JP2021529536A - ルシフェリン生合成の酵素及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)以下の配列番号群:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28として提示されるアミノ酸配列;
(b)少なくとも350個のアミノ酸の範囲内で、以下の配列番号群:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性、又は少なくとも65%の同一性、又は少なくとも70%の同一性、又は少なくとも75%の同一性、例えば、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性(例えば、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98%又は99%の同一性)を有するアミノ酸配列;
(c)以下の配列番号29〜33として提示されるコンセンサス配列を含むアミノ酸配列。
(a)以下の配列番号:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55として提示されるアミノ酸配列;
(b)以下の配列番号群:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55から選択されるアミノ酸配列と少なくとも40%の同一性、例えば少なくとも45%の同一性、又は少なくとも50%の同一性、又は少なくとも55%の同一性、又は少なくとも60%の同一性、又は少なくとも65%の同一性、又は少なくとも70%の同一性、又は少なくとも75%の同一性、例えば、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性(例えば、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98%又は99%の同一性)を有するアミノ酸配列;
(c)以下の配列番号56〜63として提示されるコンセンサス配列を含むアミノ酸配列。
(a)以下の配列番号:65、67、69、71、73、75として提示されるアミノ酸配列;
(b)以下の配列番号群:65、67、69、71、73、75から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性、又は少なくとも65%の同一性、又は少なくとも70%の同一性、又は少なくとも75%の同一性、例えば、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性(例えば、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98%又は99%の同一性)を有するアミノ酸配列;
(c)非保存的アミノ酸挿入セグメントにより区切られた配列番号76〜78を有するコンセンサス配列を含むアミノ酸配列。
(E)−6−(3,4−ジヒドロキシスチリル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン(ヒスピジン)、
(E)−4−ジヒドロキシ−6−スチリル−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン(ビスノリアンゴニン)、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2−ヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2,4−ジヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシ−3−メトキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2−(6−ヒドロキシナフタレン−2−イル)ビニル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−6−(4−アミノスチリル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、
(E)−6−(4−(ジエチルアミノ)スチリル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、
(E)−6−(2−(1H−インドール−3−イル)ビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2,3,6,7−テトラヒドロ−1H,5H−ピリド[3,2,1−ij]キノリン−9−イル)ビニル)−2H−ピラン−2−オン
から選択される化学式6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンを有するプレルシフェリンを使用する。
本発明の対象に関連する様々な用語は、上述、並びに明細書及び特許請求の範囲において使用している。本発明の明細書における用語「〜から成る」及び「〜から成っている」は、「〜から成るが、これに限定されない」と解釈する。前記用語は、「〜のみから成る」と解釈することを意図したものではない。
前述のように、本発明は、酵素として真菌ルシフェリン生合成(形質転換の環状系)に関与するタンパク質を提供する。
リンゲル液は1リットルの二重蒸留水に溶解した6.5gのNaCl、0.42gのKCl、及び0.25gのCaCl2から成る。溶液を調製する際には、塩類を順次添加する。前に添加した塩が溶解した後でなければ、後続の各塩は添加しない。炭酸カルシウム沈降を防止するために、炭酸水素ナトリウム溶液に炭酸ガスを通すことを推奨する。溶液は新鮮な蒸留水で調製する。
バーゼン液はEDTA及び無機塩類の混合物であり、蒸留水又は注射用水に溶解し、最終孔径が0.22μmのフィルターを用いた膜ろ過により滅菌してある。1リットルのバーゼン液は、8.0gのNaCl、0.2gのKCl、1.45gのリン酸二ナトリウム十二水和物、0.2gのリン酸二水素カリウム、0.2gのパルケレート(palkelate)、及び1リットルにメスアップするための二重蒸留水から成る。バーゼン液の緩衝能は1.4mlである必要がある。塩化物イオン含有量は4.4〜5.4g/lであり、EDTA量は最小で0.6mmol/lである。
Na−リン酸緩衝液は、137mMのNaCl、10mMのNa2HPO4、1.76 mMのKH2PO4から成る。緩衝液はまた、最大2.7mMの濃度でKClを含むことが可能である。1リットルの通常の強度のNa−リン酸緩衝液を調製するために、以下を使用する:8.00gのNaCl、1.44gのNa2HPO4、0.24gのKH2PO4、及び0.20gのKCl(任意)。800mlの蒸留水に溶解する。塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて所望のpHを調整する。次いで、蒸留水を総量1リットルになるように加える。
本発明のヒスピジン−ヒドロキシラーゼは、プレルシフェリンからのルシフェリン合成を触媒することが可能なタンパク質である。換言すれば、ヒスピジン−ヒドロキシラーゼは、6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンを6−(2−アリールビニル)−3,4−ジヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンに変換する反応を触媒する酵素である。当該6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンは下記構造式を有する。
本発明のヒスピジン−シンターゼは、その前駆体からのプレルシフェリン合成を触媒できるタンパク質である。換言すれば、ヒスピジン−シンターゼは、3−アリールアクリル酸を6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンに形質転換する反応を触媒する酵素である。当該3−アリールアクリル酸は下記構造式を有する。式中Rはアリール又はヘテロアリールである。
本発明のカフェオイルピルビン酸ヒドロラーゼは、3−アリールアクリル酸への6−アリール−2−ヒドロキシ−4−オキソヘキサ−2,5−ジエン酸であるオキシルシフェリンの形質転換を触媒できるタンパク質である。当該6−アリール−2−ヒドロキシ−4−オキソヘキサ−2,5−ジエン酸は下記構造式を有する。式中、Rはアリール又はヘテロアリールである。
本発明は、短縮型及び伸長型を含む、真菌ルシフェリン生合成の酵素をコードする核酸、そのタンパク質の変異体及び相同体を提供する。
好ましい実施形態では、本発明の核酸は、6−(2−アリールビニル)−3,4−ジヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン(真菌ルシフェリン)への6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン(プレルシフェリン)の形質転換の反応を触媒できるタンパク質をコードする。当該6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンは下記構造式を有する。
好ましい実施形態では、本発明の核酸は、6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンへの3−アリールアクリル酸の形質転換の反応を触媒できるタンパク質をコードする。当該3−アリールアクリル酸は下記構造式を有する。式中、Rはアリール又はヘテロアリールである。
好ましい実施形態では、本発明の核酸は、3−アリールアクリル酸へのオキシルシフェリンの形質転換の反応を触媒できるタンパク質をコードする。当該オキシルシフェリンは下記構造式を有する。式中、Rはアリール又はヘテロアリールである。
本発明の核酸を発現するトランスジェニック有機体、トランスジェニック細胞及びトランスジェニック細胞株も提供する。本発明のトランスジェニック細胞は、導入遺伝子として存在する本発明で検討されている1種又は数種の核酸を含む。本発明の目的のために、原核宿主細胞(例えば、大腸菌、ストレプトマイセス属(Streptomyces sp.)、枯草菌、好酸性乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)等)又はヒト胚細胞ではない真核宿主細胞を含む任意の好適な宿主細胞を使用できる。本発明のトランスジェニック有機体は、細菌、シアノバクテリア、真菌、植物及び動物を含む原核又は真核有機体とすることが可能であり、ここでは、本発明の異種核酸から成る1種以上の有機体細胞は、例えば、当技術分野で公知のトランスジェニック技術に沿って、人為的操作により組み込むことで導入される。
本明細書では、用語「抗体」は、少なくとも1つの抗体活性部位(抗原結合部位)を含むポリペプチド又はポリペプチド群を指す。用語「抗原結合部位」とは、表面パラメータ及び電荷分布が抗原エピトープと相補的である空間構造を指し:抗原結合部位は、関連する抗原との抗体結合を促進する。用語「抗体」は例えば、脊椎動物の抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体、ヒト化抗体、修飾抗体、一価抗体、Fab断片、及び単一ドメイン抗体を包含する。
本発明は、プレルシフェリン(即ち、6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン)からのルシフェリン合成の反応(1)を触媒する酵素としての真菌ルシフェリン生合成タンパク質(即ち、6−(2−アリールビニル)−3,4−ジヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン(真菌ルシフェリン))の応用を提供する。当該6−(2−アリールビニル)−3,4−ジヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンは下記構造式を有する。式中、Rはアリール又はヘテロアリールである。
生理条件を形成して反応を実行するために必要な成分から成るルシフェラーゼの組合せに、被験生物学的対象物又はその対象物から得た抽出物を接触させることが含まれる。当業者であれば、この条件を満たす様々な反応緩衝液を作成できる。反応緩衝液の非限定的な例としては、0.5MのNa2SO4、0.1%のドデシルマルトシド(DDM)、1mMのNADPH、10mMのATP、1mMのCoA、及び1mMのマロニル−CoAを添加した0.2Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0〜8.0)が挙げられる。
本発明の次の実施形態は、好ましくは宿主細胞における標的タンパク質発現を促進するための要素、例えば標的タンパク質をコードする核酸から成る発現ベクター又はカセットを有する上述のヒスピジンヒドロキシラーゼ、又はヒスピジンシンターゼ、又はカフェイルピルビン酸ヒドロラーゼ、又は前記酵素をコードする核酸を含む製品である。あるいは、核酸は、標的ベクターへの組み込みのための隣接配列から構成することが可能である。核酸は、標的制御要素の簡単なクローニングを目的とした無プロモーターベクターに含ませることが可能である。組換えタンパク質は凍結乾燥可能であり、又は緩衝液に溶解することも可能である。核酸は凍結乾燥させるか、アルコール溶液中に沈殿させるか、水又は緩衝液に溶解することが可能である。
シロヒカリタケ菌糸体から全RNAを[Chomczynski及びSacchi、Analytical Biochemistry、1987年、第162号、p.156−159]に記載の方法に従って単離した。メーカーのプロトコルに従ってSMART PCR cDNA Synthesis Kit(Clontech社、米国)を用いてcDNAを増幅した。得られたcDNAをルシフェラーゼのコード配列の増幅に用いた。このヌクレオチド及びアミノ酸配列を配列番号:79及び80に示す。コード配列をメーカーのプロトコルに従ってpGAPZベクター(Invitrogen社、米国)にクローニングし、XL1 Blue株の大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。細菌を抗生物質ゼオシンの存在下、シャーレ上で培養した。16時間後、コロニーをシャーレからすすぎ、集中的に混合し、プラスミドDNA単離キット(Evrogen社、ロシア)を用いてコロニーからプラスミドDNAを単離した。単離したプラスミドDNAを制限部位AvrIIで線状化し、ピキア・パストリスGS115細胞の形質転換に用いた。電気穿孔を、[Wu及びLetchworth、Biotechniques、2004年、第36号:p.152−4]に記載されている酢酸リチウム及びジチオスレイトールを用いる方法に従って行った。電気穿孔した細胞を、1Mのソルビトール、2%(重量/体積)のグルコース、1.34%(重量/体積)の酵母窒素塩基(YNB)、0.005%(重量/体積)のアミノ酸混合物、0.00004%(重量/体積)のビオチン、及び2%(重量/体積)の寒天から成るRDB培地を含むシャーレに分散させた。得られたコロニーに3−ヒドロキシヒスピジン溶液を噴霧し、発光の発生により細胞内のルシフェラーゼの存在を検出した。コロニーが放出した発光は、IVIS Spectrum CT(PerkinElmer社、米国)を用いて検出した。3−ヒドロキシヒスピジンの添加に反応して発光が検出されたコロニーを更なる研究のために選択した。
実施例1に従って得たシロヒカリタケ由来のヒスピジンヒドロキシラーゼ及びルシフェラーゼのコード配列を、哺乳動物細胞での発現に最適化(ヒト化)した。最適化した核酸(配列番号:99及び100)を合成的に得た。融合タンパク質mKate2−ケラチンをコードする配列の代わりに制限部位NheI及びNotIを用いて、ヒスピジンヒドロキシラーゼのコード配列をpmKate2−ケラチンベクター(Evrogen社、ロシア)にクローニングした。ルシフェラーゼ配列をPCRで増幅し、制限エンドヌクレアーゼNheI及びEcoRV(New England Biolabs社、Ipswich、マサチューセッツ州)で処理し、レンチウイルスベクターpRRLSIN.cPPT.EF1にライゲーションした。プラスミドDNA精製キット(Evrogen社)を用いてラスミドDNAを精製した。ルシフェラーゼ遺伝子から成るプラスミドDNAを用いて、安定的に発現する系統HEK293NTの開発を行った。メーカーのウェブサイトに提供されているプロトコルに従って、HELK293T細胞のカルシウム−リン酸トランスフェクション(Invitrogen社、Carllsbad、カリフォルニア州)によりベクター粒子を得た。トランスフェクションの24時間前に、1,500,000個の細胞を60mmの培養皿に入れた。トランスフェクションには、約4μg及び1.2μgのパッケージングプラスミドpR8.91及びpMD.G、並びにルシフェラーゼ配列から成る5μgのトランスファープラスミドを使用した。トランスフェクションから24時間後にウイルス粒子を回収し、10倍濃縮し、HEK293NT細胞の形質導入に使用した。HEK293NT細胞の約100%がシロヒカリタケルシフェラーゼを安定的に発現した。
実施例2に従って得られたシロヒカリタケのルシフェラーゼ及びヒスピジンヒドロキシラーゼを発現するHEK293NT細胞を、0.025%のトリプシンを添加したバーゼン液によるトランスフェクションの24時間後にシャーレからすすぎ、遠心分離により培地をpH8.0のリン酸緩衝生理食塩水で置換した後、細胞を再懸濁し、メーカー推奨条件でBioruptor(Diagenode社、ベルギー)を用いて0℃で最大7分間超音波処理して溶解し、1mMのNADPH(Sigma−Aldrich社、米国)、及びヒスピジン、又はその類似体の1種を、660μg/mlの濃度で以下を含む培地に添加した:(E)−4−ヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、(E)−6−(2−(1H−インドール−3−イル)ビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、(E)−6−(2−(1,2,3,5,6,7−ヘキサヒドロピリド[3,2,1−ij]キノリン−9−イル)ビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、(E)−6−(4−(ジエチルアミノ)スチリル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、又は(E)−4−ヒドロキシ−6−(2−(6−ヒドロキシナフタレン−2−イル)ビニル)−2H−ピラン−2−オン。生物発光スペクトルを分光光度計Varian Cary Eclipseで検出した。前記ヒスピジン機能性類似体全てを添加したときに溶菌液中の発光が観察された。使用のルシフェリンに応じて、予想した発光ピークの変位が観察された。
実施例1及び2に従って得られたシロヒカリタケ由来のヒスピジン−3−ヒドロキシラーゼ及びルシフェラーゼをコードする核酸の5’末端にポリヒスチジン配列(Hisタグ)を操作的に付加した。得られた構造体を制限エンドヌクレアーゼBamHI及びHindIIIを用いてpET−23ベクターにクローニングした。このベクターを、BL21−DE3株の大腸菌細胞の形質転換に使用した。この細胞を1.5%の寒天及び100μg/mlのアンピシリンから成るLB培地を含むシャーレに分散させ、37℃で一晩インキュベートした。次いで、アンピシリンを含む4mlの液体LB培地に大腸菌コロニーを移し、37℃前後で一晩インキュベートした。一晩培養した培養物1mlを、アンピシリンを予備的に添加した100mlのOvernight Express Autoinduction培地(Novagen社)に移した。培養液を600nmで0.6OEの光学密度に達するまで37℃で最大2.5時間培養し、その後室温で最大16時間培養した。その後、4500rpmで、遠心分離機Eppendorf5810Rにおいて最大20分間細胞をペレット化し、35mlの緩衝液(50mMのТris HCl рН8.0、150mMのNaCl)に再懸濁した。細胞を超音波処理し、再度ペレット化した。組換えタンパク質の精製には、TALON樹脂金属親和性クロマトグラフィー(Clontech社、米国)を使用した。予測した組換え生成物の存在を電気泳動により確認した。
実施例4に従って得たシロヒカリタケから単離した組換えヒスピジンヒドロキシラーゼを、100μlの緩衝液(0.2MのNa−リン酸緩衝液、0.5MのNa2SO4、0.1%のドデシルマルトシド(DDM)pH8.0)中1mMのNADPH及び0.2μMのヒスピジン、及び(E)−4−ヒドロキシ−6−スチリル−2H−ピラン−2−オン又は(E)−4−ヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オンを含む反応混合液に添加した。30分後、標準として合成ルシフェリンを用いてHPLCにより反応混合液を分析した。クロマトグラフィーから、3位ヒドロキシル化誘導体:3−ヒドロキシヒスピジン、(E)−3,4−ジヒドロキシ−6−スチリル−2H−ピラン−2−オン及び(E)−3,4−ジヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オンに対応するピークの発生が実証された。
実施例2に従って得られたシロヒカリタケのヒスピジンヒドロキシラーゼ及びルシフェラーゼをコードするヒト化DNA配列を、アミノ酸配列GGSGGSGGS(配列番号:115)を有する柔軟な短鎖ペプチドリンカーで互いに操作的に架橋した。得られた融合タンパク質のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を配列番号101及び102に示す。融合タンパク質をコードする核酸を、サイトメガロウイルスプロモーター制御下でEGFP遺伝子の代わりにpEGFP−N1ベクター(Clontech社、米国)にクローニングした。得られた構造体をHEK293T細胞にトランスフェクトした。ヒスピジンヒドロキシラーゼ及びルシフェラーゼの個々の遺伝子から成る類似体ベクターもコトランスフェクトした。トランスフェクションは、トランスフェクション剤FuGENE HD(Promega社、米国)を用いて、メーカーのプロトコルに従って実施した。トランスフェクションから24時間後に、100万個の細胞を0.5mlのPBSに再懸濁し、ヒスピジンを添加しない場合とヒスピジンを添加した場合(細胞100万個あたり10μg)の発光をルミノメーターで記録した。ヒスピジン添加により、緑色スペクトルで細胞発光が生じた(図6)。また、3−ヒドロキシヒスピジンの添加でも、生物発光シグナルが生じた。ヒスピジンヒドロキシラーゼ及びルシフェラーゼ融合タンパク質の発現により、細胞生物発光標識のための1つのルシフェラーゼの代わりに、より安定なルシフェリン前駆体(ヒスピジン、ビスノリアンゴニン等)を用いることができるため、2つの核酸の細胞へのコトランスフェクションは必要ない。
シロヒカリタケ(配列番号:1)及びナラタケ(配列番号:19)のヒスピジンヒドロキシラーゼのコード配列を直鎖二本鎖DNAの形態で合成的に得て、組換えタンパク質がN末端でヒスチジンタグを含むように、発現ベクターpQE−30(Qiagen社、ドイツ)にクローニングした。大腸菌で発現させた後、金属親和性樹脂TALON(Clontech社、米国)を用い、変性条件下で組換えタンパク質を精製した。フロイントアジュバントで乳化した精製タンパク質生成物を、1ヶ月間隔で4回、ウサギ免疫に使用した。免疫後10日目又は11日目にウサギを採血した。得られたポリクローナル抗血清の活性を、実施例4に従って得られた精製組換えヒスピジンヒドロキシラーゼのパネルにおいてELISA法及びウェスタン免疫ブロット法により試験した。
また、ナラタケのタンパク質をウサギに免疫して得られた抗体は、ナラタケ、ワタゲナラタケ、オニナラタケ及びアシグロナラタケの変性及び未変性ヒスピジンヒドロキシラーゼに対して活性を示した。
シロヒカリタケヒスピジンヒドロキシラーゼ及びルシフェラーゼのコード配列をヒメツリガネゴケの苔細胞での発現に最適化した。次に、インシリコで、イネaktI遺伝子のプロモーター、植物細胞での発現に最適化されたヒスピジンヒドロキシラーゼ配列をコードするヒトサイトメガロウイルス5’−非翻訳領域(配列番号103)、終止コドン、アグロバクテリウム(Agrobacterium)osc遺伝子ターミネーター配列、イネユビキチンプロモーター、コケ細胞での発現に最適化されたシロヒカリタケルシフェラーゼ(配列番号112)のコード配列、及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)nos遺伝子ターミネーターから成る発現カセットを作成した。
ヒスピジンなどの真菌ルシフェリン前駆体は、化合物の大規模なグループ ― ポリケチド誘導体に関連している。このような化合物は理論的には、3−アリールアクリル酸から得られ、3−アリールアクリル酸では、アリール又はヘテロアリールを含む芳香族置換基は3位の置換基である。ポリケチド及びその誘導体の合成に関与する酵素がポリケチドシンターゼタンパク質スーパーファミリーに関連する多ドメイン複合体であることは、当技術分野で知られている。同時に、置換された4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンへの3−アリールアクリル酸の形質転換を触媒できるポリケチドシンターゼは当技術分野では知られていない。シロヒカリタケcDNAライブラリーのスクリーニングを用いて、標的ポリケチドシンターゼを探索した。
実施例1に従って得た生物発光性真菌からの全ゲノム配列決定のデータを用いて、シロヒカリタケヒスピジン−シンターゼ及びカフェイルピルビン酸ヒドロラーゼの相同体を検索した。相同体検索は、アメリカ国立生物工学情報センターが提供するソフトウェアを用いて行った。NCBI Genbankデータベースの真菌ゲノム配列決定のデータにおいてアミノ酸配列を検索した。検索には標準的な検索パラメータblastpを使用した。
実施例9に従って得られたシロヒカリタケのヒスピジンシンターゼ及びカフェイルピルビン酸ヒドロラーゼをコードする核酸の5’末端にポリヒスチジン(Hisタグ)コード配列を操作的に付加し、得られた構造体を制限エンドヌクレアーゼNotI及びSacIを用いてpET−23ベクターにクローニングした。このベクターを、電気穿孔により行うBL21−DE3−コドン+株の大腸菌細胞の形質転換に使用した。この形質転換細胞を1.5%の寒天及び100μg/mlのアンピシリンから成るLB培地を含むシャーレに分散させ、37℃で一晩インキュベートした。次いで、100μg/mlのアンピシリンを含む4mlの液体LB培地に大腸菌コロニーを移し、37℃前後で一晩インキュベートした。一晩培養した培養物1mlを、アンピシリンを予備的に添加した200mlのOvernight Express Autoinduction培地(Novagen社)に移した。培養液を600nmで0.6OEの光学密度に達するまで37℃で最大3時間インキュベートし、その後室温で最大16時間インキュベートした。その後、4500rpmで、遠心分離機Eppendorf5810Rにおいて最大20分、細胞をペレット化し、20mlの緩衝液(50mMのТris HCl рН8.0、150mMのNaCl)に再懸濁し、メーカーが推奨する条件でBioruptor(Diagenode社、ベルギー)中、0℃で最大7分間超音波処理して溶解し、再度ペレット化した。Talon樹脂親和性クロマトグラフィー(Clontech社、米国)により溶菌液からタンパク質を得た。予測した長さのバンドが利用可能であったため、予測した組換え生成物の存在を電気泳動により確認した。
J23100プロモーター制御下にあるシロヒカリタケヒスピジン−シンターゼ(配列番号34、35)をコードする核酸から成る発現カセット、及びSS9部位の相同領域によりloxPが導入され、araBADプロモーターの制御下にあるアスペルギルス・ニデュランス由来の4’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼのNpgA遺伝子(配列番号104、105)から成る発現カセットを合成的に得て、ゼオシン耐性カセットから成る細菌発現ベクターにクローニングした。得られた構造体は、ゼオシン耐性の選択を利用して、Bassaloら[ACS Synthetic Biology、2016年7月15日;第5号(7):p.561−8]に記載のラムダバクテリオファージタンパク質媒介組換えにより、大腸菌BW25113ゲノムへの形質転換及び組み込みに使用した。SS9相同領域に特異的なプライマーからのPCRにより、全長構造の組み込みを確認した後、サンガー法によるゲノムDNAのPCR生成物の配列決定により、組み込まれた構造の適切性を検証した。
J23100プロモーター制御下にあるシロヒカリタケヒスピジンヒドロキシラーゼ(配列番号1、2)をコードする核酸から成る発現カセットを合成的に得て、スペクチノマイシン耐性遺伝子から成る細菌発現ベクターにクローニングした。得られたベクターを、実施例12に従って得たシロヒカリタケヒスピジン−シンターゼ、ゼオシン耐性遺伝子、及びNpgA遺伝子を発現する大腸菌細胞に形質転換した。得られた菌体を用いて、実施例12に記載のプロトコルに従って発酵により3−ヒドロキシヒスピジンを生成したが、培養に用いた全ての培地に50mg/mlの濃度でスペクチノマイシンを添加した。48時間の培養後、培地中の3−ヒドロキシヒスピジン濃度は2.3g/lであった。発酵培地及びHPLCで培地から精製した3−ヒドロキシヒスピジンは、シロヒカリタケルシフェラーゼとの生物発光反応に活性であった。
チロシンから生合成ヒスピジンを生成するために、チロシン及びコーヒー酸を効果的に生成する大腸菌株を得た。大腸菌株は、[Lin及びYan.、Microbial Cell Factories、2012年4月4日;第11号:p.42]の記載のとおりに得た。細菌細胞によりアラビノースの均一な消費を可能にするattB部位にacY(lacY A177C)パーミアーゼの変異遺伝子を組み込んだ大腸菌BW25113株を、菌株開発の基礎とした。ロドバクター・キャプスラータのチロシン−アンモニア−リアーゼ遺伝子(配列番号:106、107)、大腸菌4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼの構成要素HpaB及びHpaC(配列番号:108〜111)のコード配列から成る発現カセットを、それぞれ構成的J23100プロモーターの制御下で合成的に得て、実施例12に記載したように大腸菌株のゲノムに組み込んだ。次の工程で、実施例12に従って得られ、構成的J23100プロモーターの制御下にあるシロヒカリタケヒスピジン−シンターゼのコード配列から成るプラスミド、pGAP−Zベクター由来のゼオシン耐性カセット、及びNpgA遺伝子を大腸菌ゲノムに組み込んだ。大腸菌ゲノムへの組み込みは、[Bassaloら、ACS Synth Biol.、2016年;第5号(7):p.561−568]の手法に従って、ラムダバクテリオファージタンパク質媒介組換えにより行った。SS9相同領域(5’−CGGAGCATTTTGCATG−3’及び5’−TGTAGGATCAAGCTCAG−3’)に特異的なプライマーからのPCRにより全長構造の組み込みを確認した後、サンガー法によるゲノムDNAのPCR生成物の配列決定により、組み込まれた構造の適切性を検証した。得られた菌株を、発酵槽での生合成ヒスピジンの生成に用いた。
自律生物発光酵母ピキア・パストリスの生育を目的として、GAPプロモーター及びtAOX1ターミネーターの制御下で、シロヒカリタケルシフェラーゼ(配列番号: 79、80)、シロヒカリタケヒスピジンヒドロキシラーゼ(配列番号:1、2)、シロヒカリタケヒスピジン−シンターゼ(配列番号:34、35)、シロヒカリタケカフェイルピルビン酸ヒドロラーゼ(配列番号:64、65)、アスペルギルス・ニデュランスNpgAタンパク質(配列番号:104、105)、ロドバクター・カプスラータチロシン−アンモニア−リアーゼ(配列番号:106、107)、並びに大腸菌4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼの構成要素HpaB及びHpaC(配列番号:108〜111)のコード配列から成る発現カセットを合成した。各発現カセットは、BsmBI制限酵素認識配列によりloxPが導入された。BsmBI制限酵素部位でloxPが導入されたMET6ピキア・パストリス遺伝子(Uniprot、F2QTU9)に対する相同領域も合成的に得た。合成DNAをBsmBI制限酵素で処理し、[Iversonら、ACS Synthetic Biology、2016年1月15日;第5号(1):p.99−103]に記載されているGolden Gateクローニングプロトコルに従って1つのプラスミドに結合させた。DNAリガーゼ用通常強度緩衝液(Promega社、米国)、20単位のDNAリガーゼ活性(Promega社、米国)、10単位のDNA制限エンドヌクレアーゼ活性から成る合計10μlの体積の反応液に、10fmolの各DNA断片を混合した。得られた反応混合物を増幅器に入れ、以下のプロトコルに従って16℃及び37℃でインキュベートした:37℃最大1.5分及び16℃3分での25サイクルのインキュベーション、次いで50℃最大5分の単回インキュベーション、次いで80℃最大10分の単回インキュベーション。反応混合物5μlを大腸菌化学的コンピテント細胞に形質転換した。プラスミドDNAアセンブリの適切性をサンガー法で確認し、精製したプラスミドDNA生成物を、電気穿孔によるピキア・パストリスGS11細胞の形質転換に使用した。電気穿孔は、[Wu及びLetchworth、Biotechniques、2004年、第36号:p.152−4]に記載の酢酸リチウム及びジチオスレイトールを用いた方法に従って行った。電気穿孔した細胞を、1Mのソルビトール、2%(重量/体積)のグルコース、1.34%(重量/体積)の酵母窒素塩基(YNB)、0.005%(重量/体積)のアミノ酸混合物、0.00004%(重量/体積)のビオチン、及び2%(重量/体積)の寒天から成るRDB培地を含むシャーレに分散させた。ゲノムへの遺伝子カセットの組み込みは、相同領域でアニーリングしたプライマーからのPCRにより確認した。得られた正しいゲノムインサートを含む酵母株は、野生酵母株とは対照的に自律的に発光できた(図7、8)。
pBI121ベクター(Chlontech社、米国)に基づく自律生物発光顕花植物の生育を目的として、植物での発現に最適化したシロヒカリタケルシフェラーゼ(配列番号:112)、シロヒカリタケヒスピジンヒドロキシラーゼ(配列番号:103)、シロヒカリタケヒスピジン−シンターゼ(配列番号:113)、シロヒカリタケカフェイルピルビン酸ヒドロラーゼ(配列番号:114)、及びカナマイシン耐性遺伝子のコード配列から成るアグロバクテリウム形質転換用バイナリーベクターを形成した。各遺伝子はカリフラワー(cauliflower)モザイクウイルス由来の35Sプロモーターの制御下にある。発現カセットアセンブリの配列を合成的に得た。[Iversonら、ACS Synthetic Biology、2016年1月15日;第5号(1):p.99−103]に記載されているGolden Gateクローニングプロトコルに従ってベクターを組み立てた。
実施例8に記載の方法を用いてプラスミドとのプロトプラスト共形質転換することにより、自律的に生物発光するコケのヒメツリガネゴケを生育した。植物における発現のために最適化された、シロヒカリタケルシフェラーゼ(配列番号:112)、シロヒカリタケヒスピジンヒドロキシラーゼ(配列番号:103)、シロヒカリタケヒスピジン−シンターゼ(配列番号:113)、シロヒカリタケカフェイルピルビン酸ヒドロラーゼ(配列番号:114)及びカナマイシン耐性遺伝子のコード配列を含む発現カセットを合成的に得た。各酵素はイネアクチン2プロモーターの制御下にある。発現カセットをpBI121ベクター(Clontech社、CШA)に操作的に架橋し、コケゲノム標的遺伝子座配列と一致する配列で、全代謝カスケード及びカナマイシン耐性遺伝子を含む構造にloxPが導入されるようにした。ベクターを、Golden GateクローニングプロトコルGolden Gateに従って組み立てた[Iversonら、ACS Synthetic Biology、2016年1月15日;第5号(1):p.99−103]。コケゲノム中の標的領域に相補的なガイドRNA遺伝子もベクターにクローニングした。[Coveら、Cold Spring Harbor Protocols、2009年、第2号]に記載のポリエチレングリコール形質転換プロトコルに従って、特定した遺伝子を有するプラスミドと、Cas9ヌクレアーゼを構成的に発現させるためのプラスミドとを共形質転換した。得られた形質転換プロトプラストをBG−11培地で最大24時間、暗条件下でインキュベートし、BG−11培地及び8.5%寒天を入れたシャーレに移した。シャーレでの生育から1ヶ月後、連続照明でIVIS Spectrum In Vivo Imaging System(Perkin Elmer社)での可視化を行った。被験植物の70%は、野生型植物からのシグナルより最低でも1桁上回る発光を放出した。
シロヒカリタケヒスピジンヒドロキシラーゼの遺伝子から成るトランスジェニック魚類であるゼブラフィッシュ(Danio rerio)を、[Hisanoら、Scientific Reports、2015年、第5号:p.8841]に記載の技術に従って作成した。この技術には、ガイドRNAの発現と、ガイドRNA配列に相同な領域に中断点を作るためのCas9ヌクレアーゼの発現が含まれる。トランスジェニック動物の生育を目的として、バクテリオファージポリメラーゼT7プロモーターの制御下で、pX330プラスミド、Addgene#42230由来のガイドRNA配列、及びCas9ヌクレアーゼのmRNAから成る合成DNA断片を整えた。得られた断片を、MAXIscript T7キット(Life Technologies社、米国)の試薬を用いてインビトロ転写に用い、合成したRNAをDNA単離キット(Evrogen社、ロシア)を用いて精製した。
自律発光有機体の発光に対するカフェイルピルビン酸ヒドロラーゼの影響を検討する目的で、シロヒカリタケルシフェラーゼ、シロヒカリタケヒスピジンヒドロキシラーゼ、シロヒカリタケヒスピジンシンターゼ、シロヒカリタケカフェイルピルビン酸ヒドロラーゼ、及びカナマイシン耐性遺伝子のコード配列から成るアグロバクテリウム形質転換用のバイナリーベクターを使用した。各遺伝子は、実施例16に従って得られたカリフラワーモザイクウイルス由来の35Sプロモーターの制御下にあり、対照ベクターは被験ベクターからカフェイルピルビン酸ヒドロラーゼ配列を除去していることを特徴とする。これらのベクターを用いて、実施例16に記載のプロトコルに従って、同じ条件でシロイヌナズナの形質転換を行った。生物発光をIVIS Spectrum In Vivo Imaging System(Perkin Elmer社)を用いて可視化した。シロヒカリタケ生物発光系の4つの遺伝子全てを発現する植物の生物発光強度を、ルシフェラーゼ、ヒスピジンヒドロキシラーゼ及びヒスピジンシンターゼのみを発現する植物と比較したところ、カフェイルピルビン酸ヒドロラーゼを追加的に発現する植物は平均で8.3倍明るい生物発光を示すことが明らかになった。提供されたデータから、カフェイルピルビン酸ヒドロラーゼは生物発光カスケード効率の増加を可能にし、植物が発する発光の強度を増加させることが分かる。
実施例16に従って得られた自律生物発光トランスジェニック植物ベンサミアナタバコを土壌に移植し、最大8週間培養した。次いで、植物の茎を切断し、2時間水中に設置し、その後、IVIS Spectrum In Vivo Imaging System(Perkin Elmer社)により生物発光強度を測定した。次いで、植物をコーヒー酸濃度0.4g/l、0.8g/l、1.6g/l、3.2g/l、6.4g/lの5種類の水溶液の1つに移し、対照植物を水中に設置した。コーヒー酸溶液又は水中で更に2時間インキュベーションした後、生物発光強度を再度測定した。いずれの場合も、コーヒー酸溶液でインキュベートした植物の生物発光強度は、コーヒー酸溶液に設置する前の強度と比較して増加しており、6.4g/lの濃度の溶液でインキュベートした植物で最も大きな変化が観察された。水中でインキュベートした対照植物は、インキュベート開始後4時間以内に生物発光強度に有意な変化を示さなかった。
シロヒカリタケヒスピジンヒドロキシラーゼ、ヒスピジンシンターゼ及びルシフェラーゼのコード配列を使用し、数種のプロモーターの同時活性化を監視した。合成発現カセットは、アラビノースにより誘導した大腸菌araBADプロモーターの制御下にあるシロヒカリタケヒスピジンシンターゼ(配列番号:34、35)のコード配列、IPTGにより誘導したT7/lacOプロモーターの制御下にあるヒスピジンヒドロキシラーゼのコード配列(配列番号:1、2)、及びラムノースにより誘導したpRhaプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子(配列番号:79、80)、並びに構成的なJ23100プロモーターの制御下にあるNpgA遺伝子(配列番号:104、105)(Registry of Standard Biological parts、Part:BBa_J23100)から成る。得られた合成核酸を、LacZ遺伝子から成るインサートの代わりに、BpiI制限エンドヌクレアーゼを用いて、MoClo_Level2ベクター[Weberら、PLoS One、2011年2月18日、第6号(2):p.e16768]にクローニングした。得られたベクターを、T7バクテリオファージポリメラーゼのゲノムコピーから成る大腸菌BL21(NEB社、米国)株コンピテント細胞に形質転換した。
1.1%アラビノースを添加したLB培地、
2.0.2%ラムノースを添加したLB培地、
3.0.5%IPTGを添加したLB培地、
4.1%アラビノース及び0.2%ラムノースを添加したLB培地、
5.1%アラビノース及び0.5%IPTGを添加したLB培地、
6.0.2%ラムノース及び0.5%IPTGを添加したLB培地、
7.1%アラビノース、0.2%ラムノース、及び0.5%IPTGを添加したLB培地、
8.LB培地(対照)。
実施例1に従って得たシロヒカリタケヒスピジンヒドロキシラーゼ及びルシフェラーゼのコード配列を、T7プロモーターの制御下でpET23ベクターにクローニングした。精製プラスミドDNA生成物を、PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit(NEB社、米国)を用いて、インビトロでのタンパク質転写及び翻訳に使用した。反応混合物100μlに2μlの植物溶解液を添加し、ルミノメーターGloMax(Promega社、米国)で発光強度を記録することにより、約19種類の植物、キク種(Chrysanthemum sp.)、パイナップル(Ananas comosus)、ペチュニア・アトキンシアナ(Petunia atkinsiana)、オウシュウトウヒ(Picea abies)、セイヨウイラクサ(Urtica dioica)、トマト(Solanum lycopersicum)、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)、タバコ(ニコチアナ・トバクム)、シロイヌナズナ、ロサ・グラウカ(Rosa glauca)、ロサ・ルビギノーサ(Rosa rubiginosa)、ツクシ(Equisetum arvense)、エクィセトゥム・テルマテイア(Equisetum telmateia)、ポリガラ・サブロサ(Polygala sabulosa)、ハマナス(Rosa rugosa)、ヤエヤマセンニンソウ(Clematis tashiroi)、カランコエ種(Kalanchoe sp.)コムギ(Triticum aestivum)、カーネーション(Dianthus caryophyllus)の溶解液中におけるヒスピジンの存在及び濃度並びにその機能性類似体を分析するために、得られた反応混合物を用いた。最大濃度のヒスピジン及びその機能性類似体はツクシ及びエクィセトゥム・テルマテイアの溶解液中にあると判定された。また、ポリガラ・サブロサ、ハマナス及びヤエヤマセンニンソウ中にもヒスピジン又はその機能性類似体が同定された。
ヒスピジンなどの真菌ルシフェリン前駆体はポリケチド誘導体群に関連する。植物におけるポリケチド合成に関与する酵素はポリケチドシンターゼタンパク質スーパーファミリーに関連し、植物ポリケチドシンターゼは、真菌ポリケチドシンターゼとは対照的に、3−アリールアクリル酸を含む酸のCoAエーテルを用いた比較的小型のタンパク質であることは当技術分野で公知である。また、ヒスピジンへのコーヒー酸CoAエーテルの形質転換を触媒できるポリケチドシンターゼは当技術分野で公知ではないが、ヒスピジンは多くの植物有機体に存在する。
アクイラリア・シネンシス(Aquilaria sinensis)(2種の酵素)、
アジサイ(Hydrangea macrophylla)、
シロイヌナズナ、
ニセツリガネゴケ(Physcomitrella patens)、
イタドリ(Polygonum cuspidatum)、
ショウヨウダイオウ(Rheum palmatum)、
レウム・タタリカム(Rheum tataricum)、
ワケンドルフィア・シルシフロラ(Wachendorfia thyrsiflora)、
カヴァ(Piper methysticum)(2種の酵素)。
組合せ1:
組成:(a)配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28の群から選択されるアミノ酸配列を有するヒスピジンヒドロキシラーゼをコードする核酸;及び(b)配列番号:80、82、84、86、88、90、92、94、96、98の群から選択されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼをコードする核酸。
組成:(a)配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28の群から選択されるアミノ酸配列を有するヒスピジンヒドロキシラーゼをコードする核酸;及び(b)配列番号:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55の群から選択されるアミノ酸配列を有するヒスピジン−シンターゼをコードする核酸。
組合せ2で規定した全成分、及び配列番号:80、82、84、86、88、90、92、94、96、98の群から選択されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼをコードする核酸が含まれる。
組合せ3で規定した全成分、及び配列番号:65、67、69、71、73、75の群から選択されるアミノ酸配列を有するカフェイルピルビン酸ヒドロラーゼをコードする核酸が含まれる。
組成:(a)配列番号:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55の群から選択されるアミノ酸配列を有するヒスピジン−シンターゼをコードする核酸;及び(b)配列番号:105に示されるアミノ酸配列を有する4’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの遺伝子をコードする核酸。
組成:(a)配列番号:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55の群から選択されるアミノ酸配列を有するヒスピジン−シンターゼをコードする核酸;(b)配列番号:105に示すアミノ酸配列を有する4’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの遺伝子をコードする核酸;及び(c)下記構造式を有する3−アリールアクリル酸生合成の酵素をコードする核酸。式中、Rは、細胞代謝物(例えば、チロシン−アンモニア−リアーゼをコードする核酸、及び4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼ−レダクターゼの構成要素HpaB及びHpaCをコードする核酸)から得られるアリール又はヘテロアリールである。
組成:(a)配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28の群から選択されるアミノ酸配列を有するヒスピジンヒドロキシラーゼをコードする核酸;及び(b)配列番号:119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139の群から選択されるアミノ酸配列を有するPKSをコードする核酸。
組合せ7で規定した全成分、及び配列番号:80、82、84、86、88、90、92、94、96、98の群から選択されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼをコードする核酸が含まれる。当該組合せは、カフェイル−CoAの存在下、インビトロ又はインビボで生物発光を得るために使用できる。
組合せ8で規定した全成分、及び配列番号:65、67、69、71、73、75の群から選択されるアミノ酸配列を有するカフェイルピルビン酸ヒドロラーゼをコードする核酸が含まれる。
組成:(a)配列番号:119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139の群から選択されるアミノ酸配列を有するPKSをコードする核酸;及び(b)配列番号:141に示されるアミノ酸配列を有するシロイヌナズナ由来4−クマレート−CoAリガーゼ1をコードする核酸。
組合せ10で規定した全成分、及びコーヒー酸生合成の酵素をコードする核酸(例えば、チロシン−アンモニア−リアーゼ並びに4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼ−レダクターゼの成分HpaB及びHpaCをコードする核酸)が含まれる。
組合せ1:
組成:(a)配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28の群から選択されるアミノ酸配列を有するヒスピジンヒドロキシラーゼ;及び(b)配列番号:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55の群から選択されるアミノ酸配列を有するヒスピジン−シンターゼ。
組合せ1で規定した成分、及び配列番号:80、82、84、86、88、90、92、94、96、98の群から選択されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼが含まれる。
組成:(a)配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28の群から選択されるアミノ酸配列を有するヒスピジンヒドロキシラーゼ;(b)配列番号:119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139の群から選択されるアミノ酸配列を有するPKS;及び(c)配列番号:141に示すアミノ酸配列を有するシロイヌナズナ由来4−クマレート−CoAリガーゼ1。当該組合せは、コーヒー酸から真菌ルシフェリンを生成するために使用できる。
以下の例では、核酸は、発現カセット又はベクターに含まれ、宿主細胞での発現のための制御要素に操作的に架橋できる。あるいは核酸は、標的ベクターへの組み込みのための隣接配列から構成することも可能である。核酸は、標的制御要素を容易にクローニングすることを目的とした無プロモーターベクターに含ませることも可能である。
試験標本中のコーヒー酸の存在を同定するためには、キュベット中の95μlの氷冷反応緩衝液に5μlの酵素混合物を加え、慎重に混合し、5μlの試験標本を加え、再度慎重に混合し、ルミノメーターに配置する必要がある。最大30℃で最大2分間、生物発光シグナルを統合させる。試験試料のアリコートの代わりに、5μlのコーヒー酸溶液又は5μlの水を加えて同じ条件下で対照測定を行う。試料が発する発光が水での試料から記録されたバックグラウンドシグナルを上回る場合は、コーヒー酸が標本中に検出量で存在していると言える。
キットは、PKSの精製物及び本発明のヒスピジンヒドロキシラーゼの精製物を含み、カフェイル−CoAから真菌ルシフェリンを生成するために使用できる。試薬キットは反応緩衝液:0.5MのNa2SO4、0.1%のドデシルマルトシド(DDM)、1mMのNADPH、10mMのATP、及び1mMのマロニル−CoAを添加した0.2Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)、又は反応緩衝液調製のための成分も含むことが可能である。試薬キットは脱イオン水も含むことが可能である。試薬キットは使用説明書も含むことが可能である。
キットはPKSをコードする核酸、及び本発明のヒスピチジンヒドロキシラーゼをコードする核酸を含む。例えば、配列番号:119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139の群から選択されるアミノ酸配列を有するPKS、及び配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28の群から選択されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼ。
Claims (96)
- 真菌ルシフェリン生合成タンパク質であって、以下の群:
(a)ヒスピジンヒドロキシラーゼであって、そのアミノ酸配列は少なくとも350個のアミノ酸の範囲内で、以下の配列番号群:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性を有するか、又は非保存的アミノ酸挿入セグメントにより区切られた配列番号:29〜33とのコンセンサス配列を含み、前記ヒスピジンヒドロキシラーゼは、6−(2−アリールビニル)−3,4−ジヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンへの6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンの変換を触媒し、前記6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンは下記構造式
(b)ヒスピジンシンターゼであって、そのアミノ酸配列は以下の配列番号群:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55から選択されるアミノ酸配列と少なくとも45%の同一性を有するか、又は非保存的アミノ酸挿入セグメントにより区切られた配列番号:56〜63とのコンセンサス配列を含み、前記ヒスピジンシンターゼは6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンへの3−アリールアクリル酸の変換を触媒し、前記3−アリールアクリル酸は下記構造式
(c)カフェイルピルビン酸ヒドロキシラーゼであって、そのアミノ酸配列は以下の配列番号群:65、67、69、71、73、75から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性を有するか、又は非保存的アミノ酸挿入セグメントにより区切られた配列番号:76〜78とのコンセンサス配列を含み、前記カフェイルピルビン酸ヒドロキシラーゼは3−アリールアクリル酸への6−アリール−2−ヒドロキシ−4−オキソヘキサ−2,5−ジエノン酸の変換を触媒し、前記6−アリール−2−ヒドロキシ−4−オキソヘキサ−2,5−ジエノン酸は下記構造式
から選択されることを特徴とするタンパク質。 - 前記ヒスピジンヒドロキシラーゼの前記アミノ酸配列は、以下の配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも65%同一性、又は少なくとも70%の同一性、又は少なくとも75%の同一性、又は少なくとも80%の同一性、又は少なくとも85%の同一性、又は少なくとも90%の同一性、又は少なくとも95%の同一性を有する、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記ヒスピジンヒドロキシラーゼの前記アミノ酸配列は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28の群から選択されるか、又は前記配列番号と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98%又は99%の同一性を有する、請求項2に記載のタンパク質。
- 前記ヒスピジンシンターゼの前記アミノ酸配列は、以下の配列番号:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも50%の同一性、又は少なくとも55%の同一性、又は少なくとも60%の同一性、又は少なくとも65%の同一性、又は少なくとも70%の同一性、又は少なくとも75%の同一性、又は少なくとも80%の同一性、又は少なくとも85%の同一性、又は少なくとも90%の同一性、又は少なくとも95%の同一性を有する、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記ヒスピジンシンターゼの前記アミノ酸配列は、以下の配列番号:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55の群から選択されるか、又は前記配列番号と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98%又は99%の同一性を有する、請求項4に記載のタンパク質。
- 前記カフェイルピルビン酸ヒドロラーゼの前記アミノ酸配列は、以下の配列番号:65、67、69、71、73、75の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも65%の同一性、又は少なくとも70%の同一性、又は少なくとも75%の同一性、又は少なくとも80%の同一性、又は少なくとも85%の同一性、又は少なくとも90%の同一性、又は少なくとも95%の同一性を有する、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記カフェイルピルビン酸シンターゼの前記アミノ酸配列は、以下の配列番号:65、67、69、71、73、75の群から選択されるか、又は前記配列番号と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98%又は99%の同一性を有する、請求項6に記載のタンパク質。
- 請求項1に記載の操作的に架橋されたヒスピジンヒドロキシラーゼ、及び/又はヒスピジンシンターゼ、及び/又ははカフェイルピルビン酸ヒドロラーゼ、並びに発光を伴って真菌ルシフェリンを酸化できるルシフェラーゼ、及び/又は細胞内局在化シグナル、及び/又はシグナルペプチドから成ることを特徴とする融合タンパク質。
- 前記ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、以下の配列番号群:80、82、84、86、88、90、92、94、96、98から選択されるアミノ酸配列と少なくとも40%同一、例えば、少なくとも45%同一、又は少なくとも50%同一、又は少なくとも55%同一、又は少なくとも60%同一、又は少なくとも70%同一、又は少なくとも75%同一、又は少なくとも80%同一、又は少なくとも85%同一である、請求項8に記載の融合タンパク質。
- 前記アミノ酸配列は配列番号101を有する、請求項9に記載の融合タンパク質。
- 前記6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンは以下の群:
(E)−6−(3,4−ジヒドロキシスチリル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ジヒドロキシ−6−スチリル−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2−ヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2,4−ジヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシ−3−メトキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2−(6−ヒドロキシナフタレン−2−イル)ビニル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−6−(4−アミノスチリル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、
(E)−6−(4−(ジエチルアミノ)スチリル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、
(E)−6−(2−(1H−インドール−3−イル)ビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2,3,6,7−テトラヒドロ−1H,5H−ピリド[3,2,1−ij]キノリン−9−イル)ビニル)−2H−ピラン−2−オン
から選択される請求項1〜10のいずれか1項に記載のタンパク質。 - 前記3−アリールアクリル酸は、コーヒー酸、桂皮酸、パラクマル酸、クマル酸、ウンベル酸、シナピン酸及びフェルラ酸から成る群より選択される、請求項1〜7のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 真菌ルシフェリン生合成タンパク質の使用であって、前記真菌ルシフェリン生合成タンパク質は以下の群:
(a)少なくとも350個のアミノ酸の範囲内で、以下の配列番号群:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性を有するか、又は非保存的アミノ酸挿入セグメントにより区切られた配列番号:29〜33とのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列はヒスピジンヒドロキシラーゼとして、6−(2−アリールビニル)−3,4−ジヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンへの6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンの変換を触媒し、前記6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンは下記構造式
(b)以下の配列番号群:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55から選択されるアミノ酸配列と少なくとも45%の同一性を有するか、又は非保存的アミノ酸挿入セグメントにより区切られた配列番号:56〜63とのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列はヒスピジンシンターゼとして、6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンへの3−アリールアクリル酸の変換を触媒し、前記3−アリールアクリル酸は下記構造式
(c)以下の配列番号群:65、67、69、71、73、75から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性を有するか、又は非保存的アミノ酸挿入セグメントにより区切られた配列番号:76〜78とのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列はカフェイルピルビン酸ヒドロキシラーゼとして、3−アリールアクリル酸への6−アリール−2−ヒドロキシ−4−オキソヘキサ−2,5−ジエノン酸の変換を触媒し、前記6−アリール−2−ヒドロキシ−4−オキソヘキサ−2,5−ジエノン酸は下記構造式
から選択されることを特徴とする使用。 - 前記スピジンヒドロキシラーゼの前記アミノ酸配列は、以下の配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも65%の同一性、又は少なくとも70%の同一性、又は少なくとも75%の同一性、又は少なくとも80%の同一性、又は少なくとも85%の同一性、又は少なくとも90%の同一性、又は少なくとも95%の同一性を有する、請求項13に記載の使用。
- 前記ヒスピジンシンターゼの前記アミノ酸配列は、以下の配列番号:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも50%の同一性、又は少なくとも55%の同一性、又は少なくとも60%の同一性、又は少なくとも65%の同一性、又は少なくとも70%の同一性、又は少なくとも75%の同一性、又は少なくとも80%の同一性、又は少なくとも85%の同一性、又は少なくとも90%の同一性、又は少なくとも95%の同一性を有する、請求項13に記載の使用。
- 前記カフェイルプルビン酸ヒドロラーゼの前記アミノ酸配列は、以下の配列番号:65、67、69、71、73、75の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも65%の同一性、又は少なくとも70%の同一性、又は少なくとも75%の同一性、又は少なくとも80%の同一性、又は少なくとも85%の同一性、又は少なくとも90%の同一性、又は少なくとも95%の同一性を有する、請求項13に記載の使用。
- 前記6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンは以下の群:
(E)−6−(3,4−ジヒドロキシスチリル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン(ヒスピジン)、
(E)−4−ジヒドロキシ−6−スチリル−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン(ビスノリアンゴニン)、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2−ヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2,4−ジヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシ−3−メトキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2−(6−ヒドロキシナフタレン−2−イル)ビニル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−6−(4−アミノスチリル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、
(E)−6−(4−(ジエチルアミノ)スチリル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、
(E)−6−(2−(1H−インドール−3−イル)ビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2,3,6,7−テトラヒドロ−1H,5H−ピリド[3,2,1−ij]キノリン−9−イル)ビニル)−2H−ピラン−2−オン
から選択される、請求項13〜16のいずれか1項に記載の使用。 - 前記3−アリールアクリル酸は、コーヒー酸、桂皮酸、パラクマル酸、クマル酸、ウンベル酸、シナピン酸及びフェルラ酸から成る群より選択される、請求項13〜16のいずれか1項に記載の使用。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の真菌ルシフェリン生合成タンパク質をコードする核酸であって、前記真菌ルシフェリン生合成タンパク質は以下の群:
(a)ヒスピジンヒドロキシラーゼであって、そのアミノ酸配列は少なくとも350個のアミノ酸の範囲内で、以下の配列番号群:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性を有するか、又は非保存的アミノ酸挿入セグメントにより区切られた配列番号:29〜33とのコンセンサス配列を含み、前記ヒスピジンヒドロキシラーゼは、6−(2−アリールビニル)−3,4−ジヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンへの6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンの変換を触媒し、前記6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンは下記構造式
(b)ヒスピジンシンターゼであって、そのアミノ酸配列は以下の配列番号群:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55から選択されるアミノ酸配列と少なくとも45%の同一性を有するか、又は非保存的アミノ酸挿入セグメントにより区切られた配列番号:56〜63とのコンセンサス配列を含み、前記ヒスピジンシンターゼは6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンへの3−アリールアクリル酸の変換を触媒し、前記3−アリールアクリル酸は下記構造式
(c)カフェイルピルビン酸ヒドロキシラーゼであって、そのアミノ酸配列は以下の配列番号群:65、67、69、71、73、75から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性を有するか、又は非保存的アミノ酸挿入セグメントにより区切られた配列番号:76〜78とのコンセンサス配列を含み、前記カフェイルピルビン酸ヒドロキシラーゼは3−アリールアクリル酸への6−アリール−2−ヒドロキシ−4−オキソヘキサ−2,5−ジエノン酸の変換を触媒し、前記6−アリール−2−ヒドロキシ−4−オキソヘキサ−2,5−ジエノン酸は下記構造式
から選択されることを特徴とする核酸。 - 前記スピジンヒドロキシラーゼの前記アミノ酸配列は、以下の配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも65%の同一性、又は少なくとも70%の同一性、又は少なくとも75%の同一性、又は少なくとも80%の同一性、又は少なくとも85%の同一性、又は少なくとも90%の同一性、又は少なくとも95%の同一性を有する、請求項19に記載の核酸。
- 前記アミノ酸配列は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28の群から選択されるか、又は前記配列番号と少なくとも96%、97%、98%、98%又は99%の同一性を有する、請求項20に記載の核酸。
- 前記ヒスピジンシンターゼの前記アミノ酸配列は、以下の配列番号:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも50%の同一性、又は少なくとも55%の同一性、又は少なくとも60%の同一性、又は少なくとも65%の同一性、又は少なくとも70%の同一性、又は少なくとも75%の同一性、又は少なくとも80%の同一性、又は少なくとも85%の同一性、又は少なくとも90%の同一性、又は少なくとも95%の同一性を有する、請求項19に記載の核酸。
- 前記ヒスピジンシンターゼの前記アミノ酸配列は、以下の配列番号:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55の群から選択されるか、又は前記配列番号と少なくとも96%、97%、98%、98%又は99%の同一性を有する、請求項22に記載の核酸。
- 前記カフェイルピルビン酸ヒドロラーゼの前記アミノ酸配列は、以下の配列番号:65、67、69、71、73、75の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも65%の同一性、又は少なくとも70%の同一性、又は少なくとも75%の同一性、又は少なくとも80%の同一性、又は少なくとも85%の同一性、又は少なくとも90%の同一性、又は少なくとも95%の同一性を有する、請求項19に記載の核酸。
- 前記カフェイルピルビン酸シンターゼの前記アミノ酸配列は、以下の配列番号:65、67、69、71、73、75の群から選択されるか、又は前記配列番号と少なくとも96%、97%、98%、98%又は99%の同一性を有する、請求項24に記載の核酸。
- 請求項8〜10のいずれか1項に記載の前記融合タンパク質をコードする核酸。
- 前記6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンは以下の群:
(E)−6−(3,4−ジヒドロキシスチリル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン(ヒスピジン)、
(E)−4−ジヒドロキシ−6−スチリル−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン(ビスノリアンゴニン)、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2−ヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2,4−ジヒドロキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(4−ヒドロキシ−3−メトキシスチリル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2−(6−ヒドロキシナフタレン−2−イル)ビニル)−2H−ピラン−2−オン、
(E)−6−(4−アミノスチリル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、
(E)−6−(4−(ジエチルアミノ)スチリル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、
(E)−6−(2−(1H−インドール−3−イル)ビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン、
(E)−4−ヒドロキシ−6−(2,3,6,7−テトラヒドロ−1H,5H−ピリド[3,2,1−ij]キノリン−9−イル)ビニル)−2H−ピラン−2−オン
から選択される、請求項19に記載の核酸。 - 前記3−アリールアクリル酸は、コーヒー酸、桂皮酸、パラクマル酸、クマル酸、ウンベル酸、シナピン酸及びフェルラ酸から成る群より選択される、請求項19に記載の核酸。
- 発現カセットであって、以下:(a)宿主細胞で機能的な転写開始ドメイン;(b)請求項19に記載の核酸、及び(c)前記宿主細胞で機能的な転写終止ドメイン、から成る発現カセット。
- 染色体外要素の一部であるか、又は前記カセットを前記細胞に導入した結果として前記細胞のゲノムに組み込まれた請求項29に記載の少なくとも1つの発現カセットを含む宿主細胞であって、前記細胞は、真菌ルシフェリン生合成のための機能性タンパク質のうちの少なくとも1つを発現することを特徴とする宿主細胞。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の少なくとも1つのタンパク質に結合する抗体。
- 真菌ルシフェリン生合成タンパク質の使用であって、前記真菌ルシフェリン生合成タンパク質は以下の群:
(a)少なくとも350個のアミノ酸の範囲内で、以下の配列番号群:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性を有するか、又は非保存的アミノ酸挿入セグメントにより区切られた配列番号:29〜33とのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、インビトロ又はインビボ系において、6−(2−アリールビニル)−3,4−ジヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンへの6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンの変換の反応を触媒するヒスピジンヒドロキシラーゼを生成し、前記6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンは下記構造式
(b)以下の配列番号群:35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55から選択されるアミノ酸配列と少なくとも45%の同一性を有するか、又は非保存的アミノ酸挿入セグメントにより区切られた配列番号:56〜63とのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、インビトロ又はインビボ系において、6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オンへの3−アリールアクリル酸の変換の反応を触媒するヒスピジンシンターゼを生成し、前記3−アリールアクリル酸は下記構造式
(c)以下の配列番号群:65、67、69、71、73、75から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性を有するか、又は非保存的アミノ酸挿入セグメントにより区切られた配列番号:76〜78とのコンセンサス配列を含むアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、インビトロ又はインビボ系において、3−アリールアクリル酸への6−アリール−2−ヒドロキシ−4−オキソヘキサ−2,5−ジエノン酸の変換の反応を触媒するカフェイルピルビン酸ヒドロラーゼを生成し、前記6−アリール−2−ヒドロキシ−4−オキソヘキサ−2,5−ジエノン酸は下記構造式
から選択されることを特徴とする使用。 - 前記核酸は、発現カセットに含まれる真菌ルシフェリン生合成タンパク質を発現するために使用し、前記発現カセットは宿主細胞中で機能的な転写開始ドメイン、及び前記宿主細胞中で機能的な転写終止ドメインから成る、請求項32に記載の使用。
- 前記宿主細胞において前記発現カセットを使用する、請求項33に記載の使用。
- 前記反応は細胞又は有機体中で行い、前記方法は、ヒスピジンヒドロキシラーゼをコードする核酸を含む請求項29に記載の前記発現カセットを前記細胞内に導入することを含む請求項35に記載の方法。
- (a)前記宿主細胞で機能的な転写開始のドメイン;(b)発光を伴って真菌ルシフェリンを酸化できるルシフェラーゼをコードする核酸、及び(c)前記宿主細胞で機能的な転写終止のドメインを更に含む前記発現カセットを細胞又は有機体に導入することを含む方法であって、前記細胞又は有機体は前記真菌ルシフェリンの存在下で生物発光能を獲得する、請求項36に記載の方法。
- 前記ルシフェラーゼをコードする前記核酸は、請求項26に記載の前記核酸を形成するヒスピジンヒドロキシラーゼをコードする核酸と操作的に融合させる、請求項37に記載の方法。
- 前記反応は細胞又は有機体中で行い、前記方法は、ヒスピジンシンターゼをコードする核酸を含む請求項29に記載の前記発現カセットを前記細胞内に導入することを含む請求項39に記載の方法。
- 4’−ホスホパントテイニルトランスフェラーゼをコードし、前記補酵素A由来の4−ホスホパントテイニルをポリケチドシンターゼのアシル転移ドメイン内のセリンに転移させることが可能な核酸を細胞又は有機体に導入することを更に含む、請求項40に記載の方法。
- 前記4’−ホスホパントテイニルトランスフェラーゼは、配列番号:105のアミノ酸配列と少なくとも40%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項41に記載の方法。
- 前記3−アリールアクリル酸を生合成するための前記酵素は、以下の群:
(a)配列番号:107を有するアミノ酸配列と少なくとも40%同一のアミノ酸配列;配列番号:109及び111を有する大腸菌の4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼのHpaB及びHpaC成分のアミノ酸配列と少なくとも40%同一の4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼのHpaB及びHpaC成分を有するチロシンアンモニア−リアーゼ;
(b)配列番号:117を有するアミノ酸配列と少なくとも40%同一のアミノ酸配列を有するフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ
から選択する、請求項43に記載の方法。 - インビトロ又はインビボのいずれかの系において、化学式6−(2−アリールビニル)−3,4−ジヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン及び下記構造式
- 前記反応は細胞又は有機体中で行い、前記方法は、前記ヒスピジンシンターゼをコードする核酸を含む請求項29に記載の前記発現カセット、及び前記ヒスピジンヒドロキシラーゼをコードする前記核酸を含む請求項29に記載の前記発現カセットを前記細胞内に導入することを含む、請求項45に記載の方法。
- 4’−ホスホパントテイニルトランスフェラーゼをコードし、前記補酵素A由来の4−ホスホパントテイニルをポリケチドシンターゼのアシル転移ドメイン内のセリンに転移させることが可能な核酸を細胞又は有機体に導入することを更に含む、請求項46に記載の方法。
- 前記4’−ホスホパントテイニルトランスフェラーゼは、配列番号:105のアミノ酸配列と少なくとも40%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項41に記載の方法。
- 前記3−アリールアクリル酸を生合成するための前記酵素は、以下の群:
(a)アミノ酸配列番号:107と少なくとも40%同一のアミノ酸配列;配列番号:109及び111を有する大腸菌の4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼのHpaB及びHpaC成分のアミノ酸配列と少なくとも40%同一の4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼのHpaB及びHpaC成分を有するチロシンアンモニア−リアーゼ;
(b)配列番号:117を有するアミノ酸配列と少なくとも40%同一のアミノ酸配列を有するフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ
から選択する、請求項49に記載の方法。 - トランスジェニック生物発光細胞又は有機体を生成する方法であって、前記方法は請求項29に記載の発現カセットを細胞又は有機体に導入することを含み、前記発現カセットはヒスピジンヒドロキシラーゼをコードする核酸から成り、(a)宿主細胞で機能的な転写開始ドメイン;(b)発光を伴って真菌ルシフェリンを酸化できるルシフェラーゼをコードする核酸、及び(c)前記宿主細胞で機能的な転写終止ドメインを含み、前記細胞は、6−(2−アリールビニル)−4−ヒドロキシ−2H−ピラン−2−オン及び下記構造式
- 請求項19、24、25のいずれか1項に記載の前記カフェイルピルビン酸ヒドロラーゼをコードする前記核酸を、前記細胞又は有機体に導入することを更に含む請求項52に記載の方法。
- 4’−ホスホパントテイニルトランスフェラーゼをコードし、補酵素A由来の4−ホスホパントテイニルをポリケチドシンターゼのアシル転移ドメイン内のセリンに転移させることが可能な核酸を前記細胞又は有機体に導入することを更に含む、請求項52又は53に記載の方法。
- 前記核酸を前記細胞又は有機体に導入することを更に含む方法であって、前記核酸は細胞代謝物から3−アリールアクリル酸を生合成するための酵素をコードする、請求項52〜54のいずれか1項に記載の方法。
- 前記3−アリールアクリル酸を生合成するための酵素は、以下の群:
(a)アミノ酸配列番号:107と少なくとも40%同一のアミノ酸配列;配列番号:109及び111を有する大腸菌の4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼのHpaB及びHpaC成分のアミノ酸配列と少なくとも40%同一の4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼのHpaB及びHpaC成分を有するチロシンアンモニア−リアーゼ;
(b)配列番号:117を有するアミノ酸配列と少なくとも40%同一のアミノ酸配列を有するフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ
から選択する、請求項55に記載の方法。 - 請求項19、24、25のいずれか1項に記載の前記カフェイルピルビン酸ヒドロラーゼをコードする核酸を、前記細胞又は有機体に導入することを更に含む請求項58に記載の方法。
- 4’−ホスホパントテイニルトランスフェラーゼをコードし、補酵素A由来の4−ホスホパントテイニルをポリケチドシンターゼのアシル転移ドメイン内のセリンに転移させることが可能な核酸を前記細胞又は有機体に導入することを更に含む、請求項58又は59に記載の方法。
- 前記核酸を前記細胞又は有機体に導入することを更に含む方法であって、前記核酸は細胞代謝物から3−アリールアクリル酸を生合成するための酵素をコードする、請求項58〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記3−アリールアクリル酸を生合成するための酵素は、以下の群:
(a)アミノ酸配列番号:107と少なくとも40%同一のアミノ酸配列;配列番号:109及び111を有する大腸菌の4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼのHpaB及びHpaC成分のアミノ酸配列と少なくとも40%同一の4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼのHpaB及びHpaC成分を有するチロシンアンモニア−リアーゼ;
(b)配列番号:117を有するアミノ酸配列と少なくとも40%同一のアミノ酸配列を有するフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ
から選択する、請求項61に記載の方法。 - 染色体外要素の一部であるか、又は、請求項29に記載の前記発現カセットを細胞に導入した結果として前記細胞のゲノムに組み込まれた請求項19〜21のいずれか1項に記載のヒスピジンヒドロキシラーゼをコードする核酸、及び発光を伴って真菌ルシフェリンを酸化できるルシフェラーゼをコードする核酸を少なくとも含む真菌ルシフェリン及び/又は真菌プレルシフェリンの存在下で生物発光できることを特徴とするトランスジェニック有機体。
- 自立発光可能なトランスジェニック有機体であって、前記有機体は、請求項19〜21のいずれか1項に記載の前記ヒスピジンヒドロキシラーゼをコードする核酸;染色体外要素の一部であるか、又は、請求項29に記載の前記発現カセットを細胞に導入した結果として前記細胞のゲノムに組み込まれた請求項19、22及び23のいずれか1項に記載の前記ヒスピジンシンターゼをコードする核酸、及び発光を伴って真菌ルシフェリンを酸化できるルシフェラーゼをコードする核酸を少なくとも含むことを特徴とするトランスジェニック有機体。
- 請求項19、24、25のいずれか1項に記載の前記カフェイルピルビン酸ヒドロラーゼをコードする核酸を含む請求項64に記載のトランスジェニック有機体。
- 請求項19〜26のいずれか1項に記載の前記核酸の少なくとも1つから成る宿主細胞に核酸を転移させることを特徴とするベクター。
- 請求項1に記載の前記ヒスピジンヒドロキシラーゼ及びヒスピジンシンターゼから成る真菌ルシフェリン及び/又は真菌プレルシフェリンを生成することを特徴とするキット。
- インビトロ又はインビボ系において、真菌ルシフェリン及び/又は真菌プレルシフェリンを生成するためのキットであって、請求項19に記載の前記ヒスピジンヒドロキシラーゼをコードする核酸及び前記ヒスピジンシンターゼをコードする核酸を含む、キット。
- 生物発光細胞又は有機体を生成するためのキットであって、ヒスピジンヒドロキシラーゼをコードする核酸、請求項19に記載の前記ヒスピジンシンターゼをコードする核酸、及び発光を伴って真菌ルシフェリンを酸化できるルシフェラーゼをコードする核酸を含むことを特徴とするキット。
- カフェイルピルビン酸ヒドロラーゼをコードする請求項19に記載の前記核酸を更に含む、請求項69に記載のキット。
- 4’−ホスホパントテイニルトランスフェラーゼをコードする核酸及び/又は3−アリールアクリル酸を生合成するための酵素をコードする核酸を更に含む請求項68〜70のいずれか1項に記載のキット。
- インビトロ又はインビボ系でヒスピジンを生成するための、以下の配列番号群:119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139から選択される配列と少なくとも40%、又は少なくとも45%、又は少なくとも50%、又は少なくとも55%、又は少なくとも60%、少なくとも65%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも91%、又は少なくとも92%、又は少なくとも93%、又は少なくとも94%、又は少なくとも95%、又は少なくとも96%、又は少なくとも97%、又は少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるか、又は完全に一致するアミノ酸配列を有することを特徴とするポリケチドシンターゼの使用。
- 生理条件下で、請求項72に記載の少なくとも1つのPKS部位と、少なくとも2つのマロニル−CoA部分及び少なくとも1つのカフェイル−CoA部分とを組合せることを含む、インビトロ又はインビボ系でヒスピジンを生成することを特徴とする方法。
- 前記カフェイル−CoAの少なくとも1部の代わりに、少なくとも1つのコーヒー酸部分、少なくとも1つの補酵素A部分、少なくとも1つのクマレート−CoAリガーゼ部分、及び少なくとも1つのATP部分を反応混合物に添加する、請求項73に記載の方法。
- 反応は細胞又は有機体において行われ、請求項72に記載のIII型ポリケチドシンターゼをコードする核酸を含む発現カセットを導入することを含む請求項73又は74に記載の方法。
- 前記クマレート−CoAリガーゼをコードする核酸を前記細胞又は有機体に導入することを更に含む請求項75に記載の方法。
- 前記クマレート−CoAリガーゼは、配列番号:141を有する配列と少なくとも40%、又は少なくとも45%、又は少なくとも50%、又は少なくとも55%、又は少なくとも60%、又は少なくとも65%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも91%、又は少なくとも92%、又は少なくとも93%、又は少なくとも94%、又は少なくとも95%、又は少なくとも96%、又は少なくとも97%、又は少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるか、又は完全に一致するアミノ酸配列を有する請求項76に記載の方法。
- コーヒー酸を生合成するための酵素をコードする核酸を前記細胞又は有機体に導入することを更に含む請求項75〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 3−アリールアクリル酸を生合成するための酵素は、以下の群:
(a)アミノ酸配列番号:107と少なくとも40%同一のアミノ酸配列;配列番号:109及び111を有する大腸菌の4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼのHpaB及びHpaC成分のアミノ酸配列と少なくとも40%同一の4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼのHpaB及びHpaC成分を有するチロシンアンモニア−リアーゼ;
(b)配列番号:117を有するアミノ酸配列と少なくとも40%同一のアミノ酸配列を有するフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ
から選択する、請求項78に記載の方法。 - (a)宿主細胞において機能的である転写開始ドメイン;(b)請求項72に記載の前記III型ポリケチドシンターゼをコードする核酸;及び(c)宿主細胞において機能的な転写終止ドメインを含む発現カセットを前記細胞又は有機体に導入することを含み、前記細胞は外因性又は内因性カフェイル−CoAの存在下で生物発光能を獲得する、請求項51に記載の方法。
- (a)前記宿主細胞において機能的である前記転写開始ドメイン;(b)前記クマレート−CoAリガーゼをコードする前記核酸;及び(c)前記宿主細胞において機能的な前記転写終止ドメインを含む前記発現カセットを前記細胞又は有機体に導入することを含み、前記細胞はコーヒー酸の存在下で生物発光能を獲得する、請求項80に記載の方法。
- 前記クマレート−CoAリガーゼは、配列番号:141を有する配列と少なくとも40%、又は少なくとも45%、又は少なくとも50%、又は少なくとも55%、又は少なくとも60%、又は少なくとも65%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも91%、又は少なくとも92%、又は少なくとも93%、又は少なくとも94%、又は少なくとも95%、又は少なくとも96%、又は少なくとも97%、又は少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるか、又は完全に一致するアミノ酸配列を有する請求項81に記載の方法。
- 請求項19、24、25のいずれか1項に記載の前記カフェイルピルビン酸ヒドロラーゼをコードする核酸を前記細胞又は有機体に導入することを更に含む請求項80〜82のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞代謝物から前記3−アリールアクリル酸を生合成するための前記酵素をコードする核酸を前記細胞又は有機体に導入することを更に含む、請求項80〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 前記3−アリールアクリル酸を生合成するための前記酵素は、以下の群:
(a)アミノ酸配列番号:107と少なくとも40%同一の前記アミノ酸配列;配列番号:109及び111を有する大腸菌の前記4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼの前記HpaB及びHpaC成分の前記アミノ酸配列と少なくとも40%同一の前記4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼの前記HpaB及びHpaC成分を有するチロシンアンモニア−リアーゼ;
(b)配列番号:117を有する前記アミノ酸配列と少なくとも40%同一の前記アミノ酸配列を有する前記フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ
から選択する、請求項84に記載の方法。 - (a)前記宿主細胞において機能的である前記転写開始ドメイン;(b)請求項72に記載の前記III型ポリケチドシンターゼをコードする前記核酸;及び(c)前記宿主細胞において機能的な前記転写終止ドメインを含む前記発現カセットを前記細胞又は有機体に導入することを含み、前記細胞は前記外因性又は内因性カフェイル−CoAの存在下で生物発光能を獲得する、請求項57に記載の方法。
- (a)前記宿主細胞において機能的である前記転写開始ドメイン;(b)前記クマレート−CoAリガーゼをコードする前記核酸;及び(c)前記宿主細胞において機能的な前記転写終止ドメインを含む前記発現カセットを前記細胞又は有機体に導入することを含み、前記細胞は前記コーヒー酸の存在下で生物発光能を獲得する、請求項86に記載の方法。
- 前記クマレート−CoAリガーゼは、配列番号:141を有する配列と少なくとも40%、又は少なくとも45%、又は少なくとも50%、又は少なくとも55%、又は少なくとも60%、又は少なくとも65%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも91%、又は少なくとも92%、又は少なくとも93%、又は少なくとも94%、又は少なくとも95%、又は少なくとも96%、又は少なくとも97%、又は少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるか、又は完全に一致するアミノ酸配列を有する請求項87に記載の方法。
- 請求項19、24、25のいずれか1項に記載の前記カフェイルピルビン酸ヒドロラーゼをコードする前記核酸を前記細胞又は有機体に導入することを更に含む請求項86〜88のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞代謝物から前記3−アリールアクリル酸を生合成するための前記酵素をコードする前記核酸を前記細胞又は有機体に導入することを更に含む、請求項87〜89のいずれか1項に記載の方法。
- 前記3−アリールアクリル酸を生合成するための前記酵素は、以下の群:
(a)アミノ酸配列番号:107と少なくとも40%同一の前記アミノ酸配列;配列番号:109及び111を有する大腸菌の前記4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼの前記HpaB及びHpaC成分の前記アミノ酸配列と少なくとも40%同一の前記4−ヒドロキシフェニルアセテート3−モノオキシゲナーゼレダクターゼの前記HpaB及びHpaC成分を有するチロシンアンモニア−リアーゼ;
(b)配列番号:117を有する前記アミノ酸配列と少なくとも40%同一の前記アミノ酸配列を有する前記フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ
から選択する、請求項90に記載の方法。 - 請求項80〜91のいずれか1項に従った前記方法を用いて生成し、3−ヒドロキシヒスピジン及び/又はヒスピジン、及び/又はコーヒー酸の存在下で生物発光可能なトランスジェニック有機体。
- 請求項72に記載の前記ポリケチドシンターゼ及びクマレート−CoAリガーゼ、又はこれらをコードする核酸から成る、ヒスピジンを生成するためのキット。
- ヒスピジンヒドロキシラーゼをコードする核酸、請求項72に記載の前記ポリケチドシンターゼをコードする核酸、及び発光を伴って真菌ルシフェリンを酸化可能なルシフェラーゼをコードする核酸から成る生物発光性細胞又は有機体を生成するためのキット。
- 請求項19に記載の前記カフェイルピルビン酸ヒドロラーゼをコードする核酸を更に含む請求項94に記載のキット。
- クマレート−CoAリガーゼをコードする核酸及び/又は3−アリールアクリル酸を生合成するための酵素をコードする核酸を更に含む、請求項93又は94に記載のキット。
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