BR112020026792A2 - Enzimas de biossíntese de luciferina e uso das mesmas - Google Patents

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Abstract

a presente invenção visa a identificação de novas enzimas de biossíntese de luciferina fúngica, ácidos nucleicos capazes de codificar essas enzimas, e proteínas capazes de catalisar certos estágios da biossíntese de luciferina fúngica. a invenção também fornece a aplicação de ácidos nucleicos para produzir as ditas enzimas em uma célula ou organismo. métodos para preparação in vitro ou in vivo de compostos químicos idênticos às luciferinas e pré-luciferinas fúngicas também são fornecidas. vetores compreendendo ácido nucleico descritos na presente invenção também são fornecidos. além disso, a presente invenção fornece cassetes de expressão compreendendo o ácido nucleico da presente invenção e elementos regulatórios necessários para expressão de ácido nucleico em uma célula hospedeira selecionada. além de células, linhas celulares estáveis, organismos transgênicos (por exemplo, plantas, animais, fungos ou micro-organismos) incluindo os ácidos nucleicos, vetores, ou cassetes de expressão da presente invenção também são fornecidos. a presente invenção também fornece combinações de ácidos nucleicos para obter células autonomamente luminosas, linhas celulares, ou organismos transgênicos. em modalidades preferidas, células ou organismos transgênicos são capazes de produzir luciferina fúngica a partir de precursores. em algumas modalidades, células ou organismos transgênicos são capazes de produzir pré-luciferina fúngica a partir de precursores. em algumas modalidades, células ou organismos transgênicos são capazes de bioluminescência na presença de um precursor de luciferina fúngica. em algumas modalidades, células ou organismos transgênicos são capazes de bioluminescência autônoma. combinações de proteínas para produzir luciferina ou seus precursores a partir de mais compostos químicos simples também são fornecidas. um kit contendo os ácidos nucleicos, vetores, ou cassetes de expressão da presente invenção para produzir células luminosas, linhas celulares, ou organismos transgênicos também é fornecido.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO ENZIMAS DE BIOSSÍNTESE DE LUCIFERINA E USO DAS MESMAS CAMPO DA INVENÇÃO
[001] O grupo de invenções refere-se ao campo da biotecnologia e da engenharia genética. Em particular, a invenção refere-se a enzimas do sistema bioluminescente de fungos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] As enzimas que podem catalisar a oxidação de compostos de baixo peso molecular de luciferinas, que é acompanhada pela emissão de luz ou bioluminescência, são denominadas como “luciferases”. A oxidação da luciferina resulta na liberação de oxiluciferina a partir de um complexo com a enzima luciferase.
[003] As luciferases são amplamente usadas como genes repórter em uma série de aplicações biomédicas e biotecnologias. Por exemplo, as luciferases são usadas para determinar a viabilidade de células e a atividade de promotores ou outros componentes de sistemas vivos, em estudos de carcinogênese em modelos animais, em métodos de detecção de microrganismos ou agentes tóxicos na mídia, como indicadores para determinar as concentrações de várias substâncias, para visualizar a passagem de cascatas de sinalização, etc. [Scott et al., Annu Rev Anal Chem, 2011, 4:297-319; Badr e Tannous, Trends Biotechnol. 2011, 29:624-33; Andreu et al., FEMS Microbiol Rev. 2011, 35:360- 94]. Muitas aplicações de luciferases são descritas em revisões [Kaskova et al., Chem Soc Rev., 2016, 45:6048-6077; Scott et al., Annu Rev Anal Chem, 2011, 4:297-319; Widder e Falls, IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, 2014, 20: 232 - 241]. Todas as principais aplicações das luciferases são baseadas na detecção da luz emitida dependendo do fenômeno ou sinal em estudo. Tal detecção, via de regra, é realizada por meio de luminômetro ou microscópio óptico modificado.
[004] Milhares de espécies capazes de bioluminescência são conhecidas, para as quais cerca de uma dúzia de luciferinas com várias estruturas e várias dezenas de enzimas de luciferase correspondentes foram descritas. Foi demonstrado que os sistemas de bioluminescência surgiram independentemente em vários organismos no curso da evolução mais de quarenta vezes [Herring, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 1987, 1:147-63; Haddock et al., Annual Review of Marine Science, 2010; 2:443 - 93].
[005] Um grupo de luciferases de insetos que catalisam a oxidação da D- luciferina foi descrito [de Wet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 1985, 82:7870- 3; de Wet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 1987, 7:725-37]. Um grupo de luciferases que catalisam a oxidação da coelenterazina foi descrito [O. Shimomura, Bioluminescence: Chemical Principles and Methods, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, Singapura, 2006, 470 p.]. São conhecidos sistemas bioluminescentes de ostracodes do gênero Cypridina, que são caracterizados por luciferina quimicamente ativa e luciferase altamente estável [Shimomura et al., Science, 1969, 164:1299-300]. Sistemas bioluminescentes de dinoflagelados e eufausídeos também são conhecidos. Atualmente, os genes que codificam três luciferases deste grupo são clonados [O. Shimomura, Bioluminescence: Chemical Principles and Methods, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, Singapura, 2006]. No entanto, este sistema ainda é pouco estudado, em particular, sequências completas de luciferase ainda não foram estabelecidas.
[006] Nos últimos anos, um grupo de luciferases e luciferinas do sistema bioluminescente de fungos tem sido descrito. A bioluminescência dos fungos era conhecida há centenas de anos, mas a luciferina do fungo foi identificada apenas em 2015: acabou sendo 3-hidroxispidina, um metabólito capaz de penetrar nas membranas celulares [Purtov et al., Angewandte Chemie, 2015, 54:8124-28]. A mesma publicação confirma a presença de uma enzima capaz de hidroxilar a hispidina para formar luciferina nos lisados de fungos, mas a dita enzima não foi identificada. O pedido de patente 2017102986 de 30/01/2017 descreve genes de luciferase de vários fungos que contêm luciferina na forma de 3-hidroxispidina com a seguinte estrutura:
[007] Foi demonstrado que as luciferases fúngicas também podem catalisar a oxidação emissora de luz de outros compostos químicos com as estruturas mostradas na Tabela 1 [Kaskova et al., Sci. Adv. 2017; 3: e1602847]. Todos estes compostos, que são luciferinas fúngicas, incluindo 3-hidroxi-hispidin, pertencem ao grupo de 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-onas e têm a fórmula geral:
[008] , onde R é arila ou heteroarila. TABELA 1. EXEMPLOS DAS LUCIFERINAS FÚNGICAS Nome IUPAC do Fórmula do composto Nome IUPAC do composto (outros grupo de nomes de composto) substituição (“R”) (E)-6-(3,4-di-hidroxistiril)- 3,4-di-hidroxifenil 3,4-di-hidroxi-2H-piran-2- ona (3-hidroxi-hispidin) (E)-3,4-di-hidroxi-6-estiril- fenila 2H-piran-2-ona
(E)-3,4-di-hidroxi-6-(4- 4-hidroxifenila hidroxistiril)-2H-piran-2- ona
(E)-3,4-di-hidroxi-6-(2- 2-hidroxifenila hidroxistiril)-2H-piran-2- ona
(E)-3,4-di-hidroxi-6-(2,4- 2,4-di-hidroxifenila di-hidroxistiril)-2H-piran-2- ona
(E)-3,4-di-hidroxi-6-(4- 4-hidroxi-3,5- hidroxi-3,5-dimetoxistiril)- dimetoxifenila 2H-piran-2-ona
(E)-3,4-di-hidroxi-6-(4- 4-hidroxi-3- hidroxi-3-metoxistiril)-2H- metoxifenila piran-2-ona
(E)-3,4-di-hidroxi-6-(2-(6- 6-hidroxinaftalen-2- hidroxinaftalen-2-il)vinil)- ila 2H-piran-2-ona
(E)-6-(4-aminostiril)-3,4- 4-aminofenila di-hidroxi-2H-piran-2-ona
(E)-6-(4- 4-dietilaminofenila (dietilamino)estiril)-3,4- hidroxi-2H-piran-2-ona (E)-6-(2-(1H-indol-3- 1H-indol-3-ila il)vinil)-3,4-di-hidroxi-2H- piran-2-ona (E)-3,4-di-hidroxi-6- 2,3,6,7-tetra-hidro- (2,3,6,7-tetra-hidro- 1H,5H-pirido[3,2,1- 1H,5H-pirido[3,2,1- ij]quinolin-9-ila ij]quinolin-9-il)vinil)-2H- piran-2-ona
[009] As enzimas que promovem a síntese de luciferinas em um organismo vivo ou a redução das oxiluciferinas de volta às luciferinas são desconhecidas na esmagadora maioria dos casos. Portanto, a maioria das aplicações bioluminescentes de luciferinas envolve a introdução de luciferinas contendo luciferase exógena (por exemplo, cultura de células ou organismos) em um sistema. Como consequência, o uso de sistemas bioluminescentes permanece limitado devido a uma série de razões que compreendem, em particular, baixa capacidade de penetração de muitas luciferinas através de uma membrana celular, instabilidade química das luciferinas e processo complexo, de múltiplos estágios e caro de síntese de luciferinas.
[010] As enzimas que promovem a síntese de luciferina são identificadas para o único sistema bioluminescente descrito em bactérias marinhas. Entretanto, este sistema é significativamente diferente de outros sistemas bioluminescentes. A luciferina bacteriana (aldeído mirístico) é oxidada durante a reação, mas não emite luz [O. Shimomura, Bioluminescence: Chemical Principles and Methods, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, Singapura, 2006, 470 p.]. Além da luciferina, os principais componentes da reação luminescente também incluem NAD (nicotinamida adenina dinucleotídeo) e FMN-H2 (mononucleotídeo de flavina). É o derivado oxidado de FMN-H2 que atua como uma verdadeira fonte de luz. O sistema bioluminescente de bactérias marinhas é o único até o momento que pode ser totalmente codificado em um sistema de expressão heterólogo e considerado como a técnica anterior mais próxima da presente invenção. Entretanto, este sistema é geralmente aplicável apenas a organismos procarióticos. Para obter bioluminescência autônoma, o operon luxCDABE é usado, codificando luciferases (heterodímeros luxA e luxB) e proteínas de biossíntese de luciferina luxCDE atuando como substrato de bioluminescência (Meighen 1991). Em 2010, esse sistema foi usado para atingir luminescência autônoma em células humanas. Porém, o baixo nível de intensidade de bioluminescência, apenas 12 vezes superior ao sinal proveniente de células não bioluminescentes, não permitiu a aplicação do sistema desenvolvido para a solução da maioria dos problemas aplicados [Close et al. PloS One, 2010, 5 (8): e12441]. As tentativas de aumentar a intensidade da luz emitida não tiveram sucesso devido à toxicidade dos componentes do sistema bacteriano para as células eucarióticas [Hollis et al. FEBS Letters, 2001, 506 (2):140-42].
[011] Neste ponto de vista, a identificação de enzimas que promovem a síntese de luciferina de compostos precursores estáveis e/ou abundantes nas células, bem como a redução da oxiluciferina de volta à luciferina, é um problema urgente. A identificação de tais enzimas permitiria um método mais simples e barato para a síntese de luciferina e abriria o caminho para a criação de sistemas bioluminescentes autônomos. Entre eles, os sistemas bioluminescentes não tóxicos para células eucarióticas são de particular interesse.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[012] Os requerentes decodificaram estágios de biossíntese de luciferina no sistema bioluminescente de fungos e identificaram as enzimas envolvidas na circulação cíclica da luciferina fúngica e as sequências de ácido nucleico que as codificam.
[013] O fluxograma abaixo mostra os estágios de renovação da luciferina fúngica:
[014] Assim, a presente invenção primeiro fornece proteínas biossintéticas de luciferina fúngica isoladas bem como ácidos nucleicos que as codificam.
[015] Em modalidades preferidas, a presente invenção fornece hispidinas hidroxilases caracterizadas pela sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, bem como proteínas, homólogos, mutantes, e derivados essencialmente semelhantes desta hispidinas hidroxilases.
[016] Em algumas modalidades, as hispidinas hidroxilases da presente invenção são caracterizadas por uma sequência de aminoácido que dentro de pelo menos 350 aminoácidos tem pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 % de identidade, pelo menos 85 % de identidade, pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28.
[017] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido da hispidina hidroxilase da presente invenção é caracterizada pela presença de várias sequências de consenso separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos caracterizados pela seguinte SEQ ID NOs: 29 - 33.
[018] A hispidinas hidroxilases da presente invenção catalisa a reação de 6-(2- arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural ,
[019] conversão em 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural
[020] , onde R é arila ou heteroarila.
[021] A presente invenção também fornece hispidinas sintases caracterizadas pela sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, bem como proteínas, homólogos, mutantes, e derivados essencialmente semelhantes destas hispidinas sintases.
[022] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido da hispidina sintase da presente invenção é caracterizada pela presença de várias sequências de consenso separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos caracterizados pela seguinte SEQ ID NOs: 56 - 63.
[023] Em algumas modalidades, as hispidinas sintases da presente invenção são caracterizadas por uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 40 % de identidade, por exemplo, pelo menos 45 % de identidade, ou pelo menos 50 % de identidade, ou pelo menos 55 % de identidade, ou pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 % de identidade, pelo menos 85 % de identidade, pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 % , 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55.
[024] As hispidinas sintases da presente invenção catalisam a reação de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural
[025] , onde R é selecionado a partir do grupo arila ou heteroarila, conversão em 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural
[026] , onde R é arila ou heteroarila.
[027] Além disso, a presente invenção fornece cafeoilpiruvato hidrolases caracterizado pela sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, bem como proteínas, homólogos, mutantes, e derivados essencialmente semelhantes destes cafeoilpiruvatos hidrolases.
[028] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido do cafeoilpiruvato hidrolase da presente invenção é caracterizada pela presença de várias sequências de consenso separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos caracterizados pela seguinte SEQ ID NOs: 76 - 78.
[029] Em algumas modalidades, um cafeoilpiruvato hidrolase da presente invenção é caracterizado por uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 %
de identidade, pelo menos 85 % de identidade, pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75.
[030] Os cafeoilpiruvatos hidrolases da presente invenção catalisam a reação de ácido 6-aril-2-hidroxi-4-oxo-hexa-2,5-dienoicos com a fórmula estrutural
[031] , onde R é arila ou heteroarila, conversão em ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural .
[032] Em modalidades preferidas, a hispidinas hidroxilases da presente invenção catalisa a reação de pré-luciferina conversão em luciferina fúngica, por exemplo, conversão de hispidina na 3-hidroxi-hispidina.
[033] Em modalidades preferidas, as hispidinas sintases da presente invenção catalisam a conversão de um precursor de pré-luciferina na pré-luciferina, por exemplo, conversão de ácido cafeico para hispidina.
[034] Em modalidades preferidas, os cafeoilpiruvatos hidrolases da presente invenção catalisam a conversão de oxiluciferina fúngica para um precursor de pré-luciferina, por exemplo, conversão de cafeoilpiruvato para ácido cafeico.
[035] A presente invenção também fornece aplicação de uma proteína tendo a sequência de aminoácido que dentro de pelo menos 350 aminoácidos tem pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 % de identidade, pelo menos 85 % de identidade, pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, e/ou contendo sequências de consenso com a SEQ ID NOs 29 - 33 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, como hispidina hidroxilase para catalisar a reação in vitro ou in vivo de 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural
[036] conversão em 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila.
[037] A presente invenção também fornece aplicação de uma proteína tendo a sequência de aminoácido que tem pelo menos 45 % de identidade, ou pelo menos 50 % de identidade, ou pelo menos 55 % de identidade, ou pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 % de identidade, pelo menos 85 % de identidade, pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, e/ou contendo sequências de consenso com a SEQ ID NOs 56 - 63 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, como hispidina sintase para catalisar a reação in vitro ou in vivo de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural conversão em 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-
piran-2-ona com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila.
[038] A presente invenção também fornece aplicação de uma proteína tendo a sequência de aminoácido que tem pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 % de identidade, pelo menos 85 % de identidade, pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, e/ou contendo sequências de consenso com a SEQ ID NOs 76 - 78 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, como cafeoilpiruvato hidrolase para catalisar a reação in vitro ou in vivo de ácido 6-aril-2-hidroxi-4-oxo-hexa-2,5-dienoicos com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila, conversão em ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural .
[039] A presente invenção também fornece ácidos nucleicos que codificam as ditas hispidinas hidroxilases, hispidinas sintases, e cafeoilpiruvatos hidrolases.
[040] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam hispidina hidroxilase são fornecidos com sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo:
[041] (a) sequência de aminoácido apresentada como a seguinte SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28;
[042] (b) sequência de aminoácido que dentro de pelo menos 350 aminoácidos tem pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 % de identidade, pelo menos 85 % de identidade, pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28;
[043] (c) sequência de aminoácido contendo sequências de consenso apresentada como a seguinte SEQ ID NOs: 29 - 33.
[044] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam hispidina sintase são fornecidos com sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo:
[045] (a) sequência de aminoácido apresentada como a seguinte SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55;
[046] (b) sequência de aminoácido que tem pelo menos 40 % de identidade, por exemplo, pelo menos 45 % de identidade, ou pelo menos 50 % de identidade, ou pelo menos 55 % de identidade, ou pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 % de identidade, pelo menos 85 % de identidade, pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 % , 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55;
[047] (c) sequência de aminoácido contendo sequências de consenso apresentada como a seguinte SEQ ID NOs: 56 - 63.
[048] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam cafeoilpiruvatos hidrolases são fornecidos com sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo:
[049] (a) sequência de aminoácido apresentada como a seguinte SEQ ID NOs:
65, 67, 69, 71, 73, 75;
[050] (b) sequência de aminoácido que tem pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 % de identidade, pelo menos 85 % de identidade, pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75;
[051] (c) sequência de aminoácido contendo sequências de consenso com a SEQ ID NOs 76 - 78 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos.
[052] A presente invenção também fornece aplicação do ácido nucleico que codifica uma proteína com sequência de aminoácido que dentro de pelo menos 350 aminoácidos tem pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 % de identidade, pelo menos 85 % de identidade, pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, exemplo, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, e/ou contendo sequências de consenso com a SEQ ID NOs 29 - 33 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, para produzir em sistemas in vitro ou in vivo a hispidina hidroxilase que catalisa a reação de 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran- 2-ona com a fórmula estrutural ,
[053] conversão em 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural
[054] , onde R é arila ou heteroarila.
[055] A presente invenção também fornece aplicação do ácido nucleico que codifica uma proteína com sequência de aminoácido que tem pelo menos 45 % de identidade, ou pelo menos 50 % de identidade, ou pelo menos 55 % de identidade, ou pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 % de identidade, pelo menos 85 % de identidade, pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, e/ou contendo sequências de consenso com a SEQ ID NOs 56 - 63 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, para produzir em sistemas in vitro ou in vivo a hispidina sintase que catalisa a reação de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural conversão em 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila.
[056] A presente invenção também fornece aplicação de ácido nucleico que codifica uma proteína com sequência de aminoácido que tem pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 % de identidade, pelo menos 85 % de identidade, pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, e/ou contendo sequências de consenso com a SEQ ID NOs 76 - 78 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, para produzir em sistemas in vitro ou in vivo o cafeoilpiruvato hidrolase que catalisa a reação de ácido 6-aril-2-hidroxi-4-oxo-hexa-2,5- dienoicos com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila, conversão em ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural .
[057] A presente invenção também fornece uma proteína de fusão compreendendo operativamente, diretamente ou via ligantes de aminoácido, reticulada pelo menos uma hispidina hidroxilase da invenção, e/ou pelo menos uma hispidina sintase da invenção, e/ou pelo menos um cafeoilpiruvato hidrolase da invenção, e sinal de localização intracelular, e/ou peptídeo sinal, e/ou luciferase capaz de oxidar a luciferina fúngica com emissão de luz.
[058] A luciferase capaz de oxidar a luciferina fúngica com emissão de luz é conhecida na técnica. Em modalidades preferidas, tem uma sequência de aminoácido substancialmente semelhante ou idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98. Por exemplo, pode ter uma sequência de aminoácido que é pelo menos 40 % idêntica, por exemplo, pelo menos 45 % idêntica, ou pelo menos 50 % idêntica, ou pelo menos 55 % idêntica, ou pelo menos 60 % idêntica, ou pelo menos 70 % idêntica, ou pelo menos 75 % idêntica, ou pelo menos 80 % idêntica, ou pelo menos 85 % idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98. Em muitas modalidades, a sequência de aminoácido do dito luciferase tem pelo menos 90 % de identidade, ou pelo menos 95 % de identidade, (por exemplo, pelo menos 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, ou 99 % de identidade) com uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98.
[059] Em algumas modalidades, a proteína de fusão tem a sequência de aminoácido com SEQ ID NO 101.
[060] A presente invenção também fornece um ácido nucleico que codifica a dita proteína de fusão.
[061] A presente invenção também fornece um cassete de expressão compreendendo (a) um domínio de iniciação de transcrição, que é funcional em uma célula hospedeira; (b) um ácido nucleico que codifica uma enzima de biossintetização de luciferina fúngica, isto é hispidina sintase, hispidina hidroxilase ou cafeoilpiruvato hidrolase, ou uma proteína de fusão de acordo com a invenção; (c) um domínio de terminação de transcrição, que é funcional na célula hospedeira.
[062] A presente invenção também fornece um vetor para transferir um ácido nucleico em uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica uma enzima de biossintetização de luciferina fúngica da invenção, isto é, hispidina sintase, hispidina hidroxilase, ou cafeoilpiruvato hidrolase, ou uma proteína de fusão da invenção.
[063] A presente invenção também fornece uma célula hospedeira compreendendo, como uma parte de um elemento extracromossômico ou integrado no genoma da célula como um resultado de introduzir o dito cassete na dita célula, um cassete de expressão que contém um ácido nucleico que codifica hispidina sintase e/ou hispidina hidroxilase e/ou cafeoilpiruvato hidrolase da presente invenção. Tal célula produz pelo menos uma da dita enzima de biossintetização de luciferina fúngicas devido à expressão do dito ácido nucleico introduzido.
[064] A presente invenção também fornece um anticorpo obtido usando uma proteína da invenção.
[065] A presente invenção também fornece um método para produzir luciferina fúngica com a fórmula química 6-2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona e a fórmula estrutural
[066] , onde R é arila ou heteroarila, em sistema tanto in vitro quanto in vivo, que compreende a combinação de pelo menos uma molécula de hispidina hidroxilase de acordo com a invenção com pelo menos uma molécula de 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona tendo a fórmula estrutural , pelo menos uma molécula de NAD(P)H, e pelo menos uma molécula de oxigênio molecular sob condições fisiológicas.
[067] A presente invenção também fornece um método para produzir pré- luciferina fúngica com a fórmula química 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona e a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila, em sistema tanto in vitro quanto in vivo, que compreende a combinação de pelo menos uma molécula de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural
[068] com pelo menos uma molécula de hispidina sintase de acordo com a invenção, pelo menos uma molécula de coenzima A (CoA), pelo menos uma molécula de ATP, e pelo menos duas moléculas de malonil-CoA sob condições fisiológicas.
[069] A presente invenção também fornece um método para produzir luciferina fúngica in vitro ou in vivo, que compreende a combinação de pelo menos uma molécula de hispidina hidroxilase de acordo com a invenção com pelo menos uma molécula de ácido 3-arilacrílico, pelo menos uma molécula de hispidina sintase de acordo com a invenção, pelo menos uma molécula de coenzima A, pelo menos uma molécula de ATP, pelo menos duas moléculas de malonil-CoA, pelo menos uma molécula de NAD(P)H, e pelo menos uma molécula de molecular oxigênio sob condições fisiológicas.
[070] Os métodos de produção de luciferina fúngica e pré-luciferina podem ser implementados em uma célula ou um organismo. Neste caso, os ditos métodos compreendem introduzir na célula de ácidos nucleicos que codificam as enzimas de biossintetização de luciferina correspondentes (hispidina sintase e/ou hispidina hidroxilase) capazes de expressar as ditas enzimas na célula ou organismo. Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos são introduzidos em uma célula ou organismo como uma parte de um cassete de expressão ou vetor da invenção.
[071] Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um 4’- fosfopantoteinil transferase capaz de transferir o 4-fosfopanteteinil a partir da coenzima A para a serina no domínio de transferência de acila de policetídeo sintases é adicionalmente introduzido na célula ou organismo. Em algumas modalidades, o 4’-fosfopantoteinil transferase tem uma sequência de aminoácido substancialmente semelhante ou idêntica a SEQ ID NO 105.
[072] A presente invenção também fornece aplicação do policetídeo sintase (PKS) com sequência de aminoácido que é pelo menos 40 %, ou pelo menos 45 %, ou pelo menos 50 %, ou pelo menos 55 %, ou pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %, ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica a uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139 para produzir hispidina em um sistema in vitro ou in vivo.
[073] Em algumas modalidades, o método de preparação de hispidina compreende a combinação de pelo menos uma molécula de PKS com pelo menos duas moléculas de malonil-CoA e pelo menos uma molécula de cafeoil- CoA sob condições fisiológicas. Em algumas modalidades, o dito método compreende a combinação de pelo menos uma molécula de PKS com pelo menos duas moléculas de malonil-CoA, pelo menos uma molécula de ácido cafeico, pelo menos uma molécula de coenzima A, pelo menos uma molécula de ligase de cumarato-CoA, e pelo menos uma molécula de ATP sob condições fisiológicas.
[074] Para os propósitos da presente invenção, qualquer ligase de cumarato- CoA pode ser usada que catalisa a conversão de ácido cafeico em cafeoil-CoA. Por exemplo, a ligase de cumarato-CoA pode ter uma sequência de aminoácido que é pelo menos 40 %, ou pelo menos 45 %, ou pelo menos 50 %, ou pelo menos 55 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %, ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica à sequência com SEQ ID NO 141.
[075] A dita reação pode ser usada em qualquer dos ditos métodos em vez de reação para a produção de pré-luciferina fúngica a partir de precursores de pré- luciferina usando a hispidina sintase da presente invenção. Por exemplo, a reação pode ser realizada em uma célula ou organismo introduzindo um cassete de expressão com um PKS que codifica ácido nucleico na célula ou organismo. Se necessário, uma ligase de cumarato-CoA que codifica ácido nucleico pode ser adicionalmente introduzida na célula ou organismo.
[076] Em algumas modalidades, as enzimas de biossintetização de ácido 3- arilacrílico que codificam ácidos nucleicos são ainda introduzidas na mesma célula ou organismo. Por exemplo, estes podem ser ácidos nucleicos que codificam tirosina amônia-liase com uma sequência de aminoácido substancialmente semelhante ou idêntica à sequência de aminoácido de tirosina amônia-liase de Rhodobacter capsulatus tendo SEQ ID NO 107 ou ácidos nucleicos que codificam os componentes de HpaB e HpaC de 4- hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase com a sequência de aminoácidos substancialmente semelhante às sequências de componentes de HpaB e HpaC de 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase de E. coli tendo SEQ ID NOs 109 e 111. Em algumas modalidades, a fenilalanina amônia- liase que codifica ácido nucleico com sequência de aminoácido substancialmente semelhante à sequência de aminoácido tendo SEQ ID NO 117 é usada.
[077] A presente invenção também fornece métodos de produção de células bioluminescentes transgênicas ou organismos, compreendendo células ou organismos de plantas, animais, bactérias ou fungos.
[078] Em modalidades preferidas, os métodos de produção de células bioluminescentes transgênicas ou organismos compreendem introduzir pelo menos um ácido nucleico da invenção junto com um ácido nucleico que codifica a luciferase capaz de oxidar luciferina fúngica com emissão de luz em uma célula ou organismo. Ácidos nucleicos são introduzidos em uma célula ou organismo em uma forma que permita sua expressão e produção de produtos de proteína funcional. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser contidos em um cassete de expressão. Ácidos nucleicos podem ocorrer em células como partes de elementos extracromossômicos ou integrados no genoma da célula devido à inserção de um cassete de expressão na dita célula.
[079] Em modalidades preferidas, os métodos de produção de células bioluminescentes transgênicas ou organismos compreendem introduzir um ácido nucleico que codifica uma hispidina hidroxilase da invenção e um ácido nucleico que codifica uma luciferase capaz de oxidar luciferina fúngica com emissão de luz na célula ou organismo. Como um resultado, a dita célula ou organismo adquire a capacidade de bioluminescência na presença de pré-luciferina fúngica com a fórmula química 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona e fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila.
[080] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de hispidina hidroxilase e luciferase que codifica ácido nucleico é introduzida na célula em vez de ácidos nucleicos que codificam hispidina sintase e luciferase.
[081] Em algumas modalidades, os métodos de produção de células bioluminescentes transgênicas ou organismos também compreendem introduzir uma hispidina sintase que codifica ácido nucleico da invenção na célula ou organismo. A dita célula ou organismo adquire a capacidade de bioluminescência na presença do precursor de pré-luciferina fúngica na forma de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural
[082] , onde R é arila ou heteroarila.
[083] Em algumas modalidades, um PKS que codifica ácido nucleico é introduzido em uma célula em vez de hispidina sintase que codifica ácido nucleico.
[084] Em algumas modalidades, os métodos de produção de células bioluminescentes transgênicas ou organismos também compreendem introduzir um cafeoilpiruvato hidrolase que codifica ácido nucleico da invenção na célula ou organismo para aumentar a intensidade da bioluminescência.
[085] Em algumas modalidades, os métodos de produção de células bioluminescentes transgênicas ou organismos também incluem introduzir um 4’- fosfopantoteinil transferase que codifica ácido nucleico na célula ou organismo.
[086] Em algumas modalidades, os métodos de produção de células bioluminescentes transgênicas ou organismos também compreendem introduzir uma ligase de cumarato-CoA que codifica ácido nucleico na célula ou organismo.
[087] Em algumas modalidades, os métodos de produção de células bioluminescentes transgênicas ou organismos também incluem introduzir enzimas de biossintetização de ácido 3-arilacrílico que codificam ácidos nucleicos na célula ou organismo.
[088] A presente invenção também fornece células bioluminescentes transgênicas e organismos obtidas pelos os ditos métodos e contendo uma ou mais ácidos nucleicos da invenção como parte de um elemento extracromossômico ou integrado no genoma da célula.
[089] Em algumas modalidades, as células bioluminescentes transgênicas e organismos da invenção são capazes de bioluminescência autônoma sem adição de exógeno de luciferina, pré-luciferina, e precursor de pré-luciferina.
[090] A presente invenção também fornece combinações de proteínas e ácidos nucleicos da invenção bem como produtos e kits contendo a proteínas e ácidos nucleicos da invenção. Por exemplo, combinações de ácidos nucleicos são fornecidas para produzir células autonomamente luminosas, linhas celulares, ou organismos transgênicos; ensaio da atividade de promotores, ou marcação de células.
[091] Em algumas modalidades, os kits para produzir luciferina fúngica e/ou pré- luciferina fúngica são fornecidos compreendendo a dita hispidina hidroxilase, e/ou hispidina sintase, e/ou PKS, ou a codificação dos ácidos nucleicos.
[092] Em algumas modalidades, os kits são fornecidos para produzir uma célula bioluminescente ou organismo transgênico bioluminescente compreendendo uma hispidina hidroxilase que codifica ácido nucleico e uma luciferase que codifica ácido nucleico, a dita luciferase sendo capaz de oxidar luciferina fúngica com emissão de luz. O kit também pode contêm um cafeoilpiruvato hidrolase que codifica ácido nucleico. O kit também pode contêm uma hispidina sintase ou PKS que codifica ácido nucleico. O kit também pode contêm 4’-fosfopantoteinil transferase que codifica ácido nucleico e/ou ligase de cumarato-CoA que codifica ácido nucleico e/ou enzimas de biossintetização de ácido 3-arilacrílico que codificam ácidos nucleicos. O kit também pode contêm componentes adicionais como soluções tampão, anticorpos, luciferina fúngica, pré-luciferina fúngica,
precursor de pré-luciferina fúngica, etc. O kit também pode contêm o guia de aplicação de kit. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são fornecidos em cassetes de expressão ou vetores para introdução em células ou organismos.
[093] Em modalidades preferidas, as células ou organismos transgênicos da invenção são capazes de produzir luciferina fúngica a partir de precursores. Em algumas modalidades, células e organismos transgênicos da invenção são capazes de bioluminescência na presença de precursor de luciferina fúngica. Em algumas modalidades, as células ou organismos transgênicos da invenção são capazes de bioluminescência autônoma.
[094] Em modalidades preferidas de métodos e aplicação acima divulgados, a pré-luciferina com fórmula química 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona selecionada a partir do seguinte grupo:
[095] (E)-6-(3,4-di-hidroxistiril)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona (hispidina),
[096] (E)-4-di-hidroxi-6-estiril-2H-piran-2-ona,
[097] (E)-4-hidroxi-6-(4-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona (bisnoriangonina),
[098] (E)-4-hidroxi-6-(2-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona,
[099] (E)-4-hidroxi-6-(2,4-di-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona,
[100] (E)-4-hidroxi-6-(4-hidroxi-3,5-dimetoxistiril)-2H-piran-2-ona,
[101] (E)-4-hidroxi-6-(4-hidroxi-3-metoxistiril)-2H-piran-2-ona,
[102] (E)-4-hidroxi-6-(2-(6-hidroxinaftalen-2-il)vinil)-2H-piran-2-ona,
[103] (E)-6-(4-aminostiril)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona,
[104] (E)-6-(4-(dietilamino)estiril)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona,
[105] (E)-6-(2-(1H-indol-3-il)vinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona,
[106] (E)-4-hidroxi-6-(2,3,6,7-tetra-hidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il)vinil)- 2H-piran-2-ona é usado.
[107] Em modalidades preferidas, um ácido 3-arilacrílico selecionado a partir do grupo compreendendo ácido cafeico, ácido cinâmico, ácido paracoumárico, ácido cumárico, ácido umbélico, ácido sinápico, e ácido ferúlico é adequado para os propósitos da presente invenção.
[108] Em modalidades preferidas, 3-hidroxi-hispidina é usada como a luciferina, hispidina como a pré-luciferina, e ácido cafeico como o precursor de pré- luciferina.
[109] Um objetivo da presente invenção é fornecer um método eficaz para produzir sistemas bioluminescentes autônomos com luminescência visível, incluindo aqueles com base em células e organismos eucarióticos não luminosos.
[110] Um outro objetivo da presente invenção é fornecer um novo método eficaz para sintetizar hispidina ou análogos funcionais do mesmo.
[111] Um outro objetivo da presente invenção é fornecer um novo método eficaz para sintetizar luciferina fúngicas ou análogos funcionais do mesmo.
[112] Um outro objetivo da presente invenção é fornecer autonomamente células luminosas ou organismos.
[113] O objetivo da presente invenção é obtido identificando estágios de conversão de luciferina em fungos bioluminescentes e identificando sequências de aminoácido e nucleotídeo de proteínas envolvidas em biossíntese de luciferina. A função de todas as proteínas foi demonstrada pela primeira vez.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[114] A Figura 1 mostra um alinhamento de múltiplas sequências de aminoácido de hispidinas hidroxilases. O domínio de ligação de FAD/NAD(P) está sublinhado. Sequências de consenso são mostradas abaixo do alinhamento.
[115] A Figura 2 mostra um alinhamento de múltiplas sequências de aminoácido de hispidinas sintases. Sequências de consenso são mostradas abaixo do alinhamento.
[116] A Figura 3 mostra um alinhamento de múltiplas sequências de aminoácido de cafeoilpiruvatos hidrolases. Sequências de consenso são mostradas abaixo do alinhamento.
[117] A Figura 4 mostra intensidades luminescentes de células de Pichia pastoris que expressam hispidina hidroxilase e luciferase (a) ou apenas luciferase (B), e intensidades luminescentes de levedura tipo selvagem (C),
quando as colônias estão em aspersão com 3-hidroxi-hispidina (luciferina, lote esquerdo) ou hispidina (pré-luciferina, lote direito).
[118] A Figura 5 apresenta intensidade de luminescência de células HEK293NT que expressam hispidina hidroxilase e luciferase em comparação com a de células HEK293NT que expressam luciferase apenas ao adicionar hispidina.
[119] A Figura 6 mostra curvas de luminescência de células HEK293T que expressam: (1) genes de hispidina hidroxilase e luciferase separadamente ao adicionar hispidina; (2) gene de proteína quimérica de hispidina hidroxilase e luciferase ao adicionar hispidina; (3) gene de proteína quimérica de hispidina hidroxilase e luciferase ao adicionar 3-hidroxi-hispidina.
[120] A Figura 7 ilustra a capacidade de células de Pichia pastoris transfectadas para bioluminescência autônoma ao contrário de células de tipo selvagem. À esquerda: células em placa Petri sob a luz do dia, à direita: células no escuro.
[121] A Figura 8 mostra luminescência de uma cultura de células de Pichia pastoris transfectadas no escuro.
[122] A Figura 9 mostra plantas transgênicas bioluminescentes autônomas Nicotiana benthamiana. A foto à esquerda foi tirada com luz ambiente, a foto à direita foi tirada no escuro.
MODALIDADES DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES
[123] Vários termos relacionados com os objetos da presente invenção são usados acima, bem como na descrição e nas reivindicações abaixo. Os termos “compreende” e “compreendendo” na descrição desta invenção são interpretados como “compreende, mas não se limita a”. Os ditos termos não devem ser interpretados como “consiste apenas em”.
[124] Os termos “luminescência” e “bioluminescência” são intercambiáveis para os propósitos da presente invenção e se referem ao fenômeno de emissão de luz no decorrer de uma reação química catalisada pela enzima luciferase.
[125] Os termos “capaz de reagir”, “promover uma reação” e semelhantes em relação à atividade de uma proteína significa que a dita proteína é uma enzima que catalisa a reação indicada.
[126] Para os propósitos da presente invenção, o termo “luciferase” significa uma proteína que tem capacidade de catalisar a oxidação de um composto químico (luciferina) por oxigênio molecular tal que a reação de oxidação é acompanhada pela emissão de luz (luminescência ou bioluminescência) e formação de luciferina oxidada.
[127] Para os propósitos da presente invenção, o termo “luciferina fúngica” significa um composto químico selecionado a partir do grupo de 6-(2-arilvinil)- 3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-onas com a fórmula estrutural
[128] , onde R é arila ou heteroarila.
[129] A luciferina fúngica é oxidada por um grupo de luciferases, em seguida denominado como “luciferases capazes de oxidar luciferina fúngica com emissão de luz” ou semelhantes. Tais luciferases foram encontradas em fungos bioluminescentes, por exemplo, elas são descritas no pedido RU2017102986/10 (005203) datado em 30.01.2017. Sequências de aminoácidos da luciferases úteis para métodos e combinações da presente invenção são substancialmente semelhantes ou idênticas à sequência de aminoácidos selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98. Em muitas modalidades da presente invenção, luciferases úteis para propósitos da presente invenção são caracterizadas pela sequência de aminoácidos que são pelo menos 40 % idêntica, por exemplo, pelo menos 45 % idêntica, ou pelo menos 50 % idêntica, ou pelo menos 55 % idêntica, ou pelo menos 60 % idêntica, ou pelo menos 70 % idêntica, ou pelo menos 75 % idêntica, ou pelo menos 80 % idêntica, ou pelo menos 85 % idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98. Em muitos casos luciferases são caracterizadas pela sequência de aminoácidos que têm pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 91 %, pelo menos
92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % de identidade ou 100 % de identidade) com uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88,90, 92, 94, 96, 98.
[130] Oxidação de luciferina fúngica produz uma “oxiluciferina fúngica”, um produto com a fórmula química ácido 6-aril-2-hidroxi-4-oxo-hexa-2,5-dienoico e a fórmula estrutural .
[131] O termo “pré-luciferina fúngica” ou simplesmente “pré-luciferina” é usado aqui para se referir a compostos a partir do grupo de 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H- piran-2-onas com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila. A pré-luciferina é convertida em luciferina fúngica em uma reação química catalisada por uma enzima da presente invenção.
[132] O termo “precursor de pré-luciferina” é usado aqui para se referir a compostos pertencentes a um grupo de ácidos 3-arilacrílicos com a fórmula estrutural
[133] , onde R é arila ou heteroarila. Pré-luciferinas são formadas a partir de ácidos 3-arilacrílicos no decorrer de uma reação química catalisada por uma enzima da presente invenção.
[134] Exemplos de luciferinas fúngicas são apresentados na Tabela 1. Exemplos de luciferina fúngica relacionados a pré-luciferinas, oxiluciferinas, e de pré-luciferinas são mostrados na Tabela 2.
TABELA 2. EXEMPLOS DE LUCIFERINA FÚNGICA RELACIONADO PRÉ- LUCIFERINAS, OXILUCIFERINAS, E DE PRÉ-LUCIFERINAS (NOMES DE
COMPOSTOS SÃO APRESENTADOS DE ACORDO COM NOMENCLATURA DE IUPAC; NOMES TRADICIONAIS SÃO MOSTRADOS EM NEGRITO SOB FÓRMULAS ESTRUTURAIS). Luciferina Precursor de pré- Pré-luciferina Oxiluciferina luciferina (E)-6-(3,4-di- ácido (E)-3-(3,4-di- (E)-6-(3,4-di- ácido (2E,5E)-6- hidroxistiril)- hidroxifenil) hidroxistiril)-4-di- (3,4-di- 3,4-di-hidroxi- propenoico hidroxi-2H-piran- hidroxistiril)-2- 2H-piran-2- 2-ona hidroxi-4-oxo- ona(3-hidroxi- hexa-2,5- hispidina) dienoico ácido cafeico hispidina cafeoilpiruvato (E)-3,4-di- ácido (E)-3- (E)-4-di-hidroxi-6- ácido (2E,5E)-2- hidroxi-6- fenilpropenoico estiril-2H-piran-2- hidroxi-4-oxo-6- estiril-2H- ona fenil-hexa-2,5- piran-2-ona dienoico ácido cinâmico (E)-3,4-di- ácido (E)-3-(4- (E)-4-hidroxi-6-(4- ácido (2E,5E)-2- hidroxi-6-(4- hidroxifenil)propenoi hidroxistiril)-2H- hidroxi-6-(4- hidroxistiril)- co piran-2-ona hidroxifenil)-4- 2H-piran-2- oxo-hexa-2,5-
ona dienoico ácido paracoumárico bisnoriangonina (E)-3,4-di- ácido (E)-3-(2- (E)-4-hidroxi-6-(2- ácido (2E,5E)-2- hidroxi-6-(2- hidroxifenil)propenoi hidroxistiril)-2H- hidroxi-6-(2- hidroxistiril)- co piran-2-ona hidroxifenil)-4- 2H-piran-2- oxo-hexa-2,5- ona dienoico ácido coumárico
(E)-3,4-di- ácido (E)-3-(2,4-di- (E)-4-hidroxi-6- ácido (2E,5E)-2- hidroxi-6-(2,4- hidroxifenil)propenoi (2,4-di- hidroxi-6-(2,4- di-hidroxistiril)- co hidroxistiril)-2H- hidroxifenil)-4- 2H-piran-2- piran-2-ona oxo-hexa-2,5- ona dienoico ácido umbélico
(E)-3,4-di- ácido (E)-3-(4- (E)-4-hidroxi-6-(4- ácido (2E,5E)-2- hidroxi-6-(4- hidroxi-3,5- hidroxi-3,5- hidroxi-6-(4- hidroxi-3,5- dimetoxifenil)propen dimetoxistiril)-2H- hidroxi-3,5- dimetoxistiril)- oico piran-2-ona dimetoxifenil)-4- 2H-piran-2- oxo-hexa-2,5- ona dienoico ácido sinápico (E)-3,4-di- ácido (E)-3-(4- (E)-4-hidroxi-6-(4- ácido (2E,5E)-2- hidroxi-6-(4- hidroxi-3- hidroxi-3- hidroxi-6-(4- hidroxi-3- metoxifenil)propenoi metoxistiril)-2H- hidroxi-3- metoxistiril)- co piran-2-ona metoxifenil)-4- 2H-piran-2- oxo-hexa-2,5- ona dienoico ácido ferúlico
(E)-3,4-di- ácido (E)-3-(6- (E)-4-hidroxi-6-(2- ácido (2E,5E)-2- hidroxi-6-(2- hidroxinaftalen-2- (6-hidroxinaftalen- hidroxi-6-(6- (6- il)propenoico 2-il)vinil)-2H- hidroxinaftalen-2- hidroxinaftalen piran-2-ona il)-4-oxo-hexa- -2-il)vinil)-2H- 2,5-dienoico piran-2-ona ácido 3-(6- hidroxinaftalen-2- il)acrílico (E)-6-(4- ácido (E)-3-(4- (E)-6-(4- ácido (2E,5E)-6- aminostiril)- aminofenil)propenoi aminostiril)-4- (4-aminofenil)-2- 3,4-di-hidroxi- co hidroxi-2H-piran- hidroxi-4-oxo- 2H-piran-2- 2-ona hexa-2,5- ona dienoico ácido 4- aminocinâmico
(E)-6-(4- ácido (E)-3-(4- (E)-6-(4- ácido (2E,5E)-6- (dietilamino)es dietilaminofenil)prop (dietilamino)estiril) (4- tiril)-3,4- enoico -4-hidroxi-2H- (dietilamino)fenil- hidroxi-2H- piran-2-ona 2-hidroxi-4-oxo- piran-2-ona hexa-2,5- dienoico ácido 4- dietilaminocinâmic o
(E)-6-(2-(1H- ácido (E)-3-(1Н- (E)-6-(2-(1H-indol- ácido (2E,5E)-2- indol-3-il)vinil)- indol-3-il)propenoico 3-il)vinil)-4- hidroxi-6-(1Н- 3,4-di-hidroxi- hidroxi-2H-piran- indol-3-il)-4-oxo- 2H-piran-2- 2-ona hexa-2,5- ona dienoico ácido 3- indolilacrílico
(E)-3,4-di- ácido (E)-3-(2,3,6,7- (E)-4-hidroxi-6- ácido (2E,5E)-2- hidroxi-6- tetra-hidro-1H,5H- (2,3,6,7-tetra- hidroxi-4-oxo-6- (2,3,6,7-tetra- pirido[3,2,1- hidro-1H,5H- (2,3,6,7-tetra- hidro-1H,5H- ij]quinolin-9- pirido[3,2,1- hidro-1H,5H- pirido[3,2,1- il)propenoico ij]quinolin-9- pirido[3,2,1- ij]quinolin-9- il)vinil)-2H-piran- ij]quinolin-9- il)vinil)-2H- 2-ona il)hexa-2,5-
piran-2-ona dienoico
[135] O termo “arila” ou “arila substituinte” refere-se a um radical aromático em um sistema de anel carbocíclico único ou fundido contendo de cinco a quatorze membros no anel. Em uma modalidade preferida, o sistema de anel contém de seis a dez membros de anel. Além disso, um ou mais átomos de hidrogênio podem ser substituídos por um substituinte selecionado do grupo acila, acilamino, acilóxi, alquenila, alcóxi, alquila, alquinila, amino, arila, arilóxi, azido, carbamoila, carboalcóxi, carbóxi, carboxiamido, carboxiamino, ciano, amino dissubstituído, formila, guanidino, halogênio, heteroarila, heterociclila, hidróxi, iminoamino, amino monossubstituído, nitro, oxo, fosfonamino, sulfinila, sulfonamino, sulfonila, tio, tioacilamino, tioureido ou ureido. Exemplos de grupos arila incluem, mas não estão limitados a, fenila, naftila, bifenila e terfenila. Além disso, o termo “arila”, tal como aqui usado, refere-se a grupos com o anel aromático ligado a um ou mais anéis não aromáticos.
[136] O termo “substituinte heterocíclico aromático”, “substituinte heteroarila” ou “heteroarila” refere-se a um radical aromático que contém de um a quatro heteroátomos ou grupos hetero selecionados a partir de O, N, S ou SO, em um sistema de anel heterocíclico único ou fundido contendo de cinco a quinze membros do anel. Em uma modalidade preferida, o sistema de anel heteroarila contém de seis a dez membros do anel. Além disso, um ou mais átomos de hidrogênio podem ser substituídos por um substituinte selecionado do grupo acila, acilamino, acilóxi, alquenila, alcóxi, alquila, alquinila, amino, arila, arilóxi, carbamoila, carboalcóxi, carbóxi, carboxiamido, carboxiamino, ciano, amino dissubstituído formila, guanidino, halogênio, heteroarila, heterociclila, hidróxi, iminoamino, amino monossubstituído, nitro, oxo, fosfonamino, sulfinila,
sulfonamino, sulfonila, tio, tioacilamino, tioureido ou ureido. Exemplos de grupos heteroarila incluem, mas não estão limitados a, grupos piridinila, tiazolila, tiadiazolila, isoquinolinila, pirazolila, oxazolila, oxadiazoila, triazolila e pirrolila. Além disso, o termo “heteroarila”, tal como aqui usado, refere-se a grupos com o anel heteroaromático ligado a um ou mais anéis não aromáticos.
[137] Nomes de compostos químicos são usados na presente invenção de acordo com a nomenclatura internacional IUPAC. Os nomes tradicionais também são apresentados (se houver).
[138] O termo “enzima de biossintetização de luciferina”, ou “enzima envolvida na renovação cíclica das conversões de luciferina” ou semelhantes é usado para significar uma enzima que catalisa a conversão de um precursor da pré-luciferina em pré-luciferina e/ou pré-luciferina em luciferina fúngica, e/ou oxiluciferina a um precursor de pré-luciferina, em sistemas in vitro e/ou in vivo. O termo “enzima de biossintetização de luciferina fúngica” não cobre luciferases, a menos que especificado de outra forma.
[139] O termo “hispidina hidroxilase” é usado aqui para descrever a enzima que catalisa a reação de conversão de pré-luciferina para luciferina fúngica, por exemplo, sintetizando 3-hidroxi-hispidina a partir de hispidina.
[140] O termo “hispidina sintase” é usado aqui para descrever uma enzima capaz de catalisar a síntese de pré-luciferina fúngica de um precursor de pré- luciferina, por exemplo, síntese de hispidina a partir de ácido cafeico.
[141] O termo “PKS” é usado aqui para descrever uma enzima pertencente ao grupo de policetídeos sintases tipo III capaz de catalisar a síntese a partir de hispidina de cafeoil-CoA.
[142] O termo “cafeoilpiruvato hidrolase” é usado aqui para descrever uma enzima capaz de catalisar a decomposição de oxiluciferina fúngica em compostos mais simples, por exemplo, para formar um precursor de pré- luciferina. Por exemplo, pode catalisar a conversão de cafeoilpiruvato em ácido cafeico.
[143] O termo “análogo funcional” é usado na presente invenção para descrever compostos químicos ou proteínas que realizam a mesma função e/ou podem ser usados para o mesmo propósito. Por exemplo, todas as luciferinas fúngicas listadas na Tabela 1 são análogos funcionais um do outro.
[144] O termo “ATP” refere-se a trifosfato de adenosina, que é o principal portador de energia na célula e tem a fórmula estrutural: .
[145] O termo “NAD(P)H” é usado aqui para se referir à porção reduzida de fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADPH) ou porção de dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADH). O termo “NAD (P)” é usado para se referir à forma oxidada de fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADP) ou dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NAD). Dinucleotídeo de nicotinamida adenina:
[146] e fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina:
[147]
[148] são dinucleotídeos construídos a partir de amida de ácido nicotínico e adenina ligados por uma cadeia que consiste em dois resíduos de D-ribose e dois resíduos de ácido fosfórico. O NADP difere do NAD pela presença de resíduo de ácido fosfórico adicional ligado a hidroxila de um resíduo de D-ribose. Ambos os compostos são muito difundidos na natureza e participam de diversas reações redox, desempenhando função de portadores de elétrons e hidrogênio, que recebe de substâncias oxidadas. As formas reduzidas transferem os elétrons recebidos e o hidrogênio a outras substâncias.
[149] Os termos “coenzima A” ou “CoA” referem-se a uma coenzima bem conhecida da técnica anterior, que está envolvida na oxidação ou síntese de ácidos graxos, biossíntese de gorduras, transformações oxidativas de produtos de decomposição de carboidratos e tem a fórmula estrutural:
.
[150] O termo “malonil-CoA” refere-se a um derivado de coenzima A formado durante a síntese de ácidos graxos e contendo um resíduo de ácido malônico: .
[151] O termo “cumaroil-CoA” refere-se ao tioéster de coenzima A e ácido coumárico:
[152] O termo “cafeoil-CoA” refere-se ao tioéster de coenzima A e ácido cafeico:
[153] O termo “mutante” ou “derivado”, como usado aqui, refere-se a uma proteína divulgada na presente invenção, em que um ou mais aminoácidos são adicionados a, e/ou substituídos em e/ou removidos (deletados) de, e/ou incorporado (inserido) no terminal N e/ou terminal C e/ou uma sequência de aminoácidos nativa dentro de uma proteína da presente invenção. Conforme usado aqui, o termo “mutante” se refere a uma fração de ácido nucleico que codifica uma proteína mutante. Além disso, o termo “mutante”, tal como aqui usado, refere-se a qualquer variante que é mais curta ou mais longa do que a proteína ou ácido nucleico divulgado na presente invenção.
[154] O termo “homologia” é usado para descrever a relação entre sequências de nucleotídeos ou aminoácidos, que é determinada pelo grau de identidade e/ou similaridade entre as ditas sequências em comparação.
[155] Como usado aqui, uma sequência de aminoácidos ou nucleotídeos é “substancialmente idêntica” ou “substancialmente a mesma” que uma sequência de referência, se a sequência de aminoácidos ou nucleotídeos tiver pelo menos 40 % de identidade com a sequência selecionada dentro do domínio de referência. Consequentemente, as sequências substancialmente semelhantes incluem aquelas que têm, por exemplo, pelo menos 40 % de identidade, ou pelo menos 50 % de identidade, ou pelo menos 55 % de identidade, ou pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 62 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 % de identidade, pelo menos 85 % de identidade, pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade). Duas sequências idênticas uma à outra também são substancialmente semelhantes. Para os propósitos da presente invenção, o comprimento das sequências a serem comparadas deve ser de pelo menos 100 ou mais aminoácidos, de preferência pelo menos 200 aminoácidos, por exemplo, 300 aminoácidos ou mais. Em particular, é possível comparar sequências de aminoácidos de comprimento total de proteínas. Para ácidos nucleicos, o comprimento das sequências a serem comparadas deve ser de pelo menos 300 ou mais nucleotídeos; preferencialmente pelo menos 600 nucleotídeos, incluindo 900 ou mais nucleotídeos.
[156] Um exemplo do algoritmo adequado para determinar a porcentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência é o algoritmo BLAST descrito por Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990). O software para realizar análises BLAST está disponível através do Centro Nacional de
Informação de Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.ni-h.gov/). Este algoritmo compreende, em primeiro lugar, a busca de pares de segmentos de alta pontuação (HSP), identificando palavras curtas de comprimento W na sequência de teste, que ou coincidem completamente ou satisfazem uma certa pontuação de limiar de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra o mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é denominado como o limite de pontuação de palavra da vizinhança (Altschul et al., 1990). Esses acertos de palavras de vizinhança iniciais atuam como sementes para iniciar pesquisas de HSPs mais longos que os contêm. Em seguida, essas ocorrências de palavra são estendidas em ambas as direções ao longo de cada sequência, tanto quanto a pontuação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada. Para sequências de nucleotídeos, pontuações cumulativas são calculadas usando os parâmetros M (pontuação de recompensa definida para um par de resíduos correspondentes; é sempre > 0) e N (pontuação de penalidade definida para resíduos incompatíveis; é sempre < 0). Para calcular o valor cumulativo para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada. A extensão das ocorrências de palavras em cada direção é interrompida quando a pontuação de alinhamento cumulativa cai pela quantidade X de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou menos devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou o final de qualquer sequência é alcançado. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. No programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos), o comprimento da palavra padrão (W) é 11, o valor esperado (E) é 10, a queda (corte) é 100, M = 5, N = -4 e comparação é realizado em ambas as vertentes. No programa BLASTP (para sequências de aminoácidos), o comprimento de palavra padrão (W) é 3, o valor esperado (E) é 10 e uma matriz de pontuação BLOSUM62 é usada (consultar Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci EUA 89: 10915 (1989)).
[157] Além de calcular a porcentagem de identidade de sequência, o algoritmo BLAST também realiza análise de similaridade estatística entre duas sequências
(consultar, por exemplo, Karlin e Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. EUA 90:5873- 5787 (1993)). Um dos parâmetros fornecidos pelo algoritmo BLAST para determinar a similaridade é a probabilidade cumulativa mais baixa (P(N)), que indica a probabilidade de coincidência aleatória entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de teste é considerada semelhante a uma sequência de referência se a probabilidade cumulativa mais baixa na comparação da sequência de ácido nucleico de teste com a sequência de ácido nucleico de referência for menor que 0,1, mais preferencialmente menor que 0,01, e mais preferencialmente menor de 0,001.
[158] O termo “sequência de consenso” refere-se a uma sequência de aminoácidos arquetípica usada como referência para comparação de todas as variantes de uma proteína ou sequência de interesse particular. Sequências de consenso e métodos para determiná-las são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Por exemplo, uma sequência de consenso pode ser determinada a partir de múltiplas comparações de proteínas homólogas conhecidas, identificando os aminoácidos que ocorrem com mais frequência em uma determinada posição em todo o conjunto de sequências relacionadas.
[159] O termo “sequência conservada” é usado para designar uma sequência de nucleotídeos em um ácido nucleico ou uma sequência de aminoácidos em uma cadeia polipeptídica que permanece completa ou virtualmente inalterada no curso da evolução em diferentes organismos. Assim, uma “sequência não conservada” é uma sequência que varia consideravelmente entre os organismos comparados.
[160] O termo “segmento de inserção de aminoácido” significa um ou mais aminoácidos dentro de uma cadeia polipeptídica que está entre fragmentos de proteínas (domínios de proteínas, ligantes, sequências de consenso) em consideração. Deve ser óbvio para as pessoas versadas na técnica que os segmentos e fragmentos de inserção de aminoácidos em consideração estão operacionalmente ligados e formam uma única cadeia polipeptídica.
[161] A estrutura do domínio de uma proteína pode ser determinada usando qualquer software adequado conhecido na técnica. Por exemplo, um software de Ferramenta de pesquisa de arquitetura modular simples (SMART) disponível na Internet em http://smart.embl-heidelberg.de pode ser usado para este propósito [Schultz et al., PNAS 1998; 95: 5857-5864; Letunic I, Doerks T, Bork P, Nucleic Acids Res 2014; doi: 10.1093/nar/gku949].
[162] O termo “operativamente ligado” ou semelhantes na descrição de proteínas de fusão refere-se a sequências polipeptídicas que ocorrem em uma relação física e funcional umas com as outras. Nas modalidades mais preferidas, as funções dos componentes polipeptídicos da molécula quimérica não são alteradas em comparação com as propriedades funcionais dos componentes polipeptídicos isolados. Por exemplo, a hispidina hidroxilase da presente invenção pode ser operacionalmente ligada a um parceiro de fusão de interesse, por exemplo, luciferase. Neste caso, a proteína de fusão retém as propriedades da hispidina hidroxilase enquanto o polipeptídeo de interesse retém sua atividade biológica original, por exemplo, a capacidade de oxidar luciferina com emissão de luz. Em algumas modalidades da presente invenção, as atividades dos parceiros de fusão podem ser reduzidas em comparação com as atividades das proteínas isoladas. Essas proteínas de fusão também encontram aplicação no âmbito da presente invenção.
[163] O termo “operativamente ligado” ou semelhantes na descrição de ácidos nucleicos significa que os ácidos nucleicos estão covalentemente ligados de tal forma que não há mau funcionamento do quadro de leitura ou sinais de parada em suas junções. Como é óbvio para qualquer pessoa versada na técnica, as sequências de nucleotídeos que codificam uma proteína de fusão com os componentes “ligados operacionalmente” (proteínas, polipeptídeos, sequências de ligantes, segmentos de inserção de aminoácidos, domínios de proteínas, etc.) são compostas de fragmentos que codificam os ditos componentes, estando estes fragmentos ligados covalentemente de tal forma que uma proteína de fusão de comprimento total é produzida durante a transcrição e tradução da sequência de nucleotídeos.
[164] O termo “operativamente ligado” na descrição de uma relação de ácido nucleico com sequências de codificação regulatórias (promotores, potenciadores, terminadores de transcrição) significa que as sequências estão localizadas e ligadas de tal forma que a sequência reguladora afetará o nível de expressão do ácido nucleico de codificação ou sequência de ácido nucleico.
[165] No contexto da presente invenção, “ligação” de ácidos nucleicos significa que dois ou mais ácidos nucleicos estão ligados entre si usando qualquer meio conhecido na técnica. Como um exemplo não limitativo, os ácidos nucleicos podem ser ligados entre si usando DNA ligase ou reação em cadeia da polimerase (PCR) durante o emparelhamento. Os ácidos nucleicos também podem ser ligados por síntese química de um ácido nucleico usando uma sequência de dois ou mais ácidos nucleicos separados.
[166] Os termos “elementos regulatórios” ou “sequências regulatórias” referem- se às sequências envolvidas em uma regulação da expressão de ácido nucleico codificante. Os elementos reguladores incluem promotores, sinais de terminação e outras sequências que afetam a expressão de um ácido nucleico. Eles tipicamente também compreendem as sequências necessárias para a tradução adequada da sequência de nucleotídeos.
[167] O termo “promotor” é usado para descrever uma sequência de DNA não traduzida e não transcrita a montante da região de codificação que contém um sítio de ligação de RNA polimerase, bem como um sítio de ligação de DNA de iniciação da transcrição. A região promotora também pode compreender outros elementos reguladores da expressão gênica.
[168] O termo “funcional”, como usado aqui, refere-se a uma sequência de nucleotídeo ou aminoácido que pode desempenhar um papel em um teste ou tarefa particular. O termo “funcional”, se usado para descrever luciferases, significa que a proteína tem a capacidade de produzir a reação de oxidação da luciferina acompanhada por luminescência. O mesmo termo “funcional”, se usado para descrever hidroxilases de hispidina, significa que a proteína tem a capacidade de catalisar a reação de conversão de pelo menos uma das pré- luciferinas mostradas na Tabela 2 para a luciferina correspondente. O mesmo termo “funcional”, se usado para descrever a hispidina sintases, significa que a proteína tem a capacidade de catalisar a reação de conversão de pelo menos um dos precursores da pré-luciferina em pré-luciferina, por exemplo, a conversão de ácido cafeico em hispidina. O mesmo termo “funcional”, se usado para descrever cafeoilpiruvatos hidrolases, significa que a proteína tem a capacidade de catalisar a reação de convertendo pelo menos uma de oxiluciferinas para precursor de pré-luciferina (por exemplo, convertendo cafeoilpiruvato para ácido cafeico).
[169] O termo “propriedades enzimáticas”, como usado aqui, refere-se à capacidade de uma proteína para catalisar uma dada reação química.
[170] O termo “propriedades bioquímicas”, como usado aqui, refere-se ao dobramento de proteínas e compreende a taxa de maturação, meia-vida, taxa de catálise, estabilidade de pH e temperatura e outras propriedades semelhantes.
[171] O termo “propriedades espectrais”, conforme usado aqui, refere-se a espectros, rendimento quântico, intensidade de luminescência e outras propriedades semelhantes.
[172] A referência a uma sequência de nucleotídeos “codificando” um polipeptídeo significa que o polipeptídeo é produzido durante a transcrição e tradução do mRNA de acordo com esta sequência de nucleotídeos. Nela, tanto a fita codificadora, idêntica ao mRNA e geralmente usada na listagem de sequências, quanto a fita complementar, que é usada como molde para a transcrição, podem ser indicadas. Como é óbvio para qualquer pessoa versada na técnica, este termo também cobre quaisquer sequências de nucleotídeos degeneradas que codificam a mesma sequência de aminoácidos. As sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo compreendem sequências contendo íntrons.
[173] Os termos “expressão cassete” ou “cassete de expressão” são usados aqui no sentido de uma sequência de ácido nucleico capaz de regular a expressão de uma sequência de nucleotídeos particular em uma célula hospedeira apropriada. Como regra, o “cassete de expressão” contém um ácido nucleico heterólogo que codifica uma proteína ou um fragmento funcional da mesma operacionalmente ligado a um promotor e sinais de terminação. Normalmente, ele também contém sequências necessárias para a tradução adequada de uma sequência de nucleotídeos significativa. O cassete de expressão pode ser um que ocorre na natureza (incluindo células hospedeiras), mas foi produzido em uma forma recombinante útil para a expressão do ácido nucleico heterólogo. No entanto, em muitos casos, o “cassete de expressão” é heterólogo em relação ao hospedeiro, isto é, a sequência de ácido nucleico particular deste cassete de expressão não ocorre naturalmente na célula hospedeira e deve ser introduzida na célula hospedeira ou no progenitor do hospedeiro célula por meio de transformação. A expressão da sequência de nucleotídeos pode ser regulada por um promotor constitutivo ou um promotor indutível que inicia a transcrição apenas quando a célula hospedeira está aberta a um estímulo externo específico. No caso de um organismo multicelular, o promotor também pode ter especificidade para um determinado tecido, órgão ou estágio de desenvolvimento.
[174] Ácido nucleico “heterólogo” ou “exógeno” significa um ácido nucleico que nunca ocorre em uma célula hospedeira de tipo selvagem.
[175] O termo “endógeno” refere-se a uma proteína ou ácido nucleico nativo em sua posição natural dentro do genoma do organismo.
[176] O termo “hibridiza especificamente”, tal como aqui usado, refere-se a uma associação entre duas moléculas de ácido nucleico de fita simples ou sequências suficientemente complementares, de modo a permitir a hibridização sob condições predeterminadas comumente usadas na técnica (às vezes o termo “substancialmente complementar” é usado).
[177] Uma fração de ácido nucleico “isolada” ou proteína isolada é uma fração de ácido nucleico ou proteína que ocorre separadamente de seu ambiente natural devido às atividades humanas e, portanto, não é um produto da natureza. Uma molécula de ácido nucleico isolada ou uma proteína isolada pode ocorrer em uma forma purificada ou em um ambiente não natural, como, por exemplo (que não se destina a ser limitado), uma célula procariótica recombinante, célula vegetal, célula animal, célula não bioluminescente de fungo, organismo transgênico (fungo, planta, animal), etc.
[178] “Transformação” é o processo para a introdução de um ácido nucleico heterólogo em uma célula ou organismo hospedeiro. Em particular, “transformação” significa uma integração estável da fração de DNA no genoma de um organismo alvo de interesse.
[179] O termo “transformado/transgênico/recombinante” refere-se a um organismo hospedeiro, como bactéria, planta, fungo ou animal, que foi modificado pela introdução de uma fração de ácido nucleico heteróloga. Esta porção de ácido nucleico pode ser integrada de forma estável no genoma do hospedeiro ou ocorrer como uma porção extracromossômica. Essa fração extracromossômica pode ser capaz de autorreplicação. Deve ser entendido que células, tecidos ou organismos transgênicos ou transformados de forma estável incluem ambos os produtos finais do processo de transformação, mas também a progênie transgênica. Os termos “não transformado”, “não transgênico”, “não recombinante” ou “tipo selvagem” referem-se a um organismo hospedeiro natural ou célula hospedeira, por exemplo, uma bactéria ou planta, que não contêm porções de ácido nucleico heterólogas.
[180] O termo “autonomamente luminoso” ou “autonomamente bioluminescente” refere-se a organismos transgênicos ou células hospedeiras que são capazes de bioluminescência sem adição exógena de luciferinas, pré- luciferinas ou precursores de pré-luciferinas.
[181] O termo “4’-fosfopantoteinil transferase” é usado aqui para significar uma enzima que transfere 4-fosfopantoteinil a partir da coenzima A para a serina no domínio de transferência de acila de policetídeo sintase. 4’-fosfopantoteinil transferases são naturalmente expressas por muitas plantas e fungos e são conhecidas na técnica [Gao Menghao et al., Microbial Cell Factories 2013, 12:77]. Será óbvio para aquela pessoa versada na técnica que qualquer variante funcional da 4’-fosfopantoteinil transferase pode ser usada para os propósitos da presente invenção. Por exemplo, a NpgA 4’-fosfopantoteinil transferase de Aspergillus nidulans (SEQ ID NOs 104, 105) descrita em [Gao Menghao et al., Microbial Cell Factories 2013, 12:77], ou um homólogo ou mutante do mesmo, isto é, uma proteína com sequência de aminoácido substancialmente semelhante ou idêntica à sequência tendo SEQ ID NO 105. Um outro exemplo é um 4’-fosfopantoteinil transferase tendo pelo menos 40 % de identidade, incluindo pelo menos 50 % de identidade, ou pelo menos 55 % de identidade, ou pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 62 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 % de identidade, ou pelo menos 85 % de identidade, ou pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com a sequência caracterizada pela SEQ ID NO 105.
[182] Os nucleotídeos são designados de acordo com suas bases usando as seguintes abreviaturas padrão: adenina (A), citosina (C), timina (T) e guanina (G). Da mesma forma, os aminoácidos são designados pelas seguintes abreviaturas padrão: alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisteína (Cys; C), glutamina ( Gln; Q), ácido glutâmico (Glu; E), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (He; 1), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina ( Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) e valina ( Val; V).
[183] A presente invenção visa a identificação de novas enzimas de biossíntese de luciferina fúngica, ácidos nucleicos capazes de codificar essas enzimas, e proteínas capazes de catalisar certos estágios da biossíntese de luciferina fúngica. A invenção também fornece a aplicação de ácidos nucleicos para produzir as ditas enzimas em uma célula ou organismo. Métodos para preparação in vitro ou in vivo de compostos químicos idênticos às luciferinas fúngicas e pré-luciferinas também são fornecidas. Vetores compreendendo ácido nucleico descritos na presente invenção também são fornecidos. Além disso, a presente invenção fornece cassetes de expressão compreendendo o ácido nucleico da presente invenção e elementos regulatórios necessários para expressão de ácido nucleico em uma célula hospedeira selecionada. Além disso, células, linhas celulares estáveis, organismos transgênicos (por exemplo, plantas, animais, fungos ou micro-organismos) incluindo ácidos nucleicos, vetores, ou cassetes de expressão da presente invenção também são fornecidas. A presente invenção também fornece combinações de ácidos nucleicos para obter células autonomamente luminosas, linhas celulares, ou organismos transgênicos. Em modalidades preferidas, células ou organismos transgênicos são capazes de produzir luciferina fúngica a partir de precursores. Em algumas modalidades, células ou organismos transgênicos são capazes de produzir pré-luciferina fúngica a partir de precursores. Em algumas modalidades, células ou organismos transgênicos são capazes de bioluminescência na presença de um precursor de luciferina fúngica. Em algumas modalidades, células ou organismos transgênicos são capazes de bioluminescência autônoma. Combinações de proteínas para produzir luciferina ou seus precursores a partir de mais compostos químicos simples também são fornecidas. A presente invenção também fornece um kit contendo ácidos nucleicos, vetores, ou cassetes de expressão da presente invenção para produzir células luminosas, linhas celulares, ou organismos transgênicos.
PROTEÍNAS
[184] Como previamente estabelecido nesta invenção, as proteínas envolvidas na biossíntese de luciferina fúngica (sistema cíclico de transformações) como enzimas.
[185] As proteínas desta invenção podem ser obtidas a partir de fontes naturais ou por meio de tecnologias recombinantes. Por exemplo, proteínas de tipo selvagem podem ser isoladas a partir de fungos bioluminescentes, por exemplo, fungos do tipo Basidiomycota, predominantemente da classe Basidiomycetes,
em particular da ordem Agaricales. Por exemplo, as proteínas de tipo selvagem podem ser isoladas de fungos como Neonothopanus nambi, Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallophosa, Armillaria chlorenae, etc. desta invenção também pode ser obtida por expressão de ácido nucleico recombinante, sequência de proteína codificadora no respectivo hospedeiro ou em sistema de expressão livre de células, conforme descrito na seção “Ácidos nucleicos”. Em algumas modalidades, as proteínas são usadas dentro das células hospedeiras, nas quais os ácidos nucleicos capazes de expressão são introduzidos para codificar as ditas proteínas.
[186] Em modalidades preferidas, as proteínas reivindicadas são rapidamente dobradas após a expressão em uma célula hospedeira. Por “dobramento rápido” entende-se o fato de as proteínas atingirem sua estrutura terciária, o que garante sua propriedade enzimática em um curto período de tempo. Nessas modalidades, as proteínas são dobradas dentro de um período de tempo que geralmente não excede aproximadamente 3 dias, normalmente não excede aproximadamente 2 dias e prevalentemente não excede aproximadamente 12 a 24 horas.
[187] Em algumas modalidades, as proteínas são usadas na forma isolada. Quaisquer técnicas comuns, onde métodos adequados de purificação de proteínas são descritos no Guia para Purificação de Proteína (Deuthser ed., Academic Press, 1990), podem ser usadas para purificação de proteínas. Por exemplo, o lisado pode ser preparado a partir da fonte inicial e purificado usando HPLC, cromatografia de deslocamento, eletroforese em gel, cromatografia de afinidade, etc.
[188] Se as proteínas da invenção estão na forma isolada, significa que esta proteína está substancialmente livre de outras proteínas ou outras moléculas biológicas naturais, como oligossacarídeos, ácidos nucleicos e seus fragmentos, etc., onde o termo “substancialmente livre de” neste caso significa que menos de 70 %, normalmente menos de 60 % e prevalentemente menos de 50 % da dita composição, que compreende a proteína isolada, é a outra molécula biológica natural. Em algumas modalidades, as ditas proteínas estão substancialmente na forma purificada, onde o termo “forma substancialmente purificada” significa pureza igual a pelo menos 95 %, normalmente igual a pelo menos 97 % e prevalentemente igual a pelo menos 99 %.
[189] As proteínas da invenção retêm atividade em temperaturas abaixo de 50 °C, prevalentemente em temperaturas máximas de 45 °C, isto é, retêm atividade em temperaturas de 20 a 42 °C e podem ser usadas em sistemas de expressão heterólogos in vitro e in vivo.
[190] As proteínas reivindicadas têm estabilidade de рН dentro da faixa de 4 a 10, prevalentemente dentro da faixa de 6,5 a 9,5. A estabilidade de рН ideal das proteínas reivindicadas é dentro da faixa de 6,8 a 8,5, por exemplo, entre 7,3 a 8,3.
[191] As proteínas reivindicadas são ativas em condições fisiológicas. O termo “condições fisiológicas” nesta invenção se destina a se referir a um meio tendo a temperatura dentro da faixa de 20 a 42 °C, pH dentro da faixa de 6,8 a 8,5, solução salina e osmolaridade de 300 a 400 mOsm/l. Em particular, o termo “condições fisiológicas” inclui meio intracelular, preparação livre de células e líquidos extraídos de organismos vivos, como plasma sanguíneo. “Condições fisiológicas” podem ser criadas artificialmente. Por exemplo, misturas de reação, garantindo “condições fisiológicas”, podem ser criadas pela combinação de compostos químicos conhecidos. Os métodos de tal criação de mídia são bem conhecidos da técnica anterior. Exemplos não limitativos incluem:
[192] 1) Solução de ringer isotônica para plasma de sangue de mamífero.
[193] Solução de ringer consiste em 6,5 g de NaCl, 0,42 g de KCl e 0,25 g de CaCl2, dissolvidos em 1 litro de água bidestilada. Ao preparar a solução, os sais são adicionados sequencialmente, cada sal subsequente é adicionado apenas após a dissolução do anterior. Para evitar a sedimentação do carbonato de cálcio, recomenda-se a passagem do dióxido de carbono pela solução de bicarbonato de sódio. A solução é preparada com água destilada fresca.
[194] 2) Solução de Versene
[195] A solução de Versene é uma mistura de EDTA e sais inorgânicos dissolvidos em água destilada ou em água para injeção esterilizada por filtração por membrana usando filtros com tamanho de poro final de 0,22 µm. 1 l de solução de Versene compreende 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,45 g de fosfato dissódico dodeca-hidratado, 0,2 g de di-hidrogenofosfato de potássio, 0,2 g de palquelato, água bidestilada até 1 l. Capacidade tamponante da solução de Versene deve ser mínima 1,4 ml. Teor de cloreto de íon de 4,4 a 5,4 g/l, EDTA mínimo de 0,6 mmol/l.
[196] 3) solução salina tamponada com fosfato (PBS, Tampão fosfato de Na)
[197] Tampão fosfato de Na consiste em 137 mМ de NaCl, 10 mМ de Na2HPO4, 1,76 mМ de KH2PO4. O tampão também pode conter KCl a concentração de até 2,7 mМ. O seguinte é usado para preparar 1 litro de tampão fosfato de Na de força normal: 8,00 g de NaCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 0,20 g de KCl (opcionalmente). Dissolver em 800 ml de água destilada. O pH necessário é ajustado usando ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. Em seguida, a água destilada é adicionada a um volume total de 1 litro.
[198] As proteínas específicas de interesse são enzimas envolvidas na biossíntese de luciferina fúngica cíclica, seus mutantes, homólogos e derivados. Cada um desses tipos específicos de estruturas polipeptídicas de interesse será analisado individualmente em mais detalhes. HISPIDINA-HIDROXILASES
[199] Hispidina-hidroxilases desta invenção são proteínas capazes de catalisar a síntese de luciferina a partir de pré-luciferina. Em outras palavras, estas são enzimas que catalisam a reação de transformação de 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H- piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural ,
[200] em 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural
[201] , onde R - arila ou heteroarila.
[202] A reação é realizada em condições fisiológicas in vitro e in vivo na presença de pelo menos uma molécula de NAD(P)H e pelo menos de uma molécula de oxigênio molecular (O2) per uma molécula de 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi- 2H-piran-2-ona:
[203] Hispidina-hidroxilases de interesse incluem proteínas a partir de fungos bioluminescentes Neonothopanus nambi, Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos, cujas sequências de aminoácidos são mostradas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, e também seus mutantes funcionais, homólogos e derivados.
[204] Em modalidades preferidas, as hispidinas hidroxilases desta invenção são caracterizadas pela presença de domínio de ligação FAD/NAD (P), IPR002938 - código da base de dados pública InterPro disponível na Internet no site http://www.ebi.ac.uk/interpro). O dito domínio está envolvido na ligação de flavina adenina dinucleotídeo (FAD) e nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) em múltiplas enzimas, adicionando o grupo hidroxila ao substrato, e múltiplos organismos encontrados nas vias metabólicas. As hispidina-hidroxilases desta invenção compreendem o dito domínio com o comprimento de 350 a 385 aminoácidos, prevalentemente 360 - 380 aminoácidos, por exemplo, 364 a 377 aminoácidos, sequências de aminoácidos não conservativas terminais C- e N- floxed tendo menor porcentagem de identidade entre si. A posição do domínio de ligação FAD/NAD nas hispidinas hidroxilases reivindicadas é ilustrada em alinhamento múltiplo de sequências de aminoácidos de proteínas individuais na Figura 1.
[205] Homólogos ou mutantes de hispidina-hidroxilase também são fornecidos, cuja sequência difere das sequências de aminoácidos específicas acima mencionadas reivindicadas na invenção, isto é SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28. Homólogos ou mutantes de interesse têm pelo menos mínimo 40 % de identidade, por exemplo, mínimo 45 % de identidade, ou mínimo 50 % de identidade, ou mínimo 55 % de identidade, ou mínimo 60 % de identidade, ou mínimo 65 % de identidade, ou mínimo 70 % de identidade, ou mínimo 75 % de identidade, por exemplo, mínimo 80 % de identidade, mínimo 85 % de identidade, mínimo 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com proteína, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, para pelo menos 350 aminoácidos. Particularmente, refere-se a sequências de aminoácidos que fornecem sítios funcionais de proteínas, isto é, à sequência do domínio de ligação de FAD/NAD sendo a parte de hispidinas hidroxilases.
[206] Em modalidades preferidas, a sequência de aminoácidos da hispidina hidroxilase desta invenção é caracterizada pela presença de vários motivos de aminoácidos conservadores (sequências de consenso) típicos apenas deste grupo de enzimas. Estas sequências de consenso são mostradas em SEQ ID NOs: 29 - 33. Os sítios de consenso dentro das sequências de aminoácidos da hispidina hidroxilase são operativamente ligados por meio de inserções de aminoácidos com inserções inferiores. HISPIDINA-SINTASES
[207] Hispidina-sintases desta invenção são proteínas capazes de catalisar síntese de pré-luciferina a partir de seus precursores. Em outras palavras, estas são enzimas que catalisam a reação de transformação de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural
[208] , onde R - arila ou heteroarila em 6-2-arilvinil)-4- hidroxi-2H-piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural
[209] , onde R - arila ou heteroarila.
[210] Exemplos de ácidos 3-arilacrílicos sendo os precursores de pré-luciferinas são dados na Tabela 2.
[211] A reação é realizada em condições fisiológicas in vitro e in vivo na presença de pelo menos uma molécula de coenzima A, pelo menos uma molécula de ATP e pelo menos duas moléculas de malonil-CoA:
[212] Hispidina-sintases de interesse incluem proteínas a partir de fungos bioluminescentes Neonothopanus nambi, Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos, cujas sequências de aminoácidos são mostradas em SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 e também seus mutantes funcionais, homólogos e derivados.
[213] Em modalidades preferidas, a sequência de aminoácido de hispidina- sintase desta invenção é caracterizada pela presença de vários motivos de aminoácidos conservadores (sequências de consenso) típicos apenas deste grupo de enzimas. Estas sequências de consenso são mostradas em SEQ ID NOs: 56 - 63. Os sítios de consenso dentro das sequências de aminoácidos da hispidina-sintase são operativamente ligados por meio de inserções de aminoácidos com inserções inferiores.
[214] Em muitas modalidades desta invenção, as sequências de aminoácidos relevantes de homólogos e mutantes de hispidina-sintases específicas são caracterizadas por identidade substancial com sequências mostradas em SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, que é, por exemplo, pelo menos mínimo 40 % de identidade, por exemplo, mínimo 45 % de identidade, ou mínimo 50 % de identidade, ou mínimo 55 % de identidade, ou mínimo 60 % de identidade, ou mínimo 65 % de identidade, ou mínimo 70 % de identidade, ou mínimo 75 % de identidade, por exemplo, mínimo 80 % de identidade, mínimo 85 % de identidade, mínimo 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) para toda a sequência de aminoácidos da proteína.
[215] Em modalidades preferidas, as hispidina-sintases desta invenção são proteínas de polidomínio relacionadas à superfamília de policetídeo sintase. Em modalidades preferidas, as hispidina-sintases desta invenção são submetidas a modificação pós-tradução, isto é, a transferência de 4-fosfopanteteinil a partir da coenzima A para a serina em domínio de portador acila de policetídeo sintase é necessária para sua maturação. Enzimas - 4’-fosfopanteteinil transferases que realizam tal modificação são conhecidas a partir da técnica anterior [Gao Menghao et al., Microbial Cell Factories 2013, 12:77]. 4’-fosfopanteteinil transferases são expressas na natureza por muitas plantas e fungos, em que as células da hispidina-sintase funcional desta invenção amadurecem sem a introdução de enzimas adicionais ou ácidos nucleicos que as codificam. Ao mesmo tempo, a introdução da sequência de codificação de 4’-fosfopanteteinil transferase nas células hospedeiras é necessária para a maturação da hispidina- sintase em células de alguns fungos inferiores (por exemplo, levedura) e animais. É óbvio para as pessoas versadas na técnica que qualquer variante funcional de 4’-fosfopanteteinil transferase, conhecida a partir da técnica anterior, pode ser usado para os propósitos desta invenção. Por exemplo, pode ser usado 4’- fosfopanteteinil transferase NpgA a partir de Aspergillus nidulans (SEQ ID NO 104, 105), descrito em [Gao Menghao et al., Microbial Cell Factories 2013, 12:77], qualquer um é homólogo ou mutante atividade confirmada.
CAFEOILPIRUVATO HIDROLASES
[216] Cafeoilpiruvato hidrolases desta invenção são proteínas capazes de catalisar a transformação de Oxiluciferina, que é ácido 6-aril-2-hidroxi-4-oxo- hexa-2,5-dieno tendo a fórmula estrutural
[217] , onde R é arila ou heteroarila, conversão em ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural
[218] , onde R - arila ou heteroarila.
[219] Exemplos de oxiluciferinas são dados na Tabela 2.
[220] A reação é realizada em condições fisiológicas in vitro e in vivo:
[221] Em modalidades preferidas, os cafeoilpiruvatos hidrolases desta invenção transformam cafeoilpiruvato em ácido cafeico. Em modalidades preferidas, eles transformam Oxiluciferina mostrados na Tabela 2 no precursor de pré-luciferina.
[222] Cafeoilpiruvato hidrolases de interesse incluem proteínas a partir de fungos bioluminescentes Neonothopanus nambi, Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos, cujas sequências de aminoácidos são mostradas em SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, e também seus mutantes funcionais, homólogos e derivados.
[223] Em modalidades preferidas, a sequência de aminoácido de cafeoilpiruvato hidrolase desta invenção (incluindo homólogos e mutantes de interesse) é caracterizada pela presença de vários motivos de aminoácidos conservativos (sequências de consenso) típicos apenas deste grupo de enzimas. Estas sequências de consenso são mostradas em SEQ ID NOs: 76 - 78. Os sítios de consenso dentro das sequências de aminoácidos da cafeoilpiruvato hidrolase são operativamente ligados por meio de inserções de aminoácidos com inserções inferiores.
[224] Em muitas modalidades desta invenção, as sequências de aminoácidos relevantes de cafeoilpiruvato hidrolase são caracterizadas pela identidade substancial com sequências mostradas em SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, que é, por exemplo, pelo menos mínimo 40 % de identidade, por exemplo, mínimo 45 % de identidade, ou mínimo 50 % de identidade, ou mínimo 55 % de identidade, ou mínimo 60 % de identidade, ou mínimo 65 % de identidade, ou mínimo 70 % de identidade, ou mínimo 75 % de identidade, por exemplo, mínimo 80 % de identidade, mínimo 85 % de identidade, mínimo 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) para toda a sequência de aminoácido de proteína.
[225] Homólogos das proteínas específicas descritas acima (isto é, proteínas com sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53, 55, 65, 67, 69, 71, 73, 75) podem ser isolados de fontes naturais. Os homólogos podem ser encontrados em muitos organismos (fungos, plantas, microrganismos, animais). Em particular, os homólogos podem ser encontrados em diferentes tipos de fungos bioluminescentes, por exemplo, fungos do tipo Basidiomycota, predominantemente da classe Basidiomycetes, em particular da ordem Agaricales. Além disso, fungos não bioluminescentes e plantas que produzem hispidina, como Pteris ensiformis, são de interesse especial como uma fonte de homólogos de proteínas desta invenção [Yung-Husan Chen et al., «Identification of phenolic antioxidants from Sword Brake fern (Pteris ensiformis Burm.)», Food Chemistry, Volume 105, Issue 1, 2007, páginas 48 a 56], Inonotus xeranticus [In- Kyoung Lee et al., «Hispidin Derivatives from the Mushroom Inonotus xeranticus and Their Antioxidant Activity», J. Nat. Prod., 2006, 69 (2), páginas 299-301], Phellinus sp. [In-Kyoung Lee et al., «Highly oxygenated and unsaturated metabolites providing a diversity of hispidin class antioxidants in the medicinal mushrooms Inonotus and Phellinus». Bioorganic & Medicinal Chemistry. 15 (10): 3309-14.], Equisetum arvense [Markus Herderich et al., «Establishing styrylpyrone synthase activity in cell free extracts obtained from gametophytes of Equisetum arvense L. by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry » Phytochem. Anal., 8: 194-197.].
[226] Proteínas que são derivados ou mutantes das proteínas acima descritas que ocorrem naturalmente também são fornecidas. Mutantes e derivados podem reter propriedades biológicas de proteínas de tipo selvagem (por exemplo, de ocorrência natural) ou podem ter propriedades biológicas diferentes das proteínas de tipo selvagem. As mutações incluem substituições de um ou mais aminoácidos, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos, substituições ou truncamentos terminais N- ou extensões, substituições ou truncamentos terminais C- ou extensões, etc. Mutantes e derivados podem ser obtidos usando os métodos de biologia molecular padrão, conforme descrito em detalhes na seção “Ácidos Nucleicos”. Os mutantes são substancialmente idênticos às proteínas do tipo selvagem, isto é, têm pelo menos 40 % de identidade com eles dentro da região selecionada para comparação. Portanto, sequências substancialmente semelhantes incluem aquelas que têm, por exemplo, pelo menos 40 % de identidade, ou pelo menos 50 % de identidade, ou pelo menos 55 % de identidade, ou pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 62 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, por exemplo, pelo menos 80 % de identidade, ou pelo menos 85 % de identidade, ou pelo menos 90 % de identidade (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) dentro da região selecionada para comparação. Em muitas modalidades, os homólogos de interesse têm uma identidade de sequência muito maior, por exemplo, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % (por exemplo, 92 %, 93 %, 94 %) ou superior, por exemplo, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, especialmente para uma sequência de aminoácidos, que fornece regiões funcionais de proteínas.
[227] Derivados também podem ser obtidos usando métodos padrão e incluem a alteração por meio de RNA, modificações químicas, modificações após a tradução e após a transcrição, etc. Por exemplo, os derivados podem ser obtidos por métodos como fosforilação ou glicosilação modificada ou acetilação, ou lipidação, ou por diferentes tipos de segregação na maturação, etc.
[228] Métodos bem conhecidos das pessoas versadas na técnica são usados para pesquisar mutantes funcionais, homólogos e derivados. Por exemplo, a triagem funcional da biblioteca de expressão compreendendo variantes (por exemplo, formas mutantes de proteínas ou proteínas homólogas ou derivados de proteínas). A biblioteca de expressão é obtida por clonagem de ácidos nucleicos que codificam as variantes testadas de proteínas no vetor de expressão e sua entrada em células hospedeiras apropriadas. Os métodos de operação com ácidos nucleicos são descritos em detalhes na seção “Ácidos nucleicos”. De modo a identificar enzimas funcionais desta invenção, um substrato apropriado é adicionado às células que expressam os ácidos nucleicos sendo testados. A formação do produto esperado da reação catalisada pela enzima funcional pode ser detectada por métodos de HPLC usando variantes sintéticas dos produtos da reação esperados como padrões. Por exemplo, a hispidina ou outra pré-luciferina, mostrada na Tabela 2, pode ser usada como substrato para identificar hidroxilases de hispidina funcionais. O produto de reação esperado é a luciferina fúngica. O precursor da pré-luciferina (por exemplo, ácido cafeico) pode ser usado como um substrato para identificar as hispidina-sintases, e o fungo correspondente à pré-luciferina é o produto da reação. Deve-se notar que as células hospedeiras devem expressar 4’- fosfopanteteinil transferase, promovendo a modificação pós-tradução da proteína, para a triagem de hispidina-sintases funcionais.
[229] Oxiluciferina (Tabela 2) é usada como um substrato para pesquisar cafeoilpiruvatos hidrolases funcionais, e o produto de reação testado é um precursor de pré-luciferina - ácido 3-arilacrílico.
[230] Em muitas modalidades desta invenção, a reação bioluminescente pode ser usada para pesquisar enzimas funcionais desta invenção. Neste caso, para efeito de preparação da biblioteca de expressão as células produtoras de luciferase capazes de oxidar luciferina fúngica com emissão luminescente, e enzimas funcionais promovendo a produção de luciferina fúngica a partir de um produto da reação enzimática realizada pela proteína teste.
[231] Assim, as células hospedeiras que produzem luciferase funcional, cujo substrato é a luciferina fúngica, são usadas para a triagem de hispidinas hidroxilases funcionais. Ao adicionar a pré-luciferina às células que compreendem a variante funcional da hispidina hidroxilase, a luciferina fúngica é formada e a luminescência aparece devido à oxidação da luciferina fúngica com a luciferase.
[232] Células hospedeiras que produzem adicionalmente luciferase funcional, cujo substrato é a luciferina fúngica, e a hispidina hidroxilase funcional, são usadas para a triagem de hispidina sintases funcionais. Ao adicionar o precursor da pré-luciferina a tais células, a luciferina fúngica é formada e a luminescência aparece devido à oxidação da luciferina fúngica com a luciferase.
[233] Células hospedeiras que produzem luciferase funcional, cujo substrato é a luciferina fúngica, a hispidina hidroxilase funcional e a hispidina sintase funcional, são usadas para a triagem de cafeoilpiruvato hidrolases funcionais. Ao adicionar oxiluciferina a tais células, a luciferina fúngica é formada e a luminescência aparece devido à oxidação da luciferina fúngica com a luciferase.
[234] Quaisquer luciferases capazes de oxidar luciferina com emissão de luminescência, selecionadas a partir do grupo de 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H- piran-2-onas tendo a fórmula comum , onde R - arila ou heteroarila, pode ser usada para triagem. Exemplos não limitativos de luciferinas são dados na Tabela 1. Exemplos não limitantes de luciferases adequadas são descritos na seção “Aplicação, combinações e métodos de uso” abaixo.
[235] A oxidação da luciferina com luciferase é acompanhada pela emissão de luminescência detectada. A luz emitida durante a oxidação pode ser detectada por métodos padrão (por exemplo, observação visual, observação por meio de dispositivos de visão noturna, espectrofotometria, espectrofluorimetria, uso de registro fotográfico de imagem, uso de equipamento especial para detecção de luminescência e fluorescência, tal como, por exemplo, Sistema de Imageamento In vivo de Espectro IVIS (Perkin Elmer), etc.). A luminescência registada pode ser emitida na faixa de intensidade de um fóton a luminescência facilmente perceptível ao olho, por exemplo, com intensidade de 1 cd e luminescência brilhante com intensidade, por exemplo, 100 cd e mais. A luz emitida na oxidação da 3-hidroxi-hispidina está na faixa de 400 a 700 nm, prevalentemente na faixa de 450 a 650 nm, com emissão máxima em 520-590 nm. A luz emitida na oxidação de outras 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-onas pode ter deslocamento máximo de emissão (Tabela 3). TABELA 3. MÁXIMO DE EMISSÃO PARA UMA SÉRIE DE FUNGOS Substância Máximo de emissão, nm
3-hidróxi hispidina 538 (E)-3,4-di-hidroxi-6-(4-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona 520 (E)-6-(2-(1H-indol-3-il)vinil)-3,4-di-hidroxi-2H- 480 piran-2-ona, (E)-6-(4-(dietilamino)estiril)-3,4-di-hidroxi-2H- 504 piran-2-ona, (E)-3,4-di-hidroxi-6-(2-(2,3,6,7-tetra-hidro-1H,5H- 534 pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il)vinil)-2H-piran-2-ona, (E)-3,4-di-hidroxi-6-(2-(6-hidroxinaftalen-2-il)vinil)- 564 2H-piran-2-ona
[236] Exemplos de triagem funcional usando bioluminescência são descritos na parte experimental abaixo.
[237] A invenção também cobre proteínas de fusão, incluindo a proteína desta invenção. Seu homólogo. mutante, incluindo forma encurtada ou alongada. A proteína da invenção pode ser operativamente fundida com o sinal de localização intracelular (por exemplo, sinal de localização nuclear, sinal de localização em mitocôndrias, ou em peroxissomos, ou em lisossomas, ou em aparelho de Goldgi, ou em outras organelas celulares), peptídeo de sinal que promove o isolamento de proteínas em espaço intercelular, domínio transmembranar ou com qualquer proteína ou polipeptídeo (parceiro de fusão) de interesse. As proteínas de fusão podem incluir reticulação operacional, por exemplo, hispidina hidroxilase e/ou hispidina sintase, e/ou cafeoilpiruvato hidrolase, reivindicada na invenção, com o parceiro de fusão ligado ao terminal C ou N. Exemplos não limitativos de parceiros de fusão podem incluir proteínas desta invenção tendo outra função enzimática, anticorpos ou seus fragmentos de ligação, ligantes ou receptores, luciferases capazes de usar luciferinas de fungos como substratos na reação bioluminescente. Em algumas modalidades, um parceiro de fusão e proteína da invenção são operativamente reticulados via sequência de ligação (ligante peptídico), promovendo o dobramento e funcionamento independente da proteína de fusão. Os métodos de produção de proteínas de fusão são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.
[238] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão incluem hispidina hidroxilase da invenção e luciferase capazes de oxidar a luciferina fúngica com emissão de luminescência, que são operativamente reticuladas por meio de ligante peptídico curto. Tal proteína de fusão pode ser usada para obter bioluminescência in vitro e in vivo na presença de uma pré-luciferina (por exemplo, na presença de hispidina). É óbvio para a pessoa versada na técnica que qualquer hispidina hidroxilase funcional descrita acima pode ser usada com qualquer luciferase funcional para produzir uma proteína de fusão. Exemplos específicos de proteínas de fusão são descritos na Parte Experimental abaixo. Exemplos de luciferases que podem ser usadas na produção de proteínas de fusão são descritos na seção “Aplicação, combinações e métodos de uso” abaixo.
ÁCIDOS NUCLEICOS
[239] Esta invenção fornece ácidos nucleicos que codificam enzimas de biossíntese de luciferina fúngica, mutantes e homólogos destas proteínas, incluindo formas encurtadas ou alongadas.
[240] Ácido nucleico, como aqui usado, é uma molécula de DNA isolada, tal como molécula de DNA genômica ou molécula de cDNA, ou molécula de RNA, tal como molécula de mRNA. Em particular, os ditos ácidos nucleicos são moléculas de cDNA tendo quadro aberto de leitura, que codifica enzima de biossíntese de luciferina da invenção, e capaz, sob condições adequadas, para assegurar a expressão de enzima da invenção.
[241] O termo “cDNA” é para a descrição de ácidos nucleicos, que refletem o arranjo de elementos de sequência localizados em mRNA nativo maduro, onde os elementos de sequência são exons e regiões não codificantes 5’- e 3’-. O mRNA imaturo pode ter exons separados por íntrons intervenientes, que, se presentes, são removidos durante a adição de RNA pós-tradução para formar mRNA maduro com quadro de leitura aberto.
[242] A sequência genômica de interesse pode incluir ácido nucleico presente entre o códon de iniciação e o códon de terminação, conforme determinado nas ditas sequências, incluindo todos os íntrons, que estão normalmente presentes em um cromossomo nativo. A sequência genômica de interesse pode incluir, adicionalmente, regiões 5’- e 3’- não traduzidas no mRNA maduro, bem como sequências regulatórias transcricionais e traducionais específicas, tais como promotores, potencializadores, etc., incluindo flanqueamento de DNA genômico de aproximadamente 1 kbp de tamanho, mas possivelmente ainda mais, no terminal 5’- ou 3’- da região transcrita.
[243] A invenção também cobre ácidos nucleicos, que são homólogos, substancialmente semelhantes, idênticos, derivados ou miméticos de ácidos nucleicos que codificam proteínas desta invenção.
[244] Os ácidos nucleicos reivindicados estão presentes no meio ambiente diferente de seu meio natural, por exemplo, eles estão isolados, presentes em quantidades enriquecidas, ou presentes ou expressos in vitro ou em uma célula, ou em um organismo, diferente de seu ambiente de ocorrência natural.
[245] Ácidos nucleicos específicos de interesse incluem ácidos nucleicos, que codificam a hispidina hidroxilase ou a hispidina sintase, ou cafeoilpiruvato hidrolase descrita na seção “Proteínas” acima. Cada um desses ácidos nucleicos específicos de interesse é divulgado individualmente com mais detalhes. ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM HISPIDINAS HIDROXILASES.
[246] Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos da invenção codificam proteínas capazes de catalisar a reação de transformação de 6-(2-arilvinil)-4- hidroxi-2H-piran-2-ona (pré-luciferina) tendo a fórmula estrutural ,
[247] em 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona (luciferina fúngica), tendo a fórmula estrutural
,
[248] onde R - arila ou heteroarila.
[249] Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos codificam hispidinas hidroxilases, cujas sequências de aminoácidos são caracterizadas pela presença de vários motivos de aminoácidos conservativos (sequências de consenso) mostrados em SEQ ID NO: 29 - 33.
[250] Exemplos específicos de ácidos nucleicos incluem ácidos nucleicos que codificam hispidinas hidroxilases, cujas sequências de aminoácidos são mostradas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28. Exemplos de ácidos nucleicos, que codificam a dita proteínas, são dados em SEQ ID NOs: 1, 3,5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27. Também, mutantes funcionais, homólogos e derivados dos ácidos nucleicos específicos acima mencionados são de interesse.
[251] Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos da invenção codificam proteínas, cujas sequências de aminoácidos são pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %,ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %,ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica às sequências mostradas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, para pelo menos 350 aminoácidos. ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM HISPIDINA-SINTASES
[252] Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos da invenção codificam proteínas capazes de catalisar a reação de transformação de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural
[253] , onde R - arila ou heteroarila em 6-2-arilvinil)-4- hidroxi-2H-piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural
[254] , onde R - arila ou heteroarila.
[255] Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos codificam hispidina- sintases, cujas sequências de aminoácidos são caracterizadas pela presença de vários motivos de aminoácidos conservativos (sequências de consenso) mostrado em SEQ ID NOs: 56 - 63.
[256] Exemplos específicos de ácidos nucleicos incluem ácidos nucleicos que codificam hispidina-sintases da invenção, cujas sequências de aminoácidos são mostradas em SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55. Exemplos de ácidos nucleicos, que codificam as ditas proteínas, são dados em SEQ ID NOs: 34, 36,38,40,42, 44, 46, 48, 50, 52, 54.
[257] Também, mutantes funcionais, homólogos e derivados dos ácidos nucleicos acima mencionados específicos são de interesse.
[258] Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos da invenção codificam proteínas, cujas sequências de aminoácidos são pelo menos 45 %, normalmente pelo menos 50 %, por exemplo, pelo menos 55 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %, ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %,ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica às sequências mostradas em SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53, 55, para toda a cadeia de polipeptídeo de proteína.
ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM CAFEOILPIRUVATOS HIDROLASES
[259] Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos da invenção codificam proteínas capazes de catalisar a reação de transformação de Oxiluciferina com a fórmula estrutural
[260] , onde R é arila ou heteroarila, conversão em ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural
[261] , onde R é selecionado a partir do grupo arila, heteroarila.
[262] Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos codificam cafeoilpiruvatos hidrolases, cujas sequências de aminoácidos são caracterizadas pela presença de vários motivos de aminoácidos conservativos (sequências de consenso) mostrados em SEQ ID NOs: 76 - 78. Exemplos específicos de ácidos nucleicos incluem ácidos nucleicos que codificam cafeoilpiruvatos hidrolases, cujas sequências de aminoácidos são mostradas em SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75. Exemplos de ácidos nucleicos, que codificam as ditas proteínas, são dados em SEQ ID NOs: 64, 66, 68, 70,72, 74.
[263] Também, ácidos nucleicos, que codificam mutantes funcionais, homólogos e derivados das proteínas acima mencionadas, são de interesse.
[264] Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos da invenção codificam proteínas, cujas sequências de aminoácidos são pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %,ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %,ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica às sequências mostradas em SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, para toda a cadeia de polipeptídeo de proteína.
[265] Ácidos nucleicos de interesse (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam homólogos de proteínas caracterizadas pelas sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53,55, 65, 67, 69, 71, 73, 75), podem ser podem ser isolados de quaisquer organismos (fungos, plantas, micro- organismos, animais), em particular, de diferentes tipos de fungos bioluminescentes, por exemplo, fungos do tipo Basidiomycota, predominantemente da classe Basidiomycetes, em particular, ordem Agaricales, por exemplo, de fungos bioluminescentes Neonothopanus nambi, Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, plantas não-cloropianas, etc. como Pteris ensiformis, são de especial interesse como uma fonte de ácidos nucleicos que codificam homólogos de proteínas desta invenção [Yung-Husan Chen et al., «Identification of phenolic antioxidants from Sword Brake fern (Pteris ensiformis Burm.)», Food Chemistry, Volume 105, Edição 1, 2007, páginas 48 a 56], Inonotus xeranticus [In-Kyoung Lee et al., «Hispidin Derivatives from the Mushroom Inonotus xeranticus and their Antioxidant Activity», J. Nat. Prod., 2006, 69 (2), páginas 299 a 301], Phellinus sp. [In-Kyoung Lee et al., «Highly oxygenated and unsaturated metabolites providing a diversity of hispidin class antioxidants in the medicinal mushrooms Inonotus and Phellinus». Bioorganic & Medicinal Chemistry. 15 (10): 3309-14.], Equisetum arvense [Markus Herderich et al., «Establishing styrylpyrone synthase activity in cell free extracts obtained from gametophytes of Equisetum arvense L. by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry» Phytochem. Anal., 8: 194-197.].
[266] Os homólogos são identificados por qualquer um dos vários métodos. O fragmento de cDNA desta invenção pode ser usado como uma sonda de hibridização versus biblioteca de cDNA a partir do organismo alvo, usando condições de baixo rigor. A sonda pode ser um fragmento grande ou um ou iniciador degenerado mais curto. Os ácidos nucleicos, tendo similaridade de sequência, são detectados por hibridização em condições de baixo rigor, por exemplo, a 50 °C e 6×SSC (0,9 М de cloreto de sódio/0,09 М de citrato de sódio) seguido de lavagem a 55×C em 1×SSC (01,15 М de cloreto de sódio/0,015 М de citrato de sódio). A identidade da sequência pode ser determinada por hibridização em condições de alto rigor, por exemplo, a 50 °C ou superior e 0,1×SSC (15 mМ de cloreto de sódio/1,5 mМ de citrato de sódio). Os ácidos nucleicos possuindo a região substancialmente idêntica às sequências apresentadas, por exemplo, variantes alélicas, variantes geneticamente modificadas de ácido nucleico, etc., são ligadas às sequências apresentadas em condições de alto rigor de hibridização. A utilização de sondas, em particular sondas marcadas de sequências de DNA, permite recuperar genes homólogos ou semelhantes.
[267] Os homólogos podem ser identificados por meio de reação em cadeia da polimerase de biblioteca genômica ou de cDNA. Iniciadores oligonucleotídicos, representando os fragmentos de sequências conhecidas de ácidos nucleicos específicos, podem ser utilizados como iniciadores para PCR. Em um aspecto preferível, os iniciadores oligonucleotídicos têm uma estrutura degenerada e correspondem a fragmentos de ácido nucleico que codificam regiões conservativas da sequência de aminoácidos da proteína, por exemplo, as sequências de consenso são mostradas em SEQ ID NOs: 29 - 33, 56 - 63, 76 -
78. As sequências de codificação de comprimento total, então, podem ser detectadas por meio de métodos de RACE 3’- e 5’-, bem conhecidos da técnica anterior.
[268] Os homólogos também podem ser identificados nos resultados do sequenciamento do genoma total de organismos por comparação das sequências de aminoácidos deduzidas com base no sequenciamento e nas sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53,55, 65, 67, 69, 71, 73, 75. Sequência a identidade é determinada com base na sequência de referência. Algoritmos para análise de sequência são conhecidos na técnica, por exemplo, BLAST, descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, páginas 403 a 10 (1990).
Para os propósitos desta invenção, de modo a determinar o nível de identidade e similaridade entre sequências de nucleotídeos e sequências de aminoácidos, pode ser usada uma comparação de sequências de nucleotídeos e de aminoácidos realizada por meio do pacote de software Blast fornecido pelo Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.ni- h.gov/blast) usando alinhamento cortado com parâmetros padrão.
[269] Ácidos nucleicos que são hibridizados com os ácidos acima. Os ácidos nucleicos que são hibridizados com os ácidos nucleicos acima em condições rigorosas, de preferência em condições de rigor elevado (isto é, complementares aos ácidos nucleicos descritos antes) também são fornecidos. Exemplo de hibridização em condições de alta severidade é a hibridização a 50 °C ou superior e 0,1×SSC (15 mМ de cloreto de sódio/1,5 mМ de citrato de sódio). Outro exemplo de hibridização em condições de alto rigor é a incubação durante a noite a 42 °C em 50 % de formamida, 5×SSC (150 mМ de NaCl, 15 mМ de citrato trissódico), 50 mM de fosfato de sódio (рН 7,6), 5 x solução de Denhardt, 10 % de sulfato dextrano e 20 μg/ml de DNA desnaturado de espermatozoides de salmão, com lavagem preliminar em 0,1×SSC a aproximadamente 65 °C. Outras condições de alto rigor de hibridação são conhecidas na técnica e também podem ser usadas para a identificação de ácidos nucleicos da invenção.
[270] Variantes de codificação de ácidos nucleicos, mutantes ou derivados de proteínas da invenção também são fornecidos. Os mutantes ou derivados podem ser obtidos a partir do molde de ácido nucleico, selecionado a partir dos ácidos nucleicos descritos acima, por modificação, deleção ou adição de um ou mais nucleotídeos na sequência do molde ou sua combinação para obter uma variante do molde de ácido nucleico. Modificações, adições ou deleções podem ser realizadas por qualquer método conhecido na técnica (consultar, por exemplo, Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; e Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199: 537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, páginas 15.3 a 15.108), incluindo PCR propenso a erros, embaralhamento , mutagênese dirigida por oligonucleotídeo, PCR de montagem, mutagênese por PCR emparelhada, mutagênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese de conjunto recursivo, mutagênese de conjunto exponencial, mutagênese de conjunto exponencial, mutagênese dirigida por oligonucleotídeo, mutagênese aleatória, remontagem genética, mutagênese de saturação de sítio de gene (GSSM), remontagem de ligação sintética (SLR) ou suas combinações. Modificações, adições ou exclusões também podem ser realizadas por método, incluindo recombinação, recombinação de sequência recursiva, mutagênese de DNA modificada por fosforotioato, mutagênese de modelo de uracila, mutagênese de salto duplo, mutagênese de desacoplamento de redução de ponto, mutagênese de cepa deficiente de recuperação, mutagênese química, mutagênese de radiação, deletada mutagênese, mutagênese seletiva de restrição, mutagênese de restrição com purificação, síntese artificial de genes, mutagênese múltipla, criação de ácidos nucleicos múltiplos quiméricos e suas combinações. Os ácidos nucleicos que codificam variantes encurtadas e alongadas das ditas luciferases também estão no âmbito desta invenção. Tal como aqui usado, estas variantes de proteínas compreendem sequências de aminoácidos com C-, N- modificado ou ambos os terminais da cadeia polipeptídica.
[271] Em modalidades preferidas, os homólogos e mutantes em discussão são enzimas funcionais capazes de realizar a biossíntese de luciferina fúngica, por exemplo, luciferina de fungos. Homólogos e mutantes de interesse podem ter propriedades alteradas, como taxa de maturação em uma célula hospedeira, agregabilidade ou dimerizabilidade, período de meia-vida ou outras propriedades bioquímicas, incluindo constante de ligação ao substrato, estabilidade térmica, estabilidade de pH, atividade, temperatura ótima, atividade pH ótimo, constante de Michaelis-Menten, especificidade do substrato, faixa de problema lateral. Em algumas modalidades, homólogos e mutantes têm as mesmas propriedades que as proteínas reivindicadas.
[272] Ácidos nucleicos, que codificam homólogos funcionais e mutantes desta invenção, podem ser identificados durante os testes funcionais, por exemplo, na triagem funcional da biblioteca de expressão, descrita na seção “Proteínas”.
[273] Além disso, variantes degeneradas de ácidos nucleicos, que codificam proteínas desta invenção, também são fornecidas. Variantes degeneradas de ácidos nucleicos incluem substituições de códons de ácido nucleico por outros códons que codificam os mesmos aminoácidos. Em particular, as variantes degeneradas de ácidos nucleicos são criadas para aumentar a expressão em uma célula hospedeira. Nesta modalidade, códons de ácido nucleico, que não são preferíveis ou são menos preferíveis em genes de células hospedeiras, são substituídos por códons que são excessivamente apresentados nas sequências de codificação nos genes de células hospedeiras, onde os ditos códons substituídos codificam o mesmo aminoácido. Em particular, as versões humanizadas de ácidos nucleicos desta invenção são de interesse. Tal como aqui usado, o termo “humanizado” refere-se às substituições feitas na sequência de ácido nucleico para otimizar códons para a expressão de proteínas em células de mamíferos (Yang et al., Nucleic Acids Research (1996) 24: 4592-4593). Consultar também Patente US Nº 5795737, que descreve a humanização de proteínas, cuja divulgação é aqui incorporada por referência. Variantes de ácidos nucleicos otimizados para expressão em células vegetais são de particular interesse. Exemplos de tais ácidos nucleicos, proteínas codificantes desta invenção, são dados em SEQ ID NOs: 103, 113 e 114.
[274] Os ácidos nucleicos reivindicados podem ser isolados e obtidos substancialmente na forma purificada. Principalmente, a forma purificada significa que os ácidos nucleicos são pelo menos aproximadamente 50 % puros, normalmente pelo menos aproximadamente 90 % puros e normalmente são “recombinantes”, isto é, floxed por um ou mais nucleotídeos, aos quais normalmente não está ligado em um cromossomo naturalmente ocorrendo em seu organismo hospedeiro natural.
[275] Os ácidos nucleicos reivindicados podem ser sintetizados artificialmente. Os métodos para a produção de ácidos nucleicos são bem conhecidos da técnica anterior. Por exemplo, a acessibilidade à informação sobre a sequência de aminoácidos ou informação sobre a sequência de nucleotídeo permite a produção de moléculas isoladas de ácidos nucleicos desta invenção por meio da síntese de oligonucleotídeos. Em caso de disponibilidade de informações sobre a sequência de aminoácidos, poderiam ser sintetizados vários ácidos nucleicos diferentes entre si devido à degenerescência do código genético. Os métodos para a seleção de variantes de códons para o hospedeiro necessário são bem conhecidos na técnica.
[276] Os oligonucleotídeos sintéticos podem ser produzidos pelo método da fosforamidita e os construtos obtidos podem ser purificados por métodos bem conhecidos na técnica como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou outros métodos conforme descrito, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2ª Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, e de acordo com a instrução descrita, por exemplo, no Departamento de HHS dos Estados Unidos, Diretrizes do Instituto Nacional de Saúde (NI-H) para Pesquisa de DNA Recombinante. As moléculas de DNA de duas cadeias longas desta invenção podem ser sintetizadas como se segue: vários fragmentos menores, que contêm terminais adequados capazes de coesão com o fragmento adjacente, podem ser sintetizados com a complementaridade necessária. Fragmentos adjacentes podem ser reticulados por meio de DNA ligase, métodos baseados em recombinação ou método baseado em PCR.
[277] Ácidos nucleicos que codificam proteínas de fusão, incluindo proteínas desta invenção, também são fornecidos. Exemplos de tais proteínas são dados na seção “Proteínas” acima. Ácidos nucleicos que codificam proteínas de fusão podem ser sintetizados artificialmente como descrito acima.
[278] Cassetes ou sistemas de expressão, usados inter alia para obter as proteínas reivindicadas (isto é, hispidinas hidroxilases, hispidina sintases e cafeoilpiruvato hidrolases) ou proteínas de fusão em sua base ou para a replicação das moléculas de ácido nucleico reivindicadas, também são fornecidos. O cassete de expressão pode existir como elemento extracromossômico ou pode ser incluída no genoma da célula resultante da introdução do dito cassete de expressão na célula. Ao introduzir o cassete de expressão na célula, é formado um produto de proteína codificado pelo ácido nucleico da invenção; neste caso, diz-se que a proteína é “produzida” ou “expressa” pela célula. Qualquer sistema de expressão, incluindo, por exemplo, sistemas bacterianos, leveduras, plantas, insetos, anfíbios ou células de mamíferos, é aplicável. O ácido nucleico alvo no cassete de expressão está operacionalmente ligado a sequências reguladoras, que podem incluir promotores, potenciadores, sequências terminadoras, operadores, repressores e indutores. Geralmente, o cassete de expressão compreende pelo menos (a) região de iniciação da transcrição, funcional na célula hospedeira; (b) ácido nucleico da invenção e (c) região de terminação da transcrição, funcional na célula hospedeira. Os métodos para obter cassetes de expressão ou sistemas capazes de expressar o produto desejado são conhecidos das pessoas versadas na técnica.
[279] Vetor e outras estruturas de ácido nucleico, compreendendo os ácidos nucleicos reivindicados, também são fornecidos. Os vetores adequados incluem vetores virais e não virais, plasmídeos, cosmídeos, fagos, etc., e são usados para clonagem, amplificação, expressão, transferência, etc. da sequência de ácido nucleico desta invenção para um hospedeiro adequado. A seleção do vetor adequado é óbvia para as pessoas versadas na técnica. O ácido nucleico de comprimento total ou sua parte é geralmente introduzido no vetor pela ligação da DNA-ligase ao sítio dividido por enzimas de restrição no vetor. Alternativamente, a sequência de nucleotídeos desejada pode ser inserida por recombinação homóloga in vivo, normalmente, ligando regiões homólogas ao vetor nos flancos da sequência de nucleotídeos desejada. As regiões homólogas são adicionadas por ligação de oligonucleotídeo ou por reação em cadeia da polimerase, usando iniciadores, incluindo, por exemplo, como regiões homólogas, como parte da sequência de nucleotídeos desejada. O vetor, via de regra, possui origem de replicação, promovendo sua reprodução nas células do hospedeiro a partir de sua introdução na célula como elemento extracromossômico. O vetor também pode compreender elementos reguladores que promovem a expressão de ácido nucleico na célula hospedeira e obtêm proteína funcional recombinante. No vetor de expressão, o dito ácido nucleico está funcionalmente ligado a uma sequência regulatória, que pode incluir promotores, intensificadores, terminadores, operadores, repressores, silenciadores, isoladores e indutores. Para o propósito de expressão de proteínas funcionais ou suas formas encurtadas, os ácidos nucleicos codificantes são reticulados operacionalmente aos ácidos nucleicos compreendendo pelo menos sequências regulatórias e sítio de início da transcrição. Além disso, estes ácidos nucleicos podem compreender sequências que codificam o marcador de histidina (marcador 6 His), peptídeo sinal ou domínios de proteína funcionais. Em muitas modalidades, os vetores promovem a integração do ácido nucleico, operativamente ligado com elementos reguladores, no genoma da célula hospedeira. Um vetor pode compreender cassete de expressão para um marcador selecionável, como proteína fluorescente (por exemplo, gfp), gene de resistência a antibióticos (por exemplo, ampicilina ou canamicina, ou neomicina, ou higromicina, etc. gene de resistência), genes que condicionam a resistência a herbicidas, como genes que condicionam a resistência a herbicidas de fosfinotricina e sulfonamida, ou outro marcador selecionável conhecido da técnica anterior.
[280] Um vetor pode compreender cassetes de expressão adicionais, incluindo ácidos nucleicos que codificam 4’-fosfopanteteinil transferase, proteínas de síntese de ácido 3-arilacrílico (por exemplo, descrito na seção “Aplicação, combinações e métodos de uso”), luciferases, etc.
[281] Os sistemas de expressão acima podem ser usados em hospedeiros procarióticos ou eucarióticos. Para obter proteína, podem ser usadas células hospedeiras como E. coli, В. subtilis, S. cerevisiae, células de inseto ou células de organismos superiores, que não são células embrionárias humanas, como levedura, plantas (por exemplo, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana,
Physcomitrella patens), vertebrata, por exemplo, Células COS 7, НEК 293, CНO, oócitos Xenopus, etc.
[282] As linhas celulares, que produzem continuamente as proteínas da invenção, podem ser selecionadas por métodos conhecidos na técnica (por exemplo, co-transfecção com marcador selecionável, como dhfr, gpt, genes de resistência a antibióticos (ampicilina ou canamicina, ou neomicina, ou higromicina, etc.), que permite identificar e isolar células transfectadas, que compreendem um gene incluído no genoma ou incorporado no elemento extracromossômico.
[283] Se qualquer uma das células hospedeiras acima mencionadas ou outras células hospedeiras ou organismos adequados para replicação e/ou expressão de ácidos nucleicos da invenção forem usados, o ácido nucleico replicado obtido, proteína expressa ou polipeptídeo estão dentro do escopo da invenção como um produto da célula ou organismo hospedeiro. Um produto pode ser isolado por um método adequado conhecido na técnica.
[284] Em muitas modalidades desta invenção, a célula é co-transfectada com vários cassetes de expressão compreendendo ácidos nucleicos da invenção que codificam diferentes enzimas da biossíntese de luciferina fúngica. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreendendo luciferase que codifica o ácido nucleico, capaz de oxidar a luciferina fúngica com emissão de luminescência, é adicionalmente introduzido na célula. Em alguns casos, os cassetes de expressão são combinados em um vetor, que é usado para a transformação celular. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam 4’-fosfopantetoinil transferase e/ou proteínas de síntese de ácido 3- arilacrílico são adicionalmente introduzidos na célula.
[285] Fragmentos curtos de DNA dos ácidos nucleicos reivindicados, que são usados como iniciadores de PCR, amplificações de círculo rolante, sondas de triagem de hibridização, etc. também são fornecidos. Fragmentos de DNA longos são usados para obter polipeptídeos codificados, como descrito acima. No entanto, para reações de amplificação geométrica, como PCR, é utilizado um par de fragmentos curtos de DNA, isto é, iniciadores. A sequência exata do iniciador não é crítica para a invenção, no entanto, para a maioria das aplicações, os iniciadores serão hibridizados com a sequência reivindicada em condições rigorosas, como conhecido na técnica. É preferível selecionar um par de iniciadores, que dão um produto de amplificação de pelo menos aproximadamente 50 nucleotídeos, preferencialmente de pelo menos aproximadamente 100 nucleotídeos, e podem se estender para toda a sequência de ácido nucleico. Algoritmos de seleção de sequências de iniciador são normalmente conhecidos e estão disponíveis em pacotes de software comerciais. Os iniciadores de amplificação são hibridizados com cadeias de DNA complementares e semearão reações de contador de amplificação.
[286] As moléculas de ácido nucleico desta invenção também podem ser usadas para determinar a expressão gênica em espécime biológico. O método em que as células são examinadas quanto à presença de sequências de nucleotídeos específicas, como DNA ou RNA genômico, é bem conhecido na técnica. Em resumo, o DNA ou mRNA é isolado a partir de um espécime de célula. O mRNA pode ser amplificado por meio de RT-PCR, usando transcriptase reversa para formar a cadeia de DNA complementar seguida de amplificação por meio de reação em cadeia da polimerase, usando iniciadores específicos para as sequências de DNA reivindicadas. Alternativamente, a amostra de mRNA é isolada por meio de eletroforese em gel, transferida para um portador adequado, por exemplo, nitrocelulose, nilona, etc., e então é testado por um fragmento do DNA reivindicado como uma sonda. Também poderiam ser usados outros métodos, tais como análises de ligação de oligonucleotídeos, hibridização in situ e hibridização por sondas de DNA, imobilizadas em um arranjo rígido. A detecção de mRNA que hibridiza com a sequência reivindicada indica a expressão do gene na amostra.
ORGANISMOS TRANSGÊNICOS
[287] Organismos transgênicos, células transgênicas e linhas de células transgênicas que expressam ácidos nucleicos desta invenção também são fornecidos. As células transgênicas desta invenção incluem um ou vários ácidos nucleicos sob exame nesta invenção, que estão presentes como transgene. Para os propósitos desta invenção, pode ser usada qualquer célula hospedeira adequada, incluindo células procarióticas (por exemplo, Escherichia coli, Streptomyces sp., Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, etc.) ou células hospedeiras eucarióticas, que não são células embrionárias humanas. Os organismos transgênicos desta invenção podem ser organismos procarióticos ou eucarióticos, incluindo bactérias, cianobactérias, fungos, plantas e animais, onde uma ou mais células do organismo compreendendo ácido nucleico heterólogo da invenção são introduzidos incorporando-o devido à manipulação humana, por exemplo, de acordo com técnicas transgênicas conhecidas na técnica.
[288] Em uma modalidade desta invenção, o organismo transgênico pode ser um organismo procariótico. Os métodos para transformação de células hospedeiras procarióticas são bem conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press e Ausubel et al., Current Protocolos em Biologia Molecular (1995) Jo-hn Wiley & Sons, Inc).
[289] Em outra modalidade desta invenção, o dito organismo transgênico pode ser um fungo, por exemplo, levedura. As leveduras são amplamente usadas como um portador para a expressão de genes heterólogos (consultar, por exemplo, Goodey et al., Yeast biotechnology, DR Berry et al., Eds, (1987) Allen e Unwin, Londres, páginas 401 a 429, e Kong et al., Molecular and Cell Biology of Yeasts, EF Walton e GT Yarronton, eds, Blackie, Glasgow (1989) páginas 107 a 133). Existem vários vetores de levedura disponíveis, incluindo vetores de integração, que requerem recombinação com o genoma do hospedeiro para sua manutenção, e também vetores de plasmídeo de replicação autônoma.
[290] O outro organismo hospedeiro é um organismo animal. Animais transgênicos podem ser obtidos usando técnicas transgênicas conhecidas na técnica e descritas em manuais padrão (tais como: Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, 2ª edição (2003) São Diego: Academic
Press; Gersenstein e Vinterstein, Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual, 3ª ed, (2002) Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory; Blau et al., Laboratory Animal Medicine, 2ª Ed., (2002) Fox JG, Anderson LC, Loew FM, Quimby FW (Eds), American Medical Association, American Psychological Association; Gene Targeting: A Ptactical Approach por Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2ª edição (2000)). Por exemplo, os animais transgênicos podem ser obtidos por recombinação homóloga dentro de uma estrutura da qual um locus endógeno é alterado. Alternativamente, a estrutura do ácido nucleico é integrada em um genoma de modo aleatório. Os vetores para integração estável incluem plasmídeos, retrovírus e outros vírus animais, YAC, etc.
[291] O ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula direta ou indiretamente devido à introdução no precursor da célula por meio de manipulação genética cautelosa, como microinjeção, ou por infecção de vírus recombinante ou usando vetor de vírus recombinante, transfecção, transformação, entrega de pistola genética ou transconjugação. As técnicas de transferência de moléculas de ácido nucleico (por exemplo, DNA) para tais organismos são bem conhecidas e descritas em manuais padrão, como Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª Ed., (2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).
[292] O termo “manipulação genética” não inclui cruzamento clássico ou fertilização in vitro, mas refere-se à introdução de molécula de ácido nucleico recombinante. A dita molécula de ácido nucleico pode ser integrada em um cromossomo ou pode ser DNA de replicação extracromossômica.
[293] Estruturas de DNA para recombinação homóloga incluem pelo menos uma parte do ácido nucleico da invenção, onde o ácido nucleico da invenção está operacionalmente ligado a regiões de homologia, para o sítio alvo. Para integração aleatória, não é necessário incluir regiões de homologia em estruturas de DNA para facilitar a recombinação. Marcadores de seleção positivos e negativos também podem ser incluídos. Os métodos para obter as células compreendendo modificações do gene alvo por recombinação homóloga são conhecidos na técnica. Diferentes técnicas de transfecção de células de mamíferos são descritas, por exemplo, no artigo Keown et al., Meth. Enzymol. (1990) 185: 527-537).
[294] No caso de células-tronco embrionárias (ES), poderia ser usada a linha de células ES, ou as células embrionárias poderiam ser obtidas frescas a partir de um organismo hospedeiro, como um camundongo, rato, porquinho da índia, etc. Essas células são cultivadas em uma camada protetora de fibroblasto correspondente ou são cultivados na presença de fator inibidor de leucemia (LIF). ES transformadas ou células embrionárias podem ser usadas para a criação de animais transgênicos usando a técnica relevante conhecida na técnica.
[295] Os animais transgênicos podem ser quaisquer animais diferentes de um ser humano, incluindo mamíferos, diferentes de um ser humano (por exemplo, camundongo ou rato), ave ou anfíbio, etc., e são usados em testes funcionais, na triagem de drogas, etc.
[296] As plantas transgênicas também podem ser obtidas. Os métodos para a obtenção de células vegetais transgênicas são descritos nas patentes nº US 5767367, US5750870, US5739409, US5689049, US5689045, US5674731, US5656466, US5633155, US5629470, US5595896, US5576198, US5538879 e US5484956, cujas descrições são referenciadas nesta invenção. Os métodos para a obtenção de plantas transgênicas são resumidos nas seguintes revisões: Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea e Leegood, Jo-hn Wiley & Sons (1993) páginas 275 a 295 e Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey e Barz) (2002) 719 p.
[297] Para a obtenção de organismos hospedeiros transgênicos, podem ser usados, por exemplo, explantes embriogênicos compreendendo células somáticas. Após a colheita das células ou tecidos, o DNA exógeno de interesse é introduzido nas células vegetais, e existem muitas técnicas diferentes disponíveis para essa introdução. A disponibilidade de protoplastos isolados permite a introdução usando protocolos de transferência de genes mediados por DNA, incluindo incubação de protoplastos com DNA desproteinizado, como plasmídeo, incluindo sequência de codificação exógena de interesse, na presença de cátions multivalentes (por exemplo, PEG ou poli-L-ornitina) ; ou de acordo com o método de eletroporação de protoplastos na presença de DNA nu, incluindo a sequência exógena de interesse. Em seguida, há a seleção dos protoplastos, que conseguiram a captação do DNA exógeno, cultivando-os até a formação do calo e, finalmente, a obtenção das plantas transgênicas pelo contato dos fatores de realce, como auxinas e citocininas, tomadas em quantidades e proporções relevantes.
[298] As plantas podem ser obtidas por outros métodos adequados, como o método baseado em “pistola genética” ou transformação mediada por Agrobacterium, conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.
ANTICORPOS
[299] O termo “anticorpo” aqui se refere a um polipeptídeo ou um grupo de polipeptídeos, incluindo pelo menos um sítio ativo de anticorpo (sítio de ligação ao antígeno). O termo “sítio de ligação ao antígeno” refere-se a uma estrutura espacial, cujos parâmetros de superfície e distribuição de carga são complementares ao epítopo do antígeno: ele promove a ligação do anticorpo com o antígeno relevante. O termo “anticorpo” abrange, por exemplo, anticorpos de animais vertebrados, anticorpos quiméricos, anticorpos híbridos, anticorpos humanizados, anticorpos modificados, anticorpos monovalentes, fragmentos Fab e anticorpos de domínio único.
[300] Anticorpos específicos para proteínas desta invenção são aplicáveis em cromatografia de afinidade, triagem imunológica, na detecção e identificação de proteínas da invenção (hispidinas hidroxilases, hispidina sintases e cafeoilpiruvato hidrolases). Os anticorpos de interesse são ligados a polipeptídeos de antígeno ou proteínas, ou fragmentos de proteínas, que são descritos na seção “Proteína”. Os anticorpos da invenção podem ser imobilizados em um portador e usados em triagem imunológica ou coluna cromatográfica de afinidade para detectar e/ou separar polipeptídeos, proteínas ou fragmentos de proteínas, ou células incluindo tais polipeptídeos, proteínas ou fragmentos de proteínas. Alternativamente, tais polipeptídeos, proteínas ou fragmentos de proteínas podem ser imobilizados de forma a detectar anticorpos capazes de se ligar a eles especificamente.
[301] Anticorpos específicos para proteínas desta invenção, tanto policlonais quanto monoclonais, podem ser obtidos usando métodos padrão. Geralmente, em primeiro lugar, uma proteína é usada para imunizar mamíferos adequados, de preferência um camundongo, rato, coelho ou cabra. Coelhos e cabras são objetos preferidos para a obtenção de soros policlonais devido à obtenção de considerável volume de soro sanguíneo, e também à disponibilidade de marcados anticorpos anti-coelho e anti-cabra. Normalmente, a imunização é realizada misturando ou emulsionando a proteína específica em soro fisiológico, de preferência com um adjuvante, tal como o adjuvante de Freund, seguido pela introdução da mistura obtida ou emulsão parenteralmente (normalmente, por injeção hipodérmica ou intramuscular). Normalmente, as doses suficientes são 50 a 200 μg por uma injeção.
[302] Em diferentes modalidades da invenção, as proteínas recombinantes ou naturais são usadas para imunização na forma nativa ou desnaturada. Fragmentos de proteínas ou polipeptídeos sintéticos, compreendendo parte da sequência de aminoácidos da proteína da invenção, também podem ser usados para imunização.
[303] A imunização é normalmente reforçada em 2-6 semanas por uma ou várias injeções de proteína adicional em solução salina fisiológica, de preferência com adjuvante incompleto de Freund. Alternativamente, os anticorpos também podem ser obtidos por imunização in vitro usando métodos conhecidos na técnica, que são equivalentes à imunização in vitro na perspectiva dos propósitos desta invenção. Os antissoros policlonais são obtidos por amostragem de sangue de animais imunizados em vidro ou vaso de plástico seguido de incubação de sangue a 25 °C em 1 hora e depois por incubação a 4 °C em 2 a
18 horas. O soro é extraído por centrifugação (por exemplo, a 1000 g em 10 minutos). 20 a 50 ml de sangue podem ser obtidos a partir de coelhos de cada vez.
[304] Os anticorpos monoclonais são obtidos usando a técnica padrão de Ko- hler-Milstein (Ko-hler & Milstein, 1975, Nature, 256, 495-496) ou suas modificações. Normalmente, um camundongo ou rato é imunizado de acordo com as informações acima. No entanto, ao contrário da coleta de sangue de animais para obtenção de soro, essa técnica envolve esplenectomia (e, o que não é necessário, extração de alguns linfonodos grandes) e maceração de tecido para separar células individuais. Se desejado, as células do baço podem ser rastreadas (após extração de células aderentes não especificamente) por aplicação de suspensão de células em uma placa ou em um poço de placa separado revestido por antígeno-proteína. Os linfócitos B, expressando imunoglobulina ligada à membrana específica para o antígeno testado, são ligados à placa de forma que não sejam lavados com resíduo de suspensão. Em seguida, ocorre a fusão dos linfócitos B resultantes ou todos os esplenócitos macerados com células de mieloma, resultando na formação de hibridomas: então, eles são incubados em um meio seletivo (por exemplo, em meio HAT, compreendendo hipoxantina, aminopterina e timidina). Os hibridomas resultantes são semeados em incubação limitante e testados quanto à resposta de anticorpos, que são especificamente ligados ao antígeno usado para imunização (e que não estão ligados a agentes estranhos). Em seguida, os hibridomas que secretam anticorpos monoclonais (mAb) selecionados são incubados in vitro (por exemplo, em fermentadores na forma de um feixe de fibra oca ou em vasos de vidro para culturas de tecidos) ou in vivo (em fluido ascítico em camundongos).
[305] Os anticorpos (tanto policlonais quanto monoclonais) podem ser marcados usando métodos padrão. Os marcadores adequados são fluoróforos, cromóforos, radionuclídeos (em particular, 32P e 125I), reagentes densos em elétrons, enzimas e ligantes, para os quais são conhecidos parceiros de ligação específicos). As enzimas são normalmente detectadas por sua atividade catalítica. Por exemplo, a peroxidase de rábano é geralmente detectada por sua capacidade de converter 3,3’, 5,5’-tetrametilbenzidina (ТМВ) em pigmento azul, avaliado quantitativamente em espectrofotômetro. O termo “parceiro de ligação específica” refere-se a uma proteína capaz de se ligar à molécula-ligante em alto nível de especificidade, como por exemplo, no caso de antígeno e anticorpo monoclonal específico para ele. Os outros exemplos de parceiros de ligação específicos são biotina e avidina (ou estreptavidina), imunoglobulina-G e proteína-A, e também múltiplos pares de receptores e seus ligantes, conhecidos na técnica. Outras variantes e capacidades são óbvias para as pessoas versadas na técnica e são consideradas equivalentes no âmbito desta invenção.
[306] Antígenos, imunógenos, polipeptídeos, proteínas ou fragmentos de proteínas desta invenção causam a formação de parceiros de anticorpos de ligação específicos. Os ditos antígenos, imunógenos, polipeptídeos, proteínas ou fragmentos de proteínas desta invenção incluem composições imunogênicas desta invenção. Tais composições imunogênicas podem adicionalmente compreender ou incluir adjuvantes, portadores ou outras composições, que estimulam ou aumentam, ou estabilizam antígenos, polipeptídeos, proteínas ou fragmentos de proteínas desta invenção. Esses adjuvantes e portadores são óbvios para as pessoas versadas na técnica. APLICAÇÃO, COMBINAÇÕES E MÉTODOS DE USO
[307] Esta invenção fornece a aplicação de proteína de biossíntese de luciferinas fúngicas como enzimas que catalisam as reações (1) de síntese de luciferina (isto é, 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona (luciferina fúngica), tendo a fórmula estrutural
[308] , onde R - arila ou heteroarila, a partir de pré- luciferina (isto é, 6-2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona), tendo a fórmula estrutural
[309] ; ou síntese de pré-luciferina de ácido 3-arilacrílico (precursor de pré-luciferina) com a fórmula estrutural
[310] , onde R é selecionado a partir do grupo arila ou heteroarila; ou síntese de ácido 3-arilacrílico a partir do ácido 6-aril-2-hidroxi-4- oxo-hexa-2,5-dieno (Oxiluciferina) com a fórmula estrutural .
[311] As proteínas da biossíntese de luciferina fúngica são aplicadas em muitas modalidades desta invenção, e seus exemplos não limitantes são dados neste capítulo abaixo.
[312] As proteínas da biossíntese de luciferina fúngica, cuja aplicação é assegurada por esta invenção, podem ser obtidas a partir de diferentes fontes naturais ou por tecnologias recombinantes. Por exemplo, proteínas de tipo selvagem podem ser isoladas a partir de fungos bioluminescentes, por exemplo, fungos do tipo Basidiomycota, predominantemente da classe Basidiomycetes, em particular da ordem Agaricales. Por exemplo, as proteínas de tipo selvagem podem ser isoladas a partir de fungos bioluminescentes Neonothopanus nambi, Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos, etc. também pode ser obtido por expressão de ácido nucleico recombinante, sequência de proteína codificadora no respectivo hospedeiro ou em sistema de expressão livre de células.
[313] Em algumas modalidades, as proteínas são aplicadas dentro das células hospedeiras, onde são expressas e realizam transformações cíclicas de luciferina fúngica. Em outras modalidades, são usadas proteínas recombinantes ou naturais isoladas ou extratos compreendendo proteínas do pedido.
[314] As proteínas da biossíntese de luciferina fúngica são ativas em condições fisiológicas.
[315] Em algumas proteínas da modalidade, as hispidinas hidroxilases são aplicadas in vitro e in vivo para obter luciferina, que é oxidada por fungos bioluminescentes luciferases, seus homólogos e mutantes com emissão de luminescência. Portanto, esta invenção fornecida para aplicação de hispidinas hidroxilases desta invenção para catalisar a transformação de 6-(2-arilvinil)-4- hidroxi-2H-piran-2-ona (pré-luciferina) tendo a fórmula estrutural ,
[316] em 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona (luciferina fúngica), tendo a fórmula estrutural ,
[317] onde R - arila ou heteroarila.
[318] O método para obter luciferina fúngica a partir de pré-luciferina inclui a combinação de pelo menos uma molécula de hispidina hidroxilase com pelo menos uma molécula de 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, com pelo menos uma molécula de NAD(P)H e com pelo menos uma molécula de oxigênio molecular (O2). A reação é realizada em condições fisiológicas in vitro e in vivo na temperatura de 20 a 42 °C, e também a reação pode ser realizada em células,
tecidos e organismos hospedeiros que expressam hispidina hidroxilase. Em modalidades preferidas, as ditas células, tecidos e organismos compreendem uma quantidade suficiente de NAD(P)H e oxigênio molecular para realizar a reação. 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona exogenamente distribuída ou 6- (2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona endógena produzida em células, tecidos e organismos poderia ser usado na reação.
[319] Em modalidades preferidas, as hispidinas hidroxilases desta invenção sintetizam 3-hidroxi-hispidina a partir da hispidina. Em modalidades preferidas, eles sintetizam pelo menos um análogo funcional de 3-hidroxi-hispidina a partir da pré-luciferina correspondente mostrada na Tabela 2. Em algumas modalidades, as hispidinas hidroxilases desta invenção sintetizam 6-(2-arilvinil)- 3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona de qualquer 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona correspondente, tendo a fórmula estrutural , onde R - arila ou heteroarila.
[320] A 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona obtida é aplicada para sistemas de emissão de luminescência in vitro e in vivo compreendendo luciferase funcional, identificando a luciferina fúngica como um substrato.
[321] Para esta invenção, as proteínas, cujas sequências de aminoácidos são mostradas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, e também seus mutantes, homólogos e derivados são aplicáveis como hispidina- hidroxilases. Por exemplo, podem ser usadas hispidinas hidroxilases funcionais 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %, ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica para pelo menos 350 aminoácidos. Por exemplo, eles podem ser pelo menos 60 %, ou pelo menos
65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %, ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica para toda a cadeia de polipeptídeo de proteína.
[322] Em modalidades preferidas para os propósitos desta invenção, as proteínas, cujas sequências de aminoácidos são caracterizadas pela presença de vários motivos de aminoácidos conservadores (sequências de consenso) mostrados em SEQ ID NOs: 29 - 33, são aplicáveis como hispidina-hidroxilases. Os sítios de consenso dentro das sequências de aminoácidos da hispidina hidroxilase são operativamente ligados por meio de inserções de aminoácidos com inserções inferiores (Figura 1).
[323] Em algumas modalidades, as proteínas da hispidina-sintase são aplicadas in vitro e in vivo para produzir luciferina fúngica a partir de seu precursor, isto é, aplicadas para catalisar a transformação de ácidos 3- arilacrílicos com a fórmula estrutural
[324] , onde R é selecionado a partir do grupo arila, heteroarila, em 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural
[325] , onde R - arila ou heteroarila.
[326] O método para obter pré-luciferina inclui a combinação de pelo menos uma molécula de hispidina-sintase com pelo menos uma molécula de ácido 3- arilacrílico, com pelo menos uma molécula de coenzima A, pelo menos uma molécula de AMP e pelo menos duas moléculas de malonil-CoA.
[327] A reação é realizada em condições fisiológicas na temperatura de 20 a 42 °C, e também a reação pode ser realizada em células, tecidos e organismos hospedeiros que expressam hispidina-sintase. Em modalidades preferidas, as ditas células, tecidos e organismos compreendem quantidade suficiente de coenzima A, malonil-CoA e AMP para realizar a reação.
[328] O ácido 3-arilacrílico ou ácido 3-arilacrílico administrado exogenamente produzido em células, tecidos e organismos podem ser usados na reação.
[329] Por exemplo, as hispidina-sintases desta invenção podem ser usadas para a produção de hispidina a partir do ácido cafeico. Em modalidades preferidas, eles sintetizam o análogo funcional da hispidina (6-(2-arilvinil)-4- hidroxi-2H-piran-2-ona) de ácido 3-arilacrílico mostrado na Tabela 2.
[330] A 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona obtida é aplicada para a produção de luciferina fúngica na presença de hispidina hidroxilase desta invenção. A hispidina e seus análogos funcionais também são aplicados na área médica, por apresentarem propriedades antioxidantes e antitumorais; há algumas evidências de que a hispidina é capaz de prevenir a obesidade [Be Tu et al., Drug Discov Ther. Junho de 2015; 9 (3): 197-204; Nguyen et al., Drug Discov Ther. Dezembro de 2014; 8 (6): 238-44; Yousfi et al., Phytother Res. Setembro de 2009; 23 (9): 1237-42].
[331] Para o propósito desta invenção as proteínas, cujas sequências de aminoácidos são mostradas nas SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53, 55, e também seus mutantes, homólogos e derivados são aplicáveis como hispidina-sintases. Por exemplo, poderiam ser usadas hispidina-sintases funcionais com sequência de aminoácidos idêntica à sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53, 55, pelo menos 40 %, prevalentemente pelo menos 45 %, normalmente pelo menos 50 %, por exemplo, pelo menos 55 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %, ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica.
[332] Em modalidades preferidas para os propósitos desta invenção, as proteínas, cujas sequências de aminoácidos são caracterizadas pela presença de vários motivos de aminoácidos conservativos (sequências de consenso) mostrados em SEQ ID NOs: 56 - 63, são aplicáveis como hispidina-sintases. Sítios de consenso dentro de sequências de aminoácidos de hispidina-sintase são operativamente ligados por meio de inserções de aminoácidos com inserções inferiores (Figura 2).
[333] Em algumas modalidades, as proteínas de cafeoilpiruvato hidrolase são aplicadas in vitro e in vivo para produzir ácidos 3-arilacrílicos com a fórmula estrutural
[334] , onde R é selecionado a partir do grupo arila, heteroarila, de ácido 6-aril-2-hidroxi-4-oxo-hexa-2,5-dieno com a fórmula estrutural , onde R - arila ou heteroarila. A reação é realizada em condições fisiológicas in vitro e in vivo. Cafeoilpiruvato hidrolases desta invenção são aplicadas em sistemas de bioluminescência autônoma descritos em detalhe abaixo.
[335] Para os propósitos desta invenção a proteínas, cujas sequências de aminoácidos são mostradas em SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, e também seus mutantes funcionais, homólogos e derivados são aplicáveis como Cafeoilpiruvato hidrolases. Por exemplo, podem ser usados cafeoilpiruvatos hidrolases funcionais com sequência de aminoácido idêntica à sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %, ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica.
[336] Em modalidades preferidas para os propósitos desta invenção, as proteínas, cujas sequências de aminoácidos são caracterizadas pela presença de vários motivos de aminoácidos conservativos (sequências de consenso) mostrados em SEQ ID NOs: 76 - 78, são aplicáveis como Cafeoilpiruvato hidrolases. Sítios de consenso dentro de sequência de aminoácido de cafeoilpiruvato hidrolases são operativamente ligados por meio de inserções de aminoácidos com inserções inferiores (Figura 3).
[337] Combinações de proteínas aplicáveis nos métodos desta invenção também são fornecidas. Em modalidades preferidas, as combinações incluem hispidina hidroxilase funcional e hispidina sintase funcional. Esta combinação é aplicada para a produção de 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona a partir de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural
[338] , onde R é arila ou heteroarila. Por exemplo, a combinação pode ser usada para a produção de hidroxi-hispidina de ácido cafeico. A reação é realizada em condições fisiológicas na presença de pelo menos uma molécula de hispidina hidroxilase, pelo menos uma molécula de hispidina sintase, pelo menos uma molécula de ácido 3-arilacrílico, pelo menos uma molécula de coenzima A, pelo menos uma molécula de AMP, pelo menos duas moléculas de malonil-CoA, pelo menos uma molécula de NAD (P) H e pelo menos de uma molécula de oxigênio molecular (O2).
[339] Em algumas modalidades, a combinação também inclui luciferase capaz de usar 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural
[340] , onde R - arila ou heteroarila, como luciferina. Oxidação da dita 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona por tal luciferase é acompanhada com bioluminescência e formação de Oxiluciferina (ácido 6-aril-2-
hidroxi-4-oxo-hexa-2,5-dieno).
[341] Qualquer proteína caracterizada pela atividade acima pode ser usada como uma luciferase. Por exemplo, luciferases conhecidas de fungos bioluminescentes, incluindo aquelas descritas no pedido RU № 2017102986/10 (005203) datado em 30.01.2017, e também seus homólogos, mutantes e proteínas fundidas tendo atividade de luciferase.
[342] Em muitas modalidades desta invenção, as luciferases aplicáveis para os propósitos desta invenção, são caracterizadas por sequências de aminoácidos, que são pelo menos 40 % idêntica, por exemplo, pelo menos 45 % idêntica, ou pelo menos 50 % idêntica, ou pelo menos 55 % idêntica, ou pelo menos 60 % idêntica, ou pelo menos 70 % idêntica, ou pelo menos 75 % idêntica, ou pelo menos 80 % idêntica, ou pelo menos 85 % idêntica à sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90 , 92, 94, 96,
98. Luciferases são frequentemente caracterizadas por sequências de aminoácidos, que têm a seguinte identidade com a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, mínimo 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 91 %, mínimo 92 %, mínimo 93 %, mínimo 94 %, mínimo 95 %, mínimo 96 %, mínimo 97 %, mínimo 98 %, mínimo 99 % de identidade ou 100 % de identidade).
[343] Os mutantes podem reter propriedades biológicas da luciferase de tipo selvagem, a partir da qual foram obtidos, ou podem ter propriedades biológicas diferentes das proteínas de tipo selvagem. O termo “propriedades biológicas” de luciferases de acordo com esta invenção refere-se, sem limitação, à capacidade de oxidar diferentes luciferinas; propriedades bioquímicas, tais como estabilidade in vivo e/ou in vitro (por exemplo, meia-vida); taxa de maturação; tendência à agregação ou oligomerização, e também outras propriedades semelhantes. Mutações incluem alterações de um ou mais aminoácidos, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos, substituições ou truncamentos, ou truncamentos ou extensões N-terminais, truncamentos ou extensões C- terminais, etc.
[344] Em algumas modalidades da invenção, as luciferases são usadas na forma isolada, isto é, são substancialmente livres de outras proteínas ou outras moléculas biológicas naturais, como oligossacarídeos, ácidos nucleicos e seus fragmentos, etc., onde o termo “substancialmente livre de “neste caso significa que menos de 70 %, normalmente menos de 60 % e prevalentemente menos de 50 % da dita composição, que compreende a proteína isolada, é a outra molécula biológica natural. Em algumas modalidades, as ditas proteínas estão substancialmente na forma purificada, onde o termo “forma substancialmente purificada” significa pureza igual a pelo menos 95 %, normalmente igual a pelo menos 97 % e prevalentemente igual a pelo menos 99 %.
[345] Em algumas modalidades, as luciferases são usadas como parte de extratos obtidos a partir de fungos bioluminescentes ou células hospedeiras compreendendo ácidos nucleicos que codificam luciferases recombinantes.
[346] Em muitas modalidades, as luciferases estão em sistemas de expressão heterólogos (em células ou organismos desta invenção), que compreendem ácidos nucleicos que codificam luciferases recombinantes.
[347] Os métodos para a produção de proteínas recombinantes, em particular, luciferases, como na forma isolada, ou como parte de extratos, ou em sistemas de expressão heterólogos, são bem conhecidos na técnica e descritos na seção “Ácidos Nucleicos”. Os métodos de purificação de proteínas são descritos na seção “Proteínas”.
[348] Em modalidades preferidas, as luciferases retêm atividade a temperaturas abaixo de 50 °C, prevalentemente a temperaturas máximas de 45 °C, isto é, retêm atividade a temperaturas de 20 a 42 °C e podem ser usadas em sistemas de expressão heterólogos in vitro e in vivo. Normalmente, as luciferases descritas têm estabilidade na faixa de 4 a 10, prevalentemente na faixa de 6,5 a 9,5. A estabilidade ótima das proteínas reivindicadas está dentro da faixa de 7,0 a 8,5, por exemplo, entre 7,3 a 8,0. Em modalidades preferidas, nas ditas luciferases são ativas em condições fisiológicas.
[349] A combinação da hispidina hidroxilase e da luciferina fúngica oxidante da luciferase com emissão luminescente é aplicada em métodos de identificação de hispidina e seus análogos funcionais em objetos biológicos: células, tecidos ou organismos. O método inclui o contato do objeto biológico de teste ou extrato, obtido a partir dele, com combinação de hispidina hidroxilase isolada e a dita luciferase em tampão de reação adequado criando condições fisiológicas e compreendendo os componentes necessários para realizar as reações. Uma pessoa versada na técnica pode fazer uma variedade de tampões de reação que satisfaçam esta condição. O exemplo não limitativo do tampão de reação pode ser tampão de fosfato de sódio 0,2 M (pH 7,0 a 8,0) atado com 0,5 M de Na2SO4, 0,1 % de dodecilmaltosídeo (DDM), 1 mМ de NADPH.
[350] A presença de hispidina ou de seu análogo funcional é determinada pela ocorrência da luminescência detectável - bioluminescência. Os métodos para detectar a luminescência detectável são descritos acima na seção “Proteínas” ao descrever a métodos de triagem funcional.
[351] A combinação de hispidina hidroxilase, hispidina sintase e luciferase oxidante de luciferina fúngica com emissão de luminescência é aplicada em métodos para identificar ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural
[352] , onde R é arila ou heteroarila, em objetos biológicos. O método inclui o contato do objeto biológico de teste ou extrato, obtido a partir dele, com combinação de hispidina hidroxilase isolada, hispidina sintase e luciferase criando condições fisiológicas e compreendendo os componentes necessários para realizar as reações. Uma pessoa versada na técnica pode fazer uma variedade de tampões de reação que satisfaçam esta condição. O exemplo não limitativo do tampão de reação pode ser tampão de fosfato de sódio de 0,2 M (pH 7,0 a 8,0) atado com 0,5 M de Na2SO4, 0,1 % de dodecilmaltosídeo (DDM), 1 mM de NADPH, 10 mM de ATP, 1 mM de CoA, 1 mM de malonil-CoA.
[353] A presença de ácido 3-arilacrílico é determinada pela ocorrência da luminescência detectável - bioluminescência. Os métodos para detectar a luminescência detectável são descritos acima na seção “Proteínas” ao descrever a métodos de triagem funcional.
[354] Em algumas modalidades, em vez da combinação de hispidina hidroxilase e luciferase oxidante de luciferina fúngica com emissão de luminescência, poderia ser usada uma proteína de fusão descrita na seção “Proteína” acima. Uma proteína de fusão exibe simultaneamente atividade de hispidina hidroxilase e atividade de luciferase e pode ser usada em quaisquer métodos em vez da combinação das ditas enzimas.
[355] Em algumas modalidades, em vez da hispidina-sintase acima, é usada uma policetídeo sintase do tipo III caracterizada pela sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139. Para os propósitos desta invenção, existem policetídeos sintases de tipo III aplicáveis tendo a sequência de aminoácidos idêntica à sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129,131, 133, 135, 137, 139 pelo menos 40 %, prevalentemente pelo menos 45 %, normalmente pelo menos 50 %, por exemplo, pelo menos 55 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %, ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica.
[356] Os representantes das ditas policetídeos sintases (PKS) são identificados em muitos organismos vegetais; sua e/ou sua capacidade mutante de catalisar a síntese de bisnoriangonina a partir de cumaroil-CoA é conhecida na técnica [Lim et al., Molecules, 22 de junho de 2016; 21 (6)]. Os requerentes demonstraram que as ditas enzimas também são capazes de catalisar a síntese a partir de hispidina a partir de cafeoil-CoA in vitro e in vivo:
[357] Portanto, a aplicação das ditas proteínas para síntese de hispidina está também dentro do escopo desta invenção.
[358] Em algumas modalidades da invenção, os PKS são usados na forma isolada, isto é, são substancialmente livres de outras proteínas ou outras moléculas biológicas naturais, como oligossacarídeos, ácidos nucleicos e seus fragmentos, etc., onde o termo “substancialmente livre de” neste caso significa que menos de 70 %, normalmente menos de 60 % e prevalentemente menos de 50 % da dita composição, que compreende a proteína isolada, é a outra molécula biológica natural. Em algumas modalidades, as ditas proteínas estão substancialmente na forma purificada, onde o termo “forma substancialmente purificada” significa pureza igual a pelo menos 95 %, normalmente igual a pelo menos 97 % e prevalentemente igual a pelo menos 99 %.
[359] Em muitas modalidades, os PKS são em sistemas de expressão heterológos (em células ou organismos desta invenção), que compreendem ácidos nucleicos que codificam enzimas recombinantes.
[360] Os métodos de produção de proteínas recombinantes, como na forma isolada, ou como parte de extratos, ou em sistemas de expressão heterólogos, são bem conhecidos na técnica e descritos na seção “Ácidos Nucleicos”. Os métodos de purificação de proteínas são descritos na seção “Proteínas”.
[361] Em modalidades, o PKS retém a atividade a temperaturas abaixo de 50 °C, prevalentemente a temperaturas máximas de 45 °C, isto é, eles retêm a atividade a temperaturas de 20 a 42 °C e podem ser usados em sistemas de expressão heterólogos in vitro e in vivo. Normalmente, os PKS descritos têm estabilidade na faixa de 4 a 10, predominantemente na faixa de 6,0 a 9,0. A estabilidade ótima das proteínas reivindicadas está dentro da faixa de 6,5 a 8,5, por exemplo, entre 7,0 a 7,5. Em modalidades preferidas, o dito PKS é ativo em condições fisiológicas.
[362] O método para obter hispidina inclui a combinação de pelo menos uma molécula de policetídeo sintases do tipo III, descrita acima, com pelo menos duas moléculas de malonil-CoA e pelo menos uma molécula de cafeoil-CoA.
[363] Em algumas modalidades, o método inclui produzir cafeoil-CoA a partir do ácido cafeico durante a reação enzimática catalisada por cumarato-CoA ligase. Neste caso, o método inclui combinação de policetídeo sintases de tipo III, descrito acima, com pelo menos uma molécula de ácido cafeico, com pelo menos uma molécula de coenzima A, pelo menos uma molécula de cumarato-CoA ligase, pelo menos uma molécula de ATP e pelo menos duas moléculas de malonil-CoA.
[364] Para os propósitos desta invenção podem ser usados quaisquer enzimas cumarato-CoA ligase, conhecidas na técnica, que realizam a reação da adição de coenzima A ao ácido cafeico com a formação de cafeoil-CoA:
[365] Em particular, pode ser usada ligase de cumarato-CoA 1 a partir de Arabidopsis thaliana, tendo sequências de aminoácidos e nucleicas mostradas em SEQ ID NO: 141, e também seus mutantes funcionais e homólogos. Por exemplo, para os propósitos desta invenção é aplicável a ligase de cumarato-
CoA funcional, cuja sequência de aminoácido tem mínimo 40 % de identidade, por exemplo, mínimo 45 % de identidade, ou mínimo 50 % de identidade, ou mínimo 55 % de identidade, ou mínimo 60 % de identidade, ou mínimo 65 % de identidade, ou mínimo 70 % de identidade, ou mínimo 75 % de identidade, por exemplo, mínimo 80 % de identidade, mínimo 85 % de identidade, mínimo 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 141.
[366] Todas as ditas reações são realizadas em condições fisiológicas na temperatura de 20 a 50 °C, e também a reação pode ser realizada em células, tecidos e organismos hospedeiros que expressam enzimas funcionais.
[367] PKS e cumarato-CoA ligase combinados com hispidina hidroxilase desta invenção podem ser usados para produzir 3-hidroxispidina a partir de ácido cafeico. A reação é realizada em condições fisiológicas na presença de pelo menos uma molécula de hispidina hidroxilase, pelo menos uma molécula de PKS, pelo menos uma molécula de ligase de cumarato-CoA, pelo menos uma molécula de ácido cafeico ou cafeoil-CoA, pelo menos uma molécula de coenzima A, com pelo menos uma molécula de ATP, com pelo menos uma molécula de NAD(P)H, com pelo menos de uma molécula de oxigênio, e pelo menos duas moléculas de malonil-CoA.
[368] Também, esta invenção fornece a aplicação de ácidos nucleicos que codificam enzimas de biossíntese de luciferina fúngica, mutantes e homólogos destas proteínas, incluindo formas encurtadas ou alongadas, e proteínas de fusão para obter enzimas envolvidas em biossíntese de luciferina fúngica in vitro e\ou in vivo.
[369] Em modalidades preferidas é fornecida aplicação de ácidos nucleicos que codificam hispidinas hidroxilases da invenção, isto é, proteínas caracterizadas pelas sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, e também seus homólogos funcionais, mutantes e derivados. Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos codificam proteínas,
cujas sequências de aminoácidos são pelo menos 40 %, prevalentemente pelo menos 45 %, normalmente pelo menos 50 %, por exemplo, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %,ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %,ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica às sequências mostradas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, para pelo menos 350 aminoácidos. Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos codificam proteínas, cujas sequências de aminoácidos são caracterizadas pela presença de vários motivos de aminoácidos conservativos (sequências de consenso) mostrados em SEQ ID NO: 29 - 33.
[370] Também é fornecida a aplicação de ácidos nucleicos que codificam hispidina-sintases, isto é, proteínas caracterizadas pelas sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, e também seus homólogos funcionais, mutantes e derivados. Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos da invenção codificam proteínas, cujas sequências de aminoácidos são pelo menos 40 %, prevalentemente pelo menos 45 %, normalmente pelo menos 50 %, por exemplo, pelo menos 55 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %,ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %,ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica às sequências mostradas em SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45,47,49, 51, 53, 55, para toda a cadeia de polipeptídeo de proteína. Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos codificam proteínas, cujas sequências de aminoácidos são caracterizadas pela presença de vários motivos de aminoácidos conservativos (sequências de consenso) mostrados em SEQ ID NOs: 56 - 63.
[371] Também é fornecida aplicação de ácidos nucleicos que codificam cafeoilpiruvatos hidrolases, isto é, proteínas caracterizadas pelas sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, e também seus homólogos funcionais, mutantes e derivados. Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos da invenção codificam proteínas, cujas sequências de aminoácidos são pelo menos 40 %, prevalentemente pelo menos 45 %, normalmente pelo menos 50 %, por exemplo, pelo menos 55 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %,ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %,ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica às sequências mostradas em SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, para toda a cadeia de polipeptídeo de proteína. Em modalidades preferidas, os ácidos nucleicos codificam proteínas, cujas sequências de aminoácidos são caracterizadas pela presença de vários motivos de aminoácidos conservativos (sequências de consenso) mostrados em SEQ ID NOs: 76 - 78.
[372] Os grupos de ácidos nucleicos acima são aplicados para a produção de proteínas recombinantes de hispidinas hidroxilases, hispidina sintases e cafeoilpiruvatos hidrolases, e também para expressão dessas proteínas em sistemas de expressão heterológos.
[373] Em particular, os ácidos nucleicos que codificam hispidinas hidroxilases são aplicados para obter células produtoras de 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H- piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural
[374] a partir de exógeno ou endógeno 6-(2-arilvinil)-4- hidroxi-2H-piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural
[375] , onde R - arila ou heteroarila.
[376] Ácidos nucleicos que codificam cafeoilpiruvatos hidrolases são aplicados para obter células e organismos capazes de transformar Oxiluciferina no precursor de pré-luciferina.
[377] Ácidos nucleicos que codificam hispidina-sintases são aplicados para obter células produtoras da 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona acima a partir do ácido 3-arilacrílico correspondente. Por exemplo, células que expressam hispidina-sintase são aplicadas para produzir hispidina a partir de ácido cafeico.
[378] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam as hispidina- sintases são aplicados para a produção de hispidina a partir da tirosina. Nas ditas modalidades, os ácidos nucleicos, enzimas codificantes que promovem a síntese de ácido cafeico a partir da tirosina, são adicionalmente introduzidos nas células. Essas enzimas são conhecidas na técnica. Por exemplo, poderia ser usada uma combinação de ácidos nucleicos que codificam tirosina-amônia-liase Rhodobacter capsulatus, e os componentes de HpaB e HpaC de E. coli 4- hidroxifenil acetato 3-monooxigenase-reductase como descrito em [Lin e Yan. Microb Célula Fact. 2012, 4;11:42]. É óbvio para aquela pessoa versada na técnica que alternativamente podem ser usados qualquer outro conhecido na técnica de enzimas que transformam tirosina em ácido cafeico, por exemplo, enzimas, cuja sequência de aminoácidos é substancialmente idêntica à sequência de aminoácidos de tirosina-amônia-liase Rhodobacter capsulatus, e os componentes de HpaB e HpaC de E. coli 4-hidroxifenil acetato 3- monooxigenase-reductase, mostrado em SEQ ID NOs: 107, 109 e 111. Por exemplo, as ditas enzimas podem ter sequências de aminoácidos que têm mínimo 40 % de identidade, por exemplo, mínimo 45 % de identidade, ou mínimo 50 % de identidade, ou mínimo 55 % de identidade, ou mínimo 60 % de identidade, ou mínimo 65 % de identidade, ou mínimo 70 % de identidade, ou mínimo 75 % de identidade, por exemplo, ou mínimo 80 % de identidade, ou mínimo 85 % de identidade, ou mínimo 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade) com sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 107,
109 e 111 respectivamente.
[379] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos que codificam hispidina- sintases são aplicados para a obtenção de células produtoras de análogos funcionais de hispidina a partir de compostos aromáticos, incluindo aminoácidos aromáticos e seus derivados. Nas ditas modalidades, os ácidos nucleicos, enzimas codificantes que promovem a síntese de ácidos 3-arilacrílicos, a partir dos quais os análogos funcionais da hispidina são biossintetizados, são adicionalmente introduzidos nas células. Essas enzimas são conhecidas na técnica. Por exemplo, para a biossíntese de ácido cinâmico pode ser usado ácido nucleico que codifica fenilalanina-amônia-liase Streptomyces maritimus, como descrito em [Bang, H.B., Lee, Y.H., Kim, S.C. et al. Microb Cell Fact (2016) 15:
16. https://doi.org/10,1186/s12934-016 - 0415-9]. É óbvio para as pessoas versadas na técnica que, alternativamente, podem ser utilizadas quaisquer outras enzimas conhecidas na técnica para transformar aminoácidos aromáticos e outros compostos aromáticos em ácidos 3-aril acrílicos. Por exemplo, para a biossíntese de ácido cinâmico pode haver qualquer fenilalanina-amônia-liase funcional, e. fenilalanina-amônia-liase, cuja sequência de aminoácidos é substancialmente semelhante à sequência mostrada em SEQ ID NOs: 117, por exemplo, cuja sequência é idêntica à sequência de SEQ ID NO: 117 pelo menos 40 %, incluindo mínimo 45 % de identidade, ou mínimo 50 % de identidade, ou mínimo 55 % de identidade, ou mínimo 60 % de identidade, ou mínimo 65 % de identidade, ou mínimo 70 % de identidade, ou mínimo 75 % de identidade, por exemplo, mínimo 80 % de identidade, mínimo 85 % de identidade, mínimo 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade).
[380] Em algumas modalidades para obter células hospedeiras que expressam hispidina-sintase funcional, é necessário co-transfectá-las por ácido nucleico que codifica hispidina-sintases da invenção e por ácido nucleico que codifica 4’- fosfopantetoinil transferase capaz de transferir 4’-fosfopantetoinil a partir da coenzima A para a serina no domínio de portador de acila das policetidas sintases. Em outras modalidades, as células hospedeiras selecionadas, por exemplo, células vegetais ou células de alguns fungos inferiores (por exemplo, Aspergillus), compreendem 4’-fosfopantetoinil transferase endógena e a co- transfecção não é necessária.
[381] Aplicação de combinações de ácido nucleico da invenção também é fornecida. Assim, uma combinação dos ácidos nucleicos, que codificam hispidina hidroxilase e hispidina sintase, é aplicada para obter células produtoras de 6-(2- arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona a partir de ácido 3-arilacrílico, por exemplo, para produzir 3-hidroxi-hispidina a partir de ácido cafeico e/ou tirosina. Em outras modalidades, uma combinação dos ácidos nucleicos inclui um ácido nucleico que codifica 4’-fosfopanteteinil transferase. Em algumas modalidades uma combinação dos ácidos nucleicos inclui os ácidos nucleicos que codificam enzimas que promovem síntese de ácido 3-arilacrílico a partir dos metabólitos celulares, por exemplo, enzimas que promovem síntese do ácido cafeico a partir da tirosina ou a síntese do ácido cinâmico a partir da fenilalanina.
[382] Em algumas modalidades uma combinação dos ácidos nucleicos, que codificam PKS e ligase de cumarato-CoA, é usada para obter células produtoras de hispidina a partir do ácido cafeico. Para os propósitos desta invenção é aplicável um ácido nucleico que codifica PKS funcional, cuja sequência de aminoácido é substancialmente semelhante ou idêntica à sequência selecionada a partir do grupo SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139; por exemplo, PKS, cuja sequência de aminoácido é idêntica à sequência selecionada a partir do grupo SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129,131, 133, 135, 137, 139 pelo menos 40 %, prevalentemente pelo menos 45 %, normalmente pelo menos 50 %, por exemplo, pelo menos 55 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %, ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % idêntica. O ácido nucleico que codifica ligase de cumarato-CoA funcional, catalisando a reação da coenzima A, além do ácido cafeico com formação de cafeico-CoA, é também aplicável para os propósitos desta invenção. Por exemplo, pode ser usado um ácido nucleico que codifica ligase de cumarato-CoA funcional, cuja sequência de aminoácido é idêntica à sequência mostrado SEQ ID NO: 141, ou tem mínimo 40 % de identidade, por exemplo, mínimo 45 % de identidade, ou mínimo 50 % de identidade, ou mínimo 55 % de identidade, ou mínimo 60 % de identidade, ou mínimo 65 % de identidade, ou mínimo 70 % de identidade, ou mínimo 75 % de identidade, por exemplo, mínimo 80 % de identidade, mínimo 85 % de identidade, mínimo 90 % de identidade (por exemplo, pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 % ou 99 % de identidade).
[383] Em algumas modalidades, uma combinação do ácido nucleico que codifica hispidinas hidroxilases da invenção e o ácido nucleico que codifica PKS é usado. Em modalidades preferidas, a combinação também inclui um ácido nucleico que codifica ligase de cumarato-CoA. A combinação é aplicada para obter células produtoras de 3-hidroxispidina a partir de ácido cafeico e/ou cafeoil- CoA.
[384] Em algumas modalidades, uma combinação de ácidos nucleicos inclui ácidos nucleicos que codificam enzimas que promovem a síntese de ácido cafeico a partir da tirosina.
[385] As combinações dos ácidos nucleicos das invenções usadas junto com o ácido nucleico que codifica a luciferase, capaz de oxidar a luciferina fúngica com emissão de luminescência, são de especial interesse. As moléculas de ácido nucleico, que codificam luciferases para os propósitos desta invenção, podem ser clonadas a partir de fontes biológicas, por exemplo, de fungos do tipo Basidiomycota, predominantemente da classe Basidiomycetes, em particular da ordem Agaricales, ou obtidas por técnicas de modificação genética. Mutantes de luciferase com atividade de luciferase podem ser obtidos usando técnicas padrão de biologia molecular, como descrito acima em detalhes na seção “Ácidos Nucleicos”. As mutações incluem alterações de um ou mais aminoácidos, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos, substituições ou truncamentos,
ou truncamentos ou extensões N-terminais, truncamentos ou extensões C- terminais, etc. Em modalidades preferidas, esses ácidos nucleicos codificam luciferases, cujas sequências de aminoácidos são pelo menos 40 % idêntica, por exemplo, pelo menos 45 % idêntica, ou pelo menos 50 % idêntica, ou pelo menos 55 % idêntica, ou pelo menos 60 % idêntica, ou pelo menos 70 % idêntica, ou pelo menos 75 % idêntica, ou pelo menos 80 % idêntica, ou pelo menos 85 % idêntica à sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90 , 92, 94, 96, 98. Por exemplo, eles podem ter sequências de aminoácidos que têm mínimo 90 % de identidade (por exemplo, mínimo 91 %, mínimo 92 %, mínimo 93 %, mínimo 94 %, mínimo 95 %, mínimo 96 %, mínimo 97 %, mínimo 98 %, mínimo 99 % ou 100 % de identidade) com sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98. Exemplos não limitativos de ácidos nucleicos, que codificam luciferases, são dados em SEQ ID NOs: 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 e 95.
[386] É usada uma combinação do ácido nucleico que codifica a hispidina hidroxilase da invenção e o ácido nucleico que codifica a luciferase acima. A combinação é amplamente aplicável ao marcar organismos, tecidos, células, organelas celulares ou proteínas por bioluminescência. Métodos para marcar organismos, tecidos, células, organelas celulares ou proteínas por luciferase são bem conhecidos na técnica e pressupõem a introdução de um ácido nucleico, codificando a luciferase, em uma célula hospedeira, por exemplo, sendo uma parte de um cassete de expressão que promove a expressão da luciferase na dita célula, tecido ou organismo. Ao adicionar a luciferina adequada às células, tecido ou organismo, expressando uma luciferase, ocorre luminescência detectável. Ao marcar organelas celulares ou proteínas, o ácido nucleico, que codifica a luciferase, está operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica respectivamente o sinal de localização na organela da célula de teste ou proteína de teste. Na co-expressão nas células da luciferase e da hispidina-sintase desta invenção, os objetos biológicos (células, tecidos, organismos, organelas celulares ou proteínas) adquirem a capacidade de emitir luminescência na presença não apenas da luciferina fúngica, mas também da pré-luciferina como bem (o último na maioria dos casos é mais estável na presença de oxigênio ambiente).
[387] Além disso, a combinação dos ácidos nucleicos é aplicável no estudo da dependência da atividade de dois promotores em sistemas de expressão heterólogos. Neste caso, um ácido nucleico operativamente ligado ao promotor A, codificando a luciferase, e um ácido nucleico operativamente ligado ao promotor B, codificando a hispidina hidroxilase, são introduzidos em uma célula hospedeira. Adicionando luciferina ou pré-luciferina, ou mistura de pré-luciferina e luciferase a alíquotas de células (ou extratos celulares), é possível detectar por ocorrência de emissão de luminescência a atividade de um promotor A (emissão de luminescência é detectada na presença de luciferina apenas), de um promotor B (a emissão de luminescência é detectada na presença da mistura de pré- luciferina e luciferase) ou de ambos os promotores (a emissão de luminescência é detectada em todos os casos).
[388] Em algumas modalidades, a combinação também compreende um ácido nucleico que codifica hispidina-sintase. Em algumas modalidades a combinação adicionalmente compreende um ácido nucleico que codifica 4’-fosfopanteteinil transferase.
[389] Em algumas modalidades, a combinação compreende um ácido nucleico que codifica hispidina-sintase, um ácido nucleico que codifica luciferase, um ácido nucleico que codifica PKS, um ácido nucleico que codifica ligase de cumarato-CoA.
[390] As combinações são amplamente aplicáveis ao marcar organismos, tecidos, células, organelas celulares ou proteínas por bioluminescência. Nesta forma de realização, de modo a obter emissão de luminescência, um precursor de pré-luciferina adequado, por exemplo, ácido cafeico ou ácido cumárico, é adicionado a objetos biológicos que expressam hispidina hidroxilase, luciferase e hispidina sintase ou hispidina hidroxilase, luciferase, PKS e ligase de cumarato-
CoA.
[391] As combinações também são aplicáveis em métodos de estudo da dependência da atividade de três promotores em sistemas de expressão heterólogos. Os métodos pressupõem a introdução de ácido nucleico que codifica a luciferase sob o controle do promotor A, de ácidos nucleicos, que codifica a hispidina hidroxilase sob o controle do promotor B e o ácido nucleico que codifica a hispidina sintase (ou PKS), sob o controle do promotor B, na célula hospedeira. Se a co-expressão de 4’-fosfopantetoinil transferase é necessária para a maturação da hispidina-sintase funcional, ela também é introduzida na célula sob o controle de qualquer promotor constitutivo ou induzível adequado. Ao adicionar um precursor de pré-luciferina adequado às células (ou seus extratos), a luminescência detectável aparece, indica uma ativação simultânea de todos os três promotores.
[392] As combinações também são aplicáveis na produção de organismos luminosos transgênicos. Em modalidades preferidas, os organismos transgênicos são obtidos a partir de organismos, cujo tipo selvagem não é capaz de bioluminescência. Os ácidos nucleicos, que codificam proteínas alvo, são introduzidos em um organismo transgênico como uma parte do cassete de expressão ou vetor, que existe no organismo como elementos extracromossômicos ou são integrados ao genoma do organismo, conforme descrito acima na seção “Organismos transgênicos”, e promover a expressão de proteínas alvo. Os organismos transgênicos da invenção são diferentes por expressarem pelo menos hispidina hidroxilase, exceto para luciferase, cujo substrato é a luciferina fúngica. Em formas de realização preferidas, também expressam a hispidina-sintase. Em outras modalidades preferidas, eles também expressam PKS. Em outras modalidades preferidas, eles também expressam PKS. Em algumas modalidades, eles também expressam ligase cumarato-CoA. Sabe-se que ligase de cumarato-CoA endógena está presente em muitos organismos vegetais, portanto, sua introdução adicional é realizada nos casos em que a ligase de cumarato-CoA endógena está ausente.
[393] Em algumas modalidades, eles também expressam cafeoilpiruvato hidrolase. Ao contrário dos organismos que expressam apenas luciferase, os organismos transgênicos, obtidos usando os ácidos nucleicos da invenção, adquirem a capacidade de emitir luminescência na presença de pré-luciferinas e/ou precursores de pré-luciferina - ácidos 3-arilacrílicos (predominantemente, ácido cafeico) - quais são os substratos mais baratos e estáveis para a obtenção de bioluminescência, que podem ser adicionados à água para regar as plantas, ou ao meio de cultura de micro-organismos, ou para alimentar ou ao habitat animal (por exemplo, peixes). Organismos transgênicos bioluminescentes (plantas, animais ou fungos) são aplicáveis como fontes de luminescência e também são usados para propósitos ornamentais. Organismos transgênicos bioluminescentes, células e culturas de células também podem ser usados em diferentes rastreios, onde a intensidade da bioluminescência é alterada dependendo da influência externa. Por exemplo, eles poderiam ser usados na análise de diferentes fatores que afetam a atividade de promotores que controlam a expressão de ácidos nucleicos exógenos.
[394] Organismos transgênicos autonomamente bioluminescentes, que também são fornecidos por esta invenção, são de especial interesse.
[395] Em algumas modalidades, os ditos organismos têm pelo menos um ácido 3-arilacrílico, como um metabólito, com a fórmula estrutural
[396] , onde R é arila ou heteroarila.
[397] Plantas superiores e inferiores, incluindo plantas com flores e musgos podem ser mencionadas como exemplos não limitantes. A fim de obter plantas transgênicas produtoras de luminescência de forma autônoma, os ácidos nucleicos, que codificam a hispidina hidroxilase, a hispidina sintase e a luciferase, capazes de oxidar a luciferina fúngica com emissão de luminescência, e capazes de expressar as enzimas correspondentes, são introduzidos nessas plantas. Uma vez que as plantas normalmente compreendem 4’-fosfopantetoinil transferase endógena, a introdução adicional de ácido nucleico, codificando esta enzima para obter plantas produtoras de luminescência autonomamente, geralmente não é necessária.
[398] Em algumas modalidades, os organismos, que não produzem naturalmente ácidos 3-arilacrílicos, são usados para obter organismos transgênicos bioluminescentes autonomamente. Os exemplos de tais organismos são animais e uma variedade de micro-organismos, por exemplo, leveduras e bactérias. Neste caso, ácidos nucleicos, capazes de expressão, codificando enzimas que promovem a biossíntese de ácido 3-arilacrílico a partir de metabólitos celulares, por exemplo, ácido cafeico de tirosina, são adicionalmente introduzidos em organismos para obter bioluminescência autônoma. Se necessário, o ácido nucleico que codifica 4’-fosfopantetoinil transferase também é introduzido nos organismos.
[399] Em algumas modalidades para obter organismos produtores de luminescência autonomamente, os ácidos nucleicos, capazes de expressar enzimas correspondentes, codificando PKS, hispidina hidroxilase e luciferase capaz de oxidar luciferina fúngica com emissão de luminescência, são introduzidos nesses organismos. Em modalidades preferidas, as ditas células, tecidos e organismos compreendem uma quantidade suficiente de cafeoil-CoA e malonil-CoA para realizar síntese de hispidina.
[400] Em casos, quando o organismo transgênico não produz uma quantidade suficiente de cafeoil-CoA durante os processos metabólicos normais, o ácido nucleico que codifica ligase de cumarato-CoA, e também, se necessário, enzimas da biossíntese de ácido cafeico a partir da tirosina, é também introduzida nas ditas células ou organismos.
[401] Em modalidades preferidas, a combinação de ácidos nucleicos para obter autonomamente células bioluminescentes ou organismos transgênicos também compreende um ácido nucleico que codifica cafeoilpiruvato hidrolase. Como demonstrado na parte experimental abaixo, a expressão de cafeoilpiruvato hidrolase resulta no aumento da intensidade de bioluminescência de células bioluminescentes autônomas ou organismos transgênicos. Em modalidades preferidas, a intensidade de bioluminescência aumenta pelo menos 1,5 vezes, prevalentemente pelo menos 2 vezes, normalmente pelo menos 5 vezes, por exemplo, 7 a 9 vezes, por exemplo, 8 ou mais vezes.
[402] Organismos transgênicos autonomamente bioluminescentes (plantas ou animais ou fungos) e também células e estruturas celulares são diferentes de organismos transgênicos, células e culturas de células que expressam luciferase apenas e são conhecidas na técnica, em que nenhuma adição exógena de luciferina ou seu precursor é necessário para a sua luminescência.
[403] Em algumas modalidades, em vez da combinação de ácidos nucleicos que codificam hispidina hidroxilase e luciferase, é usada a proteína de fusão que codifica o ácido nucleico dessas duas enzimas. É óbvio para os especialistas na técnica que a dita proteína de fusão e a combinação de ácidos nucleicos que codificam a hispidina hidroxilase e a luciferase são objetos intercambiáveis em todos os métodos de utilização. É também óbvio que com base nos ácidos nucleicos da invenção poderiam ser produzidas outras proteínas de fusão, que reterão propriedades de parceiros de fusão; tais proteínas de fusão e ácidos nucleicos que os codificam podem ser usados sem limitação em vez de combinações de proteínas e ácidos nucleicos individuais.
[404] Em todas as aplicações e métodos descritos acima, os ácidos nucleicos podem estar na forma de cassetes de expressão, que podem ser usados para promover a expressão da sequência de codificação em uma célula hospedeira. O ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula hospedeira como uma parte do vetor para expressão em uma célula hospedeira adequada ou não incluindo- o no vetor, por exemplo, ele pode ser integrado em um lipossoma ou partícula viral. Alternativamente, a molécula purificada de ácido nucleico pode ser integrada diretamente na célula hospedeira usando meios adequados, por exemplo, por captação endocítica direta. A construção do gene pode ser introduzida diretamente nas células do organismo hospedeiro (por exemplo,
planta) por transfecção, infecção, microinjeção, fusão celular, fusão de protoplastos, usando bombardeamento de micropartículas ou por meio de “pistola genética” (arma para disparar com micropartículas carregando construções de genes).
[405] A aplicação de anticorpos policlonais e monoclonais da invenção também é fornecida. Eles são aplicados na coloração de tecidos, células ou organismos para localizar hispidina hidroxilases expressas ou naturais, hispidina sintases e cafeoilpiruvato hidrolases da invenção. Os métodos de coloração por meio de anticorpos específicos são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em [V.L. Bykov Cytology e general histology]. A técnica de imuno-histoquímica direta é baseada na reação de anticorpos marcados de ligação específica diretamente com a substância detectável, a técnica de imuno-histoquímica indireta é baseada em que os anticorpos primários não marcados são ligados à substância detectável e então são detectados por meio de anticorpos marcados secundários, desde que, os anticorpos primário sejam antígenos para anticorpos secundários. Os anticorpos também são aplicáveis para interromper a reação enzimática. O contato do anticorpo com o parceiro de ligação específico resulta na inibição da reação enzimática. Os anticorpos também são aplicáveis em métodos para purificação de proteínas recombinantes e naturais da invenção por cromatografia de afinidade. As técnicas de cromatografia de afinidade são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, em Ninfa et al (2009). Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology (2 ed.). Wiley. página 133.; Cuatrecasas (1970). JBC. Recuperado em 22 de novembro de 2017].
CONJUNTOS E PRODUTOS
[406] A próxima modalidade da invenção é um produto que inclui a hispidina hidroxilase, ou hispidinas sintases, ou cafeoilpiruvatos hidrolases, ou ácido nucleico acima descrito que codifica a enzima acima, de preferência com os elementos para promover a expressão da proteína alvo na célula hospedeira, por exemplo, cassete ou vetor de expressão, compreendendo ácido nucleico que codifica a proteína alvo. Alternativamente, os ácidos nucleicos podem compreender sequências flanqueadoras para a sua incorporação no vetor alvo. Os ácidos nucleicos podem ser incluídos em vetores sem promotor destinados a fácil clonagem de elementos reguladores alvo. As proteínas recombinantes podem ser liofilizadas ou dissolvidas em uma solução tampão. Os ácidos nucleicos podem ser liofilizados ou precipitados em uma solução alcoólica ou dissolvidos em água ou solução tampão.
[407] Em algumas modalidades, o produto inclui células que expressam um ou vários ácidos nucleicos acima.
[408] Em algumas modalidades, o produto inclui um organismo transgênico que expressa um ou vários ácidos nucleicos acima.
[409] Em algumas modalidades, o produto inclui anticorpos para coloração e/ou inibição e/ou cromatografia de afinidade das enzimas acima.
[410] O produto é um recipiente com etiqueta e instruções de uso anexadas. Os recipientes aceitáveis são, por exemplo, garrafas, ampolas, tubos de vidro, seringas, placas de células, placas de Petri, etc. O recipiente pode ser feito de diferentes materiais, como vidro ou materiais poliméricos. A seleção de um recipiente adequado é óbvia para as pessoas versadas na técnica.
[411] Além disso, o produto pode incluir outros produtos necessários comercialmente ou a partir do ponto de vista do consumidor, por exemplo: tampão de reação ou componentes para a sua preparação, tampão para diluição e/ou solução e/ou armazenamento de proteínas e ácidos nucleicos, ou componentes para sua preparação, água desionizada, anticorpos secundários para anticorpos específicos da invenção, meio de cultura de células ou componentes para sua preparação, nutrição para organismos transgênicos.
[412] Os produtos também incluem instruções para a implementação dos métodos propostos. As instruções podem ser de diferentes formas, desde que uma ou várias dessas formas possam ser anexadas ao produto, por exemplo, a instrução pode ser um arquivo em formato eletrônico e/ou em papel.
[413] A invenção também se refere aos kits que podem ser aplicados para diferentes propósitos. O kit pode incluir uma combinação de proteínas da invenção ou combinação de ácidos nucleicos da invenção, de preferência com os elementos para promover a expressão da proteína alvo na célula hospedeira, por exemplo, cassete ou vetor de expressão, compreendendo ácido nucleico que codifica a proteína alvo. Em algumas modalidades, o kit também pode compreender um ácido nucleico que codifica a luciferase, capaz de oxidar a luciferina fúngica com emissão de luminescência. Em algumas modalidades, o kit também pode compreender ácidos nucleicos que codificam enzimas envolvidas na biossíntese de ácido cafeico a partir de tirosina. Em algumas modalidades, o kit também pode compreender um ácido nucleico que codifica 4’- fosfopantetoinil transferase. Em algumas modalidades, o kit também pode compreender um ácido nucleico que codifica PKS. Em algumas modalidades, o kit também pode compreender um ácido nucleico que codifica ligase cumarato- CoA.
[414] Em algumas modalidades, o kit também pode compreender anticorpos para purificação de proteínas recombinantes ou para colorir as proteínas expressas em células hospedeiras. Em algumas modalidades, o kit também pode compreender iniciadores, complementares às regiões do dito ácido nucleico, para amplificação do ácido nucleico ou seu fragmento. Em algumas modalidades, o kit também pode compreender uma ou várias luciferinas e/ou pré-luciferinas fúngicas e/ou precursores da pré-luciferina. Os ditos compostos podem estar na forma de pó seco, na forma de solução de solvente orgânico, na forma de solução aquosa. Em algumas modalidades, o kit pode incluir células compreendendo um ou vários ácidos nucleicos acima. Em algumas modalidades, o kit pode compreender um organismo transgênico da invenção, por exemplo, cepa produtora ou planta transgênica autonomamente bioluminescente. Todos os componentes do kit são colocados em recipientes adequados. Geralmente, os kits também incluem instruções de uso.
[415] Os seguintes exemplos são dados para melhor compreensão da invenção. Estes exemplos são dados apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção de qualquer forma.
[416] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados nesta especificação são incorporados neste documento por referência. Embora a invenção acima tenha sido descrita em detalhes consideráveis por ilustração e exemplo para propósitos de clareza, é óbvio para aquelas pessoas versadas na técnica, com base nas ideias divulgadas nesta invenção, que algumas alterações e modificações podem ser introduzidas sem se afastar do espírito e escopo das modalidades propostas da invenção. PARTE EXPERIMENTAL (EXEMPLOS) EXEMPLO 1. ISOLAMENTO DE SEQUÊNCIAS DE HISPIDINA HIDROXILASE
[417] O RNA total do micélio de Neonothopanus nambi foi isolado de acordo com o método descrito em [Chomczynski e Sacchi, Anal. Biochem., 1987, 162, 156-159]. O cDNA foi amplificado por meio de Kit de síntese de cDNA SMART PCR (Clontech, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. O cDNA obtido foi usado para amplificação da sequência de codificação da luciferase, cuja sequência de nucleotídeos e aminoácidos são mostrados nas SEQ ID NOs: 79,
80. A sequência de codificação foi clonada no vetor pGAPZ (Invitrogen, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante e transformada em Células competentes de E. coli da cepa XL1 Blue. Bactria foi cultivada em placas de Petri na presença do antibiótico Zeocina. Em 16 horas as colônias foram enxaguadas das placas, intensamente misturadas, e o DNA de plasmídeo foi isolado delas por meio do kit de isolamento de DNA de plasmídeo (Evrogen, Rússia). O DNA de plasmídeo isolado foi linearizado no sítio de restrição AvrII e usado para a transformação de células GS115 de Pichia pastoris. A eletroporação foi realizada de acordo com o método, usando acetato de lítio e ditiotreitol, descrito em [Wu e Letchworth, Biotechniques, 2004, 36:152-4]. As células eletroporadas foram dispersas em placas de Petri com meio RDB, compreendendo 1 M de sorbitol, 2 % (peso/volume) de glicose, 1,34 % (peso/volume) de base de nitrogênio de levedura (YNB), 0,005 % (peso/volume) de mistura de aminoácidos, 0,00004 %
(peso/volume) de biotina e 2 % (peso/volume) de ágar. As colônias obtidas foram pulverizadas com solução de 3-hidroxi-hispidina, detectando a presença de luciferase nas células por ocorrência de luminescência. A luminescência emitida pelas colônias foi detectada por meio do Espectro de IVIS CT (PerkinElmer, EUA). As colônias, onde a luminescência foi detectada em resposta à adição de 3-hidroxispidina, foram selecionadas para trabalhos futuros.
[418] Em seguida, o cDNA total amplificado de Neonothopanus nambi foi clonado no vetor pGAPZ e transformado em células competentes de E. coli da cepa XL1 Blue. Bactria foi cultivada em placas de Petri na presença do antibiótico Zeocina. Em 16 horas, as colônias foram enxaguadas das placas, intensamente misturadas, e o DNA de plasmídeo foi isolado delas por meio do kit de isolamento de DNA de plasmídeo (Evrogen, Rússia). O DNA de plasmídeo isolado foi linearizado no sítio de restrição AvrII e usado para a transformação de células de levedura Pichia pastoris GS115, expressando constitutivamente a luciferase de Neonothopanus nambi. A transformação foi realizada pela técnica de eletrocorporação, conforme descrito acima. As células foram dispersas em placas de Petri com meio RDB, compreendendo 1 M de sorbitol, 2 % (peso/volume) de glicose, 1,34 % (peso/volume) de base de nitrogênio de levedura (YNB), 0,005 % (peso/volume) de mistura de aminoácidos, 0,00004 % (peso/volume) de biotina e 2 % (peso/volume) de ágar. A diversidade na biblioteca resultante de cDNA de Neonothopanus nambi em leveduras foi de cerca de um milhão de clones. As colônias obtidas foram pulverizadas com solução de hispidina, detectando-se a presença de hispidina hidroxilase nas células por ocorrência de luminescência. A luminescência emitida pelas colônias foi detectada por meio do Espectro de IVIS CT (PerkinElmer, EUA). As células que expressam luciferase apenas e células de levedura selvagem foram usadas como controle negativo. Durante a triagem da biblioteca, as colônias, onde a luminescência foi detectada, foram selecionadas e usadas para PCR como uma matriz com iniciadores de plasmídeo padrão. Os produtos de PCR foram sequenciados pelo método Sanger para determinar a sequência do gene expresso. A sequência obtida do ácido nucleico da hispidina hidroxilase é apresentada na SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos por ela codificada é apresentada na SEQ ID NO: 2.
[419] A Figura 4 ilustra a luminescência de células de Pichia pastoris que expressam hispidina hidroxilase e luciferase ou luciferase apenas, ou leveduras selvagens ao pulverizar as colônias com 3-hidroxi-hispidina (luciferina) e hispidina (pré-luciferina). Os dados demonstram que a luciferina é produzida em células na presença de hispidina hidroxilase.
[420] Na próxima etapa, o DNA genômico foi isolado dos fungos Armillaria fuscipes, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Mycena chlorophos, Neonothopanus nambi, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius e Panellus stipticus, e todo o sequenciamento do genoma foi realizado pela técnica Illumina HiSeq (Illumina, EUA) de acordo com as recomendações do fabricante. Os resultados do sequenciamento foram usados para a previsão de sequências de aminoácidos de proteínas hipotéticas e para a pesquisa de homólogos de hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi. A pesquisa de homólogos foi realizada por meio de um software fornecido pelo Centro Nacional para Informação de Biotecnologia. Pesquise por sequências de aminoácidos nos dados de sequenciamento do genoma fúngico no banco de dados NCBI Genbank. Os parâmetros de pesquisa padrão blastp foram usados na pesquisa. Como resultado, foram identificadas as sequências de homólogos da hispidina hidroxilase Neonothopanus nambi - em Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos.
[421] Sequências de nucleotídeos e aminoácidos de homólogos de hispidina- sintase de Neonothopanus nambi são mostradas em SEQ ID NOs: 3 - 28.
[422] Todas as enzimas identificadas são substancialmente idênticas umas às outras. O grau de identidade de sequências de aminoácidos é mostrado na Tabela 4.
[423] Tabela 4. Porcentagem de identidade das sequências de aminoácidos da proteína natural de comprimento total da hispidina hidroxilase.
SE SE SE SEQ SE SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ
Q Q Q ID Q ID ID ID ID ID ID ID ID ID NO: ID NO: NO: NO: NO: NO: NO: NO NO NO 16 NO 14 20 22 24 26 28 :2 :4 :6 :8 SEQ 100 61 71 72 70 89 72 73 73 73 69
ID NO: 2 SEQ 61 100 50 48 48 63 49 51 50 50 45
ID NO: 4 SEQ 71 50 100 69 69 71 85 86 87 88 67
ID NO: 6 SEQ 72 48 69 100 76 72 71 72 72 72 71
ID NO: 6 SEQ 72 48 70 99 76 72 71 73 73 73 71
ID NO: 18 SEQ 70 48 69 76 100 71 70 70 71 71 73
ID
NO: 8 SEQ 70 48 69 76 99 71 70 70 71 71 73
ID NO: 10 SEQ 89 63 71 72 71 100 72 75 73 74 71
ID NO: 14 SEQ 72 49 85 71 70 72 100 91 92 93 68
ID NO: 20 SEQ 73 51 86 72 70 75 91 100 93 93 69
ID NO: 22 SEQ 73 50 87 72 71 73 92 93 100 95 69
ID NO: 24 SEQ 73 50 88 72 71 74 93 93 95 100 69
ID No: 26 SEQ 69 45 67 71 73 71 68 69 69 69 100
ID NO:
[424] De Panellus stipticus e Mycena citricolor foram isoladas várias sequências de aminoácidos de hispidina hidroxilase altamente homólogas caracterizadas por substituições de um único aminoácido. Suas sequências de nucleotídeos e aminoácidos são mostradas em SEQ ID NOs 7 - 13 (Panellus stipticus) e SEQ ID NOs 15 - 18 (Mycena citricolor). Um estudo mais aprofundado das propriedades das ditas proteínas não detectou a influência dessas substituições nas propriedades enzimáticas.
[425] Sequências de codificação dos homólogos detectados (SEQ ID NOs: 3 - 28) foram clonados e transformados em células GS115 Pichia pastoris, expressando constitutivamente a luciferase de Neonothopanus nambi de acordo com o protocolo acima. As colônias obtidas foram pulverizadas com solução de hispidina, detectando-se a presença de hispidina hidroxilase nas células por ocorrência de luminescência. A luminescência emitida pelas colônias foi detectada por meio do Espectro de IVIS CT (PerkinElmer, EUA). Todas as colônias, expressando os genes de teste (SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27), produziram luminescência 1.000 a 100.000.000 vezes mais na pulverização com hispidina solução, do que células de controle, que confirma a capacidade de enzimas codificadas por genes testados para catalisar a transformação de hispidina em 3-hidroxispidina (luciferina fúngica).
[426] Foi realizada análise estrutural das sequências de aminoácidos das enzimas detectadas, Análise realizada por meio do software SMART (Simple Modular Architecture Research Tool), disponível na Internet no site http://smart.embl-heidelberg.de [Schultz et al., PNAS 1998; 95: 5857-5864; Letunic I, Doerks T, Bork P Nucleic Acids Res 2014; doi: 10.1093/nar/gku949] revelaram que todas as proteínas detectadas compreendem o domínio de ligação FAD/NAD (P), IPR002938 - código do banco de dados público da InterPro disponível na Internet no site http://www.ebi.ac.uk/interpro). Este domínio está envolvido na ligação de FAD e NAD em algumas enzimas, em particular, monooxigenases - os representantes de uma grande família de enzimas, adicionando o grupo hidroxila ao substrato, e múltiplos organismos encontrados nas vias metabólicas. As hispidina hidroxilases detectadas, exceto para o domínio de ligação FAD/NAD (P), compreendem sequências de aminoácidos N- e C-terminais operativamente ligadas a ela (Figura 1). Usando alinhamento múltiplo e comparação de sequências de aminoácidos das hispidinas hidroxilases detectadas (Figura 1), foi revelado que elas compreendem vários motivos de aminoácidos conservativos (sequências de consenso) típicos apenas deste grupo de enzimas (SEQ ID NOs: 29 - 33). Os sítios de consenso dentro das sequências de aminoácidos são operativamente ligados através de inserções de aminoácidos. EXEMPLO 2. EXPRESSÃO DE HISPIDINA HIDROXILASE E LUCIFERASE
FÚNGICA EM CÉLULAS DE MAMÍFERO E SEU USO COMBINADO PARA MARCAÇÃO DE CÉLULA
[427] Sequências de codificação de hispidina hidroxilase e luciferase de Neonothopanus nambi, obtidas de acordo com o Exemplo 1, foram otimizadas (humanizadas) para expressão em células de mamífero. Ácidos nucleicos otimizados (SEQ ID NOs: 99 e 100) foram obtidos sinteticamente. A sequência de codificação da hispidina hidroxilase foi clonada no vetor pmKate2-queratina (Evrogen, Rússia), usando os sítios de restrição NheI e NotI em vez da sequência de codificação da proteína de fusão mKate2-queratina. A sequência da luciferase foi amplificada por PCR, tratada pelas endonucleases de restrição NheI e EcoRV (New England Biolabs, Ipswich, MA) e ligada ao vetor lentiviral pRRLSIN.cPPT.EF1. O DNA de plasmídeo foi purificado por meio de kits de purificação de DNA de plasmídeo (Evrogen). O DNA de plasmídeo, compreendendo o gene da luciferase, foi usado para o desenvolvimento de linhas de expressão estável HEK293NT. As partículas de vetor foram obtidas por transfecção de fosfato de cálcio (Invitrogen, Carlsbad, CA) de células HELK293T de acordo com o protocolo fornecido no site do fabricante. 1.500.000 células foram colocadas em placas de cultura de 60 mm 24 horas antes da transfecção. Cerca de 4 e 1,2 μg de plasmídeos de empacotamento pR8.91 e pMD.G, e também 5 μg de plasmídeo de transferência, compreendendo a sequência de luciferase, foram usados para a transfecção. As partículas virais foram colhidas 24 horas após a transfecção, 10 vezes concentradas e utilizadas para a transdução de células HEK293NT. Cerca de 100 % das células HEK293NT expressaram estavelmente Neonothopanus nambiluciferase.
[428] As células obtidas foram submetidas a retransfecção pelo vetor compreendendo a sequência de codificação da hispidina hidroxilase usando o reagente de transfecção FuGENE HD (Promega, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. 24 horas após a transfecção, hispidina na concentração de 800 μg/ml foi adicionada ao meio e a luminescência celular foi detectada por meio de Espectro de IVIS CT (PerkinElmer). As células obtidas emitiram luminescência com intensidade superior a duas ordens de magnitude, excedendo o sinal de saída das células de controle não transfectadas (Figura 5).
[429] As células foram visualizadas em luz transmitida em canal de detecção de luminescência verde. A expressão da hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi em células humanas resultou na ocorrência de sinal luminoso distinto em espectro verde na presença de hispidina, permitindo distinguir células transfectadas de não transfectadas. EXEMPLO 3. USO DE HISPIDINA HIDROXILASE COM ANÁLOGOS DE
HISPIDINA EM LISATO CELULAR
[430] Células HEK293NT, expressando luciferase e hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi, obtidas de acordo com o Exemplo 2, foram enxaguadas de placas de Petri 24 horas após a transfecção com solução de Versene misturada com 0,025 % de tripsina, o meio foi substituído por solução salina tamponada com fosfato com pH 8,0 por centrifugação, as células foram ressuspensas, lisadas por ultrassom em Bioruptor (Diagenode, Bélgica) em 7 minutos a 0 °C nas condições recomendadas pelo fabricante, e 1 mM de NADPH (Sigma-Aldrich, EUA), e também hispidina ou um de seus análogos foi adicionado ao meio:
[431] (E)-4-hidroxi-6-(4-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona, (E)-6-(2-(1H-indol-3-
il)vinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, (E)-6-(2-(1,2,3,5,6,7-hexa-hidropirido[3,2,1- ij]quinolin-9-il)vinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, E)-6-(4-(dietilamino)estiril)-4- hidroxi-2H-piran-2-ona, ou (E)-4-hidroxi-6-(2-(6-hidroxinaftaleno-2-il)vinil)-2H- piran-2-ona na concentração de 660 μg/ml. Os espectros de bioluminescência foram detectados pelo espectrofluorômetro Varian Cary Eclipse. Foi observada luminescência nos lisados com a adição de todos os referidos análogos funcionais da hispidina. Dependendo da luciferina utilizada, foi observado o deslocamento esperado do pico de luminescência. EXEMPLO 4. OBTENDO HISPIDINAS HIDROXILASES RECOMBINANTES
[432] A sequência de poli-histidina (His tag) foi operativamente ligada à extremidade 5’ dos ácidos nucleicos que codificam hispidina-3-hidroxilases e luciferase de Neonothopanus nambi, obtida de acordo com os exemplos 1 e 2. As estruturas obtidas foram clonadas em pET-23 vetor por meio de endonucleases de restrição BamHI e HindIII. O vetor foi usado para a transformação de células de Escherichia coli da cepa BL21-DE3. As células foram dispersas em placas de Petri com meio LB, contendo 1,5 % de ágar, 100 μg/ml de ampicilina, e incubadas durante a noite a 37 °C. Em seguida, as colônias de Escherichia coli foram transferidas para 4 ml de meio LB líquido misturado com ampicilina, incubado durante a noite a 37 °C com flutuação. 1 ml de cultura durante a noite foi transferido para 100 ml de meio de autoindução expresso durante a noite (Novagen), onde a ampicilina foi preliminarmente adicionada. A cultura foi cultivada a 37 °C em 2,5 horas até atingir densidade óptica de 0,6 OE a 600 nm, e então foi cultivada em temperatura ambiente em 16 horas. Em seguida, as células foram sedimentadas a 4500 rpm em 20 minutos em centrífuga Eppendorf 5810R, ressuspensas em 35 ml do tampão (50 mM de Тris HCl рН 8,0, 150 mM de NaCl). As células foram sonicadas e peletizadas novamente. A cromatografia de afinidade de resina metálica TALON (Clontech, EUA) foi usada para purificação de proteínas recombinantes. A presença do produto recombinante esperado foi confirmada por eletroforese.
[433] Alíquotas de hispidina hidroxilases recombinantes isoladas foram usadas para testar a funcionalidade e estabilidade. Para a determinação da funcionalidade, 15 µl de solução de proteína recombinante isolada foram colocados em um tubo de vidro, compreendendo 100 µl do tampão (0,2 M de Tampão fosfato de Na, 0,5 M de Na2SO4, 0,1 % dodecilmaltosídeo (DDM) pH 8,0), 0,5 µl de luciferase recombinante purificada de Neonothopanus nambi, 1 mM de NADPH e 0,2 µM de hispidina. O tubo de vidro foi colocado em um luminômetro. A atividade de proteínas recombinantes isoladas resultou em luminescência em combinação com hispidina e seus análogos descritos no Exemplo 3, na presença de luciferase de Neonothopanus nambi. Em todos os casos, a intensidade da luminescência com a hispidina foi mais elevada com a hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi e a mais baixa com a hispidina hidroxilase de Armillaria mellea. EXEMPLO 5. OBTENÇÃO DE 3-HIDROXI-HISPIDIN, (E)-3,4-DI-HIDROXI-6- ESTIRIL-2H-PIRAN-2-ONA E (E)-3,4-DI-HIDROXI-6-(4-HIDROXISTIRIL)-2H- PIRAN-2-ONA USANDO HISPIDINA HIDROXILASE RECOMBINANTE
[434] A hispidina hidroxilase recombinante isolada de Neonothopanus nambi, obtida de acordo com o Exemplo 4, foi adicionada a misturas de reação compreendendo 1 mM de NADPH e 0,2 µM de hispidina, (E)-4-hidroxi-6-estiril- 2H-piran-2-ona ou (E)-4-hidroxi-6-(4-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona em 100 µl do tampão (0,2 M de Tampão fosfato de Na, 0,5 M de Na2SO4, 0,1 % dodecilmaltosídeo (DDM) pH 8,0). Em 30 minutos, a mistura de reação foi analisada por HPLC usando luciferinas sintéticas como padrões. A cromatografia demonstrou a ocorrência de picos correspondentes aos derivados hidroxilados na posição 3d: 3-hidroxi-hispidin, (E)-3,4-di-hidroxi-6-estiril-2H-piran-2-ona e (E)- 3,4-di-hidroxi-6-(4-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona. EXEMPLO 6. DETECÇÃO DE BIOLUMINESCÊNCIA POR HISPIDINA
HIDROXILASE E PROTEÍNA DE FUSÃO DE LUCIFERASE
[435] Sequências de DNA humanizado que codificam hispidina-hidroxilase e luciferase de Neonothopanus nambi, obtidas de acordo com o Exemplo 2, foram operativamente reticuladas entre si por ligante de peptídeo curto flexível com sequência de aminoácidos GGSGGSGGS (SEQ ID NOs: 115). As sequências de nucleotídeos e aminoácidos da proteína fundida obtida são mostradas em SEQ ID NO 101 e 102. A proteína fundida que codifica o ácido nucleico foi clonada no vetor pEGFP-N1 (Clontech, EUA) em vez do gene EGFP sob controle do promotor Citomegaloviral. A estrutura obtida foi transfectada em células HEK293T. Vetores análogos, compreendendo genes individuais de hispidina hidroxilase e luciferase, também foram co-transfectados. A transfecção foi realizada pelo agente de transfecção FuGENE HD (Promega, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. 24 horas após a transfecção, 1 milhão de células foram ressuspensas em 0,5 ml de PBS, e a luminescência sem adição de hispidina e com adição de hispidina (10 μg por 1 milhão de células) foi registrada por luminômetro. A adição de hispidina causou luminescência celular no espectro verde (Figura 6). A adição de 3-hidroxispidina também causou sinal bioluminescente. A expressão de proteínas de fusão de hispidina hidroxilase e luciferase permite usar precursores de luciferina mais estáveis (hispidina, bisnoriangonina e outros) em vez de uma luciferase para marcação de células bioluminescentes e não requer co-transfecção de dois ácidos nucleicos em células. EXEMPLO 7. PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS
[436] Sequências de codificação de hispidina hidroxilases de Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 1) e Armillaria mellea (SEQ ID NO: 19) foram obtidas sinteticamente na forma de DNA de fita dupla linear e clonadas em vetores de expressão pQE-30 (Qiagen, Alemanha) de tal forma que as proteínas recombinantes compreendem um marcador de histidina no terminal N. Após a expressão em E. coli, as proteínas recombinantes foram purificadas pela resina de afinidade metálica TALON (Clontech, EUA) em condições desnaturantes. Produtos de proteína purificada emulsionados em adjuvante de Freund foram usados para quatro imunizações de coelhos em intervalos de meses. O sangue de coelho foi coletado no décimo ou décimo primeiro dia após as imunizações. A atividade dos antissoros policlonais obtidos foi testada por ELISA e métodos de imunoblotting Western no painel de hispidina hidroxilases recombinantes purificadas obtidas de acordo com o Exemplo 4.
[437] Os anticorpos, obtidos na imunização de coelho com proteína de Neonothopanus nambi, demonstraram atividade contra a hispidina hidroxilase desnaturada e não desnaturada de Neonothopanus nambi e contra a hispidina hidroxilase desnaturada de Neonothopanus gardneri.
[438] Os anticorpos, obtidos na imunização de coelho com proteína de Armillaria mellea foram ativos contra hispidina hidroxilase desnaturada e não desnaturada de Armillaria mellea, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae e Armillaria fuscipes. EXEMPLO 8. OBTENÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS QUE
EXPRESSAM HISPIDINA HIDROXILASE E LUCIFERASE DE NEONOTHOPANUS NAMBI
[439] Sequências de codificação de hispidina hidroxilase e luciferase de Neonothopanus nambi foram otimizadas para expressão em células de musgo Physcomitrella patens. Em seguida, in silico, foi criado um cassete de expressão compreendendo o promotor do gene aktI do arroz, a região 5’-não traduzida do citomegalovírus humano que codifica a sequência de hispidina hidroxilase otimizada para expressão em células vegetais (SEQ ID NO 103), códon de terminação, sequência terminadora do gene Agrobacterium osc, promotor da ubiquitina de arroz, sequência de codificação da luciferase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NO 112) otimizada para expressão em células de musgo, terminador do gene Agrobacterium tumefaciens nos.
[440] A sequência obtida foi sintetizada de tal forma que todos os ditos fragmentos pareciam estar operativamente reticulados entre si e clonados pela técnica de montagem Gibson [Gibson et al., Nat Methods, 2009, 6: 343-5 ] no vetor de expressão pLand # 1 (Institut Jean-Pierre Bourgin, França), entre fragmentos de DNA coincidentes com o locus de DNA genômico de musgo Physcomitrella patens entre sequências de genes de musgo altamente expressos Pp3c16_6440V3.1 e Pp3c16_6460V3.1. O vetor pLand # 1 também compreendia uma sequência de RNA guia (sgRNA) para a nuclease Cas9, complementar à região do mesmo locus de DNA.
[441] O produto de DNA de plasmídeo foi co-transformado juntamente com o vetor de expressão compreendendo a sequência de nuclease Cas9 sob o promotor de ubiquitina de Arabidopsis thaliana, em protoplastos de musgo Physcomitrella patens de acordo com o protocolo de transformação de polietilenoglicol descrito em [Cove et al., Cold Spring Harb Protoc., 2009, 2]. Em seguida, os protoplastos foram incubados em meio BCD dentro de dois dias em condições de câmara escura com flutuação a 50 rpm para regenerar a parede celular. Em seguida, os protoplastos foram transferidos para placas de Petri compreendendo ágar e meio BCD e cultivados em 16 horas de iluminação em uma semana. Colônias de musgo transformadas foram selecionadas a partir de iniciadores genômicos externos por PCR para determinar o progresso da integração da construção do gene no genoma, transferidas para placas de Petri frescas e cultivadas nas mesmas condições de iluminação em 30 dias.
[442] Os gametófitos de musgo obtidos foram embebidos em meio BCD compreendendo hispidina na concentração de 900 μg/ml e analisados por meio de Sistema de Imageamento In vivo de Espectro IVIS (Perkin Elmer). Todas as plantas transgênicas analisadas demonstraram bioluminescência com intensidade mínima em duas ordens de magnitude excedendo o sinal das plantas controle expressando apenas luciferase, incubadas na mesma solução com hispidina. EXEMPLO 9. IDENTIFICAÇÃO DE HISPIDINA-SINTASES E
CAFEOILPIRUVATOS HIDROLASES
[443] Os precursores fúngicos da luciferina, como a hispidina, estão relacionados a um grande grupo de compostos químicos - derivados de policetídeos. Esses compostos podem ser teoricamente obtidos a partir de ácidos 3-arilacrílicos, nos quais os substituintes aromáticos, incluindo arilo ou heteroarila, são substituintes na posição 3d. É conhecido na técnica que as enzimas envolvidas na síntese de policetídeos e seus derivados são complexos de múltiplos domínios relacionados com a superfamília de proteínas do policetídeo sintase. Ao mesmo tempo, nenhuma policetídeo sintase, capaz de catalisar a transformação do ácido 3-arilacrílico em 4-hidroxi-2H-piran-2-ona substituída, foi conhecida na técnica. O rastreio da biblioteca de cDNA de Neonothopanus nambi foi utilizado para pesquisar o policetídeo sintase alvo.
[444] É conhecido que, para obter policetídeo sintases funcionais em sistema de levedura de expressão heteróloga, é necessário introduzir adicionalmente na cultura um gene que expressa 4’-fosfopantetoinil transferase - enzima que transfere 4-fosfopantetoinil a partir da coenzima A para a serina em domínio de portador de acila do policetídeo sintase [Gao Menghao et al., Microbial Cell Factories 2013, 12:77]. O gene NpgA de 4’-fosfopantetoinil transferase de Aspergillus nidulans (SEQ ID NOs 104, 105), conhecido na técnica, foi obtido sinteticamente e clonado no vetor pGAPZ. O plasmídeo foi linearizado no sítio de restrição AvrII e usado para a transformação da linha de levedura GS115 Pichia pastoris expressando constitutivamente Neonothopanus nambi, luciferase e hispidina hidroxilase, obtida de acordo com o Exemplo 1. A diversidade na biblioteca resultante de cDNA de Neonothopanus nambi em leveduras foi de cerca de um milhão de clones.
[445] A biblioteca de cDNA de Neonothopanus nambi expressa na referida linha de levedura de Pichia pastoris foi obtida de acordo com o protocolo dado no Exemplo 1 e foi usada para identificação de hispidina-sintases e cafeoilpiruvato hidrolases. As células foram dispersas em placas de Petri com meio RDB, compreendendo 1 M de sorbitol, 2 % (peso/volume) de glicose, 1,34 % (peso/volume) de base de nitrogênio de levedura (YNB), 0,005 % (peso/volume) de mistura de aminoácidos, 0,00004 % (peso/volume) de biotina e 2 % (peso/volume) de ágar.
[446] As colônias obtidas foram pulverizadas com solução de ácido cafeico (potencial precursor da hispidina), detectando a presença de hispidina-sintase nas células por ocorrência de luminescência. A luminescência emitida pelas colônias foi detectada por meio de Espectro de IVIS CT (PerkinElmer, EUA).
Células que expressam apenas luciferase e hispidina hidroxilase e células de levedura selvagem foram usadas como controle negativo. Durante a triagem da biblioteca, as colônias, onde a luminescência foi detectada, foram selecionadas e usadas para PCR como uma matriz com iniciadores de plasmídeo padrão. Os produtos de PCR foram sequenciados pelo método Sanger para determinar a sequência do gene expresso. A sequência obtida do ácido nucleico da hispidina- sintase é mostrada na SEQ ID NO: 34. A sequência de aminoácidos codificada por ela é mostrada na SEQ ID NO: 35.
[447] Então, a linha de levedura de Pichia pastoris obtida, compreendendo Neonothopanus nambi luciferase, genes de hispidina hidroxilase e hispidina sintase integrados no genoma, e também o gene NpgA de 4’-fosfopanteteinil transferase de Aspergillus nidulans, foi usado para a identificação da transformação catalisadora de enzimas de oxiluciferina (ácido (2E, 5E) -6- (3,4- di-hidroxifenil) -2-hidroxi-4-oxo-hexa-2,5-dieno) em ácido cafeico. A linha celular foi novamente transformada por biblioteca de plasmídeos linearizados de genes Neonothopanus nambi, que foi obtida na primeira etapa do trabalho. As colônias foram pulverizadas com solução de cafeoilpiruvato, detectando a presença da enzima alvo nas células por ocorrência de luminescência. A luminescência emitida pelas colônias foi detectada por meio de Espectro de IVIS CT (PerkinElmer, EUA). Células que expressam apenas luciferase e hispidina hidroxilase e células de levedura selvagem foram usadas como controle negativo. Durante a triagem da biblioteca, as colônias, onde a luminescência foi detectada, foram selecionadas e usadas para PCR como uma matriz com iniciadores de plasmídeo padrão. Os produtos de PCR foram sequenciados pelo método Sanger para determinar a sequência do gene expresso. A sequência obtida do ácido nucleico da enzima isolada é mostrada na SEQ ID NO: 64. A sequência de aminoácidos codificada por ela é mostrada na SEQ ID NO: 65. A enzima identificada foi chamada de cafeoilpiruvato hidrolase. EXEMPLO 10. IDENTIFICAÇÃO DE HOMOLOGOS HISPIDINA-SINTASE
NEONOTHOPANUS NAMBI E CAFEOILPIRUVATO HIDROLASE NEONOTHOPANUS NAMBI
[448] Dados de sequenciação do genoma total de fungos bioluminescentes, obtidos de acordo com o Exemplo 1, foram usados para pesquisar homólogos de Neonothopanus nambi hispidina-sintase e cafeoilpiruvato hidrolase. A pesquisa de homólogos foi realizada por meio de um software fornecido pelo Centro Nacional para Informação de Biotecnologia. Pesquise por sequências de aminoácidos nos dados de sequenciamento do genoma fúngico no banco de dados NCBI Genbank. Os parâmetros de pesquisa padrão blastp foram usados na pesquisa.
[449] Foram identificadas as sequências de homólogos da hispidina-sintase de Neonothopanus nambi - em Armillaria fuscipes, Armillaria mellea, Guyanagaster necrorhiza, Mycena citricolor, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos. Suas sequências de nucleotídeos e aminoácidos são mostradas na SEQ ID NO 36 - 55. Todas as enzimas identificadas eram substancialmente idênticas umas às outras. O grau de identidade de sequências de aminoácidos é mostrado na Tabela 5. TABELA 5. PERCENTUAL DE IDENTIDADE DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DA PROTEÍNA NATURAL DE HISPIDINA-SINTASE DE COMPRIMENTO COMPLETO.
SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ SEQ
ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID NO: NO: NO: NO: NO: NO: NO: NO: NO: NO: 35 53 43 45 37 41 55 47 49 51 SEQ 100 56 57 56 51 81 57 50 57 57
ID NO: 35 SEQ 56 100 80 52 45 55 88 46 88 88
ID NO: 53 SEQ 57 80 100 52 47 56 83 45 85 86
ID NO: 43 SEQ 56 52 52 100 53 54 52 54 53 53
ID NO: 45 SEQ 51 45 47 53 100 51 46 51 47 47
ID NO: 37 SEQ 81 55 56 54 51 100 55 50 56 56
ID NO: 41 SEQ 57 88 83 52 46 55 100 46 90 91
ID NO: 55 SEQ 50 46 45 54 51 50 46 100 46 46
ID NO: 47 SEQ 57 88 85 53 47 56 90 46 100 95
ID
NO: 49 SEQ 57 88 86 53 47 56 91 46 95 100
ID NO: 51
[450] De Panellus stipticus foram isoladas duas sequências de aminoácidos de hispidina-sintase altamente homólogas caracterizadas por substituição de um único aminoácido. Suas sequências de nucleotídeos e aminoácidos são mostradas em SEQ ID NO 36 - 39.
[451] As enzimas identificadas foram testadas quanto à capacidade de transformar ácido cafeico em hispidina usando a técnica descrita no Exemplo 9.
[452] O alinhamento múltiplo de sequências de aminoácidos de proteínas identificadas permitiu a identificação de vários fragmentos altamente homólogos de sequência de aminoácidos típica deste grupo de enzimas. As sequências de consenso para esses fragmentos são mostradas em SEQ ID NOs: 70 - 77. As referidas sequências são separadas por longas sequências de aminoácidos, como mostrado na Figura 2.
[453] Sequências homólogas de cafeoilpiruvato hidrolase Neonothopanus nambi foram identificadas em Neonothopanus gardneri, Armillaria mellea, Armillaria fuscipes, Armillaria gallica, Armillaria ostoyae. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos dos homólogos identificados são apresentadas em SEQ ID NOs: 66 - 75. As enzimas identificadas foram testadas quanto à capacidade de transformar Cafeoilpiruvato em ácido cafeico usando técnica descrita no exemplo 9.
[454] Todas as enzimas identificadas são substancialmente idênticas umas às outras e têm um comprimento de 280 a 320 aminoácidos. O grau de identidade de sequências de aminoácidos é mostrado na Tabela 6.
TABELA 6. PERCENTUAL DE IDENTIDADE DE SEQUÊNCIAS DE
AMINOÁCIDOS DE PROTEÍNA AMINOÁCIDO DE CAFEOILPIRUVATO HIDROLASE DE COMPRIMENTO COMPLETO.
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO:65 NO:73 NO:75 NO:67 NO:69 NO:71 SEQ ID 100 64 64 64 64 64 NO:65 SEQ ID 64 100 92 62 96 95 NO:73 SEQ ID 64 92 100 62 90 90 NO:75 SEQ ID 64 62 62 100 60 61 NO:67 SEQ ID 64 96 90 60 100 97 NO:69 SEQ ID 64 95 90 61 97 100 NO:71
[455] Análise realizada por meio do software SMART (Simple Modular Architecture Research Tool), disponível na Internet no site http://smart.embl- heidelberg.de [Schultz et al., PNAS 1998; 95: 5857-5864; Letunic I, Doerks T, Bork P Nucleic Acids Res 2014; doi: 10.1093/nar/gku949] revelou que todas as proteínas detectadas compreendem um domínio fumarilacetoacetase (EC
3.7.1.2) de cerca de 200 aminoácidos de comprimento, localizado mais próximo do terminal C, no entanto, a região conservada começa aproximadamente a partir de 8 aminoácidos de acordo com a numeração de aminoácidos de aminoácidos de cafeoilpiruvato hidrolase de Neonothopanus nambi. O alinhamento múltiplo permitiu identificar sequências de consenso (SEQ ID NOs 76 - 78), típicas deste grupo de proteínas, separadas por inserções de aminoácidos com menor identidade. A posição das sequências de consenso é mostrada na (Figura 3). EXEMPLO 11. OBTENÇÃO DE HISPIDINA-SINTASES RECOMBINANTES E
CAFEOILPIRUVATO HIDROLASE E SEU USO PARA OBTER BIOLUMINESCÊNCIA
[456] A sequência de codificação de poli-histidina (His tag) foi operativamente ligada às extremidades 5’ dos ácidos nucleicos que codificam a hispidina-sintase e cafeoilpiruvato hidrolase de Neonothopanus nambi, obtido de acordo com o Exemplo 9, e as estruturas obtidas foram clonadas no vetor pET-23 por meios de endonucleases de restrição NotI e SacI. Os vetores foram utilizados para a transformação de células de Escherichia coli da cepa BL21-DE3-códon +, realizada por eletroporação. As células transformadas foram dispersas em placas de Petri com meio LB, compreendendo 1,5% de ágar, 100 μg/ml de ampicilina e incubadas durante a noite a 37 °C. Em seguida, as colônias de Escherichia coli foram transferidas para 4 ml de meio LB líquido compreendendo 100 μg/ml de ampicilina, incubadas durante a noite a 37 °C com flutuação. 1 ml de cultura durante a noite foi transferido para 200 ml de meio de autoindução expresso durante a noite (Novagen), onde a ampicilina foi preliminarmente adicionada. A cultura foi incubada a 37 °C em 3 horas até atingir densidade óptica de 0,6 OE a 600 nm e, em seguida, foi incubada em temperatura ambiente em 16 horas. Em seguida, as células foram sedimentadas a 4500 rpm em 20 minutos na centrífuga Eppendorf 5810R, ressuspensas em 20 ml do tampão (50 mM de Тris HCl рН 8.0, 150 mM de NaCl), lisadas por ultrassom em Bioruptor (Diagenode, Bélgica) dentro 7 minutos a 0 °C nas condições recomendadas pelo fabricante e novamente peletizado. A proteína foi obtida a partir do lisado por cromatografia de afinidade em resina Talon (Clontech, EUA). A presença do produto recombinante esperado foi confirmada por eletroforese, pois as bandas do comprimento esperado estavam disponíveis.
[457] Alíquotas de proteínas recombinantes isoladas foram usadas para testar a funcionalidade e estabilidade.
[458] Para determinação da funcionalidade da hispidina sintase 30 µl de solução de proteína recombinante isolada foram colocados em um tubo de vidro, compreendendo 100 µl do tampão (0,2 M de Tampão fosfato de Na, 0,5 M de Na2SO4, 0,1 % dodecilmaltosídeo (DDM) pH 8,0, todos os componentes - Sigma- Aldrich, EUA), 0,5 µl de luciferase recombinante purificada de Neonothopanus nambi, obtida de acordo com o Exemplo 4, 1 mM de NADPH (Sigma-Aldrich, EUA), 15 µl de hispidina hidroxilase recombinante purificada de Neonothopanus nambi, obtido de acordo com o Exemplo 4, 10 mM de ATP (ThermoFisher Scientific, EUA), 1 mM de CoA (Sigma-Aldrich, EUA), 1 mM de malonil-CoA (Sigma-Aldrich, EUA). O tubo de vidro foi colocado em um luminômetro GloMax 20/20 (Promega, EUA). As misturas de reação demonstraram bioluminescência com a adição de 20 µM de ácido cafeico à solução (Sigma-Aldrich, EUA). A emissão máxima da luminescência emitida foi de 520 a 535 nm.
[459] Para a determinação da funcionalidade cafeoilpiruvato hidrolase, 10 µl de solução de proteína recombinante isolada foram colocados em um tubo de vidro, compreendendo 100 µl do tampão (0,2 M de Tampão fosfato de Na, 0,5 M de Na2SO4, 0,1 % dodecilmaltosídeo (DDM) pH 8,0, 0,5 µl de luciferase de Neonothopanus nambi, 1 mM de NADPH (Sigma-Aldrich, EUA), 15 µl de hispidina hidroxilase 10 mM de ATP (ThermoFisher Scientific, EUA), 1 mM de CoA (Sigma-Aldrich, EUA), 1 mM de malonil-CoA (Sigma-Aldrich, EUA), 30 µl de sintase de hispidina recombinante purificada. O tubo de vidro foi colocado em um luminômetro GloMax 20/20 (Promega, EUA). A bioluminescência da mistura de reação foi detectada na adição de 25 µM de cafeoilpiruvato na solução, sendo indicativo da capacidade da enzima de teste para decompor Cafeoilpiruvato para ácido cafeico. A emissão máxima da luminescência emitida foi de 520 a 535 nm.
[460] As enzimas obtidas foram utilizadas para a obtenção de luminescência (bioluminescência) em reação com a luciferase de Neonothopanus nambi e a hispidina hidroxilase, obtida de acordo com o Exemplo 4. 5 µl de cada solução de proteína recombinante isolada foram colocados em um tubo de vidro, compreendendo 100 µl de tampão (0,2 M de Tampão fosfato de Na, 0,5 M de Na2SO4, 0,1 % dodecilmaltosídeo (DDM) pH 8,0), 1 mM de NADPH (Sigma-
Aldrich, EUA), 10 mM de ATP (ThermoFisher Scientific, EUA), 1 mM de CoA (Sigma-Aldrich, EUA), 1 mM de malonil-CoA (Sigma-Aldrich, EUA) e 0,2 µM de um de ácidos 3-arilacrílicos: ácido paracoumárico (Sigma-Aldrich, EUA), ácido cinâmico (Sigma-Aldrich, EUA) ou ácido ferúlico (Abcam, EUA). No outro experimento em vez de substituído ácido 3-arilacrílico os análogos de oxiluciferina fúngica - ácidos (2E,5E)-2-hidroxi-6-(4-hidroxifenil)-4-oxo-hexa-2,5- dieno, (2E,5E)-2-hidroxi-4-oxo-6-fenil-hexa-2,5-dieno, ou (2E,5E)-2-hidroxi-6-(4- hidroxi-3-metoxifenil)-4-oxo-hexa-2,5-dieno - também na concentração de 0,2 µM foram colocados em um tubo de vidro. Os tubos de vidro foram colocados em um luminômetro. A atividade das proteínas recombinantes isoladas resultou em luminescência em cada uma das reações descritas. EXEMPLO 13. OBTENDO HISPIDINA DE ÁCIDO CAFEICO
[461] Cassete de expressão, compreendendo ácido nucleico que codifica Neonothopanus nambi hispidina-sintase (SEQ ID NOs 34, 35), sob o controle do promotor J23100, e cassete de expressão, compreendendo o gene NpgA de 4’- fosfopanteteinil transferase de Aspergillus nidulans (SEQ ID NOs 104, 105) sob o controle do promotor araBAD, floxed por regiões de homologia para o sítio SS9, foram obtidas sinteticamente e clonadas no vetor de expressão bacteriana compreendendo cassete de resistência à zeocina. A estrutura obtida foi utilizada para transformação e integração no genoma de BW25113 E. coli por meio de recombinação mediada pela proteína do bacteriófago lambda, conforme descrito em Bassalo et al. [ACS Synth Biol. 15 de julho de 2016; 5 (7):561-8], usando a seleção para resistência à zeocina. A integração da estrutura de comprimento total foi confirmada por PCR de iniciadores específicos para regiões de homologia SS9 e, em seguida, a correção da estrutura integrada foi verificada por sequenciamento do produto de PCR de DNA genômico pelo método de Sanger.
[462] A cepa de E. coli obtida foi usada para a produção de hispidina. Na primeira etapa, as bactérias foram incubadas em cinco tubos de plástico de 50 ml em meio LB dentro de 10 horas a uma flutuação de 200 rpm a 37 °C. 250 ml da cultura obtida foram adicionados a 3,3 litros de meio de fermentação em um fermentador Biostat B5 (Braun, Alemanha) de modo que a densidade óptica da cultura inicial a 600 nm fosse cerca de 0,35. O meio de fermentação compreendia 10 g/l de peptona, 5 g/l de ácido cafeico, 5 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de NaCl, 25 g/l de glicose, 15 g/l de (NH4)2SO4, 2 g/l de KH2PO4, 2 g/l de MgSO4·7 H2O, 14,7 mg/l de CaCl2, 0,1 mg/l de tiamina, 1,8 mg/l e 0,1 % da solução composta por: EDTA de 8 mg/l, CoCl2·6 H2O de 2,5 mg/l, MnCl2·4H2O de 15 mg/l, CuCl2·2H2O de 1,5 mg/l, H3BO3 de 3 mg/l, Na2MoO4·2H2O de 2,5 mg/l, Zn(CH3COO)2·2H2O de 13 mg/l, citrato de ferro (III) 100 mg/l, cloridreto de tiamina 4,5 mg/l. Fermentação foi realizada a 37 °C, com arejamento de 3 l/min e mistura a 200 rpm. Após 25 horas de cultivo, foi adicionada arabinose à cultura até a concentração final de 0,1 mM. O pH foi controlado automaticamente pela adição de NH4O-H, reduzindo pH a 7,0. A solução compreendendo 500 g/l de glicose, 5 g/l de ácido cafeico, 2 g/l de arabinose, 25 g/l de tripton, 50 g/l de extrato de levedura, 17,2 g/l de MgSO4·7H2O, 7,5 g/l de (NH4)SO4, 18 g/l de ácido ascórbico, foram adicionados a um fermentador para manter o nível de glicose sempre que o pH aumentasse para 7,1. Após 56 horas de cultivo, a concentração de hispidina no meio era de 1,23 g/l. O meio fermentador e também a hispidina purificada a partir dele por HPLC foram ativos na reação de bioluminescência com hispidina hidroxilase e luciferase de Neonothopanus nambi. EXEMPLO 13. OBTENDO 3-HIDROXI-HISPIDINA A PARTIR DE ÁCIDO
CAFEICO
[463] Cassete de expressão, compreendendo ácido nucleico que codifica hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs 1, 2) sob controle do promotor J23100, foi obtido sinteticamente e clonado em vetor de expressão bacteriano compreendendo gene de resistência à espectinomicina. O vetor obtido foi transformado em células de E. coli que expressam hispidina-sintase de Neonothopanus nambi, gene de resistência à zeocina e gene NpgA, obtido de acordo com o Exemplo 12. As bactérias obtidas foram utilizadas para produzir 3- hidroxispidina por fermentação de acordo com o protocolo descrito no Exemplo
12, porém com adição de espectinomicina na concentração de 50 mg/ml em todos os meios usados para cultivo. Após 48 horas de cultivo, a concentração de 3-hidroxispidina no meio era de 2,3 g/l. O meio fermentador e também a 3- hidroxi-hispidina purificada a partir dele por HPLC foram ativos na reação de bioluminescência com a luciferase de Neonothopanus nambi. EXEMPLO 14 OBTENDO HISPIDINA A PARTIR DE METABÓLITOS
CELULARES E TIROSINA
[464] A cepa de E. coli, produzindo efetivamente tirosina e ácido cafeico, foi obtida para a produção de hispidina biossintética a partir da tirosina. A cepa de E. coli foi obtida conforme descrito em [Lin e Yan. Microb Cell Fact. 4 de abril de 2012; 11: 42]. A linha de E. coli BW25113 com gene mutante integrado de acY (lacY A177C) permease no sítio attB proporcionando consumo uniforme de arabinose por células de bactérias foi tomada como base para o desenvolvimento da cepa. Cassetes de expressão compreendendo sequências de codificação de genes de tirosina-amônia-liase de Rhodobacter capsulatus (SEQ ID NOs: 106, 107) e os componentes HpaB e HpaC de E. coli 4-hidroxifenil acetato 3-monooxigenase-redutase (SEQ ID NOs: 108 - 111), cada um sob o controle do promotor J23100 constitutivo, foram obtidos sinteticamente e integrados no genoma da cepa de E. coli como descrito no Exemplo 12. Na próxima etapa, o plasmídeo obtido de acordo com o Exemplo 12 e compreendendo a sequência de codificação de hispidina-sintase de Neonothopanus nambi sob o controle do promotor J23100 constitutivo, o cassete de resistência à zeocina do vetor pGAP-Z e também o gene NpgA foram integrados no genoma de E. coli. A integração no genoma de E. coli foi realizada por meio de recombinação mediada pela proteína do bacteriófago lambda de acordo com a técnica de [Bassalo et al., ACS Synth Biol. 2016; 5 (7): 561-568]. A integração da estrutura de comprimento total foi confirmada por PCR a partir de iniciadores específicos para regiões de homologia SS9 (5’- CGGAGCATTTTGCATG-3’ e 5’-TGTAGGATCAAGCTCAG-3’) e, em seguida, a correção da estrutura integrada foi verificada por sequenciamento de DNA genômico Produto de PCR pelo método Sanger. A cepa de bactéria obtida foi usada para produzir hispidina biossintética em um fermentador.
[465] As bactérias foram cultivadas em um fermentador, conforme descrito no Exemplo 12, com a única diferença - o ácido cafeico não foi adicionado ao meio de cultura de bactérias. A hispidina biossintética foi isolada do meio por HPLC. A cepa obtida foi capaz de produzir 1,20 mg/l de hispidina por 50 horas de fermentação. A pureza do produto obtido foi de 97,3 %. A adição de tirosina ao meio de cultura na concentração de 10 g/ml permitiu aumentar a produção de hispidina para 108,3 mg/ml. EXEMPLO 15. DESENVOLVIMENTO DE LEVEDURA AUTÔNOMA
BIOLUMINESCENTE PICHIA PASTORIS
[466] Para o propósito de desenvolvimento autônomo da levedura bioluminescente Pichia pastoris, foram sintetizados cassetes de expressão compreendendo, sob o controle do promotor GAP e do terminador tAOX1, sequências de codificação de luciferase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 79, 80), hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 1, 2), hispidina-sintase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 34, 35), cafeoilpiruvato hidrolase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 64, 65), proteína de NpgA de Aspergillus nidulans (SEQ ID NOs: 104, 105), tirosina- amônia-liase de Rhodobacter capsulatus (SEQ ID NOs: 106, 107), e os componentes de HpaB e HpaC de E. coli 4-hidroxifenil acetato 3- monooxigenase-reductase (SEQ ID NOs: 108 - 111). Cada cassete de expressão foi floxed por sequências de reconhecimento de enzima de restrição BsmBI. Regiões de homologia com o gene MET6 Pichia pastoris (Uniprot F2QTU9), floxed por sítios de enzima de restrição BsmBI, também foram obtidas sinteticamente. O DNA sintético foi tratado por enzimas de restrição BsmBI e combinado em um plasmídeo de acordo com o protocolo de clonagem Golden Gate, descrito em [Iverson et al., ACS Synth Biol. 15 de janeiro de 2016; 5 (1): 99-103]. 10 fmol de cada fragmento de DNA foram misturados na reação compreendendo tampão de força normal para DNA ligase (Promega, EUA), 20 unidades de atividade de DNA ligase (Promega, EUA), 10 unidades de atividade de endonuclease de restrição de DNA em um volume total de 10 µl. A mistura de reação obtida foi colocada em um amplificador e incubada a 16 °C e 37 °C de acordo com o seguinte protocolo: 25 ciclos de incubação a 37 °C dentro de 1,5 min e a 16 °C - 3 min, em seguida, incubação única a 50 °C em 5 min e, em seguida, incubação única a 80 °C em 10 min. 5 µL da mistura de reação foram transformados em células de E. coli quimicamente competentes. A exatidão da montagem de DNA de plasmídeo foi confirmada pelo método de Sanger e o produto de DNA de plasmídeo purificado foi usado para a transformação de células GS11 de Pichia pastoris por eletroporação. A eletroporação foi realizada de acordo com o método, usando acetato de lítio e ditiotreitol, descrito em [Wu e Letchworth, Biotechniques, 2004, 36:152-4]. As células eletroporadas foram dispersas em placas de Petri com meio RDB, compreendendo 1 M de sorbitol, 2 % (p/v) de glicose, 1,34 % (p/v) de base de nitrogênio de levedura (YNB), 0,005 % (p/v) de mistura de aminoácidos, 0,00004 % (p/v) de biotina e 2 % (p/v) de ágar. A integração do cassete do gene no genoma foi confirmada por PCR a partir de iniciadores emparelhados em uma região de homologia. A cepa de levedura obtida compreendendo a inserção de genoma correta foi capaz de iluminar de forma autônoma em contraste com a cepa de levedura selvagem (Figura 7, 8). EXEMPLO 16. DESENVOLVIMENTO DE PLANTAS DE FLORESCÊNCIA
AUTÔNOMA BIOLUMINESCENTES
[467] Para o propósito de desenvolvimento autônomo de plantas com flores bioluminescentes com base no vetor pBI121 (Clontech, EUA), foi criado um vetor binário para transformação de agrobacterium compreendendo sequências de codificação da luciferase de Neonothopanus nambi otimizada para expressão em plantas (SEQ ID NO: 112), hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 103), hispidina-sintase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 113), cafeoilpiruvato hidrolase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 114) e gene de resistência à canamicina, cada gene está sob o controle do promotor
35S vírus do mosaico da couve-flor. As sequências para montagem de cassetes de expressão foram obtidas sinteticamente, o vetor foi montado de acordo com o protocolo de clonagem Golden Gate, descrito em [Iverson et al., ACS Synth Biol. 15 de janeiro de 2016; 5 (1): 99-103].
[468] Arabidopsis thaliana foi transformada por co-cultivo de tecido vegetal com bactérias Agrobacterium tumefaciens da cepa AGL0 [Lazo et al., Biotechnology, outubro de 1991; 9 (10): 963-7], compreendendo o vetor binário criado. A transformação foi realizada usando co-cultivo de segmentos de raiz de Arabidopsis thaliana (ecótipo C24), conforme descrito em [Valvekens et al., 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 85, 5536-5540]. Raízes de Arabidopsis thaliana foram cultivadas em meio Gamborg agarizado B-5 com 20 g/l de glicose, 0,5 g/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético e 0,05 g/l de cinetina dentro de 3 dias. Em seguida, as folhas foram cortadas em pedaços de 0,5 cm de comprimento e transferidas para 10 ml de meio Gamborg líquido B-5 com 20 g/l de glicose, 0,5 g/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético e 0,05 g/l de cinetina em 3 dias. Em seguida, as raízes foram cortadas em pedaços de 0,5 cm de comprimento e transferidas para 10 ml de meio Gamborg líquido B-5 com 20 g/l de glicose, 0,5 g/l de ácido 2,4- diclorofenoxiacético e 0,05 g/l de cinetina e Adicionou-se 1,0 ml de meio de cultura de agrobactérias durante a noite. Explantes com agrobactérias foram co- cultivados em 2 a 3 minutos. Em seguida, os explantes foram colocados em filtros estéreis em placas de Petri com meio agarizado da mesma composição. Após 48 horas de incubação em termostato a 25 °C, os explantes foram transferidos para meio fresco com 500 mg/l de cefotaxima e 50 mg/l de canamicina. Em três semanas, foi iniciada a regeneração das plantas em meio seletivo, contendo 50 mg/l de canamicina. As plantas transgênicas criaram raízes e foram transferidas para o meio de germinação ou solo. A bioluminescência foi visualizada por meio de Sistema de Imageamento In vivo de Espectro IVIS (Perkin Elmer). Mais do que 90 % das plantas transgênicas emitiram luminescência no mínimo em duas ordens de magnitude, excedendo o sinal das plantas do tipo selvagem.
[469] Nicotiana benthamiana foi transformada por co-cultivo de tecido vegetal com bactérias Agrobacterium tumefaciens da cepa AGL0 [Lazo et al., Biotechnology, outubro de 1991; 9 (10): 963-7], compreendendo o vetor binário criado. A transformação foi realizada usando co-cultivo de segmentos de folha Nicotiana benthamiana. Em seguida, as folhas foram cortadas em pedaços de 0,5 cm de comprimento e transferidas para 10 ml de meio Gamborg líquido B-5 com 20 g/l de glicose, 0,5 g/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético e 0,05 g/l de cinetina, e adicionou-se 1,0 ml de meio de cultura de agrobactérias durante a noite. Explantes com agrobactérias foram co-cultivados em 2-3 minutos. Em seguida, os explantes foram colocados em filtros estéreis em placas de Petri com meio agarizado da mesma composição. Após 48 horas de incubação em termostato a 25 °C, os explantes foram transferidos para meio fresco com 500 mg/l de cefotaxima e 50 mg/l de canamicina. Em três semanas, foi iniciada a regeneração das plantas em meio seletivo, contendo 50 mg/l de canamicina. As plantas transgênicas criaram raízes e foram transferidas para o meio de germinação ou solo. A bioluminescência foi visualizada por meio de Sistema de Imageamento In vivo de Espectro IVIS (Perkin Elmer). Mais do que 90 % das plantas transgênicas emitiram luminescência no mínimo em duas ordens de magnitude, excedendo o sinal das plantas do tipo selvagem. Fotos de Nicotiana benthamiana autonomamente luminescente são fornecidas na Figura 9.
[470] Para o propósito de desenvolvimento de Agrostis stolonifera L. autonomamente bioluminescente, foram clonadas no vetor pBI121 (Clontech, EUA) as sequências de codificação dos genes da cascata metabólica da luciferina fúngica, otimizados para expressão em plantas e floxed por sítios de endonuclease de restrição BsaI: luciferase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 126), hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 117), hispidina-sintase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 127), cafeoilpiruvato hidrolase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 128) e gene de resistência ao herbicida glifosato (gene bar). Cada sequência estava sob o controle do promotor CmYLCV [Stavolone et al., Plant Mol Biol. Novembro de 2003; 53 (5):663-73]. As sequências foram sintetizadas de acordo com a técnica padrão. O vetor foi montado de acordo com o protocolo de clonagem Golden Gate. A transformação foi realizada pelo método de transformação embriogênica de callus agrobacterium. Cultura durante a noite de bactérias Agrobacterium tumefaciens da cepa AGL0 [Lazo et al., Biotechnology, Outubro 1991; 9 (10):963-7], compreendendo o vetor binário criado, foi adicionado ao meio líquido. Após dois dias de co-cultivo em meio agarizado Murashige e Skoog, as plantas foram transferidas para meio fresco com 500 mg/l de cefotaxima e 10 mg/l de fosfinotricina. A regeneração da planta começou em três semanas. As plantas transgênicas foram replantadas no meio com metade do conteúdo de sal de Murashige e Skoog e 8 mg/l de fosfinotricina para enraizamento. As plantas enraizadas foram colocadas em uma estufa. Cerca de 25 % das plantas obtidas com integração correta e completa no genoma da cascata metabólica tinham bioluminescência excedendo a bioluminescência de plantas de tipo selvagem de controle.
[471] Organismos capazes de emitir luminescência em certos tecidos ou em certas horas do dia são de especial interesse. Esses organismos consomem os recursos necessários para a luminescência de forma mais eficiente. Para o propósito de desenvolvimento autônomo de rosas bioluminescentes que emitem luminescência apenas nas pétalas, foram selecionadas diversas variedades de rosas com pétalas brancas. Com base no vetor pBI121 (Clontech, EUA), foram criados dois vetores binários para a transformação de agrobacterium compreendendo a cascata metabólica das sequências codificantes da luciferase de Neonothopanus nambi, hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi, hispidina sintase de Neonothopanus nambi, cafeoilpiruvato hidrolase de Neonothopanus nambi e gene de resistência à neomicina, que foram otimizados para expressão em plantas. Todos os genes, exceto o gene da luciferase, foram colocados sob controle do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor. Em um dos vetores o gene da luciferase foi colocado sob controle do promotor da chalcona sintase rosa, e no outro - sob controle do promotor UEP1 da chalcona do crisântemo. Foram usados ácidos nucleicos sintéticos necessários para a montagem do vetor, floxed por sítios de reconhecimento da enzima de restrição BsaI, e o vetor foi montado de acordo com o protocolo de clonagem Golden Gate. Rosa hybrida L. cv. Plantas transgênicas Tinike foram obtidas por co-cultivo de calos embriogênicos com bactérias Agrobacterium tumefaciens da cepa AGL0 [Lazo et al., Biotechnology, outubro 1991; 9 (10):963-7], compreendendo um dos vetores binários acima. O cultivo foi realizado em meio líquido compreendendo macro e micro-sais de Murashige e Skoog, com adição de 1 a 2 mg/l de cinetina, 3 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético e 1 mg/l de 6-benzilaminopurina dentro 40 minutos. O calo foi transferido para meio agarizado com a mesma composição. Em dois dias, os explantes foram transferidos para meio Murashige e Skoog fresco com 500 mg/l de cefotaxima e 50 mg/l de canamicina. A formação e regeneração dos brotos ocorreram em 5 a 8 semanas. Os brotos foram transferidos para meio de propagação ou enraizamento. Os brotos enraizados foram colocados em mistura de turfa numa estufa. A floração foi observada em 8 semanas. As plantas com flores maduras foram visualizadas no Sistema de Imageamento In vivo de Espectro IVIS (Perkin Elmer). Todas as plantas testadas de cada estrutura testada emitiram luminescência, no mínimo, três ordens de magnitude, excedendo o sinal das plantas de tipo selvagem. A luminescência foi emitida apenas a partir de tecidos de pétalas, confirmando o funcionamento específico de tecido de promotores.
[472] Para o propósito desenvolvimento de plantas bioluminescentes autônomas, onde a bioluminescência é controlada por ritmos circadianos e ativada durante a noite, foi usado o vetor binário obtido anteriormente para transformação de agrobacterium compreendendo sequências de codificação de luciferase de Neonothopanus nambi, Neonothopanus nambi, hispidina hidroxilase, Neonothopanus nambi hispidina sintase, cafeoilpiruvato hidrolase de Neonothopanus nambi e gene de resistência à neomicina, e cada gene está sob controle do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor. O promotor da expressão da luciferase de Neonothopanus nambi foi substituído pelo promotor do gene CAT3 de Arabidopsis thaliana.
A transcrição do promotor do gene CAT3 é controlada por ritmos circadianos e ativada à noite.
A sequência do promotor CAT3 é conhecida na técnica [Michael e McClung, Plant Physiol.
Outubro de 2002; 130 (2):627-38]. Arabidopsis thaliana foi transformada por co-cultivo de tecido vegetal com bactérias Agrobacterium tumefaciens da cepa AGL0 [Lazo et al., Biotechnology, outubro de 1991; 9 (10): 963-7], compreendendo o vetor binário criado.
A transformação foi realizada usando co-cultivo de segmentos de raiz de Arabidopsis thaliana (ecótipo C24), conforme descrito em [Valvekens et al., 1988, Proc.
Nat.
Acad.
Sci.
EUA 85, 5536-5540]. Raízes de Arabidopsis thaliana foram cultivadas em meio Gamborg agarizado B-5 com 20 g/l de glicose, 0,5 g/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético e 0,05 g/l de cinetina em 3 dias.
Em seguida, as raízes foram cortadas em pedaços de 0,5 cm de comprimento e transferidas para 10 ml de meio Gamborg líquido B-5 com 20 g/l de glicose, 0,5 g/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético e 0,05 g/l de cinetina, e adicionou-se 1,0 ml de meio de cultura de agrobactérias durante a noite.
Explantes com agrobactérias foram co-cultivados em 2-3 minutos.
Em seguida, os explantes foram colocados em filtros estéreis em placas de Petri com meio agarizado da mesma composição.
Após 48 horas de incubação em termostato a 25 °C, os explantes foram transferidos para meio fresco com 500 mg/l de cefotaxima e 50 mg/l de canamicina.
Em três semanas, foi iniciada a regeneração das plantas em meio seletivo, contendo 50 mg/l de canamicina.
As plantas transgênicas criaram raízes e foram transferidas para o meio de germinação, foram cultivadas em condições naturais de ciclo dia-noite.
A bioluminescência foi visualizada por meio de Sistema de Imageamento In vivo de Espectro IVIS (Perkin Elmer), colocando as plantas no instrumento por 24 horas e registrando a intensidade da bioluminescência a cada meia hora.
As plantas emitiram luminescência dentro de 24 horas, no entanto, a intensidade da bioluminescência foi significativamente modulada pelos ritmos circadianos: a intensidade luminosa integral à noite excedeu a luminosidade integral durante o dia mais de 1.000 vezes para 85% das plantas testadas.
EXEMPLO 17. DESENVOLVIMENTO DE PLANTAS INFERIORES
TRANSGÊNICAS AUTONOMOSAMENTE BIOLUMINESCENTES
[473] Musgo autonomamente bioluminescente Physcomitrella patens foi desenvolvido por co-transformação de protoplastos com plasmídeos usando o método descrito no Exemplo 8. Foram obtidos cassetes de expressão obtidos sinteticamente, incluindo, otimizados para expressão em plantas, sequências de codificação de luciferase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 112), hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 103), hispidina-sintase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 113), cafeoilpiruvato hidrolase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 114) e gene de resistência à canamicina, cada um está sob o controle do promotor da actina 2 do arroz. Os cassetes de expressão foram reticulados operacionalmente no vetor pBI121 (Clontech, CШA) de tal forma que a estrutura incluindo a cascata metabólica completa e o gene de resistência à canamicina foram floxed por sequências coincidentes com a sequência do locus alvo do genoma do musgo. O vetor foi montado de acordo com o protocolo de clonagem Golden Gate Golden Gate [Iverson et al., ACS Synth Biol. 15 de janeiro de 2016; 5 (1):99-103]. O gene do RNA guia, complementar à região alvo do genoma do musgo, também foi clonado no vetor. O plasmídeo com os genes especificados foi co-transformado com o plasmídeo para a expressão constitutiva da nuclease Cas9 de acordo com o protocolo de transformação de polietilenoglicol descrito em [Cove et al., Cold Spring Harb Protoc., 2009, 2]. Os protoplastos transformados obtidos foram incubados no escuro em 24 horas em meio BG-11, e então transferidos para placas de Petri com meio BG-11 e ágar 8,5 %. A visualização no Sistema de Imageamento In vivo de Espectro IVIS (Perkin Elmer) foi realizada um mês após o cultivo em placas de Petri com iluminação contínua. 70 % das plantas testadas emitiram luminescência excedendo o sinal das plantas do tipo selvagem no mínimo em uma ordem de magnitude. EXEMPLO 18. DESENVOLVIMENTO DE ANIMAIS LUMINESCENTES
TRANSGÊNICOS
[474] Peixes transgênicos Danio rerio, compreendendo o gene da hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi foram criados de acordo com a técnica descrita em [Hisano et al., Sci Rep., 2015, 5:8841]. A técnica inclui a expressão de RNA guia e nuclease Cas9 para fazer um ponto de interrupção na região homóloga à sequência de RNA guia. Para o propósito de desenvolvimento de animais transgênicos, foram ordenados fragmentos de DNA sintético compreendendo sequências de RNA guia do plasmídeo pX330, Addgene # 42230 e mRNA da nuclease Cas9 sob controle do promotor da polimerase T7 do bacteriófago. Os fragmentos obtidos foram utilizados para transcrição in vitro por meio de reagentes do kit MAXIscript T7 (Life Technologies, EUA), e o RNA sintetizado foi purificado por meio do kit de isolamento de DNA (Evrogen, Rússia).
[475] A sequência de codificação de hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi floxed por sequências de 50 nucleotídeos do gene krtt1c19e Danio rerio, descrito em [Hisano et al., Sci Rep., 2015, 5:8841], foi obtido sinteticamente e clonado em pEGFP/C1 base de plasmídeo compreendendo origem pUC e cassete de resistência à canamicina. O vetor obtido, mRNA de nuclease Cas9 e RNA guia foram dissolvidos em tampão de injeção (HEPES 40 mM (pH 7,4), 240 mM de KCl com adição de 0,5 % de vermelho de fenol) e injetados em 1 a 2 embriões de células do Danio rerio obtido anteriormente linha, expressando estavelmente a luciferase de Neonothopanus nambi, no volume de cerca de 1 a 2 nl. Cerca de 12 dos 48 embriões sobreviveram à injeção e demonstraram desenvolvimento normal no quarto dia após a fertilização.
[476] A solução de hispidina foi injetada por via intravenosa nas larvas de Danio rerio para registrar o sinal bioluminescente de acordo com a técnica descrita em [Cosentino et al., J Vis Exp. 2010; (42): 2079]. A bioluminescência foi registrada por meio de Sistema de Imageamento In vivo de Espectro IVIS (Perkin Elmer). Após o registro, o DNA genômico foi isolado de larvas para confirmar a integração da hispidina hidroxilase no genoma. Todas as larvas com integração correta do gene da hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi no genoma demonstraram intensidade de bioluminescência mínima em duas ordens de magnitude, excedendo o sinal de saída de peixes selvagens após a injeção de solução de hispidina. EXEMPLO 19. ESTUDO DO EFEITO DE CAFEOILPIRUVATO HIDROLASE
NA LUMINESCÊNCIA DE ORGANISMOS AUTÔNOMOS BIOLUMINESCENTES
[477] Para o propósito de estudar o efeito da cafeoilpiruvato hidrolase na luminescência de organismos autonomamente bioluminescentes, foi usado um vetor binário para a transformação de agrobacterium compreendendo sequências codificadoras de luciferase de Neonothopanus nambi, hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi, hispidina sintase de Neonothopanus nambi, cafeoilpiruvato hidrolase de Neonothopanus nambi e gene de resistência à canamicina, e cada gene está sob o controle do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor, obtido de acordo com o Exemplo 16, e o vetor de controle caracterizado pela sequência de cafeoilpiruvato hidrolase ter sido removida dele. Os vetores foram utilizados para a transformação de Arabidopsis thaliana nas mesmas condições de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 16. A bioluminescência foi visualizada por meio de Sistema de Imageamento In vivo de Espectro IVIS (Perkin Elmer). A comparação das intensidades de bioluminescência das plantas que expressam todos os quatro genes do sistema bioluminescente de Neonothopanus nambi com as plantas que expressam apenas luciferase, hispidina hidroxilase e hispidina sintase, revelou que as plantas que expressam adicionalmente cafeoilpiruvato hidrolase têm em média 8,3 vezes mais bioluminescência brilhante. Os dados fornecidos indicam que a expressão de cafeoilpiruvato hidrolase permite aumentar a eficiência da cascata bioluminescente, o que resulta no aumento da intensidade da luminescência emitida pelas plantas. EXEMPLO 20. EFEITO DA ADIÇÃO EXTERNA DE ÁCIDO CAFEICO NA
BIOLUMINESCÊNCIA DE ORGANISMO TRANSGÊNICO
[478] Plantas transgênicas autonomamente bioluminescentes Nicotiana benthamiana, obtidas de acordo com o Exemplo 16, foram transferidas para o solo e cultivadas em oito semanas. Em seguida, o caule da planta foi cortado e colocado em água por duas horas, após isso, a intensidade da bioluminescência foi medida pelo Sistema de Imageamento In vivo de Espectro IVIS (Perkin Elmer). Em seguida, as plantas foram transferidas para uma das cinco soluções de água na concentração de ácido cafeico de 0,4 g/l, 0,8 g/l, 1,6 g/l, 3,2 g/l ou 6,4 g/l, e as plantas de controle foram colocadas na água. Após mais duas horas de incubação na solução de ácido cafeico ou em água, a intensidade da bioluminescência foi medida novamente. Em todos os casos, a intensidade de bioluminescência das plantas incubadas em solução de ácido cafeico aumentou em comparação com a intensidade antes da colocação na solução de ácido cafeico, e as maiores mudanças foram observadas em plantas incubadas na solução a uma concentração de 6,4 g/l. As plantas de controle incubadas em água não demonstraram mudança significativa na intensidade da bioluminescência dentro de quatro horas após o início da incubação. EXEMPLO 21. USO DE GENES DO SISTEMA BIOLUMINESCENTE DE
FUNGOS PARA ENSAIO DE ATIVIDADE DE PROMOTORES E INTEGRAÇÃO LÓGICA INTRACELULAR DE SINAIS EXTERNOS.
[479] Sequências de codificação de Neonothopanus nambi hispidina hidroxilase, hispidina sintase e luciferase foram usadas para monitorar a ativação simultânea de vários promotores. Cassetes de expressão sintética compreendendo a sequência de codificação de hispidina-sintase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 34, 35) sob controle do promotor araBAD de E. coli induzido por arabinose, sequência de codificação de hispidina hidroxilase (SEQ ID NOs 1, 2) sob controle de promotor T7/lacO induzido por IPTG e gene da luciferase (SEQ ID NOs: 79, 80) sob o controle do promotor pRha induzido por ramnose, e também o gene NpgA (SEQ ID NOs: 104, 105) sob o controle do promotor constitutivo J23100 (Registro de Partes biológicas padrão, parte: BBa_J23100). Os ácidos nucleicos sintéticos obtidos foram clonados no vetor MoClo_Level2 [Weber et al., PLoS One. 18 de fevereiro de
2011; 6 (2): e16765] em vez da inserção que compreende o gene LacZ, usando a endonuclease de restrição BpiI. O vetor obtido foi transformado em células competentes da cepa E.coli BL21 (NEB, EUA) compreendendo cópia genômica da polimerase do bacteriófago T7.
[480] Com o propósito de determinar a possibilidade de registrar a ativação simultânea de vários promotores, as células obtidas na etapa anterior foram cultivadas em uma noite em um frasco com 100 ml de meio LB com adição de ampicilina na concentração de 100 mg/l. No dia seguinte, as alíquotas de cultura de células foram colocadas por 120 minutos a 24 °C e 200 rpm em um dos meios com a seguinte composição:
[481] 1. Meio LB com adição de 1 % de arabinose,
[482] 2. Meio LB com adição de 0,2 % de rhamnose,
[483] 3. Meio LB com adição de 0,5 % de IPTG,
[484] 4. Meio LB com adição de 1 % de arabinose e 0,2 % de rhamnose,
[485] 5. Meio LB com adição de 1 % de arabinose e 0,5 % de IPTG,
[486] 6. Meio LB com adição de 0,2 % de rhamnose e 0,5 % de IPTG,
[487] 7. Meio LB com adição de 1 % de arabinose, 0,2 % de rhamnose e 0,5 % de IPTG,
[488] 8. Meio LB (controle).
[489] Após a incubação, as células foram sedimentadas, o meio foi substituído por solução salina tamponada com fosfato com pH 7,4 (Sigma-Aldrich, EUA) com adição de ácido cafeico (Sigma-Aldrich, EUA) na concentração de 1 g/l, o as células foram ressuspensas por pipetagem. A bioluminescência celular foi analisada em meia hora por meio do luminômetro GloMax 20/20 (Promega, EUA). A experiência foi repetida em triplicado. De oito amostras testadas, a intensidade da bioluminescência foi significativamente diferente da bioluminescência das bactérias de teste incubadas em meio LB (meio nº 8) apenas para bactérias incubadas no meio nº 7 (meio LB com adição de 1 % de arabinose, 0,2 % de ramnose e 0,5 % de IPTG). Portanto, a luminescência da bactéria foi indicativa de colocar a bactéria no meio garantindo a ativação simultânea de três promotores diferentes. Neste experimento, as células da bactéria integraram informações sobre a presença de substâncias, induzindo a atividade do promotor em meio externo e sinalizado por luminescência apenas quando todas as três substâncias estavam presentes no meio simultaneamente, realizando a operação lógica “AND” intracelularmente.
[490] Cassetes de expressão sintética compreendendo (1) sequência de codificação de hispidina hidroxilase (SEQ ID NOs: 1, 2) sob controle do promotor Odf2 de acordo com [Pletz et al., Biochim Biophys Acta. Junho de 2013; 1833 (6): 1338-46]; (2) sequência de codificação da hispidina-sintase (SEQ ID NOs: 34, 35) sob o controle do promotor CDK7 da quinase dependente de ciclina; (3) luciferases (SEQ ID NOs: 79, 80) sob controle do promotor do gene CCNH foram clonadas no vetor pmKate2-queratina (Evrogen, Rússia) em vez de sequências do promotor citomegaloviral abd inserção de queratina mKate2. Além disso, a sequência de codificação do gene NpgA (SEQ ID NOs: 104, 105) foi clonada no vetor pmKate2-queratina em vez da sequência de inserção de mKate2- queratina. Todos os vetores obtidos foram co-transfectados em células HEK293T pelo agente de transfecção FuGENE HD (Promega, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. 24 horas após a transfecção, ácido cafeico na concentração de 5 mg/ml foi adicionado ao meio e a luminescência celular foi detectada por meio do microscópio Leica TCS SP8. A luminescência permitiu identificar a ativação simultânea dos promotores Odf2, CCNH e CDK7, estando a intensidade da luminescência relacionada ao estágio do ciclo celular.
[491] Os dados obtidos indicam que genes do sistema bioluminescente de fungos podem ser usados para monitorar a ativação simultânea de vários promotores, para detectar a presença de diferentes substâncias e suas combinações no meio, e também para integração lógica intracelular de sinais externos. EXEMPLO 22. IDENTIFICAÇÃO DE HISPIDINA EM EXTRATOS DE PLANTA
[492] As sequências de codificação de Neonothopanus nambi hispidina hidroxilase e luciferase, obtidas de acordo com o Exemplo 1, foram clonadas no vetor pET23 sob controle do promotor T7. Produtos de DNA de plasmídeo purificado foram usados para transcrição e tradução de proteínas in vitro por meio Kit de Síntese de Proteína In vitro PURExpress (NEB, EUA). A mistura de reação obtida foi utilizada para análise da presença e concentração de hispidina e seus análogos funcionais em lisados de cerca de 19 plantas diferentes (Chrysanthemum sp., Ananas comosus, Petunia atkinsiana, Picea abies, Urtica dioica, Solanum lycopersicum, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tobacum, Arabidopsis thaliana, Rosa glauca, Rosa rubiginosa, Equisetum arvense, Equisetum telmateia, Poligala sabulosa, Rosa rugosa, Clematis tashiroi, Kalanchoe sp., Triticum aestivum, Dianthus caryophyllus) adicionando 2 μl de lisado de planta e 100 μl da mistura de reação à mistura de 100 μl registro da intensidade da luminescência pelo luminômetro GloMax (Promega, EUA). Foi determinado que a concentração máxima de hispidina e seus análogos funcionais está em lisados de Equisetum arvense e Equisetum telmateia. Hispidina ou seus análogos funcionais também foram identificados em lisados de Polygala sabulosa, Rosa rugosa e Clematis tashiroi. EXEMPLO 23. IDENTIFICAÇÃO DE PKS CAPAZ DE CATALIZAR A SÍNTESE
DE HISPIDINA E SEU USO PARA A PRODUÇÃO DE HISPIDINA IN VITRO E IN VIVO.
[493] Os precursores de luciferina fúngica, como a hispidina, se relacionam a um grupo de derivados policetídeos. É conhecido na técnica que as enzimas envolvidas na síntese de policetídeo em plantas se relacionam com a superfamília de proteínas de policetídeo sintase e sintases de policetídeo de planta, em contraste com o policetídeo de sintase fúngica, são proteínas comparativamente compactas usando éteres CoA de ácidos, incluindo ácidos 3- arilacrílicos. Nenhuma policetídeo sintase, capaz de catalisar a transformação do éter CoA do ácido cafeico em hispidina, foi conhecida na técnica, no entanto, a hispidina está presente em muitos organismos vegetais.
[494] Usando a análise de bioinformática, foram selecionadas 11 sintases de policetídeos potencialmente capazes de catalisar a síntese a partir de hispidina a partir das seguintes fontes:
[495] Aquilaria sinensis (2 enzimas),
[496] Hydrangea macrophylla,
[497] Arabidopsis thaliana,
[498] Physcomitrella patens,
[499] Poligonum cuspidatum,
[500] Rheum palmatum,
[501] Rheum tataricum,
[502] Wachendorfia thyrsiflora,
[503] Piper methysticum (duas enzimas).
[504] As sequências de nucleotídeos selecionadas para expressão em células de levedura de Pichia pastoris e células vegetais de Nicotiana benthamiana foram otimizadas. Os ácidos nucleicos resultantes foram obtidos sinteticamente e clonados no vetor pGAPZ e usados para verificar a capacidade das proteínas expressas de sintetizar hispidina.
[505] Para este propósito, no genoma da linha de levedura de Pichia pastoris GS115, expressando constitutivamente a luciferase de Neonothopanus nambi e a hispidina hidroxilase, obtida de acordo com o Exemplo 1, foi introduzido adicionalmente o plasmídeo pGAPZ, compreendendo o gene da ligase 1 de cumarato-CoA de Arabidopsis thaliana (que A sequência de nucleotídeos e de aminoácidos são mostradas em SEQ ID NOs: 140, 141), também obtidas por síntese de oligonucleotídeos. O plasmídeo foi linearizado no sítio de restrição AvrII e usado para transformação em células GS115 de Pichia pastoris.
[506] As células de levedura obtidas, expressando constitutivamente a luciferase de Neonothopanus nambi e a hispidina hidroxilase e a ligase de cumarato-CoA 1 de Arabidopsis thaliana, foram linearizadas por plasmídeos compreendendo sequências de codificação de PKS e dispersas em placas de Petri com meio RDB, compreendendo 1 M de sorbitol, 2 % (peso/volume) de glicose, 1,34 % (peso/volume) de base de nitrogênio de levedura (YNB), 0,005 % (peso/volume) de mistura de aminoácidos, 0,00004 % (peso/volume) de biotina e 2 % (peso/volume) de ágar. Para identificar enzimas com atividade de hispidina-sintase, as colônias obtidas foram pulverizadas com solução de ácido cafeico, detectando a presença de hispidina-sintase nas células por ocorrência de luminescência. A luminescência emitida pelas colônias foi detectada por meio de Espectro de IVIS CT (PerkinElmer, EUA). Linha de levedura expressando constitutivamente luciferase, hispidina hidroxilase e ligase de cumarato-CoA 1, e também células de levedura selvagem foram utilizadas como controle negativo. Dos genes testados, 11 enzimas tinham atividade de hispidina-sintase e sua sequência é mostrada em SEQ ID NOs: 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138. As sequências de aminoácidos codificadas até então são mostradas em SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139 respectivamente. A atividade mais elevada foi demonstrada por enzimas de PKS1 e PKS2 de Aquilaria sinensis (SEQ ID NOs: 119, 121), PKS de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 123) e PKS de Hydrangea macrophylla (SEQ ID NO:125).
[507] O ácido nucleico que codifica PKS de Hydrangea macrophylla (SEQ ID NOs: 124, 125) foi usado para a produção de proteína recombinante de acordo com a técnica descrita no Exemplo 4. A presença do produto recombinante esperado foi confirmada por eletroforese como bandas do comprimento esperado estavam disponíveis. Alíquotas da proteína recombinante isolada foram usadas para verificar a funcionalidade de: 30 µl de solução de proteína recombinante isolada foram colocados em um tubo de vidro, compreendendo 100 µl do tampão (0,2 M de Tampão fosfato de Na, 0,5 M de Na2SO4, 0,1 % de dodecilmaltosídeo (DDM) pH 8,0, todos os componentes - Sigma-Aldrich, EUA), 0,5 µl de luciferase recombinante purificada de Neonothopanus nambi, obtida de acordo com o Exemplo 4, 1 mM de NADPH (Sigma-Aldrich, EUA), 15 µl de hispidina hidroxilase recombinante purificada de Neonothopanus nambi, obtida de acordo com o Exemplo 4, 10 mM de ATP (ThermoFisher Scientific, EUA), 1 mM de CoA (Sigma-Aldrich, EUA), 1 mM de malonil-CoA (Sigma-Aldrich, EUA). O tubo de vidro foi colocado em um luminômetro GloMax 20/20 (Promega, EUA). As misturas de reação demonstraram bioluminescência na adição de 20 µM de cafeoil-CoA à solução. A emissão máxima da luminescência emitida foi de 520 a 535 nm.
[508] O ácido nucleico que codifica PKS2 de Aquilaria sinensis (SEQ ID NO: 120, 121) foi usado para produzir a cepa produtora de hispidina. Para este propósito, foram sintetizados o cassete de expressão compreendendo o ácido nucleico SEQ ID NO: 120 sob o controle do promotor J23100 constitutivo, e o cassete de expressão compreendendo o ácido nucleico SEQ ID NO: 140, codificando ligase de 4-cumarato-CoA 1 de Arabidopsis thaliana sob controle do promotor araBAD; os cassetes de expressão de bothe foram floxed por regiões de homologia para o sítio SS9. Os cassetes de expressão foram clonados em vetor de expressão bacteriana, compreendendo cassete de resistência à zeocina, e foram usados para transformação e integração no genoma de E. coli BW25113 por meio de recombinação mediada por proteína de bacteriófago lambda, conforme descrito em Bassalo et al. [ACS Synth Biol. 15 de julho de 2016; 5 (7): 561-8], usando a seleção para resistência à zeocina. A integração da estrutura de comprimento total foi confirmada por PCR a partir de iniciadores específicos para regiões de homologia SS9 e, em seguida, a exatidão da estrutura integrada foi verificada por sequenciamento do produto de PCR de DNA genômico pelo método Sanger.
[509] A cepa de E. coli obtida foi usada para a produção de hispidina. No primeiro passo, as bactérias foram incubadas em cinco tubos de plástico de 50 ml em meio LB dentro de 10 horas a uma flutuação de 200 rpm a 37 °C. 250 ml da cultura obtida foram adicionados a 3,3 litros de meio de fermentação em um fermentador Biostat B5 (Braun, Alemanha) de modo que a densidade óptica da cultura inicial a 600 nm fosse cerca de 0,35. O meio de fermentação compreendia 10 g/l de peptona, 5 g/l de ácido cafeico, 5 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de NaCl, 25 g/l de glicose, 15 g/l de (NH4)2SO4, 2 g/l de KH2PO4, 2 g/l de MgSO4·7 H2O, 14,7 mg/l de CaCl2, 0,1 mg/l de tiamina, 1,8 mg/l e 0,1 % da solução composta de: 8 mg/l de EDTA, 2,5 mg/l de CoCl2·6 H2O, 15 mg/l de MnCl2·4H2O, 1,5 mg/l de CuCl2·2H2O, 3 mg/l de H3BO3, 2,5 mg/l de
Na2MoO4·2H2O, 13 mg/l de Zn(CH3COO)2·2H2O, 100 mg/l de citrato de ferro (III), cloridreto de tiamina 4,5 mg/l. A fermentação foi realizada a 37 °C, com arejamento de 3 l/min e mistura a 200 rpm. Após 25 horas de cultivo, foi adicionada arabinose à cultura até a concentração final de 0,1 mM. O pH foi controlado automaticamente pela adição de NH4O-H, reduzindo o pH a 7,0. A solução compreendendo 500 g/l de glicose, 5 g/l de ácido cafeico, 2 g/l de arabinose, 25 g/l de tripton, 50 g/l de extrato de levedura, 17,2 g/l de MgSO4·7H2O, 7,5 g/l de (NH4)SO4, 18 g/l de ácido ascórbico, foi adicionado a um fermentador para manter o nível de glicose sempre que O pH aumentou para 7,1. Após 56 horas de cultivo, a concentração de hispidina no meio era de 3,48 g/l. O meio fermentador e também a hispidina purificada a partir dele por HPLC foram ativos na reação de bioluminescência com hispidina hidroxilase e luciferase de Neonothopanus nambi, obtida de acordo com o Exemplo 4.
[510] Para o propósito de desenvolvimento autônomo da levedura bioluminescente Pichia pastoris, foram usados cassetes de expressão compreendendo, sob o controle do promotor GAP e do terminador tAOX1, sequências de codificação de luciferase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 79, 80), hispidina hidroxilase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 1, 2), hispidina-sintase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 34, 35), cafeoilpiruvato hidrolase de Neonothopanus nambi (SEQ ID NOs: 64, 65), tirosina-amônia-liase Rhodobacter capsulatus (SEQ ID NOs: 106, 107), e os componentes de HpaB e HpaC de E. coli 4-hidroxifenil acetato 3- monooxigenase-reductase (SEQ ID NOs: 108 - 111), obtido de acordo com Exemplo 15, e também foram sintetizados cassetes de expressão semelhantes compreendendo sequências de codificação de ligase de 4-cumarato-CoA 1 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NOs: 140, 141) e três PKS: de Aquilaria sinensis (SEQ ID NOs:120, 121), PKS de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NOs: 122, 123) e PKS de Hydrangea macrophylla (SEQ ID NO: 124, 125). Cada cassete de expressão foi floxed por sequências de reconhecimento de enzima de restrição BsmBI. Regiões de homologia com o gene MET6 Pichia pastoris (Uniprot
F2QTU9), floxed por sítios de enzima de restrição BsmBI, também foram obtidas sinteticamente. O DNA sintético foi tratado por enzimas de restrição BsmBI e combinado em um plasmídeo de acordo com o protocolo de clonagem Golden Gate, descrito em [Iverson et al., ACS Synth Biol. 15 de janeiro de 2016; 5 (1):)styril 99-103]. Foram produzidos três plasmídeos diferentes em PKS em sua composição. Os plasmídeos obtidos foram usados para produzir leveduras transgênicas Pichia pastoris de acordo com a técnica descrita no Exemplo 15. A integração do cassete do gene no genoma foi confirmada por PCR a partir de iniciadores emparelhados em uma região de homologia. Todas as três cepas de levedura obtidas compreendendo a inserção de genoma correta foram capazes de iluminar de forma autônoma em contraste com a cepa de levedura selvagem.
[511] Para o desenvolvimento de plantas com flores bioluminescentes autônomas com base no vetor pBI121 (Clontech, EUA), foi criado um conjunto de vetores binários para transformação de Agrobacterium compreendendo sequências de codificação de luciferase de Neonothopanus nambi otimizada para expressão em plantas (SEQ ID NO: 112), hispidina hidroxilase Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 103), cafeoilpiruvato hidrolase Neonothopanus nambi (SEQ ID NO: 114), gene de resistência à canamicina e PKS (SEQ ID NOs: 122, 123), cada gene está sob o controle do promotor 35S de vírus do mosaico da couve-flor. As sequências para montagem de cassetes de expressão foram obtidas sinteticamente, o vetor foi montado de acordo com o protocolo de clonagem Golden Gate, descrito em [Iverson et al., ACS Synth Biol. 15 de janeiro de 2016; 5 (1):99-103]. Nicotiana tabacum foi transformada por co-cultivo de tecido vegetal com bactérias Agrobacterium tumefaciens da cepa AGL0 [Lazo et al., Biotechnology, outubro de 1991; 9 (10): 963-7], compreendendo o vetor binário criado. A transformação foi realizada usando co- cultivo de segmentos de folhas de Nicotiana tabacum. Em seguida, as folhas foram cortadas em pedaços de 0,5 cm de comprimento e transferidas para 10 ml de meio Gamborg líquido B-5 com 20 g/l de glicose, 0,5 g/l de ácido 2,4- diclorofenoxiacético e 0,05 g/l de cinetina, e adicionou-se 1,0 ml de meio de cultura de agrobactérias durante a noite. Explantes com agrobactérias foram co- cultivados em 2-3 minutos. Em seguida, os explantes foram colocados em filtros estéreis em placas de Petri com meio agarizado da mesma composição. Após 48 horas de incubação em termostato a 25 °C, os explantes foram transferidos para meio fresco com 500 mg/l de cefotaxima e 50 mg/l de canamicina. Em três semanas, foi iniciada a regeneração das plantas em meio seletivo, contendo 50 mg/l de canamicina. As plantas transgênicas criaram raízes e foram transferidas para o meio de germinação ou solo. A bioluminescência foi visualizada por meio do Sistema de Imageamento in vivo de Espectro IVIS (Perkin Elmer). Mais do que a % das plantas transgênicas emitiram luminescência, no mínimo, três ordens de magnitude, excedendo o sinal das plantas selvagens. EXEMPLO 24. COMBINAÇÕES DE ÁCIDO NUCLEICO COMBINAÇÃO 1:
[512] Composição: (a) Ácido nucleico que codifica hispidina hidroxilase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28; e (b) Ácido nucleico que codifica luciferase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98.
[513] A combinação pode ser usada para obter bioluminescência em sistemas de expressão in vitro ou in vivo na presença de uma substância selecionada a partir do grupo de 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-onas, tendo a fórmula estrutural ,
[514] onde substituinte na posição 6 é 2-arilvinila ou 2-heteroarilvinila substituinte (R-CH=CH-), incluindo 2-(3,4-di-hidroxistiril), 2-(4-hidroxistiril), 2-(4- (dietilamino)estiril), 2-(2-(1H-indol-3-il)vinil), 2-(2-(1,2,3,5,6,7-hexa- hidropirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il)vinil), 2-(6-hidroxinaftaleno-2-il)vinila.
[515] A dita combinação também pode ser usada no estudo da dependência de dois promotores em sistemas de expressão heterólogos.
[516] A dita combinação também pode ser usada para identificar hispidina e seus análogos em objetos biológicos.
[517] A dita combinação também pode ser usada para marcação de célula por bioluminescência que ocorre na presença de hispidina e seus análogos funcionais. COMBINAÇÃO 2:
[518] Composição: (a) Ácido nucleico que codifica hispidina hidroxilase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28; e (b) Ácido nucleico que codifica hispidina-sintase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55.
[519] A combinação pode ser usada para produzir luciferina fúngica em sistemas de expressão in vitro ou in vivo de uma substância selecionada a partir de ácido acrílico substituído com a fórmula estrutural
[520] , onde R é arila ou heteroarila (por exemplo, a partir de ácido cafeico). COMBINAÇÃO 3:
[521] Inclui todos os componentes especificados na Combinação 2, e também ácido nucleico que codifica luciferase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98.
[522] A combinação pode ser usada para obter bioluminescência em sistemas de expressão in vitro ou in vivo na presença de uma substância selecionada a partir de ácido acrílico substituído com a fórmula estrutural
[523] , onde R é arila ou heteroarila.
[524] A combinação pode ser usada para produzir células bioluminescentes e organismos transgênicos. A dita combinação também pode ser usada no estudo da dependência de três promotores em sistemas de expressão heterólogos. COMBINAÇÃO 4:
[525] Inclui todos os componentes especificados na Combinação 3, e também ácido nucleico que codifica cafeoilpiruvato hidrolase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73,
75.
[526] A combinação pode ser usada para produzir células bioluminescentes e organismos transgênicos. COMBINAÇÃO 5:
[527] Composição: (a) Ácido nucleico que codifica hispidina-sintase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55; e (b) Ácido nucleico que codifica gene de 4’-fosfopanteteinil transferase, cuja sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 105
[528] A combinação pode ser usada para produzir hispidina a partir de ácido cafeico em sistemas de expressão in vitro e in vivo. COMBINAÇÃO 6:
[529] Composição: (a) Ácido nucleico que codifica hispidina-sintase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55; (b) Ácido nucleico que codifica gene de 4’- fosfopanteteinil transferase, cuja sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 105; e (c) ácidos nucleicos que codificam enzimas de biossíntese de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural
[530] , onde R é arila ou heteroarila de metabólitos celulares (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam tirosina-amônia-liase e os componentes de HpaB e HpaC de 4-hidroxifenil acetato 3-monooxigenase- reductase).
[531] A combinação pode ser usada para produzir hispidina a partir de tirosina em sistemas de expressão in vitro e in vivo.
[532] Combinações 2 a 4 também podem incluir a sequência de codificação do gene NpgA de 4’-fosfopanteteinil transferase (SEQ ID NOs: 104, 105) ou outra enzima que demonstra a mesma atividade. COMBINAÇÃO 7:
[533] Composição: (a) Ácido nucleico que codifica hispidina hidroxilase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28; e (b) Ácido nucleico que codifica PKS, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139.
[534] A combinação pode ser usada para produzir 3-hidroxi-hispidina a partir de cafeoil-CoA em sistemas de expressão in vitro ou in vivo. COMBINAÇÃO 8:
[535] Inclui todos os componentes especificados na Combinação 7, e também ácido nucleico que codifica luciferase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98. A combinação pode ser usada para obter bioluminescência in vitro ou in vivo na presença de cafeoil-CoA. COMBINAÇÃO 9:
[536] Inclui todos os componentes especificados na Combinação 8, e também ácido nucleico que codifica cafeoilpiruvato hidrolase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73,
75.
[537] A combinação pode ser usada para produzir células bioluminescentes e organismos transgênicos. COMBINAÇÃO 10:
[538] Composição: (a) Ácido nucleico que codifica PKS, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139; e (b) Ácido nucleico que codifica ligase de 4- cumarato-CoA 1 a partir de Arabidopsis thaliana, cuja sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 141.
[539] A combinação pode ser usada para produzir hispidina a partir de ácido cafeico em sistemas de expressão in vitro e in vivo. COMBINAÇÃO 11:
[540] Inclui todos os componentes especificados na Combinação 10, e também ácidos nucleicos que codificam enzimas de ácido cafeico biossíntese (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam tirosina-amônia-liase e os componentes de HpaB e HpaC de 4-hidroxifenil acetato 3-monooxigenase- reductase).
[541] A combinação pode ser usada para produzir hispidina a partir de tirosina em sistemas de expressão in vitro e in vivo. EXEMPLO 25. COMBINAÇÕES DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES COMBINAÇÃO 1:
[542] Composição: (a) hispidina hidroxilase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28; e (b) hispidina-sintase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55.
[543] A combinação pode ser usada para produzir luciferina fúngica de uma substância selecionada a partir de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural
, onde R é arila ou heteroarila (por exemplo, a partir de ácido cafeico). COMBINAÇÃO 2:
[544] Inclui os componentes especificados na Combinação 1, e também luciferase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98.
[545] A combinação pode ser usada para detectar em uma amostra a presença de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural
[546] , onde R é arila ou heteroarila (por exemplo, a partir de ácido cafeico). COMBINAÇÃO 3:
[547] Composição: (a) hispidina hidroxilase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28; e (b) PKS, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139; e (c) ligase de 4-cumarato-CoA 1 a partir de Arabidopsis thaliana, cuja sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID NO: 141. A combinação pode ser usada para produzir luciferina fúngica de ácido cafeico. EXEMPLO 25. KITS
[548] Nos exemplos abaixo, os ácidos nucleicos podem ser incluídos nos cassetes de expressão ou vetores e reticulados operacionalmente a elementos reguladores para sua expressão em uma célula hospedeira. Alternativamente, os ácidos nucleicos podem compreender sequências flanqueadoras para a sua incorporação no vetor alvo. Os ácidos nucleicos podem ser incluídos em vetores livres de promotores destinados a fácil clonagem de elementos reguladores alvo.
[549] Kit de reagente nº 1 inclui um produto purificado de hispidina-sintase da invenção, e pode ser usado para produzir hispidina a partir de ácido cafeico. O kit também pode ser usado para produzir as outras de 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H- piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural
[550] , a partir do ácido 3-arilacrílico correspondente com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila.
[551] O kit de reagente também pode incluir um tampão de reação. Por exemplo, tampão de fosfato de sódio de 0,2 M (pH 8,0) atado com 0,5 M de Na2SO4, 0,1 % de dodecilmaltosídeo (DDM), 1 mM de NADPH, 10 mM de ATP, 1 mM de CoA, 1 mM de malonil-CoA, ou componentes para preparação de tampão de reação.
[552] O kit de reagente também pode incluir água desionizada.
[553] O kit de reagente também pode incluir instruções para o uso.
[554] Kit de reagente nº 2 inclui um produto purificado de hispidina sintase da invenção e produto purificado de hispidina hidroxilase da invenção, e pode ser usado para produzir luciferina fúngica a partir de uma substância selecionada a partir de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila (por exemplo, a partir de ácido cafeico).
[555] O kit de reagente também pode incluir um tampão de reação: tampão de fosfato de sódio de 0,2 M (pH 8,0) atado com 0,5 M de Na2SO4, 0,1 % de dodecilmaltosídeo (DDM), 1 mM de NADPH, 10 mM de ATP, 1 mM de CoA, 1 mM de malonil-CoA, ou componentes para preparação de tampão de reação.
[556] O kit de reagente também pode incluir água desionizada.
[557] O kit de reagente também pode incluir instruções para o uso.
[558] Kit de reagente nº 3 inclui um produto purificado de hispidina hidroxilase da invenção, e pode ser usado para produzir luciferina fúngica a partir de 6-(2- arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila. Por exemplo, o kit pode ser usado para produzir 3-hidroxi-hispidina a partir de hispidina.
[559] O kit de reagente também pode incluir um tampão de reação. Por exemplo, tampão de fosfato de sódio de 0,2 M (pH 8,0) atado com 0,5 M de Na2SO4, 0,1 % de dodecilmaltosídeo (DDM), 1 mM de NADPH.
[560] O kit de reagente também pode incluir água desionizada.
[561] O kit de reagente também pode incluir instruções para o uso.
[562] Kit de reagente nº 4 e nº 5 diferem dos kits nº 2 e nº 3 por compreenderem luciferase purificada, cujo substrato é 6-(2-arilvinil)-3,4-di- hidroxi-2H-piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila.
[563] Os kits podem ser usados para identificar ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila (por exemplo, a partir de ácido cafeico), e/ou 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural
[564] , onde R é arila ou heteroarila, (por exemplo,
hispidina) em espécimes biológicas, por exemplo, em extratos vegetais, extratos fúngicos e em micro-organismos.
[565] O kit de reagentes também pode incluir um tampão de reação (consultar descrição de kits 2 e 3) para reagir, ou componentes para preparação de tampão de reação.
[566] O kit de reagente também pode incluir água desionizada.
[567] O kit de reagente também pode incluir instruções para o uso.
[568] O kit de reagente também pode incluir ácido cafeico. Por exemplo, solução aquosa de ácido cafeico ou resíduo para dissolver em água.
[569] O kit de reagente também pode incluir hispidina.
APLICAÇÕES DE KIT
[570] Para a identificação da presença de ácido cafeico na amostra de teste, é necessário adicionar 5 μl da mistura de enzimas a 95 μl de tampão de reação gelado em uma cubeta, misturar cuidadosamente, adicionar 5 μl da amostra de teste, misturar cuidadosamente novamente e coloque em um luminômetro. Integre o sinal bioluminescente em dois minutos a 30 °C no máximo, faça medições de controle nas mesmas condições com adição de 5 μl de solução de ácido cafeico ou 5 μl de água em vez da alíquota da amostra de teste. Pode-se dizer que o ácido cafeico está presente na amostra nas quantidades detectadas, se a luminescência emitida pela amostra de teste exceder um sinal de fundo recuperado a partir de uma amostra com água.
[571] Sensibilidade: o kit permite determinar a presença de ácido cafeico em um meio em concentração que excede 1 nM.
[572] Condições de armazenamento: todos os componentes de kit devem ser armazenados na temperatura que não excede -20 °C.
[573] Para a identificação da presença de hispidina na amostra de teste, é necessário adicionar 5 μl da mistura de enzimas a 95 μl de tampão de reação gelado em uma cubeta, misturar cuidadosamente, adicionar 5 μl da amostra de teste, misturar cuidadosamente novamente e coloque em um luminômetro. Integre o sinal bioluminescente em dois minutos a 30 °C no máximo, faça medições de controle nas mesmas condições com adição de 5 μl de hispidina ou 5 μl de água em vez da alíquota da amostra de teste. Pode-se dizer que a hispidina está presente na amostra nas quantidades detectadas, se a luminescência emitida pela amostra de teste exceder um sinal de fundo recuperado a partir de uma amostra com água.
[574] Sensibilidade: o kit permite determinar a presença de hispidina em meio em concentração que excede 100 pM.
[575] Condições de armazenamento: todos os componentes de kit devem ser armazenados na temperatura que não excede -20 °C.
[576] Kit de reagente nº 6 inclui ácido nucleico que codifica hispidina hidroxilase da invenção. Por exemplo, hispidina hidroxilase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28.
[577] O kit de reagente também pode compreender instruções para o uso de ácido nucleico.
[578] O kit de reagente também pode compreender água desionizada ou tampão para dissolver ácido nucleico liofilizado e/ou diluir solução de ácido nucleico.
[579] O kit de reagente também pode compreender iniciadores, complementares às regiões do dito ácido nucleico, para amplificação de ácido nucleico ou seu fragmento.
[580] O kit de reagente pode ser usado para produzir hispidina hidroxilase recombinante da invenção ou para expressão de hispidina hidroxilase em células e/ou linhas celulares, e/ou organismos. Após a expressão de ácido nucleico em células, linhas celulares e/ou organismos essas células, linhas celulares e/ou organismos adquirem a capacidade de catalisar a transformação de exógeno ou endógeno 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural
,
[581] em 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila. Por exemplo, eles adquirem a capacidade de catalisar a transformação de hispidina em 3-hidroxi-hispidina.
[582] Kit de reagente nº 7 inclui ácido nucleico que codifica hispidina-sintase da invenção. Por exemplo, hispidina-sintase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55.
[583] O kit de reagente também pode compreender instruções para o uso de ácido nucleico.
[584] O kit de reagente também pode compreender água desionizada ou tampão para dissolver ácido nucleico liofilizado e/ou diluir solução de ácido nucleico.
[585] O kit de reagente também pode compreender iniciadores, complementares às regiões do dito ácido nucleico, para amplificação de ácido nucleico ou seu fragmento.
[586] O kit de reagente também pode compreender ácido nucleico que codifica 4’-fosfopanteteinil transferase, por exemplo, 4’-fosfopanteteinil transferase, tendo sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO 105.
[587] O kit de reagente pode ser usado para produzir recombinante hispidina sintase da invenção ou para expressão de hispidina hidroxilase em células e/ou linhas celulares, e/ou organismos.
[588] Após a expressão de ácido nucleico em células, linhas celulares e/ou organismos essas células, linhas celulares e/ou organismos adquirem a capacidade de catalisar transformação de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural
[589] , onde R é arila ou heteroarila, em 6-2-arilvinil)-4- hidroxi-2H-piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural .
[590] Por exemplo, eles adquirem a capacidade de catalisar transformação de ácido cafeico em hispidina e/ou ácido cinâmico em (E)-4-hidroxi-6-estiril-2H- piran-2-ona e/ou ácido paracoumárico em bisnoriangonina e/ou (E)-3-(6- hidroxinaftalen-2-il) de ácido propenoico em (E)-4-hidroxi-6-(2-(6-hidroxinaftalen- 2-il)vinil)-2H-piran-2-ona e/ou (E)-3-(1Н-indol-3-il) de ácido propenoico em (E)-6- (2-(1Н-indol-3-il)vinil)-4-hidroxi-2Н-piran-2-ona.
[591] O kit de reagente também pode compreender ácidos nucleicos que codificam tirosina-amônia-liase e os componentes de HpaB e HpaC de 4- hidroxifenil acetato 3-monooxigenase-reductase. O kit com tal composição pode ser usado para produzir hispidina a partir de tirosina em sistemas de expressão in vitro e in vivo.
[592] Kit de reagente nº 8 inclui ácido nucleico que codifica hispidina sintase da invenção e ácido nucleico que codifica hispidina hidroxilase da invenção. Por exemplo, hispidina-sintase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55; e hispidina hidroxilase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28.
[593] O kit de reagente também pode incluir instruções para o uso de ácidos nucleicos.
[594] O kit de reagente também pode compreender água desionizada ou tampão para dissolver ácido nucleico liofilizado e/ou diluir solução de ácido nucleico.
[595] O kit de reagente também pode compreender iniciadores, complementares às regiões dos ácidos nucleicos incluídos no kit, para amplificação desses ácidos nucleicos ou seus fragmentos.
[596] O kit de reagente também pode compreender ácido nucleico que codifica 4’-fosfopanteteinil transferase, por exemplo, 4’-fosfopanteteinil transferase, tendo sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO 105.
[597] O kit de reagente também pode compreender ácidos nucleicos que codificam enzimas da biossíntese de ácido 3-arilacrílico a partir de metabólitos celulares, por exemplo, ácidos nucleicos que codificam tirosina-amônia-liase e os componentes de HpaB e HpaC de 4-hidroxifenil acetato 3-monooxigenase- reductase.
[598] O kit pode ser usado para quaisquer propósitos descritos para kits 6 e 7. O kit pode ser usado para expressão de hispidina hidroxilase e hispidina sintase em células e/ou linhas celulares, e/ou organismos. Após a expressão de ácido nucleico em células, linhas celulares e/ou organismos essas células, linhas celulares e/ou organismos adquirem a capacidade para produzir 6-(2-arilvinil)- 3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona, tendo a fórmula estrutural ,г onde R é arila ou heteroarila, a partir do ácido 3-arilacrílico correspondente com a fórmula estrutural .
[599] O kit pode ser usado para expressão de hispidina hidroxilase e hispidina sintase junto com tirosina-amônia-liase e os componentes de HpaB e HpaC de 4-hidroxifenil acetato 3-monooxigenase-reductase em células e/ou linhas celulares, e/ou organismos. Após a expressão de ácido nucleico em células, linhas celulares e/ou organismos essas células, linhas celulares e/ou organismos adquirem a capacidade para produzir hispidina a partir de tirosina e metabólitos celulares.
[600] Kit de reagente nº 9 inclui ácido nucleico que codifica hispidina hidroxilase da invenção. Por exemplo, hispidina hidroxilase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 e ácido nucleico que codifica a luciferase capaz de oxidar pelo menos uma de luciferinas fúngicas com emissão de luminescência. Por exemplo, poderia ser selecionada a luciferase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98.
[601] O kit de reagente também pode incluir instruções para o uso de ácidos nucleicos.
[602] O kit de reagente também pode compreender água desionizada ou tampão para dissolver ácido nucleico liofilizado e/ou diluir solução de ácido nucleico.
[603] O kit de reagente também pode compreender iniciadores, complementares às regiões dos ácidos nucleicos incluídos no kit, para amplificação desses ácidos nucleicos ou seus fragmentos.
[604] O kit pode ser usado para marcação de células e/ou linhas celulares, e/ou organismos, onde as ditas células, linhas celulares e/ou organismos adquirem capacidade de bioluminescência na presença de exógeno ou endógeno pré- luciferina fúngica como um resultado de expressão dos ditos ácidos nucleicos. Por exemplo, eles adquirem capacidade de bioluminescência na presença de hispidina.
[605] O kit pode ser também usado para o estudo da co-ativação de promotores de genes alvo.
[606] O kit também pode incluir um ácido nucleico que codifica hispidina-sintase da invenção, por exemplo, hispidina-sintase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55. Neste caso o kit pode ser usado para produzir células, linhas celulares e organismos transgênicos capazes de bioluminescência na presença de exógeno ou endógeno ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural
[607] , onde R é arila ou heteroarila. Por exemplo, na presença de ácido 3-arilacrílico selecionado a partir do seguinte grupo: ácido cafeico ou ácido cinâmico, ou ácido paracoumárico, ou ácido coumárico, ou ácido umbélico, ou ácido sinápico, ou ácido ferúlico. Em particular, o kit pode ser usado para produzir organismos transgênicos autonomamente bioluminescentes, por exemplo, plantas ou fungos).
[608] O kit também pode incluir um ácido nucleico que codifica 4’- fosfopanteteinil transferase, por exemplo, 4’-fosfopanteteinil transferase, tendo sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO 105, ou semelhante.
[609] O kit também pode compreender ácidos nucleicos que codificam enzimas de biossíntese de ácido 3-arilacrílico a partir de metabólitos celulares.
[610] O kit também pode compreender um ácido nucleico que codifica cafeoilpiruvato hidrolase da invenção, por exemplo, cafeoilpiruvato hidrolase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75.
[611] O kit pode ser também usado para quaisquer propósitos descritos para kits Nº 6 e Nº 8.
[612] O kit pode ser também usado para produzir linhas celulares que permitem identificar o ácido cafeico em amostras de teste.
[613] Kit de reagente nº 10 inclui células Agrobacterium tumefaciens da cepa AGL0, contendo plasmídeo compreendendo sequências de codificação de hispidina hidroxilase, hispidina sintase, luciferase, gene NpgA de fosfopantetoinil transferase e gene de resistência a antibióticos (por exemplo, canamicina) sob o controle de promotor adequado, por exemplo, Promotor 35S a partir do vírus do mosaico da couve-flor.
[614] O kit de reagente também pode incluir iniciadores para determinar a exatidão da integração do cassete de expressão em células de plantas com flores dicotiledôneas.
[615] O kit de reagente pode ser usado para o cultivo autônomo de plantas dicotiledôneas bioluminescentes.
[616] O kit de reagente também pode incluir instruções para o uso.
[617] Método de aplicação: Fazer a transformação de uma planta dicotiledônea usando células de agrobactérias a partir do kit de acordo com o protocolo perfeitamente adequado para esta espécie de planta. Faça a seleção de plantas em meio antibiótico (por exemplo, canamicina). Faça a correção da integração de comprimento total do cassete de expressão usando PCR com os iniciadores do kit.
[618] Condições de armazenamento: células de agrobactérias competentes devem ser armazenadas a uma temperatura que não excede -70 °C, é deixado armazenar solução de ácido cafeico em temperaturas que não excedem -20 °C. KIT DE REAGENTE nº 11
[619] O kit inclui um produto purificado de PKS e um produto purificado de hispidina hidroxilase da invenção, e pode ser usado para produzir luciferina fúngica a partir de cafeoil-CoA. Kit de reagente também pode incluir um tampão de reação: tampão de fosfato de sódio de 0,2 M (pH 8,0) atado com 0,5 M de Na2SO4, 0,1 % de dodecilmaltosídeo (DDM), 1 mM de NADPH, 10 mM de ATP, 1 mM de malonil-CoA, ou componentes para preparação de tampão de reação. Kit de reagente também pode incluir água desionizada. Kit de reagente também pode incluir instruções para o uso. KIT DE REAGENTE nº 12
[620] O kit inclui um ácido nucleico que codifica PKS e um ácido nucleico que codifica hispidina hidroxilase da invenção. Por exemplo, PKS cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125,
127, 129, 131, 133, 135, 137, 139 e hispidina hidroxilase, cuja sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28.
[621] O kit de reagente também pode incluir instruções para o uso de ácidos nucleicos. Kit de reagente também pode compreender água desionizada ou tampão para dissolver ácido nucleico liofilizado e/ou diluir solução de ácido nucleico. Kit de reagente também pode compreender iniciadores, complementares às regiões dos ácidos nucleicos incluídos no kit, para amplificação desses ácidos nucleicos ou seus fragmentos.
[622] O kit de reagente também pode compreender um ácido nucleico que codifica ligase de cumarato-CoA, por exemplo, ligase de cumarato-CoA, tendo sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO 141.
[623] O kit de reagente também pode compreender ácidos nucleicos que codificam enzimas da biossíntese de ácido cafeico a partir de metabólitos celulares, por exemplo, ácidos nucleicos que codificam tirosina-amônia-liase e os componentes de HpaB e HpaC da 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenase- redutase. O kit de reagentes também pode compreender um ácido nucleico que codifica cafeoilpiruvato hidrolase da invenção.
[624] O kit de reagentes pode ser usado para a expressão de hispidina hidroxilase e PKS em células e/ou linhas celulares e/ou organismos. Após a expressão do ácido nucleico nas células, linhas celulares e/ou organismos, essas células, linhas celulares e/ou organismos adquirem a capacidade de produzir 3-hidroxispidina a partir do ácido cafeico. O kit também pode ser usado para a expressão de hispidina hidroxilase e PKS juntamente com cumarato-CoA ligase, Cafeoilpiruvato hidrolase e/ou combinação de tirosina-amônia-liase e os componentes HpaB e HpaC de 4-hidroxifenil acetato 3-monooxigenase-redutase em células e/ou linhas celulares e/ou organismos. Após a expressão do ácido nucleico nas células, linhas celulares e/ou organismos, essas células, linhas celulares e/ou organismos adquirem a capacidade de produzir 3-hidroxispidina a partir da tirosina e metabólitos celulares.
[625] O kit também pode compreender um ácido nucleico que codifica a luciferase capaz de oxidar 3-hidroxi-hispidina com emissão de luminescência.
Neste caso o kit pode ser usado para marcação de células e/ou linhas celulares, e/ou organismos, onde as ditas células, linhas celulares e/ou organismos adquirem capacidade de bioluminescência na presença de exógeno ou endógeno hispidina e/ou cafeoil-CoA, e/ou ácido cafeico como um resultado de expressão dos ditos ácidos nucleicos.
Por exemplo, células, linhas celulares e/ou organismos adquirem capacidade de bioluminescência autônoma.

Claims (96)

REIVINDICAÇÕES
1. PROTEÍNA DE BIOSSÍNTESE DE LUCIFERINA FÚNGICA caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo: (a) hispidinas hidroxilases tendo a sequência de aminoácido que dentro de pelo menos 350 aminoácidos tem pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, ou contém sequências de consenso com a SEQ ID NOs 29 - 33 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, a conversão catalizadora de hispidina hidroxilase de 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural , em 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila; (b) hispidinas sintases tendo a sequência de aminoácido que tem pelo menos 45 % de identidade com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, ou contém sequências de consenso com a SEQ ID NOs 56 - 63 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, a conversão catalizadora de hispidina sintase de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila, em 6-(2-arilvinil)-4- hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural
, onde R é arila ou heteroarila; (c) cafeoilpiruvato hidroxilases tendo a sequência de aminoácido que tem pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou contém sequências de consenso com a SEQ ID NOs 76 - 78 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, a conversão catalizadora de cafeoilpiruvato hidroxilase de ácido 6-aril-2-hidroxi-4-oxo-hexa-2,5-dienoico com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila, conversão em ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural .
2. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácido de hispidina hidroxilase tem pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, ou pelo menos 80 % de identidade, ou pelo menos 85 % de identidade, ou pelo menos 90 % de identidade, ou pelo menos 95 % de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28.
3. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácido de hispidina hidroxilase é selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, ou tem pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98
%, ou 99 % de identidade com ele.
4. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácido de hispidina sintase tem pelo menos 50 % de identidade, ou pelo menos 55 % de identidade, ou pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, ou pelo menos 80 % de identidade, ou pelo menos 85 % de identidade, ou pelo menos 90 % de identidade, ou pelo menos 95 % de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55.
5. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácido de hispidina sintase é selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, ou tem pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, ou 99 % de identidade com ele.
6. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácido de cafeoilpiruvato hidrolase tem pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, ou pelo menos 80 % de identidade, ou pelo menos 85 % de identidade, ou pelo menos 90 % de identidade, ou pelo menos 95 % de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75.
7. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácido de cafeoilpiruvato sintase é selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou tem pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, ou 99 % de identidade com ele.
8. PROTEÍNA DE FUSÃO caracterizada pelo fato de que compreende hispidina hidroxilase operativamente reticulada, e/ou hispidina sintase, e/ou cafeoilpiruvato hidrolase, de acordo com a reivindicação 1, e luciferase capaz de oxidar luciferina fúngica com emissão de luz, e/ou sinal de localização intracelular, e/ou peptídeo sinal.
9. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácido de luciferase é pelo menos 40 % idêntica, por exemplo, pelo menos 45 % idêntica, ou pelo menos 50 % idêntica, ou pelo menos 55 % idêntica, ou pelo menos 60 % idêntica, ou pelo menos 70 % idêntica, ou pelo menos 75 % idêntica, ou pelo menos 80 % idêntica, ou pelo menos 85 % idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98.
10. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácido tem a SEQ ID No. 101.
11. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona é selecionado a partir do grupo: (E)-6-(3,4-di-hidroxistiril)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, (E)-4-di-hidroxi-6-estiril-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(4-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(2-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(2,4-di-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(4-hidroxi-3,5-dimetoxistiril)-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(4-hidroxi-3-metoxistiril)-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(2-(6-hidroxinaftalen-2-il)vinil)-2H-piran-2-ona, (E)-6-(4-aminostiril)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, (E)-6-(4-(dietilamino)estiril)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, (E)-6-(2-(1H-indol-3-il)vinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(2,3,6,7-tetra-hidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il)vinil)- 2H-piran-2-ona.
12. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que ácido 3-arilacrílico é selecionado a partir do grupo compreendendo: ácido cafeico, ácido cinâmico, ácido paracoumárico, ácido coumárico, ácido umbélico, ácido sinápico, e ácido ferúlico.
13. USO DE PROTEÍNA DE BIOSSÍNTESE DE LUCIFERINA FÚNGICA caracterizado pelo fato de que é selecionada a partir do grupo: (a) a sequência de aminoácido que dentro de pelo menos 350 aminoácidos tem pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, ou contém sequências de consenso com a SEQ ID NOs 29 - 33 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, como conversão catalizadora de hispidinas hidroxilases de 6-(2- arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural , em 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila; (b) a sequência de aminoácido que tem pelo menos 45 % de identidade com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, ou contém sequências de consenso com a SEQ ID NOs 56 - 63 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, como conversão catalizadora de hispidinas sintases de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural em 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural
, onde R é arila ou heteroarila; (c) a sequência de aminoácido que tem pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou contém sequências de consenso com a SEQ ID NOs 76 - 78 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, como conversão catalizadora de cafeoilpiruvato hidroxilase de ácido 6-aril-2-hidroxi-4-oxo-hexa-2,5-dienoico com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila, conversão em ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural .
14. USO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de hispidina hidroxilase tem pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, ou pelo menos 80 % de identidade, ou pelo menos 85 % de identidade, ou pelo menos 90 % de identidade, ou pelo menos 95 % de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28.
15. USO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de hispidina sintase tem pelo menos 50 % de identidade, ou pelo menos 55 % de identidade, ou pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, ou pelo menos 80 % de identidade, ou pelo menos 85 % de identidade, ou pelo menos 90 % de identidade, ou pelo menos 95 % de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55.
16. USO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de cafeoilpiruvato hidrolase tem pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, ou pelo menos 80 % de identidade, ou pelo menos 85 % de identidade, ou pelo menos 90 % de identidade, ou pelo menos 95 % de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75.
17. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona é selecionado a partir do grupo: (E)-6-(3,4-di-hidroxistiril)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona (hispidina), (E)-4-di-hidroxi-6-estiril-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(4-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona (bisnoriangoninaa), (E)-4-hidroxi-6-(2-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(2,4-di-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(4-hidroxi-3,5-dimetoxistiril)-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(4-hidroxi-3-metoxistiril)-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(2-(6-hidroxinaftalen-2-il)vinil)-2H-piran-2-ona, (E)-6-(4-aminostiril)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, (E)-6-(4-(dietilamino)estiril)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, (E)-6-(2-(1H-indol-3-il)vinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(2,3,6,7-tetra-hidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il)vinil)- 2H-piran-2-ona.
18. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que ácido 3-arilacrílico é selecionado a partir do grupo compreendendo: ácido cafeico, ácido cinâmico, ácido paracoumárico,
ácido coumárico, ácido umbélico, ácido sinápico, e ácido ferúlico.
19. ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA A PROTEÍNA DE BIOSSÍNTESE DE LUCIFERINA FÚNGICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que selecionado a partir do grupo: (a) hispidinas hidroxilases tendo a sequência de aminoácido que dentro de pelo menos 350 aminoácidos tem pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, ou contém sequências de consenso com a SEQ ID NOs 29 - 33 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, a conversão catalizadora de hispidina hidroxilase de 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural , em 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila; (b) hispidinas sintases tendo a sequência de aminoácido que tem pelo menos 45 % de identidade com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, ou contém sequências de consenso com a SEQ ID NOs 56 - 63 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, a conversão catalizadora de hispidina sintase de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural em 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural
, onde R é arila ou heteroarila; (c) cafeoilpiruvato hidroxilases tendo a sequência de aminoácido que tem pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou contém sequências de consenso com a SEQ ID NOs 76 - 78 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, a conversão catalizadora de cafeoilpiruvato hidroxilase de ácido 6-aril-2-hidroxi-4-oxo-hexa-2,5-dienoico com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila, conversão em ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural .
20. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de hispidina hidroxilase tem pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, ou pelo menos 80 % de identidade, ou pelo menos 85 % de identidade, ou pelo menos 90 % de identidade, ou pelo menos 95 % de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28.
21. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido é selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, ou tem pelo menos 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, ou 99 % de identidade com ele.
22. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de hispidina sintase tem pelo menos 50 % de identidade, ou pelo menos 55 % de identidade, ou pelo menos 60 % de identidade, ou pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, ou pelo menos 80 % de identidade, ou pelo menos 85 % de identidade, ou pelo menos 90 % de identidade, ou pelo menos 95 % de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55.
23. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de hispidina sintase é selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 20, 49, 51, 53, 55, ou tem pelo menos 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, ou 99 % de identidade com ele.
24. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de cafeoilpiruvato hidrolase tem pelo menos 65 % de identidade, ou pelo menos 70 % de identidade, ou pelo menos 75 % de identidade, ou pelo menos 80 % de identidade, ou pelo menos 85 % de identidade, ou pelo menos 90 % de identidade, ou pelo menos 95 % de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75.
25. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de cafeoilpiruvato sintase é selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou tem pelo menos 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, ou 99 % de identidade com ele.
26. ÁCIDO NUCLEICO caracterizado pelo fato de que codifica a proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10.
27. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona é selecionado a partir do grupo: (E)-6-(3,4-di-hidroxistiril)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona (hispidina),
(E)-4-di-hidroxi-6-estiril-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(4-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona (bisnoriangoninaa), (E)-4-hidroxi-6-(2-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(2,4-di-hidroxistiril)-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(4-hidroxi-3,5-dimetoxistiril)-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(4-hidroxi-3-metoxistiril)-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(2-(6-hidroxinaftalen-2-il)vinil)-2H-piran-2-ona, (E)-6-(4-aminostiril)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, (E)-6-(4-(dietilamino)estiril)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, (E)-6-(2-(1H-indol-3-il)vinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona, (E)-4-hidroxi-6-(2,3,6,7-tetra-hidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quinolin-9-il)vinil)- 2H-piran-2-ona.
28. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que ácido 3-arilacrílico é selecionado a partir do grupo compreendendo: ácido cafeico, ácido cinâmico, ácido paracoumárico, ácido coumárico, ácido umbélico, ácido sinápico, e ácido ferúlico.
29. CASSETE DE EXPRESSÃO caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um domínio de iniciação de transcrição, que é funcional em uma célula hospedeira; (b) ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 19, e (c) um domínio de terminação de transcrição, que é funcional na célula hospedeira.
30. CÉLULA HOSPEDEIRA caracterizada pelo fato de que contém pelo menos um cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 29 como uma parte de um elemento extracromossômico ou integrado no genoma celular como um resultado de introduzir o dito cassete na dita célula, em que a dita célula expressa pelo menos uma das proteínas funcionais para biossíntese de luciferina fúngica.
31. ANTICORPO caracterizado pelo fato de que se liga a pelo menos uma proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
32. USO DE UM ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UMA PROTEÍNA DE BIOSSÍNTESE DE LUCIFERINA FÚNGICA caracterizado pelo fato de que é selecionada a partir do grupo:
(a) a sequência de aminoácido que dentro de pelo menos 350 aminoácidos tem pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, ou contém sequências de consenso com a SEQ ID NOs 29 - 33 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, para produzir em sistemas in vitro ou in vivo a hispidina hidroxilase que catalisa a reação de 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural
, conversão em 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural
, onde R é arila ou heteroarila; (b) a sequência de aminoácido que tem pelo menos 45 % de identidade com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, ou contém sequências de consenso com a SEQ ID NOs 56 - 63 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, para produzir em sistemas in vitro ou in vivo a hispidina sintase que catalisa a reação de conversão de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural em 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona com a fórmula estrutural
, onde R é arila ou heteroarila; (c) a sequência de aminoácido que tem pelo menos 60 % de identidade com a sequência de aminoácido selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou contém sequências de consenso com a SEQ ID NOs 76 - 78 separadas por segmentos de inserção de aminoácido não conservativos, para produzir em sistemas in vitro ou in vivo o cafeoilpiruvato hidrolase que catalisa a reação de um ácido 6-aril-2-hidroxi-4-oxo-hexa-2,5- dienoico com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila, conversão em ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural .
33. USO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é usado para expressar uma proteína de biossíntese de luciferina fúngica contida em um cassete de expressão que também compreende um domínio de iniciação de transcrição, que é funcional em uma célula hospedeira e um domínio de terminação de transcrição, que é funcional na célula hospedeira.
34. USO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão é usado em uma célula hospedeira.
35. MÉTODO DE BIOSSÍNTESE DE UMA LUCIFERINA FÚNGICA com a fórmula química 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2h-piran-2-ona e a fórmula estrutural
, onde r é arila ou heteroarila, em sistema tanto in vitro quanto in vivo, caracterizado pelo fato de que compreende a combinação de pelo menos uma porção de hispidina hidroxilase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 com pelo menos uma porção de 6-(2-arilvinil)-4- hidroxi-2H-piran-2-ona tendo a fórmula estrutural , pelo menos uma porção de NAD(P)H, e pelo menos uma porção de oxigênio molecular sob condições fisiológicas.
36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a reação é realizada em uma célula ou organismo, o método compreendendo a introdução na célula do cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 29 que contém uma hispidina hidroxilase que codifica ácido nucleico.
37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir em uma célula ou organismo o cassete de expressão ainda contendo: (a) um domínio de iniciação de transcrição, que é funcional em uma célula hospedeira; (b) um ácido nucleico, que codifica a luciferase capaz de oxidar luciferina fúngica com emissão de luz, e (c) um domínio de terminação de transcrição, que é funcional na célula hospedeira, em que a dita célula ou organismo adquire a capacidade de bioluminescência na presença do dito luciferina fúngica.
38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico, que codifica a luciferase, é operativamente fundido com o ácido nucleico, que codifica a hispidina hidroxilase para formar o ácido nucleico da reivindicação 26.
39. MÉTODO DE BIOSSÍNTESE DE UMA LUCIFERINA FÚNGICA com a fórmula química 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2h-piran-2-ona e a fórmula estrutural , onde r é arila ou heteroarila, em sistema tanto in vitro quanto in vivo, caracterizado pelo fato de que compreende a combinação de pelo menos uma porção de ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural com pelo menos uma porção de hispidina sintase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4, 5, em que pelo menos uma porção de coenzima A, pelo menos uma porção ATP, e pelo menos duas porções de malonil-CoA sob condições fisiológicas.
40. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a reação é realizada em uma célula ou organismo, o método compreendendo a introdução na célula do cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 29 que contém uma hispidina sintase que codifica ácido nucleico.
41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de um ácido nucleico que codifica um 4’-fosfopantoteinil transferase e capaz de transferir o 4- fosfopantoteinil a partir da coenzima A para a serina no domínio de transferência de acila de policetídeo sintases.
42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o 4’-fosfopantoteinil transferase tem uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica à sequência de aminoácido com SEQ ID No. 105.
43. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 42, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de ácidos nucleicos, que codificam as enzimas para biossíntese de ácido 3-arilacrílico a partir de metabólitos celulares com a fórmula estrutural
, onde R é arila ou heteroarila.
44. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as enzimas para biossíntese de ácido 3-arilacrílico são selecionadas a partir do grupo de: (a) tirosina amônia-liase com uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica à sequência de aminoácido tendo SEQ ID No. 107; componentes de HpaB e HpaC de 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase pelo menos 40 % idêntica à sequências de aminoácidos de componentes de HpaB e HpaC de 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase de E. coli tendo SEQ ID NOs 109 e 111; (b) fenilalanina amônia-liase com uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica à sequência de aminoácido tendo SEQ ID No.117.
45. MÉTODO DE BIOSSÍNTESE DE UMA LUCIFERINA FÚNGICA com a fórmula química 6-(2-arilvinil)-3,4-di-hidroxi-2h-piran-2-ona e a fórmula estrutural , onde r é arila ou heteroarila, em sistema tanto in vitro quanto in vivo, caracterizado pelo fato de que compreende a combinação de pelo menos uma porção de ácido 3-arilacrílico tendo a fórmula estrutural com pelo menos uma porção de hispidina sintase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4, 5; pelo menos uma porção de coenzima A; pelo menos uma porção ATP; pelo menos duas porções de malonil- CoA; pelo menos uma porção de hispidina hidroxilase , de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3; pelo menos uma porção de NAD(P)H, e pelo menos uma porção de oxigênio molecular sob condições fisiológicas.
46. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a reação é realizada em uma célula ou organismo, o método compreendendo a introdução na célula do cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 29, que contém uma hispidina sintase que codifica ácido nucleico, e o cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 29, que contém uma hispidina hidroxilase que codifica ácido nucleico.
47. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de um ácido nucleico que codifica um 4’-fosfopantoteinil transferase e capaz de transferir o 4- fosfopantoteinil a partir da coenzima A para a serina no domínio de transferência de acila de policetídeo sintases.
48. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o 4’-fosfopantoteinil transferase tem uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica à sequência de aminoácido com SEQ ID No. 105.
49. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 48, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de ácidos nucleicos, que codificam as enzimas para biossíntese de ácido 3-arilacrílico a partir de metabólitos celulares com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila.
50. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que as enzimas para biossíntese de ácido 3-arilacrílico são selecionadas a partir do grupo de: (a) tirosina amônia-liase com uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica ao aminoácido SEQ ID No. 107; componentes de HpaB e HpaC de 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase pelo menos 40 % idêntica à sequências de aminoácidos de componentes de HpaB e HpaC de 4- hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase de E. coli tendo SEQ ID NOs 109 e 111; (b) fenilalanina amônia-liase com uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica à sequência de aminoácido tendo SEQ ID No.117.
51. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE CÉLULA OU ORGANISMO
BIOLUMINESCENTE TRANSGÊNICO COMPREENDENDO INTRODUZIR UM CASSETE DE EXPRESSÃO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que na célula ou organismo, o dito cassete de expressão compreendendo uma hispidina hidroxilase que codifica ácido nucleico e contendo (a) um domínio de iniciação de transcrição, que é funcional em uma célula hospedeira; (b) um ácido nucleico, que codifica a luciferase capaz de oxidar luciferina fúngica com emissão de luz, e (c) um domínio de terminação de transcrição, que é funcional na célula hospedeira, em que a dita célula adquire a capacidade de bioluminescência na presença de pré-luciferina fúngica com a fórmula química 6-(2-arilvinil)-4-hidroxi-2H-piran-2-ona e fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila.
52. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de um ácido nucleico que codifica a hispidina sintase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 22, 23, como uma parte de um cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 29, em que a dita célula adquire a capacidade de bioluminescência na presença de um precursor exógeno ou endógeno de pré-luciferina fúngica, que é ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila.
53. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de um ácido nucleico que codifica o cafeoilpiruvato hidrolase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 24, 25.
54. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 53, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de um ácido nucleico que codifica o 4’-fosfopantoteinil transferase e capaz de transferir o 4-fosfopantoteinil a partir da coenzima A para a serina no domínio de transferência de acila de policetídeo sintases.
55. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 54, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de ácidos nucleicos, que codificam as enzimas para biossíntese de ácido 3-arilacrílico a partir de metabólitos celulares.
56. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que as enzimas para biossíntese de ácido 3-arilacrílico são selecionadas a partir do grupo de: (a) tirosina amônia-liase com uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica ao aminoácido SEQ ID No. 107; componentes de HpaB e HpaC de 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase pelo menos 40 % idêntica à sequências de aminoácidos de componentes de HpaB e HpaC de 4- hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase de E. coli tendo SEQ ID NOs 109 e 111; (b) fenilalanina amônia-liase com uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica à sequência de aminoácido tendo SEQ ID No.117.
57. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE CÉLULA OU ORGANISMO BIOLUMINESCENTE TRANSGÊNICO caracterizado pelo fato de que compreende introduzir um ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 26, na forma de um cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 29, na célula ou organismo, em que a dita célula adquire a capacidade de bioluminescência na presença de pré-luciferina fúngica com a fórmula química 6-(2-arilvinil)-4-
hidroxi-2H-piran-2-ona e fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila.
58. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de um ácido nucleico que codifica a hispidina sintase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 22, 23, como uma parte de um casset de expressão, de acordo com a reivindicação 29, em que a dita célula adquire a capacidade de bioluminescência na presença de um precursor exógeno ou endógeno de pré-luciferina fúngica, que é ácido 3-arilacrílico com a fórmula estrutural , onde R é arila ou heteroarila.
59. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de um ácido nucleico que codifica o cafeoilpiruvato hidrolase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 24, 25.
60. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 59, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de um ácido nucleico que codifica o 4’-fosfopantoteinil transferase e capaz de transferir o 4-fosfopantoteinil a partir da coenzima A para a serina no domínio de transferência de acila de policetídeo sintases.
61. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 60, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de ácidos nucleicos, que codificam as enzimas para biossíntese de ácido 3-arilacrílico a partir de metabólitos celulares.
62. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que as enzimas para biossíntese de ácido 3-arilacrílico são selecionadas a partir do grupo de: (a) tirosina amônia-liase com uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica ao aminoácido SEQ ID No. 107; componentes de HpaB e HpaC de 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase pelo menos 40 % idêntica à sequências de aminoácidos de componentes de HpaB e HpaC de 4- hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase de E. coli tendo SEQ ID NOs 109 e 111; (b) fenilalanina amônia-liase com uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica à sequência de aminoácido tendo SEQ ID No.117.
63. ORGANISMO TRANSGÊNICO CAPAZ DE BIOLUMINESCÊNCIA NA PRESENÇA DE LUCIFERINA FÚNGICA E/OU PRÉ-LUCIFERINA FÚNGICA,
CONTENDO PELO MENOS UM ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA A HISPIDINA HIDROXILASE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que como uma parte de um elemento extracromossômico ou integrado no genoma de uma célula como um resultado de introduzir um cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 29, na dita célula e um ácido nucleico que codifica a luciferase capaz de oxidar luciferina fúngica com emissão de luz.
64. ORGANISMO TRANSGÊNICO CAPAZ DE BIOLUMINESCÊNCIA AUTÔNOMA caracterizado pelo fato de que o dito organismo contém pelo menos um ácido nucleico que codifica a hispidina hidroxilase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21; um ácido nucleico que codifica a hispidina sintase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 22, 23, como uma parte de um elemento extracromossômico ou integrado no genoma de uma célula como um resultado de introduzir um cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 29, na dita célula, e um ácido nucleico que codifica a luciferase capaz de oxidar luciferina fúngica com emissão de luz.
65. ORGANISMO TRANSGÊNICO, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que que contém um ácido nucleico que codifica o cafeoilpiruvato hidrolase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19,
24, 25.
66. VETOR PARA TRANSFERIR UM ÁCIDO NUCLEICO EM UMA CÉLULA HOSPEDEIRA caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 26.
67. KIT PARA PRODUZIR LUCIFERINA FÚNGICA E/OU PRÉ-LUCIFERINA FÚNGICA caracterizado pelo fato de que compreende hispidina hidroxilase e hispidina sintase, de acordo com a reivindicação 1.
68. KIT PARA PRODUZIR LUCIFERINA FÚNGICA E/OU PRÉ-LUCIFERINA FÚNGICA EM SISTEMAS IN VITRO E/OU IN VIVO caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica a hispidina hidroxilase e um ácido nucleico que codifica a hispidina sintase, de acordo com a reivindicação
19.
69. KIT PARA PRODUZIR UMA CÉLULA OU ORGANISMO BIOLUMINESCENTE caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica a hispidina hidroxilase, um ácido nucleico que codifica a hispidina sintase, de acordo com a reivindicação 19, e um ácido nucleico que codifica a luciferase capaz de oxidar luciferina fúngica com emissão de luz.
70. KIT, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que ainda contém um ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 19, que codifica um cafeoilpiruvato hidrolase.
71. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 70, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um ácido nucleico que codifica 4’- fosfopantoteinil transferase e/ou ácidos nucleicos que codificam enzimas para biossintetizar o ácido 3-arilacrílico.
72. USO DE POLICETÍDEO SINTASE COM SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDO caracterizado pelo fato de que é pelo menos 40 %, ou pelo menos 45 %, ou pelo menos 50 %, ou pelo menos 55 %, ou pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %, ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %,
ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, ou completamente idêntica a uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo SEQ ID NOs: 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, para produzir hispidina em um sistema in vitro ou in vivo.
73. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE HISPIDINA EM UM SISTEMA IN VITRO OU IN VIVO caracterizado pelo fato de que compreende a combinação de pelo menos uma porção de PKS, de acordo com a reivindicação 72, com pelo menos duas porções de malonil-CoA e pelo menos uma porção de cafeoil-CoA sob condições fisiológicas.
74. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção de ácido cafeico, pelo menos uma porção de coenzima A, pelo menos uma porção de ligase de cumarato-CoA, e pelo menos uma porção ATP são adicionadas à mistura de reação em vez de pelo menos uma porção de cafeoil-CoA.
75. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizado pelo fato de que a reação é realizada em uma célula ou organismo, o método compreendendo introduzir o cassete de expressão que contém um ácido nucleico que codifica o policetídeo sintase tipo III, de acordo com a reivindicação
72.
76. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que ainda compreende introduzir um ácido nucleico que codifica a ligase de cumarato-CoA na célula ou organismo.
77. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que a ligase de cumarato-CoA tem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 40 %, ou pelo menos 45 %, ou pelo menos 50 %, ou pelo menos 55 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %, ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, ou completamente idêntica à sequência com SEQ ID No. 141.
78. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 a 77, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de ácidos nucleicos, que codificam as enzimas para biossíntese de ácido cafeico.
79. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que as enzimas para biossíntese de ácido 3-arilacrílico são selecionadas a partir do grupo de: (a) tirosina amônia-liase com uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica ao aminoácido SEQ ID No. 107; componentes de HpaB e HpaC de 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase pelo menos 40 % idêntica à sequências de aminoácidos de componentes de HpaB e HpaC de 4- hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase de E. coli tendo SEQ ID NOs 109 e 111; (b) fenilalanina amônia-liase com uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica à sequência de aminoácido tendo SEQ ID No.117.
80. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que ainda compreende introduzir em uma célula ou organismo um cassete de expressão contendo: (a) um domínio de iniciação de transcrição, que é funcional em uma célula hospedeira; (b) um ácido nucleico, que codifica o policetídeo sintase tipo III, de acordo com a reivindicação 72, e (c) um domínio de terminação de transcrição, que é funcional na célula hospedeira, em que a dita célula adquire a capacidade de bioluminescência na presença de exógeno ou endógeno cafeoil-CoA.
81. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que ainda compreende introduzir em uma célula ou organismo um cassete de expressão contendo: (a) um domínio de iniciação de transcrição, que é funcional em uma célula hospedeira; (b) um ácido nucleico, que codifica a ligase de cumarato-CoA, e (c) um domínio de terminação de transcrição, que é funcional na célula hospedeira, em que a dita célula adquire a capacidade de bioluminescência na presença de ácido cafeico.
82. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que a ligase de cumarato-CoA tem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 40 %, ou pelo menos 45 %, ou pelo menos 50 %, ou pelo menos 55 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %, ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, ou completamente idêntica à sequência com SEQ ID No. 141.
83. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 82, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de um ácido nucleico que codifica o cafeoilpiruvato hidrolase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 24, 25.
84. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 83, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de ácidos nucleicos, que codificam as enzimas para biossíntese de ácido 3-arilacrílico a partir de metabólitos celulares.
85. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que as enzimas para biossíntese de ácido 3-arilacrílico são selecionadas a partir do grupo de: (a) tirosina amônia-liase com uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica ao aminoácido SEQ ID No. 107; componentes de HpaB e HpaC de 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase pelo menos 40 % idêntica à sequências de aminoácidos de componentes de HpaB e HpaC de 4- hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase de E. coli tendo SEQ ID Nos 109 e 111; (b) fenilalanina amônia-liase com uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica à sequência de aminoácido tendo SEQ ID No.117.
86. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que ainda compreende introduzir em uma célula ou organismo o cassete de expressão contendo: (a) um domínio de iniciação de transcrição, que é funcional em uma célula hospedeira; (b) um ácido nucleico, que codifica o policetídeo sintase tipo III, de acordo com a reivindicação 72, e (c) um domínio de terminação de transcrição, que é funcional na célula hospedeira, em que a dita célula adquire a capacidade de bioluminescência na presença de exógeno ou endógeno cafeoil-CoA.
87. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que ainda compreende introduzir em uma célula ou organismo um cassete de expressão contendo: (a) um domínio de iniciação de transcrição, que é funcional em uma célula hospedeira; (b) um ácido nucleico, que codifica a ligase de cumarato-CoA, e (c) um domínio de terminação de transcrição, que é funcional na célula hospedeira, em que a dita célula adquire a capacidade de bioluminescência na presença de ácido cafeico.
88. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a ligase de cumarato-CoA tem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 40 %, ou pelo menos 45 %, ou pelo menos 50 %, ou pelo menos 55 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %, ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, ou completamente idêntica à sequência com SEQ ID No. 141.
89. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 86 a 88, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de um ácido nucleico que codifica o cafeoilpiruvato hidrolase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 24, 25.
90. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 89, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução na célula ou organismo de ácidos nucleicos, que codificam as enzimas para biossíntese de ácido 3-arilacrílico a partir de metabólitos celulares.
91. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que as enzimas para biossíntese de ácido 3-arilacrílico são selecionadas a partir do grupo de: (a) tirosina amônia-liase com uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica ao aminoácido SEQ ID No. 107; componentes de HpaB e HpaC de 4-hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase pelo menos 40 % idêntica às sequências de aminoácidos de componentes de HpaB e HpaC de 4- hidroxifenilacetato 3-monooxigenase reductase de E. coli tendo SEQ ID Nos 109 e 111; (b) fenilalanina amônia-liase com uma sequência de aminoácido pelo menos 40 % idêntica à sequência de aminoácido tendo SEQ ID No.117.
92. ORGANISMO TRANSGÊNICO caracterizado pelo fato de que é capaz de bioluminescência na presença de 3-hidroxi-hispidina, e/ou hispidina, e/ou ácido cafeico, produzido usando qualquer um dos métodos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 91.
93. KIT PARA PRODUZIR HISPIDINA caracterizado pelo fato de que compreende o policetídeo sintase, de acordo com a reivindicação 72 e ligase de cumarato-CoA ou ácidos nucleicos que os codificam.
94. KIT PARA PRODUZIR UMA CÉLULA OU ORGANISMO BIOLUMINESCENTE caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica a hispidina hidroxilase, um ácido nucleico que codifica o policetídeo sintase, de acordo com a reivindicação 72, e um ácido nucleico que codifica a luciferase capaz de oxidar luciferina fúngica com emissão de luz.
95. KIT, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que ainda contém um ácido nucleico que codifica o cafeoilpiruvato hidrolase, de acordo com a reivindicação 19.
96. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 93 a 94, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um ácido nucleico que codifica a ligase de cumarato-CoA e/ou ácidos nucleicos que codificam enzimas para biossíntese do ácido 3-arilacrílico.
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