分析のためのｐＲＫ5。組換えアデノウイルスは、インヴィヴォの連結によって以下のように生成した。使用したトランスベクターは、以下のＤＮＡ配列をこの順に含んでいる：パッケージング配列をコード化しているアデノウイルス5型の左端領域(アデノウイルス５型ヌクレオチド1−454)；プラスミドｐＲＥＰ（インヴィトロジェン社）から発現カセットとして単離された、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびＳＶ40ポリＡ領域;5型アデノウイルスゲノムの3320−5790のヌクレオチド；および大腸菌プラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔに由来するｏｒｉおよびβラクタマーゼ遺伝子。二つの付加的なプラスミドの形状が産生された。第一は、ｐＡｄＲＳＶｌａｃＺであり、ＲＳＶプロモータとＳＶ40ポリＡ配列との間のＢａｍＨＩ部位に、二本鎖の合成オリゴヌクレオチドが挿入されており、以下のヌクレオチド配列を有していた（上側の鎖を示す）：5' CTTCGAAAGCTTGAAATCGGTACCATCGATTCTAGAGTTAACTTCGAA（ＳＥＱＩＤＮＯ：73 ）。大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を、酵素ＮｏｔＩを用いて発現プラスミドｐＣＭＶｂ（クロンテック社）より切り出し、プロモーターとポリＡ配列との間のＮｏｔＩ部位に挿入した。これによりｌａｃＺ遺伝子を発現し、かつｌａｃＺ遺伝子とポリＡ領域との間に二つのＢＳｔＢＩ制限部位を有するプラスミドが産生された。第二のプラスミド（ｐＡｄＲＳＶＯＥＳ−）は、二本鎖の合成ヌクレオチドを前文と同じ領域に挿入することにより産生した。そのヌクレオチド配列は、以下のようであった：5'CTCTAGAACGCGTTAAGGCGCGCCAATATCGATGAATTCTTCGAAGC（ＳＥＱＩＤＮＯ：74）。このプラスミドは、当該プラスミド内に外来性ｃＤＮＡを、発現を目的として導入することを可能にした。組換えウイルスの産生のために使用したウイルスＤＮＡは、アデノウイルスゲノムの左端がｐＡｄＲＳＶｌａｃＺの同一の領域で置換されているウイルス（ＡｄｌａｃＺＢｓｔＢＩ）に由来したものであった。これを行なうため、Ａｄ5 ｄ1327系アデノウイルス（JonesおよびShenk,Ccll,1978）(E3領域に欠失）からＤＮＡを単離し、ＣｌａＩ酵素で開裂し、リン酸カルシウムによる共沈により、ｐＡｄＲＳＶｌａｃＺプラスミドと共にＨＥＫ2394細胞系内に同時ランスフェクトした。このトランスフェクションの結果生じた組換えアデノウイルスのプラークを、ｌａｃＺ遺伝子を発現する能力について、Ｘ−Ｇａｌを用いた組織化学染色によりスクリーニングした。結果として生じた組換えアデノウイルス（ＡｄｌａｃＺＢｓｔＢＩ）は、付加的なアデノウイルス構築物のためのバックボーンが供給され、さらなる組換えが、同時トランスフェクトされたｃＤＮＡを用いてｌａｃＺ遺伝子を置換することになるという点で、ｌａｃＺ活性の有無に基づく組換えプラークのスクリーニングを可能にする。これを成し遂げるためには、トランスファーベクター構築物をＢｓｔＢＩを用いた消化によって直鎖化し、すでにＢｓｔＢＩにより開裂されているＡｄｌａｃＺＢｓｔＢＩＤＮＡと同時トランスフェクトする。典型的には、5mgのトランスファーベクタープラスミドＤＮＡを2 mgのトランスフェクション用のウイルスＤＮＡと同時トランスフェクトする；ウイルスＤＮＡと直鎖化したトランスファーベクターとのインヴィヴォでの連結は、新たなトランスジーンの発現を命令する新規な組換えウイルスを産生する。シグナリング不能のＡＬＫ−７構築物も、ｐＡｄＲＳＶＯＥＳ−およびｐＲＫ 5の両ベクターにおける、ＡＬＫ−7コード化領域の触媒ドメインIIの直後の、23 0位のアミノ酸におけるＨＡタグの挿入により作成した。他のＩ型ＳＴＫＲの類似した位置における切断は、優性ネガティブな様式で機能した。この構築物をＡＬＫ−7ＤＮと呼んだ。構造的に活性化した形のＡＬＫ−7は、触媒ドメインＩの GXGXXGモチーフのすぐ上流のアミノ酸194におけるトレオニンからアスパラギン酸への突然変異によって産生された。他のＩ型ＳＴＫＲでは、この残基はII型ＳＴＫＲと結合することによりリガンド依存性のリン酸基転位反応を受け、結果としてリセプターが活性化され、シグナリングカスケードを開始することになる。他のＩ型ＳＴＫＲにおける同様な突然変異は、結果としてリガンドに無関係な、構造的に活性化されたリセプターを生じる。この構築物をＡＬＫ−7ＴＤと名付けた。ＡＬＫ−7−アデノウイルスの組換え体の産生ＨＥＫ293細胞（Grahamら、J.Gen.Virol.36：59,1977）を、10％子ウシ血清を加えたダルベッコ（Dulbecco's）変法イーグル(Eagles)培地において、早めの継代を維持した。単層のＨＥＫ293を、ＡＬＫ−7をコード化しているトランスファーベクターを用いてトランスフェクトし、プラークが見えるようにするため５日から７日間培養した。次にこの単層を、25mg／mLの5−ブロモ−4−クロロ73−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドを用いて数時間染色し、非組換え（青色に染色された）プラークを同定した。推定される組換えプラークは、トランスジーンの発現について、ＨＥＫ293培養物の感染およびそれに続く、ＨＡエピトープを認識するモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学とによりスクリーニングした。トランスジーンタンパク質の発現に関して陽性であったウイルスを採集し、増幅と塩化セシウム勾配上での精製とに先立ち、数回のプラーク精製を行なった。バンド状のウイルスを希釈用緩衝液（Curielら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 8：8850-8854,1991）を用いて５倍に希釈し、−80℃に貯蔵した。ウイルス標品のおよその力価は、ＨＥＫ293培養物についての免疫組織化学により測定した。以下のウイルスが産生された：ＡｄＲＳＶＡＬＫ−7−ＨＡ；ＡｄＲＳＶＡＬＫ −7−ＤＮ；およびＡｄＲＳＶＡＬＫ−7−ＴＤ。一過性発現ＫＡをタグしたＡＬＫ−7、ＡＬＫ−7ＤＮ、およびＡＬＫ−7ＴＤ構築物を含んでいるｐＲＫ5発現プラスミドを、リポフェクタミン（lipophectamine）(ギブコBRL)と共にＣＯＳおよび293細胞に導入した。72時間後に、細胞を0．5mlの可溶化緩衝液（20mMＨＥＰＥＳ pH7．35、 150mM ＮａＣｌ、10％グリセロール、1％トリトンX−100、1．5mM ＭｇＣｌ₂、１ｍＭＥＧＴＡ、2mMフェニルメチルスルフォニルフロリド、１μg／mLのアプロチニン）中に収穫した。サンプルのアリコートを、15％アクリルアミド／0.5％ビスアクリルアミドゲル上でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により解析し、エレクトロプリクレティカリーにニトロセルロースに移した。非特異的な結合は、ブロットを、ブロット（Blotto）(5％W/Vの脱脂粉乳、および0.2％v／vのノニデットP−40を含んでいるリン酸緩衝液（シグマ）)中でプレインキュベートすることにより阻止し、組換えタンパク質は、ＨＡデカペプチドのタグに対するマウスＭａｂを用いて検出した。別法として、組換えタンパク質は種々のＡＬＫ−7に特異的な抗血清を用いて検出することができる。ニューロン細胞における発現前文に述べた組換えＡＬＫ−7タンパク質は、アデノウイルスを媒介とした感染により、ＰＣ12細胞およびラットニューロンの初代培養物において発現された。これらの細胞は、ＡＬＫ−7の機能についてのさらなる研究を可能にするであろう。組換えタンパク質の発現は、抗ＨＡ抗体を用いた免疫染色により確認された。ＰＣ12培養物（Greeneら、Methods Enzymol.147：207,1987）を、10％ウマ血清および5％ウシ胎児血清を含んでいるＲＰＭＩ培地中に維持した。分化の実験用には培地を、1xＮ2サプリメントおよび0．1％ＢＳＡを含んでいるＲＰＭＩに変え、コラーゲンＩの基体の上で細胞を育成した。ＰＣ12細胞の生存用には、細胞を0．1％ＢＳＡを含んでいるＲＰＭＩ中で育成した。培養物はすべて、1xペニシリン／ストレプトマイシンを含んでいた。アデノウイルス感染用にはＰＣ21細胞を、組換えウイルスと共に、１と10の間の感染多重度（ＭＯＩ）で一晩インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、二日間にわたる分化または生存用のいずれかの条件に播きなおした。神経成長因子（50ng／mL）はポジティブな対照として役立った。分化用には、培養物を2％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、一個の細胞の直径よりも長い突起のある細胞のパーセンテージを決定した。生存用には、培養物を0．0 5％ＭＴＴと共に1．5時間インキュベートして生きている細胞を染色し、各々の条件の中で生きている細胞の相対数を測定した。交感および感覚ニューロンを、詳述されているように単離し（HawrotおよびPa tterson,Methods Enzymol.53：574,1979；Ficldsら、Cell 14：43,1978）、合成培地（HawrotoおよびPatterson、前述）にて培養した。交感神経ニューロンは、ラット胎児Ｅ20−Ｅ21から切り出した上頚神経節から単離し、一方、後根神経節の感覚ニューロンは、Ｅ16−Ｅ18ラットから得た。神経節を0．25％トリプシンで10分間処理し、洗浄し、すりつぶして単細胞の懸濁液を得た。感覚ニューロンは、組織培養プラスティック上にあらかじめ１時間播いておき、接着性のある細胞を除去する。ドーパミン作動性ニューロンは、詳述されているように単離し（ Shimodaら、Brain Research 586：319-331,1992）、B27サプリメント（ライフテクノロジーズ(Life Technologies)）を補給したニューロベイサル（Neurobasal ）培地中で培養した。ニューロンは、コラーゲンＩでコートした組織培養プラスティック（感覚およびシナプスニューロン用にはＮＧＦを補給した）の上で、アデノウイルスを用いて２時間感染させ、次いで細胞を洗浄し、さらに２ないし４時間にわたり回復ができるようにした（もし適切であればＮＧＦと共に）。回復期の後、細胞を広範囲に洗浄して成長因子を除去し、ポリリジン−ラミニンをコートしたチャンバースライドに播種した。ＮＧＦの50ｎｇ／ｍＬでの添加は、感覚および交感神経ニューロンの生存についてのポジティブな対照として役立った。さらなる２日ないし３日の後、感覚および交感神経培養物をカルセイン（calc ein）ＡＭ（1mg／mL）を用いて45分間染色し、包埋し、免疫蛍光法により調べた。一般的には、五つの分散した視野（ウエルの７％を表す）の写真を撮り、生存しているニューロンを定量した。ドーパミン作動性ニューロンの生存を測定するためには、培養物を固定し、チロシンヒドロキシラーゼ陽性のニューロンの数を測定した。

【手続補正書】【提出日】平成１１年１１月４日（１９９９．１１．４）【補正内容】請求の範囲１．ＰＴＰ０４分子をコードする、単離された、濃縮されたまたは精製された核酸分子であって、（ａ）配列番号：１に記載される配列を有し；（ｂ）高度にストリンジェントな条件下で配列番号：１に記載される配列にハイブリダイズし；または（ｃ）配列番号：９に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし；（ｄ）配列番号：９に記載される配列を有するＰＴＰ０４ドメインポリペプチドをコードするが、ただしアミノ酸残基１−４８、４９−２９４、２９５−８０７のセグメントの全部ではないが少なくとも１つを欠失している、ことを特徴とする核酸分子。２．核酸分子が、ヒトから単離された、濃縮された、または精製されたものである、請求項１記載の核酸分子。３．前記分子が、（ａ）配列番号：９のアミノ酸配列を有しかつアミノ酸残基：１−４８、４９ −２９４、２９５−８０７のセグメントの少なくとも１つを欠失しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸残基：１−５５、５６−１０９、１２０−２１２、２３０−４８０、４８１−４８８のセグメントの少なくとも１つを欠失しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３または配列番号：１４のアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸残基のセグメントの少なくとも１つを欠失しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号：１５のアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸残基：１−８５７、３５３−７７７、８５８−１０９６、１０９７−１２７４、１１０１−１２１４のセグメントの少なくとも１つを欠失しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号：１６のアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸残基：１−２５、２６−１１３、１１４−４９３、１９３−４８３のセグメントの少なくとも１つを欠失しているポリペプチドをコードする；または（ｆ）ストリンジェントな条件下で（ａ）−（ｆ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズするを含む、請求項１記載の核酸分子。４．配列番号：９に記載される配列を有するＰＴＰ０４ポリペプチドをコードし、宿主細胞において転写を開始させるのに有効なベクターまたはプロモーターを含有する組換え核酸分子。５．（ａ）配列番号：９に記載される配列を有するＰＴＰ０４ポリペプチド；または（ｂ）配列番号：９に記載される配列を有するがアミノ酸残基：１−４８、４９−２９４、２９５−８０７のセグメントの全部ではないが少なくとも１つを欠失しているＰＴＰ０４ドメインであって、前記ＰＴＰ０４ドメインは、異種ポリペプチドに融合されている、をコードする組換え核酸分子。６．（ａ）配列番号：９に記載される配列を有するＰＴＰ０４ポリペプチド；（ｂ）配列番号：９に記載される配列を有するがアミノ酸残基：１−４８、４９−２９４、２９５−８０７のセグメントの全部ではないが少なくとも１つを欠失しているＰＴＰ０４ポリペプチド；または（ｃ）配列番号：９に記載される配列を有するがアミノ酸残基：１−４８、４９−２９４、２９５−８０７のセグメントの全部ではないが少なくとも１つを欠失している、それぞれ異種ポリペプチドに融合されたＰＴＰ０４ポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換え細胞。７．配列番号：９に記載される配列を有する、単離された、濃縮されたまたは精製されたＰＴＰ０４ポリペプチド８．配列番号：９に記載される配列を有するが、ただし、アミノ酸残基：１− ４８、４９−２９４、２９５−８０７のセグメントの全部ではないが少なくとも１つを欠失している、単離された、濃縮されたまたは精製されたＰＴＰ０４ポリペプチド。９．前記ポリペプチドが、（ａ）配列番号：９のアミノ酸配列；（ｂ）高度にストリンジェントな条件下で配列番号：１の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によりコードされるアミノ酸配列；または（ｃ）配列番号：９に記載される配列を有するが、ただし、アミノ酸残基１− ４８、４９−２９４および２９５−８０７のセグメントの全部ではないが少なくとも１つを欠失しているＰＴＰ０４ポリペプチド、である、請求項７記載のＰＴＰ０４ポリペプチド。１０．配列番号：９に記載される配列を有するがアミノ酸残基：１−４８、４９−２９４および２９５−８０７のセグメントの全部ではないが少なくとも１つを欠失しているＰＴＰ０４ポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体。１１．配列番号：９に記載される配列を有するＰＴＰ０４ポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマ。１２．ＰＴＰ０４の活性を調節しうる物質を同定する方法であって、（ａ）配列番号：９に記載される配列を有するＰＴＰ０４ポリペプチドを試験物質と接触させ、そして（ｂ）前記物質が前記ポリペプチドの活性を変化させるか否かを判定するの各工程を含む方法。１３．細胞中においてＰＴＰ０４の活性を調節しうる物質を同定する方法であって、（ａ）細胞中で配列番号：９に記載される配列を有するＰＴＰ０４ポリペプチドを発現させ、（ｂ）試験物質を前記細胞に加え、そして（ｃ）細胞表現型、細胞増殖、細胞分化、ＰＴＰ０４の触媒活性、またはＰＴＰ０４ポリペプチドと天然の結合相手との間の相互作用の変化をモニターするの各工程を含む方法。１４．治療を必要とする患者に、インビトロで、配列番号：９に記載される配列を有するＰＴＰ０４ポリペプチドの機能を調節する化合物を投与することにより、異常な状態を予防または治療する方法。１５．前記異常な状態に、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、またはＡＬＰシグナル伝達経路の異常が関与する、請求項１４記載の方法。１６．前記異常な状態が癌である、請求項１５記載の方法。１７．治療を必要とする患者に、インビトロでＡＬＫ−７の活性を調節する物質を投与することにより、ニューロンの生存を促進する方法。１８．配列番号：９に記載される配列を有するＰＴＰ０４の蛋白質活性の調節剤を同定する方法であって、ａ）配列番号：９に記載される配列を有するＰＴＰ０４を天然の結合相手と接触させ、このことにより捕獲蛋白質を形成し；ｂ）前記捕獲蛋白質を試験化合物と接触させ；ｃ）前記蛋白質活性を測定し；そしてｄ）前記蛋白質活性を対照蛋白質の活性と比較して調節の程度を判定し、ここで、前記対照蛋白質は前記天然の結合相手を有しない工程ａ）の蛋白質と同じアミノ酸配列を有する、の各工程を含む方法。１９．前記方法が、非放射活性試薬を用いる、請求項１８記載の方法。２０．前記ＰＴＰ０４が融合蛋白質ではない、請求項１９記載の方法。２１．前記蛋白質がＧＳＴ−融合蛋白質ではない、請求項２０記載の方法。２２．前記蛋白質が、酵素、レセプター酵素、または非レセプター酵素である、請求項２１記載の方法。２３．前記蛋白質が蛋白質キナーゼである、請求項２２記載の方法。２４．前記蛋白質キナーゼが蛋白質チロシンキナーゼである、請求項２３記載の方法。２５．前記蛋白質チロシンキナーゼがＺａｐ７０またはＳｙｋである、請求項２４記載の方法。２６．前記天然の結合相手が固体支持体に結合しうる、請求項１９記載の方法。２７．前記天然の結合相手がペプチドである、請求項２６記載の方法。２８．前記ペプチドがホスホペプチドを含む、請求項２７記載の方法。２９．前記ホスホペプチドがＩＴＡＭモティーフを含む、請求項２８記載のの方法。３０．前記天然の結合相手が脂質を含む、請求項２６記載の方法。３１．前記固体支持体が、ウエルプレート、ガラスビーズ、または樹脂を含む、請求項２６記載の方法。３２．前記活性が、自己触媒活性、基質の触媒的ターンオーバー、または第２の天然の結合相手の結合を含む、請求項２６記載の方法。３３．前記捕獲蛋白質を、基質、第２の天然の結合相手、および抗体からなる群より選択される１つまたはそれ以上の成分と接触させる工程をさらに含む、請求項２６記載の方法。３４．工程（ａ）の前に、前記蛋白質を含有する細胞を溶解させる工程をさらに含む、請求項２６記載の方法。３５．ａ）天然の結合相手；ｂ）固体支持体；およびｃ）結合剤を含む、非レセプター酵素活性の調節剤を同定するためのキット。３６．前記結合剤が、基質、第２の天然の結合相手、および抗体からなる群より選択される、請求項３５記載のキット。３７．前記天然の結合相手がペプチドである、請求項３６記載のキット。３８．前記ペプチドがホスホペプチドである、請求項３７記載のキット。３９．前記ホスホペプチドがＩＴＡＭモティーフを含む、請求項３８記載のキ４０．前記天然の結合相手が脂質を含む、請求項３５記載のキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｂ 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/42 9/16 1/48 ＺＣ１２Ｑ 1/42 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/48 5/00 Ａ (31)優先権主張番号６０／０４９，４７７ (32)優先日平成９年６月11日(1997．6．11) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０４９，７５６ (32)優先日平成９年６月11日(1997．6．11) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０４９，９１４ (32)優先日平成９年６月18日(1997．6．18) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０６３，５９５ (32)優先日平成９年10月23日(1997．10．23) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ジャラル，バイジャアメリカ合衆国カリフォルニア州94025, メンロ・パーク，オキーフェ・ストリート 101 (72)発明者ペレス，エリオールイスラエル国レホボット 76303，ハンサイ・ハリション 51 (72)発明者オンラスト，スーザンニュージーランド国オークランド３, マウント・アルバート，サミット・ドライブ６ (72)発明者マークビー，デイブアメリカ合衆国カリフォルニア州94131, サンフランシスコ，バーネット・アベニュー 477，アパートメントエイ (72)発明者コートネイジ，サラ・エイアメリカ合衆国カリフォルニア州94010, バーリンゲーム，アルヴァラード・アベニュー 1408 (72)発明者アップ，ハラルドアメリカ合衆国カリフォルニア州94116, サンフランシスコ，フォーティーンス・アベニュー 2000 (72)発明者ヒューイ，テレンス・エイチアメリカ合衆国カリフォルニア州94015, ダリー・シティー，スカイライン・ドライブ 363

Claims

【特許請求の範囲】１．ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ− ７ポリペプチドをコードする、単離された、濃縮されたまたは精製された核酸分子。２．（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、または配列番号：８に記載される配列を有する；（ｂ）高度にストリンジェントな条件下で配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、または配列番号：８に記載される配列にハイブリダイズする；（ｃ）配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、または配列番号：１６に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；または（ｄ）ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ− ７ドメインポリペプチドをコードする、請求項１記載の核酸分子。３．核酸分子が、ヒトから単離された、濃縮されたまたは精製されたものである、請求項１記載の核酸分子。４．前記分子が、（ａ）配列番号：９のアミノ酸配列を有しかつアミノ酸残基：１−４８、４９− ２９４、２９５−８０７のセグメントの少なくとも１つを欠失しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸残基：１−５５、５６−１０９、１２０−２１２、２３０−４８０、４８１−４８８のセグメントの少なくとも１つを欠失しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号：１１．配列番号：１２、配列番号：１３または配列番号：１４のアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸残基のセグメントの少なくとも１つを欠失しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号：１５のアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸残基：１−８５７、３５３−７７７、８５８−１０９６、１０９７−１２７４、１１０１−１２１４のセグメントの少なくとも１つを欠失しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号：１６のアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸残基：１−２５、２６−１１３、１１４−４９３、１９３−４８３のセグメントの少なくとも１つを欠失しているポリペプチドをコードする；または（ｆ）ストリンジェントな条件下で（ａ）−（ｆ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズするを含む、請求項２記載の核酸分子。５．試料中の、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドをコードする核酸の検出のための核酸プローブ。６．前記ポリペプチドが、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、または配列番号：１６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含む、請求項５記載のプローブ。７．ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ− ７ドメインポリペプチドをコードする、単離された、濃縮されたまたは精製された核酸配列。８．ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ− ７ポリペプチドまたはＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ドメインポリペプチド、および宿主細胞において転写を開始させるのに有効なベクターまたはプロモーターをコードする組換え核酸分子。９．（ａ）ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチド；または（ｂ）異種ポリペプチドに融合されたＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ドメインポリペプチドをコードする組換え核酸分子。１０．（ａ）ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチド；（ｂ）ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ− ７ドメインポリペプチド；または（ｃ）異種ポリペプチドに融合された、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドまたはＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ドメインポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換え細胞。１１．単離された、濃縮されたまたは精製された、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチド。１２．単離された、濃縮されたまたは精製された、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ドメインポリペプチド。１３．前記ポリペプチドが、（ａ）配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、または配列番号：１６のアミノ酸配列；（ｂ）高度にストリンジェントな条件下で、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、または配列番号：８の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によりコードされるアミノ酸配列；または（ｃ）ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ− ７ドメインポリペプチドを含む、請求項１１記載のＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチド。１４．ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ −７ポリペプチドまたはＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ドメインポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体。１５．ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ −７ポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマ。１６．ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ −７の活性を調節しうる物質を同定する方法であって、（ａ）ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ− ７ポリペプチドを試験物質と接触させ、そして（ｂ）前記物質が前記ポリペプチドの活性を変化させるか否かを判定するの各工程を含む方法。１７．細胞中においてＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７の活性を調節しうる物質を同定する方法であって、（ａ）細胞中でＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７ポリペプチドを発現させ、（ｂ）試験物質を前記細胞に加え、そして（ｃ）細胞表現型、細胞増殖、細胞分化、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、もしくはＡＬＫ−７の触媒活性、またはＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、もしくはＡＬＫ−７ポリペプチドと天然の結合相手との間の相互作用の変化をモニターするの各工程を含む方法。１８．治療を必要とする患者に、インビトロでＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、またはＡＬＰポリペプチドの機能を調節する化合物を投与することにより、異常な状態を予防または治療する方法。１９．前記異常な状態が、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、またはＡＬＰシグナル伝達経路の異常を含む、請求項１８記載の方法。２０．前記異常な状態が癌である、請求項１９記載の方法。２１．治療を必要とする患者に、インビトロでＡＬＫ−７の活性を調節する物質を投与することにより、ニューロンの生存を促進する方法。２２．蛋白質活性の調節剤を同定する方法であって、ａ）蛋白質を天然の結合相手と接触させ、このことにより捕獲蛋白質を形成し；ｂ）前記捕獲蛋白質を試験化合物と接触させ；ｃ）前記蛋白質活性を測定し；そしてｄ）前記蛋白質活性を対照蛋白質の活性と比較して調節の程度を判定し、ここで、前記対照蛋白質は前記天然の結合相手を有しない工程ａ）の蛋白質と同じアミノ酸配列を有する、の各工程を含む方法。２３．前記方法が、非放射活性試薬を用いる、請求項２２記載の方法。２４．前記蛋白質が融合蛋白質ではない、請求項２３記載の方法。２５．前記蛋白質がＧＳＴ−融合蛋白質ではない、請求項２４記載の方法。２６．前記蛋白質が、酵素、レセプター酵素、または非レセプター酵素である、請求項２５記載の方法。２７．前記蛋白質が蛋白質キナーゼである、請求項２６記載の方法。２８．前記蛋白質キナーゼが蛋白質チロシンキナーゼである、請求項２７記載の方法。２９．前記蛋白質チロシンキナーセがＺａｐ７０またはＳｙｋである、請求項２８記載の方法。３０．前記蛋白質が蛋白質ホスファターゼである、請求項２６記載の方法。３１．前記蛋白質ホスファターゼが蛋白質チロシンホスファターゼである、請求項３０記載の方法。３２．前記蛋白質チロシンホスファターゼが、ＰＴＰ０４、ＳＡＤ、ＰＴＰ０５、ＰＴＰ１０、ＡＬＰ、またはＡＬＫ−７である、請求項３１記載の方法。３３．前記天然の結合相手が固体支持体に結合しうる、請求項２３記載の方法。３４．前記天然の結合相手がペプチドである、請求項３３記載の方法。３５．前記ペプチドがホスホペプチドを含む、請求項３４記載の方法。３６．前記ホスホペプチドがＩＴＡＭモティーフを含む、請求項３５記載の方法。３７．前記天然の結合相手が脂質を含む、請求項３３記載の方法。３８．前記固体支持体が、ウエルプレート、ガラスビーズ、または樹脂を含む、請求項３３記載の方法。３９．前記活性が、自己触媒活性、基質の触媒的ターンオーバー、または第２の天然の結合相手の結合を含む、請求項２３記載の方法。４０．前記捕獲蛋白質を、基質、第２の天然の結合相手、および抗体からなる群より選択される１つまたはそれ以上の成分と接触させる工程をさらに含む、請求項２３記載の方法。４１．工程（ａ）の前に、前記蛋白質を含有する細胞を溶解させる工程をさらに含む、請求項２３記載の方法。４２．ａ）天然の結合相手；ｂ）固体支持体；およびｃ）結合剤を含む、非レセプター酵素活性の調節剤を同定するためのキット。４３．前記結合剤が、基質、第２の天然の結合相手、および抗体からなる群より選択される、請求項４２記載のキット。４４．前記天然の結合相手がペプチドである、請求項４３記載のキット。４５．前記ペプチドがホスホペプチドである、請求項４４記載のキット。４６．前記ホスホペプチドがＩＴＡＭモティーフを含む、請求項４５記載のキット。４７．前記天然の結合相手が脂質を含む、請求項４２記載のキット。