WO2007037532A1 - Ｓｒｍｓ遺伝子の治療的又は診断的用途 - Google Patents

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WO2007037532A1
WO2007037532A1 PCT/JP2006/320008 JP2006320008W WO2007037532A1 WO 2007037532 A1 WO2007037532 A1 WO 2007037532A1 JP 2006320008 W JP2006320008 W JP 2006320008W WO 2007037532 A1 WO2007037532 A1 WO 2007037532A1
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protein
rms
antibody
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Shinichirou Niwa
Yasutaka Makino
Tomoki Ikuta
Kazuya Arai
Takayuki Shindou
Hiromichi Ogura
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Link Genomics, Inc.
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a gene specifically amplified in cancer, a therapeutic or diagnostic use thereof, and the like. Background art
  • cancers Malignant tumors (cancers) are characterized by lethality due to proliferation, invasion, and metastasis. With surgical excision or radiation local therapy, the development of pharmacotherapy that can adequately address metastatic recurrent cancer will improve the future cancer treatment results. Therapies often act directly and on Z or RNA, killing cells to death, but other than cancer cells, such as bone marrow cells, cells, gastrointestinal epithelial cells Had strong side effects. On the other hand, the molecular mechanisms that have recently been attracting attention as the mechanism of molecular cell growth, the mechanism involved in cancer cell invasion, proliferation, and metastasis.
  • non-small cell lung cancer treatment GF R (epidermal growth factor receptor), tyrosine kinase inhibitor (generic name: gefutinib) (WO 9 6 3 3 9 8 0), It is in 3rd place.
  • GF R epimal growth factor receptor
  • tyrosine kinase inhibitor generic name: gefutinib
  • WO 9 6 3 3 9 8 0 tyrosine kinase inhibitor
  • It is in 3rd place.
  • 60s are in the order of 50s and 70s.
  • the cause of the increase in colorectal cancer and environmental factors may be considered, but it has been pointed out that this is due to the westernization of eating habits and excessive consumption.
  • the large intestine is waiting for the development of targeted drugs.
  • CEA CA 19-9 used for diagnosis only shows that it is advanced colorectal cancer, has no organ specificity, and is a higher performance diagnostic agent. Disclosure of the invention
  • the present inventors have found that it is an R M S gene that is frequently amplified in cancer (especially colorectal cancer).
  • the present inventors have completed that it is possible to suppress the proliferation of cancer cells by causing SRM Stamper injury in a cell line and a cervical cancer cell line. That is, the present invention provides the following screening methods for candidate substances having cancer-suppressing activity, cancer diagnosis kits, cancer diagnosis methods, and the like.
  • An active ingredient and a therapeutic agent comprising an SRM S protein activity inhibitor, comprising a substance selected from the group consisting of:
  • a cancer therapeutic agent comprising the antibody according to (9) above.
  • the above (1 therapeutic agent) further comprising a vector carrying a radioisotope, a therapeutic protein, a low molecular drug gene.
  • a cancer diagnostic agent comprising the antibody according to (9) above.
  • a diagnostic agent for cancer that can be hyper-predated under a high pre-hydration condition to the SRM S gene or a part of the base sequence thereof.
  • SRM S Can be hyper-predated under high pre-hybridization conditions to the S gene or a part of its base sequence The method described in 9).
  • (24) (a) a polynucleotide process comprising a biological sample derived from a subject and a base sequence that is stringent to a base sequence of an S RMS genetic fragment and capable of high-prisidization, and
  • a therapeutic agent comprising an SRM S gene expression inhibitor as an active ingredient, and having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 10 Contains a cancer therapeutic agent.
  • the present invention provides novel drugs, kits and methods useful for the treatment and treatment of cancer (eg, colorectal cancer), and methods for screening candidate compounds for cancer.
  • cancer eg, colorectal cancer
  • FIG. 1 is a histogram showing the frequency of the SRM S gene with respect to the degree of amplification of 20 gene derived from a colon cancer patient.
  • Figure 2 shows an optical micrograph (phase contrast diagram 3) showing the results of RNA 1 analysis of (A) colon cancer cell line Caco 2 and (cell line RKO with s 1 RNA of the S RMS gene.
  • Fig. 4 shows the results of evaluating RNA 1 effect by measuring the number of viable cells. It is a photograph (phase contrast image) showing the result verified by RNAi mirror when siRNA of the cell line CCD 18 Co derived from the cell line is transfected.
  • Figure 5 shows a cell line derived from normal colon tissue. It is rough.
  • FIG. 8A-C show the correspondence between cucumbers and amino acids (or amino acid sequences) determined by MS / MS analysis
  • Figure 9 shows SRMS inheritance in cervical cancer cell line HeLa cell line
  • FIG. 5 is a graph showing the results of live cell proof of RNA 1 effect when transferred.
  • FIG. 10 is an optical micrograph showing the results of detailed observation of the experiment of FIG. 9 under a microscope according to the time series (differential interference image Best Mode for Carrying Out the Invention). The number of genes amplified in colorectal cancer was verified using specimens from cancer patients, and among the areas where amplification was frequently occurring in specimens (S rc— relatedkinaselackirmi na 1 regulatorytyrosine — te rm inal my ristylationsi High frequency in specimens from patients with colorectal cancer
  • S RMS is a non-receptor tyrosine kinase (NR — S rc homology (SH) domain S rc member (Kohmura, N, eta 1 o 1 Cell Biol 14 (1 0), 6 9 1 5 c— src is a non-receptor tyrosine kinase identified as Roussarcoma virus, DA, eta 1 (1 9 8 7) Procat S ci U SA 8 4, 8 3 2 5-8 3 2 9, Hunt 9 9 1) M ethods E nz ymo l 2 0 0, 3 rle, D, eta 1 (1 9 9 3) Nature 6— 2 3 3).
  • the S rc family is a non-receptor tyrosine kinase protein around 50 to 60 kDa. From the common N-terminal side, the myristate required for localization to the cell membrane contains an SH 4 domain containing residues, a unique domain maintained between Src families, and a proline-rich sequence that recognizes proline-rich tyrosine structure from important regulatory region to control the recognizing SH 2 domain, and quinic is SH 1 kina f over peptidase activity
  • S RMS has no N-terminal glycine residue found in the Src family. For this reason, it is not localized in the cell membrane of myristic acid but in the cytoplasm. There is no tyrosine residue on the C-terminal side. Therefore, in other families, ermlna 1 S rckinase) is phosphorylated (N ada, S, eta 1 (1 9 9 3) 1 1 2 5-1 1 3 5; Okada, M, It is estimated that eta IB iol C chem 2 5 6, 2 4 2 4 9— 24 2 5 S is not regulated by C sk.
  • the S rc family is responsible for the role in canceration, important intracellular signaling related to the proliferation, differentiation, and function of blood cells and cells.
  • Cell lines derived from the thymus, cerebellum, liver, uterus, prostate) include colon tumor cell lines (HCT-15, HT-29), ovarian cancer (IGROV1), and cecal primary 2 B) reported high expression (special table 2 0 0 2 — S RMS force expressed and prepared in yeast, in
  • the present invention provides (1) a cancer therapeutic agent containing an S RMS gene expression inhibitor, and (2) a cancer therapeutic agent containing an S RMS protein as an active ingredient.
  • S RMS gene refers to Ac c es s i o n N o ⁇ in the NC BI database.
  • S RMS number 1 is a human S RMS number 1 consisting of 1 5 1 6 bases registered in 3) (reference (Kohmu ra, N, What is included in the “S RMS gene” used in the description is a known method or, for example, molecular cloning (Mo 1 ecu 1 lng T hird E dition, JS amb ra 1, C old When using a commercially available library, it can be carried out according to the attached instruction manual according to the method described in Spring Harbor L as 2 0 0 1).
  • stringent stringent conditions medium stringent conditions or entrant conditions
  • Low stringent 5 XSSC, 5 X Denhardt solution, 0 5% SD
  • middle string is a condition of 5 XSSC, 5 X Denhardt solution, 050% formamide, 42 ° C.”
  • the “trid” is, for example, the conditions of 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 050% formamide, 50 ° C. The higher these conditions, the more efficiently DNA having high homology can be obtained.
  • factors that can affect the stringency of hybridization such as temperature, probe concentration, probe long time, salt concentration, etc. Realize genies.
  • Hybridizable polynucleotides include F
  • “inhibition of gene expression” refers to a gene that inhibits any one of a series of events up to and including the gene (for example, transcription (mRNA generation), quality generation) The production of the protein encoded by shall be inhibited.
  • S RMS protein refers to a protein (SEQ ID NO: 2) consisting of 4 8 8 amino acid residues registered as A nocess 0 1 3 in the N quality database and this protein. In other words, it retains phosphorylation of tyrosine residues of the target protein and one or more activities selected from the self), and deletion or substitution of one or more amino acid residues in this protein sequence
  • the insertion of the mutant protein consisting of the added amino acid sequence is not particularly limited because the amino acid mutation site in the above mutant protein has substantially the same activity as the original protein, but the number of mutations is, for example, 1 to 50 pieces, 1 to 30 pieces, 1 to 25 pieces, 1 to 20 pieces, 1 to 15 pieces, 19 pieces, 1 to 8 pieces ⁇ 7, 1-6 (1 ⁇ several), 1, 1-3, 1-2, 1 The number of mutations is generally good.
  • such a mutant protein has a sequence of SEQ ID NO: 2 and about 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more 91% or more, 92% or more, 93% or more, 9% 4% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more of the same Any material having the same activity as that of the protein may be used.
  • Any material having the same activity as that of the protein may be used.
  • 20 amino acids preferably at least 50, more preferably 0, more preferably at least 100, most preferably 200 amino acid residues.
  • these polypeptides have an amino acid sequence corresponding to a part involved in the activity of the protein.
  • the partial peptide used in the present invention is one or more of the amino acid sequences of the above polypeptides (for example, 1 to It is preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5 amino acid residues may be changed by deletion, addition, substitution or insertion.
  • the SRM S protein used in the present invention can be prepared from cells or tissues containing the protein. They can also be synthesized by these known peptide synthesizers, or can be recombinant using appropriate host cells selected from prokaryotes. Although it may be derived from the SRM S protein used in the present invention, it is preferably derived from human.
  • Substantially the same activity means that the activity is characteristic. Accordingly, the enzyme activities (such as target protein tin oxidation and autophosphorylation) are equivalent (for example, about 0 0 1, preferably about 0 5 to 20 times, more preferably about 0 5, Degree of activity and of protein Algorithm B LA ST (proc N at 1 S ci USA 8 7 2 2 6 4-2 2 6 8, 1 9 9 0; at 1 A cad S cl U SA 9 0 5 8 7 3, Based on the BLAST algorithm, programs called N and B LAS TX have been developed (hu 1 SF, eta 1 JMol B iol 0 3, 1 9 90). The base sequence is resolved using B LAS TN.
  • cancer therapeutic agent refers to anticancer agents, apoptosis inducers of cancer cells, cancer cells It is used in the meaning that includes antiproliferative agents, cancer agents, cancer preventive agents, and the like. Note that the terms “cancer” (or cancer) and “tumor” in this application have the same meaning.
  • the present invention provides a cancer therapeutic agent containing an SRM S gene as an active ingredient.
  • the “SRM S gene expression inhibitor” is not limited as long as it inhibits the expression of a child. (b) Decoy nucleus for S RMS gene or part of it
  • examples of substances from S RMS mR N A to S RMS S protein include
  • RNA a polynucleotide RN to S RMS mRNA or a portion thereof (eg, si RNA),
  • nucleic acid means RNA or DNA.
  • Nucleic acid includes those having other decorated heterocyclic bases containing purine and pyrimidine bases. The product may contain methylated and pyrimilated purines and pyrimidines, acylated purines, or other heterocycles. Leosides and modified nucleotides can also be sugar moieties, for example, one or more hydroxyl groups can be halogens or oils. Examples of RNA that can inhibit the expression of endogenous genes include double-stranded RNAs with a length of 19 to 30 bases, such as ds RNA (double RNA), si RNA ( smallinterfer
  • RNA can be locally delivered to a delivery cis site such as a ribosome, and such a double-stranded RNA (ds RNA) that is expressed locally using the above-constructed vector.
  • ds RNA double-stranded RNA
  • antisense nucleic acid or “antireotide” has a small number of polynucleotides in a DNA region of interest, and the polynucleotide can be hyperhybridized with some of the polynucleotides.
  • Antisense nucleic acids which are nucleic acids, are RNA, DNA, or modified NA, DA).
  • the antisense nucleic acid of the present invention is a modified nucleic acid (RNA, DNA). It may be NA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, or NA hybrid.
  • Modified nucleic acid ingredients include, but are not limited to, nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphate derivatives, and resistance to degradation of oligonucleotide amides.
  • the antisense nucleic acid used is a suitable promoter
  • a sequence complementary to the translation inhibition coding region of the gene or the 3 'untranslated region can be made.
  • the target nucleic acid is effectively expressed using the length of the antisense nucleic acid is at least about 10 bases (about 40 bases), preferably about 15 bases or more, and more preferably 100 bases or more.
  • a nucleic acid having about 500 bases or less can be designed with reference to known literature. Hirashima and Inoue, New Chemistry Laboratory 2 Nucleic acid IV gene Japan Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin, 1 9 9 3 , P 3 1 9 Kawa ka am ieta 1, P harm T ec V ol 8, p 2 4 7, 1 9 9 2, V ol 8, p 2, STC rookeeta 1, ed, se R esearchand Ap plicati Press , 1 9 9 3 etc.).
  • a nucleic acid having a liposomal activity that specifically cleaves S RMS gene can be effectively produced.
  • liposome activity refers to site-specific cleavage of mRNA, which is a transcription product of a gene.
  • Ribozymes include Group I introns and RNs Reference can be made to 9 0, 3 5, p 2 1 9 1, Nuc 1 A cids R 1 7, p 7 0 5 9, etc.
  • the gene can be cleaved by specifically cleaving the gene transcript.
  • the present invention can use a compound that inhibits the transcriptional activity of the S RMS gene as an active ingredient.
  • a compound that inhibits the transcriptional activity of the S RMS gene is related to factors involved in the expression and transcription of the S RMS gene.
  • Such a compound which is neither a natural product nor a synthetic compound, can be obtained by a screening method described later.
  • the present invention also provides a cancer therapeutic agent containing an S RMS toxic substance.
  • an activity inhibitor of S RM S protein (a) an antibody that binds to S RM S protein,
  • SRM S protein mutant having a property of being dominant to S RMS protein refers to endogenous wild-type SR by expressing the gene. Proteins that have the function of eliminating or reducing the activity of Kunihiro, see the gene activity inhibition experiment method edited by Yoshikazu Tahira, Yodo 2 6-3 2).
  • a compound other than the above antibody that binds to the S RMS protein can be used as an active ingredient as the active material of the S RMS protein.
  • it binds to S RMS protein and inhibits its activity.
  • molecules that inhibit the function of S RMS protein include bis-part, bicyclic or heteroaromatic aromatics 9 2/2 0 64 2 (Maguire, 1 9 9 2 years 1 January Vinylene-azazaindole derivatives (W 094Z 1 4 8 0 nari et al., Published on July 7, 1 994)), 1-cyclopyridylquinophanes (US Pat. No. 5, 3 3 0, 9 92), (US Pat. No. 5, 2 1 7, 9 9 9), styryl substituted pyridi patent 5, 3 0 2, 6 0 6), certain quinazoline derivatives 0 5 6 6 2 6 6 A 1), selenoindoles and seleno
  • 4/0 3 4 2 7 (D enny et al., 1 9 9 4 years February 1 7 It can be used as a therapeutic agent that inhibits the activity of the SRMS protein of the present invention described above.
  • the present invention also provides a screen for a candidate compound having a cancer suppressing action.
  • One preferred embodiment is a method of using SRM S protein and a test index. Usually, it has an effect of inhibiting the activity of SRM S protein and SRM S protein.
  • the compound is preferable for the active site of S RMS protein.
  • SRM S protein is contacted.
  • the S RMS protein may be, for example, an intracellular or extracellular form of the S RMS protein, or an affini-bound form, depending on the index for the test compound.
  • the test compound used in this method can be appropriately labeled for use. Examples of the label include a fluorescent label.
  • the SRM S protein and the binding are then detected.
  • test compound used for this method.
  • Proteins and test compounds can be measured by known methods (for example, radioisotopes of the body and phosphate (such as P 3 2 P and P 3 3 ) using the Isa method, immunoprecipitation method, Including, but not limited to, the Western plot method.
  • a test compound that inhibits binding to the SRM S protein is then selected.
  • the compound isolated by this method has a cancer suppressing action and is useful as a cancer therapeutic agent.
  • Another aspect of the screening method of the present invention is a method using an S RMS index.
  • a compound expressing the SRMS gene is contacted.
  • cells examples include cats, dogs, ushi, hedges, birds, pets, livestock, and the like, but are not limited to these sources.
  • an endogenous S RMS gene that expresses an endogenous S RMS gene or an exogenous S RMS gene has been introduced, and the gene can be used for development.
  • Exogenous SRM S genes are usually generated by introducing expression vectors into which each S RMS gene has been inserted. It can be prepared by the expression-specific genetic engineering technique.
  • test compound used in this method.
  • compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, peptides In the case of a protein or the like, “contact” can be performed by introducing the protein into a DNA vector that expresses the protein.
  • the S RMS gene is then expressed.
  • the expression level of transcription and translation can be measured by methods known to those skilled in the art.
  • the bell can be measured by extracting from the cell expressing the SRMS gene according to m, and carrying out the Northern hyrone method or RT_PCR method using this mRNA as a saddle type.
  • a region of the S RMS can be isolated according to a conventional method, and downstream thereof include genes such as labeled genes such as ferase, GFP, and galactosidase, which can be detected by luminescence, fluorescence, and markers.
  • the inheritance can also be measured by observing the activity of the marker gene.
  • the Western blotting method can be performed using the SRM S protein, and the level of gene translation can be detected by detecting the expression of the protein.
  • the antibody is not particularly limited as long as it is an antibody that can be used for detection of S RMS protein. For example, both mono- and polyclonal antibodies can be used. In this method, the test compound is not contacted.
  • the present invention also provides an anti-S RMS antibody, comprising this antibody.
  • the anti-S RMS antibody is used for targeted therapy or targeted drug delivery of the above cancer.
  • the “anti-S RMS antibody” is specifically included in an S RMS fragment (including a partial peptide) or a salt thereof.
  • the anti-S RMS antibody used in the present invention may be an antibody, or may be a monoclonal antibody, and the lath is not particularly limited, and any of Ig G, IgM, IgA, IgE, etc. It is Ig G or IgM which also includes an antibody having an isotype, and IgG when considering the ease of purification.
  • the term “antibody” used herein is meant to include a fragment or derivative thereof, for example, F 2 , CDR, humanized antibody, multifunctional antibody, single chain antibody (ScF). Antibody can be produced by known methods, and antibody production methods are well known in the art (for example, Har 1 Lane D, Antibody, Old Slaboratory Laboratory Pres (1 9 8 (1) antigen) Preparation of
  • the present invention is a protein RMS protein or a salt thereof used as a sensitizing antigen.
  • the S RMS and its partial peptides are also included, which are not limited ))) Amino acid residues may be deleted, substituted, inserted and Z or attached.
  • Examples of salts of S RMS protein used herein include inorganic acids (eg, hydrochloric acid, or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid), etc. Used as a sensitizing antigen for antibody acquisition.
  • the protein of the present invention is not limited to the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from mammals or humans, particularly preferably derived from rabbits.
  • SRM S protein as described above, and its partial peptide In the specification, the description of the antibody is collectively referred to as “protein”. )
  • the dose of the antigen per animal is 0 l to 100 mg when no sputum is used, and l to 100 g when aju is used.
  • the adjuvant include adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant, aluminum hydroxide adjuvant and the like. Immunization is performed by injection into the vein, subcutaneous or intraperitoneal cavity. The interval is not particularly limited, and immunization is performed every several days to several weeks, preferably at intervals of 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times.
  • Antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, Medium (Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine is not included, and it can survive only when fused with antibody-producing cells.
  • Preferred examples of myeloma cells include X 6 3 ANSIZ 1—Ag 4—1, NS 0/1, etc.
  • Rat myeloma cell lines such as mouse mye YB 2Z0, etc.
  • cell fusion between the above myeloma cells and antibody-producing cells is carried out in serum-free DMEM, R PM I — 16 40 cell culture medium, 1 X 10 6 to 1 X 10 7 cells / m 1 and 2 X 10 5 to 2 X 10 6 cells Zm 1 cell ratio of myeloma cells to producer cells and myeloma cells 2 1 to 3 1 cells
  • the fusion reaction is performed in the presence of a fusion accelerator Cell fusion average molecular weight 10 000 to 6 000 Dalton polyethylene can be used In addition, electrical stimulation (eg, electon) is used. Fusing with antibody-producing cells using a commercially available cell fusion device Rukoto can also.
  • the cell suspension is appropriately diluted with R 0 medium containing fetal bovine serum, etc. Add selective medium to each well, and replace the following to culture. As a result, it is possible to obtain cells that grow after the culture is started in the selective medium as a hybridoma. Next, during the culture of the hybridoma that has proliferated, Hypri, a cell that produces monoclonal antibodies
  • a normal cell culture method or ascites formation method can be used.
  • normal culture conditions for example, 37 ° C., 5% 7 to 14 days
  • the antigen described above is administered to mammals such as rats and mice.
  • the dose of antigen per animal is 0 1 ⁇ : LO Omg when adjudicated and ⁇ 100 xg with adjuvant.
  • Adjuvants include Freuvant (F CA), Freund's incomplete adjuvant (FI aluminum adjuvant, etc.) A, radloi mmu noassay) etc., blood is collected on the day when the antibody titer is shown to obtain antiserum.
  • an antibody (column adsorbed fraction) that undergoes SRM reaction is collected by applying a polyclonal antibody in anti-clot to a protein column fixed with a protein.
  • the reactivity of polyclonal antibodies in antiserum to S RMS can be determined by E L I.
  • the Fab or Fab 2 fragment can be prepared by digestion with pepsin or papain (for example, using conventional methods). For example, Rhiec hma nn et al. (Rn J Mol Biol Oct 5; 2 0 3 (3)
  • Chimeric antibodies are, for example, “Experimental Medicine (Extraordinary Supplement 16, No 10, 1 9 8 8”), Japanese Patent Publication No. 3-7 3 2 8 humanized antibodies, for example, “Nature Gene 1 5, p 1 4 6— 1 5 6, 1 9 9 7 ”,“ Naturlcs, Vol 7, p 1 3— 2 1, 1 9 9 4 ”, JP 3 6 5 Gazette, International Application Publication W ⁇ 9 4-2 5 5 8 No. 5 public, June issue, pages 40 to 50, 1 9 95 years ”, V ol 3 6 8, p 8 5 6— 8 5 9, 1 9 9 4 ", special Labeled with quality (eg, radioisotope, fluorescent substance, etc.) Labeled with radioactive substance, fluorescent compound, etc. as required.
  • quality eg, radioisotope, fluorescent substance, etc.
  • antibody S RMS antibodies can be produced using bioluminescent compounds as well as fluoresinate, rhodamine, phycoerythrin and fluorescein.
  • the presence of a bioluminescent protein is measured by the presence of fluorescence.
  • Bioluminescent ferrin, luciferase and aequorin are important for this labeling purpose.
  • the antibody of the present invention is used for specifically detecting S protein or the like in a sample such as a body fluid or tissue, and is used for purifying SRM protein or the like. Used for detection of S RM S protein in each fraction, analysis of behavior of test RM S protein, etc. 3.2 Complex containing anti-S RMS antibody, etc.
  • the anti-S RMS antibody used in the present invention may be an agent having an activity that attenuates the activity of an antigen in itself or in a diagnostic agent.
  • the present invention may be used in combination with other drugs such as cancer (for example, targeted therapy or targeted imaging). According to such an aspect, the present invention provides a composite containing a complex. Indicated.
  • radioisotope is iodine - 1 2 5 (1 25 1), and iodine - include 1 3 1 such as emission element.
  • radioactive halogen elements can also be widely used as radiotherapeutic diagnostic agents by labeling antibodies and peptides in the same manner as the above elements.
  • 1 25 I or 1 de reduction by known methods of chloramine-T method can be antibodies or binding.
  • tech m for diagnosis, indium 1 1 1 1 and gallium mu 6 7 ( 6 7 Ga for treatment use yttrium— 90 ( 9 0 Y), rhenium 6 R e) or rhenium—1 8 8 ( 1 8 8 R e), etc.
  • EDTA EDTA
  • D nodio compound cyclam
  • DOT A DOT A
  • examples of the “therapeutic protein” include site-in force that activates, for example, human 2, human granulocyte / macrophage / coloni / stimulating factor, fuzzy colony stimulating factor, Human leukin 1 2 etc.
  • lysine and diph toxins can be used to directly kill colon cancer cells.
  • therapeutic protein It may mean a diagnostic or therapeutic compound other than “protein”.
  • small molecule drugs include alkylating agents such as nitrogen 'cyclophosphamide, antimetabolites such as 5-flumesotrexate, daunomycin, mitomycin C, daunorubicin, doxorubicin vincristine, vinblastine , Hormones such as vindesine, hormonal agents such as moxifen, dexamethasone, bed tumor oncology (edited by the Japanese Society of Clinical Oncology 1 9 9 6 Non-sterolides, immunomodulators such as gold thomalamine, cyclophosphamide, immunosuppressants such as chlorophene lamin maleate, and anti-histamines such as Kle antihistamines (Inflammation and anti-inflammatory therapy Publishing Co., Ltd.)
  • Daunoma As a method for engaging, method, or the like water-soluble carboxyalkyl Te amino group and antibodies carboxyl group of daunomycin and the like for bonding the amino group of the emission and the antibody via a dull
  • virus vector a virus vector modified so as to be capable of anti-SR of the present invention can be used.
  • No virus virus Wang, P, eta 1 Somatic Celland Molecium 1, 4 2 9-44 1
  • retroviral vectors N Incorporates genes that have therapeutic effects such as inducing apoptosis.
  • Antivirus recognized by the RMS antibody ie, S RMS
  • administered to a patient in need of gene therapy along with a viral RMS antibody that binds to the anti-S RMS antibody can exist.
  • the anti-S RMS antibody and the other agent can be chemically or conjugated.
  • chemical bond is assumed to be due to ionic bond covalent bond, bond due to intermolecular force, and hydrophobic interaction
  • genetic engineering bond refers to fusion consisting of, for example, a protein. The binding mode between the antibody and the therapeutic protein when the protein is produced by genetic recombination or the like.
  • a cancer therapeutic agent containing an S RMS gene expression inhibitor of the present invention but containing an MS protein activity inhibitor, a therapeutic agent containing an MS antibody, or an antibody used in the present invention is a radioisotope, a therapeutic protein
  • a therapeutic agent chemically bound to either a viral vector or a non-viral vector carrying a low molecular drug gene, or any combination thereof, can be based on known methods.
  • Examples include cyclopropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, disulfide, rutileylaminoacetate, polyvinyllatin, medium-chain fatty acid tridallylide, polyoxyethylene oil 60, sucrose, carboxymethylcellulose, corns, etc. .
  • Examples of the dosage form of the therapeutic agent of the present invention include oral powders, pills, powders, granules, fine granules, soft * hard capsules, pellets, sublinguals, and pastes.
  • non-propellants, suppositories, transdermal agents, ointments, plasters, and liquids for external use have optimal dosage forms according to the route of administration and subjects of administration.
  • Inhibitors of SRM S protein activity (also expressed as a child) as an active ingredient can be from 0 1 to 99 9 wt.
  • the dose of the active ingredient of the drug of the present invention varies depending on the administration subject, subject administration method, and the like, but in the case of oral administration, about 0 l mg to l per day for general (as 60 kg)
  • the amount is preferably about 10 to 100 mg, more preferably about 1.
  • the single dose varies depending on the organ, symptoms, administration method, etc. For example, is usually, for example, about 30 mg per patient (for 60 kg), Preferably, about 0.1 to 20 mg, about 0 1 to 10 mg is administered by intravenous injection.
  • the therapeutic agent of the present invention is cancer (for example, colorectal cancer, stomach cancer, cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen bladder cancer, uterine cancer (eg, cervical cancer). Uterine body cancer), adenocarcinoma, spleen cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc.)
  • cancer for example, colorectal cancer, stomach cancer, cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen bladder cancer, uterine cancer (eg, cervical cancer).
  • Uterine body cancer adenocarcinoma, spleen cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc.
  • it is used for the prevention / treatment of colorectal cancer.
  • the drug of the present invention comprises a cell, tissue, organ, or cancer used as an inhibitor of metastasis, an apoptosis inducer of cancer cells, etc. containing an SRMS protein activity inhibitor gene expression inhibitor as an active ingredient
  • the type of the present invention may be specific, and the agent of the present invention may contain both an SRMS protein activity inhibitory substance and an MS gene expression inhibitory substance.
  • a combination of a recombinant adenovirus particle and an anti-SRMS antibody may be used alone for cancer treatment, but is generally used together with pharmaceuticals.
  • Such carriers already include those described above as well as water, saline, glucose, and albumin.
  • the number of administrations may be once to several times a day, may be from one day to several months or more, and a large number of doses may be administered intermittently over a long period of time.
  • Viral vector particles or viruses used in the detection of specific cells and cells or tissues can be used.
  • viral vector particles obtained by integrating a viral marker nuclear marker gene into a suitable host cell can be used to detect and diagnose tumor cells using anti-SRM.
  • a detectable label can be attached to the anti-SRM S antibody and used for tumor cells.
  • the present invention also provides a diagnostic agent for cancer.
  • the diagnostic agent for cancer of the present invention comprises (a) an S RMS protein or (b) a polypeptide that can be hyper-predated under high pre-hybridization conditions. Contains nucleotides.
  • the labeled anti-antibody is used to detect and / or quantify SRMS protein or fragments thereof and anti-SRM.
  • subject-derived biological sample includes subject-derived or body fluid (for example, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.), saliva, sweat, semen, etc.).
  • subject-derived or body fluid for example, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.), saliva, sweat, semen, etc.).
  • a “subject” is a human subject who is, or is suspected to be, a human subject who receives or is desired to receive. Cancer, stomach cancer, lung cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, cancer, uterine cancer (eg cervical cancer, uterine body cancer), testis knee Colorectal cancer including ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc. is preferable.
  • An immunoassay for SRMS in a biological sample derived from a subject as described above produces a body binding of a biological sample taken from a subject at risk of having cancer (eg, colorectal cancer). Contact with an anti-SRMS antibody under the conditions to be measured, and measuring the amount of immunospecific binding by. This binding is used to detect the presence and expression of SRMS protein. In this case, increased SRMS protein is an indicator of disease status. If necessary, the level of S quality in the biological sample is compared with the level of a healthy person without cancer. In one embodiment of the immunoassay described above, for example, a serum sample It can be determined appropriately by the person.
  • One method for detectably labeling anti-SRM S antibodies is to bind to an enzyme, such as the enzyme used in the enzyme immunoassay (EIA) [Vo 1 1 er, A ("The Enzyme Liquid A ssay) (ELISA), 1 gnostic Horizons, 2 1-7, Miogical A ssociates Quarterlication, Walkersvi 1 le MD; A by JC lin Pathol, 3 1.5 0 9 7 8 Butler, JE Meth E nz 7 3.4 4 2 to 5 2 3, 1 9 8 1] Chemical molecules detected by fluorescence measurement using visible means by photometric measurement of antibody binding React with a suitable substrate, a preferred substrate, in a manner that produces an antibody Enzymes that can be labeled with a detectable antibody include, but are not limited to, peroxidase and alcohol.
  • This detection can also be achieved by a colorimetric method using a chromogenic substrate.
  • methods that can be used in the present invention include: racey (RIA), sandwich immunoassay, immunometry, fluorescence immunoassay (FIA), time-resolved fluorescence RFIA), enzyme immunoassay (EIA), luminescence Immunoassay Electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA), Latex coagulation
  • RIA racey
  • sandwich immunoassay immunometry
  • fluorescence immunoassay FIA
  • time-resolved fluorescence RFIA time-resolved fluorescence RFIA
  • EIA enzyme immunoassay
  • ELIA luminescence Immunoassay Electrochemiluminescence immunoassay
  • Latex coagulation As described above, various diseases associated with S RMS protein can be diagnosed by utilizing the in vivo quantification method of S quality using the antibody of the present invention.
  • the anti-S RMS antibody of the present invention can also be used in vivo. Preparation of antibody preparations that can be used here and are well known in the art. For example, antibody-chelating agent c 1 Me d B iol 1 9 9 0 1 7 2 4 An antibody having a target ion for use in magnetic resonance imaging is described in, for example, Magnetinance Medicine 1 9 9 1 2 4 2.
  • a probe or primer designed for the base of the SRM S gene can be used.
  • the base sequence of a live MS gene derived from a subject or a fragment thereof can be used.
  • a nucleotide sequence or a rheotide (probe) that can be hyperlysed under stringency conditions; and
  • it may be a nucleotide fragment of 27 or more bases, 30 or more bases, or a longer fragment.
  • Medium or high stringency conditions may be used for hybridization.
  • the base sequence of the SRMS gene or a fragment thereof, which can be hybridized under the conditions of stringency includes a base polynucleotide complementary to the base sequence of the RMS gene or a fragment thereof.
  • the method of pro-hybridization is known to those skilled in the art and is described in Japanese Patent Publication No. 8 9 0 6 6 98, EP—A 0 2 0 0 3 6 2, 9 1 5, 0 8-2, EP—A 0 0 6 3 8 7 9, and EP—AEP-A 0 1 2 8 0 1 8.
  • a known target sequence can be detected or quantified using a nucleotide probe or primer for the SRM S gene.
  • a nucleotide probe or primer for the SRM S gene For example, Southern Hybridization, Northern-Son, RT-PCR, PCR-SSCP (G e, Vol. 5, 8 7 4-8 7 9 (1 9 8 9 Procofthe National Academy ofcesofthe United Stateslca, Vol. 8 6, 2 7 6 6-2 7 70 (1 9 8 9) Method, DNA chip or array C GH (C omp aren om ic Hy bridization). Quantitative detection is performed by quantitative RT_PCR This is a method to detect cancer copy number abnormalities with high resolution by detecting the binding state (Pineta 1 (1 9 9 8) N at Genet 2 0,
  • the mRNA level of the SRM S of the cell housekeeping gene (eg, Shaper, Mammary G land B iol N eopl (1 9 9 8) 3 1 5-3 24, Wu, YY and L. Acta derm Venereo 1 8 2— 3) and preferably RT-PCR.
  • a mass spectrometer can be used for the presence of or a fragment thereof in a test sample. That is, the amino acid sequence of a protein or a fragment thereof can be determined by using a mass spectrometer.
  • ionization such as matrix-assisted laser desonization (MAL DI), electrospray ionization, phase (EI, CI), and field desorption (FD).
  • MAL DI matrix-assisted laser desonization
  • EI, CI electrospray ionization
  • FD field desorption
  • ion separation ion content compatible with ionization method
  • time-of-flight type ti me ght.
  • T0F mass spectrometer in the case of ESI, quadruple ion trap type, A mass spectrometer such as a magnetic field type is sometimes used in tandem with a mass spectrometer.
  • mass spectrometer such as a magnetic field type is sometimes used in tandem with a mass spectrometer.
  • IMS / S, Q-TOF MS, MAL DI-TO Other amino acid sequencing methods, for example, amino acid sequencing by 1 (eg, gas phase sequencer) may be used.
  • the present invention also provides a kit for quantifying a subject's RMS protein or fragment thereof containing an anti-S RMS antibody as a cancer marker.
  • SRM contains a base sequence that can be replicated under a stringent hybrid in a part of the base sequence of SRM. Also provide. It is used to detect by these chiimmunological methods or the hyperprecipitation method.
  • cancer Refers to a molecule that is not derived from normal tissue, or is a cancer cell or alternatively enhanced expression, and the presence of the molecule in the subject or tissue suggests the presence of cancer. .
  • the kit according to the first aspect contains a component to be quantified in a body fluid sample from a subject (including S R M S protein and a partial peptide thereof).
  • a component to be quantified in a body fluid sample from a subject including S R M S protein and a partial peptide thereof.
  • it can be used to detect and / or quantify S R M S in such tissue sections or body fluid samples such as blood and urine, if detected and / or quantified with S R M S Tan S A.
  • the label which may be labeled with fluorescence, colorimetric or enzyme label, may contain a labeled secondary antibody.
  • the kit of the second aspect contains a polynucleotide comprising a SRM S gene or a base sequence that can be used under high-precipitation conditions that are stringent to the gene.
  • the light kit can have the above-mentioned polygons fixed on the DNA chip.
  • the kit of the present invention may be a container and a label, in addition to an anti-SRMS antibody, a base sequence capable of hybridizing that is subtle to the base sequence of the SRMS gene, and the like.
  • the label on or associated with the container may indicate that the drug is used for mass detection.
  • an instruction manual may be further included. Sample preparation and Array C validation of 200 colon cancer specimens were performed.
  • amplification occurred frequently in colorectal cancer specimens, and genetic information in the public DB (NCBI: http: // wn 1 mnihgov no) was used, and as a result of examination, C lone RP 1 1 — 9 5 N 1 S—relatedkinaselacking C a 1 regulatorytyrosineanmlna 1 my ristylationsites A ccession No o NM— 0 8 0 8 2 3)
  • Fig. 1 This is a histogram showing the amplification of S RM S gene in 20 colorectal cancer patients, and Table 2 below shows the degree of amplification (GZR value) and frequency in 20 SR SR patients.
  • the SRM S gene is amplified in 75 5% of 20 0 samples, and the value is the average value for samples with GZR values of 12 or more. The degree was 0. The maximum value was 37, which was very frequent. I'm stuck.
  • C a co which is a cell line derived from colorectal cancer
  • Genomic DNA was extracted from the cultured cells according to the kit supplement using BLOOD & CELDNA Kit (QIAGEN).
  • Table 3 shows the values of SRM S gene in colon cancer-derived cell lines. As shown, it was found that amplification occurred in the child located in C C lone RP 1 1-9 5 N 13 in the colon cancer-derived cell line.
  • Quantitative PCR is S YB RG reen RT—PC Primer sequence
  • the value of the S RMS gene in the colorectal cancer cell line is relative to the control DNA (normal).
  • the intestinal cancer-derived cell line was also found to increase in the SRM S gene region.
  • the SRM S gene was also amplified in the colorectal cancer cell line (Cac). It was cultivated for use in the functional analysis of the S RMS gene in cancer. 3 According to RN Ai analysis using colorectal cancer cell lines In this example, the S RMS gene, which was frequently found in 200 colorectal cancer patients, was The target sl RNA was synthesized (composition commissioned by QI AGEN (Table 5)
  • siRNA was introduced into Caco 2 cells using 0 1 iglne (Invitrogen) and introduced into the cells according to the protocol attached to ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .
  • Introduction into siRNA [Lipofect amine (Invitr was used, 5 0 1] ⁇ 3 1 RNA was used as an attached protocol.
  • N egative Controlsisi AGEN was used as a control.
  • the standard gene for calculating the relative ratio is G l y c r e— 3— p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s H) C o n t r o l R e a g e n ts (Ap p i y s t em s) is used to determine the expression level of G A P D H.
  • RNA 1 analysis of the S gene which is a cell line derived from colorectal cancer, was performed.
  • FIGS. 2A and 2B respectively, C aco 2 cells and Fig. 3 A and Fig. 3 B show that the SRM S gene sl RNA was transferred to the Caco 2 cell cell. Amount indicated. As shown, the results showed that the number of cells was significantly reduced compared to N egative cont as well as the phenotype (Fig. 3 A, B). All three offspring s 1 RNAs (a, b, c) were t-tested (p ⁇ 0 0 1).
  • Example 4 For RNAI analysis using a normal cell line derived from the large intestine
  • the suppression effect of the target gene was verified in a cancer-specific manner by performing a cell line derived from a normal tissue of the large intestine.
  • FIG. 4 shows an observation image obtained on the 5th day after the SRM S gene slnsfection on C CD 1 8 CO cells (upper X 2 0 0).
  • S RM S c is the S RM S gene s 1
  • FIG. 5 shows the result of measuring the measurement reagent using the cells on the fifth day after s 1 ns f e c tio n of S RMS gene in C CD 18 CO cells.
  • the relative amount to NC was the same as the phenotype, and no N e g ati v e C o n t r o l (NC) effect was observed (Fig. 5).
  • FIG. 6 shows some of the cancer cells observed in each specimen tissue (A to J) (academic micrographs (fluorescence images). As shown, more than 3 spots of cancer signals were found. It was confirmed that S RMS remains in 10 samples with (G / R) of 12 or more by the array CGH method, and that gene amplification occurred at the early stage of the disease state. This indicates that the child region can be applied not only as a molecular target for cancer drugs but also for FI diagnosis Example 6 ⁇ Detection of blood S RM S protein by mass spectrometry
  • Recycle is 80 L of 2M urea + lOOmM ammonium bicarbonate solution. Separated by 5 m, 300A, 300 mm idx 5 mm LC PACKINGS 163589 Nano column (C18 PepMap 3 m, 100 A, 75 mid PACKINGS 160321). As the HPLC apparatus, Ulti PACKINGS was used.
  • the flow rate was 200nL / min, and a linear gradient with a concentration gradient of 0 1% formic acid (Wak-containing 2% acetonitrile and MERCK 1287229) and 0 1% formic acid-containing tolyl was 0 57% / min.
  • Nano-HPLC The sample separated in 1 was introduced into ion trap mass spectrometry directly connected through PicoTip (New Object 10-D-20)
  • the mass spectrometer was ionized with a HCT Plus (Bruker Dal tonics) material with a single voltage of 1500 V, an end play of 500 V, Dry gas flow rate 12 L / min, dry gas temperature 250 ° C Ion trap was set by MS / MS analysis with 2 Da before and after target m / z 3) Data analysis
  • Figure 7 A and Figure 7 B are: (A) from colorectal cancer patients It was. That is, as shown in FIG. 8B, at least a partial sequence called C-terminal PATW was determined, which corresponds to positions 392 to 3999 in the S RMS mino acid sequence (SEQ ID NO: 2). To do. Therefore, as shown in Fig. 8A, the ionic peak corresponding to the partial sequence identified by the target peptide fragment (SEQ ID NO: 1 3) at position 3 of the amino acid sequence could not be used for healthy human serum (see Fig. 8C). ) Therefore, this target component (SRM S protein) increased in blood abundance in a cancer-specific manner and was strongly suggested.
  • SRM S protein Example 7RNAi effect in cervical cancer-derived strain HeLa cell line SRM gene knockdown effect was observed in colorectal cancer cell lines, but what can be done in cervical cancer cell lines? Evaluation was performed by the RNAi analysis method described above.
  • RNAi analysis was performed using the above 3.
  • s 1 RN A into the cell was introduced into the cell according to the protocol attached to the nM s l RN A, using the N g ga te C nt r ol si RNA (Q I. Results)
  • Figure 9 shows the S RMS gene sl RNA in HeLa cells. Furthermore, following the time series, differential interference images were taken under a microscope and observed in detail. Specifically, differential interference in the same visual field after 1 day, 2, 3, 4 days after siRNA (a, b, fusion) in HeLa cells is shown in Fig. 10. NC used Negative control siRN. In comparison with NC, the growth rate was suppressed and cell death was indicated. In the figure, a, b, and c were induced in a, b, and c, where growth inhibition was observed, as shown by siRNA a, siRNAb, and sl RNAc.
  • the present invention provides a therapeutic agent for cancer, a diagnostic agent, a diagnostic method, a kit used for the therapeutic method, and the like. Therefore, it is useful in the field of this invention or targeted therapy.

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Abstract

本発明は、ＳＲＭＳタンパク質の発現阻害物質または活性阻害物質を含有するがん治療剤；そのような治療剤の有効成分として使用し得る化合物のスクリーニング方法；ＳＲＭＳタンパク質に対する抗体；その抗体などを用いるがん診断剤・がん診断方法などを提供する。

Description

明細書
S RM S遺伝子の治療的又は診断的用途 技術分野
本発明は、 がんにおいて特異的に増幅している遺伝子 遺伝子、 その治療的又は診断的用途などに関する。 背景技術
悪性腫瘍 （がん） の特徴として、 増殖 · 浸潤 · 転移を ことによる致死があげられる。 外科的な切除または放射 局所療法では、 転移性再発がんに対して十分な対処はで である薬物療法の発展が、 今後のがん治療成績の向上に がん薬物療法の現在の中心である化学療法は、 直接が および Zまたは RN Aに作用し、 細胞を死に至らせる殺 る場合が多いが、 がん細胞以外の、 例えば、 骨髄細胞、 細胞、 消化管上皮細胞など分裂がさかんな正常細胞に対 強い副作用をもたらしていた。 一方、 近年の分子細胞生 り、 がん細胞の浸潤 · 増殖 · 転移などにかかわるメカニ そのがん細胞の特定メカニズムに特異的に作用する分子 注目されている。 代表例として、 非小細胞肺がんの治療 GF R (上皮成長因子受容体） 、 チロシンキナーゼ阻害 サ （一般名 ゲフイチニブ） （WO 9 6ノ 3 3 9 8 0) 、 んに次いで 3位になっている。 年齢別では 6 0歳代が一 5 0歳代、 7 0歳代の順である。 大腸がんの増加の原因 因、 環境的要因などが考えられるが、 食生活の西欧化、 の取りすぎが原因ではないかと指摘されている。 大腸が 標的薬の開発が待たれている。 また、 診断に用いられて 一 ( C E A， C A 1 9 - 9 ) は、 進行大腸がんであって を示すのみで、 臓器特異性も無く、 より高性能な診断薬 ている。 発明の開示
上記のような状況下で、 がんを治療および Zまたは診 たな薬剤または方法が求められている。
特に、 がんに対して特異性の高い治療薬および Zまた られている。
上記のような状況に鑑み、 本発明者らは、 鋭意研究を ん （特に、 大腸がん） において高頻度に増幅が起きてい R M S遺伝子であることを見出した。 本発明者らはさら 胞株ならびに子宮頸がん細胞株において S R M Sタンパ 害することによって、 癌細胞の増殖を抑制し得ることを を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、 以下に記載 がん抑制作用を有する候補物質のスクリーニング方法、 ん診断用キッ ト、 がんの診断方法などを提供する。
( 1 ) S R M S遺伝子の発現阻害物質を有効成分として (c ) S RMS遺伝子またはその一部に対するデコイ
(d) S RM S遺伝子またはその一部に対してドミナ に作用する S RM S遺伝子変異体
(e ) S RM S遺伝子の転写産物を特異的に切断する を有する核酸、
および
( f ) S RMS遺伝子の転写または S RMS mRN する化合物 （上記核酸を除く）
からなる群から選択される物質を含む、 上記 （ 1 ) に記 ( 3) S RM Sタンパク質の活性阻害物質を有効成分と ん治療剤。
(4) 上記 S RM Sタンパク質の活性阻害物質が、
( a ) 該 S RM Sタンパク質に対する抗体、
(b) 該 S RMSタンパク質に対して ドミナントネガ 有する S RM Sタンパク質変異体、 および、
(c ) 該 S RMSタンパク質に結合する化合物 （上記 体を除く）
からなる群から選択される物質を含む、 上記 （ 3) に記
( 5 ) 上記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 (4) のいずれかに記載のがん治療剤。
(6) S RMS遺伝子の発現阻害物質をスクリーニング て、
(a) S RM S遺伝子を発現する細胞に、 被検化合物 (a) S RMSタンパク質と被検化合物とを接触させ
(b) 該 S RMSタンパク質と被検化合物との結合活 程、 および
(c ) 該 S RMSタンパク質と結合する化合物を選択 する、 スク リーニング方法。
(8) 上記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 は （7 ) に記載の方法。
(9) S RMSタンパク質に対する抗体。
( 1 0 ) 上記 （9 ) に記載の抗体を含有するがん治療剤。 ( 1 1 ) 放射性同位元素、 治療タンパク質、 低分子の薬 遺伝子を担持したベクターをさ らに含有する、 上記 （ 1 ん治療剤。
( 1 2 ) 上記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 または （ 1 1 ) に記載のがん治療剤。
( 1 3 ) 上記 （9) に記載の抗体を含有するがん診断剤。
( 1 4 ) S RM S遺伝子またはその一部の塩基配列にス なハイプリダイゼーショ ン条件下でハイプリダイズ可能 有するがん診断剤。
( 1 5 ) 上記がんが大腸がんである、 上記 （ 1 3 ) また 載のがん診断剤。
( 1 6 ) 上記 （ 9 ) に記載の抗体を含有するがん診断用
( 1 7 ) S RM S遺伝子またはその一部の塩基配列にス なハイプリダイゼーショ ン条件下でハイプリダイズ可能 9) に記載の方法。
( 2 1 ) 質量分析装置を用いて、 S RM Sタンパク質を たは定量する、 上記 （ 1 9 ) または （ 2 0) に記載の方
(2 2 ) 抗 S RMS抗体を用いて、 S RM Sタンパク質 または定量する、 上記 （ 1 9) 〜 （2 1 ) のいずれかに
( 2 3 ) ( a) 被験者由来の生体試料と、 S RM Sタン 抗体とを接触させる工程、 および
(b) 上記試料中での上記抗体と、 S RMSタンパク 出および Zまたは定量する工程、
を包含する、 上記 （2 2) に記載の診断方法。
(24) ( a) 被験者由来の生体試料と、 S RMS遺伝 片の塩基配列にス トリ ンジェン トなハイプリダイゼーシ ィプリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチド 工程、 および
(b ) 上記試料中での上記ポリヌクレオチドと、 S R はその断片とのハイプリダイゼーショ ンを検出および 工程、
を包含する、 上記 （ 1 9) または （2 0 ) に記載の方法。
(2 5) がんの診断に用いるための上記 （ 1 9 ) 〜 （2 に記載の方法。
( 2 6 ) 前記がんが、 大腸がんである、 上記 （ 2 5 ) に ( 2 7 ) S RMS遺伝子の発現阻害物質を患者に投与す る、 がん治療方法。 (3 1 ) 配列番号 5、 配列番号 6、 配列番号 7、 配列番 9、 または配列番号 1 0の塩基配列を有する、 ポリヌク
(3 2 ) S RM S遺伝子の発現阻害物質を有効成分とし 治療剤であって、 配列番号 5、 配列番号 6、 配列番号 7、 配列番号 9、 または配列番号 1 0の塩基配列を有するポ を含有する、 がん治療剤。
本発明により、 がん （例えば、 大腸がん） の治療およ に有用な新規な薬剤、 キッ トおよび方法、 ならびにがん る候補化合物のスクリ一二ング方法が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、 S RM S遺伝子の大腸がん患者由来の 2 0 0 伝子増幅度に対する頻度を示すヒス トグラムである。
図 2は、 （A) 大腸がん細胞株 C a c o 2、 および （ 胞株 RKOに、 S RMS遺伝子の s 1 RNAを トランス 合の、 RNA 1解析の結果を示す光学顕微鏡写真（位相差 図 3は、 （A) 大腸がん細胞株 C a c o 2、 および （ 株 RKOに S RMS遺伝子の s 1 RNAを トランスフエ 生細胞数測定による RNA 1効果を評価した結果を示す 図 4は、 大腸正常組織由来の細胞株 C C D 1 8 C oに の s i RNAを トランスフエク 卜した場合の、 RNA i 鏡により検証した結果を示す写真（位相差像）である。
図 5は、 大腸正常組織由来の細胞株 C CD 1 8 C oに S ラフである。
図 8 A〜Cは、 M S/M S解析によって決定された、 クとアミノ酸 （またはアミ ノ酸配列） との対応関係を示 図 9は、 子宮頸癌細胞株 HeLa 細胞株に S RM S遺伝 を トランスフエク 卜した場合の、 RNA 1効果を生細胞 証した結果を示すグラフである。
図 1 0は、 図 9の実験を時系列に従い、 顕微鏡下で撮 を詳細に観察した結果を示す光学顕微鏡写真（微分干渉像 発明を実施するための最良の形態 本発明者らは、 大腸がん患者由来の検体を用いてアレ る増幅遺伝子の検証を行い、 大腸がん特異的な遺伝子増 た。 検体において高頻度に増幅が起きている領域のうち、 (S r c— r e l a t e d k i n a s e l a c k i r m i n a 1 r e g u l a t o r y t y r o s i n e — t e rm i n a l my r i s t y l a t i o n s i 子が大腸がん患者由来の検体において高頻度であること
S RMSは、 非受容体型のチロシンキナーゼ （NR— S r c h omo l o g y ( S H) ドメインを持つ S r c ンバーである （Ko hmu r a， N ， e t a 1 o 1 C e l l B i o l 1 4 ( 1 0) ， 6 9 1 5 c— s r cは、 R o u s s a r c o m aウィルスの して同定された非受容体型のチロシンキナーゼであり、 D A ， e t a 1 ( 1 9 8 7 ) P r o c a t S c i U SA 8 4， 8 3 2 5 - 8 3 2 9 , Hu n t 9 9 1 ) M e t h o d s E n z ymo l 2 0 0， 3 r l e , D , e t a 1 ( 1 9 9 3 ) N a t u r e 6— 2 3 3 ) 。
S r cファミ リ一は、 非受容体型のチロシンキナーゼ 5 0〜 6 0 k D a前後のタンパク質である。 その共通の N末端側から、 細胞膜への局在に必要なミ リスチン酸が ン残基を含む S H 4 ドメイン、 S r cフアミ リー間で保 ユニーク ドメイン、 プロリンに富む配列を認識する S H ン酸化チロシンを認識する S H 2 ドメイン、 およびキナ ある S H 1キナ fーゼ活性の制御に重要な調節領域から構
S RMSは、 S r cファミ リ一で見られる N末端側の にあるグリ シン残基が無い。 このため、 ミ リスチン酸の 胞膜には局在せずに細胞質に局在する。 また、 C末端側 るチロシン残基がない。 このため、 他のファミ リ一では e r m l n a 1 S r c k i n a s e ) により リ ン酸 化される （N a d a， S , e t a 1 ( 1 9 9 3) 1 1 2 5 - 1 1 3 5 ; O k a d a, M , e t a I B i o l C h em 2 5 6 , 2 4 2 4 9— 24 2 5 Sは C s kの調節を受けないことが推定されている。
S r cファミ リ一は、 がん化における役割、 血球系や 胞の増殖 · 分化 ·機能に関わる重要な細胞内シグナル伝 胸腺、 小脳、 肝臓、 子宮、 前立腺） では認められていな 由来細胞株においては、 結腸腫瘍細胞株 （HC T— 1 5， HT- 2 9 ) 、 卵巣がん （ I GROV 1 ) 、 盲腸原発が 2 B) では高い発現が報告されている （特表 2 0 0 2— また、 酵母で発現し調製した S RMS力 、 i n
ラーゼ及びポリ — G 1 u— Ty rを用いたアツセィによ をもつことが報告されている （特表 2 0 0 2 - 5 1 3 2 8 本発明者らは、 S RM S遺伝子の発現を RN A i (R つて抑制することによってがん細胞の増殖を抑制できる したがって、 S RMS遺伝子の発現を抑制することによ 療することが可能となる。 また、 S RM S遺伝子の発現 とによってがんの診断を行うことも可能となる。
以下、 本発明のがん治療剤、 スクリーニング方法、 診 て詳細に説明する。
1 がん抑制作用を有する薬剤
まず、 本発明は、 （ 1 ) S RMS遺伝子の発現阻害物 して含有するがん治療剤、 及び （2 ) S RM Sタンパク 質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。
本明細書中、 「S RMS遺伝子」 という場合、 NC B I データベースにおいて、 Ac c e s s i o n N o ·
2 3で登録されている 1 5 1 6塩基からなるヒ ト S RMS 番号 1 ) を意味するが （文献 （K o hmu r a , N ， 明細書中で使用する 「S RMS遺伝子」 に含まれるもの ハイプリダイゼーショ ンは、 公知の方法あるいはそれ 例えば、 モレキュラー · クローニング （Mo 1 e c u 1 l n g T h i r d E d i t i o n , J S amb r a 1 , C o l d S p r i n g H a r b o r L a s 2 0 0 1 ) に記載の方法などに従って行うことが 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書 従って行う ことができる。 ここて、 「ス トリ ンジェン卜 ス トリ ンジェン トな条件、 中ス トリ ンジェン卜な条件及 ェントな条件のいずれでもよい。 「低ス トリ ンジェント えば、 5 X S S C、 5 Xデンハルト溶液、 0 5 % S D ムアミ ド、 3 2°Cの条件である。 また、 「中ス トリ ンジ は、 例えば、 5 X S S C、 5 Xデンハルト溶液、 0 5 0 %ホルムアミ ド、 4 2 °Cの条件である。 「高ス ト リ 件」 は、 例えば、 5 X S S C、 5 Xデンハルト溶液、 0 5 0 %ホルムアミ ド、 5 0°Cの条件である。 これらの条 度を上げるほど高い相同性を有する DN Aが効率的に得 待できる。 ただし、 ハイブリダィゼーシヨ ンのス ト リン 響する要素としては温度、 プローブ濃度、 プローブの長 時間、 塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者てあれ 適宜選択することで同様のス トリンジエンシーを実現す める。
ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチドとしては、 F 本明細書中、 「遺伝子の発現阻害」 とは、 遺伝子から までの一連の事象 （例えば、 転写 （mRNAの生成） 、 質の生成） を含む） のうちのいずれかの事象を阻害する の遺伝子によってコードされるタンパク質の生成を阻害 するものとする。
本明細書中、 「S RMSタンパク質」 という場合、 N 質データベースにおいて、 A c c e s s i o n N o · 0 1 3で登録されている 4 8 8アミノ酸残基からなるヒ パク質 （配列番号 2 ) およびこのタンパク質と実質的に えば、 標的タンパク質のチロシン残基のリ ン酸化、 自己 ら選択される一種以上の活性） を保持し、 このタンパク 列に対して 1〜複数個のアミノ酸残基の欠失、 置換、 挿 は付加が生じたアミノ酸配列からなる変異タンパク質を 上記変異タンパク質における、 アミノ酸の変異部位お 異タンパク質が元のタンパク質と実質的に同質の活性を り特に制限はないが、 変異個数は、 例えば、 1〜 5 0個、 1〜 3 0個、 1〜 2 5個、 1〜 2 0個、 1〜 1 5個、 1 9個、 1〜 8個、 ：！〜 7個、 1〜 6個 （ 1〜数個） 、 1 個、 1〜 3個、 1〜 2個、 1個である。 変異個数は一般 ましい。 また、 このような変異タンパク質は、 配列番号 2 列と約 7 0 %以上、 7 5 %以上、 8 0 %以上、 8 5 %以 9 1 %以上、 9 2 %以上、 9 3 %以上、 9 4 %以上、 9 6 %以上、 9 7 %以上、 9 8 %以上、 9 9 %以上の同一 ンパク質の活性と同様の活性を有するものであればいず い。 例えば、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列におい 2 0個、 好ましくは少なく とも 5 0個、 さらに好ましく 0個、 より好ましくは少なく とも 1 0 0個、 最も好まし 2 0 0個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する どが挙げられる。 好ましくは、 これらのポリペプチドは、 パク質の活性に関与する部分に対応するアミノ酸配列を 本発明で使用される部分ペプチドは、 上記のポリペプチ のアミノ酸配列中の 1 または複数個 （例えば、 1〜 2 0 ましくは 1 〜 1 0個程度、 さらにより好ましくは 1 〜 5 ノ酸残基が欠失、 付加、 置換、 または挿入により変更さ もよい。
本発明で用いる S R M Sタンパク質は、 そのタンパク る細胞や組織から調製することができる。 また、 これら 公知のペプチド合成機によっても合成できるし、 原核生 生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法 することができる。 本発明で用いる S R M Sタンパク質 由来のものでもよいが、 好ましくはヒ ト由来である。
「実質的に同質の活性」 とは、 それらの活性が性質的 とを示す。 したがって、 酵素活性 （標的タンパク質のチ ン酸化、 自己リ ン酸化など） が同等 （例えは、 約 0 0 1 好ましくは約 0 5〜 2 0倍、 より好ましくは約 0 5 ことが好ましいが、 これらの活性の程度やタンパク質の ールによるアルゴリズム B LA S T (p r o c N a t 1 S c i U S A 8 7 2 2 6 4 - 2 2 6 8 , 1 9 9 0 ; a t 1 A c a d S c l U SA 9 0 · 5 8 7 3 , を用いて決定できる。 B L A S Tのアルゴリスムに基づ Nや B LAS T Xと呼ばれるプログラムが開発されてい h u 1 S F， e t a 1 J M o l B i o l 0 3， 1 9 9 0 ) 。 B LAS T Nを用いて塩基配列を解 パラメ一夕一は、 例えば s c o r e = 1 0 0、 wo r d l 1 2とする。 また、 B L A S T Xを用いてアミノ酸配列 は、 ノ、ラメ一夕一は、 例えば、 s c o r e = 5 0、 wo r = 3とする。 B LA S Tと G a p p e d B LAS Tプ る場合は、 各プログラムのデフォルトパラメ一夕一を用 本明細書中、 「がん治療剤」 という用語は、 抗癌剤、 癌細胞のアポトーシス誘導剤、 癌細胞の増殖抑制剤、 癌 剤、 がん予防剤等を含む意味で使用される。 なお、 本願 「癌 （または、 がん） 」 と 「腫瘍」 とは同じ意味を有す 用される。
1. 1 S RMS遺伝子の発現阻害物質を含有するがん 本発明は、 1つの実施形態において、 S RM S遺伝子 を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。
本明細書中、 「S RM S遺伝子の発現阻害物質」 には、 子の発現を阻害するものであれば制限はないが、 例えば、 (b) S RMS遺伝子またはその一部に対するデコイ核
( c ) S RMS遺伝子またはその一部に対してドミナン 作用する S RM S遺伝子変異体、 あるいは
(d) その他の転写阻害化合物
などが含まれる。
また、 S RMS mR N Aから S RM Sタンパク質へ る物質の例としては、
( e ) S RMS mRNAまたはその一部に対して RN るポリヌクレオチド （例えば、 s i RNA) 、
( f ) S RMS mRNAまたはその一部に対するアン クレオチド、
(g) S RMS mRNAまたはその一部に対してリボ するポリヌクレオチド、 あるいは
(h) その他の翻訳阻害化合物
などが含まれる。
本明細書中、 「核酸」 とは RNAまたは DN Aを意味 う 「核酸」 は、 プリ ンおよびピリ ミジン塩基を含有する 飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含ん こう した修飾物は、 メチル化されたプリ ンおよびピリミ されたプリ ンおよびピリ ミジン、 ァシル化されたプリ ン ン、 あるいはその他の複素環を含むものであって良い。 レオシドおよび修飾されたヌク レオチドはまた、 糖部分 て良く、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂 内在性遺伝子の発現がいずれも阻害される現象のことを いられる RNAとしては、 例えば、 1 9〜 3 0塩基長の ずる二重鎖 RNA、 例えは、 d s RNA (d o u b l e RNA) , s i RNA ( s m a l l i n t e r f e r
O
A) 又は s h RNA ( s h o r t h a i r p i n R a
れる。 このような RNAは、 リボソームなどの送達シス の部位に局所送達させることも可能であり、 また上記二 成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させる このような二重鎖 RNA (d s RNA、 s i R N Aまた の調製方法、 使用方法などは、 多くの文献から公知であ
2 - 5 1 6 0 6 2号 ； 米国公開言午第 2 0 0 2 ' , 0 8 6
N a t u r e G e n e t 1 C s， 2 4 (2 ) , F e
0一 1 8 3 ， G e n e s 1 S 2 6 (4) , A p r
0 - 2 44 ， N a t u r e， S p e 2 1 , 4 0 7 : 6
9 - 2 0 ， G e n e s & D e v ， V o 1 1
Ap r 1 6， 94 8一 9 5 8 ， P r o c N a t l
S c l U S A ， 9 9 (8 ) ， 1 6 Ap r ， 5
2 0 ， S e 2 9 6 ( 5 5 6 7 ) ， 1 9
5 5 0 - 5 5 3 ， P r O C N a t 1 A c a d
S A, A p r 3 0 9 9 . 9， 6 0 4 7 - 6 0 5 2 r e B 1 o t e c h n O 1 o g y ， V o 1 2 0 y， 4 9 7 - 5 0 0 , N a t u r e B l o t e c h n
V o 1 2 0 ( 5 ) M a y， 5 0 0 - 5 0 8 ， (表 1 )
s i R N A配列
Figure imgf000017_0001
本明細書中、 「アンチセンス核酸」 、 または 「アンチ レオチド」 とは、 ある対象となる DNA領域の少なく と なポリヌクレオチドを有し、 そのポリヌクレオチドが当 とも一部とハイプリダイズすることができる核酸のこと のアンチセンス核酸は、 RNA、 DNA、 あるいは修飾 NA、 D A) である。 本発明のアンチセンス核酸は、 あるいは修飾された核酸 （RNA、 DNA) である。 そ NA、 一本鎖 DNA、 二本鎖 RNA、 一本鎖 RNA、 さ N Aハイブリ ツ ドであってもよい。 修飾された核酸の具 核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフエ一 ト誘導体、 さらには ドアミ ドゃオリゴヌクレオチドアミ ドの分解に抵抗性を が挙げられるが、 それらに限定されるものではない。
使用されるアンチセンス核酸は、 適当なプロモーター 例えば、 S RMS遺伝子の mRNAの 5， 端近傍の非 的なアンチセンス配列を設計すれば、 遺伝子の翻訳阻害 コード領域もしくは 3 ' 側の非翻訳領域に相補的な配列 ができる。 遺伝子の翻訳阻害に効果的なアンチセンス核 子の転写産物に対して約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的 アンチセンス核酸の長さは少なく とも約 1 0塩基以上 （ 4 0個程度） 、 好ましくは約 1 5塩基以上であり、 より 0 0塩基以上であり、 さ らに好ましくは約 5 0 0塩基以 チセンス核酸は公知の文献を参照して設計することがで 平島および井上、 新生化学実験講座 2 核酸 I V遺伝子 日本生化学会編、 東京化学同人、 1 9 9 3、 p 3 1 9 K awa k am i e t a 1 , P h a r m T e c V o l 8 , p 2 4 7 , 1 9 9 2 , V o l 8 , p 2 , S T C r o o k e e t a 1 ， e d , s e R e s e a r c h a n d Ap p l i c a t i P r e s s , 1 9 9 3など参照） 。
また、 本発明のがん治療剤においては、 S RMS遺伝 特異的に切断するリポザィム活性を有する核酸を有効成 ことができる。 ここでいう 「リポザィム活性」 とは、 タ 遺伝子の転写産物である mRNAを部位特異的に切断す いう。 リボザィムには、 グループ Iイントロン型や R N 9 0， 3 5， p 2 1 9 1 , N u c 1 A c i d s R 1 7， p 7 0 5 9などを参照することができる。 また、 ボザィムについては、 例えば、 N a t u r e , 1 9 8 6， 3 4 9 , N u c 1 A c i d s R e s , 1 9 9 1， 1 1 ； 菊池洋， 化学と生物， 1 9 9 2， 3 0， p 1 1 2 ことができる。 このようなリポザィムを用いて本発明に 遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、 該遺伝子 ることができる。
さらに、 本発明は、 S RMS遺伝子の転写活性を阻害 化合物を有効成分として用いることができる。 そのよう えば、 S RMS遺伝子の発現 · 転写に関与する因子に結 ある。 このような化合物は、 天然物でも合成化合物でも な化合物は、 後述のスク リーニング方法によって、 取得 である。
1. 2 S RMSタンパク質の活性阻害物質を含有する 本発明はまた、 別の実施形態において、 S RMSタン 害物質を含有するがん治療剤を提供する。
本明細書中、 「 S RM Sタンパク質の活性阻害物質」 (a) S RM Sタンパク質に結合する抗体、
(b ) S RMSタンパク質に対してドミナン トネガティ する S RM Sタンパク質変異体、 あるいは
( c ) S RM Sタンパク質に結合する化合物 （上記抗 さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。 S RMS 合する抗体 （抗 S RMS抗体） は、 当業者に公知の方法 ことが可能である。 なお、 抗 S RMS抗体の詳細につい 本明細書における 「S RMSタンパク質に対してドミ ブの性質を有する S RM Sタンパク質変異体」 とは、 そ 遺伝子を発現させることによって、 内在性の野生型 S R の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク 邦博著、 遺伝子の活性阻害実験法 多比良和誠編、 羊土 2 6 - 3 2など参照） 。
さらに、 本発明においては、 S RMSタンパク質の活 物質として、 S RMSタンパク質に結合する、 上記抗体 外の化合物を有効成分として用いることができる。 その 例えば、 S RMSタンパク質に結合し、 その活性を阻害 る。 S RMSタンパク質 （キナーゼ）の機能を阻害する る分子の例としては、 ビス一環、 二環または複素環芳香 9 2/2 0 64 2 (M a g u i r e、 1 9 9 2年 1 1月 ビニレン—ァザインドール誘導体 （W 0 94Z 1 4 8 0 n a r i ら、 1 9 9 4年 7月 7 日公開） ） 、 1 —シクロ ピリジルキノ口ン類 （米国特許 5， 3 3 0， 9 9 2 ) 、 (米国特許 5， 2 1 7 , 9 9 9 ) 、 スチリル置換ピリジ 特許 5， 3 0 2 , 6 0 6 ) 、 ある種のキナゾリ ン誘導体 0 5 6 6 2 6 6 A 1 ) 、 セレノインドール類およびセレ
4 / 0 3 4 2 7 (D e n n yら、 1 9 9 4年 2月 1 7 日 上記した本発明の S R M Sタンパク質の活性を阻害し ん治療剤として使用することができる。
2. S RMSタンパク質の活性もしくは発現を阻害する 一二ング方法
本発明は、 がん抑制作用を有する候補化合物のスクリ も提供する。
一つの好ましい態様は、 S RM S夕ンパク質と被検化 指標とする方法である。 通常、 S RM Sタンパク質と結 S RM S夕ンパク質の活性を阻害する効果を有すること ここで、 該化合物は、 S RMSタンパク質の活性部位に 好ましい。 本方法においては、 まず、 S RM Sタンパク とを接触させる。 S RMSタンパク質は、 被検化合物と るための指標に応じて、 例えば、 S RMSタンパク質の 細胞内または細胞外に発現した形態、 あるいはァフィ二 結合した形態であり得る。 この方法に用いる被検化合物 適宜標識して用いることができる。 標識としては、 例え 蛍光標識等を挙げることができる。
本方法においては、 次いで、 S RM Sタンパク質と被 合を検出する。
本方法に用いる被検化合物としては、 特に制限はない。 化合物、 有機化合物、 無機化合物、 タンパク質、 ペプチ 合物、 並びに、 化合物ライブラリー、 遺伝子ライブラリ 標として検出することもできる。 夕ンパク質と被検化合 は、 公知の手法によって測定することができる （例えば、 体やリ ン酸の放射性同位元素 （P 3 2 Pや P 3 3など） を I SA法、 免疫沈降法、 ウエスタンプロッ ト法やそれら どが挙げられるが、 これらに限定されない。 ） 。
本方法においては、 次いで、 S RM Sタンパク質と結 を阻害する被検化合物を選択する。
本方法により単離される化合物は、 がん抑制作用を有 され、 がん治療剤として有用である。
本発明のスク リーニング方法の他の態様は、 S RMS 指標とする方法である。
本方法においては、 まず、 S RM S遺伝子を発現する 合物を接触させる。 用いられる 「細胞」 の由来としては、 ネコ、 ィヌ、 ゥシ、 ヒッジ、 トリなど、 ペッ ト、 家畜等 が挙げられるが、 これら由来に制限されない。 「S RMS する細胞」 としては、 内因性の S RMS遺伝子を発現し たは外因性の S RM S遺伝子が導入され、 該遺伝子が発 を利用することができる。 外因性の S RM S遺伝子が発 通常、 それぞれ S RMS遺伝子が挿入された発現ベクタ 導入することにより作製することができる。 該発現べク な遺伝子工学技術によって作製することができる。
本方法に用いる被検化合物としては、 特に制限はない 然化合物、 有機化合物、 無機化合物、 タンパク質、 ペプ ク質等の場合には、 該タンパク質を発現する DNAベク へ導入することにより、 「接触」 を行う ことができる。
本方法においては、 次いで、 該 S RMS遺伝子の発現 る。 ここで 「遺伝子の発現」 には、 転写および翻訳の双 遺伝子の発現レベルの測定は、 当業者に公知の方法によ できる。 例えば、 S RM S遺伝子を発現する細胞から m 従って抽出し、 この mRNAを铸型としたノーザンハイ ヨ ン法または R T_ P C R法を実施することによって該 ベルの測定を行うことができる。 あるいは、 S RMS遺 夕一領域を常法に従って単離し、 その下流に標識遺伝子 フェラーゼ、 G F P、 ガラク トシダーゼ等の発光、 蛍光、 標に検出可能な遺伝子が挙げられるが、 これらに限定さ げ、 その標識遺伝子の活性を見ることによっても該遺伝 の測定を行うことができる。 また、 S RMS遺伝子を発 タンパク質画分を回収し、 それぞれ S RM Sタンパク質 — P A G E等の電気泳動法で検出することにより、 遺伝 の測定を行うこともできる。 さらに、 S RM Sタンパク を用いて、 ウエスタンブロッティ ング法を実施すること ク質の発現を検出することにより、 遺伝子の翻訳レベル とも可能である。 S RMSタンパク質の検出に用いる抗 出可能な抗体であれば、 特に制限はないが、 例えばモノ またはポリクローナル抗体の両方を利用することができ 本方法においては、 次いで、 被検化合物を接触させな
Figure imgf000023_0001
本発明はまた、 抗 S RMS抗体、 この抗体を含有する を提供する。 本発明の 1つの好ましい態様では、 上記が んの標的化療法または標的化薬物送達のために使用され 3 1 抗 S RMS抗体
本明細書中、 「抗 S RMS抗体」 には、 S RMSタン 片 （部分ペプチド） もしくはその塩を含む） に特異的に 含まれる。 本発明において使用する抗 S RMS抗体は、 抗体であってもよいし、 モノクローナル抗体であっても ラスは、 特に限定されず、 I g G、 I gM、 I gA、 I g E等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含す I g Gまたは I gMであり、 精製の容易性等を考慮する くは I g Gである。 また、 ここでいう 「抗体」 という用 体断片または誘導体を含む意味で用いられ、 例えば、 F 2、 CDR、 ヒ ト化抗体、 多機能抗体、 単鎖抗体 （S c F む。 本発明の抗体は、 公知の方法で製造することができ 抗体の製造法は当該分野で周知である （例えば H a r 1 L a n e D ， An t i b o d y, C o l d S a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s ( 1 9 8 ( 1 ) 抗原の調製
本発明において、 感作抗原として使用されるタンパク RM Sタンパク質またはその塩である。 上記 S RMSタ その部分ペプチドも含まれ、 これは、 限定されることは 個） ） のアミノ酸残基が欠失、 置換、 挿入及び Z又は付 あってもよい。 ここで用いられる S RMS夕ンパク質ま プチドの塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸） いられる。 抗体取得の感作抗原として使用される本発明 パク質は、 その由来となる動物種に制限されないが哺乳 ウス、 ヒ ト由来のタンパク質が好ましく、 特にヒ 卜由来 好ましい。
( 2 ) S RM Sタンパク質に対するモノクローナル抗体 ( 1 ) 抗体産生細胞の採取
上記のような S RM Sタンパク質、 その部分ペプチド 明細書中、 抗体に関する説明ては、 これらをまとめて、 パク質」 という。 ） を抗原として、 哺乳動物、 例えばラ ゥサギなどに投与する。 抗原の動物 1匹当たりの投与量 卜を用いないときは 0 l〜 1 0 0mgであり、 アジュ ときは l〜 1 0 0 gである。 アジュバントとしては、 アジュバント （F CA) 、 フロイン ト不完全アジュバン 水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。 免疫 脈内、 皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。 間隔は特に限定されず、 数日から数週間間隔、 好ましく 隔で、 1〜 1 0回、 好ましくは 2〜 5回免疫を行う。 そ 疫日から 1〜 6 0 日後、 好ましくは 1〜 1 4日後に抗体 する。 抗体産生細胞としては、 脾臓細胞、 リ ンパ節細胞、 培地 （ヒポキサンチン、 アミノプテリ ン、 チミジンを含 ず、 抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質 好ましい。 ミエローマ細胞としては、 例えば X 6 3 A N S I Z 1— A g 4— 1、 NS 0/ 1などのマウスミエ Y B 2Z0などのラッ トミエローマ細胞株が挙げられ 次に、 上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融 融合は、 血清を含まない DMEM、 R PM I — 1 6 40 細胞培養用培地中で、 1 X 1 0 6〜 1 X 1 0 7個/ m 1 と 2 X 1 0 5〜 2 X 1 0 6個 Zm 1 のミエローマ細胞と 産生細胞とミエローマ細胞との細胞比 2 1〜 3 1が 胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。 細胞融合促 均分子量 1 0 0 0〜 6 0 0 0ダルトンのポリエチレンダ 用することができる。 また、 電気刺激 （例えばエレク ト ン） を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細 細胞とを融合させることもできる。
( i i i ) ハイプリ ドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリ ドーマ の方法として、 細胞懸濁液を例えばゥシ胎児血清含有 R 0培地などで適当に希釈後、 マイクロタイ夕一プレー ト 個 we 1 1程度まき、 各ゥエルに選択培地を加え、 以 地を交換して培養を行う。 その結果、 選択培地で培養開 後から生育してく る細胞をハイプリ ドーマとして得るこ 次に、 増殖してきたハイプリ ドーマの培養上凊中に、 するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイプリ
( I V ) モノクローナル抗体の採取
上記のようにして得たハイプリ ドーマからモノクロー する方法として、 通常の細胞培養法又は腹水形成法等を できる。 細胞培養法においては、 ハイプリ ドーマを 1 0 含有 R PM I — 1 6 40培地、 MEM培地又は無血凊培 培養培地中で、 通常の培養条件 （例えば 3 7°C、 5 % 7〜 1 4日間培養し、 その培養上清から抗体を取得する。 場合は、 ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の リ ドーマを約 1 X 1 07個投与し、 ハイプリ ドーマを大 そして、 1〜 2週間後に腹水を採取する。 上記抗体の採 抗体の精製が必要とされる場合は、 硫安塩析法、 イオン ラフィー、 ゲル濾過、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィ 方法を適宜選択して、 又はこれらを組み合わせることに とができる。
( 3 ) S RM Sタンパク質に対するポリクローナル抗体 まず、 上記した抗原を哺乳動物、 例えばラッ ト、 マウ に投与する。 抗原の動物 1匹当たりの投与量は、 アジュ いときは 0 1〜： L O Omgであり、 アジュバントを用 〜 1 0 0 0 x gである。 アジュバントとしては、 フロイ バント （F CA) 、 フロイント不完全アジュバント （F I アルミニウムアジュバン ト等が挙げられる。 免疫は、 主 A , r a d l o i mmu n o a s s a y) 等で抗体価 の抗体価を示した日に採血し、 抗血清を得る。
次いで、 例えば、 抗血凊中のポリクローナル抗体を、 ク質で固定されたァフイエティーカラムにかけて S RM 反応する抗体 （カラム吸着画分） を採取する。 S RMS する抗血清中のポリクローナル抗体の反応性は、 E L I 定することができる。
(4) 抗体の断片など
F a bまたは F a b ' 2断片は、 従来の方法によるプ えば、 ペプシンまたはパパイン） を用いた消化により作 きる。 ヒ 卜化抗体は、 例えば R i e c hma n nら （R n J Mo l B i o l O c t 5 ; 2 0 3 (3)
1 9 8 8 ) 、 および J o n e s ら （ J o n e s ら N a 1 5 2 2 - 5 2 5 , 1 9 8 6 ) に記載のような方法の することができる。
また、 キメラ抗体は、 例えば、 「実験医学 （臨時増刊 1 6， N o 1 0 , 1 9 8 8」 、 特公平 3— 7 3 2 8 ヒ ト化抗体は、 例えば、 「 N a t u r e G e n e t i 1 5， p 1 4 6— 1 5 6 , 1 9 9 7」 、 「 N a t u r l c s , V o l 7 , p 1 3— 2 1， 1 9 9 4」 、 特 3 6 5号公報、 国際出願公開 W〇 9 4 - 2 5 5 8 5号公 ィエンス、 6月号、 第 4 0〜第 5 0頁、 1 9 9 5年」 、 V o l 3 6 8， p 8 5 6— 8 5 9， 1 9 9 4」 、 特 質 （例えば、 放射性同位元素、 蛍光物質など） て標識さ 必要に応じて、 放射性物質、 蛍光化合物などにより標識 る。 最も慣用の蛍光標識化合物の中には、 フルォレセイ ネート、 ローダミン、 フィ コエリ ト リンおよびフルォレ 同様に、 生体発光性化合物を用いて、 抗体 S RMS抗体 もできる。 生体発光性タンパク質の存在は、 蛍光の存在 によって測定される。 この標識目的に重要な生体発光性 フェリ ン、 ルシフェラーゼおよびイエクオリンである。
なお、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に Sタンパク質等を特異的に検出するために使用すること S RM S夕ンパク質等を精製するために使用する抗体カ 製時の各分画中の S RM S夕ンパク質等の検出、 被検細 RM S夕ンパク質の挙動の分析などのために使用するこ 3. 2 抗 S RMS抗体を含有する複合体など
また、 本発明において使用する抗 S RMS抗体は、 本 たは診断剤において、 それ自体が、 抗原の活性を減弱さ 活性を有する薬剤 （ a g e n t ) であり得るが、 必要に 果を奏するための他の薬剤と組み合わせて用いることが つて、 本発明は、 もう一つの態様において、 がん （例え の標的化療法または標的化イメージング等に使用するた S抗体と他の薬剤との複合体、 そのような複合体を含有 をも提供する。 このような態様によれば、 本発明におい 示される。
本発明において、 「放射性同位元素」 の例としては、 ヨウ素— 1 2 5 (1 25 1 ) 、 およびヨウ素— 1 3 1など ン元素が挙げられる。 これらの放射性ハロゲン元素も上 元素と同様に抗体やペプチドに標識して、 放射性治治療 性診断剤として広く利用し得る。 例えば、 1 25 I または1 ド化は、 クロラミン T法等の公知の方法により、 抗体ま 結合させることができる。 さらに、 診断用としてはテク m、 インジウム一 1 1 1およびガリ ウムー 6 7 ( 6 7 G a 治療用としてはイ ッ トリ ウム— 9 0 ( 9 0 Y) 、 レニウム 6 R e ) またはレニウム— 1 8 8 (1 8 8R e ) などが使用 射性同位元素を用いて抗体に標識する場合には、 通常、 が用いられる。 金属キレート剤としては、 EDTA、 D ノジチォ化合物、 サイクラム、 および DOT Aなどが知 れらのキレート剤は抗体に予め結合しておき、 その後放 する場合と、 放射性金属キレー トを形成後、 抗体に結合 法力 Sある。
本発明において、 「治療タンパク質」 の例としては、 を活性化するサイ ト力インが好適であり、 例えば、 ヒ トイ ン 2、 ヒ ト顆粒球一マクロファージ一コロニ一刺激因子、 ァージコロニー刺激因子、 ヒ トイン夕一ロイキン 1 2等 また、 大腸がん細胞を直接殺傷するため、 リシンやジフ の毒素を用いることができる。 例えば、 治療タンパク質 パク質」 等以外の診断または治療用化合物を意味するも れる。 「低分子の薬剤」 の例としては、 ナイ トロジェン ' サイクロファスフアミ ドなどのアルキル化剤、 5—フル メソ トレキセー トなどの代謝拮抗剤、 ダウノマイシン、 マイ トマイシン C， ダウノルビシン、 ドキソルビシンな ビンクリスチン、 ビンブラスチン、 ビンデシンのような ド、 夕モキシフェン、 デキサメタソンなどのホルモン剤 床腫瘍学 （日本臨床腫瘍研究会編 1 9 9 6年 癌と化 またはハイ ド口コーチゾン、 プレドニゾンなどのステロ リ ン、 インドメ夕シンなどの非ステロイ ド剤、 金チォマ ラミンなどの免疫調節剤、 サイクロフォスフアミ ド、 ァ どの免疫抑制剤、 マレイン酸クロルフエ二ラミ ン、 クレ な抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤 （炎症と抗炎症療法 昭 薬出版株式会社） などがあげられる。 例えば、 ダウノマ 結合させる方法としては、 ダルタールアルデヒ ドを介し ンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、 水溶性カルボ てダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を 等があげられる。
「ウィルスベクター」 の例としては、 本発明の抗 S R し得るように改変されたウィルスベクターが使用し得る ノウィルスぺク夕一 （Wa n g, P ， e t a 1 S oma t i c C e l l a n d Mo l e c G e 1， 4 2 9 - 44 1 ) 、 レ トロウイルスベクター （N アポトーシスを誘導するなどの治療効果を奏する遺伝子 が組み込まれる。 抗 S RMS抗体に結合するウィルスベ RMS抗体と共に遺伝子治療を必要とする患者に投与さ RMS抗体が認識する抗原 （すなわち、 S RM S) が存 的化することができる。
抗 S RMS抗体と上記他の薬剤とは、 化学的または遺 合され得る。 ここで、 「化学的な結合」 には、 イオン結 共有結合、 分子間力による結合、 疎水性相互作用による れるものとし、 「遺伝子工学的な結合」 には、 例えば、 パク質とからなる融合タンパク質を遺伝子組換えなどの 製した場合の、 抗体と治療夕ンパク質との間の結合様式 ものとする。
4. 製剤化および製剤の投与方法
本発明の S RMS遺伝子の発現阻害物質を含有するが M Sタンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療剤、 MS抗体を含有する治療剤、 または本発明において使用 抗体が、 放射性同位元素、 治療タンパク質、 低分子の薬 遺伝子を担持したウィルスベクターもしくは非ウィルス のいずれか、 またはこれらの任意の組み合わせと化学的 学的に結合されている治療剤は、 公知の手法に基づいて ができる。
本発明の治療剤の製剤化にあたっては、 常法に従い、 シプロピルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルメチルセル 二ルァセ夕一ルジェチルァミノアセテー ト、 ポリ ビニル ラチン、 中鎖脂肪酸トリダリセライ ド、 ポリオキシエチ 油 6 0、 白糖、 カルボキシメチルセルロース、 コーンス 類等を挙げることがてきる。
本発明の治療剤の剤型の種類としては、 例えば、 経口 粉末剤、 丸剤、 散剤、 顆粒剤、 細粒剤、 軟 *硬カプセル 一ティ ング剤、 ペレッ ト剤、 舌下剤、 ペース ト剤等、 非 射剤、 坐剤、 経皮剤、 軟膏剤、 硬膏剤、 外用液剤等が挙 においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を る。 有効成分としての S RM Sタンパク質の活性 （また 子の発現） 阻害物質は、 製剤中 0 1から 9 9 9重量 ができる。
本発明の薬剤の有効成分の投与量は、 投与対象、 対象 与方法などにより差はあるが、 経口投与の場合、 一般的 (6 0 k gとして） に対して一日につき約 0 l mg〜 l 好ましくは約 1 0〜 1 0 0mg、 より好ましくは約 1 である。 非経口的に投与する場合は、 その一回投与量は 臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 は通常例えば、 患者 （ 6 0 k gに対して） 、 一日につき 3 0mg程度、 好ましくは約 0 1から 2 0mg程度、 約 0 1〜 1 0 mg程度を静脈注射により投与するのが しかしながら、 最終的には、 剤型の種類、 投与方法、 患 本発明の治療剤は、 がん （例えば、 大腸がん、 胃がん、 ん、 前立腺がん、 食道がん、 肝臓がん、 胆道がん、 脾臓 膀胱がん、 子宮がん （例 ： 子宮頸がん、 子宮体がん） 、 腺がん、 滕臓がん、 卵巣がん、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） 好ましくは、 大腸がんの予防 · 治療に用いられる。
本発明の薬剤は、 S R M S夕ンパク質の活性阻害物質 遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有しているた 転移阻害剤、 癌細胞のアポトーシス誘導剤等として使用 なる細胞、 組織、 臓器、 または癌の種類は特定のものに また、 本発明の薬剤は、 S R M Sタンパク質の活性阻害 M S遺伝子の発現阻害物質の両方を含んでいても良い。
本発明の治療剤において、 アンチセンス核酸を用いる センス核酸を単独あるいはレトロウィルスベクター、 ア クタ一、 アデノウィルスァソシエーテツ ドウィルスベク なベクターに挿入した後、 公知の手段に従って投与する アンチセンス核酸は、 単独で、 あるいは生理学的に認め もに製剤化し、 遺伝子銃やハイ ドロゲルカテーテルのよう によって投与することができる。
また、 本発明において組換えアデノウイルス粒子のよう クタ一と抗 S R M S抗体との組み合わせを癌治療のため は、 これら単独で使用してもよいが、 一般には製薬的に と共に使用される。 そのような担体としては、 既に上記 ならびに水、 生理食塩水、 グルコース、 ヒ 卜アルブミン 与する場合は、 通常成人一人当たり 1回に 1 03〜 1 01 粒子を投与するのが好ましいが、 疾病の状態や標的細胞 · よって変更してよい。 投与回数は、 1 日 1回〜数回でよ 1 日〜数ケ月以上にわたってもよく、 1〜数回の投入を 長期にわたって断続的に多数セッ トを投与してもよい。 おいて使用されるウィルスベクター粒子またはウィルス 子は、 特定の細胞およびノまたは組織の検出、 または疾 使用することができる。 例えば、 ウィルスベクターの核 能なマーカー遺伝子を組込み、 これを適切な宿主細胞に シヨ ンして得られたウィルスベクター粒子は、 抗 S RM わせて腫瘍細胞を検出診断するために使用することがで 抗 S RM S抗体に検出可能な標識を結合させて腫瘍細胞 ために使用することができる。 5. がんの診断剤及び診断方法
本発明はまた、 がんの診断剤を提供する。 1つの好ま て、 本発明のがんの診断剤は、 （a) S RMSタンパク 又は （b) S RMS遺伝子またはその一部の塩基配列に 卜なハイプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可 らなるポリヌクレオチドを含有する。
5. 1 抗 S RMS抗体を用いる診断剤及び診断方法
S RMSタンパク質に対する抗体は、 S RM S夕ンパ 出および または定量する工程において、 標識された抗 用いて、 S R M Sタンパク質またはその断片と抗 S R M が検出および または定量される。
本明細書中、 「被験者由来の生体試料」 は、 被験者由 または体液 （例えば、 血液 （全血、 血漿、 血清等を含む） 液、 唾液、 汗、 精液等） を含む。 また、 「被験者」 は、 を受ける、 または受けることが望まれるヒ ト被験体であ しているか、 または罹患していると疑われるヒ ト被験体 このようながんの例としては、 大腸がん、 胃がん、 肺が 立腺がん、 食道がん、 肝臓がん、 胆道がん、 脾臓がん、 ん、 子宮がん （例 子宮頸がん、 子宮体がん） 、 精巣が 膝臓がん、 卵巣がん、 脳腫瘍、 血液腫瘍などが含まれる 大腸がんが好ましい。
上記のような被験者由来の生体試料における S R M S るための免疫測定は、 がん （例えば、 大腸がん） を有す がんの危険性を有する被験体から採取した生体試料を、 体結合を生じさせる条件下で抗 S R M S抗体と接触させ、 による免疫特異的結合量を測定することを包含する。 こ 結合を使用して、 S R M Sタンパク質の存在およびノま 現が検出される。 この場合、 増大した S R M Sタンパク 疾病状態の指標となる。 必要に応じて、 生体試料中の S 質のレベルを、 がんを有しない健常者のレベルと比較し 上記免疫測定法の 1つの態様では、 例えば、 血清試料 者により適宜決定され得る。
抗 S RM S抗体を検出可能に標識する方法の 1つにお を、 酵素、 例えば、 酵素ィムノアッセィ （E I A) に使 ような酵素に結合させる [V o 1 1 e r， A による 「 疫吸着アツセィ」 （ "T h e E n z yme L i n k n o s o r b e n t A s s a y) (E L I S A) ， 1 g n o s t i c H o r i z o n s , 2 1〜 7， M i o g i c a l A s s o c i a t e s Q u a r t e r l i c a t i o n , Wa l k e r s v i 1 l e MD ； A による J C l i n P a t h o l ， 3 1 . 5 0 9 7 8 B u t l e r , J E による M e t h E n z 7 3 . 4 8 2〜 5 2 3， 1 9 8 1 ] 。 抗体に結合する酵 光光度測定により、 可視手段による蛍光測定により検出 る化学分子が生成されるような方法で、 適当な基質、 好 性基質と反応させる。 抗体に検出可能な標識を付けるた とができる酵素は、 ペルォキシダーゼおよびアル力リ性 を包含するが、 これらに限定されない。 この検出はまた、 色素原性基質を用いる比色法により達成することができ その他の本発明において使用し得る方法としては、 ラ セィ （R I A) 、 サンドイッチ免疫測定法、 ィムノメ トリ ロメ トリー、 蛍光免疫測定法 （F I A) 、 時間分解蛍光 R F I A) 、 酵素免疫測定法 （E I A) 、 発光免疫測定 電気化学発光免疫測定法 （E C L I A) 、 ラテックス凝 以上のように、 本発明の抗体を用いる、 生体内での S 質の定量法を利用することにより、 S RMS夕ンパク質 連する各種疾患の診断をすることができる。 例えば、 S 質の濃度増加が検出された場合は、 例えば、 S RMSタ 発現に起因する疾患 （例えば、 がん （例 ： 大腸がん） ） 高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することが なお、 本発明の抗 S RMS抗体は、 i n v i v oで こともできる。 ここで使用し得る抗体調製物の調製およ 該分野でよく知られている。 例えば、 抗体ーキレート剤 c 1 Me d B i o l 1 9 9 0 1 7 2 4 載されている。 また、 磁気共鳴イメージングで用いる標 性イオンを有する抗体については、 例えば、 M a g n e t o n a n c e i n M e d i c i n e 1 9 9 1 2 4 2に記載されている。
5. 2 ポリヌクレオチド （例えば、 DNA) プロ 断剤及び診断方法
本発明の診断方法においては、 S RM S遺伝子の塩基 設計されるプローブ又はプライマーを用いることができ そのような診断方法は、 例えば、 （ a) 被験者由来の生 M S遺伝子またはその断片の塩基配列にス トリ ンジェン ィゼーショ ン条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列か レオチド （プローブ） とを接触させる工程、 および （b) 以上、 2 7塩基以上、 3 0塩基以上、 またはさ らに長い レオチド断片であり得る。 ハイブリダィゼーシヨ ンには、 中又は高ス ト リ ンジェン トな条件を使用し得る。 なお、 「S RM S遺伝子またはその断片の塩基配列にス ト リン ブリダィゼーシヨン条件下でハイブリダィズ可能な塩基 RM S遺伝子またはその断片の塩基配列に相補的な塩基 ンスポリヌクレオチド） も含まれるものとする。 プロー ハイブリダィゼーショ ンの方法は当業者に知られており、 開公報第 8 9 0 6 6 9 8号、 E P— A 0 2 0 0 3 6 2、 9 1 5， 0 8 2号、 E P— A 0 0 6 3 8 7 9、 E P— A E P -A 0 1 2 8 0 1 8に記載されている。
本発明の診断方法においては、 S RM S遺伝子に対す クレオチドプローブまたはプライマーを用いて、 公知の 的配列を検出または定量することがてきる。 そのような て、 例えは、 サザンハイブリダィゼーシヨ ン、 ノーザン —シヨ ン、 RT— P C R法、 P C R— S S C P法 （G e 第 5巻， 8 7 4〜 8 7 9頁 （ 1 9 8 9年） ） 、 P r o c o f t h e N a t i o n a l A c a d e my o f c e s o f t h e Un i t e d S t a t e s l c a , 第 8 6巻， 2 7 6 6〜 2 7 7 0頁 （ 1 9 8 9年） 法、 DNAチップあるいはアレイ C GH (C omp a r e n om i c Hy b r i d i z a t i o n) 法などを きる。 定量的な検出は、 定量 RT_ P C Rによって実施 ヨ ンを行い、 その結合状態を検出することにより、 がん コピー数異常を高解像度に検出する方法である （P i n e t a 1 ( 1 9 9 8 ) N a t G e n e t 2 0，
1 ) o
なお、 本発明においては、 S RM S遺伝子の発現が上 否かを検出するために、 細胞の S RM Sの mR N Aレベ (ハウスキーピング遺伝子 （例えば、 S h a p e r , M amm a r y G l a n d B i o l N e o p l ( 1 9 9 8 ) 3 1 5 - 3 24 ， Wu， Y Y および L . A c t a D e r m V e n e r e o 1 8 2— 3 ) の mRNAレベルと、 好ましくは R T— P C R ることもできる。
上記のような手法によって標的配列 （DNA、 mR 出 · 定量し、 S RM S遺伝子の発現過多が確認された場 S RM Sの過剰発現に起因する疾患 （例えば、 がん （例 ' である可能性が高い、 あるいは将来罹患する可能性が高 とができる。
5 3 質量分析装置を用いる診断方法
本発明の診断方法の別の実施形態では、 被検試料中の またはその断片の存在を、 質量分析装置 （MS) を用い ができる。 すなわち、 質量分析装置を用いることによっ ク質またはその断片のアミノ酸配列の決定を行う ことが イオン化には、 マ トリクスアシステツ ドレーザーデソ ン化法 （MAL D I ) 、 エレク トロスプレーイオン化法 相法 （E I， C I ) 、 電界脱離 （F D) 法など種々の方 る。 イオン分離には、 イオン化法と相性のよいイオン分 例えば、 MAL D I の場合には、 飛行時間型 （ t i me g h t . T〇F) 質量分析計、 E S Iの場合には、 四重 イオントラップ型、 磁場型などの質量分析計がそれぞれ 量分析装置は、 タンデムで用いられることもある。 例え I M S / S , Q - T O F MS、 MAL D I - TO げられる。 なお、 その他のアミノ酸配列決定法、 例えば、 一 （例 気相シークェンサ一） によるアミノ酸配列決定 もよい。
5. 4 診断用キッ ト
本発明はまた、 抗 S RMS抗体を含有する、 被験者の RMSタンパク質またはその断片をがんマーカーとして たは定量するためのキッ トを提供する。 さらに、 S RM その一部の塩基配列にス トリンジェン卜なハイブリダイ 下で八ィプリダイズ可能な塩基配列を含有する、 被験者 中の S RM S遺伝子またはその断片をがんマーカーとし または定量するためのキッ トをも提供する。 これらのキ 免疫学的手法またはハイプリダイゼーショ ン法等により、 を検出するために用いられる。 このようながんとしては、 正常組織に由来していないか、 あるいはがん細胞または 択的に発現の亢進している分子のことをいい、 被験者の もしくは組織中における当該分子の存在ががんの存在を 唆するものをいう。
上記第一の態様のキッ トは、 被験者からの体液試料中 ( S R M Sタンパク質およびその部分べプチドを含む） または定量する成分を含有する。 例えば、 S R M Sタン S Aで検出および または定量される場合、 このような 組織切片、 または血液や尿のような体液試料中の S R M S 出および Zまたは定量するために使用され得る。 このよ 能、 蛍光、 比色、 または酵素標識で標識されていてもよ ッ トは、 標識された二次抗体を含有していてもよい。
上記第二の態様のキッ 卜は、 S R M S遺伝子またはそ 列にス トリ ンジェン 卜なハイプリダイゼーショ ン条件下 ズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。 明のキッ トは、 D N Aチップ上に固定された上記ポリヌ 有し得る。
本発明のキッ トは、 抗 S R M S抗体、 S R M S遺伝子 の塩基配列にス 卜リ ンジェントなハイブリダィゼーショ ブリダィズ可能な塩基配列等の他に、 容器およびラベル よい。 容器上のまたは容器に伴うラベルには、 薬剤が大 の検出に使用されることが示されていてもよい。 また、 例えば、 使用説明書等がさ らに含まれていてもよい。 大腸がん検体 2 0 0症例のサンプル調製およびアレイ C 検証を実施した。
その結果、 大腸がん検体において高頻度に増幅が起き 公共 D Bでの遺伝子情報 （N C B I ： h t t p ： //w n 1 m n i h g o vノ） を利用し、 精査した結果、 C l o n e R P 1 1 — 9 5 N 1 3に位置している、 S — r e l a t e d k i n a s e l a c k i n g C a 1 r e g u l a t o r y t y r o s i n e a n m l n a 1 my r i s t y l a t i o n s i t e s A c c e s s i o n N o NM— 0 8 0 8 2 3 ) 遺 患者において高頻度で高値であることを見出した （図 1， は、 S RM S遺伝子の大腸がん患者 2 0 0検体での増幅 を示すヒス トグラムである。 また、 下記の表 2は、 S R 腸がん患者 2 0 0検体での増幅度 （GZR値） および頻 値は、 GZR値が 1 2以上の検体での平均値を示して 表 2に示されるように、 S RM S遺伝子は、 2 0 0検 者の 7 5 5 %において増幅が認められ、 その増幅度の 0であった。 最大値は 3 7であり、 非常に高頻度で顕 つていた。
(表 2 )
200検体アレイ CGH
平均 G/R値 最大 G/R値 頻度 <サンプル調製 >
培養細胞株は、 大腸がん由来の細胞株である C a c o を使用した。 培養細胞より B l o o d & C e l l D N A K i t (Q I AGEN) を使用して、 キッ ト添 ルに従い、 ゲノム DNAを抽出した。
ぐアレイ C GH>
遺伝子領域の増幅を確認するために、 アレイ C GHを の詳細は実施例 1 と同様に実施した。 結果
表 3に、 S RM S遺伝子の大腸がん由来の細胞株での 値） を示した。 示されるように、 大腸がん由来細胞株に C C l o n e R P 1 1— 9 5 N 1 3に位置している、 子で増幅が起きていることを見出した。
(表 3 )
Figure imgf000044_0001
<定量的 P C R>
S RM S遺伝子領域の増幅を確認するために、 定量的 P た。 定量的 P C Rは、 S YB R G r e e n RT— P C プライマー配列
5 ' - GAC T GGAGG C AGAC TT CAGTAT (配列番号 3 )
5， -C TC GGC T C C C GTC C TTTC - 3 ' ( 結果
表 4に、 S RMS遺伝子の大腸がん由来の細胞株での 値は対照 DNA (正常） との相対値を示している。 示さ 腸がん由来細胞株においても、 S RM S遺伝子領域に増 ことを見出した。
(表 4)
Figure imgf000045_0001
これらの結果により、 大腸がん由来の細胞株 （C a c においても、 S RM S遺伝子が増幅していることが確認 がんにおける S RM S遺伝子の機能解析に使用可能な培 れた。 実施例 3 大腸がん細胞株を用いた RN A i解析による 本実施例では、 大腸がん患者 2 0 0検体において高頻 られた S RMS遺伝子について、 大腸がん由来の細胞株 的とする s l RNAを合成した （Q I AGENに合成委 (表 5)
s 1 R N A配列
Figure imgf000046_0001
s i RNAの C a c o 2細胞内への導入は、 〇 1 i g l n e ( I n v i t r o g e n) を使用し、 Ι Ο Ο ηΜ 添付のプロ トコールに従い細胞に導入した。 s i RNA への導入【ま、 L i p o f e c t am i n e ( I n v i t r 使用し、 5 0 1 ]^の 3 1 RNAを添付のプロ トコールに した。 対照には N e g a t i v e C o n t r o l s i AGEN) を使用した。 細胞に導入後 4日間、 倒立顕微 く定量的 RT— P C R解析 >
定量的 R T— P C R法を用いて、 s 1 R N Aの効果を で検証した。 s 1 R N A導入後 2 4時間の細胞から、 M i 一 M i d i T o t a l RNA P u r i f i c a t i t ern ( I n v i t r o g e n) を使用して、 添付の (Ap p l i e d B i o s y s t ern s ) を使用して、 コールに従い、 7 5 0 0 R e a l -T i me P C R
(A p p 1 l e d B ι o s y s t em s ) を用いて実 マーは、 以下の配列を合成し （OP E RONに合成委託） プライマー配列 ：
5 ' —GC TGGGTGAAGGC TAC TTTGG—
5 ' -GC GAGGTCAGTGAGC TTCATG- 1 2)
相対比を算出するための標準遺伝子には G l y c e r e— 3— p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s H ) C o n t r o l R e a g e n t s (Ap p l i y s t em s ) を用いて G A P D Hの発現量を求め、 相 <生細胞数の測定〉
s 1 R N A導入後の生細胞数を A 1 ama r B l u u r c e ) を用いて、 添付のプロ トコールに従い、 Wa 1 2 0 Mu l t i 1 a b e l / L um i n e s c e n c e r ARV〇 (P e r k i n E l me r ) により測定 .
大腸がん由来の細胞株である C じ 0 2ぉょぴ 1：〇 S遺伝子のRNA 1解析を実施した。
図 2 Aおよび図 2 Bに、 それそれ、 C a c o 2細胞お 図 3 Aおよび図 3 Bには、 それぞれ、 C a c o 2細胞 胞に S RM S遺伝子の s l RNAをT r a n s f e c t: 目の細胞を用いて測定試薬により生細胞数を測定した結 フは N Cに対する相対量を示した。 示されるように、 生 行った結果、 表現型同様、 N e g a t i v e C o n t と比較して顕著に細胞数が減少していた （図 3 A， B) 。 子の s 1 RNA 3種 （a， b， c ) 全てについて、 t検 ( p < 0 0 1 ) であった。
よって、 RNA 1効果により S RMS遺伝子の発現が C a c o 2細胞および R K〇 E 6細胞の両方において、 の増殖が抑制されることが見出された。 実施例 4 大腸由来正常細胞株を用いた RN A i解析に 本実施例では、 大腸の正常組織由来の細胞株を用いて 実施することにより、 標的遺伝子の抑制効果ががん特異 検証した。
ぐ RNA 1解析〉
細胞株は AT C Cより購入した C CD 1 8 C oを使用 は、 添付のプロ トコールに従った。 使用した s l RNA c配列を使用した。 s i RNAの細胞内への導入は、 L i am i n e 2 0 0 0 ( I n v i t r o g e n) を使用 s i RNAを添付のプロ トコールに従い細胞に導入した。 g a t l v e C o n t r o l s ι R A (Q I AG 結果
S RM S遺伝子の、 大腸正常組織由来の細胞株 C CD I N A 1の効果は以下の通りてある。
図 4に、 C CD 1 8 C O細胞に S RM S遺伝子の s l n s f e c t i o n後、 5日目に得た観察像を示す （上 段 X 2 0 0 ) 。 S RM S cは、 S RM S遺伝子の s 1
(実施例 3の c配列） を示し、 N Cはネガティ ブコント 示されるように、 表現型の観察では、 NCとほぼ同様で、 れなかった （図 4) 。
図 5に、 C CD 1 8 C O細胞に S RM S遺伝子の s 1 n s f e c t i o n後、 5日目の細胞を用いて測定試薬 を測定した結果を示す。 グラフは NCに対する相対量を 表現型同様、 N e g a t i v e C o n t r o l (NC) 効果は認められなかった （図 5) 。
このことにより、 大腸がん由来の細胞株である C a c RKO細胞では、 RNA 1効果により S RM S遺伝子の た結果、 顕著にがん細胞の増殖が抑制されたが、 大腸正 胞株 C C D 1 8 C oでは影響が無いことが見出された。 S遺伝子が、 正常細胞には影響が少ないことより、 がん 的遺伝子となり うることを見出した。 実施例 5 遺伝子増幅の評価
検体組織のがん細胞において S RM S遺伝子領域で遺 図 6は、 各検体組織（A〜 J)で観察したがん細胞の一部（ 学顕微鏡写真 （蛍光像） を示す。 示されるように、 がん グナルが 3スポッ ト以上見出された。 アレイ CGH法によ (G/R)が 1 2以上であった 10検体において、 S RMS遺 していることが確認された。 また、 病態ステージの初期 り遺伝子増幅が起きていることが示された。 このことは、 子領域が、 がん治療薬の分子標的としてだけでなく、 FI ん診断に応用できることを示している。 実施例 6 · 質量分析による血中 S RM Sタンパク質の検
1 ) 血液検体の前処理
大腸癌患者の血清検体 10 zL及び健常者血清検体 10^ L フ ァ溶液 （ 10mM Tns HC1 ph 7 4+150mM NaCl ) 500 u ProteomeLab IgY-12 SC プロテオームパーティ シ ョ (BECKMAN COULTER A24618) を用いてアルブミン、 グロ 凊中多量蛋白質を除去した。 得られた画分に終濃度 10mM ジチオスレィ トール （Wako 049-08972) を加え、 還元反 分間行った。 反応終了後、 終濃度 10mM となるようにョ ド （SIGMA 144-48-9) を加え、 アルキル化反応を室温で 状態で行った。 反応終了後、 反応液の 4 倍量の冷アセ ト 08681, - 20°C) を加え、 — 80°Cに 1 時間静置した後に 30 分間遠心してタンパク質を沈殿として回収した。 回 質は 80 L の 2M尿素 + lOOmM重炭酸アンモニゥム溶液 5 m, 300A, 300 ΠΙ i d x 5 mm LC PACKINGS 163589 ナ ノ カ ラ ム （C18 PepMap 3 m, 100 A， 75 m i d PACKINGS 160321) によ り分離した。 HPLC 装置は Ulti PACKINGS)を用いた。 流速は 200nL/min、 0 1%ギ酸 （Wak 含有 2%ァセ トニ トリル （MERCK 1287229) と 0 1%ギ酸含 トリルの濃度勾配が 0 57%/minの直線グラジェントを設 つた。 Nano-HPLCで分離した試料は PicoTip (New Object 10-D-20) を通して直結したイオン トラップ型質量分析 導入した。 質量分析装置は HCT Plus (Bruker Dal tonics) 料のイオン化はキヤビラリ一電圧 1500V、 エンドプレー 500V、 ドライガス流量 12 L/min, ドライガス温度 250°C イオン トラップの設定は標的 m/z の前後 2 Da の取り込 一ドでの MS/MS解析を行った。 3 ) データ解析
質量分析装置から得た全分析データは Data Analysis (Bruker Daltonics) を介して出力した。 出力した全デ 分子の分析デ一夕のみを抽出した。 抽出したデータの中 における MS/MSデータを精査し、 標的分子のフラグメン する質量を持つイオンピークの有無を解析した。 結果
図 7 Aおよび図 7 Bは、 （ A ) 大腸がん患者由来の た。 すなわち、 図 8 Bに示すように、 少なく とも C末端 P ATWという部分配列が決定され、 これは、 S RMS ミノ酸配列 （配列番号 2 ) 中の 3 9 2位〜 3 9 9位のア 当する。 よって、 図 8 Aに示すように、 ァミノ酸配列 3 位の標的ペプチドフラグメント （配列番号 1 3 ) が同定 うな部分配列に対応するィオンピークは健常者血清を用 められなかった （図 8 Cを参照） 。 よって、 この標的分 S RM Sタンパク質） は癌特異的に血中存在量が増加し 強く示唆された。 実施例 7 · 子宮頸がん由来株 HeLa細胞株での RNAi効果 大腸がん細胞株では、 S RMS遺伝子のノックダウン 制効果が認められたが、 子宮頸がん細胞株においてどの められるのか、 前述の RNAi解析法により、 評価した。
子宮頸がん由来細胞の HeLa細胞株を用いて、 前出の 3 用いて RNAi 解析を実施した。 s 1 RN Aの細胞内への g o f e c t am i n e I n v i t r o g e n) を nMの s l RN Aを添付のプロ トコールに従い細胞に導 は N e g a t i v e C o n t r o l s i RNA (Q I 使用した。 結果
図 9は、 HeLa 細胞に S RMS遺伝子の s l RNAを さらに、 時系列に従い、 顕微鏡下で微分干渉像を撮影 詳細に観察した。 具体的には、 HeLa細胞に siRNA (a, b， フエクシヨ ン後、 1， 2, 3, 4 日後の同視野の微分干渉 その結果を図 1 0に示す。 NC は Negative control siRN を使用した。 NC と比較して増殖速度の抑制と、 細胞死の 印で示す）が確認された。 図中、 a、 b、 および cはそ s i RNA a、 s i RNAb、 および s l RNAcに対 に示されるように、 増殖抑制が認められた a， b, cにお 導が認められた。
この結果より、 S RMS遺伝子機能の阻害が大腸がん 宮頸がんにおいても抗腫瘍性効果を示すことが示唆され 産業上の利用可能性
本発明は、 がんの治療剤、 診断剤、 診断方法、 治療方 れに使用するキッ トなどを提供する。 したがって、 本発 断、 または標的治療等の分野において有用である。

Claims

請求の範囲
1 S RM S遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含 剤。
2 前記 S RMS遺伝子の発現阻害物質が、
(a) S RMS遺伝子の発現を RN A i効果により阻 する核酸、
(b) S RM S遺伝子の転写産物またはその一部に対 ス核酸、
および
(c ) S RM S遺伝子の転写産物を特異的に切断する を有する核酸、
からなる群から選択される物質を含む、 請求項 1に記載 3 S RM S夕ンパク質の活性阻害物質を有効成分とし 治療剤。
4 前記 S RMSタンパク質の活性阻害物質が、
該 S RM S夕ンパク質に対する抗体、
を含む、 請求項 3に記載のがん治療剤。
5 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、 請求 れかに記載のがん治療剤。
6 S RM S遺伝子の発現阻害物質をスクリーニングす
(a) S RM S遺伝子を発現する細胞に、 被検化合物 程、 (b) 該 S RMSタンパク質と被検化合物との結合活 程、 および
(c ) 該 S RMSタンパク質と結合する化合物を選択 する、 スク リ一二ング方法。
8 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、 請求 記載の方法。
9 S RM S夕ンパク質に対する抗体。
1 0 請求項 9に記載の抗体を含有するがん治療剤。
1 1 放射性同位元素、 治療タンパク質、 低分子の薬剤、 伝子を担持したベクターをさらに含有する、 請求項 1 0 療剤。
1 2 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、 請 1 1に記載のがん治療剤。
1 3 請求項 9に記載の抗体を含有するがん診断剤。
1 4 S RMS遺伝子またはその一部の塩基配列にス ト ハイプリダイゼ一ショ ン条件下でハイプリダイズ可能な するがん診断剤。
1 5 前記がんが大腸がんである、 請求項 1 3または 1 診断剤。
1 6 請求項 9に記載の抗体を含有するがん診断用キッ
1 7 S RMS遺伝子またはその一部の塩基配列にス ト ハイプリダイゼーショ ン条件下でハイプリダイズ可能な るポリヌクレオチドを含有するがん診断用キッ ト。 2 1 質量分析装置を用いて、 S RM Sタンパク質を検 は定量する、 請求項 1 9または 2 0に記載の方法。
2 2 抗 S RMS抗体を用いて、 S RM Sタンパク質を たは定量する、 請求項 1 9〜 2 1のいずれかに記載の方 2 3 (a) 被験者由来の生体試料と、 S RM Sタンパ 体とを接触させる工程、 および
(b) 前記試料中での前記抗体と、 S RMSタンパク 出および または定量する工程、
を包含する、 請求項 2 2に記載の方法。
2 4 (a) 被験者由来の生体試料と、 S RM S遺伝子 の塩基配列にス トリ ンジェン卜なハイプリダイゼーショ ブリダィズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドと 程、 および
(b) 前記試料中での前記ポリヌクレオチドと、 S R はその断片とのハイプリダイゼーションを検出および 工程、
を包含する、 請求項 1 9または 2 0に記載の方法。
2 5 がんの診断に用いるための請求項 1 9〜 24のい 方法。
2 6 前記がんが、 大腸がんである、 請求項 2 5に記載
2 7 配列番号 5、 配列番号 6、 配列番号 7、 配列番号 8 または配列番号 1 0の塩基配列を有する、 ポリヌクレオ 2 8 S RMS遺伝子の発現阻害物質を有効成分として
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