BRPI0614851A2 - luciferases de arachnocampa - Google Patents

Abstract

LUCIFERASES DE ARAçHNOCAMPA. A presente invenção refere-se a sequências de aminoácidos e nucleotídeos de peptídeos de luciferase que são codificadas por genes no genoma de Arachnocampa (Diptera). São especificamente fornecidas luciferases dependentes de ATP funcionais que catalisam as reações de luminescência com espectro de emissão na porção azul do espectro. A presente invenção especificamente proporciona moléculas de peptídeo e ácidos nucleicos isolados, métodos de identificação de ortólogos e subsequências ativas dos peptídeos da enzima, e métodos de identificação de moduladores e substratos dos peptídeos de luciferase. Métodos de ensaios, incluindo ensaios repórteres múltiplos utilizando pelo menos duas luciferases dependentes de ATP são fornecidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LUCIFERA-SES DE ARACHNOCAMPA".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A. Campo da invenção

A presente invenção refere-se de um modo geral, a luciferases.

Particularmente, a invenção se refere a proteínas e peptídeos das enzimasIuciferase que são funcionais para catalisar reações de luminescência de-pendentes de ATP produzindo espectro de emissão de luz com intensidadesmáximas na porção azul do espectro e ensaios utilizando tais luciferases.

Em um outro aspecto, a invenção se refere às luciferases isoladas de orga-nismos do gênero Arachnocampa (Diptera).

B. Descrição da técnica relacionada

O uso de moléculas repórteres ou marcadoras para monitorarqualitativamente ou quantitativamente eventos moleculares é bem-estabelecido. Eles são encontrados em ensaios para diagnose médica, paraa detecção de toxinas e outras substâncias em ambientes industriais, e paraa pesquisa básica e aplicada em biologia, biomedicina e bioquímica. Taisensaios incluem imunoensaios, ensaios de hibridização de sonda de ácidonucleico e ensaios nos quais uma enzima repórter ou outra proteína é pro-duzida pela expressão sob o controle de um promotor particular. Moléculasrepórteres, ou marcadoras em tais sistemas de ensaio, incluíram isótoposradioativos, agentes fluorescentes, enzimas e agentes quimiluminescentes.

Incluídos em sistemas de ensaio empregando quimiluminescên-cia para monitorar ou medir eventos de interesse estão os ensaios que me-dem a atividade de uma enzima bioluminescente, luciferase.

Sistemas de emissão de luz têm sido conhecidos e isolados apartir de muitos organismos Iuminescentes incluindo bactérias, protozoários,celenterados, moluscos, peixes, diplópodes, moscas, fungos, vermes, crus-táceos e besouros, particularmente besouros da família Elateridae do gêneroPyrophorus e os vaga-lumes dos gêneros Photinus, Photurisl e Luciola.

Organismos adicionais apresentando bioluminescência estãolistados em WO/2000/024878 e 1999/049019. Também ver Viviani, V. R..(2002) Cell. Mol. Life Sei. 59: 1833-1850, as quais listam propriedades deinsetos e artrópodos terrestres bioluminescentes.

Em muitos desses organismos, as enzimas catalisam a monoxi-genação, utilizando a energia livre resultante para excitar uma molécula atéum elevado estado de energia. A luz visível é emitida quando a moléculaexcitada espontaneamente retorna para o estado mais estável. Essa luz emi-tida é chamada "bioluminescência". De agora em diante, ela também podeser referida simplesmente como "luminescência".

Desde os estudos mais iniciais, as Iuciferases de besouro (parti-cularmente aquela das espécies de vaga-lumes da América do Norte co-muns Photinus pyralis) serviram como paradigmas para o entendimento dabioluminescência. O conhecimento fundamental e as aplicações das Iucife-rases têm sido tipicamente baseadas em uma única enzima, chamada "luci-ferase de vaga-lume", derivada de Photinus pyralis. Entretanto, há aproxi-madamente 1800 espécies de besouros luminosos pelo mundo. Dessa for-ma, a Iuciferase de Photinus pyralis é um exemplo individual de um grande ediverso grupo de Iuciferases de besouro. É sabido que todas as Iuciferasesde besouro catalisam uma reação do mesmo substrato, um ácido orgânicopolieterocíclico (de agora em diante referido como "luciferina", a não ser queseja indicado de outra forma), o qual é convertido em uma molécula de ele-vada energia. É provável que a reação catalisada requeira o mesmo meca-nismo em cada caso.

Luciferases de besouro, incluindo as chamadas Iuciferases devaga-lume, são membros da superfamília de enzimas formadoras de adeni-lato. As Iuciferases de besouro catalisam uma reação de múltiplos etapasque tem algumas similaridades com as reações catalisadas por outras enzi-mas formadoras de adenilato, tais como as acil-CoA ligases, várias outrasCoA ligases (por exemplo, 4-cumarato-CoA ligase) e peptídeo sintases.

A primeira etapa da reação é a adição de monofosfato de adeni-na (adenilação) ao carbono carboxílico da D-Iuciferina para formar Iuciferil-AMP. ATP é a fonte do AMP e o outro produto da reação é pirofosfato. Des-sa forma, essa reação é "dependente de ATP" ou "dependente no ATP".Presumivelmente, a hidrólise do pirofosfato é usada para direcionar a reaçãopara frente. LuciferiI-AMP é um anidrido de ácido misturado dos ácidos acé-tico e fosfórico. Ela é relativamente reativa porque o grupo adenilila é umbom grupo de saída. Em enzimas similares a primeira etapa também é aadenilação de um carboxilato na molécula de substrato, seja ele um acetato,um ácido graxo de cadeia longa, 4-cumarato ou um aminoácido.

No caso de CoA utilizando enzimas, existe geralmente um ata-que nucleofílico da CoA sulfidrila no ácido carboxílico adenilado resultandona conjugação da CoA ao substrato. No caso de Iuciferases de besouro, e-xiste o ataque de oxigênio molecular na carbonila, resultando em um inter-mediário de dioxietano altamente energético, o qual subseqüentemente de-cai liberando um fóton, tipicamente dentro da porção verde-amarela do espectro(550 - 570 nm) mais dióxido de carbono.

Luciferases possuem características as quais as tornam particu-larmente úteis como moléculas repórteres para biossensorial (usando umsistema repórter para revelar propriedades de um sistema biológico). Atransdução de sinal em biossensores (sensores os quais compreendem umcomponente biológico), geralmente envolve um processo de duas etapas: ageração de sinal através de um componente biológico, e a transdução e am-plificação de sinal através de um componente elétrico. A geração de sinal étipicamente alcançada através de ligação ou catálise.

A conversão desses eventos bioquímicos em um sinal elétrico étipicamente baseada em métodos de detecção eletroquímicos ou calóricos,os quais estão limitados pela alteração de energia livre das reações bioquí-micas. Para a maior parte das reações, essa é menor do que a energia dehidrólise para duas moléculas de ATP, ou cerca de 70 KJ/mol. Entretanto, aluminescência eliciada pelas Iuciferases carrega um conteúdo de energiamuito mais elevado. Fótons emitidos da reação catalisada por Iuciferase devaga-lumes (560 nm) têm 214 KJ/einstein. A Iuciferase de vaga-lumes con-verte energia química em luz com alta eficiência e sinal extraordinário paraas características de ruído. A quantidade gerada por molécula de D-Iuciferina é 0,88 (Seliger e McEIroy 1960; Seliger e W.D 1960). Essa enzimaé, dessa forma, um transdutor extremamente eficiente de energia química.

Entretanto, as Iuciferases dependentes de ATP conhecidas, porexemplo, as Iuciferases de besouro, emitem dentro de uma faixa relativa-mente estreita de espectro de emissão. Nenhuma das Iuciferases de besou-ro conhecidas emitem com intensidades de emissão máximas em compri-mentos de onda menores do que ou iguais a 530 ± 5 nm (Viviani 2002; Na-katsu et al. 2006). De fato, as modificações estruturais para Iuciferases co-nhecidas permitem a redução da energia do espectro de emissão (isto é, atéintensidades de emissão máximas em comprimentos de onda mais longos),mas não um aumento na energia do espectro de emissão (isto é, para com-primentos de onda mais curtos). Informação adicional de como as modifica-ções estruturais atualmente ensinadas para modificar o espectro de emissãopode ser encontrada em Nakatsu et al. (2006).

Luciferases foram isoladas diretamente a partir de várias fontese seus DNAsc foram reportados. Ver, por exemplo: de Wet et al, Molec. Cell.Biol 7, 725-737 (1987); Masuda et al, Gene 77, 265-270 (1989); Nakatsu etal (2006); e Wood et al, Science 244, 700-702 (1989)). Com o DNAc codifi-cando uma Iuciferase em mãos, é completamente direto para os versadospreparar grandes quantidades da Iuciferase pelo isolamento de bactérias(por exemplo, E. coli), levedura, células de mamíferos em cultura ou seme-lhantes, as quais foram transformadas para expressar o DNAc. Alternativa-mente, o DNAc, sob o controle de um promotor apropriado e outros sinaispara controlar a expressão, pode ser usado em tal célula para proporcionarIuciferase (e enfim a bioluminescência catalisada por meio disso) como umsinal para indicar a atividade do promotor. A atividade do promotor pode, porsua vez, refletir outro fator que se busca ser monitorado, tal como a concen-tração de uma substância que induz ou reprime a atividade do promotor. Vá-rios sistemas livres de células que se tornaram recentemente disponíveispara fazer proteínas a partir de ácidos nucleicos que os codificam tambémpodem ser usados para fazer luciferases.

A pronta disponibilidade dos DNAsc codificando luciferases tornapossível o uso das luciferases como repórteres nos ensaios empregadospara sinalizar, monitorar ou medir eventos genéticos associados com trans-crição e tradução, pelo acoplamento da expressão de tal DNAc1 e conse-qüentemente produção da enzima para tais eventos genéticos.

Por exemplo, a Iuciferase de vaga-lume tem sido amplamenteusada para detectar a atividade do promotor em eucariotos e procariotos.Substratos requeridos para a reação de luminescência, incluindo uma Iucife-rina ou outro substrato, oxigênio e ATP, são disponíveis ou tornados pron-tamente disponíveis nas células vivas.

Ensaios de Repórter Múltiplos

Repórteres múltiplos, duais (ou duplos) são comumente usadospara melhorar a precisão experimental. O termo "repórter dual" se refere àexpressão simultânea e medição de duas enzimas repórteres individuais emum sistema individual. O termo "repórter múltiplo" se refere à expressão si-multânea e medição de duas ou mais enzimas repórteres individuais em umsistema individual, quando usados juntos, duas ou mais enzimas repórteresindividuais podem ser nomeadas "correpórteres". Exemplos que atualmentese beneficiam de múltiplos ensaios de repórter incluem células individuais oupopulações celulares (tais como células dispersas em cultura, tecidos segre-gados ou animais inteiros) geneticamente manipulados para expressar si-multaneamente dois diferentes genes repórteres. Mais freqüentemente, aatividade de um gene reporta o impacto das condições experimentais espe-cíficas, enquanto que a atividade de um segundo gene repórter proporcionaum controle interno pelo qual todos os grupos de valores experimentais po-dem ser normalizados. A normalização da atividade do repórter experimentalpara a atividade do controle interno minimiza a variabilidade experimentalcausada, por exemplo, por diferenças na viabilidade celular ou eficiência detransfecção. Outras fontes de variabilidade, tais como diferenças em volu-mes de pipetagem, eficiência de Iise celular e eficiência de ensaio, podemser eficazmente eliminadas. Dessa forma, ensaios repórteres duais geral-mente permitem uma interpretação mais confiável do dado experimental pelaredução de influências externas.

Sistemas reconstituídos livres de células que podem se benefici-ar da tecnologia repórter de enzima dual são Iisados celulares derivados datradução simultânea, ou da transcrição e tradução acopladas de materiaisgenéticos independentes codificando enzimas repórteres de controle e expe-rimentais. Imunoensaios podem da mesma forma, ser designados para areportagem dual ou tanto dos valores experimental quanto de controle deuma amostra individual.

Atualmente, genes que codificam Iuciferases de vaga-lumes(luc), Iuciferases de Renilla1 cloranfenicol acetil transferase (CAT)1 beta-galactosidades (IacZ)1 beta-glucuronidase (GUS) e várias fosfatases, taiscomo fosfatase alcalina secretada (SEAP) e uteroferrina (Uf; uma fosfataseácida) foram combinados e usados como correpórteres de atividade genéti-ca. As seguintes referências proporcionam exemplos representativos dessesvários genes repórteres usados de forma combinada para o propósito dereportagem dual de atividade genética: Iuc e GUS: Leckie1 F., et al, 1994; Iuce CAT, e Iuc e IacZ: Jain1 V. K. e Magrath, I. T., 1992; CAT e IacZ: Flanagan,W. M., et al, 1991. Ver também o sistema de ensaio repórter Dual-Luciferase™ da Promega1 o sistema de ensaio da Iuciferase Dual-Glodescrito em seu Manual Técnico: Instructions for use of Products E2920,E2940, and E2980, revisado em 1/06, Número da Parte TM058; e Wood, K.V., (1998) The Chemistry of Bioluminescent Repórter Assays1 Promega No-tes 65, página 14, assim como Promega pGL3 Luciferase Repórter Vectors(disponível da Promega Corporation, Madison1 Wis.) assim como as Paten-tes Americanas Nos. 5.744.320 e 5.670.356.

O desempenho de qualquer ensaio repórter múltiplo é limitadopelas características e compatibilidade das químicas da enzima constituinte,e pela capacidade de correlacionar os respectivos resultados para cada. Re-querimentos de enzima ou condições de ensaio diferentes podem ditar quecorrepórteres podem não ser empregados em uma mistura integrada de umúnico ensaio ou em formato de tubo individual. Idealmente, um sistema re-pórter múltiplo poderia compreender pelo menos dois ensaios de enzimacom requerimentos compatíveis, tais como químicas, temperaturas, requeri-mentos de manuseio, velocidade, sensibilidade, instrumentação de detec-ção, etc.

Em uma tentativa de atender os requerimentos ideais de um sis-tema repórter múltiplo, clones de diferentes Iuciferases1 particularmente deum único gênero ou espécie, podem ser utilizados juntamente em sistemasrepórter bioluminescentes. A capacidade de distinguir cada uma das Iucife-rases em uma mistura, entretanto, é limitada pela largura dos seus espectrosde emissão. Variações mensuráveis na cor da luminescência das Iuciferasessão necessárias para sistemas os quais utilizam duas ou mais Iuciferasescomo repórteres.

Um exemplo de variação de cor de luminescência ocorre em P-yrophorus plagiophthalamus, um grande besouro da família Elateridae indí-gena do Caribe. Ver, por exemplo, o Pedido de Patente US 20030166905,publicado em 4 de setembro de 2003. O besouro tem dois grupos de órgãosleves, um par na superfície dorsal do protórax, e um único órgão em umafenda ventral do abdômen. Quatro diferentes clones de Iuciferase foram iso-lados do órgão ventral e foram nomeados LucPpIGR, LucPpIYG, LucPpI YEe LucPpI OR. As reações Iuciferina-Iuciferase catalisadas por essas enzimasproduzem luz que varia de verde para laranja.

Dados espectrais da reação Iuciferase-Iuciferina catalisada poressas quatro Iuciferases mostram quatro picos que se sobrepõem de espa-çamento aproximadamente uniforme, emitindo luz verde (intensidade do pi-co: 546 nanômetros), verde-amarelo (intensidade do pico: 560 nanômetros),amarelo (intensidade do pico: 578 nanômetros) e laranja (intensidade do pi-co: 593 nanômetros. Conforme aqui utilizado, intensidade do pico: 546 na-nômetros, por exemplo, significa que a emissão máxima de um espectro deluminescência produzido por uma reação de luminescência catalisada poruma Iuciferase ocorre em ou em cerca de 546 nanômetros. O termo "cerca"nesse contexto se refere aos limites normais de precisão na medição docomprimento de onda em cada pico, ou à ocorrência de intensidade máxima(também conhecida como lambda-max). Limites normais de precisão são,por exemplo, mais ou menos 5 nanômetros (isto é, ± 5 nm).

Infelizmente, embora os comprimentos de onda da intensidadedo pico emitido por essas Iuciferases variem em aproximadamente 50 nm,ainda há uma considerável sobreposição dentro do espectro, mesmo aque-les com picos em 546 e 593 nm. O aumento da diferença no comprimento deonda da intensidade do pico dentre as reações de luminescência empregadapoderia, dessa forma, ser altamente desejável para obter uma maior preci-são de medição em sistemas usando duas ou mais luciferases. Particular-mente, uma nova Iuciferase que catalisa uma reação de luminescência pro-duzindo uma intensidade máxima igual a ou menos do que cerca de 530 nmpoderia ser altamente desejável. Intensidades do pico de menos do que cer-ca de 530 nm estão dentro da porção azul do espectro.

Em uma tentativa de atender a essa necessidade, o sistema deluminescência emitindo azul de colônia de organismos marinhos em formade folha do gênero Renilla, Renilla reniformis, foi explorada em sistemas re-pórteres duais com Iuciferase de vaga-lume. A luminescência de colônia deorganismos marinhos em forma de folha do gênero Renilla (Renilla renifor-mis e espécies intimamente relacionadas) está no espectro azul, o qual ofe-rece vantagens em relação à luminescência verde-amarelo em algumas a-plicações. A química da reação de luz de Renilla é não-relacionada com a-quela dos besouros e o intermediário reativo é gerado por uma via diferentedas luciferases de besouro. Especificamente, luciferases de Renilla catali-sam a oxidação de celenterazina para celenteramida com emissão de luzazul a 480 nm. Um intermediário de dioxetano pode estar envolvido, porém aadenilação não ocorre. Luciferase de Renilla é evolucionariamente não-relacionada com as luciferases de besouro ou enzimas formadoras de adeni-lato. Ver, por exemplo, as Patentes Americanas 5.292.658 e 6.418.155.

Vantagens e limitações da Iuciferase de Renilla

A principal vantagem do sistema Iuciferase de Renil-la/celenterazina como um repórter de gene expressão é que ela ilumina noespectro azul usando diferentes substratos da Iuciferina de besouro. Lucife-rase de Renilla pode, dessa forma, ser usada em experimentos de duplamarcação com luciferase/luciferina de besouro. Ver, por exemplo, PatenteUS 5.744.320. Todavia, em outros aspectos a Iuciferase de Renilla é inferioràs Iuciferases de besouro por que o substrato de celenterazina exibe umbaixo nível de luminescência não-enzimática. Esse nível de auto-luminescência varia de acordo com a hidrofobicidade do ambiente e, juntos,esses dois fenômenos limitam significativamente a sensibilidade absolutados ensaios.

A Iuciferase de besouro não sofre dessa deficiência, presumi-velmente porque o substrato oxidável (IuciferiI-AMP) nunca é encontradolivre em solução mas é sintetizado, conforme descrito acima, enquanto fir-memente ligado pela Iuciferase e é, conseqüentemente, de vida muito curta,com oxidação também ocorrendo na enzima.

Deficiências adicionais da Iuciferase de Renilla é que ela nãopode ser diretamente usada em aplicações que envolvem a quantificação deATP, porque a reação não utiliza ATP. Também, a Iuciferase de Renilla nãoé responsável por ensaios de duplo rótulo contínuos na presença de Iucife-rase de besouro ativa ou não-suprimida.

Orfelia fultoni

Orfelia fultoni é uma mosca bioluminescente (Diptera) encontra-da na América do Norte (Fulton, 1941). Sua biologia geral é muito similaràquela das moscas australasiáticas do gênero Arachnocampa, descritas napróxima seção. De acordo com Viviani, Hasting et al. (Viviani, Hastings et al2002). Orfelia tem uma luminescência azul com Iambda max = 460 nm, umcomprimento de onda mais curto do que para qualquer outra luminescênciaderivada de inseto. Interessantemente, a luminescência de Orfelia não é de-pendente do ATP, uma característica que a distingue da luminescência detodos os outros insetos, e é estimulada por alguns agentes redutores bran-dos. Viviani, Hastings et al caracterizou parcialmente a Iuciferase de Orfeliabioquimicamente (Viviani, Hastings et al. 2002).

Arachonocampa

A presença de vaga-lumes emissores de azul em habitats prote-gidos pela Austrália Oriental deve ter sido bem-conhecida para os australia-nos indígenas por milhares de anos. Espécies intimamente relacionadas o-correm em concentrações espetaculares na Nova Zelândia. Os vaaa-lumes.os quais usam sua luminescência azul para atrair vítimas em uma rede pe-gajosa, são as larvas de moscas keroplatidae. Entretanto, as primeiras des-crições europeias as identificaram mal como as larvas de besouros relacio-nadas com o vaga-lume europeu Lampyris noctiluca (Coleoptera, Lampyri-dae). Espécies atualmente reconhecidas (Baker 2004; Harrison 1966; Pugs-Iey 1983) dos vaga-lumes australianos (Diptera: Keroplatidae: Arachnocam-pinae) são listadas, em parte, na Tabela 1.

TABELA 2

<table>table see original document page 11</column></row><table>

De acordo com (Shimomura, Johnson et al. 1966), o máximo doespectro de emissão de Arachnocampa é de 487 ± 5 nm, o qual está emíntima concordância com o espectro de emissão corrigido apresentado por(Lee 1976) para A. richardsae. Viviani, Hastings et al. (2002) cita um máximode emissão de 484 nm para A. fiava. Lee (1976) também mostrou que a lu-minescência de Iuciferase de Arachnocampa é estimulada por ATP e requerMg++. A emissão em comprimento de onda curta sugere que o substrato daIuciferase de Araehnoeampa é diferente da Iuciferina de besouro (Wood1983) e, de fato, a D-Iuciferina de besouro não foi ainda demonstrada comoestimulando a Iuciferase de Araehnoeampa (Lee 1976; Wood 1983; Viviani,Hastings et al. 2002).

Wood (1983) mostrou que a luminescência em extratos geladosesgotados de órgãos de luz de Araehnoeampa poderiam ser regeneradospela adição de um extrato tratado com calor. Vivianii Hastings et al. (Viviani1Hastings et al. 2002) foram capazes de extrair alguma Iuciferina de Araehno-campa usando acetato de etila ácido e efetuaram uma separação parcialusando TLC. Nenhuma informação estrutural é disponível considerando aIuciferina de Arachnocampa natural. De acordo com Viviani, Hastings et al.(2002) a Iuciferase de Arachnocampa tem um peso molecular, estimado porfiltração a gel, de 36 KDa1 isto é, aproximadamente metade do peso molecu-lar da Iuciferase de vaga-lume, a qual é de 62 KDa (Conti, Franks et al.1996).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um peptídeoisolado compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEO ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ IDNO: 10. Em aspectos adicionais, a invenção proporciona um peptídeo isola-do compreendendo uma seqüência de aminoácidos uma variante de umaseqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10, em que a variante é codificada por umamolécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes parauma molécula de ácido nucleico com uma seqüência selecionada do grupoconsistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7e SEQ ID NO: 9 ou um complemento seu.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um peptídeo iso-lado compreendendo uma seqüência de aminoácidos de um ortólogo deuma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQID NO:2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10, em que o ortólogoé codificado por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condiçõesestringentes para uma molécula de ácido nucleico com uma seqüência sele-cionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9 ou um complemento seu.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece um peptídeoisolado compreendendo uma seqüência de aminoácidos compreendendo umfragmento de uma seqüência de aminoácidos de pelo menos 10 aminoáci-dos contíguos selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:2, SEQ IDNO: 6, SEQ ID NO: 8, e SEQ ID NO: 10. Em modalidades particulares, ainvenção inclui um peptídeo isolado com uma seqüência de aminoácidosque compartilha pelo menos 70, 80 ou 90 por cento de identidade com umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ IDNO:2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10. Em algumas modali-dades preferidas, os peptídeos isolados da invenção têm um peso molecularmaior do que 36 quiloDaltons (KD). Esses peptídeos podem ser nomeados"um peptídeo da invenção".

Em modalidades especialmente preferidas, a invenção propor-ciona para porções enzimaticamente ativas dos peptídeos da invenção quesão responsáveis pela catálise de reações de luminescência com espectromostrando a emissão máxima em um comprimento de onda menor do queou igual a 530 ± 5 nm. Em modalidades especialmente preferidas^ a reaçãode luminescência é dependente de ATP.

Conforme aqui notado, í 5 nm reflete a precisão típica com aqual tais comprimentos de onda podem ser especificados. Particularmente,reações de luminescência de modalidades preferidas produzem espectro deemissão com intensidades de emissão máxima em comprimentos de ondamenores do que ou iguais a 520 ± 5 nm, 510 ± 5 nm, 500 ± 5 nm ou 490 ± 5nm. Esses peptídeos da invenção apresentando atividade Iuciferase podemser nomeados "uma Iuciferase ativa" ou "um peptídeo da invenção apresen-tando atividade luciferase", uma "luciferase adicional" ou "luciferase GW" da invenção.

Em modalidades preferidas, a invenção proporciona um peptí-deo isolado que apresenta atividade luciferase, em que a atividade luciferasecompreende a catálise de uma reação de luminescência dependente de ATPe a reação de luminescência produz um espectro de emissão com uma in-tensidade de emissão máxima em comprimentos de onda menores do queou iguais a 530 ± 5 nm. Em uma modalidade, o peptídeo compreende umaseqüência de aminoácido contígua com pelo menos 70% de seqüência deidentidade com os aminoácidos de 200 a 350 de uma seqüência selecionadado grupo consistindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQID NO: 10.

Em outras modalidades específicas, a invenção proporciona umpeptídeo isolado que apresenta atividade de luciferase, em que a atividadede luciferase compreende a catálise de uma reação de luminescência de-pendente de ATP e a reação de luminescência produz um espectro de emis-são com uma intensidade de emissão máxima em comprimentos de ondamenores do que ou iguais a 530 nm e em que o peptídeo isolado tem umaseqüência de aminoácidos que, quando alinhada com uma luciferase dePhotinus, por exemplo, SEQ ID NO: 4, difere daquela da SEQ ID NO: 4 porpelo menos uma alteração na seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo consistindo da anulação de R218, H245N, G315S, L342S e T343S.

Em ainda outras modalidades, tal peptídeo tem uma seqüência de aminoáci-dos que, quando alinhada com aquela da SEQ ID NO: 4, difere daquela daSEQ ID NO: 4 por pelo menos uma alteração na seqüência de aminoácidosselecionada do grupo consistindo em A22Y, Y53A, L63T, E83D, F88Y,F89Y, P911, A103C, Y109W, E113D, V139I, G160P, S198T, H212Q, umaanulação de R218, D224S, uma anulação de P225, G228D, P233K, P242Q,F243Y, H245N, L253M, Y255R, F273Y, Y280F, S298K, L300E, E311R,G315S, P318T, L319V, G339F, L342S, T343S, D375H, K380A, E389F,T408S, W417Y, L418V, D427N, L441I, I442V, K443M, Y444V, K445D,Q448A, A452T, L458I, V485L, V486T, G490R, V506L, R513K, V516C,T527A e uma anulação de todos os resíduos de e incluindo K549 para ocarbóxi terminal. Peptídeos da invenção incluem aqueles baseados na se-qüência da SEQ ID NO: 4, mas modalizando uma ou mais alterações da se-qüência de aminoácidos conforme listada acima ou conforme listada na Ta-bela 5 e na descrição detalhada que se segue.

Além disso, modalidades preferidas, os peptídeos isolados dainvenção que apresentam atividade luciferase têm seqüências de aminoáci-dos que compartilham pelo menos 70 por cento de identidade com uma se-qüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:2,SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10.

Em modalidades particulares, o peptídeo de luciferase ativocompreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consis-tindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10. Emaspectos adicionais, a invenção proporciona um peptídeo de Iuciferase ativocompreendendo uma seqüência de aminoácidos uma variante de uma se-qüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:2,SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10, em que a variante é codifi-cada por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sob condições es-tringentes para uma molécula de ácido nucleico com uma seqüência sele-cionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9 ou um complemento seu.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um peptídeo deluciferase ativo compreendendo uma seqüência de aminoácidos de um ortó-Iogo de uma seqüência de aminoácidos selecionada do gruo consistindo em:SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10, em que oortólogo é codificado por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sobcondições estringentes para uma molécula de ácido nucleico com uma se-qüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9 ou um complemento seu.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um peptídeo deIuciferase ativo compreendendo uma seqüência de aminoácidos compreen-dendo um fragmento de uma seqüência de aminoácido de pelo menos 10aminoácidos contíguos selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10. Em modalidades particu-lares, a invenção inclui um peptídeo de Iuciferase ativo com uma seqüênciade aminoácidos que compartilha pelo menos 70, 80 ou 90 por cento de iden-tidade com uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistin-do em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10; Emalgumas modalidades preferidas, os peptídeos ativos da invenção apresen-tando atividade Iuciferase têm pesos moleculares maiores do que 36 quilo-Daltons.

Aspectos adicionais da invenção incluem anticorpos que se li-gam seletivamente a um peptídeo da invenção. Em modalidades preferidas,tais anticorpos encontram uso na detecção da presença dos peptídeos dainvenção selecionados do grupo consistindo em: (a) uma seqüência de ami-noácidos mostrada na SEQ ID NO: 2; (b) uma seqüência de aminoácidosuma variante de uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2,em que a variante é codificada por uma molécula de ácido nucleico que hi-bridiza sob condições estringentes para uma molécula de ácido nucleicomostrada na SEQ ID NO: 1 ou seu complemento: (c) uma seqüência de a-minoácidos de um ortólogo de uma seqüência de aminoácidos mostrada naSEQ ID NO: 2, em que o ortólogo é codificado por uma molécula de ácidonucleico que hibridiza sob condições estringentes para uma molécula de á-cido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 1 ou seu complemento; e (d) umfragmento de uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2,em que o fragmento compreende pelo menos 10 aminoácidos contíguos.

A invenção ainda engloba uma molécula de ácido nucleico isola-da compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma se-qüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:2,SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10. A invenção, do mesmo mo-do, inclui uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma variante de umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ IDNO:2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, e SEQ ID NO: 10, em que a seqüênciade nucleotídeos hibridiza sob condições estringentes para uma molécula deácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ IDNO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9 ou um complementoseu. Além disso, a invenção inclui uma seqüência de nucleotídeos que codi-fica um ortólogo de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupoconsistindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO:10, em que a seqüência de nucleotídeos hibridiza sob condições estringen-tes para uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo consistindoem SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 e SEQ IDNO: 9 ou um complemento seu. Ainda adicionalmente, a invenção inclui umaseqüência de nucleotídeos que codifica um fragmento de pelo menos 10 a-minoácidos contíguos de uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ IDNO: 10 e uma seqüência de nucleotídeos que é o complemento da seqüên-cia de nucleotídeos.

Moléculas de ácido nucleico conforme descritas no limite da in-venção podem ser referidas como "molécula de ácido nucleico da invenção".A invenção inclui uma seqüência de nucleotídeos que é o complemento deuma molécula de ácido nucleico da invenção.

Em várias outras modalidades, a invenção ainda compreendeuma molécula de ácido nucleico da invenção incluída em uma tira de gene,em uma célula transgênica, em um vetor de ácido nucleico ou em uma célulahospedeira.

Os métodos da invenção incluem um método de detecção dapresença de uma molécula de ácido nucleico da invenção em uma amostra.Dessa forma, em uma modalidade particular, o método compreende o conta-to da amostra com um oligonucleotídeo que hibridiza para uma molécula deácido nucleico da invenção sob condições estringentes e determinando se ooligonucleotídeo se liga à molécula de ácido nucleico na amostra.

Métodos adicionais da invenção incluem, por exemplo, um mé-todo de monitorar a expressão de um gene de interesse ou uma porção suaem uma célula hospedeira, compreendendo: (a) a introdução na célula hos-pedeira de um constructo de vetor, o constructo de vetor compreendendouma molécula de ácido nucleico da invenção, e ainda compreendendo umamolécula de ácido nucleico codificando uma seqüencia de nucleotídeos ouproduto de interesse; em que a molécula de ácido nucleico da invenção e aseqüência ou produto de interesse são coexpressos; e (b) a detecção dapresença da expressão da molécula de ácido nucleico da invenção, monito-rando dessa forma a expressão da seqüência ou produto de interesse.

Em métodos particulares da invenção, a molécula de ácido nu-cleico da invenção codifica um peptídeo apresentando atividade luciferase.Conseqüentemente, em métodos preferidos da invenção, a detecção da pre-sença da expressão da molécula de ácido nucleico da invenção compreendeo ensaio para atividade da luciferase. Em métodos especificamente preferi-dos, a atividade da Iuciferase inclui a catálise de uma reação de luminescên-cia dependente de ATP e a reação de luminescência produz um espectro deemissão com uma intensidade de emissão máxima em comprimentos deonda menores do que ou iguais a 530 ± 5 nm.

Em modalidades adicionais dentro do escopo da invenção, umvetor de expressão compreende a seqüência de nucleotídeos da invençãoem ligação operativa com um promotor. Em modalidades particulares, opromotor é funcional em uma célula selecionada do grupo consistindo emuma célula vegetal, uma célula bacteriana, uma célula animal e uma célulade inseto. Em ainda modalidades adicionais, o vetor ainda compreende umaseqüência de nucleotídeos codificando uma seqüência adicional ou produtode interesse. A seqüência adicional ou produto de interesse pode ser umácido nucleico, uma proteína, uma Iuciferase ativa ou uma porção enzimati-camente ativa sua. É claro, em modalidades adicionais, a invenção incluiuma célula hospedeira contendo um vetor da invenção. A célula hospedeirapode ser qualquer célula adequada. Em modalidades particulares, a célulahospedeira é selecionada do grupo consistindo em uma célula vegetal, umacélula de inseto, uma célula fúngica, uma célula animal e uma célula bacteri-ana.

Em ainda outros aspectos, os métodos da invenção incluem ummétodo de transformação ou transfecção de uma célula hospedeira com umácido nucleico de interesse ou porção sua, compreendendo: (a) a introduçãona célula hospedeira de um constructo de vetor, o constructo de vetor com-preendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção que codifica umpeptídeo apresentando atividade luciferase, em que o peptídeo apresentan-do atividade luciferase é expresso; e (b) a detecção da atividade luciferase,por meio disso estabelecendo que a célula hospedeira seja transformada outransfectada.

Em outras modalidades, os métodos da invenção incluem ummétodo de monitorar a atividade de um elemento controlador em uma célulahospedeira compreendendo: (a) a introdução na célula hospedeira de umconstructo de vetor, o constructo de vetor compreendendo uma molécula deácido nucleico da invenção e em ligação operativa com o elemento controla-dor; e (b) a detecção da presença de luciferase, monitorando dessa forma aatividade do elemento controlador. O elemento controlador nessa modalida-de pode ser um promotor ou um intensificador. A molécula de ácido nucleicoda invenção pode codificar um peptídeo apresentando atividade luciferase.Em tais modalidades, em que o peptídeo apresenta atividade luciferase, adetecção da presença da luciferase pode ser por ensaio para a atividade daluciferase.

Métodos adicionais da invenção incluem um método de identifi-cação de um composto como substrato putativo de uma luciferase funcional,compreendendo: (a) o contato de uma luciferase funcional codificada poruma molécula de ácido nucleico da invenção com pelo menos um compostocandidato sob condições adequadas para a atividade da luciferase funcional;e (b) o ensaio para a atividade da luciferase, em que a detecção da atividadeda luciferase indica que pelo menos um composto candidato é um substratoputativo de uma luciferase funcional. Novos compostos identificados pelaoperação dos métodos da invenção são expressamente incluídos dentro doescopo da invenção.

Métodos particularmente preferidos da invenção incluem um mé-todo de medição da atividade de pelo menos duas enzimas repórteres emuma alíquota de uma amostra compreendendo o ensaio para a atividade deuma primeira enzima repórter pela medição do sinal de luz produzido pelacatálise de uma reação de luminescência pela primeira enzima repórter, epelo ensaio para a atividade de pelo menos uma segunda enzima repórterpela medição do sinal de luz produzido pela catálise de uma reação de lumi-nescência por pelo menos uma segunda enzima repórter. Métodos incluemaqueles nos quais os ensaios são efetuados na mesma alíquota da amostra.Em tais modalidades, os ensaios podem proceder em qualquer ordem, agru-pamento ou seqüência de tempo desejada da invenção. Em modalidadesparticulares, os ensaios procedem simultaneamente. Além disso, modalida-des particulares, pelo menos um ensaio é efetuado antes de pelo menos umsegundo ensaio, ou pelo menos um ensaio é efetuado subseqüentemente atodos os outros ensaios, ou os ensaios são efetuados seqüencialmente. Emmodalidades particulares, a primeira enzima repórter compreende uma Iuci-ferase ativa da invenção. É claro, em modalidades especialmente preferidas,pelo menos uma das enzimas repórteres é um peptídeo que mostra ativida-de Iuciferase em que a atividade Iuciferase compreende a catálise de umareação de luminescência dependente de ATP e a reação de luminescênciaproduz um espectro de emissão com uma intensidade de emissão máximaem comprimentos de onda menores do que ou iguais a 530 ± 5 nm.

Em ainda outras modalidades, pelo menos duas enzimas repór-teres são Iuciferases dependentes de ATP. Em modalidades especialmentepreferidas, a primeira enzima repórter é Iuciferase de Arachnocampa e a se-gunda enzima repórter é uma Iuciferase diferente. Por "luciferase diferente"se entende qualquer outra luciferase, seja dependente de ATP ou não. Luci-ferases diferentes particularmente preferidas incluem aquelas dos vaga-lumes, barata de estalo ou vermes de estrada de ferro. Luciferases adicio-nais preferidas catalisam reações de luminescência que produzem espectrode emissão com intensidades de emissão máxima em comprimentos de on-da maiores do que 530 nm.

Outros objetos, características e vantagens da presente inven-ção tornar-se-ão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deveser entendido, entretanto, que a descrição detalhada e os exemplos especí-ficos, enquanto indicando modalidades específicas da invenção, são dadossomente a título de ilustração, uma vez que várias alterações e modificaçõesdentro do espírito e escopo da invenção tornar-se-ão aparentes para aque-Ies indivíduos versados na técnica a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os seguintes desenhos formam parte da presente especificaçãoe são incluídos para demonstrar adicionalmente certos aspectos da presenteinvenção. A invenção pode ser melhor entendida por referência a um oumais daqueles desenhos em combinação com a descrição detalhada da in-venção aqui apresentada.

Figura 1A - Seqüência de nucleotídeos de consenso da Iucifera-se de Arachnocampa richardsae (SEQ ID NO: 1).

Figura 1B - Seqüência de nucleotídeos de consenso da Iucifera-se de Arachnocampa richardsae (SEQ ID NO: 1) continuada da Figura 1A.

Figura 2A - Seqüência de ácido nucleico e seqüência e aminoá-cidos correspondente da Iuciferase de Araehnoeampa richardsae.

Figura 2B - Seqüência de ácido nucleico e seqüência e aminoá-cidos correspondente da Iuciferase de Arachnocampa richardsae continuadada Figura 2A.

Figura 3 - Seqüência de aminoácidos de consenso da Iuciferasede Arachnocampa richardsae (SEQ ID NO: 2).

Figura 4 - Seqüência de ácido nucleico de uma Iuciferase da in-venção (SEQ ID NO: 3).

Figura 5A - Seqüência de ácido nucleico e seqüência de amino-ácidos correspondente de um peptídeo de Iuciferase da invenção.

Figura 5B - Seqüência de ácido nucleico e seqüência de amino-ácidos correspondente de um peptídeo de Iuciferase da invenção continuadada FIG 5A.

Figura 5C - Seqüência de ácido nucleico e seqüência de amino-ácidos correspondente de um peptídeo de Iuciferase da invenção continuadada FIG 5B.

Figura 6A - Alinhamento das seqüências de aminoácidos da Iuci-ferase de 18 espécies de besouros Iuminescentes e Iuciferase de Arachno-campa richardsae.

Figura 6B - Alinhamento das seqüências de aminoácidos da Iuci-ferase de 18 espécies de besouros Iuminescentes e Iuciferase de Arachno-campa richardsae continuada da Figura 6A.

Figura 6C - Alinhamento das seqüências de aminoácidos da Iuci-ferase de 18 espécies de besouros Iuminescentes e Iuciferase de Arachno-campa richardsae continuada da Figura 6B.

Figura 6D - Alinhamento das seqüências de aminoácidos da Iuci-ferase de 18 espécies de besouros Iuminescentes e Iuciferase de Arachno-campa richardsae continuada da Figura 6C.Figura 6E - Alinhamento das seqüências de aminoácidos da Iuci-ferase de 18 espécies de besouros Iuminescentes e Iuciferase de Arachno-campa richardsae continuada da Figura 6D.

Figura 7 - Posição de Arachnocampa richardsae na filogenia mo-lecular de outras Iuciferases da superfamília da acil-CoA ligase.

Figura 8 - Expressão dos peptídeos da invenção de GWLuc#1.Números das raias são da esquerda para a direita. A primeira raia apresentapadrões de peso molecular, marcados em quiloDaltons (KD). Outras raiasapresentam cepa de E. coli BL21 (DE3) transformada com pETDuet-1 :FFLuc(Raias 3 - 5) e pETDuet-1 :GWLuc#1 (Raias 6 - 8). As raias 4 e 7 apresentamamostras de culturas incubadas por 48 horas sem IPTG. As raias 3 e 6 apre-sentam amostras de pré-indução das culturas. As raias 5 e 8 apresentamamostras de culturas incubadas por 48 horas na presença de IPTG a 0,4 mMe expressando os constructos relevantes.

Figura 9 - Seqüência de aminoácidos natural da Iuciferase devaga-lume, Photinus pyralis (FF luciferase, SEQ ID NO: 4).

Figura 10 - Seqüência de ácidos nucleicos codificando uma luci-ferase de A. fiava (SEQ ID NO: 5).

Figura 11 - Seqüência de ácidos nucleicos de luciferase de A.fiava (SEQ ID NO: 6).

Figura 12 - Seqüência de ácidos nucleicos codificando uma luci-ferase de A. girraweenensis (SEQ ID NO: 7).

Figura 13 - Seqüência de aminoácidos codificando uma lucifera-se de A. girraweenensis (SEQ ID NO: 8).

Figura 14 - Seqüência de ácidos nucleicos codificando uma luci-ferase de A. tasmaniensis (SEQ ID NO: 9).

Figura 15 - Seqüência de aminoácidos de luciferase de A. tas-maniensis (SEQ ID NO: 10).

Figura 16 - Intensificação da bioluminescência por Iuciferases dainvenção.

Figura 17 - Respostas quantitativas de bioluminescência porquantidades crescentes de Iuciferases da invenção.Figura 18 - Curva de calibração.

Figura 19 - Desnaturação por calor elimina a atividade de biolu-minescência.

Figura 20 - Bioluminescência é dependente da Iuciferina e ATP.

Figura 21 - Atividade de bioluminescência é específica aos pep-tídeos da invenção.

Figura 22 - Peptídeos da invenção não utilizam celentarazinacomo substrato.

Figura 23 - Bioluminescência máxima produzida por peptídeosda invenção ocorre em comprimentos de onda de menos de 530 ± 5 nm.

Figura 24 - Expressão da atividade de bioluminescência da in-venção em leveduras.

Figura 25A - Alinhamento de seqüência múltipla de quatro peptí-deos de Iuciferase de Arachnocampa.

Figura 25B - Alinhamento da Figura 25A continuado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As seguintes descrições detalhadas de modalidades e exemplosparticulares são oferecidos a título de ilustração e não a título de limitação. Anão ser que seja contraindicado ou notado de outra forma, nessas descri-ções e através dessa especificação, os termos "um" e "uma" significam umou mais. Semelhantemente, o termo "ou" significa "e/ou".

Por "compreendendo" se entende incluindo, mas sem se limitar,ao que seguir a palavra "compreendendo". Dessa forma, o uso do termo"compreendendo" indica que os elementos listados são requeridos ou man-datórios, mas que outros elementos são opcionais e podem ou não estarpresentes. Por "consistindo em" se entende incluindo, e limitado ao que se-guir a frase "consistindo em". Dessa forma, a frase "consistindo em" indicaque os elementos listados são requeridos ou mandatórios, e que nenhumoutro elemento pode estar presente. Por "consistindo essencialmente em" seentende incluindo quaisquer elementos listados após a frase, e limitados aoutros elementos que não interferem com ou contribuem para a atividade ouação especificada na descoberta para os elementos listados. Dessa forma, afrase "consistindo essencialmente de" indica que os elementos listados sãorequeridos ou mandatórios, mas que outros elementos são opcionais e po-dem ou não podem estar presentes, dependendo se ou não eles afetam aatividade ou ação dos elementos listados.

Onde uma faixa de valores é fornecida, se entende que cadavalor interveniente, entre o limite superior e inferior daquela faixa, e qualqueroutro valor estabelecido ou interveniente naquela faixa estabelecida é englo-bado na invenção. Os limites superior e inferior dessas faixas menores po-dem ser independentemente incluídos nas faixas menores, e também sãoenglobados na invenção, submetidos a qualquer limite especificamente in-cluído na faixa estabelecida.

Moléculas de peptídeo

A presente invenção proporciona seqüências de nucleotídeosque codificam moléculas de peptídeos que foram identificadas como sendomembros da família de proteínas da enzima luciferase. As seqüências depeptídeos fornecidas, assim como variantes óbvias aqui descritas, particu-larmente variantes congêneres conforme aqui identificadas e usando a in-formação fornecida aqui, serão referidas como enzimas, peptídeos de enzi-ma, peptídeos ou proteínas da presente invenção.

A presente invenção, em um aspecto, proporciona moléculas deproteína e peptídeo isoladas que consistem em, ou consistem essencialmen-te em, ou compreendem seqüências de aminoácidos dos peptídeos da en-zima revelados nas Figuras 2, 3, 5, 11, 13, 15 ou SEQ ID Nos: 2, 6, 8 e 10ou codificadas pelas moléculas de ácido nucleico mostradas nas Figuras 1,2, 4, 5, 10, 12, 14 ou SEQ ID Nos: 1, 3, 11, 13 e 15, assim como todas asvariantes óbvias dessas que estão dentro da técnica para fazer e usar. Al-gumas dessas variantes são descritas em detalhes abaixo.

Conforme aqui utilizado, um peptídeo é dito como sendo "isola-do" ou "purificado" quando ele é substancialmente livre de material celular oulivre de precursores químicos ou outras substâncias químicas. Os peptídeosda presente invenção podem ser purificados até a homogeneidade ou outrosgraus de pureza. O nível de purificação será baseado no uso tencionado.(Características de uma molécula de ácido nucleico isolada são discutidasabaixo).

Em alguns usos, "substancialmente livre de material celular" in-clui preparações do peptídeo tendo menos do que cerca de 30% (em pesoseco) de outras proteínas (isto é, proteína contaminante), menos do que20% de outras proteínas, menos do que cerca de 10% de outras proteínasou menos do que cerca de 5% de outras proteínas. Quando o peptídeo érecombinantemente produzido, ele também pode ser substancialmente livrede meio de cultura, isto é, meio de cultura representa menos do que cercade 20% do volume da preparação de proteína.

A linguagem "substancialmente livre de precursores químicos ououtras substâncias químicas" inclui preparações do peptídeo nas quais ele éseparado de precursores químicos ou outras substâncias químicas que es-tão envolvidas na sua síntese. Em uma modalidade, a linguagem "substan-cialmente livre de precursores químicos ou outras substâncias químicas"inclui preparações do peptídeo da enzima tendo menos do que cerca de30% (em peso seco) de precursores químicos ou outros substâncias quími-cas, menos do que cerca de 20% de precursores químicos ou outras subs-tâncias químicas, menos do que cerca de 10% de precursores químicos ououtras substâncias químicas, ou menos do que 5% de precursores químicosou outras substâncias químicas.

O peptídeo da enzima isolado pode ser purificado a partir de cé-lulas que naturalmente a expressam, purificado a partir de células que foramalteradas para expressá-lo (recombinante) ou sintetizado usando métodosde síntese de proteína comuns. Por exemplo, uma molécula de ácido nuclei-co codificando o peptídeo da enzima é clonado em um vetor de expressão, ovetor de expressão introduzido em uma célula hospedeira e a proteína ex-pressa na célula hospedeira. A proteína pode, dessa forma, ser isolada dascélulas por um esquema de purificação apropriado usando técnicas de puri-ficação de proteína-padrões. Muitas dessas técnicas estão descritas em de-talhes abaixo.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona proteínas queconsistem nas seqüências de aminoácidos fornecidas. Uma proteína consis-te em uma seqüência de aminoácidos quando a seqüência de aminoácidos éa seqüência de aminoácidos final da proteína.

Em um aspecto adicional, a presente invenção ainda proporcio-na proteínas que consistem essencialmente nas seqüências de aminoácidosfornecidas. Uma proteína consiste essencialmente em uma seqüência deaminoácidos quando tal seqüência de aminoácidos está presente com so-mente alguns resíduos de aminoácidos adicionais, por exemplo, de cerca de1 até cerca de 100 ou resíduos aproximados adicionais, tipicamente de 1 atécerca de 20 resíduos adicionais na proteína final.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção proporcionaproteínas que compreendem as seqüências de aminoácidos fornecidas.

Uma proteína compreende uma seqüência de aminoácidos quando a se-qüência de aminoácidos é pelo menos parte da seqüência de aminoácidosfinal da proteína. De tal forma, a proteína pode ser somente o peptídeo outer moléculas de aminoácido adicionais, tais como resíduos de aminoácidos(seqüência codificada contígua) que são naturalmente associadas com elaou seqüências de peptídeo ou resíduos de aminoácidos heterólogos. Talproteína pode ter alguns resíduos de aminoácidos adicionais ou pode com-preender várias centenas ou mais de aminoácidos adicionais. Uma brevedescrição de como vários tipos dessas proteínas podem ser feitas ou isola-das é fornecida abaixo.

Os peptídeos da enzima da presente invenção podem estar liga-dos a seqüencias heterólogas para formar proteínas de fusão ou quiméricas.

Tais proteínas de fusão e quiméricas podem compreender um peptídeo deenzima operativamente ligado a uma proteína heteróloga com uma seqüên-cia de aminoácidos não-substancialmente homóloga ao peptídeo da enzima.

"Operativamente ligado" indica que o peptídeo da enzima e a proteína hete-róloga estão fundidos de forma que a operabilidade de cada um não é des-truída. A proteína heteróloga pode estar fundida ao N-término ou C-términodo peptídeo da enzima.

Em alguns usos, a proteína de fusão não afeta a atividade dopeptídeo da enzima per se. Por exemplo, a proteína de fusão pode incluir,mas não está limitada, a proteínas de fusão enzimáticas, por exemplo, fu-sões de beta-galactosidase, fusões GAL de dois híbridos de levedura, fu-sões poli-HIS, etiquetadas com MYC, etiquetadas com Hl e fusões Ig. Taisproteínas de fusão, particularmente fusões poli-His, podem facilitar a purifi-cação do peptídeo da enzima recombinante. Em certas células hospedeiras(por exemplo, células hospedeiras de mamíferos), a expressão da secreçãode uma proteína pode ser aumentada pelo uso de seqüência de sinal heteró-loga.

Em alguns usos, a proteína de fusão pode ser um componentede um ensaio de complementação de proteína, ou PCA1 em que uma enzimaativa é dividida em dois domínios, cada um fundido ou ligado a domínios in-fluenciadores que são mantidos juntos pela atração com uma terceira molé-cula de forma que a atividade da enzima original seja restaurada. Ver, porexemplo, Patentes Americanas 6.270.964 e 6.342.345.

Uma proteína quimérica ou de fusão pode ser produzida por téc-nicas de DNA recombinantes. Por exemplo, fragmentos de DNA codificandopara as diferentes seqüências de proteína são ligados juntos na estrutura deacordo com técnicas convencionais. Em outra modalidade, o gene de fusãopode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizadores deDNA automatizados. Alternativamente, amplificação por PCR ou ligação dosfragmentos de gene pode ser executada usando iniciadores âncora os quaisgeram projeções complementares entre dois fragmentos de gene consecuti-vos os quais podem ser subseqüentemente anelados e reamplificados paragerar uma seqüência de gene quimérica (ver Ausubel et at, Current Proto-cols in Molecular Biology, 1998). Além disso muitos vetores de expressãosão comercialmente disponíveis que já codificam uma porção de fusão (porexemplo, uma proteína GST). Um ácido nucleico codificante de peptídeo deenzima pode ser clonado em tal vetor de expressão de forma que a porçãode fusão esteja ligada em estrutura ao peptídeo da enzima, a qual é umaforma pela qual a proteína de fusão é feita sem destruir a operabilidade decada componente.Conforme mencionado acima, a presente invenção também pro-porciona e capacita variantes óbvias da seqüência de aminoácidos das pro-teínas da presente invenção, tais como formas maduras de ocorrência natu-ral do peptídeo, variantes de seqüência ou alélicas dos peptídeos, variantesderivadas recombinantemente de ocorrência não-natural dos peptídeos eortólogos e parálogos dos peptídeos. Ortólogos e análogos dos presentespeptídeos que podem ser isolados do gênero Arachnocampa (Diptera) comoentendidas por aqueles indivíduos versados na técnica são modalidades pre-feridas dos peptídeos da invenção. Tais variantes podem ser prontamentegeradas usando técnicas conhecidas na técnica nos campos da tecnologiade ácido nucleico e bioquímica de proteína. É entendido, entretanto, que va-riantes excluem quaisquer seqüências de aminoácidos completas reveladasantes da invenção.

Tais variantes podem ser prontamente identificadas ou feitasusando técnicas moleculares e a informação de seqüência aqui revelada.Além disso, tais variantes podem ser prontamente distinguidas de outrospeptídeos baseando-se na seqüência ou homologia estrutural para os peptí-deos da enzima da presente invenção. O grau de identidade presente serábaseado primariamente em se o peptídeo é uma variante funcional ou vari-ante não-funcional, na quantidade de divergência presente na família de pa-rálogo e na distância evolucionária entre os ortólogos.

Para determinar a identidade porcentual de duas seqüências deaminoácidos ou de duas seqüências de nucleotídeos, as seqüências sãoalinhadas para propósitos de comparação ótima (por exemplo, intervalospodem ser introduzidos em uma ou em ambas de um primeiro e de um se-gundo aminoácido ou seqüência de nucleotídeo para o alinhamento ótimo eseqüências não-homólogas podem ser desconsideradas para propósitos decomparação). Em uma modalidade preferida, pelo menos 30%, 40%, 50%,60%, 70%, 80%, ou 90% ou mais do comprimento de uma seqüência de re-ferência é alinhado para propósitos de comparação. Os nucleotídeos ou re-síduos de aminoácidos nas correspondentes posições de nucleotídeos ouposições de aminoácidos são, a seguir, comparados. Quando uma oosicãona primeira seqüência é ocupada pelo menos resíduo de aminoácido ou nu-cleotídeo como a correspondente posição na segunda seqüência, então asmoléculas são idênticas naquela posição (conforme aqui utilizado, "identida-de" de aminoácido ou ácido nucleico é equivalente a "homologia" de amino-ácido ou ácido nucleico). A identidade porcentual entre as duas seqüênciasé uma função da quantidade de posições idênticas compartilhadas pelasseqüências, levando em consideração a quantidade de intervalos, e a exten-são de cada intervalo, o qual precisa ser introduzido para o alinhamento óti-mo das duas seqüências.

Variantes preferivelmente têm pelo menos 60% de identidade deseqüência com a seqüência de aminoácidos estabelecida nas Figuras 2, 3ou 5 ou na SEQ ID NO: 2, mais preferivelmente pelo menos 70, 80, 90, 05,98 ou 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidosestabelecida nas Figuras 2, 3 ou 5 ou na SEQ ID NO: 2.

Alternativamente, conforme mencionado acima, a identidade deseqüência pode ser calculada em relação a regiões particulares do peptídeo,por exemplo, a bolsa de ligação de luciferina. Uma comparação de seqüên-cias da seqüência de aminoácidos da Iuciferase de Arachnocampa spp esta-belecida na SEQ ID NO: 2 e aquela de Photinus pyralis, um membro repre-sentativo das Iuciferases de besouro, mostra que a identidade de seqüênciaem relação à região da bolsa de ligação de luciferina, a qual é localizada emaproximadamente nos aminoácidos 201 a 350 da SEQ ID NO: 2 é de 28%,enquanto a identidade de seqüência em relação à região C-terminal, os ami-noácidos 351 a 530 da SEQ ID NO: 2, é de cerca de 41% (Tabela 6). A iden-tidade de seqüência em relação aos aminoácidos N-terminais de 1 a 200 éde cerca de 29%. Concordantemente, um peptídeo da invenção preferivel-mente compreende uma seqüência de aminoácido contígua com pelo menos50% de identidade de seqüência co os aminoácidos 201 a 350 da SEQ IDNO: 2, mais preferivelmente pelo menos 60, 70, 80, 90, 95, 98 ou 99% deidentidade de seqüência com os aminoácidos 201 a 350 da SEQ ID NO: 2.

Alternativamente, ou além disso, um peptídeo da invenção preferivelmentecompreende uma seqüência de aminoácido contígua com pelo menos 50%de identidade de seqüência com os aminoácidos 351 a 530 da SEQ ID NO:2, mais preferivelmente pelo menos 60, 70, 80, 90, 95, 98 ou 99% de identi-dade de seqüência com os aminoácidos 351 a 530 d SEQ ID NO: 2. Umpeptídeo da invenção também pode compreender uma seqüência de amino-ácidos contígua com pelo menos 50% de identidade de seqüência com osaminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 2, mais preferivelmente pelo menos 60,70, 80, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de seqüência com os aminoácidos201 a 350 da SEQ ID NO: 2.

Uma comparação das seqüências de aminoácido da Iuciferasede 10 besouros Iuminescentes identifica 128 resíduos que são completa-mente conservados. Quando os resíduos correspondentes da espécie Ara-chnocampa são comparados, 55 daqueles resíduos diferem (mais 3 anula-ções). Os 55 resíduos que diferem na A. richardsae são estabelecidos naTabela 5. Peptídeos preferidos compreendem uma seqüência de aminoáci-dos compreendendo resíduos de aminoácidos correspondendo aos 55 resí-duos de aminoácidos estabelecidos na Tabela 5, a saber, Y26, A54, T64,D84, Y89, Y90, I92, C104, W110, D114, 1140, P161, T197, Q211, S219,D221, K226, Q235, Y236, N238, M246, R248, Y266, F273, K291, E293,R304, S308, T311, V312, F332, S335, S336, H367, A372, F381, S400,Y409, V410, N419, I433, V434, M435, V436, D437, A440, T444, I450, L477,T478, R481, L497, K504, C507, A518. Outros peptídeos preferidos compre-endem uma seqüência de aminoácidos compreendendo resíduos de amino-ácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos estabelecidos na Ta-bela 5, os quais se baseiam na bolsa de ligação de Iuciferina em de aproxi-madamente os aminoácidos 201 a 350, a saber, Q211, S219, D221, K226,Q235, Y236, N238, M246, R248, Y266, F273, K291, E293, R304, S308,T311, V312, F332, S335, S336.

A comparação das seqüências e a determinação da identidadeporcentual e da similaridade entre as duas seqüências pode ser efetuadausando um algoritmo matemático. (Computational Molecular Biology, Lesk,A. M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing: Infor-matics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova Ior-que, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin1 A. M., eGriffiη, Η. G., eds., Humana Press, Nova Jérsei, 1994; Sequence Analysis inMolecular Biology, von Heinje, G., Aeademie Press, 1987; e Sequenee A-nalysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stoekton Press, NovaIorque, 1991).

Em modalidades preferidas, alinhamentos de seqüência múlti-plos e árvores filogenéticas são derivadas usando os programas PROTMLou PROTPARS: PROTML (Adachi, J. e Hasegawa, M. 1996: Molphy versão2.3. Programas para filogenética molecular baseado na probabilidade máxi-ma. Monografia de Computer Science No. 28. Uma publicação do Institute ofStatistical Mathematics, Tóquio)); e PROTPARS (Felsenstein, J. 1989. PH-YLIP - Pacote de programas de inferência de filogenia (versão 3.2). Cladis-tics 5: 164-166).

Alinhamentos em pares e níveis de identidade e homologia deseqüência são determinados usando o programa BestFit no pacote de pro-gramas de computador GCG. A identidade porcentual entre duas seqüênciasde aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman eWunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), o qual foi incorporado no progra-ma GAP no pacote de programas de computador GCG. O algoritmo é em-pregado usando ou uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e umpeso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A identidade porcentual entre duas seqüências de nucleo-tídeo pode ser determinada usando o programa GAP (Devereux, J., et al„Nucleie Acids Res. 12(1):387 (1984)) com uma matriz NSWgapdna.CMP eum peso de intervalo de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de1, 2, 3, 4, 5 ou 6,

As seqüências de ácido nucleico e de proteína da presente in-venção podem ainda ser usadas como a "seqüência de consulta" para efe-tuar uma busca contra os bancos de dados da seqüência para, por exemplo,identificar outros membros da família ou seqüências relacionadas. Tais bus-cas podem ser efetuadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão2.0) de Altschul, et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)). Buscas de nucleotí-deo BLAST podem ser efetuadas com o programa NBLAST, pontuação =100, comprimento de palavra = 12 para obter seqüências de nucleotídeoshomólogas às moléculas de ácido nucleico da invenção, buscas de proteínaBLAST podem ser efetuadas com o programa XBLAST, pontuação = 50,comprimento de palavra = 3 para obter seqüências de aminoácidos homólo-gas às proteínas da invenção. Para obter alinhamentos intervalados parapropósitos de comparação, BLAST intervalado pode ser utilizado conformedescrito em Altschul et ai. (Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997)). Aoutilizar os programas BLAST e BLAST intervalado, os parâmetros predefini-dos dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podemser usados.

Formas pré-processadas de comprimento total, assim como for-mas processadas maduras de proteínas que compreendem um dos peptí-deos da presente invenção, podem ser prontamente identificadas como ten-do a identidade de seqüência completa para um dos peptídeos da enzima dapresente invenção como sendo codificados por um ácido nucleico que codifi-ca o peptídeo da enzima aqui fornecido.

Variantes alélicas de um peptídeo de enzima podem ser pronta-mente identificadas como sendo um peptídeo de Iuciferase de Arachnocam-pa com um alto grau de identidade de seqüência para pelo menos uma por-ção dos peptídeos da enzima aqui revelados. Conforme aqui utilizado, duasproteínas (ou uma região das proteínas) têm um alto grau de identidade deseqüência quando as seqüências de aminoácidos são de tipicamente cercade pelo menos cerca de 70 - 80%, 80 - 90%, e de forma mais elevada pelomenos cerca de 90 - 95% ou mais de homólogos. Uma seqüência de amino-ácidos significativamente homóloga, de acordo com a presente invenção,será codificada por uma seqüência de nucleotídeos que irá hibridizar parauma molécula de ácido nucleico codificando um peptídeo de Iuciferase deArachnocampa sob condições estringentes conforme mais completamentedescrito abaixo.

Ortólogos de um peptídeo de enzima podem ser prontamenteidentificados como tendo algum grau de identidade de seqüência sianificati-va para pelo menos uma porção do peptídeo de enzima, assim como sendocodificado por um gene de outro organismo. Ortólogos preferidos serão iso-lados de organismos classificados como membros do gênero Arachnocampa(Diptera). Tais ortólogos serão codificados por uma seqüência de nucleotí-deos que irá hibridizar para uma nova molécula de ácido nucleico aqui reve-lada sob condições de moderada a estringente, conforme mais completa-mente descrito abaixo, dependendo do grau de relacionamento dos dois or-ganismos produzindo as proteínas.

Variantes de ocorrência não-naturais dos peptídeos da enzimada presente invenção podem ser prontamente geradas usando técnicas re-combinantes. Tais variantes incluem, mas não estão limitadas, a anulações,adições e substituições na seqüência de aminoácidos do peptídeo da enzi-ma. Por exemplo, uma classe de substituições é a substituição de aminoáci-dos conservados. Tais substituições são aquelas que substituem um dadoaminoácido em um peptídeo de enzima por outro aminoácido de característi-cas semelhantes. Tipicamente vistas como substituições conservativas sãoas substituições, uma por outra, dentre os aminoácidos alifáticos Ala, Vai,Leu e lie; a permutação dos resíduos de hidroxila Ser e Thr; a troca dos re-síduos ácidos Asp e Glu; a substituição entre os resíduos de amida Asn eGln; a troca dos resíduos básicos Lys e Arg; e as substituições entre os resí-duos aromáticos Phe e Tyr. Orientação envolvendo quais alterações de ami-noácidos são prováveis de serem fenotipicamente silenciosas são encontra-das em Bowie etal., Science 247:1306-1310 (1990).

Peptídeos de enzima variante podem ser inalterados em todasas funções em comparação com aquelas de um peptídeo funcional, por e-xemplo, aquele da SEQ ID NO: 2, ou podem consistir em uma função altera-da ou mesmo de falta de função em uma ou mais atividades, por exemplo,capacidade de se ligar ao substrato, ou alteração no espectro de emissão.

Variantes funcionais podem conter somente variação conservativa ou varia-ção em resíduos não-críticos ou em regiões não-críticas. Figura 6, Tabelas 3e 5, e outros detalhes aqui podem ser usados para identificar domí-nios/regiões críticas. Variantes funcionais também podem conter substituiçãode aminoácidos similares que resultam em nenhuma alteração ou em umaalteração insignificante na função.

Em uma modalidade, as variantes têm atividade luciferase, cujaatividade luciferase compreende a catálise de um reação Iuminescente de-pendente de ATP, a reação de luminescência gera um espectro de emissãocom uma intensidade de emissão máxima em comprimentos de onda meno-res do que ou iguais a 530 nm. Preferivelmente, as variações têm pelo me-nos 25% de atividade luciferase da luciferase da SEQ ID NO: 2, mais prefe-rivelmente pelo menos 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% da atividade de lucife-rase da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade particularmente preferida, asvariantes têm pelo menos a atividade luciferase da luciferase da SEQ ID NO:2, ou uma atividade maior.

Alternativamente, substituições de aminoácidos podem alterar afunção em algum grau. Tais variantes tipicamente contêm uma ou maissubstituições de aminoácidos não-conservativas, anulações, inserções, in-versões ou corte ou uma substituição, inserção, inversão ou anulação emum resíduo crítico ou região crítica. Semelhantemente, Figura 6, Tabelas 3 e5, e os outros detalhes aqui podem ser usados para identificar tais altera-ções em domínios/regiões críticas. Variantes da função alterada tambémpodem conter substituição de aminoácidos similares que resultam em ne-nhuma alteração ou em uma alteração insignificante na função.

Aminoácidos que são essenciais para a função também podemser identificados por métodos conhecidos na técnica, tais como mutagênesedirecionada a sítio ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham etal., Science 244:1081-1085 (1989). O último procedimento introduz muta-ções de alanina individuais em cada resíduo na molécula. As moléculas mu-tantes resultantes são, a seguir, testadas para atividade biológica, por e-xemplo, atividade enzimática ou alteração do seu espectro de emissão nosensaios. Sítios que são críticos para a ligação de parceiro/ligação de subs-trato podem também ser determinados por análise estrutural tal como crista-lização, ressonância magnética nuclear ou marcação por fotoafinidade (Smi-th et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992); de Vos et al. Science 255: 306-312 (1992)). A estrutura cristalina da Iuciferase de Photinus é conhecida(Conti et al. Structure 4:287-298 (1996) e pode ser referida quando efetuan-do a identificação dos aminoácidos essenciais para a função. Ver, por e-xemplo, Nakatsu et al. (2006).

Seqüências de peptídeo de enzima ou peptídeo são escritas eas posições dos aminoácidos numeradas da metionina iniciante, a qual énumerada "1", até o aminoácido carboxiterminal. Um aminoácido particularem uma posição particular é indicado com a designação de uma letra do a-minoácido, por exemplo, M para MET ou metionina, seguido pelo número daposição do aminoácido relevante, por exemplo, M1 para a metionina inicial.

Conforme será claro a partir do contexto, em algumas comparações das se-qüências de aminoácidos do peptídeo da invenção com outras, tais comoIuciferases de Photinus, a ordem na qual a comparação é descrita indica aseqüência de aminoácidos relevante para a qual a posição recitada se refe-re. Dessa forma, resíduos na Iuciferase de Arachnocampa richardsae quediferem da Iuciferase de Photinus pyralis podem estar no ditado como, porexemplo, A343I351, a qual indica que a alanina na posição 343 da seqüên-cia de Arachnocampa corresponde à isoleucina na posição 351 de P. pyralis.

Semelhantemente, DEL 213-214 R218 indica uma anulação de arginina naposição 218 da P. pyralis que poderia, se a arginina estivesse presente, caientre os resíduos 213 e 214 da seqüência de Arachnocampa. Ver, por e-xemplo, os alinhamentos fornecidos como Figura 6A até a Figura 6E.

Uma substituição na posição em uma seqüência de aminoácidoou peptídeo é indicada por uma designação de letra para o aminoácido, se-guido pelo número da posição da seqüência não-substituída relevante oupeptídeo, seguido por uma ou mais das designações de letra para a substitu-ição de aminoácidos. Dessa forma, por exemplo, a substituição de Ieucinana posição 342 da Iuciferase de Photinus pyralis natural com uma serina po-deria ser designada como L342S. Designações similares serão claras a par-tir do contexto e outros detalhes fornecidos aqui. Por exemplo, uma designa-ção alternativa para L342S pode ser indicada como L342->S. Semelhante-mente, a mesma alteração nas seqüências de Iuciferase adicionais pode serindicada com referência a qualquer tal seqüência como "substituição de Leucom Ser na posição de alinhamento com Leu342 da SEQ ID NO: 4".

A presente invenção proporciona ainda fragmentos dos peptí-deos, além das proteínas e peptídeos que compreendem e consistem emtais fragmentos, particularmente aqueles compreendendo os resíduos identi-ficados nas Figuras 2, 3, 5 e na SEQ ID NO: 2. Os fragmentos para os quaisa invenção pertence, entretanto, não são para serem construídos como en-globando fragmentos que podem ser revelados de forma pública antes dapresente invenção.

Fragmentos de peptídeos da invenção incluindo o N-término damolécula podem ser gerados por engenharia genética ou sítios de parada detradução em uma região codificadora. Alternativamente, o tratamento do po-lipeptídeo com enzimas proteolíticas, conhecidas como proteases, podemproduzir uma variedade de fragmentos N-terminal, C-terminal e internos. Emcertas modalidades, peptídeos podem ser sintetizados por métodos conhe-cidos. Exemplos de fragmentos podem incluir resíduos contíguos de 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40,45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500 ou mais ami-noácidos em comprimento. Esses fragmentos podem ser purificados de a-cordo com métodos conhecidos, tais como precipitação (por exemplo, comsulfato de amônio), HPLC, cromatografia de troca iônica, cromatografia porafinidade (incluindo cromatografia por imunoafinidade) ou várias separaçõesde tamanho (sedimentação, eletroforese de gel, filtração em gel).

Tais fragmentos podem ser escolhidos baseando-se na capaci-dade de reter uma ou mais das atividades biológicas do peptídeo da enzimaou poderiam ser escolhidos a partir da capacidade de efetuar uma função,por exemplo, ligar um substrato ou agir como um imunógeno. Fragmentosparticularmente importantes são fragmentos biologicamente ativos, peptí-deos que são, por exemplo, cerca de 10 ou mais aminoácidos de compri-mento. Tais fragmentos irão tipicamente compreender um domínio ou porçãodo peptídeo da enzima, por exemplo, sítio ativo, um domínio transmembra-na, um domínio de ligação a substrato ou uma porção enzimaticamente ativado peptídeo da enzima. Além disso, possíveis fragmentos incluem, mas nãoestão limitados, a fragmentos contendo domínio ou porção, fragmentos depeptídeo solúveis e fragmentos contendo estruturas imunogênicas. domíniosprevistos e sítios funcionais são prontamente identificáveis por programas decomputador bem-conhecidos e prontamente disponíveis pra as pessoas ver-sadas na técnica (por exemplo, análise de PROSITE).

Em uma modalidade, os fragmentos têm atividade luciferase,cuja atividade luciferase compreende a catálise de uma reação de Iumines-cência dependente de ATP, a reação de luminescência gera um espectro deemissão com um máximo de intensidade de emissão em comprimentos deonda menores do que ou iguais a 530 nm. Preferivelmente, os fragmentostêm pelo menos 25% da atividade da luciferase da luciferase da SEQ ID NO:2, mais preferivelmente pelo menos 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% da ativi-dade da luciferase da luciferase da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade par-ticularmente preferida, os fragmentos têm pelo menos a atividade da lucife-rase da luciferase da SEQ ID NO: 2, ou uma atividade maior.

Polipeptídeos da invenção podem conter aminoácidos diferentesdos 20 aminoácidos comumente referidos como os 20 aminoácidos de ocor-rência natural. Além disso, muitos aminoácidos, incluindo os aminoácidosterminais, podem ser modificados por processos naturais, tais como peloprocessamento e outras modificações pós-traducionais, ou por técnicas demodificação química bem-conhecidas na técnica. Modificações comuns queocorrem naturalmente em peptídeos de enzima são descritas em textos bá-sicos, monografias detalhadas e na literatura de pesquisa, e elas são bem-conhecidas pelas pessoas versadas na técnica.

Modificações conhecidas incluem, mas não estão limitadas, aacetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente da flavi-na, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um nucleo-tídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou deriva-do de lipídeo, ligação covalente de fosfotidilinositol, ligação cruzada, cicliza-ção, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de ligaçõescruzadas covalentes, formação de cistina, formação de piroglutamato, formi-lação, gama carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI1 hidroxila-ção, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico,fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfação, adição media-da por RNA-transferência de aminoácidos para proteínas tais como arginila-ção e ubiquitinação.

Tais modificações são bem-conhecidas pelos indivíduos versa-dos na técnica e foram descritas em maiores detalhes na literatura científica.Várias modificações particularmente comuns, glicosilação, ligação de lipídeo,sulfatação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilaçãoe ADP-ribosilação, por exemplo, são descritas na maioria dos textos básicos,tais como Proteins-Structure and Molecular Properties, 2a Ed., Τ. E. Creigh-ton, W. H. Freeman and Company1 Nova Iorque (1993). Muitas revisões de-talhadas estão disponíveis nesse assunto, tais como por Wold, F., Posttrans-Iational Covalent Modification of Proteins1 B. C. Johnson, Ed., AcademicPress, Nova Iorque 1-12 (1983); Seifter et aí. (Meth. Enzymol. 182: 626-646(1990)) e Rattan et al. (Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 663: 48-62 (1992)).

Concordantemente, os peptídeos da enzima da presente inven-ção também englobam derivados ou análogos nos quais um resíduo de ami-noácido substituído não é aquele codificado pelo código genético, no qualum grupo substituinte é incluído, no qual o peptídeo de enzima madura éfundido com outro composto, tal como com um composto para aumentar ameia-vida do peptídeo da enzima (por exemplo, polietilenoglicol), ou no qualos aminoácidos adicionais são fundidos com o peptídeo de enzima madura,tal como uma seqüência líder ou secretória ou uma seqüência para a purifi-cação do peptídeo de enzima madura ou uma seqüência de pró-proteína.Usos de proteína/peptídeo

Os usos potenciais dos peptídeos da presente invenção são ba-seados primariamente na fonte da proteína, assim como na classe/ação daproteína. Tais usos podem ser prontamente determinados usando a informa-ção aqui fornecida, que o qual é conhecido na técnica, e a experimentaçãorotineira. As proteínas da presente invenção (incluindo variantes e fragmen-tos que podem ser revelados antes da presente invenção) são úteis paraensaios biológicos relacionados com enzimas que estão relacionadas commembros das luciferases. Tais ensaios envolvem qualquer uma das funçõesou atividades ou propriedades das luciferases comuns, de um modo geral.Os peptídeos, fragmentos ou luciferases da presente invenção podem tam-bém ser usados em qualquer método ou composição conhecido das pesso-as versadas na técnica e para o qual o peptídeo ou fragmento de Iuciferasepode ser adequadamente colocado. Uma lista não-exclusiva de aplicaçõesexemplares inclui aqueles revelados nas Patentes Americanas Nos.6.927.037; 6.690.461; 6.602.658; 6.602.657; 6.586.196; 6.503.723;6.297.018; 6.171.809; 6.143.502; e 6.068.979. Além disso, modalidades dainvenção são adequadas para aplicação, tais como o parceiro excitatório natécnica conhecida como Transferência de Energia de Ressonância de Bio-luminescência (BRET) (Ver, por exemplo, WO/1999/066324).

As proteínas da presente invenção podem ser usadas para pro-mover anticorpos ou para eliciar outra resposta imune; como um reagente(incluindo o reagente marcado) em ensaios projetados para determinarquantitativamente os níveis da proteína (ou seu parceiro ou Iigante de liga-ção) em fluidos biológicos; e como marcadores para tecidos nos quais a pro-teína correspondente está preferencialmente expressa. Onde a proteína seliga ou potencialmente se liga a outra proteína ou Iigante (tal como, por e-xemplo, em uma interação de enzima - proteína efetora ou interação enzima- ligante), a proteína pode ser usada para identificar a ligação do parcei-ro/ligante de forma a desenvolver um sistema para identificar inibidores dainteração de ligação. Qualquer um ou todos esses usos são capazes de se-rem desenvolvidos em grau reagente ou em formato de kit para comerciali-zação como produtos comerciais.

Métodos para efetuar os usos listados acima são bem-conhecidos por aqueles indivíduos versados na técnica. Referências reve-lando tais métodos incluem "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2aed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J. E. F. Fritsch e T.Maniatis eds., 1989, e "Methods in Enzymology: Guide to Molecular CloningTechniaues". Aeademic Press, Berger. S. L. e A. R. Kimmel eds.. 1987.Os polipeptídeos podem ser usados para identificar compostosque modulam a atividade enzimática da proteína no seu estado natural ouem uma forma alterada. Ambas as enzimas da presente invenção e varian-tes e fragmentos apropriados podem ser usados em varreduras de alta pro-dutividade para ensaiar compostos candidatos para a capacidade de se ligarà enzima ou participar nas reações de luminescência. Esses compostos po-dem ser adicionalmente testados contra uma enzima funcional para determi-nar o efeito do composto na atividade enzimática. Além disso, esses com-postos podem ser testados em animais ou em sistemas invertebrados paradeterminar a atividade/eficácia. Compostos também podem ser identificadosque ativam (agonistas) ou inativam (antagonistas) da enzima para um graudesejado.

Além disso, as proteínas da presente invenção podem ser usa-das para fazer a varredura de um composto para a capacidade de estimularou inibir a interação entre a proteína da enzima e uma molécula que nor-malmente interage com a proteína da enzima, por exemplo, um substrato ouum componente da via de sinalização que a proteína da enzima normalmen-te interage, ou cofatores envolvidos de combinação da proteína da enzimacom um composto candidato sob condições que permitem que a proteína daenzima, ou fragmento, interajam com a molécula-alvo, e detectem a forma-ção de um complexo entre a proteína e o alvo ou detectem a conseqüênciabioquímica da interação com a proteína da enzima e com o alvo, tal comouma reação de luminescência de Iuciferases ou uma etapa reacional indivi-dual da reação de luminescência.

Compostos candidatos incluem, por exemplo: (1) pequenas mo-léculas orgânicas e inorgânicas (por exemplo, moléculas obtidas a partir debibliotecas de produto natural ou combinatoriais sintéticas); (2) anticorpos(por exemplo, policlonais, monoclonais, humanizados, anti-idiotípicos, qui-méricos e anticorpos de cadeia individual assim como fragmentos de biblio-teca de expressão Fab, F(ab').sub.2, Fab, e fragmentos de ligação a epítopode anticorpos); (3) fosfopeptídeos (por exemplo, membros de bibliotecas defosfopeptídeos direcionados, parcial e aleatoriamente degenerados ver, porexemplo, Songyang et ai, Cell 72:767-778 (1993)); e (4) peptídeos tais comopeptídeos solúveis, incluindo peptídeos de fusão com uma cauda de Ig emembros de bibliotecas de peptídeo aleatórias (ver, por exemplo, Lam et al.,Nature 354: 82-84 (1991); Houghten et a!., Nature 354:84-86 (1991)) e biblio-tecas moleculares químico-derivadas combinatoriais feitas de aminoácidosde configuração D- ou L-.

Um composto candidato é um peptídeo variante da invenção quecompete para a ligação de substrato contra o peptídeo de, por exemplo,SEQ ID NO: 2. Outros compostos candidatos incluem enzimas mutantes oufragmentos apropriados contendo mutações que afetam a função da enzimae, dessa forma, competem por substrato. Concordantemente, um fragmentoque compete por substrato, por exemplo com uma afinidade maior, ou umfragmento que se liga ao substrato mas não permite a liberação, é engloba-do pela invenção.

A invenção ainda inclui outros ensaios de ponto final para identi-ficar compostos que modulam (estimulam ou inibem) a atividade enzimática.

Os ensaios tipicamente envolvem um ensaio de eventos na via de Iumines-cência que indicam a atividade enzimática. Qualquer uma das funções bioló-gica ou bioquímica mediadas pela enzima pode ser usada como um ensaiode ponto final. Especificamente, uma função biológica de uma célula ou teci-dos que expressa a enzima pode ser ensaiada.

As proteínas da presente invenção são úteis em ensaios de liga-ção por competição em métodos projetados para descobrir compostos queinteragem com a enzima (por exemplo, parceiros de ligação, Iigantes ousubstratos). Dessa forma, um composto é exposto a um polipeptídeo de en-zima sob condições que permitem que o composto se ligue a ou, de outraforma, interaja com o polipeptídeo. Polipeptídeo de enzima solúvel também éadicionado à mistura. Se o composto de teste interage com o polipeptídeode enzima solúvel, ele pode aumentar ou diminuir a quantidade de complexoformado ou atividade do alvo da enzima. Esse tipo de ensaio é particular-mente útil em casos nos quais são procurados compostos que interajam comregiões específicas da enzima. Dessa forma, o polipeptídeo solúvel quecompete com a região da enzima-alvo é designado para conter seqüênciasde peptídeos correspondendo à região de interesse.

Para efetuar os ensaios de varredura de células livres dos com-postos ou proteínas de interesse, é algumas vezes desejável imobilizar ou aproteína da enzima, ou fragmento, ou sua molécula-alvo para facilitar a se-paração dos complexos de formas não-complexadas de uma ou ambas.

Agentes que modulam uma das enzimas da presente invençãopodem ser identificados usando um ou mais dos ensaios acima, sozinhos ouem combinação. É geralmente preferível usar um sistema livre de células oubaseado em células primeiro e, a seguir, confirmar a atividade em qualqueroutro sistema modelo pode ser desejável. Tais sistemas de modelo sãobem-conhecidos na técnica e podem ser prontamente empregados nessecontexto. Essa invenção ainda inclui novos agentes ou substratos identifica-dos pelos ensaios de varredura acima descritos.

Os peptídeos da presente invenção também proporcionam alvospara o diagnóstico da atividade de proteína ativa, particularmente atividadese condições que são conhecidas para outras luciferases. Dessa forma, opeptídeo pode ser isolado a partir de uma amostra biológica e ensaiado paraa presença de uma mutação genética que resulte em um peptídeo aberran-te. Isso inclui substituição, anulação, inserção, rearranjo (como resultado deeventos de união aberrantes) e modificações pós-traducionais inapropriadasde aminoácidos. Métodos analíticos incluem mobilidade eletroforética altera-da, digestão de peptídeo tríptico alterada, atividade enzimática alterada emensaio baseado em célula ou livre de célula, alteração no substrato ou pa-drão de ligação de anticorpo, ponto isoelétrico alterado, seqüenciamento deaminoácido direto e qualquer outra das técnicas de ensaio conhecidas úteispara detectar mutações em uma proteína. Tal ensaio pode ser proporciona-do em um formato de detecção individual ou em um formato de detecçãomúltipla tal como em um arranjo de fragmento de anticorpo. Técnicas in vitropara a detecção de peptídeos incluem ensaios de imunossorvência ligados àenzima (ELISAs), Western blots, imunoprecipitações e imunofluorescência,usando um reagente de detecção, tal como um anticorpo ou aqente de liga-ção à proteína.

Ensaios de repórter múltiplos

Os presentes peptideos da invenção são particularmente ade-quados para uso em ensaios de múltiplos repórteres. Repórteres múltiplos,duais (ou duplos) são comumente usados para melhorar a precisão experi-mental. O termo "repórter múltiplo" se refere à medição e expressão simultâ-nea de duas ou mais enzimas repórteres individuais em um sistema indivi-dual. Quando usadas junto, essas enzimas repórteres individuais podem sernomeadas "correpórteres". Na reportagem genética, exemplos que atual-mente se beneficiam de ensaios de repórter duais incluem células individuaisou populações celulares (tais como células dispersas em cultura, tecidossegregados ou animais inteiros) geneticamente manipulados para expressarsimultaneamente dois diferentes genes repórteres. Mais freqüentemente,enquanto a atividade do segundo gene repórter proporciona um controle in-terno pelo qual todos os grupos de valores experimentais podem ser norma-lizados. A normalização da atividade do repórter experimental para a ativida-de do controle interno minimiza a variabilidade experimental causada, porexemplo, pelas diferenças na viabilidade celular ou eficiência de transfecção.Outras fontes de variabilidade, tais como diferenças em volumes de pipeta-gem, eficiência de Iise celular e eficiência de ensaio, podem ser eficiente-mente eliminadas. Dessa forma, ensaios repórter duais geralmente permitemuma interpretação mais confiável dos dados experimentais pela redução dasinfluências estranhas.

Exemplos que atualmente se beneficiam de ensaios empregan-do pelo menos dois repórteres (isto é, ensaios repórteres duais) incluem cé-lulas individuais ou populações celulares (tais como células dispersas emcultura, tecidos segregados ou animais inteiros) geneticamente manipuladospara expressar simultaneamente dois diferentes genes repórteres. Mais fre-qüentemente, a atividade de um gene reporta o impacto das condições ex-perimentais específicas, enquanto que a atividade do segundo gene repórterproporciona um controle interno pelo qual todos os grupos de valores expe-rimentais podem ser normalizados.Sistemas reconstituídos livre de células que podem se beneficiarda tecnologia repórter múltipla são Iisados celulares derivados para a tradu-ção simultânea, ou transcrição e tradução acoplada, de materiais genéticosindependentes que codificam enzimas repórteres de controle e experimen-tais. Imunoensaios podem, da mesma forma, ser projetados para a reporta-gem múltipla tanto dos valores experimentais quanto de controle dentro deuma amostra individual. Ver, por exemplo, sistema de ensaio repórter Dual-Luciferase™ da Promega, assim como vetores repórteres pGL3 Iuciferaseda Promega (disponíveis da Promega Corporation, Madison, Wis.), assimcomo as Patentes Americanas números 5.744.320 e 5.670.356.

Anticorpos

A invenção também proporciona anticorpos que se ligam seleti-vamente a um dos peptídeos da presente invenção, uma proteína compre-endendo tal peptídeo, assim como variantes e fragmentos seus. Conformeaqui utilizado, uma proteína compreendendo tal peptídeo, assim como vari-antes e fragmentos seus. Conforme aqui utilizado, um anticorpo se liga sele-tivamente a um peptídeo-alvo quando ele se liga ao peptídeo-alvo e não seliga significativamente a proteínas não-relacionadas. Um anticorpo ainda éconsiderado se ligando seletivamente a um peptídeo mesmo se ele tambémse ligar a outras proteínas que não são substancialmente homólogas com opeptídeo-alvo, contanto que tais proteínas compartilhem de homologia comum fragmento ou domínio do alvo peptídico do anticorpo. Nesse caso, pode-ria ser entendido que a ligação do anticorpo ao peptídeo ainda é seletiva,apesar de algum grau de reatividade cruzada.

Muitos métodos são conhecidos para gerar ou identificar anti-corpos para um dado peptídeo-alvo. Vários tais métodos são descritos porHarlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, (1989). Em geral, para geraranticorpos, um peptídeo isolado é usado como um imunógeno e administra-do a um organismo mamífero, tal como um rato, coelho ou camundongo. Aproteína de comprimento total, um fragmento peptídico antigênico ou umaproteína de fusão podem ser usados. Fragmentos particularmente importan-tes são aqueles cobrindo domínios funcionais, tais como os domínios identi-ficados aqui e domínios de homologia de seqüência ou divergência entre asfamílias, tais como aqueles que podem ser prontamente identificados usan-do métodos de alinhamento de proteína e conforme apresentado na Figura 6.

Anticorpos podem ser preparados a partir de qualquer região dopeptídeo, conforme é aqui descrito. Entretanto, regiões preferidas irão incluiraquelas envolvidas na função/atividade ou interação de enzima/parceiro deligação. Figura 6A até a Figura 6E, e a informação das Tabelas 3 e 5, junta-mente com as direções adicionais aqui fornecidas através dos exemplos po-dem ser usadas para identificar regiões particularmente importantes e váriosalinhamentos de seqüência podem ser usados para identificar fragmentos deseqüência conservados e únicos.

Um fragmento antigênico irá tipicamente compreender pelo me-nos 8 resíduos de aminoácidos contíguos, o peptídeo antigênico pode com-preender, entretanto, pelo menos 10, 12, 14, 16 ou mais resíduos de amino-ácidos. Tais fragmentos podem ser selecionados em uma propriedade física,tais como fragmentos correspondentes a regiões que estão localizadas nasuperfície da proteína, por exemplo, regiões hidrofílicas ou podem ser sele-cionados baseando-se na unicidade da seqüência.

A detecção de um anticorpo da presente invenção pode ser faci-litada pelo acoplamento (isto é, ligação física) do anticorpo com uma subs-tância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias en-zimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes,materiais bioluminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimasadequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta-galactosidade ou acetilcolinesterase. exemplos de complexos de gruposprostéticos incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de ma-teriais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotioci-anato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloretode dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material Iuminescente incluiluminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, Iuciferi-na e aequorina, e exemplos de material radioativo adequado inclui 125I, 131I135S ou 3H.

Os anticorpos podem ser usados para isolar uma das proteínasda presente invenção por técnicas padronizadas, tais como cromatografiapor afinidade ou imunoprecipitação. Os anticorpos podem facilitar a purifica-ção da proteína natural a partir de células e de proteínas recombinantementeproduzidas em células hospedeiras. Além disso, tais anticorpos são usadospara detectar a presença de uma das proteínas da presente invenção emcélulas ou tecidos para determinar o padrão de expressão da proteína dentrevários tecidos em um organismo ou sobre o curso do desenvolvimento, sejanormal ou anormal. Além disso, tais anticorpos podem ser usados para de-tectar proteína in situ, in vitro ou em um Iisado celular ou sobrenadante paraavaliar a abundância e padrão de expressão. A detecção de anticorpo defragmentos livres de uma proteína de comprimento total pode ser usada paraidentificar a renovação.

Os anticorpos também são úteis para inibir a função da proteína,por exemplo, pelo bloqueio da ligação do peptídeo da enzima a um parceirode ligação tal como a um substrato. Esses usos também podem ser aplica-dos em um contexto analítico no qual a análise envolve a inibição da funçãoda proteína. Um anticorpo pode ser usado, por exemplo, para bloquear aligação, dessa forma modulando (agonizando ou antagonizando) a atividadedo peptídeo. Anticorpos podem ser preparados contra fragmentos específi-cos contendo sítios requeridos para a função ou contra a proteína intactaque é associada com uma célula ou organismo.

A invenção também engloba kits para usar anticorpos para de-tectar a presença de uma proteína em uma amostra biológica. O kit podecompreender anticorpos tais como anticorpo marcado ou marcável e umcomposto ou agente para detectar proteína em uma amostra biológica; for-mas para determinar a quantidade de proteína na amostra; formas paracomparar a quantidade de proteína na amostra com um padrão; e instruçõespara uso. Tal kit pode ser fornecido para detectar uma única proteína ou epí-topo ou pode ser configurado para detectar um de uma multidão de epíto-pos, tal como em um arranjo de detecção de anticorpo. Arranjos são descri-tos em detalhes abaixo para arranjos de ácido nucleico e métodos similaresforam desenvolvidos para arranjos de anticorpo.

Moléculas de ácido nucleico

A presente invenção proporciona moléculas de ácido nucleicoisoladas conforme descrito nas Figuras 1, 2, 4, 5 e nas SEQ ID Nos: 1 e 3 evárias modificações ou fragmentos seus. Em modalidades particulares, ainvenção proporciona moléculas de ácido nucleico isoladas que codificamuma proteína ou peptídeo de enzima da presente invenção (DNAc, transcritoe seqüência genômica). Tais moléculas de ácido nucleico podem consistirem, consistir essencialmente em ou compreender uma seqüência de nucleo-tídeos que codifica um dos peptídeos da enzima da presente invenção, umavariante alélica sua ou um ortólogo ou parálogo seu.

Conforme aqui utilizado, uma molécula de ácido nucleico "isola-da" é uma que é separada de outro ácido nucleico presente na fonte naturaldo ácido nucleico. Preferivelmente, um ácido nucleico "isolado" é livre deseqüências as quais naturalmente flanqueiam o ácido nucleico (isto é, se-qüências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNAgenômico do organismo do qual o ácido nucleico é derivado. Entretanto, po-dem haver algumas seqüências de nucleotídeo flanqueadoras, por exemplo,de até cerca de 5 quilobase pares (KB), 4, KB, 3 KB, 2 KB ou 1 KB ou me-nos, particularmente seqüências codificadoras de peptídeos contíguos e se-qüências codificadoras de peptídeos no mesmo gene, porém separadas poríntrons na seqüência genômica. O ponto importante é que o ácido nucleico éisolado a partir de seqüências flanqueadoras remotas e não-importantes, deforma que ela possa ser submetida às manipulações específicas descritasaqui, tal como a expressão recombinante, preparação de sondas e iniciado-res e outros usos específicos para as seqüências de nucleotídeo.

Além disso, uma molécula de ácido nucleico "isolada", tal comoum transcrito ou molécula de DNAc, pode ser substancialmente livre de ou-tro material celular, ou meio de cultura quando produzida por técnicas re-combinantes, ou precursores químicos ou outras substâncias químicasquando quimicamente sintetizada. Entretanto, a molécula de ácido nucleicopode estar fundida com outras seqüências codificantes ou regulatórias e a-inda ser considerada isolada.

Por exemplo, moléculas de DNA recombinantes contidas em umvetor são consideradas isoladas. Outros exemplos de moléculas de DNAisoladas incluem moléculas de DNA recombinante mantidas em células hos-pedeiras heterólogas ou moléculas de DNA purificado (parcialmente ousubstancialmente) em solução. Moléculas de RNA isolado incluem transcri-tos de RNA in vivo ou in vitro das moléculas de DNA isoladas da presenteinvenção, assim como novos fragmentos seus. Moléculas de ácido nucleicoisoladas de acordo com a presente invenção ainda incluem tais moléculasproduzidas sinteticamente.

Concordantemente, a presente invenção proporciona moléculasde ácido nucleico que consistem nas seqüências de nucleotídeo da inven-ção. Uma molécula de ácido nucleico consiste em uma seqüência de nucleo-tídeo onde a seqüência de nucleotídeo é a seqüência de nucleotídeo com-pleta da molécula de ácido nucleico. A presente invenção ainda proporcionamoléculas de ácido nucleico que consistem essencialmente de uma seqüên-cia de nucleotídeos quando tal seqüência de nucleotídeos está presente comsomente alguns resíduos de ácido nucleico adicionais na molécula de ácidonucleico final. A presente invenção ainda proporciona moléculas de ácidonucleico que compreendem as seqüências de nucleotídeo da invenção. Umamolécula de ácido nucleico compreende uma seqüência de nucleotídeosquando a seqüência de nucleotídeos é pelo menos parte da seqüência denucleotídeo final da molécula de ácido nucleico. De tal forma, a molécula deácido nucleico pode ser somente a seqüência de nucleotídeos ou ter resí-duos de ácido nucleico adicionais, tais como resíduos de ácido nucleico quesão naturalmente associados com ele ou seqüências de nucleotídeo heteró-logas. Tal molécula de ácido nucleico pode ter alguns poucos nucleotídeosadicionais ou pode compreender várias centenas ou mais de nucleotídeosadicionais. Uma breve descrição de como vários tipos dessas moléculas deácido nucleico podem ser prontamente feitas ou isoladas é fornecida abaixo.

As moléculas de ácido nucleico isoladas podem codificar umaproteína madura mais aminoácidos amino ou carbóxi terminais adicionais, ouaminoácidos interiores ao peptídeo maduro (quando a forma madura temmais de uma cadeia peptídica, por exemplo). Tais seqüências podem de-sempenhar um papel no processamento de uma proteína de uma forma pre-cursora para uma forma madura, facilitar o tráfego de proteínas, prolongarou encurtar a meia-vida de proteínas ou facilitar a manipulação de uma pro-teína para ensaio ou produção, dentre outras coisas. Conforme é geralmenteo caso in situ, os aminoácidos adicionais podem ser processados fora daproteína madura por enzimas celulares.

Conforme mencionado acima, as moléculas de ácido nucleicoisoladas incluem, mas não estão limitadas, à seqüência que codifica o peptí-deo da enzima sozinha, a seqüência que codifica o peptídeo maduro e se-qüências codificadoras adicionais, tais como uma seqüência líder ou secre-tória (por exemplo, uma seqüência pré-pró ou pró-proteína), a seqüênciacodificando o peptídeo maduro, com ou sem as seqüências codificadorasadicionais, mais seqüências não-codificadoras adicionais, por exemplo, ín-trons e seqüências 5' e 3' não-codificantes, tais como transcrito, porém se-qüências não-traduzidas que desempenham um papel na transcrição, pro-cessamento de RNAm (incluindo sinais de união e poliadenilação), ligaçãode ribossomo e estabilidade de RNAm. Além disso, a molécula de ácido nu-cleico pode ser fundida com uma seqüência marcadora codificando, por e-xemplo, um peptídeo que facilita a purificação.

Moléculas de ácido nucleico isoladas podem estar na forma deRNA, tal como RNAm, ou na forma de DNA, incluindo DNAc e DNA genômi-co obtido por clonagem ou produzido por técnicas sintéticas químicas ou poruma combinação dessas. O ácido nucleico, especialmente DNA, pode ser defita dupla ou de fita única. Ácido nucleico de fita única pode ser o filamentocodificante (filamento de senso) ou o filamento não-codificante (filamentoantissenso).

A invenção ainda proporciona moléculas de ácido nucleico quecodificam fragmentos dois peptídeos da presente invenção, assim como mo-léculas de ácido nucleico que codificam variantes óbvias das proteínas deenzima da presente invenção que são descritas acima. Tais moléculas deácido nucleico podem ser de ocorrência natural, tais como variantes alélicas(mesmo local), parálogos (diferentes locais) e ortólogos (diferentes organis-mos), ou podem ser construídas por métodos de DNA recombinante ou porsíntese química. Tais variantes de ocorrência não-natural podem ser feitaspor técnicas de mutagênese, incluindo aquelas aplicadas a moléculas deácido nucleico, células ou organismos. Concordantemente, conforme discu-tido acima, as variantes podem conter substituições, anulações, inversões einserções de nucleotídeos. Variação pode ocorrer em uma ou em ambas asregiões codificantes e não-codificantes. As variações podem produzir substi-tuições de aminoácidos tanto conservativas quanto não-conservativas.

Conforme usado nesse pedido, o termo "uma molécula de ácidonucleico codificando uma luciferase" se refere a uma molécula de ácido nu-cleico que foi isolada livre de ácido nucleico celular total. O termo "códonfuncionalmente equivalente" é aqui utilizado para se referir a códons quecodificam o mesmo aminoácido, tais como os seis códons para arginina ouserina (Tabela 2), e também se refere a códons que codificam aminoácidosbiologicamente equivalentes, conforme discutido nas páginas a seguir.

Permitindo para a degeneração do código genético, seqüênciassão consideradas essencialmente as mesmas que aquelas estabelecidas seelas se elas tiverem pelo menos cerca de 50%, usualmente pelo menos cer-ca de 60%, mais usualmente cerca de 70%, mais usualmente cerca de 80%,preferivelmente pelo menos cerca de 90% e mais preferivelmente cerca de95% de nucleotídeos que são idênticos à seqüência de nucleotídeos da in-venção. Seqüências que são essencialmente as mesmas que aquelas esta-belecidas também podem ser funcionalmente definidas como seqüênciasque são capazes de hibridizar para um segmento de ácido nucleico conten-do o complemento de um polinucleotídeo sob condições padrões. O termoseqüências intimamente relacionadas se refere às seqüências ou com simi-laridade de seqüência substancial ou seqüência que codifica proteínas queperfazem funções de luciferase (isto é, uma ou mais atividade resultando emluminescência) ou invocam respostas antiaênicas similares às aqui descri-tas. O termo seqüência intimamente relacionada é aqui utilizado para desig-nar uma seqüência com um mínimo de 50% de similaridade com um polinu-cleotídeo ou polipeptídeo com o qual ela está sendo comparada.

Os segmentos de DNA da presente invenção incluem aquelescodificando peptídeos e proteínas de Iuciferase biologicamente equivalentesfuncionais, conforme descrito acima. Tais seqüências podem se originar co-mo uma conseqüência de redundância de códon e equivalência funcional deaminoácidos que são conhecidas por ocorrer naturalmente em seqüênciasde nucleotídeos e as proteínas codificadas dessa forma. Alternativamente,peptídeos ou proteínas funcionalmente equivalentes podem ser criadas atra-vés da aplicação de tecnologia de DNA recombinante, na qual alterações naestrutura da proteína podem ser projetadas, baseando-se em consideraçõesdas propriedades dos aminoácidos sendo trocados. Alterações podem serprojetadas através da aplicação de técnicas de mutagênese direcionada asítio ou podem ser introduzidas aleatoriamente e testadas mais tarde para afunção desejada, conforme descrito abaixo.

Naturalmente, a presente invenção também engloba oligonu-cleotídeos que são complementares, ou essencialmente complementares àsseqüências de um polinucleotídeo codificando uma Iuciferase de Arachno-campa. Seqüências de ácidos nucleicos que são "complementares" são a-quelas que são capazes de pareamento de bases de acordo com o padrãode regras de complementaridade Watson-Crick. Conforme aqui utilizado, otermo "seqüências complementares" significa seqüências de nucleotídeosque são substancialmente complementares, conforme pode ser avaliado pe-la mesma comparação de nucleotídeos estabelecida acima, ou como defini-do como sendo capazes de hibridizar para o segmento de ácido nucleico deum polinucleotídeo sob condições relativamente estringentes, tais como a-quelas aqui descritas.

Alternativamente, os segmentos hibridizantes podem ser oligo-nucleotídeos mais curtos. Seqüências de 17 bases de comprimento devemocorrer somente uma vez em um genoma complexo e, conseqüentemente,suficientes para especificar uma sequência-alvo única. Embora olioômerosmais curtos sejam mais fáceis de fazer e aumentar a acessibilidade in vivo,vários outros fatores estão envolvidos na determinação da especificidade dehibridização. Tanto a afinidade de ligação quanto a especificidade da se-qüência de um oligonucleotídeo para o seu alvo complementar aumenta como comprimento crescente. É contemplado que oligonucleotídeos exemplaresde 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais pares de bases serão usados,embora outros sejam contemplados. Polinucleotídeos mais longos codifican-do 250, 500, 1000, 1212, 1500, 2000, 2500, 3000 ou 3500 bases e mais lon-gos são contemplados da mesma forma. Tais oligonucleotídeos ou polinu-cleotídeos irão tipicamente encontrar uso, por exemplo, como sondas emSouthern e Northern blots e como iniciadores em reações de amplificação,ou para vacinas.

TABELA 2

<table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table>

Naturalmente, a presente invenção também engloba oligonu-cleotídeos que são complementares, ou essencialmente complementares àsseqüências de um nucleotídeo da invenção. Seqüências de nucleotídeosque são "complementares" são aquelas que são capazes de pareamento debases de acordo com as regras de complementaridade Watson-Crick pa-drões. Conforme aqui utilizado, o termo "seqüências de complementaridade"significa seqüências de nucleotídeos que são substancialmente complemen-tares, conforme pode ser avaliado pela mesma comparação de nucleotídeosestabelecida acima, ou conforme definido como sendo capaz de hibridizarpara o segmento de ácido nucleico de um polinucleotídeo sob condiçõesrelativamente estringentes, tais como aquelas descritas aqui.

A extensão do fragmento será baseada no seu uso pretendido.Por exemplo, o fragmento pode codificar regiões suportando epítopos dopeptídeo, ou pode ser útil como sondas e iniciadores de DNA. Tais fragmen-tos podem ser isolados usando a seqüência de nucleotídeos conhecida parasintetizar uma sonda de oligonucleotídeo. Uma sonda marcada pode, a se-guir, ser usada para fazer a varredura de uma biblioteca de DNAc, uma bi-blioteca de DNA genômica ou RNAm para isolar o ácido nucleico correspon-dendo à região codificadora. Além disso, os iniciadores podem ser usadosem reações de PCR para clonar regiões específicas do gene. Uma son-da/iniciador tipicamente compreende substancialmente um oligonucleotídeoou par de oligonucleotídeo purificado.

Ortólogos, homólogos e variantes alélicas podem ser identifica-das usando métodos bem-conhecidos na técnica. Conforme descrito na Se-ção de Peptídeo, essas variantes compreendem uma seqüência de nucleotí-deos codificando um peptídeo que é tipicamente 60 - 70%, 70 - 80%, 80 -90% e, mais tipicamente, pelo menos cerca de 90 - 95% ou mais homólogoem relação á seqüência de nucleotídeos mostrada nas páginas de Figura ouum fragmento dessa seqüência. Tais moléculas de ácidos nucleicos podemser prontamente identificadas como sendo capazes de hibridizar sob condi-ções de moderadas a estringentes, para a seqüência de nucleotídeos mos-trada nas páginas de Figura ou um fragmento da seqüência. Variantes aléli-cas podem ser prontamente determinadas por locais genéticos do gene codi-ficante.

Conforme aqui utilizado, e conforme é bem-conhecido para a-queles indivíduos versados na técnica, "condições de alta estringência","condições de estringência moderada" e "condições de baixa estringência"para hibridizações de ácidos nucleicos são explicadas nas páginas 2.10.1 -2.10.16 e nas páginas 6.3.1-6 em Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel, F. M. et ai, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley &Sons, (1998)). As condições exatas as quais determinam a estringência dehibridização dependem não somente da força iônica (por exemplo, SSC χ0,2, SSC χ 0,1), temperatura (por exemplo, temperatura ambiente, 42 grausCelsius, 68 graus Celsius) e a concentração de agentes desestabilizantestais como formamida ou agentes desnaturantes tais como SDS, mas tam-bém em fatores tais como a extensão da seqüência de nucleotídeos, com-posição de base, mau-emparelhamento porcentual entre as seqüências hi-bridizantes e a freqüência de ocorrência dos subgrupos daquela seqüênciaem outras seqüências não-idênticas. Dessa forma, condições de alta, mode-rada ou baixa estringência nas quais nenhuma hibridização ocorre até umnível no qual a hibridização é primeiramente observada, condições as quaisirão permitir que uma dada seqüência hibridize (por exemplo, seletivamente)com as seqüências mais similares na amostra podem ser determinadas.

Condições exemplares são descritas em Krause, Μ. H. e S. A.Aaronson, Methods in Enzymology, 200:546-556 (1991). Também ver Au-subel et ai, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons,(1998), o qual descreve a determinação das condições de lavagem paracondições de estringência moderada a baixa. Lavagem é a etapa na qual ascondições são geralmente ajustadas de forma a determinar um nível mínimode complementaridade dos híbridos. Geralmente, partindo da temperaturamais baixa na qual somente ocorre a hibridização homóloga, cada qrau Cel-sius pelo qual a temperatura de lavagem final é reduzida (mantendo a con-centração de SSC constante) permite um aumento de 1% na extensão má-xima de maus-emparelhamentos dentre as seqüências que hibridizam. Ge-ralmente, a duplicação da concentração do SSC resulta em um aumento deTm de cerca de 17 graus Celsius. Usando essas diretrizes, a temperatura delavagem pode ser determinada empiricamente pra estringência al-ta,moderada ou baixa, dependendo do nível de mau-emparelhamento procu-rado.

Por exemplo, uma lavagem com baixa severidade pode compre-ender uma lavagem em uma solução contendo 0,2 χ SSC / 0,1% de SDS por10 minutos em temperatura ambiente; uma lavagem com severidade mode-rada pode compreender uma lavagem em uma solução pré-aquecida (42°C)contendo 0,2 χ SSC / 0,10% de SDS por 15 minutos a 42°C; e uma lavagemcom alta severidade pode compreender uma lavagem em uma solução pré-aquecida (68°C) contendo 0,1 χ SSC / 0,1% de SDS por 15 minutos a 68°C.Além disso, lavagens podem ser realizadas repetida ou seqüencialmentepara obter o resultado desejado como conhecido do estado da técnica. Con-dições equivalentes podem ser determinadas através da variação de um oumais parâmetros dados como exemplo, como conhecido do estado da técni-ca, enquanto mantém-se um nível similar de identidade ou similaridade entrea molécula de ácido nucléico alvo e o iniciador ou sonda utilizado.

Usos de molécula de ácido nucleico

As moléculas de ácido nucleico da presente invenção são úteispara sondas, iniciadores, intermediários químicos e em ensaios biológicos.As moléculas de ácido nucleico são úteis como uma sonda de hibridizaçãopara RNA mensageiro, RNA transcrito ou DNAc e DNA genômico para isolarDNAc de comprimento total e clones genômicos codificando os peptídeosdescritos e para isolar DNAc e clones genômicos que correspondem às vari-antes (alelos, ortólogos, etc.) produzindo o mesmo ou peptídeos relacionados.

A sonda pode corresponder a qualquer seqüência juntamentecom o comprimento total das moléculas de ácido nucleico fornecidas. Entre-tanto conforme discutido, fragmentos não são para serem construídos comoenglobando fragmentos revelados antes da presente invenção.

As moléculas de ácido nucleico são também úteis como iniciado-res para PCR para amplificar qualquer dada região de uma molécula de áci-do nucleico e são úteis para sintetizar moléculas antissenso de comprimentoe seqüência desejados. Conforme mencionado acima, moléculas antissensoincluem expressamente constructos de RNA eficazes em alcançar modula-ção da expressão pela interferência de RNA.

As moléculas de ácido nucleico são também úteis para construirvetores recombinantes. Tais vetores incluem a expressão de vetores queexpressam uma porção de, ou todas as seqüências de peptídeo. Vetorestambém incluem vetores de inserção, usados para integrar em outra se-qüência de molécula de ácido nucleico, tal como no genoma celular, paraalterar a expressão in situ de um gene ou produto de gene. Por exemplo,uma seqüência codificadora endógena pode ser substituída através da re-combinação homóloga com toda ou parte da região codificadora contendouma ou mais mutações especificamente introduzidas.

As moléculas de ácido nucleico também são úteis para expres-sar porções antigênicas das proteínas.

As moléculas de ácido nucleico também são úteis como sondaspara determinar as posições cromossomais das moléculas de ácido nucleicoatravés de métodos de hibridização in situ.

As moléculas de ácido nucleico são também úteis para fazer ve-tores contendo as regiões regulatórias de gene das moléculas de ácido nu-cleico da presente invenção.

As moléculas de ácido nucleico também são úteis para projetarribozimas correspondendo a todo ou a parte do RNAm produzido a partir dasmoléculas de ácido nucleico aqui descritas.

As moléculas de ácido nucleico também são úteis para fazer ve-tores que expressam parte ou todos os peptídeos.

As moléculas de ácido nucleico são também úteis para construircélulas hospedeiras expressando uma parte ou todas as moléculas e peptí-deos de ácido nucleico.

As moléculas de ácido nucleico são também úteis para construirorganismos transgênicos expressando uma parte ou todas as moléculas epeptídeos de ácido nucleico.

As moléculas e ácido nucleico também são úteis como sondasde hibridização para determinar a presença, nível, forma e distribuição deexpressão de ácido nucleico. Concordantemente, as sondas podem ser usa-das para detectar a presença de, ou para determinar os níveis de uma molé-cula de ácido nucleico específica em células, tecidos e em organismos. Oácido nucleico cujo nível é determinado pode ser DNA ou RNA. Concordan-temente, sondas correspondendo aos peptídeos aqui descritos podem serusadas para avaliar a expressão ou número de cópias de gene em uma da-da célula, tecido ou organismo.

Técnicas in vitro para a detecção de RNAm incluem hibridiza-ções Northern e hibridizações in situ. Técnicas in vitro para detectar DNAincluem hibridizações Southern e hibridização in situ.

Um ensaio para a expressão de ácido nucleico de enzima podeenvolver o ensaio direto dos níveis de ácido nucleico, tais como os níveis deRNAm, ou em compostos colaterais envolvidos na reação de luminescência.Além disso, a expressão de genes que são supra- ou infrarregulados emresposta a um agente ou condições de sinal ou ambiental também pode seravaliada. Nessa modalidade, as regiões regulatórias desses genes podemser operativamente ligadas a um gene repórter codificando um ou mais pep-tídeos de luciferase da invenção.

Dessa forma, moduladores da expressão do gene da enzimapodem ser identificados em um método em que uma célula está em contatocom um composto candidato e o nível de luminescência (isto é, intensidadeou espectro) determinado. As características (espectro, distribuição de inten-sidade, intensidade absoluta, etc.) de luminescência na presença do com-posto candidato é comparada com as características de luminescência naausência do composto candidato. O composto candidato pode, então, seridentificado como um modulador da expressão de ácido nucleico baseando-se nessa comparação e ser usado, por exemplo, para tratar um distúrbiocaracterizado pela expressão de ácido nucleico aberrante.

Alternativamente, um modulador para expressão de ácido nucle-ico da enzima pode ser uma pequena molécula ou fármaco identificado u-sando os ensaios de varredura descritos aqui, contanto que o fármaco oumolécula pequena iniba a expressão de ácido nucleico da enzima nas célu-las e tecidos que expressam a proteína.

As moléculas de ácido nucleico são úteis como constructos an-tissenso para controlar a expressão gênica e as enzimas nas células, tecidose organismos. Uma molécula de ácido nucleico antissenso de DNA é proje-tada para ser complementar a uma região do gene envolvida na transcrição,prevenção da transcrição e, dessa forma, na produção da proteína da enzi-ma. Uma molécula de ácido nucleico de RNA ou DNA antissenso poderiahibridizar para o RNAm e, dessa forma, bloquear a tradução de RNAm naproteína da enzima. Técnicas e métodos de efetuar a interferência de RNAsão expressamente incluídos nessas técnicas.

A invenção também engloba kits para detectar a presença de umácido nucleico de enzima em uma amostra biológica. Por exemplo, o kit po-de compreender reagentes tais como um ácido nucleico marcado ou marcá-vel ou agente capaz de detectar ácido nucleico de enzima em uma amostrabiológica; formas de determinar a quantidade de ácido nucleico de enzimana amostra; e formas para comparar a quantidade de ácido nucleico de en-zima na amostra com um padrão. O composto ou agente pode ser empaco-tado em um recipiente adequado. O kit pode ainda compreender instruçõespara usar o kit para detectar o RNAm ou DNA da proteína.Arranjos de ácido nucleico

A presente invenção proporciona ainda kits de detecção de áci-do nucleico, tais como arranjos ou microarranjos de moléculas de ácido nu-cleico que são baseadas na informação de seqüência fornecida.

Conforme aqui utilizado, "arranjos" ou "microarranjos" se refere aum arranjo de polinucleotídeos ou oligonucleotídeos discretos sintetizadosem um substrato, tal como papel, náilon ou outro tipo de membrana, filtro,tira, lâmina de vidro ou qualquer outro suporte sólido adequado. Em umamodalidade, o microarranjo é preparado e usado de acordo com os métodosdescritos na Patente US No. 5.837.832, WO/1995/011995, Lockhart, D. J. etal. (1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680) e Schena, M. et ai. (1996; Proc. Natl.Acad. Sei. 93: 10614 - 10619). Em outras modalidades, tais arranjos sãoproduzidos pelos métodos descritos na Patente US No. 5.807.522.

O microarranjo ou kit de detecção é preferivelmente compostode um grande número de seqüências de nucleotídeos de fita única únicas,geralmente ou oligonucleotídeos antissenso sintéticos ou fragmentos deDNAsc, fixados em um suporte sólido. Os oligonucleotídeos são preferivel-mente de cerca de 6 a 60 nucleotídeos em comprimento, mais preferivel-mente de 15 a 30 nucleotídeos de comprimento, e mais preferivelmente decerca de 20 a 25 nucleotídeos de comprimento. Para um certo tipo de micro-arranjo ou kit de detecção, pode ser preferível usar oligonucleotídeos quesão somente de 7 - 20 nucleotídeos de comprimento. O microarranjo ou kitde detecção pode conter oligonucleotídeos que cobrem a seqüência 5' ou 3'conhecida, oligonucleotídeos seqüenciais os quais cobrem a seqüência decomprimento total; ou oligonucleotídeos únicos selecionados de áreas parti-culares juntamente com o comprimento da seqüência. Polinucleotídeos usa-dos no microarranjo ou kit de detecção podem ser oligonucleotídeos que sãoespecíficos para um gene ou genes de interesse.

Em um exemplo de uma análise de amostra usando um microar-ranjo ou kit de detecção, o RNA ou DNA de uma amostra biológica pode serfeito em sondas de hibridização. O RNAm é isolado, e o DNAc é produzido eusado como um molde para fazer RNA antissenso (RNAa). O RNAa é ampli-ficado na presença de nucleotídeos fluorescentes, e sondas marcadas sãoincubadas com o microarranjo ou kit de detecção deforma que as seqüên-cias de sonda hibridizem para oligonucleotídeos complementares do micro-arranjo ou kit de detecção. Condições de incubação são ajustadas de formaque a hibridização ocorra com emparelhamentos complementares precisosou com vários graus de menos complementaridade. Depois da remoção desondas não-hibridizadas, um "scanner" é usado para determinar os níveis epadrões de fluorescência. As imagens escaneadas são examinadas paradeterminar o grau de complementaridade e a relativa abundância de cadaseqüência de oligonucleotídeo no microarranjo ou kit de detecção. As amos-tras biológicas podem ser obtidas a partir de qualquer fonte adequada deinteresse. Um sistema de detecção pode ser usado para medir a ausência,presença e quantidade de hibridização, para todas as seqüências distintassimultaneamente. Esses dados podem ser usados para estudos de correla-ção em grande escala nas seqüências, padrões de expressão, mutações,variantes ou polimorfismos dentre as amostras, espécies ou amostras ambi-entais.

As amostras de teste da presente invenção incluem células, ex-tratos de proteína ou membrana de células ou mesmo amostras ambientaisbrutas. A amostra de teste usada no método acima descrito irá variar base-ando-se no formato do ensaio, na natureza do método de detecção e nostecidos, células ou extratos usados como a amostra a ser ensaiada. Métodospara preparar extratos de ácido nucleico ou de células são bem-conhecidosna técnica e podem ser prontamente adaptados para obter uma amostra queé compatível com o sistema utilizado.

Em outra modalidade da presente invenção, são fornecidos kitsos quais contêm os reagentes necessários para executar os ensaios da pre-sente invenção.

Vetores/Células hospedeiras

A invenção também fornece vetores contendo as moléculas deácido nucleico aqui descritas. O termo "vetor" se refere a um veículo, preferi-velmente a uma molécula de ácido nucleico, a qual pode transportar as mo-léculas de ácido nucleico. Quando o vetor é uma molécula de ácido nucleico,as moléculas de ácido nucleico são covalentemente ligadas ao ácido nuclei-co do vetor. Com esse aspecto da invenção, o vetor inclui um plasmídeo, umfago de fita única ou duplo, um vetor viral de DNA ou RNA de fita dupla ouindividual ou cromossomo artificial, tal como um BAC, PAC, YAC, ou MAC.

Um vetor pode ser mantido na célula hospedeira como um ele-mentos extracromossomal onde ele se replica e produz cópias adicionaisdas moléculas de ácido nucleico. Alternativamente, o vetor pode integrar nogenoma da célula hospedeira e produzir cópias adicionais das moléculas deácido nucleico quando a célula hospedeira se replica.

A invenção fornece vetores para a manutenção (vetores de clo-nagem) ou vetores para a expressão (vetores de expressão) das moléculasde ácido nucleico. Os vetores podem funcionar em células procarióticas oueucarióticas ou em ambas (vetores de transporte).

Vetores de expressão contêm regiões regulatórias de ação eisque são operativamente ligadas no vetor às moléculas de ácido nucleico deforma que a transcrição das moléculas de ácido nucleico é permitida emuma célula hospedeira. As moléculas de ácido nucleico podem ser introduzi-das na célula hospedeira com uma molécula de ácido nucleico separadacapaz de afetar a transcrição. Dessa forma, a segunda molécula de ácidonucleico pode proporcionar um fator de ação trans interagindo com a regiãode controle cis-regulatória para permitir a transcrição das moléculas de ácidonucleico do vetor. Alternativamente, um fator de ação trans pode ser forneci-do pela célula hospedeira. Finalmente, um fator de ação trans pode ser pro-duzido a partir do próprio vetor. É entendido, entretanto, que em algumasmodalidades, a transcrição ou a tradução das moléculas de ácido nucleicopodem ocorrer em um sistema livre de células.

A seqüência regulatória para a qual as moléculas de ácido nu-cleico aqui descritas podem ser operativamente ligadas incluem promotorespara direcionar a transcrição de RNAm. Esses incluem, mas não estão limi-tados, ao promotor esquerdo do bacteriófago X, aos promotores lac, TRP eTAC de E. coli, aos promotores inicial e tardio de SV40, ao promotor inicialimediato de CMV, aos promotores inicial e tardio de adenovírus e ás repeti-ções longas terminais de retrovírus.

Além das regiões de controle que promovem a transcrição, veto-res de expressão podem também incluir regiões que modulam a transcrição,tais como sítios de ligação repressores e intensificadores. Exemplos incluemo promotor SV40, o intensificador inicial imediato de citomegalovírus, o in-tensificador de polioma. os intensificadores de adenovírus e os intensificado-res LTR de retrovírus.

Além de conter sítios para a inicialização e controle da transcri-ção, vetores de expressão também podem conter seqüências necessáriaspara a terminação da transcrição e, na região transcrita, um sítio de ligaçãoa ribossomo para tradução. Outros elementos de controle regulatórios paraexpressão incluem os códons de iniciação e terminação, assim como sinaisde poliadenilação. A pessoa normalmente versada na técnica poderia estaratenta das numerosas seqüências regulatórias que são úteis em vetores deexpressão. Tais seqüências regulatórias são descritas, por exemplo, emSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold S-pring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989).

Uma variedade de vetores de expressão pode ser usada paraexpressar uma molécula de ácido nucleico. Tais vetores incluem vetorescromossomais, epissomais e derivados de vírus, por exemplo, vetores deri-vados de plasmídeos bacterianos, de bacteriófago, de epissomas de levedu-ra, de elementos cromossomais de levedura, incluindo cromossomos artifici-ais de levedura, de vírus tais como baculovírus, papovavírus tais comoSV40, vírus vaccinia, adenovírus, poxvírus, vírus de pseudorraiva e retroví-rus. Vetores também podem ser derivados de combinações dessas fontes,tais como aqueles derivados de plasmídeo e de elementos genéticos de bac-teriófagos, por exemplo, cosmídeos e fagemídeos. Vetores de expressão eclonagem apropriados para hospedeiros procarióticos e eucarióticos sãodescritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2aed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989).

A seqüência regulatória pode proporcionar a expressão constitu-tiva em uma ou mais células hospedeiras (isto é, tecido específica) ou podeproporcionar a expressão induzível em um ou mais tipos celulares tais comopor temperatura, aditivo de nutriente ou fator exógeno tal como hormônio ououtro ligante. Uma variedade de vetores proporcionando a expressão consti-tutiva e induzível em hospedeiros procarióticos e eucarióticos é bem-conhecida pelas pessoas normalmente versadas na técnica.

As moléculas de ácido nucleico podem ser inseridas no vetor deácido nucleico por uma metodologia bem-conhecida. Geralmente, a seqüên-cia de DNA que irá ser expressa no fim das contas é junta a um vetor de ex-pressão pela clivagem da seqüência de DNA e o vetor de expressão comuma ou mais enzimas de restrição e, a seguir, pela ligação dos fragmentosjuntos. Procedimentos para a digestão e ligação das enzimas de restriçãosão bem-conhecidos por aqueles indivíduos normalmente versados na técnica.

O vetor contendo a molécula de ácido nucleico apropriada podeser introduzido em uma célula hospedeira apropriada para a propagação ouexpressão usando técnicas bem-conhecidas. Células bacterianas incluem,mas não estão limitadas, a E. coli, Streptomyces, e Salmonella typhimurium.Células eucarióticas incluem, porém não estão limitadas, a levedura, célulasde inseto tais como Drosophila, células animais tais como células COS eCHO e células vegetais.

Conforme aqui descrito, pode ser desejável expressar o peptí-deo como uma proteína de fusão. Concordantemente, a invenção proporcio-na vetores de fusão que permitem a produção dos peptídeos. Vetores defusão podem aumentar a expressão de uma proteína recombinante, aumen-tar a solubilidade da proteína recombinante, e ajudar na purificação da prote-ína pela ação, por exemplo, como um Iigante para purificação por afinidade.Um sítio de clivagem proteolítico pode ser introduzido na junção da porçãode fusão de forma que o peptídeo desejado possa ser no final separado daporção de fusão. Enzimas proteolíticas incluem, mas não estão limitadas, aofator Xa, trombina e enteroenzima. Vetores de expressão de fusão típicosincluem pGEX (Smith et ai, Gene 67:31-40 (1988)), pMAL (New EnglandBiolabs, Beverly, Mass.) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.), os quais sefundem à glutationa S-transferase (GST), proteína de ligação à maltose E1ou proteína A, respectivamente, para a proteína recombinante alvo. Exem-plos de vetores de expressão de E. coli não-fusão induzíveis incluem pTrc(Amann et ai, Gene 69: 301-315 (1988)) e pET 11d (Studier et ai, Gene Ex-pression Technology: Methods in Enzymology 185: 60-89 (1990)).

A expressão de proteína recombinante pode ser maximizada nabactéria hospedeira proporcionando um fundo genético em que a célulahospedeira tem uma capacidade prejudicada de clivar proteoliticamente aproteína recombinante. (Gottesman1 S., Gene Expression Technology: Me-thods in Enzymology 185, Academic Press, São Diego, Calif. (1990)119-128). Alternativamente, a seqüência da molécula de ácido nucleico de inte-resse pode ser alterada para proporcionar o uso do códon preferencial parauma célula hospedeira específica, por exemplo, E. coli. (Wada et a!., NucleicAcids Res. 20:2111-2118 (1992)).

As moléculas de ácido nucleico também podem ser expressaspor vetores de expressão que são operativos em leveduras. Exemplos devetores de expressão em leveduras, por exemplo, S. cerevisiae, incluempYepSed (Baldari, et al, EMBO J. 6: 229-234 (1987)), pMFa (Kujan et al.,Cell 30: 933-943(1982)), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54: 113-123 (1987)) epYES2 (Invitrogen Corporation, São Diego, Calif.).

As moléculas de ácido nucleico também podem ser expressasem células de inseto usando, por exemplo, vetores de expressão de baculo-vírus. Vetores de baculovírus disponíveis para expressão de proteínas emcélulas de inseto cultivadas (por exemplo, células Sf9) incluem a série pAc(Smith et al., Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165 (1983)) e a série pVL (Lucklow etal., Virology 170: 31-39 (1989)).

Em certas modalidades da invenção, as moléculas de ácido nu-cleico descritas aqui são expressas em células de mamíferos usando veto-res de expressão de mamíferos. Exemplos de vetores de expressão de ma-míferos incluem pCDM8 (Seed, B. Nature 329: 840(1987)) e pMT2PC (Kau-finan et al., EMBO J. 6: 187-195 (1987)).

Os vetores de expressão aqui listados são fornecidos a título deexemplo somente dos vetores bem-conhecidos disponíveis para as pessoasnormalmente versadas na técnica que poderiam ser úteis para expressar asmoléculas de ácido nucleico. A pessoa normalmente versada na técnica po-deria estar ciente de outros vetores adequados para a manutenção da pro-pagação ou expressão das moléculas de ácido nucleico aqui descritas. Es-ses são encontrados, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsh, E. F., e Mania-tis, Τ. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed„ Cold Spring HarborLaboratory1 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,1989.

A invenção também engloba vetores nos quais as seqüências denucleotídeos aqui descritas são clonadas no vetor em orientação reversa,mas operativamente ligados para uma seqüência regulatória que permite atranscrição de RNA antissenso. Dessa forma, um transcrito antissenso podeser produzido para toda, ou para uma porção das seqüências de moléculade ácido nucleico aqui descritas, incluindo tanto as regiões codificadorasquanto as não-codificadoras. A expressão desse RNA antissenso é sujeita acada um dos parâmetros descritos acima em relação à expressão do RNAsenso (seqüências regulatórias, expressão constitutiva ou induzível, expres-são tecido-específica).

A invenção também se refere às células hospedeiras recombi-nantes contendo os vetores aqui descritos. Células hospedeiras, dessa for-ma, incluem células procarióticas, células eucarióticas inferiores tais comolevedura, outras células eucarióticas tais como células de insetos e célulaseucarióticas superiores, tais como células de mamíferos. Células hospedei-ras podem incluir, mas não estão limitadas, a larvas do bicho da seda, célu-las CHO, de E. coli e levedura.

As células hospedeiras recombinantes são preparadas pela in-trodução dos constructos de vetor aqui descritos nas células por técnicasprontamente disponíveis para a pessoa normalmente versada na técnica.Essas incluem, mas não estão limitadas, a transfecção com fosfato de cál-cio, transfecção mediada por DEAE-dextrana, transfecção mediada por lipí-deo catiônica, eletroporação, transdução, infecção, lipofecção e outras técni-cas tais como aquelas encontradas em Sambrook, et ai. (Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

Células hospedeiras podem conter mais de um vetor. Dessaforma, diferentes seqüências de nucleotídeos podem ser introduzidas emdiferentes vetores da mesma célula. Semelhantemente, as moléculas deácido nucleico podem ser introduzidas ou sozinhas ou com outras moléculasde ácido nucleico que não estão relacionadas com as moléculas de ácidonucleico tais como aquelas proporcionando fatores de ação trans para veto-res de expressão. Quando mais de um vetor é introduzido em uma célula, osvetores podem ser introduzidos independentemente, cointroduzidos ou jun-tos ao vetor da molécula de ácido nucleico.

No caso de vetores virais e bacteriófagos, esses podem ser in-troduzidos nas células como vírus empacotado ou encapsulado por proce-dimentos padrões para infecção e transdução. Vetores virais podem sercompetentes de replicação ou defeituosos de replicação. No caso no qual areplicação viral é defeituosa, a replicação irá ocorrer em células hospedeirasproporcionando funções que complementam os defeitos.

Vetores geralmente incluem marcadores selecionáveis que ca-pacitam a seleção da subpopulação de células que contêm os constructosde vetor recombinante. O marcador pode estar contido no mesmo vetor quecontém as moléculas de ácido nucleico aqui descritas ou pode estar em umvetor separado. Marcadores incluem genes resistentes à tetraciclina ou am-picilina para células hospedeiras procarióticas e resistência à neomicina oudi-hidrofolato redutase para células hospedeiras eucarióticas. Entretanto,qualquer marcador que proporciona a seleção para um traço fenotípico seráeficaz.

Enquanto as proteínas maduras podem ser produzidas em bac-térias, leveduras, células de mamíferos e outras células sob o controle dasseqüências regulatórias apropriadas, sistemas de transcrição e de traduçãolivres de células também podem ser usados para produzir essas proteínasusando DNA derivado dos constructos de DNA aqui descritos.

Onde a secreção do peptídeo é desejada, a qual é difícil de con-seguir com proteínas contendo domínio de transmembrana tais como enzi-mas, sinais de secreção apropriados são incorporados no vetor. A seqüênciade sinal pode ser endógena aos peptídeos ou heterólogos desses peptídeos.

Onde o peptídeo não é secretado no meio, a proteína pode serisolada da célula hospedeira por procedimentos de rompimento padrões,incluindo descongelamento em baixa temperatura, ultrassom, rompimentomecânico, uso de agentes de Iise e semelhantes. O peptídeo pode, a seguir,ser recuperado e purificado por métodos de purificação bem-conhecidos in-cluindo precipitação com sulfato de amônio, extração com ácido, cromato-grafia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia de fosfocelulose, croma-tografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografiade hidroxiapatita, cromatografia de Iectina ou cromatografia líquida de altodesempenho.

Também é entendido que dependendo da célula hospedeira naprodução recombinante dos peptídeos aqui descritos, os peptídeos podemter vários padrões de glicosilação, dependendo da célula, ou podem ser não-glicosilados como quando produzidos na bactéria. Além disso, os peptídeospodem incluir em uma metionona modificada inicial em alguns casos comoum resultado de processos mediados por hospedeiro.

Uso de vetores e de células hospedeiras

As células hospedeiras recombinantes expressando os peptí-deos aqui descritos têm uma variedade de usos. Primeiramente, as célulassão úteis para a produção de uma proteína ou peptídeo de enzima que podeser adicionalmente purificado para produzir quantidades desejadas de prote-ína de enzima ou fragmentos. Dessa forma, células hospedeiras contendovetores de expressão são úteis para a produção de peptídeos.

Células hospedeiras também são úteis para conduzir ensaiosbaseados em células envolvendo a proteína da enzima ou fragmentos deproteína da enzima, tais como aqueles descritos acima assim como outrosformatos conhecidos na técnica. Dessa forma, uma célula hospedeira re-combinante expressando uma proteína de enzima natural é útil para ensaiarcompostos que estimulam ou inibem a função da proteína da enzima.

Células hospedeiras também são úteis para identificar mutantesde proteína de enzima nos quais essas funções são afetadas. Se os mutan-tes ocorrem naturalmente e geram uma patologia, as células hospedeirascontendo as mutações são úteis para ensaiar compostos que têm um efeitodesejado na proteína de enzima mutante (por exemplo, função estimulanteou inibitória) o que pode não ser indicado pelos seus efeitos na proteína deenzima natural.

Transgênicos

Os ácidos nucleicos da Iuciferase de Arachnocampa podem serusados para gerar plantas ou animais transgênicos, não-humanos, ou modi-ficações de gene sítio-específicas em linhagens celulares. Células transgê-nicas da invenção em questão incluem um ou mais ácidos nucleicos de a-cordo com a invenção presente como um transgene, onde incluído nessadefinição estão as células vegetais transformadas para incluir o transgene ea sua progênia.

Em muitas modalidades, as células transgênicas são células quenão abrigam ou contêm normalmente um ácido nucleico de acordo com ainvenção exposta. Naquelas modalidades onde as células transgênicas nãocontêm naturalmente os ácidos nucleicos do assunto, o ácido nucleico esta-rá presente em uma posição diferente de sua localização natural, isto é, in-tegrado no material genômico da célula em um local não-natural.

Animais transgênicos podem ser feitos através de recombinaçãohomóloga, onde o local endógeno é alterado. Vetores para a integração es-tável incluem plasmídeos, retrovírus e outros vírus animais, YACs e seme-lhantes.

Organismos transgênicos da referida invenção incluem células eorganismos multicelulares, por exemplo, plantas e animais, que são "knoc-kouts" endógenos nos quais a expressão do gene endógeno é pelo menosreduzida, se não eliminada. Organismos transgênicos de interesse tambémincluem células e organismos multicelulares, por exemplo, plantas e animais,nos quais a proteína ou suas variantes é expressa em células ou tecidosonde ele não é normalmente expresso ou é expresso em níveis não nor-malmente presentes em tais células ou tecidos. Constructos de DNA pararecombinação homóloga irão compreender pelo menos uma porção do geneda referida invenção, em que o gene tem a(s) modificação(ões) genética(s)desejada(s), e inclui regiões de homologia para o local-alvo. Constructos deDNA para a integração aleatória não precisam incluir reaiões de homoloaiapara mediar a recombinação. Convenientemente, marcadores para a sele-ção positiva e negativa podem ser incluídos.

Métodos para gerar células com modificações de gene direcio-nadas através de recombinação homóloga são conhecidos na técnica. Paravárias técnicas para transfectar células de mamíferos, ver Keown et al.(1990), Meth. Enzymol. 185: 527-537. Para células tronco-embrionárias(ES), uma linhagem celular de ES pode ser empregada, ou células embrio-nárias 10 podem ser obtidas frescas de um hospedeiro, por exemplo, ca-mundongo, rato, porquinho-da-índia, etc. Tais células crescem em uma ca-mada alimentadora de fibroblasto apropriada ou crescem na presença defator inibitório de leucemia (LIF). Quando ES ou células embrionárias foremtransformadas, elas podem ser usadas para produzir animais transgênicos.

Depois da transformação, as células são plaqueadas em uma camada ali-mentadora em um meio apropriado. Células contendo o constructo podemser detectadas pelo emprego de um meio seletivo 15. Depois de tempo sufi-ciente para as colônias crescerem, elas são colhidas e analisadas para aocorrência de integração ou recombinação homóloga do constructo. Aquelascolônias que são positivas podem, então, ser usadas para manipulação em-brionária de injeção de blastocisto. Blastocistos são obtidos a partir fêmeassuperovuladas de 4 até 6 semanas de idade. As células ES são tripsiniza-das, e as células modificadas são injetadas na blastocele do blastocisto 20.

Depois da injeção, os blastocistos são retornados para cada trompa uterinade fêmeas pseudográvidas. As fêmeas são, então, deixadas ir a termo e aprole é testada para o constructo. Porfornecer um diferente fenótipo do blas-tocisto e as células geneticamente modificadas, a progenia quimérica podeser prontamente detectada. Os animais quiméricos são testados para a pre-sença do gene modificado e os machos e fêmeas com a modificação sãoacasalados para produzir progênia homozigótica. Se as alterações do genecausam Ietalidade em algum ponto do desenvolvimento, os tecidos ou ór-gãos podem ser mantidos como enxertos ou transplantes alogênicos oucongênicos, ou em cultura in vitro. Os animais transgênicos podem ser qual-quer mamífero não-humano, tais como animais de laboratório, animais do-mésticos, etc. Os animais transgênicos podem ser usados em estudos fun-cionais ou de varredura para moduladores, ou outros usos conforme forneci-dos ou conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.

Plantas transgênicas podem ser produzidas e usadas de umaforma similar. Métodos para preparar células de plantas transgênicas e plan-tas são descritos nas Patentes Americanas Nos. 5.767.367; 5.750.870;5.739.409; 5.689.049; 5.689.045; 5.674.731; 5.656.466; 5.633.155;5.629.470; 5.595.896; 5.576.198; 5.538.879; 5.484.956. Métodos para pro-duzir plantas transgênicas são também revistos em Plant Biochemistry andMolecular Biology (eds. Lea & Leegood, John Wiley & Sons) (1993) pp 275-295.

Em resumo, uma célula ou tecido vegetal adequado é colhido,dependendo da natureza da espécie vegetal. Como tal, em certos exemplos,protoplastos serão isolados, onde tais protoplastos podem ser isolados apartir de uma variedade de diferentes tecidos vegetais, por exemplo, folha,hipocotil, raiz, etc. Para o isolamento do protoplasto, as células coletadassão incubadas na presença de celulases para remover a parede celular, on-de as condições de incubação exatas variam dependendo do tipo de plantaou tecido a partir do qual a célula é derivada. Os protoplastos resultantessão, a seguir, separados dos fragmentos celulares resultantes por peneira-ção e centrifugação. Ao invés de usar protoplastos, explantes embriogênicoscompreendendo células somáticas podem ser usados para a preparação dohospedeiro transgênico. Após a coleta de célula ou tecido, DNA exógeno deinteresse é introduzido nas células vegetais. Uma variedade de diferentestécnicas são disponíveis para tal introdução. Com protoplastos isolados, aoportunidade surge para a introdução através de protocolos de transferênciade gene mediada por DNA, incluindo: incubação dos protoplastos com DNAnu, por exemplo, plasmídeos, compreendendo a seqüência codificadora e-xógena de interesse na presença de cátions polivalentes, por exemplo, PEGou PLO; e eletroporação dos protoplastos na presença de DNA nu compre-endendo a seqüência exógena de interesse.

Protoplastos que absorveram com sucesso o DNA exógeno são,a seguir, selecionados, crescidos em um calo e, por fim, em uma plantatransgênica através do contato com as quantidades e proporções apropria-das de fatores estimulatórios, por exemplo, auxinas e citocinas. Com explan-tes embriogênicos, um método conveniente de introdução do DNA exógenonas células somáticas-alvo é através do uso de aceleração de partículas ouprotocolos de "arma de gene". Os explantes resultantes são, a seguir, deixa-dos crescer em plantas quiméricas, criados de forma cruzada e é obtida pro-genia transgênica.

Ao invés das abordagens de DNA nu descritas acima, outro mé-todo conveniente de produzir plantas transgênicas é a transformação media-da por Agrobacterium. Com transformação mediada por Agrobacterium, ve-tores cointegrativos ou binários compreendendo o DNA exógeno são prepa-rados e, a seguir, introduzidos em uma cepa de Agrobacterium apropriada,por exemplo, A. tumefaciens. As bactérias resultantes são, a seguir, incuba-das com protoplastos preparados ou explantes de tecido, por exemplo, dis-cos de folha, e um calo é produzido. Os calos, a seguir, crescem sob condi-ções de crescimento seletivas, selecionados e submetidos ao meio de cres-cimento para induzir o crescimento de raiz e de broto para produzir, por fim,uma planta transgênica.

Qualquer uma das seqüências regulatórias ou outras úteis emvetores de expressão pode formar parte da seqüência transgênica. Isso in-clui seqüências intrônicas e sinais de poliadenilação, se não já incluídos.Uma(s) seqüência(s) regulatória(s) tecido-específica pode ser operativamen-te ligada ao transgene para direcionar a expressão da proteína da enzimapara células particulares.

Exemplos

Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar modali-dades preferidas da invenção. Deve ser percebido por aquelas pessoas ver-sadas na técnica que as técnicas reveladas nos exemplos que seguem re-presentam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na práticada invenção, e dessa forma, podem ser consideradas por constituir modospreferidos para essa prática. Entretanto, aqueles indivíduos versados natécnica deveriam, à luz da presente descoberta, perceber que muitas altera-ções podem ser feitas nas modalidades específicas as quais são reveladas eainda obter um resultado igual ou semelhante sem sair do espírito e escopoda invenção.

Materiais variados e metodologia empregada nos ExemplosInsetos

Indivíduos de Arachnocampa richardsae foram coletados da na-tureza sob permissão informada do NSW National Parks e Wildlife Service.Cem larvas de A. richardsae foram coletadas a partir do Túnel da FerroviaNewnes, mapa no. 8931, referência de grade E414, N187, New South Wa-les, Austrália. As larvas foram transferidas para o laboratório e órgãos de luzforam dissecados do resto da carcaça sob um microscópio.

Espécies de Arachnocampa podem ser cultivadas através deformas conhecidas na técnica. Ver: Takaie1 H. (1989) Breeding and displayof the glow-worms, Araehnoeampa spp. Insectarium, vol. 26 Julho: 214-219;Takaie, H. (1997) Ten years of the glow-worm (Arachnoeampa richardsae)rearing at Tama Zoo -Fascination of a living milky way. Insectarium, vol 34Novembro: 336-342. Sakurai, Y., R. Komatani, K. Tabata e H. Takaie On theglow-worm breeding at Tama Zoo.

Isolamento de RNA: O RNA total foi isolado ou de uma carcaçade aproximadamente 10 órgãos de luz usando o micro kit RNAqueous™(Ambion) de acordo com as instruções do fabricante, exceto que o tecidocresceu em 300 μι. de solução de lise.

Biblioteca de DNAc: bibliotecas de DNAc representativas da car-caça e do órgão de luz foram construídas usando o kit de construção de bi-blioteca de DNAc Creator™ SMART™ (CIontech) com modificação. O pri-meiro filamento de DNAc foi sintetizado pelo método de PCR de longa dis-tância (LC) descrito usando um micrograma de RNA e DNAc total amplifica-do usando 20 ciclos. Dois microgramas do DNAc ds amplificado sofreu di-gestão por Proteinase K e Sfil conforme descrito pelo fabricante e foram fra-cionados em uma coluna de fracionamento de tamanho de DNAc (Invitro-gen) de acordo com as instruções do fabricante. Frações individuais (até 100ng de DNAc ds) foram ligadas com 100 ng de LIB-pDNR digerido por Sfil eforam subseqüentemente eletroporadas em E. coli resistente ao Fago T1ElectroMAX™ DH10p™ (Invitrogen). Um estoque de glicerol de cada biblio-teca de DNAc foi preparado pela diluição da biblioteca não-amplificada 1:2com glicerol 50% - LB (v/v). Adicionalmente, estoques de glicerol de 1056clones individualmente colhidos de cada biblioteca de DNAc de órgão de luzforam preparados em placas de fundo plano de poliestireno de 96 poçoscom tampas de baixa evaporação (Becton Dickinson) pela inoculação de 100μL de glicerol 10% - LB (v/v) com uma única colônia e incubando de um diapara o outro a 37 °C. Esses foram estocados congelados a -80 °C.

Isolamento de plasmídeo: Para cada uma das duas bibliotecasde DNAc de órgão de luz de (fração da biblioteca 10 e fração da biblioteca9), DNA de plasmídeo foi preparado a partir de 96 clones aleatoriamentecolhidos.

Preparação de DNA de plasmídeo de 96 poços: DNA de plasmí-deo foi preparado de acordo com um método modificado a partir de informa-ção fornecida pela Millipore Corporation (Beckman Coulter - Biomek 2000Workstation ™- Millipore Protocols, agosto de 2002). Colônias individuaisforam inoculadas em 1,1 mL de caldo Luria 2 χ contendo 30 μg mL"1 de clo-ranfenicol em placas de 96 poços profundos. AS placas foram cobertas comAeraSeal™ (Excel Scientific, Wrightswood CA) e incubadas a 37 0C em umagitador orbital ajustado a 320 rpm por 24 horas. As placas foram centrifu-gadas a 1500 g por cinco minutos em temperatura ambiente e o sobrena-dante foi decantado e o excesso de fluido foi removido do pélete dando levestapas firmemente em um tecido.

Usando a estação de trabalho robótica BioMek2000™ (BeckmanCoulter), 150 μί. de solução 1 (glicose a 30 mM, Tris-HCI a 15 mM (pH 8,0),Na2EDTA a 30 mM, 60 μg/mL de RNaseA) foi adicionado a cada poço emisturado. A placa foi manualmente submetida ao vórtex por três minutos.150 μί. de solução 2 (NaOH a 0,2 N1 SDS a 1% (p/v) foi adicionado, seguidopor 150 μί de solução 3 (potássio a 3,6 M/ acetato 6 M). Os conteúdos dopoço foram misturados completamente. 300 uL de Iisados brutos foramtransferidos para uma placa de compensação MultiScreen™ (Millipore), aqual foi colocada em uma placa Plasmid™ (MiIIipore) em um tubo de vácuo.O Iisado foi filtrado sob vácuo (sete minutos a 203 mm Hg). A placa de com-pensação foi descartada e o Iisado foi filtrado a vácuo na placa de Plasmí-deo (8 minutos; 508 mm de Hg). A placa de plasmídeo foi lavada por seisminutos sob o mesmo vácuo com 200 μL de água por poço. O vácuo foi libe-rado, 35 μL de Tris a 10 mM (pH 8,0) foram adicionados a cada poço da pla-ca Plasmid, cuja placa foi agitada a 600 rpm por 15 minutos. Os conteúdosdo poço, contendo o DNA de plasmídeo, foram coletados com uma pipeta demúltiplos canais.

Seqüenciamento: Os clones foram seqüenciados usando o CEQ2000 Dye Terminator Cycle Sequencing ™ com o Quick Start Kit™ (BeckmanCoulter) e 100 fmol de DNA de plasmídeo.

""Dot blot"ting" para a varredura de clones de biblioteca de DNAcde órgão de luz de A. richardsae: Clones dos estoques de glicerol da biblio-teca de DNAc de órgão de luz de vaga-lume (fração 9) foram marcados emmembranas Hybond-XL® (Amersham) usando um replicador de 96 poços (V& P Scientific, Inc.). As membranas foram, então, desnaturadas, neutraliza-das e fixadas de acordo com as instruções do fabricante.

"Dot blots" foram sondados com uma sonda de PCR marcadacom a32P-dATP de 796 pb preparada usando os seguintes iniciadores:

Iniciador a jusante GWLucScreenU - 5' GATGATAATGCACCA-GAAAAG -3' - direcionado aos nucleotídeos 142 - 162 do clone 1E1 (SEQ IDNO: 11).

Iniciador reverso GWLucScreenU - 5'- TTATAATATCCAGCAT-CACCA -3' - direcionado aos nucleotídeos 938 - 918 do clone 1E1 (SEQ IDNO: 12).

A sonda de PCR foi gerada com Taq DNA polimerase (Invitrogen) usando o clone 1E1 de DNAc como molde, seguindo o método de Milli-can e Bird (Millican e Bird 1997). Os "blots" foram hibridizados e lavados deacordo com as instruções do fabricante da membrana, a seguir expostos aum filme de raios X. DNA de plasmídeo foi purificado a partir dos clones quehibridizaram para 1E1 e a inserção foi seqüenciada.

Construção de DNAc de comprimento total codificando a Iucife-rase de A. richardsae: duas versões do DNAc de Iuciferase de Arachnocam-pa richardsae foram preparadas. GWLuc#1 (Seqüência 4) continha a se-qüência codificadora de consenso, enquanto GWLuc#2 contém um afasta-mento único, silencioso do consenso na posição 1308. GWLuc#1 e G-WLuc#2 também diferem em uma única base na UTR 3'.

GWLuc#1 foi construído usando a região 5" do clone 8F5 e aregião 3' do clone 4F12. O clone 8F5 é um DNAc de comprimento total iso-lado da Fração 9 da biblioteca de DNAc de órgão de luz de vaga-lume (Pla-ca 8; Posição F5). Ele contém três diferenças do consenso na região 3' deum único sítio BamHI (1030). O clone 4F12 é um DNAc parcial, de 1,5 Kb decomprimento, cuja 3' do mesmo sítio BamHI corresponde exatamente à se-qüência codificadora de consenso. Concordantemente, a extremidade 3' doclone 8F5 entre o sítio BamHI e o sítio Xhol no MCS do pDNR-LIB foi remo-vido e o fragmento correspondente do clone 4F12 foi unido ao clone 8F5.

GWLuc#2 foi construído usando o mesmo clone 8F5 que descri-to acima, nesse caso com a região 3' do sítio BamHI único sendo substituídacom o fragmento correspondente inserido do clone 1B6 (substituindo um Tcom um C).

Os constructos foram amplificados por PCR usando DNA poli-merase Platinum Pfx® (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante.

Preparação de extrato de Iuciferina: Uma Iuciferina de Aracho-nocampa ( de agora em diante "GWLuciferina") contendo a fração foi prepa-rada a partir de órgãos de luz de Arachonocampa de acordo com Viviani (Vi-viani, Hastings et al. 2002)). 90 órgãos de luz de A. richardsae foram homo-geneizados em tampão de citrato quente a 0,1 M pH 5. A suspensão foi in-cubada a 95 °C por 5 minutos, e acidificada até pH 2,5 - 3,0 com HCI a 0,1Μ. O extrato foi extraído com um volume igual de acetato de etila e seco sobnitrogênio. O resíduo foi dissolvido em água.

Alinhamentos de seqüências múltiplas: Alinhamentos de se-qüências múltiplas e árvores filogenéticas foram derivados usando os oro-gramas PROTML ou PROTPARS: PROTML (Adachi, J. e Hasegawa, M.1996: Molphy versão 2.3. Programas para filogenética molecular baseadosna probabilidade máxima. Monografia de Computer Science No. 28. Umapublicação do Institute of Statistical Mathematics, Tóquio)); e PROTPARS(Felsenstein, J. 1989. PHYLIP - Pacote de programas de inferência de filo-genia (versão 3.2). Cladistics 5: 164 - 166). Alinhamentos em pares e níveisde identidade de seqüência e homologia foram determinados usando BestFit(GCG). Os programas de alinhamento de seqüência foram usados atravésda interface BioManager fornecida pelo Australian National Genomic Infor-mation Service (http://www.anqis.orq.au).

Exemplo 1: Isolamento de ácidos nucleicos codificando Iuciferases de Ara-chnocampa.

Bibliotecas de DNAc de carcaça foram construídas a partir dasFrações 8 - 10 da carcaça fracionada de DNAc ds e bibliotecas de DNAc deórgãos de luz foram construídas a partir das Frações 9 e 10 do DNAc ds fra-cionado, respectivamente.

Dos 96 clones isolados de cada biblioteca de DNAc de órgão deluz, 92 e 95 clones, respectivamente, seqüenciaram com sucesso. Cada se-qüência foi consultada contra os bancos de dados NCBI usando o programatBLASTx. Nenhum clone da Fração 10 de biblioteca de DNAc de órgão deluz foi identificado como tendo qualquer homologia a qualquer luciferase,mas cinco clones da Fração 9 da biblioteca de DNAc de órgão de luz tinhamhomologias para as Iuciferases de besouros luminescentes. Os clones 1E1(1275 pb); 1B6 (1163 pb); 1F7 (948 pb); 1G12 (768 pb); e 1C5 (494 pb) fo-ram completamente seqüenciados e demonstraram ter DNAsc parciais cor-tados derivados de 5' de forma independente representando a mesma estru-tura de leitura aberta e, em buscas tBLASTx, todos os cinco mostraram ho-mologia às Iuciferases de Phrixothrix vivianii e Phrixothrix hirtus. Essas es-pécies de besouro (Coleoptera: família Phengodidae) têm larvas Iuminescen-tes e são conhecidas como "vermes de estradas de ferro" (Phrixothrix) To-das as cinco seqüências de DNAc foram cortadas para extensões variáveisna extremidade 5'. A análise de seqüência dos cinco clones identificou 11substituições de base na extremidade 3', das quais três são silenciosas.

Independentemente do uso de DNA polimerase à prova de leitu-ra para amplificações de DNAc (Advantage 2 Polymerase Mix1 Clontech) umalto nível de variação de seqüência putativa foi obtido depois de cada etapade amplificação. Isso necessitou o seqüenciamento de amplicons indepen-dentes múltiplos para determinar uma seqüência autêntica e para isolar umamplicon com essa seqüência. Um fenômeno semelhante foi observado naamplificação da Iuciferase de P. Pylaris com outra DNA polimerase à provade leitura (Pfx, Invitrogen). As Iuciferases do vaga-lume e de Arachnocampacompartilham a característica incomum de que há uma alta proporção dedíades de nucleotídeos, o que pode possivelmente explicar a fidelidade rela-tivamente fraca da PCR com essas seqüências como alvo.

Clones de estoques em glicerol da biblioteca de DNAc de luz devaga-lumes (fração 9) foram marcados em membranas Hybond-XL (Amer-sham), usando um replicador de 96 poços (V & P Scientific, Inc.). As mem-branas foram desnaturadas, neutralizadas e fixadas de acordo com as ins-truções do fabricante.

Das 960 colônias contendo DNAc de órgão de luz testadas coma sonda derivada de 1E1, 29 (cerca de 3%) produziram um sinal positivo.Uma vez que a eficiência do contato da membrana com o replicador não foiabsoluta, isso pode ter sido uma subestimativa da quantidade total de positi-vos. Das aproximadamente 1.000 colônias da Fração 9 da biblioteca deDNAc de carcaça testadas com a sonda 1E1, nenhuma foi encontrada como sendo positiva.

Vinte e um clones, aqueles produzindo o sinal de hibridizaçãomais forte, foram estados por PCR usando pDONRLIBM13F, direcionadocontra a seqüência de vetor 5' como o iniciador a jusante e GWLuc484, aqual é direcionada para o nucleotídeo 804 - 788 de 1E1, como o iniciadorreverso. Amplicons foram obtidos a partir de dez dos clones alvos, confir-mando suas sobreposições com a extremidade 5' de 1E1. Quatro dos ampli-cons foram demonstrados como sendo mais longos do que 1E1. Um deles,obtido do clone 4F12, tenha um comprimento de 1,1 de pares de auilobase,indicando um comprimento de clone total de 1,5 pares de quilobase. Os trêsoutros amplicons, obtidos dos clones 11B11, 8F5 e 6B6, foram todos domesmo comprimento, 1,3 pares de quilobase, indicando que cada um dosclones é de comprimento de 1,7 pares de quilobase.

A seqüência da estrutura de leitura aberta completa de Iuciferasede A. richardsae foi deduzida pelo seqüenciamento dos clones 1E1, 1B6,1F7, 1C5, 1G12 e 11B11, 8F5 e 6B6. As seqüências de pelo menos três clo-nes independentes foram comparadas em todas as posições de nucleotí-deos. A seqüência de nucleotídeo de consenso é mostrada na Figura 1A atéa Figura 1B ou SEQ ID NO: 1. Em um pequeno número de casos, um únicodos três ou mais clones seqüenciados tinha uma seqüência diferente doconsenso. Essas variações estão listadas na Tabela 3.

Tabela 3. Variações de nucleotídeos únicas em clones parciais ou de com-primento total seqüenciados de Arachnocamoa richardsae.

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Uma varredura de PCR foi efetuada para identificar qualquerseqüência não-traduzida adicional a montante do término 5' que seja comumaes clones Bll1 8F5 e 6B6. Os clones de DNAc representando a extremi-dade 5' do gene da Iuciferase foram obtidos por PCR semiancorado, usandoo DNAc de órgão de luz de Arachnocampa como molde. Na construção doDNAc de órgão de luz de Araehnoeampa (kit de construção da biblioteca deDNAc Creator SMART (Clontech), síntese de LD-PCR), o oligoiniciadorSMART IV foi adicionado a todo o DNAc amplificado. Uma porção do oligoi-niciador SMART IV foi, portanto, usada para ancorar a extremidade 5' dareação de PCR: 5' - CAACGCAGAGTGGCCATTA - 3' (SEQ ID NO: 13). Uminiciador específico de gene da luciferase, direcionado aos nucleotídeos 514- 494 do DNAe de luciferase: 5' - TGGCTTTTCTGGTGCATTATC -3*(SEQ ID NO: 14) foi usado como o iniciador reverso. Uma alíquota do poolde DNAc de órgão de luz de Araehnoeampa, preparado conforme descritoanteriormente, porém antes da digestão e do fracionamento por tamanho, foiusado como molde. DNA foi amplificado com a DNA polimerase HotStarTaq(Qiagen). Amplicons (aproximadamente 500 pb) foram clonados no pGEM-Teasy (Promega). Treze clones, identificados como possuindo o DNAc deluciferase, foram seqüenciados. Desses, oito tinham exatamente a mesmaseqüência UTR 5' como os clones de DNAc de luciferase de comprimentototal putativos, 11B11, 8F5 e 6B6.

O DNAc mostra uma estrutura de leitura aberta longa individualem uma estrutura de tradução. Essa seqüência corresponde àquela da SEQID NO: 2. A ORF começa com uma AUG, no correto contexto AXXAUGGpara a iniciação do ribossomo (Kozak 1986; Kozak 1987) e termina com umcódon de terminação UAA na posição do nucleotídeo 1621. A proteína é de530 aminoácidos de comprimento, um comprimento similar ao de outras Iuci-ferases de inseto e proteínas tipo luciferase.

A luciferase tem um peso molecular calculado de 58,955 e umponto isoelétrico calculado de 7,36. Como tal, ela é marginalmente menor doque a luciferase de Photinus pyralis (de Wet et al. 1987) e uma variedade deoutras Iuciferases de vaga-lumes. O peso molecular calculado da luciferasede Araehnoeampa difere substancialmente do valor determinado por filtraçãoem gel. Viviani, Hastings et al. (2002) ensina um peso molecular de 36 KDa.Exemplo 2: Comparação da seqüência de Iuciferase de Arachnocampa comas seqüências de outras Iuciferases de inseto.

Buscas tBLASTX dos bancos de dados NCBI com a seqüênciade Iuciferase de Arachnocampa recuperaram acertos com as proteínas tipoluciferase de D. melanogaster e Anopheles gambiae e Iuciferases de Phrixo-thrix viviani, vaga-lumes e outros besouros luminescentes. A homologia deaminoácidos entre a Iuciferase de Arachnocampa e os besouros começa naAsn 9 da seqüência de Arachnocampa, correspondendo à asparagina con-servada encontrada entre as posições 5 e 9 nas Iuciferases de besouro (Fi-gura 6).

No nível de nucleotídeo, o nível mais alto de identidade (58,1%)é com a Iuciferase de P. viviani, mas o nível de identidade com Photinus p-yralis (57.1%) é quase tão alto (Tabela 4).

Tabela 4. Sumário das comparações de seqüências de pares entre a Iucife-rase de A. richardsae, Iuciferases de dois besouros luminescentes represen-tativos e proteínas tipo Iuciferase de duas moscas não-luminescentes. Phri-xothrix viviani é o acerto da Iuciferase de pontuação mais elevada usando aA. richardsae como a consulta em uma busca tBLASTx dos bancos de da-dos da seqüência NCBI.

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Proteínas tipo Iuciferase de Drosophila e Anopheles têm níveismarginalmente mais baixos de identidade de nucleotídeo. No nível de ami-noácido, o nível mais alto de identidade (38,8%) e homologia (51,2%) é coma proteína tipo Iuciferase de D. melanogaster. O nível mais alto de identidade(34,9%) e homologia (48,3%) com uma luciferase funcional é com a enzimade Phrixothrix viviani (Tabela 4). Claramente, a Iuciferase da espécie de Ara-chnocampa pertence à mesma superfamília de genes que as Iuciferases dosvaga-lumes e de outros besouros. Também é evidente que a Iuciferase deArachnocampa é um novo membro da família, somente distantemente rela-cionado às Iuciferses de besouro. Isso é enfatizado pela observação de que,no nível de aminoácido, a similaridade de seqüência é maior com as proteí-nas tipo Iuciferase que não têm atividade luminescente in vitro ou in vivo.

Baseando-se em um alinhamento das seqüências de luciferasede 18 espécies de besouros luminescentes, representando um gênero dafamília Elateridae, um gênero da família Phengodidae e outros gêneros dafamília Lampyridae, as Iuciferases de besouro compartilham 128 resíduos deaminoácidos absolutamente conservados (Figura 6). Luciferases de vaga-lumes são consistentemente aproximadamente de 550 resíduos de aminoá-cidos em comprimento. Concordantemente, aproximadamente 23% dos re-síduos são absolutamente conservados dentre todos os membros do grupode luciferase de besouro seqüenciados até hoje. Ao contrário, somente seteresíduos são completamente conservados dentre todos os membros da luci-ferase, acil-CoA ligase e superfamília da peptídeo sintase (Conti et al. 1996).A seqüência da Iuciferase de A. richardsae difere daquela do consenso deluciferase de besouro em 58 das 129 posições (Tabela 3). A seqüência daluciferase de A. richardsae, dessa forma, representa uma solução profunda-mente diferente do problema de luminescência daquele exibido nos vaga-lumes.

Tabela 5. Listagem daqueles 58 resíduos os quais são completamente con-servados dentre todas as Iuciferases de besouro. mas nos quais divergemda seqüência de A. richardsae.

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Notas para a Tabela 5:

A: 550 aminoácidos de comprimento de Iuciferase de P. pyralisΒ. 530 aminoácidos de comprimento de Iuciferase de A. richard-sae.

N0 Das 57 alterações onde foram obtidos seqüências para ogene tipo Iuciferase de Anopheles:

1. Resíduo de A. richardsae é o mesmo que uma das duas se-qüências tipo Iuciferase de díptero, mas não a outra.

2. Resíduo é o mesmo para a A. richardsae, D. melanogaster eA. gambiae, mas ele é diferente do consenso de besouro.

3. Resíduo de A. richardsae é diferente do consenso de besouro,mas as proteínas tipo Iuciferase de D. melanogaster e A. gambiae ambastêm o mesmo resíduo que o consenso de besouro.

4. Todos os três genes dípteros têm diferentes resíduos nessaposição.

5. Resíduo de A. richardsae é diferente do consenso de besouroe as proteínas tipo Iuciferase de D. melanogaster e A. gambiae ambas têm omesmo resíduo, o qual não é o consenso de besouro.

Exemplo 3: Identificação de posições e aminoácidos críticos.

Todas as Iuciferases de besouro até hoje usam a mesma D-luciferina. Estudos de mutagênese revelaram a importância de várias de re-síduos na ligação do substrato ou no mecanismo cataiítico das Iuciferasesde besouro. A Iuciferase de A. richardsae difere na seqüência no subgrupodesses resíduos chave. Arginina 218 da Iuciferase de vaga-lume foi mostra-da como sendo um resíduo do sítio de ligação da Iuciferina essencial (Bran-chini, Magyar et al. 2001). A substituição de R218 com glutamina, Iisina oualanina resultou em um aumento de 15 - 20 vezes no valor de Km para a Iuci-ferina. A altura do lampejo (intensidade) foi reduzida para 33%, 5% e 3,6%,respectivamente, do valor do tipo selvagem e os valores de kcat foram dimi-nuídos. Os comprimentos de onda do máximo de emissão foram tambémreduzidos em todos os três mutantes. R218 representa um dos resíduos a-cima mencionados que é absolutamente conservado em todas as 18 Iucife-rases de besouro examinadas. Entretanto, na região correspondente da Iuci-ferase de Arachnocampa, quatro resíduos de aminoácidos são anulados. Aanulação, entre o N213 e o L214 de A. richardsae (Tabela 3) engloba a posi-ção onde a arginina, equivalente à R218 de P. pyralis, poderia ser esperadaocorrer (Figura 6). Os resíduos de A. richardsae K205, G206, V207 e H216,os quais têm a extensão da anulação, são absolutamente conservados entreArachnocampa e todas as 18 luciferases de besouro (Figura 6). Os resíduosN213, L214 e 1215, os quais diretamente margeiam a anulação, são comunscom, respectivamente, 10, 2 e 2 outros luciferases de besouro. Conseqüen-temente, as características de ligação ao substrato da luciferase de Arach-nocampa se desviam substancialmente das propriedades das luciferases debesouro nessa região.

Em um estudo mais amplo (Branchini, Southworth et al. 2003),15 resíduos (R218, H245, G246, F247, F250, T251, G315, G316, G341,L342, T343, S347, A348, 1351, K529) que se acredita estarem posicionadosnos 5 A do sítio ativo da Iuciferase de P. pyralis, foram modificados. Os 11resíduos em negrito mostraram uma alteração de quatro vezes ou maior noKm para a D-luciferina. O resíduo na posição correspondente na Iuciferasede A. richardsae difere em 10 dos 15 casos identificados por Branchini (op.Cit.; DEL 213-214 R218, N238H245, A239G246, T243F250, A244T251,S308G315, S335L342, S336T343, L339S347, A343I351; também vera Figu-ra 6). A natureza da substituição ou anulação de aminoácido em Arachno-campa, em cada uma dessas dez posições, é diferente das manipulaçõesexperimentais testadas por Branchini et al., as quais foram limitadas às se-guintes: R218 -> K, Q, A (Branchini, Magyar et al. 2001; Branchini, South-worth etal. 2003); H245 -> F, D, A (Branchini, Magyar et al. 1998; Branchini,Magyar et al. 2001; Branchini, Southworth ef al. 2003); G246 -> A; F247 ->Y, L, A; F250 -> S, G; T251 -> A; G315 -> A; G316 -> A; G341 -> A; L342 ->A; T343 -> A; S347 > A; A348 -> V; 1351 -> A; K529 -> A (Branchini,Southworth et al. 2003).

Não existem, dessa forma, precedentes para as versões de Ara-chnocampa desses resíduos, mesmo como substituições individuais. Alémdisso, oito dos resíduos do sítio de ligação testados por Branchini et al.(R218, H245. F247, G315, G341, L342, T343 e K529) são absolutamenteconservados dentre todas as 18 Iuciferases de abelha que foram usadas noalinhamento. Nas posições correspondentes em A. richardsae (Figura 6),cinco desses resíduos são um subgrupo de resíduos invariantes que se ali-nham à bolsa de ligação de substrato em Iuciferases de besouro, o corres-pondente resíduo de Arachnocampa é diferente em mais de 60% dos casosconforme é refletido pela similaridade/identidade porcentual entre os seg-mentos especificados da Iuciferase de Arachnocampa spp e a seqüência dePhotinus pyralis:

<table>table see original document page 86</column></row><table>

Os resultados foram obtidos usando GAP (GCG/ANGIS). Notarque os resultados de BESTFIT obtidos foram substancialmente os mesmos.

Exemplo 4: Similaridades para as proteínas tipo Iueiferase de outras Dioterae origens evolueionárias de Iueiferase de Arachnoeamoa.

Cinqüenta e sete dos 58 resíduos de aminoácidos onde as Iuci-ferases da invenção diferem da seqüência de consenso da Iuciferase de be-souro caem nas regiões onde a seqüência é disponível para proteínas "tipoluciferase" tanto de D. melanogaster quanto de A. gambiae. Em 33 desses57 resíduos, as proteínas tipo luciferase concordam com a seqüência da lu-ciferase de besouro (Tabela 5), mesmo que os organismos não emitam luz.Baseando-se nesses resíduos de consenso, parece que a luciferase de A.richardsae foi submetida à pressão evolucionária para se afastar da famíliaancestral. Baseando-se nos presentes dados de seqüência, não é possívelconcluir se as Iuciferases dos besouros e moscas Iuminescentes evoluíramde um ancestral Iuminescente comum, ou se a luminescência evoluiu inde-pendentemente em Coleoptera e Diptera de uma proteína tipo luciferase dafamília da acil-CoA ligase.

Exemplo 5: Posieão da luciferase de Araehnoeampa na filogenia molecularde outras Iuciferases da superfamilia da AciI-CoA liaase.

Uma análise filogenética não-ancorada usando o programaPROTML (Figura 7) de 18 seqüências de luciferase únicas de coleópterosluminescentes, as proteínas tipo luciferase de D. melanogaster e A. gambia-e, uma acil-CoA Iigase de camundongo e uma nova Iuciferase de A. richard-sae separa os vaga-lumes (Lampyridae: e.g. Hotaria, Photinus, Lampyris,Luciola e Pyrocoelia) de vermes de estrada de ferro (Phengodidae: isto éespécies Phrixothrix) e besouros da família Elateridae (Elateridae: isto é,espécies Pyrophorus). A luciferase de A. richardsae foi claramente separadadaquelas de todas as três famílias de besouro luminescente, embora maisintimamente relacionada com as luciferases de besouro do que com as pro-teínas tipo luciferase de dípteros. Entretanto, em uma filogenia moleculardas mesmas seqüências, ancoradas com a acil-Co Iigase de camundongousando o programa PROTPARS (não mostrado), a luciferase de Arachno-campa foi colocada como um estranho às proteínas tipo Iuciferase de dípte-ros. As relações entre todas as outras luciferases foram inalteradas.

Exemplo 6: Expressão de Iuciferase de ArachnocampaConstrução de ρETDuet-1 :GWLue N0 1

O DNAc de comprimento total de GWLue N0 1 foi amplificadousando DNA polimerase de Platinum Pfx (Invitrogen) seguindo as recomen-dações do fabricante usando 10 pmols por reação dos iniciadores pETG-WLucF e pETGWLucR:

pETGWLucF: GACACACCATGGCTTGTACTTCAGT (SEQ ID NO: 15)

pETGWLucR: GACGACCCTAGGTTACAATGTTCCTCTTAAA(SEQ ID NO: 16)

Esses iniciadores introduzem os sítios de restrição Ncol e Avrll5' e 3' do DNAc de Iuciferase de Araehnoeampa de comprimento total. Oproduto de PCR purificado foi adicionada uma cauda poli-A conforme descri-to no manual pGEM T-easy Vector System I (Promega) e ligado no pGEM T-easy. Os constructos foram eletroporados na cepa DH5a de E. eoli e foramseqüenciados usando o seqüenciador CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Se-quencing com o kit Quick Start (Beckman Coulter) e 50 fmols de DNA deplasmídeo. Os constructos contendo uma seqüência de DNAc de Iuciferasede Araehnoeampa livre de erros foram cortados com Ncol e Avrll e inseridosno vetor pET-Duet1 da Novagen (EMD/Merck Biosciences, São Die-go/Darmstadt) usando o sítio Ncol de MCS1 e o sítio Avrll de MCS2. Oplasmídeo resultante foi designado pETDuet-1:GWLuc N0 1. Os plasmídeosforam eletroporados para a cepa BL21 (DE3) de E. coli e novamente se-qüenciados.

Controle de Iuciferase de besouro (Photinus pyralis)

Um constructo de comprimento total (1653 nucleotídeos) do ge-ne Iuc de P. pyralis foi inserido no vetor pETDuet-1 para produzir pETDuet-1:FFLuc, o qual foi subseqüentemente eletroporado na cepa de E. coli BL21(DE3) conforme descrito para pETDuet-1 :GWLuc N0 1.Vetor de expressão de controle

Um vetor de expressão de controle, pETDuet-1 :Control foi pre-parado a partir de pETDuet-1 pelo corte de MCS1 5' do sítio Ncol através dosítio Avrll de MCS2, o qual remove as etiquetas His e S de MCS1 e MCS2,respectivamente. As projeções 5' resultantes foram preenchidas na extremi-dade usando DNA polimerase I (Klenow, NEB) com 25 mM de cada dNTP. Areação foi incubada a 25 0C por 15 minutos e foi terminada pela adição deEDTA a 10 mM e incubação a 75 0C por 20 minutos. O vetor foi purificado eautoligado usando T4 DNA Iigase (Fermentas) na presença de 5% (p/v) dePEG8000 de acordo com as recomendações de Fermenta para ligações deextremidade cega. O vetor de controle foi subseqüentemente eletroporadona cepa de E. coli BL21(DE3) conforme descrito para pETDuet-1 :GWLuc N0 1.

Pré-indução

Culturas de dois mililitros (ml_) do vetor de controle vazio pET-Duet-1: vetor de controle (em BL21(DE3)); pETDuet-1: constructo FFLuc(luciferase de vaga-lume) (em BL21 (DE3)); pETDuer-1: constructo N0 1GWLuc (luciferase de vaga-lume) (em BL21(DE3)) e células BL21 (DE3) fo-ram incubadas de um dia para o outro em meio LB contendo glicose a 1 M a37 0C1 200 rpm. No próximo dia, as culturas foram centrifugadas por três mi-nutos a 1.500 rpm em temperatura ambiente e o pélete ressuspenso em 2mL de LB. 50 mL de LB foram inoculados com uma diluição 1:50 de cadacultura, seguido da adição de 50 μΙ_ de 1000 χ ampicilina. Essas soluçõesinoculadas foram incubadas a 37 0C por 1 hora antes de começar a indução.A absorvância ds culturas foi medida a 600 nm (Abs600 nm) e ao alcançaruma Abs600 nm > 0,6, quatro alíquotas de 1 ml_ foram removidas, centrifu-gadas a 10.000 g por cinco minutos em temperatura ambiente e os péletescelulares foram estocados a -80 °C.

Indução

Dos volumes de cultura remanescentes, duas alíquotas de 9 mLforam transferidas para tubos de centrífuga cônicos de 50 mL. Uma alíquotafoi induzida pela adição de IPTG (concentração final de 0,4 mM) e a segun-da não foi induzida (ao contrário, foi adicionada quantidade equivalente deágua). A cultura BL21 (DE3) não-transformada não foi induzida e 20 mL fo-ram transferidos para um frasco cônico de 250 mL. Todas as culturas foram,a seguir, incubadas a 20 °C, 150 rpm por 48 horas, em cujo tempo a Abs600nm foi absorvida. Três alíquotas de 250 μί foram removidas de cada culturae centrifugadas a 10.000 g por 5 minutos em temperatura ambiente e os pé-letes foram estocados a -80 0C para análise de proteína. 5 mL de pETDuet-1: vetor de controle; pETDuet-1: FFLuc e pETDuet-1: GWLuc N0 1 e 15 mLde culturas BL21 (DE3) foram transferidos para tubos de centrífuga limpos ecentrifugados a 4 0C por 10 minutos a 3.000 rpm. O sobrenadante foi decan-tado, cada pélete foi ressuspenso no respectivo volume de partida de solu-ção salina tamponada com fosfato gelado (pH 7,4) (NaCI a 137 mM, KCI a2,7 mM, Na2HPO4 a 4,3 mM)) e novamente centrifugado a 4 0C por 10 minu-tos a 3.000 rpm. O PBS foi decantado e os péletes foram ressuspensos emPBS gelado ajustado para produzir a mesma Abs 600 nm que a amostramais concentrada.

Análise de proteína

Análise de proteína foi efetuada usando o sistema de gel NuPA-GE® Novex Bis-Tris usando as instruções do fabricante. Péletes bacterianoscongelados foram Iisados pela adição de 1 χ tampão de amostra de Iaurildo-decilsulfato (LDS) NUPAGE® contendo DTT a 50 mM e aquecido por 10 mi-nutos a 70 °C. DNA cromossomal foi submetido ao cisalhamento passando olisado bacteriano através de uma agulha 30G várias vezes. Amostras bacte-rianas de concentrações de proteína aproximadamente iguais, estimadaspela medição da densidade bacteriana (Abs600 χ fator de diluição), e os pa-drões pré-manchados SeeBlueR (Invitrogen) foram carregados em géis NU-PAGE® a 12% Tris-Bis e eletroforisados por aproximadamente 50 minutosem 200 V constantes usando tampão de corrida NUPAGE® MOPS SDS (pH7,7, MOPS a 50 mM, Tris a 50 mM, 0,1% de SDS (p/v), EDTA a 1 mM) parao qual 1 χ antioxidante NUPAGE® tinha sido adicionado somente na câmarasuperior da minicélula XCeII SureLock® (Invitrogen).

O gel foi removido do cassete e lavado três vezes em 45% demetanol (v/v) - 10% a ácido acético (v/v) por 10 minutos em temperaturaambiente com agitação branda. Após a lavagem final, o gel foi submergidono corante Fast (16% de solução estoque de corante Fast (Fisher Biotec)(v/v), 9% de metanol (v/v), 2% de ácido acético (v/v) e manchado de um diapara o outro em temperatura ambiente com agitação branda. A solução docorante foi decantada e o gel inicialmente enxaguado em 10% de ácido acé-tico (v/v) por 10 minutos em temperatura ambiente antes de ser estocado em10% a ácido acético (v/v). Os géis foram fotografados com iluminação fluo-rescente transmitida usando um sistema de imagem de captura de vídeo.Figura 8 mostra a eletroforese em gel de poliacrilamida LDS dos péletes in-duzidos transformados ou com pETDuetl: FFLuc (trilha 5) dos constructospETDuet1:GWLuc N0 1 (trilha 8) que exibiram padrões similares de expres-são de proteína. Bactérias transformadas (com vetor pETDuetl :FFLuc) indu-zidas com IPTG exibiram uma nova banda no meio do caminho entre a ca-racterística de Iuciferase de vaga-lume de 51 e 64 KDa (trilha 5). Semelhan-temente, as bactérias induzidas por PTG transformadas com o vetor pETDu-etl :GWLuc N0 1 exibiram uma nova banda (trilha 8) indicando a expressãobem-sucedida de Iuciferase de Arachnocampa.

Preparação de lisados

40 μl de células não-transformadas BL21 (DE3) foram mistura-das com 50 μl de culturas pETDuet-1 :controle, pETDuet-1:FFLuc ou pET-Duet-1 :GELuc N0 1, e 10 uL de H2HPO4 a 1 M (pH 7,8), EDTA a 20 mM foiadicionado. Alíquotas da mistura celular foram congeladas instantaneamenteem gelo seco e estocadas a -80 °C. Células congeladas foram descongela-das colocando o tubo em um banho maria em temperatura ambiente. As alí-quotas de células foram misturadas com 300 μΙ_ de mistura de Iise recente-mente preparada (1 χ reagente de Iise de cultura de células Iuciferase (C-CLR1 Promega), 1,25 mg/mL de Iisozima (Sigma), 2,5 mg/mL de albumina desoro bovino (BSA) (Sigma). Após a incubação em temperatura ambiente por10 minutos, o Iisado foi aliquotado e estocado a -80 0C ou usado imediata-mente.

Ensaio de Iuciferina

Esse ensaio de Iuciferina usou os Iisados celulares (acima) con-tendo Iuciferase derivada de Arachnocampa ("luciferase de vaga-lume" ou"luciferase GW"). Alíquotas de 10 μί do Iisado celular (a não ser que estabe-lecido de outra forma) foram adicionadas aos poços de uma placa OptiPIa-te®-96. 90 μΙ_ (ou volume apropriado para produzir o volume final de 100 μΙ_)de uma mistura de tampão contendo tampão Tris-acetato (pH 7,75), ATP,acetato2 de magnésio e D-Iuciferina (Sigma) foi adicionado ao Iisado paraproduzir as respectivas concentrações finais de 25 mM, 2 mM, 4 mM e 0,4mM. Alternativamente, 100 μί_ de reagente de ensaio de luciferase comerci-almente disponível (Promega) foi preparado pela mistura de 10 mL de tam-pão de ensaio de luciferase para o frasco contendo o substrato de ensaio deluciferase liofilizado, foi adicionado a 20 μΙ_ do Iisado celular especificado. Aprodução de luz total foi medida usando o modo de cinética de lampejo doluminômetro Wallad 420 Victor 2 (Perkin-Elmer). O tempo de integração foiajustado para 0,5 s e a quantidade de repetições ajustada como 100.Exemplo 7: Atividade da luciferase de Arachnocampa

A adição de D-Iuciferina para 10 μί de um Iisado celular de luci-ferase derivada de Arachnocampa ("luciferase de vaga-lume" ou "luciferaseGW") resultou em um aumento da atividade bioluminescente em compara-ção com aquela do Iisado de célula de controle (Figura 16). Foi reportadoque não existe absolutamente reatividade cruzada entre o sistema biolumi-nescente de besouro e o sistema bioluminescente de Arachnocampa. Quan-tidades diferentes e crescentes de Iuciferase de GW foram adicionadas à D-luciferina e demonstram que essa resposta foi quantitativa (Figura 17). Emtodos os casos, cuidado foi tomado pra assegurar que não houve comunica-ção cruzada entre os poços através do espaçamento separado dos poçosusados. A Iuciferase de GW presente na mistura de Iisado podia ser quantifi-cada usando a D-Iuciferina de besouro (sensibilidade foi de 18,52 CPS/μί. delisado de Iuciferase GW adicionada) (Figura 18). O ensaio é sensível o sufi-ciente para quantificar a Iuciferase de vaga-lume preparada da maneira des-crita.

Controles

Para assegurar que a intensificação bioluminescente observadafoi devido à interação da Iuciferase GW com D-luciferina, diversos experi-mentos de controle foram executados. O primeiro experimento de controlesimplesmente envolveu aquecimento do Iisado de célula de Iuciferase deGW por 5 minutos a 95 °C antes da mistura com D-luciferina. O aquecimentodo lisado celular contendo Iuciferase de GW antes da adição de D-luciferinaaboliu completamente a intensificação bioluminescente (Figura 19).

O segundo controle olhou para a resposta da luciferase de GWao ATP/Mg (concentrações de 2 mM e 4 mM, respectivamente). A Figura 20mostra a resposta de 50 μL do Iisado de luciferase de GW à adição deATP/Mg com e sem a adição simultânea de D-luciferina. A intensificação nabioluminescência não é causada por ATP ou Mg, mas pela presença de D-luciferina.

Outros controles foram executados usando uma diferente lucife-rase com D-luciferina e um diferente substrato com Iuciferase de GW. Asubstituição de Iuciferase de GW com uma Iuciferase tipo drosophila induzi-da por IPTG não resultou em qualquer intensificação significativa da biolumi-nescência na adição de D-luciferina em comparação com um Iisado de célu-las não-induzido (Figura 21). A substituição de D-luciferina com o substratode celentarazina bioluminescente mais eficiente (CLZN-hcp (1 μ/100 μL) nãoresultou em qualquer intensificação bioluminescente na adição com a Iucife-rase de GW em comparação com aquela do lisado celular de controle (Fiqu-ra 22).

A reação de intensificação de bioluminescência observada namistura da Iuciferase de GW e de D-Iuciferina é devido à interação específicaenvolvendo esses dois componentes na presença de ATP.

Exemplo 8: Sistema de bioluminescência de Arachnocampa RichardsaePreparação de extrato bruto: Método 1

Esse método foi adaptado daquele descrito por Viviani et al(2002). Extratos brutos de Arachnocampa foram preparados pela homoge-neização de 5 órgãos de luz em 0,5 mL de tampão de extração gelado (trici-na a 27 mM, MgSO4 a 7 mM, EDTA a 0,2 mM, 10% de glicerol e 1% a TritonX-100, pH 7,4. Depois da homogeneização, os extratos foram centrifugadosa 15.000 g por 15 minutos a 4 °C. O extrato quente foi preparado pelo aque-cimento do sobrenadante a 98 °C por cinco minutos e pela adição de ATP a1 mM (concentração final). A atividade da Iuciferase foi determinada pelamistura de 10 μί de extrato quente com 90 μΙ_ de solução tampão reacionalcontendo 0,84 mL de tampão Tris-HCI (pH 8), 0,11 mL de Iuciferase de va-ga-lume ("glow-worm") ou de pirilampo ("firefly") e 0,05 mL de ATP/Mg(40/80 mM).

Preparação de extrato bruto: Método 2

No segundo método, o extrato bruto foi preparado pela adiçãode 100 μL de acetato de etila a cinco órgãos de luz congelados em um tubode eppendorf e, após a homogeneização, os extratos foram centrifugados a15.000 q por 5 minutos. O eppendorf contendo os órgãos de luz foi mantidoem gelo seco enquanto o processo de homogeneização foi executado. En-saios de bioluminescência in vitro foram executados pela mistura de 20 μίde extrato bruto com solução tampão reacional contendo tampão tris-acetato(25 mM), acetato de magnésio (4 mM) e ATP (2 mM) (todas concentraçõesfinais) para produzir um volume final de 100 μL.

Ensaio de luciferase GW

O tampão reacional contendo tampão tris-acetato (25 mM), ace-tato de magnésio (4 mM), ATP (2 mM) (todas concentrações finais) e Iisadode células de Iuciferase de GW para produzir um volume final de 100 uL fo-ram adicionados a 20 μΙ_ de extrato bruto.

Atividade do extrato bruto

Investigações iniciais tentando replicar os experimentos de ex-trato quente-frio com a Iuciferase de GW descrita por Viviani et al. (2002)não foram bem-sucedidas. A adição de Iuciferase de GW, sem a adição si-multânea de ATP, às amostras de extrato bruto preparadas conforme descri-to resultou em um lampejo de atividade bioluminescente. Esse efeito foi re-produzível na adição adicional de Iuciferase de GW com a adição simultâneade ATP. Esse tipo de lampejo é característico do tipo de lampejo geralmentevisto na adição de Iuciferase em excesso e de ATP à D-luciferina.

Espectros de luminescência

Após a demonstração positiva da atividade da Iuciferase de GWna presença de D-luciferina, o espectro de fluorescência e de biolumines-cência tanto das Iuciferases GW quanto FF na adição de D-luciferina foramregistrados.

Preparação da solução. Uma solução de 0,5 ml_ foi preparadapela mistura de 450 μΙ_ de solução tampão de ensaio e de reagente de en-saio comercial (Promega), com 50 μΙ_ da Iuciferase correspondente confor-me indicado. A mistura foi executada em uma cubeta de fluorímetro de 1 mMe o espectro registrado por um fluorímetro de fluorescência CAry Eclipseusando o modo de varredura de comprimento de onda. Os espectros de bio-luminescência foram registrados imediatamente após a mistura das soluçõese os espectros de fluorescência foram registrados antes e depois da adiçãoda respectiva luciferase, conforme indicado.

Espectro de bioluminescência

O espectro de bioluminescência normalizado tanto da luciferasede GW (Arachnocampa) quanto de FF (vaga-lume, Photinus) na adição deD-luciferina estão mostrados na FIG 23. A bioluminescência máxima induzi-da pela adição de luciferase de GW fraca entre 440 e 480 nm. O uso da Iuci-ferase de GW no lugar da luciferase de FF resulta em uma alteração hipso-crômica no espectro de emissão de 555 nm para abaixo de 530 nm. O má-ximo reportado para a luciferase de FF é de 562 nm em pH 7,6. As intensi-dades máximas dos espectros variaram consideravelmente, sendo de 90,98unidades arbitrárias (a. u.) e de 3,12 a. u. para as luciferases de FF e GW,respectivamente.

Exemplo 9: isolamento de luciferases homólogas de outras espécies de Ara-chnocampa

Conforme revisado em Baker (2004), por diversos anos, quatroespécies australianas de Arachnocampa fluorescentes foram reconhecidas.Essas foram Arachnocampa fiava, Araehnocampa riehardsae, Arachnocam-pa tasmaniensis e Araehnoeampa luminosa, a qual é endêmica da Nova Ze-lândia. O primeiro par de espécies é atribuído ao subgênero Campara e oúltimo par ao subgênero Arachnocampa. Em sua pesquisa de doutorado,Baker (op cit.) obteve evidências convincentes de que o díptero biolumines-cente australasiático é representado por pelo menos nove espécies biológi-cas. Além das quatro espécies já mencionadas, Baker (op. Cit.) descreveucinco novas espécies australianas, a saber: Arachnocampa buffaloensis,Arachnnoeampa tropicus, Arachnocampa girraweenensis, Arachnocampagippslandensis e Arachnocampa otwayensis. Além da Arachnocampa spp. ea Orfelia fultoni norte-americana (Fulton, 1941; Viviani, 2002), houve relató-rios ocasionais das espécies Iuminescentes de dípteros, geralmente Kero-platus spp. (por exemplo, resumido em Sivinski, 1998; Baker, 2004). Essesrelatórios são geralmente pouco documentados e se referem a espécies quegeralmente não são encontradas nas agregações localmente abundantescaracterísticas da fauna australasiática. O presente pedido demonstra a via-bilidade de isolar seqüências codificadoras de Iuciferases de outros dípterosbioluminescentes, usando a seqüência de A. riehardsae para projetar inicia-dores de PCR e algumas espécies australianas prontamente disponíveis deArachnocampa como exemplos.

Métodos e resultados

Homólogos do gene da Iuciferase de A. riehardsae de três outrasespécies de Arachnocampa foram isolados, clonados e seqüenciados. Astrês espécies foram Arachnocampa fiava e Arachnocampa girraweenensisdo subgênero Campara, e Arachnocampa tasmaniensis do subgênero Ara-chnocampa. Para cada uma dessas espécies, de duas a cinco espécies delarva foram coletadas a partir de seus habitantes naturais, e foram transferi-das vivas para o laboratório dentro de 24 horas. Espécimes de cada espécieforam dessecadas sob solução salina tamponada com Tris ou fosfato. Ór-gãos de luz cortados, com alguns tecidos ao redor ligados, foram reunidos econgelados instantaneamente a -80 °C.

A. Extração de RNA

Para cada uma das três espécies, o RNA total de dois ou trêsórgãos de luz foi extraído usando o "RNAqueous-MicroKit" (Ambion, cat. no.1931), seguindo as instruções do fabricante.

B. Síntese de DNAc

1. Síntese de DNAc do primeiro filamento: DNAc de fita única foisintetizado usando iniciadores do kit de construção da biblioteca de DNAcCreator SMART (Clontech/BD Biosciences, no. Cat. K1053-1). As reaçõesforam efetuadas seguindo as instruções do fabricante. A transcriptase rever-sa fornecida no kit foi diretamente substituída com Transcriptase ReversaPowerScript fresca (BD Biosciences, no. Cat. 639500).

2. Síntese de DNAc da segunda fita: DNAc de fita dupla (ds) foisintetizado por PCR de longa distância, usando os iniciadores fornecidoscom o kit de construção da biblioteca de DNAc Creator SMART. Usando 2μΙ_ do primeiro filamento de DNAc, sintetizado conforme descrito na seçãoprecedente, 25 ciclos térmicos de amplificação foram efetuados, seguindo asinstruções do kit. DNA polimerase no kit foi diretamente substituída com amistura de DNAc polimerase Advantage fresca (BD Biosciences, cat. no.50595).

C. Clonagem da DNAc Iuciferase por PCR1. A. fiava e A. Girraweenensis

Porções dos DNAs da Iuciferase de A. fiava e A. Girraweenensisforam amplificadas a partir de seus respectivos pools de DNAc. As reaçõesde PCR foram efetuadas usando a DNA polimerase HotStarTaq (Qiagen, no.Cat. 203203), com iniciadores de PCR projetados para complementar o geneda Iuciferase de A. richardsae (Tabela 6).Tabela 6: Seqüências dos iniciadores de DNAc de luciferase de A. richard-sae mencionados no texto e na Tabela 7.

<table>table see original document page 97</column></row><table>

Para A. fiava, 30 combinações dos pares de iniciadores foramtestadas (Tabela 7), e 40 ciclos térmicos de amplificação foram efetuadosseguindo as instruções do fabricante. Vinte e nove das 30 combinações depares de iniciadores amplificaram produtos únicos do tamanho esperado.Dois produtos de PCR (Tabela 7) foram purificados com reagente DNA Cle-an up da microCLEAN (Astral, cat. no. 2MCL-5) e seqüenciados com inicia-dores específicos para a seqüência de DNAc da luciferase de A. richardsae.Uma comparação BESTFIT mostrou que a seqüência de nucleotídeos da A.fiava foi 96% idêntica à seqüência de DNAc determinada anteriormente daluciferase de A. richardsae. Isso confirmou a identidade da seqüência de A.Fiava como um homólogo da Iuciferase de A. richardsae.

Para A. Girraweenensis, somente quatro combinações dos inici-adores específicos do gene da luciferase de A. Richardsae foram testadas(Tabela 7) usando as mesmas condições de PCR conforme descrito na se-ção precedente. Todas as quatro combinações de pares de PCR amplifica-ram produtos únicos do tamanho esperado. Dois produtos de PCR (Tabela7) foram purificados e seqüenciados com os iniciadores específicos da se-qüência de DNAc da Iuciferase de A. richardsae. Uma comparação BESTFITmostrou que a seqüência de nucleotídeos de A. girraweenensis foi 96,5%idêntica à seqüência de DNAc previamente determinada de Iuciferase de A.richardsae. Isso confirmou a identidade da seqüência de A. girraweenensiscomo um homólogo da Iuciferase de A. richardsae.

As extremidades 5' e 3' dos DNAsc de Iuciferase de A. fiava e A.girraweenensis foram amplificadas separadamente por PCR semiancorado:cada par de iniciador incluiu um iniciador específico de seqüência de DNAcde Iuciferase de A. richardsae, e um segundo iniciador que complementouuma porção do iniciador SMART usado na síntese de DNAc de DNAc ds deA. fiava e A. girraweenensis (Tabela 8). DNAc de dupla fita foi usado comomolde e reações de PCR "touchdown" foram efetuadas com DNA polimerasePfx50 e 40 ciclos térmicos de amplificação, seguindo as instruções do fabri-cante.

Para a amplificação da extremidade 5', duas combinações depares de iniciadores foram testadas com ambas as espécies (Tabela 9).Ambos os pares de iniciadores amplificaram produtos únicos do tamanhoesperado tanto para A. fiava quanto para A. girraweenensis (Tabela 9).

Para a amplificação da extremidade 3', duas combinações depares de iniciadores foram testadas para ambas as espécies (Tabela 10).Ambos os pares de iniciadores amplificaram produtos únicos do tamanhoesperado tanto para A. fiava quanto para A. girraweenensis (Tabela 10). Pa-ra ambas as espécies, um produto de cada amplificação da extremidade 3' e5' foi seqüenciado, o que revelou a seqüência tanto da extremidade 5' quan-to da extremidade 3' da DNAc luciferase. Para os genes tanto da Iuciferasede A. fiava quanto de A. girraweenensis, os primeiros 40 nucleotídeos e osúltimos 40 nucleotídeos da ORF foram idênticos àquelas da ORF de DNAcde luciferase de A. richardsae. A ORF completa para ambos os genes deluciferase de A. fiava e de A. girraweenensis foi amplificada por PCR "touch-down" com os dois iniciadores pETGWLucF e pETGWLucR, descritos naseção de expressão de Virgínia. As reações foram efetuadas com DNAc defita única como molde e DNA Polimerase Pfx50 (Invitrogen, cat. no. 12355-012) e amplificadas seguindo as instruções do fabricante. Os amplicons de1,6 Kb foram seqüenciados nas suas totalidades. As seqüências de peptí-deos da Iuciferase de A. fiava e A. girraweenensis foram descobertas comosendo 99,6% e 99,8% idênticas, respectivamente, ao gene da Iuciferase deA. richardsae.

2. A. tasmaniensis

Ambas as extremidades 5' e 3' do DNAc de Iuciferase de A. tas-maniensis foram diretamente amplificadas por PCR semiancorado. Uma va-riedade de pares de iniciadores foi testada para cada extremidade (Tabela11; Tabela 12). DNAc de fita dupla foi usado como molde e as reações dePCR "touchdown" foram efetuadas com DNA polimerase Pfx50 e 40 ciclostérmicos de amplificação, seguindo as instruções do fabricante.

Para a amplificação da extremidade 5', seis combinações de pa-res de iniciadores foram testadas. Dois desses amplificaram produtos únicosdo tamanho esperado. Um dos produtos (Tabela 11) foi diretamente clonadoem pJET1/vetor de clonagem cego (Fermentas, cat. no. K1221) seguindo asinstruções do fabricante.

Para amplificar a extremidade 3', duas combinações de pares deiniciadores foram testadas. Um par (Tabela 12) amplificou um único produtodo tamanho esperado, que foi diretamente clonado no pJET1/vetor de clo-nagem cego. Quatro clones de cada um dos dois produtos clonados foramseqüenciados com os iniciadores de seqüenciamento pJET1. Uma compara-ção da seqüência de DNA BESTFIT para o DNAc da Iuciferase de A. ri-chardsae mostrou 83% de identidade na extremidade 5', e 88% de identida-de na extremidade 3'. Uma comparação de seqüência de peptídeo BESTFITpara o gene da Iuciferase de A. richardsae mostrou 89% de identidade e93% de identidade na extremidade 5' e na extremidade 3', respectivamente.

Esses dados confirmaram que os dois amplicons de PCR foram derivadosde um homólogo provável da DNAc de Iuciferase de A. richardsae. Tanto oinício quanto a extremidade da ORF foram identificados. Iniciadores foramdesignados que foram complementares ao início e fim da ORF de Iuciferasede A. tasmaniensis, para amplificar o ORF completo:

A.tasLucORF-F: 5'-ATGACTTCTACATCTGTGGA-3'; (SEQ ID NO: 31)A.tasLucORF-R: 5-TTACAATGTTGATCTTAAAATAC-3'; (SEQ ID NO: 32)

Tabela 7: Combinações de iniciadores de DNAc de A. richardsae testadascom DNAc ds de A. fiava.

<table>table see original document page 100</column></row><table>

Y: Produto único de tamanho esperado amplificado

N: nenhum produto de tamanho esperado amplificado

-: combinação de iniciador não-testado

*g: combinação de iniciador também testada com A. girraweenensis-, e pro-duto único aomplificado de tamanho esperado

N° *f,g: Produto seqüenciado de A. fiava e A. girraweenensis

Tabela 8: Seqüências de iniciador usadas para a amplificação das extremi-dades 5' e 3' dos DNAsc de luciferase.

<table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table>

*: Iniciadores da seqüência de DNAc de Iuciferase de A. richardsaeTabela 9: Combinações de iniciadores testadas quanto à amplificacão daextremidade 5' da Iuciferase de A. fiava e A. airraweenensis

<table>table see original document page 101</column></row><table>

Y: produto único de tamanho esperado amplificado

-: combinação de iniciadores não-testada

*f,g: produto seqüenciado, tanto para A. fiava quanto para A. girraweenensis

Tabela 10: Combinações de iniciadores testadas quanto à amplificacão daextremidade 3' da Iuciferase de A. fiava e A. Qirraweenensis

<table>table see original document page 101</column></row><table>

Y: produto único de tamanho esperado amplificado

* f,g: produto seqüenciado, tanto para A. fiava quanto para A. girraweenensisTabela 11: Combinações de iniciadores testados quanto à amplificacão daextremidade 5' da Iuciferase de A. tasmaniensis.

<table>table see original document page 101</column></row><table>

Y: produto único de tamanho esperado amplificado

N: nenhum produto de tamanho esperado amplificado-: combinação de iniciadores não-testada*: produto único clonado e seqüenciadoTabela 12: Combinações de iniciadores testadas quanto à amplificação daextremidade 3' da Iuciferase de A. tasmaniensis.

<table>table see original document page 102</column></row><table>

Y: produto único de tamanho esperado amplificadoN: nenhum produto de tamanho esperado amplificado

*: produto único clonado e seqüenciado

Tabela 13: Comparação em pares de identidade/similaridade de aminoáci-dos para as quatro espécies de Arachnocamoa

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Usando as abordagens de PCR descritas nas seções preceden-tes, foram isolados diretamente não somente os DNAsc de Iuciferase de A.fiava e de A. girraweenensis, mas também de A. tasmaniensis. Dados osaltos níveis de homologia de seqüência observados dentre as espécies nosubgênero Campara, também poderiam ser usados diretamente as técnicasdescritas aqui para isolar Iuciferases de Arachnocampa (Campara) gippslan-densis, Araehnoeampa (Campara) otwayensis, Araehnoeampa (Campara)tropieus e de fato qualquer outra espécie do gênero Arachnocampa, subgê-nero Campara que possa ser descrita no futuro. Além disso, foi demonstradoque usando iniciadores de PCR específicos para A. riehardsae, é possívelsem experimentação demasiada isolar a Iuciferase de A. tasmaniensis. Serápossível, dessa forma, concluir que poderia se recuperar diretamente Iucife-rases homólogas de outras espécies classificadas no subgênero Arachno-campa, incluindo Arachnocampa luminosa e Arachnocampa buffaloensis e,de fato, qualquer outra espécie do gênero Arachnocampa que possa serdescrita no futuro. É claro, será muito mais direto usar iniciadores específi-cos para a seqüência de Iuciferase de A. tasmaniensis para recuperar Iucife-rases homólogas de outras espécies do subgênero Arachnocampa usandoas estratégias e métodos anteriormente descritos. Não é necessário recorrerà varredura de bibliotecas de DNAc para isolar as Iuciferases de A fiava, A.girraweenenis ou A tasmaniensis. Entretanto, a abordagem da varredura dabiblioteca, conforme anteriormente descrito, poderia ser uma forma viável derecuperar Iuciferases homólogas não somente de outros membros do gêneroArachnocampa1 mas também de outros dípteros azul-luminescentes maisdistantemente relacionados, tais como Orfelia fultoni ou Keroplatus spp.

Devido ao fato de ser possível isolar seqüências codificando Iuci-ferases homólogas de tão poucos quanto dois órgãos de luz de Arachno-campa spp., também se acredita que isso poderia ser possível, usando osmétodos descritos, para amplificar e isolar uma Iuciferase homóloga de mes-mo um único espécime de um díptero azul-luminescente, tal como aquelasespécies, mencionadas por Sivinski (1998), para as quais somente espéci-mes individuais são constantemente encontrados.

Exemplo 10: Expressão bacteriana de Iuciferase de vaaa-lume: vetores deexpressão, células hospedeiras, regimes de indução e etiquetas de fusão

Constructos de expressão e regimes de indução alternados paraa expressão bacteriana de GWLuc N01.

Em uma tentativa de otimizar a expressão e particionamentosubcelular de GWLuc N0 1 expresso de forma bacteriana, as seguintes vari-áveis do regime de indução foram manipuladas conforme descrito na seguin-te seção; (i) período de indução, (ii) temperatura de indução, (iii) concentra-ção de IPTG e (iv) cepa de E. coli (Revista em Derewenda, 2004). Uma se-gunda estratégia utilizada foi criar fusões N-terminais entre o GWLuc N0 1 eos marcadores, tiorredoxina (Trx; por exemplo, vetor de expressãopET48b(+)) e NusA (por exemplo, vetor de expressão pET50b(+)). Essesmarcadores foram demonstrados como tendo efeitos positivos tanto na ex-pressão de proteína quanto na solubilidade.(Revisado em Hammarstrõm,Hellgren, van den Berg, Berglund e Hàrd, 2002). Um constructo de fusão6His N-terminal com GWLuc N0 1 também foi criado para demonstrar adicio-nalmente a capacidade de criar proteínas de fusão GWLuc N0 1. O marcadorHis foi escolhido porque ele é responsável pela purificação usando cromato-grafia de metal-íon quelato.

Análise do particionamento de FFLuc e WLuc N0 1 expresso embactérias.

Péletes bacterianos congelados foram Iisados com 100 μl demistura de lise recentemente preparada (reagente de lise de cultura de célu-las de luciferase 1x), 1,25 mg ml-1 de lisozima). Após a incubação em tem-peratura ambiente por 10 minutos, o lisado foi centrifugado por 20 minutos a16.000 g em temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido e a eletampão de amostra de laurildodecilsulfato NuPAGE® contendo DTT a 50mM foi adicionado. O pélete foi lisado pela adição de tampão de amostra delaurildodecilsulfato NuPAGE® 1 χ contendo DTT a 50 mM e o DNA cromos-somal cisalhado passando o lisado bacteriano através de uma agulha 30Gvárias vezes. As amostras de pélete e sobrenadante foram analisadas usan-do o sistema de Gel Bis-Tris Novex NuPAGE® conforme descrito anterior-mente.

Regimes de indução alternados para a expressão bacteriana deGWLuc N0 1 natural.

Os constructos pETDuet-1 de Iuciferases de P. pyralis e A. ri-chardsae naturais expressos na cepa de E. coli BL21 (DE3) foram submeti-dos a regimes de indução alternados. Das culturas e pré-indução preparadasconforme anteriormente descrito, alíquotas de 5 mL foram, cada uma, trans-feridas para tubos de centrífuga cônicos de 50 mL. As alíquotas foram ounão-induzidas (água adicionada a um volume equivalente de IPTG a 0,4mM) ou induzidas pela adição de IPTG até uma concentração final de 0,1mM, 0,2 mM ou 0,4 mM. Essas culturas foram incubadas a 10 °C ou 20 °C,150 rpm por 24, 48 (10 °C e 20 °C) ou 120 (10 °C somente) horas, em cujostempos a Abs600 nm de cada cultura foi medida. Três de quatro alíquotas de0,25 - 0,5 mL foram removidas de cada cultura e centrifugadas a 10.000 gpor 5 minutos em temperatura ambiente. O pélete foi estocado a -80 °C paraanálise de proteína.

Os constructos pETDuet-1 de Iuciferases de P. pyralis e A. ri-chardsae naturais foram eletroporados na cepa Rosetta-gami® B(DE3) de E.coli como anteriormente descrito para as cepas de E. coli de DH5a eBL21(DE3). As culturas foram pré-induzidas conforme anteriormente descritopara pETDuet-1 :GWLuc N0 1 em BL21(DE3). Ao alcançar uma abs600 nmde 0,6 - 1,0, alíquotas de 5 mL foram, cada uma, transferidas para tubos decentrífuga cônicos de 50 mL. As alíquotas foram ou não-induzidas (água a-dicionada até um volume equivalente de IPTG a 0,4 mM) ou induzidas pelaadição de IPTG até uma concentração final de 0,2 mM ou 0,4 mM. Essasculturas foram incubadas ou a 10 0C ou a 20 °C, 150 rpm por 4 (20 0C so-mente), 24, 48 (10 0C e 20 0C) ou 120 (10 0C somente) horas, em cujostempos a Abs600 nm de cada cultura foi medida. Três de quatro alíquotas de0,25 - 0,5 mL foram removidas de cada cultura e centrifugadas a 10.000 gpor 5 minutos em temperatura ambiente. O pélete foi estocado a -80 0C paraanálise de proteína.

A construção de uma proteína de fusão GWLuc N0 1 6 His N-terminal em pETDuet-1.

O DNAc de comprimento total de GWLuc N01 foi amplificado por20 ciclos usando a DNA polimerase Platinum Pfx seguindo as recomenda-ções do fabricante usando 2 ng de molde e 10 pmols dos iniciadores NHis-GWLuc N0 1 (Sl-GAgaattcGATTGAGGGACGCATGGCTTGTACTTCAGT-S';SEQ ID NO: 42) e pETGWLucR (5'-GACGACcctaggTTACAATGTTCCTCTTAAA-3'; SEQ ID NO: 16). Esses ini-ciadores introduziram os sítios de restrição EcoRI e Avrll (letras minúsculas)5' e 3' do DNAc de Iuciferase de A. richardsae de comprimento total. Ao pro-duto purificado foi adicionada uma cauda poli A conforme descrito anterior-mente e ligado em pGEM T-easy. Os constructos foram eletroporados nacepa DH5a de E. coli e foram seqüenciados usando o seqüenciador "CEQ2000 Dye Terminator Cycle Sequencing" com o kit de início rápido e 50fmols de DNA de plasmídeo. O constructo livre de erros, de comprimentototal foi cortado com EcoRI (Fermentas) e Avrll e inserido no pETDuet-1 Ii-nearizado EcoRI/AvrlI e o plasmídeo resultante foi designado pETDuet:NHis-GWLuc N0 1. Esses plasmídeos foram eletroporados na ceoa BL21ÍDE3) deΕ. coli conforme anteriormente descrito e seqüenciado.

Construção de pET-48b(+)AmpR:GWLuc N0 1 e pET-50b(+)AmpR:GWLucN0 1.

A resistência à ampicilina foi conferida nos vetores de expres-são, pET-48b(+) (marcador Trx N-terminal) e pET-50b(+) (NusA etiqueta N-terminal) (Novagen, EMD Biosciences) pela inserção do gene de resistênciaà ampicilina de pTAL-Luc no sítio da enzima de restrição Sphl presente emcada vetor. O gene de resistência à ampicilina de pTAL-Luc (pb 4148-3218na fita negativa + 10 pb imediatamente 5' e 3' ao gene) foi amplificado por 20ciclos usando DNA polimerase Platinum Pfx seguindo a recomendação dofabricante, usando 2 ng de molde e 10 pmols dos iniciadores AmpRCasS-phlF (5'-TAGCGAAgcatgcGGTCTGACAGTTACCAA-3·; SEQ ID NO: 43) eAmpRCasSphIR (5'-CGTAAGCgcatgcTCTAAATACATTCAAATATG-3'; SEQID NO: 44). Cada iniciador introduziu um sítio de enzima de restrição Sphl(letras minúsculas) na extremidade 5' e 3' do gene de resistência à ampicili-na. O produto de PCR foi purificado usando microCLEAN, digerido com Sphl(New England Biolabs) e novamente purificado usando microCLEAN. O pro-duto de PCR do gene de resistência à ampicilina digerido Sphl foi ligado empET-48b(+) ou pET-50b(+) Iinearizado Sphl, desfosforilado, eletroporado nacepa DH5a de E. coli e seqüenciado usando o seqüenciador "CEQ 2000Dye Terminator Cycle Sequencing" com o kit de início rápido e 25 fmols deDNA de plasmídeo. Os plasmídeos resultantes foram designados pET-48b(+)AmpR e pET-50b(+)AmpR, respectivamente.

O DNAc de comprimento total de GWLuc N0 1 foi amplificado por20 ciclos usando a DNA polimerase Platinum Pfx seguindo as recomenda-ções do fabricante usando 2 ng de molde e 10 pmols dos iniciadores G-WLucI FHRV3C (5'-gggacccATGGCTTGTACTTCAG-3'; SEQ ID NO: 45) epETGWLucR (5'-GACGACcctaggTTACAATGTTCCTCTTAAA-3'; SEQ IDNO: 16). Esses iniciadores introduzem os sítios de restrição SanDI e Avrll(letras minúsculas) 5' e 3' do DNAc de Iuciferase de A. richardsae de com-primento total. Ao produto purificado foi adicionada uma cauda poli-A con-forme descrito anteriormente e ligado no pGEM T-easy. Os constructos fo-ram eletroporados na cepa DH5f de E. coli e foram seqüenciados usando oseqüenciador "CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing" com o kit deinício rápido e 50 fmols de DNA de plasmídeo. O constructo livre de erros decomprimento total foi cortado com SanDI (Stratagene, La Jolla CA) e Avrll einserido ou no pET-48b(+)AmpR ou pET-50b(+)AmpR linearizado San-Dl/Avrll e os plasmídeos resultantes foram designados pET-48b(+)AmpR:GWLuc N0 1 e pET-50b(+)AmpR:GWLuc N0 1, respectivamen-te. Esses plasmídeos foram eletroporados para a cepa BL21(DE3) de E. coliconforme anteriormente descrito e seqüenciado. Um constructo livre de errosde cada vetor de expressão; pET-48b(+)AmpR, pET 48b(+)AmpR:GWLuc N01, pET-50b(+)AmpR e pET-50b(+)AmpR:GWLuc N0 1 foi eletroporado para acepa Rosetta-gami® B(DE3) de E. coli.

Regimes de indução para pETDuet:NHis-GWLuc N0 1. pET-48b(+)AmpR:GWLuc N0 1 e pET-50b(+)AmpR:GWLuc N0 1.

Culturas de pré-indução de pETDuet-1:NHis-GWLuc N0 1 emBL21(DE3) foram conforme anteriormente descrito para pETDuet-1 .GWLucN0 1 in BL21(DE3). Alíquotas (10 mL) foram ou não-induzidas (água adicio-nada a um volume equivalente de IPTG a 0,4 mM) ou induzidas pela adiçãode IPTG até uma concentração final de 0,4 mM. Essas culturas foram incu-badas ou a 20 °C ou a 37 °C, 150 rpm por 1, 2, 3, 5 e 24 horas a 37°C ou 2,5, 24, 30 e 48 horas a 20 °C, em cujos tempos a Abs600 nm de cada culturafoi medida. Cinco alíquotas de 0,5 mL e três de 1,5 mL foram removidas decada cultura e centrifugadas a 10.000 g por 5 min em temperatura ambiente.

O pélete foi estocado a 80 0C para análise de proteína.

As culturas de pré-indução de pET-48b(+)AmpR, pET-48b(+)AmpR:GWLuc N0 1, pET-50b(+)AmpR e pET-50b(+)AmpR:GWLuc N01 em B(DE3) Rosetta-gami® são conforme anteriormente descrito para pET-Duet-1 :GWLuc N0 1 em BL21(DE3). Ao alcançar uma Abs600 nm de 0,6 -1,0, alíquotas de 5 mL de cada cultura de pré-indução foram transferidaspara tubos de centrífuga cônicos de 50 mL. As alíquotas foram ou não-induzidas (água adicionada até um volume equivalente de IPTG a 0,4 mM)ou induzidas pela adição de IPTG até uma concentração final de 0,1 mM, 0,2mM ou 0,4 mM. Essas culturas foram incubadas ou a 10 0C ou a 20 °C, 150rpm por 24 ou 48 horas, em cujos tempos a Abs600 nm de cada cultura foimedida. Quatro de cinco alíquotas de 0,20 - 1,0 mL foram removidas de ca-da cultura e centrifugadas a 10.000 g por 5 minutos em temperatura ambien-te. O pélete foi estocado a 80 0C para análise de proteína.

Ensaios bioluminescentes de GWLuc N0 1 expresso em bactérias com regi-mes de indução alternativos e constructos de expressão.

Os ensaios bioluminescentes foram executados conforme ante-riormente descrito pela adição ou de 100 μΙ_ de tampão reagente Promega à20 μΙ_ de Iisado celular ou tampão caseiro para amostras de Iisado celular. Abioluminescência foi registrada ou com o luminômetro Wallad 420 Victor 2(Perkin-EImer) usando o modo de cinética de lampejo (tempo de integração= 0,5 s e o n° de repetições = 100) ou um POLARstar OPTIMA (BMG) ope-rado em modo de bioluminescência (tempo de intervalo = 0,2 s, ganho paraPMT = 4095, n° de intervalos = 200, tempo de normalização = 0,5 s).

Resultados

Ambas as Iuciferases nativas foram expressas em bactérias u-sando uma faixa de regimes de indução. Os constructos de fusão GWLuc N01 N-terminais Trx e NusA foram expressos com sucesso na cepa de E. coliB(DE3) de Rosetta-gami® e o constructo de fusão GWLuc N0 1 N-terminal6His foi expresso com sucesso em BL21(DE3) já em uma hora a 37°C e du-as horas a 20°C.

Luciferase de A. richardsae expressa na cepa de E. coli B(DE3)de Rosetta-gami® com o constructo pETDuet-1 induzida sob regimes alter-nativos foi ensaiada para determinar a atividade de bioluminescência na adi-ção de tampão feito em casa. Os Iisados celulares mais ativos foram produ-zidos pela incubação das culturas por 48 horas a 20 0C em comparação comas amostras preparadas a partir de culturas as quais foram incubadas a 100C ou 20 0C por 24 horas. Se a atividade bioluminescente de Iuciferase de A.richardsae expressa na cepa de E. coli B(DE3) de Rosetta-gami® foi compa-rada com aquela expressa na cepa de E. coli BL21(DE3) houve um aumentopor um fator de aproximadamente dois. Deve ser notado que a Iuciferase deA. richardsae foi expressa em um nível muito mais elevado em BL21(DE3)de E. coli do que em Rosetta-gami® B, implicando que a atividade específicada proteína Iuciferase expressa é muito mais elevada no sistema de Rosetta-gami® Β. A Iuciferase de A. richardsae marcada com NusA e tiorredoxinaexpressa na cepa de E. coli de B(DE3) de Rosetta-gami® não produziu qual-quer atividade bioluminescente significativa (P = 0,05) em comparação comaquela do vetor de controle sob qualquer um dos regimes de indução aqui descritos.

O particionamento subcelular das Iuciferases de P. pyralis (F-FLuc) e A. richardsae (GWLuc N0 1) expressas foi determinado. Baseando-se na coloração de proteína dos géis FFLuc particionados predominante-mente para o sobrenadante, com somente uma pequena quantidade sendoretida na fração do pélete. O GWLuc N01 particionou de modo muito diferen-te, com uma proporção significativa particionando para o pélete. Sua pre-sença não foi observada no sobrenadante, baseando-se na coloração deproteína dos géis. Observou-se que, sob nenhuma indução, o particiona-mento da Iuciferase de A. richardsae natural muda do pélete para a fraçãosobrenadante baseando-se na coloração da proteína. Essa observação po-deria explicar porque a sensibilidade das medições de bioluminescência deFFLuc (luciferase de vaga-lume) foi muito maior do que a de GWLuc N0 1 naadição de D-luciferina.

Exemplo 11. Expressão da luciferase de A richardsae no eucarioto Saccha-romyces cerevisiae.

Construção do pYES2:GWLuc N0 1 para a expressão induzívelem Saccharomyces cerevisiae.

O fragmento EcoRI do clone pGEM T-easy contendo o construc-to de DNAc livre de erro de comprimento total de GWLuc N0 1, anteriormenteusado e descrito, em "Construção de pET-48b(+)AmpR:GWLuc N0 1 e pET-50b(+)AmpR:GWLuc N0 1" foi cortado e inserido em pYES2 (Invitrogen) Iine-arizado com EcoRI desfosforilado. Esse plasmídeo, designadopYES2:GWLuc N0 1, foi eletroporado na célula DH5a de E. coli. Transfor-mantes contendo o GWLuc N0 1 na correta orientação foram identificadospor PCR padrão fazendo a triagem usando os iniciadores T7 (5-TAATACGACTCACTATAGGG-3') e pETGWLucR. O DNA de plasmídeo tan-to de pYES2 quanto de pYES2:GWLuc N0 1 foram isolados usando o kit deminipreparação QIAprep Spin (Qiagen) e 1 μg de plasmídeo foi usado paratransformar a cepa de S. cerevisiae S288C (Invitrogen) usando o kit detransformação de levedura (Sigma). Os transformantes de levedura foramselecionados para a uracil prototrofia pela seleção no suplemento de meio"drop out" sintético de levedura sem uracila (SCCM-U) (Sigma) suplementa-do com 2% (p/v) de glicose (Sigma) por 48 horas a 30 °C. A presença dopYES2:GWLuc N0 1 foi reconfirmada pela extração do DNA de plasmídeousando o kit reagente de extração Y-DER® (Pierce, Rockford IL) e repetindoa varredura de PCR descrita acima usando T7 e pETGWLucR.Indução de pYES2:GWLuc N0 1.

Culturas de quinze mL de pYES2 em S288C e pYES2:GWLucN0 1 em S288C em SCCM-U contendo 2% (p/v) de glicose cresceram de umdia para o outro a 28 0C com agitação constante. A Abs600 nm de cada cul-tura de um dia para o outro foi determinada para calcular o volume de culturarequerido para obter uma Abs6oonm de 0,5 em 5 mL. O volume requerido decada cultura foi removido e centrifugado por cinco minutos a 1500 g parapeletizar as células. As células de levedura peletizadas foram ressuspensasem 5 mL ou de meio de não-indução (SCCM-U contendo 2% (p/v) de rafino-se (Sigma)) ou meio de indução (SCCM-U contendo 2% (p/v) de galactose(Sigma) e 2% (p/v) de rafinose). As culturas foram incubadas a 28 0C por 24,48 e 72 horas com agitação constante, e no final da incubação a Abs600 nmde cada cultura foi medida. Alíquotas (0,1 - 0,5 mL) foram removidas de ca-da cultura e centrifugadas a 10.000 g por 5 minutos em temperatura ambien-te. O pélete foi estocado a 80 0C para análise de proteína.

A análise de proteína GWLuc N0 1 expressa por S. cerevisiae foiefetuada conforme descrito com a seguinte modificação. As amostras Iisa-das foram aquecidas a 100 0C por cinco minutos devido à presença da pare-de celular de levedura.

Preparação dos Iisados celulares para ensaio de luciferase.Tampão de Iise passiva 1 X (Promega) foi adicionado aos péle-tes celulares para produzir uma quantidade de células de levedura de 1,446χ 107 com os cálculos baseados em Abs6oonm 1 = 3 χ 107 células/mL. Otampão de Iise passivo foi adicionado imediatamente antes do ensaio comum tempo de mistura de aproximadamente 15 - 20 s.

Ensaio de bioluminescência de Iuciferase de A. richardsae em Saccharomv-ces cerevisiae.

Após a adição do tampão de Iise1 25 μΙ_ da mistura de Iisado ce-lular foram misturados com 75 μΙ_ do tampão de ensaio feito em casa e aprodução de luz monitorada como uma função do tempo com um luminôme-tro Wallad 420 Victor 2 (Perkin-EImer) conforme descrito anteriormente.

Resultados.

A coloração da proteína dos géis não revelou quaisquer diferen-ças entre a(s) cepa(s) de Ievedura(s) executando o constructo GWLuc N0 1 eaquelas que não o carregam. Entretanto, o sistema de expressão pYES2,diferentemente do sistema de expressão pET-E. coli, não é um sistema desuperexpressão. Outros experimentos para identificar a proteína de Iucifera-se de A. richardsae não foram adotados. Ao contrário, ensaios de Iueiferaseforam conduzidos para comparar a(s) fita(s) carregando GWLuc N0 1 e umafita de controle que não carregava. Esse é um método muito mais sensívelpra fazer a triagem quanto à presença de Iuciferase ativa do que a SDS-PAGE e a coloração de proteína.

A bioluminescência pareceu como uma curta explosão de ativi-dade como poderia ser esperado se baixas concentrações de qualquer Iuci-ferase fossem ensaiadas com um grande excesso de D-luciferina/ATP. AFigura 24 mostra a intensidade de bioluminescência (CPS 0,5 s) ou de G-WLuc N0 1 ou do vetor de controle, mediu 1,12 s depois do início do registro,preparado a partir das culturas incubadas a 28 graus por 24, 48 ou 72 horas.A melhor atividade de bioluminescência foi alcançada com Iisados celularespreparados a partir de culturas incubadas por 72 horas e a atividade de G-WLuc N0 1 foi significativamente mais alta (P = 0,05) do que aquela da a-mostra de controle. Isso indica que GWLuc N0 1 foi expresso com sucessoem S. cerevisiae e também exibiu atividade apreciável. Embora a intensida-de bioluminescente (CPS) é de uma magnitude similar quando a luciferasede A. richardsae é expressa ou na cepa BL21(DE3) de E. coli ou S. Cerevi-siae (Figura 24) o nível de expressão no primeiro é muito mais alto do queno último, sugerindo que a atividade específica da Iuciferase expressa é mui-to maior em S. cerevisia do que na cepa bacteriana BL21(DE3).

Todas as publicações e patentes mencionadas no relatório des-critivo acima são aqui incorporadas por referência. Várias modificações evariações do método e sistema descrito da invenção serão aparentes paraaqueles indivíduos versados na técnica sem sair do escopo e espírito da in-venção. Embora a invenção tenha sido descrita juntamente com modalida-des específicas preferidas, deve ser entendido que a invenção conforme rei-vindicada não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específi-cas. De fato, várias modificações dos modos acima descritos para executara invenção os quais são óbvios para aqueles indivíduos versados no campoda biologia molecular ou campos relacionados, devem estar dentro do esco-po das seguintes reivindicações.

REFERÊNCIAS

As seguintes referências, até a extensão que elas proporcionamprocedimentos exemplares ou outros detalhes suplementares para outrosaqui estabelecidos, são especificamente aqui incorporadas por referência.

Patente US 5.484.956

Patente US 5.538.879

PatenteUS 5.576.198

Patente US 5.595.896

Patente US 5.629.470

PatenteUS 5.633.155

Patente US 5.656.466

Patente US 5.670.356

Patente US 5.670.356

Patente US 5.674.731

Patente US 5.689.045Patente US 5.689.049Patente US 5.739.409Patente US 5.744.320Patente US 5.744.320Patente US 5.750.870

Patente US 5.767.367Patente US 5.807.522Patente US 5.837.832Patente US 6.068.979PatenteUS 6.143.502

PatenteUS 6.171.809Patente US 6.270.964PatenteUS 6.297.018Patente US 6.342.345PatenteUS 6.503.723

PatenteUS 6.586.196Patente US 6.602.657Patente US 6.602.658Patente US 6.690.461Patente US 6.927.037

Pedido de Patente U. S. 20030166905 (2003)Adachi1 J. Hasegawa1 M. MOLPHY: programs for molecular ph-ylogenetics, ver 2.3. Institute of Statistical Mathematics, Tokyo (1996).Altschul, etal. J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)Amann etal., Gene 69:301-315 (1988)

Angers, S., A. Salahpour1 et ai Proc Natl Acad Sei U S A 97(7):3684-9 (2000).

Ausubel et a/., "Current Protocols in Molecular Biology", JohnWiley & Sons, (1998).Baker, C. (2004). Australian glow-worms (Diptera: Keroplatidae:

Arachnocampa spp.): distribution, diversity, identity and management. Ph. D.Thesis1 Department of Zoology and Entomology1 University of Queensland,Brisbane: 186ρρ.

Baldari1 et al, EMBO J. 6:229-234 (1987).

Berger, S. L. e A. R. Kimmel eds., 1987 "Methods in Enzymo-logy: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press.

Bowie et a!., Science 247:1306-1310 (1990).

Branchini, B. R., R. A. Magyar1 et al. Biochemistry 37(44): 15311-9(1998).

Branchini, B. R., R. A. Magyar1 et al. Biochemistry 40(8): 2410-8(2001).

Branchini, B. R., T. L. Southworth1 et al. Bioehemistry 42(35):10429-36 (2003).

Conti et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1996 Jul 1;52(Pt4):876-8.

Conti, E., Ν. P. Franks, et al. Structure 4(3): 287-298 (1996).

Creighton, T. E., Proteins--Structure and Molecular Properties,2nd Ed., W. H. Freeman and Company, Nova Iorque (1993).

Cunningham et al., Science 244: 1081-1085 (1989)

Day1 J. C., L. C. Tisi, et ai, Luminescence 19(1): 8-20 (2004).

de Vos et ai Science 255:306-312 (1992)

de Wet1 J. R., Κ. V. Wood1 et ai Molecular and Cellular Biology7(2): 725-37(1987).

Derewenda1 Z.S. (2004) Methods 34: 354-363.

Devereux1 J., et ai, NucIeicAcids Res. 12(1):387 (1984)

Elion E.A. (2003) Unit 3.17 - Constructing recombinant DNAmolecules by the polymerase chain reaction. In Ausubel F.M., Brent R.,Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A. and Struhl K. (Eds)Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., USA.

Felsenstein, J. Cladistics 5: 164-166, 1989

Flanagan, W. M. et ai (1991) J. Virology: 65, 769-786Fulton, Β. B. Annals of the Entomological Society of America 34:289-302 (1941).

Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzy-mology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)119-128)

Gribskov, M. e Devereux, J., eds., Sequence Analysis Primer, MStoekton Press, Nova Iorque, 1991

Griffin, A. M., e Griffin1 H. G., eds., Computer Analysis of Se-quence Data, Part 1, Humana Press, Nova Jérsei, 1994

Hammarstrõm M., et al. (2002) Protein Science 11: 313-321.Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, (1989)Harrison, R. A.. Pacific Insects 8(4): 877-833 (1966).Houghten et ai, Nature 354:84-86 (1991)Jain, V. K. and Magrath, I. T., BioTechniques: 12, 681-683(1992)

Kaufinan etal., EMBO J. 6:187-195 (1987)Keown etal. (1990), Meth. Enzymol. 185:527-537.Kozak, M., Cell 44(2): 283-92 (1986).Kozak, M., Nucleic Acids Res 15(20): 8125-48 (1987).Krause, Μ. H. and S. A. Aaronson, Methods in Enzymology, 200:546-556(1991)

Kujan etal., Cell 30: 933-943(1982)Lam etal., Nature 354: 82-84 (1991)Leckie, F. etal. BioTechniques: 17, 52-57 (1994)Lee, J. Photochemistry and Photobiology 24: 279-285 (1976).Lesk, A. M., ed., Computational Molecular Biology, Oxford Uni-versity Press, Nova Iorque, 1988

Lockhart, D. J. etal., Nat. Biotech. 14: 1675-1680, 1996.

Lucklow et al., Virology 170:31-39 (1989)

Lundin, A. Methods Enzymol 305: 346-70 (2000).

Masuda etal., Gene 77, 265-270 (1989) and

Millican, D. S. and I. M. Bird, Anal Biochem 249(1): 114-7 (1997).

Nakatsu, T. et al. Nature 440:372-376 (2006).

Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)

Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997)

Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea & Leegood,John Wiley & Sons)(1993) pp 275-295.

Promega: Instructions for use of Products E2920, E2940, andE2980, revised 1/06, Part Number TM058. and Promega pGL3 LuciferaseRepórter Vectors (available from Promega Corporation, Madison, Wis.)

Pugsley, C. W., New Zealand Entomologist 7(4): 419-424 (1983).Rattan etal. (Ann. N.Y Acad. Sei. 663:48-62 (1992)Sakurai, Y., R. Komatani, K. Tabata and H. Takaie On the glow-worm breeding at Tama Zoo

Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a.ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)Schena, M. etal. (1996 Proc. Natl. Acad. Sei. 93: 10614-10619)Schultz etal., Gene 54: 113-123 (1987)Seed, B. Nature 329: 840(1987)Seifter et al. (Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990)) eSeliger, Η. H. e W. D. MeEIroy1 Arch Biochem Biophys 88: 136-41 (1960).

Shimomura, Johnson etal. 1966

Shimomura, O., F. H. Johnson, et al., Observations on the bio-chemistry of Iuminescence in the New Zealand glowworm, Arachnocampaluminosa. Bioluminescence in Progress. F. H. Johnson e Y. Haneda. Prince-ton, Princeton University Press: 487-494 (1966).

Smith etal., Gene 67:31-40 (1988)Smith etal., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992)Smith etal., Mol. Cell Biol. 3:2156-2165 (1983)Smith, D. W., ed., Biocomputing: Informatics and Genome Pro-jects, Academic Press, Nova Iorque, 1993

Songyang etal., Cell 72: 767-778 (1993)Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzy-mology 185: 60-89 (1990)

Sivinski, J. M. (1998). Florida Entomologist 81(3): 282-292.Takaie, H. (1989) Breeding and display of the glow-worms, Ara-chnocampa spp. Insectarium, vol. 26 Julho: 214-219Takaie, Η. (1997) Ten years of the glow-worm (Arachnocamparichardsae) rearing at Tama Zoo -Fascination of a living milky way. Insectari-um, vol 34 Novembro: 336-342.

Viviani, Hastings et al. Photochem Photobiol. 75(1): 22-7 (2002)Viviani, V. R., Cell. Mol. Life Sei. 59: 1833-1850 (2002)von Heinje, G., Sequenee Analysis in Molecular Biology1 Aeade-mic Press, (1987)

Wada et al., Nueleie Acids Res. 20: 2111-2118 (1992)WO/1995/011995

WO/1999/066324

W0/2000/024878WOI999/049019

Wold1 F., Posttranslational Covalent Modifieation of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academie Press, Nova Iorque 1-12 (1983)Wood1 Κ. V., (1998) The Chemistry of Bioluminescent RepórterAssays, Promega Notes 65, página 14.

Wood et ai, Science 244, 700-702 (1989)Wood, Κ. V., Evolution of bioluminescence in insects. Vll Interna-tional Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, Wiley, Chi-chester, UK (1983).

Xu, Y., D. W. Piston1 et ai, Proc Natl Acad Sci U S A 96(1): 151-6 (1999)LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisational.)

<120> Arachnocampa Lueiferases

<130> 20294CSI

<140> PCT/AU200 6/001180

<141> 2006-08-18

<150> 60/709,473

<151> 2005-08-19

<160> 45

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1<211> 1713

<212> DNA

<213> Araehnoeampa riehardsae

<400> 1

ateaattgte ttgtgaaatttatggteeta ageegaectttttaaacgat tgagageeaggaaattegtg eateegatattatggcatca gaaagggcgataeattgtaa tgggaacaatactgaagccg aeatgaaeeaaaaagtattt tgccaacgatattgtctttg atgataatgcaatccaaaag tgccatcaaaattgccactg ttttattgaceaatataate tgatccacttttgtgtgtag cacagtactcaatggcacca gggtacttcacaaaaattca aggtcaattaaaacccgaaa ttgcgaacta

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gaaaaaaaaa aaaagaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1713

<210> 2

<211> 530

<212> PRT

<213> Arachnocampa richardsae

<400> 2

Met Ala Cys Thr Ser Val Asn Asn Ile Val Tyr Gly Pro Lys Pro Thr1 5 10 15

Phe Asp Val Leu Lys Glu Ala Asn Ser Tyr Gly Glu Tyr Ala Phe Lys

20 25 30

Arg Leu Arg Ala Arg Gly Asp Glu Val Ser Val Ile Asp Ala Leu Thr35 40 45

Gly Glu Glu Ile Arg Ala Ser Asp Ile Tyr Ala Lys Thr Val Arg Thr50 55 60

Ala Glu Cys Leu Gln Ala Tyr Gly Ile Arg Lys Gly Asp Arg Val Gly65 70 75 80

Ile Cys Ser Asp Thr Met Ile Glu Tyr Tyr Tyr Ile Val Met Gly Thr

85 90 95

Met Ala Val Gly Ala Ile Ile Cys Pro Ile Ile Ile Ser Trp Thr Glu100 105 110Ala Asp Met Asn His Ala Phe Asn Ile Ser Cys Pro Thr Val Phe Phe

115 120 125

Val Ser Lys Ser Ile Leu Pro Thr Ile Ala Arg Ile Ala Lys Arg Asn

130 135 140

Pro Tyr Val Lys Asp Ile Ile Val Phe Asp Asp Asn Ala Pro Glu Lys145 150 155 160

Pro Leu Ile Ser Phe Lys Asp Phe Leu Ala Asn Pro Lys Val Pro Ser

165 170 175

Lys Pro His Phe Asp Cys Glu Pro Gln Asp Met Glu Asn Thr Ile Ala

180 185 190

Thr Val Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Gly Ile Ser Lys Gly Val Ala

195 200 205

Ile Ser Gln Tyr Asn Leu Ile His Phe Met Ser Leu Asp Thr Lys Thr

210 215 220

Tyr Lys Lys Gly Leu Phe Leu Cys Val Ala Gln Tyr Ser Asn Ala Phe225 230 235 240

Gly Phe Thr Ala Leu Met Arg Arg Ala Phe Asn Gly Thr Arg Val Leu

245 250 255

His Leu Pro Arg Tyr Asp Glu Lys Ser Tyr Leu Glu Cys Val Gln Lys

260 265 270

Phe Lys Val Asn Tyr Ile Ser Val His Pro Pro Leu Met Leu Ser Leu

275 280 285

Ala Lys Lys Pro Glu Ile Ala Asn Tyr Asp Leu Ser Ser Leu Glu Arg

290 295 300

Ile Tyr Cys Ser Gly Thr Thr Val Ser Val Arg Ile Leu Tyr Gln Val305 310 315 320

Ala Glu Arg Ile Gly Val Lys Val Val Arg Gln Phe Tyr Gly Ser Ser

325 330 335

Glu Cys Leu Ala Val Val Ala Gln Ser Asp Glu Phe Cys Thr Lys Gly

340 345 350

Ser Val Gly Thr Leu Met Pro Gly Ile Ile Gly Lys Val Ile His Pro355 360 365Glu Thr Gly Ala Leu Leu Gly Pro Asn Glu Arg Gly Phe Leu Lys Phe

370 375 380

Lys Ala Asn Ser Thr Met Tyr Gly Tyr Phe Asn Asn Pro Glu Ala Ser385 390 395 400

Lys Val Val Lys Asp Glu Glu Gly Tyr Val Asn Thr Gly Asp Ala Gly

405 410 415

Tyr Tyr Asn Glu Arg Phe Glu Trp Phe Val Val Asp Arg Leu Lys Asp

420 425 430

Ile Val Met Val Asp Gly Val Ala Val Ala Pro Thr Glu Met Glu Thr435 440 445

Thr Ile Leu Leu His Pro Asp Ile Ile Asp Ala Cys Val Ile Gly Ile

450 455 460

Ser Asp Gly Glu Gly Gly Glu Val Leu Phe Ala Phe Leu Thr Lys Thr465 470 475 480

Arg Lys Glu Val Thr Glu Lys Asp Val Met Asp Phe Val Ala Glu Lys

485 490 495

Leu Pro Tyr Pro Lys His Leu Lys Gly Gly Cys Gln Phe Val Asp Glu

500 505 510

Ile Pro Lys Asn Pro Ala Gly Lys Met Leu Arg Arg Ile Leu Arg Gly515 520 525

Thr Leu530

<210> 3

<211> 1711

<212> DNA

<213> Arachnocampa richardsae

<400> 3

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tatggtccta agccgacctt tgatgtcttg aaggaggcta attcgtatgg tgaatatgca 120tttaaacgat tgagagccag aggtgatgaa gtttcagtta ttgatgccct aacaggagag 180gaaattcgtg catccgatat ttatgctaag accgtgcgaa cagctgagtg tcttcaagct 240tatggcatca gaaagggcga tcgtgttggt atttgcagtg ataccatgat taaatactat 300tacattgtaa tgggaacaat ggcagttggt gctattatct gtccaattat tatttcatgg 360

actgaagccg acatgaacca tgcttttaat atttcatgtc caacggtttt ctttgtttcg 420

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aatccaaaag tgccatcaaa accacatttt gattgtgaac cacaagacat ggaaaatacc 600

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ttgcttcatc ccgatattat tgatgcttgt gtcattggta tctctgatgg tgaaggtggt 1440

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caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1711

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<212> PRT

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atggcttgta cttcagtgaa taatattgtaaaggaggcta attcgtatgg tgaatatgcagtttcagtta ttgatgccct aacaggagagaccgtgcgaa cagctgagtg tcttcaagctatttgcagtg ataccatgat tgaatactatgctattatct gtccaattat tatttcatggatttcatgtc caacggtttt ctttgtttcagctaagagaa atccttatgt aaaggacattccattaataa gctttaaaga ttttttggctgattgtgaac cacaagacat ggaaaataccacgggtattt ctaaaggtgt tgctatatcggacactaaga cttacaagaa gggcttgtttggtttcactg cattgatgag acgtgcgttttatgacgaaa agagttactt ggaatgtgttcatcctccct tgatgttgtc attagctaagagtcttgaac gtatttattg ttctggtacagctgagagac ttggcgtcaa ggtcgtacgtgtcgttgctc aaagtgatga attttgtaccattattggca aagttataca tcctgaaactttcttgaaat ttaaggctaa cagcactatgaaagttgtta aagatgaaga aggatatgttagatttgaat ggttcgttgt ggatagattagttgcaccaa cagaaatgga aactaccatagtcattggta tctctgatgg tgaaggtggt

540

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<213> Arachnocampa fiava

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ccaagaaggg caccagttt

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> Sintético

<400> 26

ttataatatc cagcatcacc

<210> 27

<211> 19<212> DNA

<213> Sintético

<400> 27

caacgaacca ttcaaatct<210> 28<211> 23

<212> DNA

<213> Sintético

<400> 28

aatgcaaata atacttcacc acc<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> Sintético

<400> 29

gccaccttta agatgcttg

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> Sintético

<400> 30

aacattttgc cagctggatt c

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Arachnocampa tasmaniensis

<4 00> 31

atgacttcta catctgtgga

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> Arachnocampa tasmaniensis<400> 32

ttacaatgtt gatcttaaaa tac<210> 33

<211> 20<212> DNA

<213> Sintético

<400> 33

aagcagtggt atcaacgcag<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> Sintético

<400> 34

caacgcagag tggccatta

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> Sintético

<4 00> 35

attctagagg ccgaggcg

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> Arachnocampa richardsae

<400> 36

tggcttttct ggtgcattat c

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> Arachnocampa richardsae

<400> 37

cccgtagtac caaatgtcaa<210> 38

<211> 18<212> DNA

<213> Arachnocampa richardsae

<400> 38

catgtcggct tcagtcca

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> Arachnocampa richardsae<400> 39aagggagggt gaacaetga<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> Arachnoeampa richardsae

<400> 40

ttggtacaet tatgcctgga

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> Araehnocampa richardsae

<400> 41

caatcctgaa gcctccaaa

<210> 42

<211> 38

<212> DNA

<213> Sintético

<400> 42

gagaattcga ttgagggaeg catggcttgt acttcagt

<210> 43

<211> 30<212> DNA

<213> Sintético

<400> 43

tagcgaagca tgcggtctga cagttaccaa

<210> 44

<211> 33

<212> DNA

<213> Sintético

<400> 44

cgtaagcgca tgctctaaat acattcaaat atg

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> Sintético

<400> 45

gggacccatg gcttgtactt cag

Claims (20)

1. Peptídeo isolado que apresenta atividade de luciferase, emque:a. a atividade de luciferase compreende a catálise de uma rea-ção de luminescência dependente de ATP; eb. a reação de luminescência produz um espectro de emissãocom uma intensidade de emissão máxima em comprimentos de onda meno-res do que ou iguais a 530 ± 5 nm; ec. o peptídeo tem uma seqüência de aminoácido que, quandoalinhada com aquela da SEQ ID NO: 4, difere daquela da SEQ ID NO: 4 porpelo menos uma alteração na seqüência de aminoácido selecionada do gru-po consistindo em anulação de R218, H245N, G315S, L342S, e T343S.

2. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, compre-endendo uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada com aquelada SEQ ID NO: 4, ainda difere daquela da SEQ ID NO: 4 por pelo menosuma alteração adicional na seqüência de aminoácidos selecionada do grupoconsistindo em A22Y, Y53A, L63T, E83D, F88Y, F89Y, P91I, A103C,Y109W, E113D, V139I, G160P, S198T, H212Q, uma anulação de R218,D224S, uma anulação de P225, G228D, P233K, P242Q, F243Y, H245N,L253M, Y255R, F273Y, Y280F, S298K, L300E, E311R, G315S, P318T,L319V, G339F, L342S, T343S, D375H, K380A, E389F, T408S, W417Y,L418V, D427N, L441I, I442V, K443M, Y444V, K445D, Q448A, A452T, L458I,V485L, V486T, G490R, V506L, R513K, V516C, T527A e uma anulação detodos os resíduos de e incluindo K549 para o término carbóxi.

3. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou com areivindicação 2, compreendendo um fragmento de uma seqüência de ami-noácidos de pelo menos 10 aminoácidos contíguos selecionados do grupoconsistindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10.

4. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou com areivindicação 2, compreendendo uma seqüência de aminoácidos, uma vari-ante de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo naSEQ ID ΝΟ:2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10, em que avariante é codificada por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza sobcondições estringentes para uma molécula de ácido nucleico com uma se-qüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9 ou um complemento seu.

5. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, compre-endendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindoem SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10.

6. Peptídeo isolado, tendo uma seqüência de aminoácidos quecompartilha pelo menos 70 por cento de identidade com a seqüência de a-minoácido mostrada na SEQ ID NO: 2.

7. Anticorpo que seletivamente se liga a um peptído como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Molécula de ácido nucleico isolada, compreendendo uma se-qüência de nucleotídeos que codifica o peptídeo como definid em qualqueruma das reivindicações 1 a 6.

9. Lâmina de gene, compreendendo uma molécula de ácido nu-cleico como definido na reivindicação 8.

10. Célula transgência compreendendo uma molécula de ácidonucleico como definida na reivindicação 8.

11. Vetor de ácido nucleico, compreendendo uma molécula deácido nucleico como definida na reivindicação 8.

12. Célula hospedeira contendo o vetor como definido na reivin-dicação 11.

13. Método de monitoramento da expressão de um gene de inte-resse ou uma porção sua em uma célula hospedeira, compreendendo: (a)introdução na célula hospedeira de um constructo de vetor, o constructo devetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico como definida na rei-vindicação 8, e ainda compreendendo uma molécula de ácido nucleico codi-ficando uma seqüência de nucleotídeo ou produto de interesse: em que amolécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 8 e a seqüênciado produto de interesse são coexpressos; e (b) deteccão da presença daexpressão da molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 8,monitorando dessa forma a expressão da seqüência de produto de interesse.

14. Método de medição da atividade de pelo menos duas enzi-mas repórteres em uma alíquota de uma amostra compreendendo o ensaiopara atividade de uma primeira enzima repórter pela medição do sinal de luzproduzido por catálise de uma reação de luminescência pela primeira enzi-ma repórter, e a avaliação para a atividade de pelo menos uma segunda en-zima repórter pela medição do sinal de luz produzido por catálise de umareação de luminescência por pelo menos uma segunda enzima repórter, emque pelo menos uma dentre a primeira ou a segunda enzima repórter apre-senta atividade da Iuciferase compreendendo a catálise de uma reação deluminescência dependente de ATP e que produz um espectro de emissãocom uma intensidade de emissão máxima em comprimentos de onda meno-res do que ou iguais a 530 ± 5 nm.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que ambasde pelo menos duas enzimas repórteres são Iuciferases dependentes deATP.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que a primei-ra enzima repórter compreende um peptídeo como definido na reivindicação 1.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que a primei-ra enzima repórter compreende um peptídeo como definido na reivindicação 5.

18. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que a segun-da enzima repórter catalisa uma reação de luminescência e a reação de lu-minescência produz um espectro de emissão com uma intensidade de emis-são máxima em comprimentos de onda maiores do que 530 nm.

19. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que os en-saios são efetuados na mesma alíquota da amostra.

20. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que os en-saios procederam simultaneamente.