WO2024034619A1 - 発光タンパク質 - Google Patents

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WO2024034619A1
WO2024034619A1 PCT/JP2023/028990 JP2023028990W WO2024034619A1 WO 2024034619 A1 WO2024034619 A1 WO 2024034619A1 JP 2023028990 W JP2023028990 W JP 2023028990W WO 2024034619 A1 WO2024034619 A1 WO 2024034619A1
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amino acid
luciferase
acid sequence
seq
mutation
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PCT/JP2023/028990
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永井健治
田中奏希
長部謙二
圓谷徹之
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国立大学法人大阪大学
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    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)

Definitions

  • the present disclosure relates to a modified luciferase and its use.
  • Molecular imaging is a method of observing the movement and changes of various molecules within a living body while the object being observed is alive.
  • Chemiluminescence imaging is one of the molecular imaging techniques.
  • Chemiluminescence imaging is a method for observing inside living organisms using the phenomenon of luminescence (Luciferin-luciferase reaction) caused by the oxidation reaction of a luminescent substrate (luciferin) catalyzed by a chemiluminescent protein (luciferase).
  • chemiluminescent reaction is caused by a chemiluminescent protein (luciferase), which is one of the luminescent proteins, and its luminescent substrate (luciferin), and these structures vary depending on the species of living organisms.
  • luciferase chemiluminescent protein
  • luminescent substrate luciferin
  • luciferase When luciferase is expressed in cells and used as a reporter or probe, it is necessary to add a luminescent substrate (luciferin) to the cells.
  • a luminescent substrate luciferin
  • self-luminescence imaging self-luminescence imaging
  • genes constituting the luciferin biosynthesis cycle are simultaneously introduced into living organisms and imaged.
  • One of the self-luminescent systems is a system derived from luminescent mushrooms (Fungal bioluminescence pathway: FBP). It can be said that FBP is particularly suitable for self-luminescence imaging in plants.
  • the luminescence intensity of the luminescent mushroom-derived self-luminous system has limitations in observing physiological phenomena that occur within cells and between cells, and there is a need to improve the luminescence intensity of the luminescent mushroom-derived self-luminescent system.
  • the present disclosure provides a modified luciferase with improved luminescence intensity and use thereof.
  • the present disclosure provides a modified luciferase derived from a luminescent mushroom or a functional fragment thereof, which contains arginine or lysine corresponding to position 26 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and valine corresponding to position 161 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention relates to a modified luciferase or a functional fragment thereof, in which a mutation has been introduced into at least one of the luciferases, and which has enhanced luminescence compared to the luminescent mushroom-derived wild-type luciferase before the introduction of the mutation.
  • the present disclosure relates to an isolated nucleic acid encoding the modified luciferase of the present disclosure or a functional fragment thereof.
  • the present disclosure provides arginine or lysine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and 161st position in any amino acid sequence selected from the group consisting of (a) to (c) below.
  • the present disclosure provides arginine or lysine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and 161st position in any amino acid sequence selected from the group consisting of (a) to (c) below.
  • the present invention relates to a modified luciferase or a functional fragment thereof, which has an amino acid sequence selected from the group consisting of (a) to (c) below, in which at least one of the valines corresponding to valine has been mutated.
  • a modified luciferase with improved luminescence intensity can be provided.
  • FIG. 1 shows a comparison of luminescence intensities in E. coli colonies for the wild type and mutant Mycena chlorophos luciferases in Example 1.
  • FIG. 2 shows an alignment of the sequences of luminescent mushroom luciferases (nine types) in Example 2.
  • FIG. 3 shows a comparison of luminescence intensities in E. coli colonies for the wild type and mutant luciferase of Neonothopanus nambi in Example 3.
  • the present disclosure relates to a modified luciferase obtained by inserting a mutation in a specific amino acid (an amino acid corresponding to the 26th amino acid and an amino acid corresponding to the 161st amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) in a luminescent mushroom-derived luciferase. This is based on the finding that the luminescence intensity of luciferase is improved compared to that of luciferase before the mutation is introduced.
  • “Luciferase” in the present disclosure refers to an enzyme that has the activity of catalyzing the oxidation reaction of a luminescent substrate (luciferin). The energy produced in the oxidation process of luciferin by luciferase is released as light.
  • “Modified luciferase of the present disclosure” refers to a luciferase modified in the present disclosure, in which at least one of arginine or lysine corresponding to the 26th position and/or valine corresponding to the 161st position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is present. This refers to luciferase in which mutations have been introduced.
  • a “luminescent mushroom” in the present disclosure refers to a mushroom that produces luminescence, and that produces green luminescence due to an enzymatic reaction with luciferase.
  • the luminescent mushrooms include Mycena chlorophos, Neonothopanus nambi, Armillaria gallica, Armillaria mellea, Armillaria ostoyae, Omphalotus olearius, Panelus stipticus, Mycena citricolor, and Neonothopanus gardner.
  • “luminescent mushroom-derived luciferase” refers to luciferase extracted from luminescent mushrooms.
  • the luminescent mushroom-derived luciferase includes Mycena chlorophos luciferase, Neonothopanus nambi luciferase, Armillaria gallica luciferase, Armillaria mellea luciferase, Armillaria ostoyae luciferase, Mycena citricolor luciferase, Neonothopanus gardner luciferase, Examples include luciferase from Omphalotus olearius and luciferase from Panelus stipticus.
  • polynucleotide and “nucleic acid” in the present disclosure are synonymous with each other.
  • a polynucleotide may be any type of nucleotide sequence in one or more embodiments.
  • polynucleotides include synthetic RNA sequences, synthetic DNA sequences, cDNA sequences, partial genomic DNA sequences, and the like.
  • Polypeptide in the present disclosure is synonymous with “protein”. “Polypeptide” refers to a series of consecutive residues in which the ⁇ -amino groups and carboxyl groups of adjacent amino acids are bonded via peptide bonds. In one or more embodiments, the polypeptide may include structures such as sugar chains and isoprenoids.
  • isolated includes that the nucleic acids or polypeptides of the present disclosure have been prepared or isolated in vitro, or have been substantially purified from in vitro material. sell. Also, “isolated” or “isolated” refers to the fact that the nucleic acids or polypeptides of the present disclosure are substantially separated from other materials/components with which they are present in their natural state; Or, it means being in an environment that is different from the environment that exists in its natural state.
  • An “isolated polypeptide” in this disclosure can include a polypeptide, peptide or protein encoded by cDNA or recombinant RNA, or a combination thereof.
  • the "isolated nucleic acid of the present disclosure” may be simply referred to as the "nucleic acid of the present disclosure.”
  • a "functional fragment” refers to a portion or region of luciferase that can catalyze the oxidation reaction of luciferin accompanied by luminescence, and has the same or similar activity as the full-length luciferase.
  • a functional fragment is 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more of the activity of full-length luciferase. , 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 100%.
  • nucleic acid (nucleotide sequence) encoding a polypeptide means that the polypeptide encoded by the nucleic acid (nucleotide sequence) is produced from the nucleotide sequence by transcription and translation of mRNA.
  • a nucleotide sequence encoding a polypeptide may, in one or more embodiments, include sequences that include introns.
  • amino acid corresponding to the 26th and/or 161st amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 refers to the amino acid corresponding to the 26th and/or 161st amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: Refers to the amino acids identified as corresponding.
  • Homology analysis can be performed in one or more embodiments using commonly available sequence comparison programs.
  • the homology analysis method includes a method using Pairwise Sequence Alignment, a method using Multiple Sequence Alignment such as the ClustalW method, and the like.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a reference sequence based on these methods, for example, by performing multiple alignment, / or the amino acid corresponding to position 161". Note that in multiple alignment, a gap may exist in one or more embodiments.
  • “Mutation” in the amino acid sequence in the present disclosure refers to substitution, deletion, or insertion of amino acid residues.
  • the mutation is a substitution or deletion, preferably a substitution.
  • the "expression cassette” in the present disclosure refers to an expression unit that includes an expression control region (regulatory element) functional in a host cell and a polynucleotide operably linked to the expression control region.
  • "operably linked” means that an expression control region (regulatory element) functional in a host cell and a polynucleotide are physically or functionally linked to each other.
  • the expression control region (regulatory element) and the nucleic acid (polynucleotide) of the present disclosure are linked by genetic engineering.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector.
  • the expression vector may have an origin of replication, usually introduced into the cell as an extrachromosomal element, thereby ensuring its replication in the host cell.
  • the nucleic acid (polynucleotide) of the present disclosure is functionally linked to an expression control sequence in one or more embodiments.
  • expression control sequences include promoters, enhancers, transcription terminators, operators, repressors, silencers, silencing suppressors, insulators, inducers, start codons, intron splicing signals, stop codons, etc. may include.
  • "enhanced luminescence” in the present disclosure refers to an increase in luminescence intensity compared to before introduction of mutation.
  • the luminescence intensity of the luciferase of the present disclosure is 1% or more, 2% or more, 3% or more, 5% or more, 10% or more than the luminescence intensity of the luciferase before mutation introduction (reference luciferase). , 20% or more, 25% or more, 50% or more, 75% or more, 90% or more, 100% or more, 200% or more, 300% or more, or 400% or more.
  • luciferase before mutation is introduced refers to luciferase that has not been modified (amino acid sequence mutation) according to the present disclosure, that is, has the amino acid sequence before modification. means.
  • the present disclosure in one aspect, relates to a modified luciferase or a functional fragment thereof.
  • the modified luciferase of the present disclosure has an effect of having enhanced luminescence compared to the luciferase before modification according to the present disclosure (mutagenesis of the present disclosure).
  • the modified luciferase of the present disclosure has a mutation introduced into at least one of arginine or lysine corresponding to position 26 and valine corresponding to position 161 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, The luciferase has enhanced luminescence compared to the luciferase before the mutation is introduced.
  • the modified luciferase of the present disclosure is a modified version of luminescent mushroom luciferase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 29.
  • the modified luciferase of the present disclosure has a mutation introduced into at least one of the 5th arginine or lysine and the 140th valine in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 29. It has the amino acid sequence described in 19 or 29.
  • at least one or both of the 29th and 130th Xs in SEQ ID NOs: 19 and 29 may be a gap (an amino acid is deleted).
  • the modified luciferase of the present disclosure is located at the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in any amino acid sequence selected from the group consisting of (a) to (c) below. It has any amino acid sequence selected from the group consisting of (a) to (c) below, in which a mutation has been introduced into at least one of the corresponding arginine or lysine and the valine corresponding to position 161.
  • identity is 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98%. or more than 99%.
  • the number of substituted, deleted, inserted, and/or added amino acids is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11.
  • the modified luciferases of the present disclosure may, in one or more embodiments, include homologues that may be conservatively substituted.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, or 17 is the amino acid sequence of luminescent mushroom luciferase.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of luciferase of Mycena chlorophos
  • SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence of luciferase of Neonothopanus nambi
  • SEQ ID NO: 5 shows the amino acid sequence of luciferase of Armillaria gallica
  • SEQ ID NO: 7 shows the amino acid sequence of luciferase of Armillaria mellea.
  • SEQ ID NO: 9 shows the amino acid sequence of Armillaria ostoyae luciferase
  • SEQ ID NO: 11 shows the amino acid sequence of Mycena citricolor luciferase
  • SEQ ID NO: 13 shows the amino acid sequence of Neonothopanus gardneri luciferase
  • SEQ ID NO: 15 shows the amino acid sequence of Omphalotus olearius luciferase
  • SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of Panelus stipticus luciferase.
  • the modified luciferase of the present disclosure includes Mycena chlorophos luciferase (SEQ ID NO: 1), Neonothopanus nambi luciferase (SEQ ID NO: 3), Armillaria gallica luciferase (SEQ ID NO: 5), and Armillaria mellea luciferase.
  • SEQ ID NO: 7 Armillaria ostoyae luciferase (SEQ ID NO: 9), Mycena citricolor luciferase (SEQ ID NO: 11), Neonothopanus gardneri luciferase (SEQ ID NO: 13), Omphalotus olearius luciferase (SEQ ID NO: 15), Panellus stipticus luciferase In (SEQ ID NO: 17), a mutation has been introduced into at least one of arginine or lysine corresponding to the 26th position and valine corresponding to the 161st position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the mutation may be introduced only into the amino acid (arginine or lysine) corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; It may be introduced only into the amino acid corresponding to position 26 (valine), or both the amino acid corresponding to position 26 (arginine or lysine) and the amino acid corresponding to position 161 (valine) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. may have been introduced.
  • the amino acid corresponding to the 26th amino acid (arginine) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the 40th arginine in Neonothopanus nambi luciferase, the 42nd arginine in Armillaria gallica luciferase, and the 42nd arginine in Armillaria mellea luciferase.
  • the amino acid after mutation of the amino acid corresponding to the 26th amino acid (arginine) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a natural amino acid other than arginine or lysine. It may also be a non-natural amino acid.
  • the amino acid after mutation includes an amino acid whose side chain is uncharged.
  • the mutated amino acid includes an amino acid whose side chain has 3 or 4 carbon atoms and whose side chain is uncharged.
  • the amino acids after mutation include leucine, isoleucine, glutamine, and the like.
  • the modified luciferase of the present disclosure is an isolated polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, in which a mutation has been introduced into the 26th arginine, and the mutation is R26L, R26I or R26Q.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Mycena chlorophos luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a mutation is introduced into the 40th arginine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is R40L, R40I or R40Q.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Luciferase of Neonothopanus nambi) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a mutation is introduced into the 42nd arginine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is R42L, R42I or R42Q.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Armillaria gallica luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and a mutation is introduced into the 42nd arginine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is R42L, R42I or R42Q.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Armillaria mellea luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and a mutation is introduced into the 42nd arginine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is R42L, R42I or R42Q.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Armillaria ostoyae luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and a mutation is introduced into the 27th lysine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is K27L, K27I or K27Q.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Mycena citricolor luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, and a mutation is introduced into arginine at position 36, which corresponds to position 26 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is R36L, R36I or R36Q.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Luciferase of Neonothopanus gardneri) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, and a mutation is introduced into the 29th arginine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is R29L, R29I or R29Q.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Omphalotus olearius luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, and a mutation is introduced into the 25th arginine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is R25L, R25I or R25Q.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Panellus stipticus luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  • the amino acid corresponding to the 161st amino acid (valine) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the 175th valine in Neonothopanus nambi luciferase, the 177th valine in Armillaria gallica luciferase, and the 177th valine in Armillaria mellea luciferase.
  • Valine 177th valine in Armillaria ostoyae luciferase, 160th valine in Mycena citricolor luciferase, 171st valine in Neonothopanus gardneri luciferase, 164th valine in Omphalotus olearius luciferase, 160th valine in Panelus stipticus luciferase It is valine.
  • the amino acid after mutation of the amino acid corresponding to the 161st amino acid (valine) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be a natural amino acid other than valine. It may also be a non-natural amino acid.
  • the amino acid after mutation includes an amino acid whose side chain is uncharged.
  • the amino acid after mutation includes an amino acid whose side chain has 0 or 1 carbon number and whose side chain is uncharged.
  • the amino acids after mutation include alanine, serine, and glycine.
  • the modified luciferase of the present disclosure is an isolated polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, in which a mutation has been introduced at the 161st valine, and the mutation is V161A, V161S or V161G.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Mycena chlorophos luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a mutation is introduced at the 175th valine corresponding to the 161st position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is V175A, V175S or V175G.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Luciferase of Neonothopanus nambi) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and a mutation is introduced into the 177th valine corresponding to the 161st position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is V177A, V177S or V177G.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Armillaria gallica luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and a mutation is introduced at the 177th valine corresponding to the 161st position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is V177A, V177S or V177G.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Armillaria mellea luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and a mutation is introduced at the 177th valine, which corresponds to the 161st position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is V177A, V177S or V177G.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Armillaria ostoyae luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and a mutation is introduced into valine at position 160, which corresponds to position 161 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is V160A, V160S or V160G.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Mycena citricolor luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, and a mutation is introduced into valine at position 171, which corresponds to position 161 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is V171A, V171S or V171G.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Luciferase of Neonothopanus gardneri) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, and a mutation is introduced into the 164th valine corresponding to the 161st position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is V164A, V164S or V164G.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Omphalotus olearius luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, and a mutation is introduced into valine at position 160, which corresponds to position 161 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. wherein the mutation is V160A, V160S or V160G.
  • the modified luciferase of this aspect has enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Panellus stipticus luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  • the modified luciferase of the present disclosure uses arginine or lysine corresponding to the 26th position and valine corresponding to the 161st position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in order to obtain even stronger luminescence intensity. It is preferable that mutations are introduced into both.
  • the modified luciferase of the present disclosure is an isolated polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, with mutations introduced into arginine at position 26 and valine at position 161.
  • the mutations include R26L, R26I or R26Q, and V161A, V161S or V161G.
  • the modified luciferase of this aspect has further enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Mycena chlorophos luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the 40th arginine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: An isolated polypeptide in which a mutation has been introduced into valine at position 175, which corresponds to position 161 in the amino acid sequence shown in , wherein the mutation includes R40L, R40I, or R40Q, and V175A, V175S, or V175G.
  • the modified luciferase of this aspect has further enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Mycena chlorophos luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the 42nd arginine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 1
  • the modified luciferase of this aspect has further enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Mycena chlorophos luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and the 42nd arginine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: An isolated polypeptide in which a mutation has been introduced into valine at position 177 corresponding to position 161 in the amino acid sequence shown in , wherein the mutation includes R42L, R42I, or R42Q, and V177A, V177S, or V177G.
  • the modified luciferase of this aspect has further enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Mycena chlorophos luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and the 42nd arginine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 1
  • the modified luciferase of this aspect has further enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Mycena chlorophos luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and the 27th lysine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 1
  • the modified luciferase of this aspect has further enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Mycena chlorophos luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, and has arginine at position 36 corresponding to position 26 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and An isolated polypeptide in which a mutation has been introduced into valine at position 171, which corresponds to position 161 in the amino acid sequence shown in , wherein the mutation includes R36L, R36I, or R36Q, and V171A, V171S, or V171G.
  • the modified luciferase of this aspect has further enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Mycena chlorophos luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, and has an arginine at position 29 corresponding to position 26 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and An isolated polypeptide in which a mutation has been introduced into valine at position 171 corresponding to position 161 in the amino acid sequence shown in , wherein the mutation includes R29L, R29I, or R29Q, and V171A, V171S, or V171G.
  • the modified luciferase of this aspect has further enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Mycena chlorophos luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • the modified luciferase of the present disclosure has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, and the 25th arginine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: An isolated polypeptide in which a mutation has been introduced into valine at position 164 corresponding to position 161 in the amino acid sequence shown in , wherein the mutation includes R25L, R25I, or R25Q, and V164A, V164S, or V164G.
  • the modified luciferase of this aspect has further enhanced luminescence compared to the wild-type luciferase (Mycena chlorophos luciferase) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  • Neonothopanus nambi is known to maintain its luminescent function as a luciferase even if the luciferase fragment has 6, 9, 12, 15, 25, 31, 33, or 35 amino acids deleted from the N-terminus.
  • Examples of amino acid sequences of functional fragments of luciferase derived from luminescent mushrooms are shown in SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, and 28.
  • the functional fragment of the modified luciferase in the present disclosure includes the 5th arginine or lysine and the 140th arginine or lysine in any amino acid sequence selected from the group consisting of (d) to (f) below.
  • identity is 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98%. or more than 99%.
  • One to several amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, or 28.
  • An amino acid sequence having an amino acid sequence in which the 5th amino acid is arginine or lysine and the 140th amino acid is valine.
  • the number of substituted, deleted, inserted, and/or added amino acids is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11.
  • SEQ ID NO: 20 is an example of a functional fragment of Mycena chlorophos luciferase, and corresponds to the 22nd to 242nd amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 21 is an example of a functional fragment of Neonothopanus nambi luciferase, and corresponds to the 36th to 256th amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: 22 is an example of a functional fragment of Armillaria gallica luciferase, and corresponds to the 38th to 258th amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • SEQ ID NO: 23 is an example of a functional fragment of Armillaria mellea luciferase, and corresponds to the 38th to 258th amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • SEQ ID NO: 24 is an example of a functional fragment of Armillaria ostoyae luciferase, and corresponds to the 38th to 258th amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • SEQ ID NO: 25 is an example of a functional fragment of Mycena citricolor luciferase, and corresponds to the 23rd to 241st amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • SEQ ID NO: 26 is an example of a functional fragment of Neonothopanus gardneri luciferase, and corresponds to the 32nd to 252nd amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • SEQ ID NO: 27 is an example of a functional fragment of Omphalotus olearius luciferase, and corresponds to the 25th to 245th amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
  • SEQ ID NO: 28 is an example of a functional fragment of Panelus stipticus luciferase, and corresponds to the 21st to 241st amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.
  • the modified luciferase of the present disclosure can emit detectable light through an oxidation reaction of a luminescent substrate (luciferin).
  • a luminescent substrate luciferin
  • the luminescent substrate of the modified luciferase of the present disclosure includes 3-hydroxyhispidine having the following structure.
  • other luminescent substrates include compounds having the following structure ((E)-6-(4-diethylamino)styryl)-3,4-dihydroxy-2H-pyran-2-one, ( E)-3,4-dihydroxy-6-(4-hydroxystyryl)-2H-pyran-2-one, (E)-6-(2-1H-indol-3-yl)vinyl)-3,4-dihydroxy -2H-pyran-2-one, and (E)-6-(2-(1,2,3,5,6,7-hexahydropyrido[3,2,1-ij]quinoline-9-yl)vinyl) -3,4-dihydroxy-2H-pyran-2-one).
  • the modified luciferase of the present disclosure may use coelenterazine as a luminescent substrate.
  • Coelenterazine in one or more embodiments, includes those disclosed in U.S. Application No. 12/056,073 (paragraph [0086]), such as coelenterazine-n, coelenterazine-f, coelenterazine-h, coelenterazine-hcp, coelenterazine -cp, coelenterazine-c, coelenterazine-e, coelenterazine-fcp, bis-deoxycoelenterazine (“coelenterazine-hh”), coelenterazine-i, coelenterazine-icp, coelenterazine-v, and 2-methylcoelenterazine.
  • coelenterazine may include those disclosed in WO2012/061529 in one or more other embodiments.
  • the contents of US Application No. 12/056073 and WO2012/061529 are incorporated by reference as forming part of this disclosure.
  • the modified luciferase of the present disclosure may be synthesized by chemical synthesis.
  • the modified luciferase of the present disclosure may be a fusion protein or polypeptide having additional amino acids at the N-terminus and/or C-terminus.
  • the present disclosure relates to a fusion protein obtained by fusing the modified luciferase of the present disclosure or a functional fragment thereof with another protein.
  • other proteins to be fused include fluorescent substances, antibodies, and the like.
  • the fusion protein of the present disclosure includes a fusion protein fused with a fluorescent polypeptide.
  • the fusion protein of the present disclosure includes a modified luciferase of the present disclosure or a functional fragment thereof and a fluorescent protein, and resonance energy is applied to the fluorescent protein from the modified luciferase or functional fragment thereof.
  • Examples include fusion proteins that are linked via a linker sequence to allow movement.
  • Resonance energy transfer includes bioluminescence resonance energy transfer (BRET).
  • BRET bioluminescence resonance energy transfer
  • the fusion protein of the present disclosure may have the modified luciferase of the present disclosure or a functional fragment thereof on the N-terminal side of the fusion protein, and a fluorescent substance on the C-terminal side, in one or more embodiments that are not particularly limited. .
  • the fusion protein of the present disclosure may be synthesized by chemical synthesis or may be produced by genetic recombination technology.
  • nucleic acid encoding modified luciferases of the present disclosure or functional fragments thereof.
  • the nucleic acid of the present disclosure has a mutation introduced into at least one of arginine or lysine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and valine corresponding to the 161st position, and the mutation Encodes a modified luciferase or a functional fragment thereof that has enhanced luminescence compared to luminescent mushroom luciferase without or before introduction of luminescent mushroom luciferase or wild-type luciferase derived from luminescent mushroom.
  • the nucleic acid of the present disclosure corresponds to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in any amino acid sequence selected from the group consisting of (a) to (c) below.
  • identity is 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98%. or more than 99%.
  • amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, or 17.
  • the number of substituted, deleted, inserted, and/or added amino acids is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11.
  • the nucleic acid of the present disclosure provides at least one of arginine or lysine at position 5 and valine at position 140 in any amino acid sequence selected from the group consisting of (d) to (f) below.
  • the present disclosure relates to an isolated nucleic acid encoding a functional fragment of a modified luciferase, which has an amino acid sequence selected from the group consisting of (d) to (f) below, in which a mutation has been introduced.
  • the number of substituted, deleted, inserted, and/or added amino acids is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11.
  • the nucleic acids of the present disclosure can be applied to Mycena chlorophos luciferase (SEQ ID NO: 1), Neonothopanus nambi luciferase (SEQ ID NO: 3), Armillaria gallica luciferase (SEQ ID NO: 5), Armillaria mellea luciferase (SEQ ID NO: 5), Armillaria mellea luciferase (SEQ ID NO: 5), 7), Armillaria ostoyae luciferase (SEQ ID NO: 9), Omphalotus olearius luciferase (SEQ ID NO: 11), Panelus stipticus luciferase (SEQ ID NO: 13), Mycena citricolor luciferase (SEQ ID NO: 15), Neonothopanus gardneri luciferase (SEQ ID NO: 15), Neonothopanus gardneri luciferase (SEQ ID NO: 15
  • the nucleic acid of the present disclosure can obtain stronger luminescence intensity, and in one or more embodiments, Mycena chlorophos luciferase (SEQ ID NO: 1), Neonothopanus nambi luciferase (SEQ ID NO: 3), Armillaria gallica luciferase (SEQ ID NO: 3), Armillaria gallica luciferase (SEQ ID NO: 5), Armillaria mellea luciferase (SEQ ID NO: 7), Armillaria ostoyae luciferase (SEQ ID NO: 9), Omphalotus olearius luciferase (SEQ ID NO: 11), Panelus stipticus luciferase (SEQ ID NO: 13), Mycena citricolor luciferase (SEQ ID NO: 5) 15) and Neonothopanus gardneri luciferase (SEQ ID NO: 17), a modification in which
  • the DNA base sequence encoding luciferase shown in SEQ ID NO: 1 includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the DNA base sequence encoding luciferase shown in SEQ ID NO: 3 includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the DNA base sequence encoding luciferase shown in SEQ ID NO: 5 includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the DNA base sequence encoding luciferase shown in SEQ ID NO: 7 includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • the DNA base sequence encoding luciferase shown in SEQ ID NO: 9 includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • the DNA base sequence encoding luciferase shown in SEQ ID NO: 11 includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the DNA base sequence encoding luciferase shown in SEQ ID NO: 13 includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • the DNA base sequence encoding luciferase shown in SEQ ID NO: 15 includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • the DNA base sequence encoding luciferase shown in SEQ ID NO: 17 includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 18.
  • the modified luciferase of the present disclosure is produced by introducing a mutation into the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, or 18. A nucleic acid containing the encoding base sequence can be easily obtained.
  • the nucleic acid of the present disclosure is SEQ ID NO: 19 or 29, in which a mutation has been introduced into at least one of arginine or lysine at position 5 and valine at position 140 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 29.
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid encoding a polypeptide having the amino acid sequence set forth in No. 29 or a functional fragment thereof.
  • the nucleic acid of the present disclosure may include a nucleic acid encoding a fusion protein of the present disclosure.
  • the present disclosure relates in one aspect to expression cassettes used to obtain modified luciferases of the present disclosure or fusion proteins of the present disclosure, or to replicate nucleic acids of the present disclosure.
  • the expression cassette may exist as an extrachromosomal element, or may be integrated into the genome of the cell by introducing the expression cassette into the cell.
  • an expression cassette of the present disclosure is, in one or more embodiments, an expression cassette comprising a nucleic acid of the present disclosure under the control of regulatory elements necessary for expression of the nucleic acid in a host cell, and that is integrated into the cell genome.
  • the invention relates to an expression cassette capable of effecting the expression of a luciferase encoded by a nucleic acid of the present disclosure, which has been present in the cell or introduced into said cell in the form of an extrachromosomal element.
  • the nucleic acids and expression cassettes of the present disclosure can be used, in one or more embodiments, to generate transformants.
  • the transformant of the present disclosure contains the nucleic acid of the present disclosure introduced by gene transfer.
  • methods for obtaining transformants include the Agrobacterium method, the PEG-calcium phosphate method, the electroporation method, the liposome method, the particle gun method, the microinjection method, and the like.
  • the Agrobacterium method includes cases where protoplasts are used, cases where tissue pieces are used, and cases where the plant itself is used (in planta method).
  • spheroplast method When using protoplasts, there is a method of co-culture with Agrobacterium carrying Ti plasmid, a method of fusion with Agrobacterium that has become a spheroplast (spheroplast method), and when using tissue pieces, aseptic cultivation of the target plant This can be done by infecting leaf discs or callus.
  • spheroplast method when applying the in planta method using seeds or plants, that is, in a system that does not involve tissue culture with addition of plant hormones, it is possible to directly treat water-absorbing seeds, young plants (seedlings), potted plants, etc. with Agrobacterium. It is possible to implement it by
  • the present disclosure in one aspect, relates to cells that produce luciferase encoded by the nucleic acids of the present disclosure.
  • the cell contains an expression cassette comprising a nucleic acid of the present disclosure under the control of regulatory elements necessary for expression of the nucleic acid in the host cell, said expression cassette being integrated into the cell genome or in the presence of extrachromosomal elements.
  • luciferase encoded by a nucleic acid of the present disclosure in the form of an extrachromosomal element or an element integrated into the genome of the cell.
  • prokaryotic cells and eukaryotic cells can be used as hosts.
  • host cells include E. coli, Bacillus subtilis, yeast, plants, insect cells, and non-human vertebrate cells.
  • plants include Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, and Physcomitrella sinensis.
  • transgenic organisms The present disclosure, in one aspect, relates to transgenic organisms comprising the nucleic acids of the present disclosure. In one or more embodiments, transgenic organisms include transgenic plants and transgenic animals.
  • transgenic plants include, in one or more embodiments, transgenic plants such as Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, N. benthamiana, N. chinensis, rice, wheat, and barley.
  • transgenic animals include transgenic non-human animals such as zebrafish, mice, rats, and pigs.
  • the transgenic organism of the present disclosure can be produced by introducing the nucleic acid of the present disclosure, the modified luciferase of the present disclosure, the expression cassette of the present disclosure, or the vector of the present disclosure into a subject (organism). .
  • the method for producing a transgenic organism can be determined as appropriate depending on the type of transgenic organism.
  • methods for producing transgenic plants include the Agrobacterium method, the PEG-calcium phosphate method, the electroporation method, the liposome method, the particle gun method, and the microinjection method.
  • the method for producing a transgenic animal includes introducing the nucleic acid of the present disclosure into a fertilized egg collected from an organism, and introducing a viral vector such as a retrovirus into a donor organism in vitro. Examples include infecting the cells of the early developing lung from which the virus is derived.
  • the transgenic organism of the present disclosure may further include a gene group constituting the biosynthetic cycle of a luminescent substrate such as 3-hydroxyhispidine.
  • a luminescent substrate such as 3-hydroxyhispidine.
  • autonomous luminescence imaging self-luminescence imaging
  • kits The present disclosure, in one aspect, relates to a kit comprising a modified luciferase of the present disclosure, a nucleic acid encoding a modified luciferase of the present disclosure, an expression cassette of the present disclosure, and/or a fusion protein of the present disclosure.
  • the kit of the present disclosure may further include a luminescent substrate (luciferin) for the modified luciferase of the present disclosure.
  • the luminescent substrate (luciferin) is as described above.
  • the components of the kit may be packaged in a container in one or more embodiments.
  • the components of the kit may be stored in a dry state or in a medium such as a buffer.
  • the kit of the present disclosure may include instructions for using each component.
  • the modified luciferases, fusion proteins, nucleic acids, expression cassettes, and kits of the present disclosure can be used in various fields such as medicine and biotechnology.
  • Applications include self-luminous imaging in one or more embodiments.
  • other uses include analysis of intracellular functions, diagnosis, quality control, environmental testing, and the like.
  • other uses include, in one or more embodiments, the production of bioluminescent transgenic plants that can be used as light sources for illumination and the like.
  • the present disclosure relates to methods of expressing the modified luciferases of the present disclosure or functional fragments thereof.
  • the method of this aspect includes introducing the nucleic acid of the present disclosure into a cell or plant, and causing an oxidation reaction of a luminescent substrate in the introduced cell or plant.
  • the present disclosure in other aspects, relates to methods of producing bioluminescence.
  • the method of this aspect includes adding a luminescent substrate to a medium or soil in which a transgenic plant having a nucleic acid of the present disclosure is placed.
  • the present disclosure relates to the use of a transgenic plant having a nucleic acid of the present disclosure and a group of genes constituting a biosynthetic cycle of a luminescent substrate.
  • a modified luciferase derived from a luminescent mushroom or a functional fragment thereof A mutation is introduced into at least one of arginine or lysine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and valine corresponding to the 161st position, and the luciferase has enhanced luminescence compared to the luciferase before the introduction of the mutation.
  • a modified luciferase or a functional fragment thereof is introduced into at least one of arginine or lysine corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and valine corresponding to the 161st position.
  • the modified luciferase has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19: FPXXXXDYXTFLXXGPSYAPQNXXGYXIVXVLXLFRXEXXXXXIYXXXPEKRXWLXXLPXRXGXRPXTSHIIQRQXXQXXDXXFXXXXLXXXIXRXQXRHXXXTXXXXSXFEFHAXAIFXXXXXXXXXXPXXPXXXTVRRTKXEIAHMHDYHDXTXHLALAAX DXKXVXXKGWGQRHPLAGPGXPGPPXEWTFXYAPRXEXEXVXEXIXEAXXXYMXN, or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29: FPXXXXDYXTFLXXGPSYAPQNXXGYXIVXVLXLFRXEX
  • amino acid sequence having an amino acid sequence wherein the amino acid corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is arginine or lysine, and the amino acid corresponding to the 161st position is valine.
  • An expression cassette comprising the nucleic acid according to any one of [3] to [5], which is under the control of regulatory elements necessary for expression of the nucleic acid in a host cell, integrated into the cell genome or introduced into said cell in the form of an extrachromosomal element; An expression cassette capable of bringing about the expression of luciferase encoded by the nucleic acid according to any one of [3] to [5].
  • amino acid sequence having an amino acid sequence wherein the amino acid corresponding to the 26th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is arginine or lysine, and the amino acid corresponding to the 161st position is valine.
  • the modified luciferase or functional fragment thereof according to [1], [2], [8] or [9] and a fluorescent protein are transferred from the modified luciferase or functional fragment thereof to the fluorescent protein.
  • a fusion protein that is linked via a linker sequence to allow resonance energy transfer.
  • a kit comprising at least one selected from the group consisting of (1) to (6) below and the luminescent substrate for modified luciferase according to [1], [2], [8] or [9] .
  • the luminescent substrate is 3-hydroxyhispidine, (E)-6-(4-diethylamino)styryl)-3,4-dihydroxy-2H-pyran-2-one, (E)-3,4- dihydroxy-6-(4-hydroxystyryl)-2H-pyran-2-one, (E)-6-(2-1H-indol-3-yl)vinyl)-3,4-dihydroxy-2H-pyran-2- one, (E)-6-(2-(1,2,3,5,6,7-hexahydropyrido[3,2,1-ij]quinoline-9-yl)vinyl)-3,4-dihydroxy-2H -pyran-2-one), coelenterazine-n, coelenterazine-f, coelenterazine-h, coelenterazine-hcp, coelenterazine-cp, coelenterazine-c, coelenterazine-e, coelenterazine-fcp,
  • Example 1 Production of mutant luciferase 1
  • Random mutations were induced in the full-length Mycena chlorophos luciferase gene sequence (SEQ ID NO: 2) to create a mutant cDNA library.
  • Escherichia coli (JM109 (DE3)) transformed with a plasmid containing the gene was cultured (37°C/16 hours) on an LB agar medium containing 100 ⁇ g/mL ampicillin to express the protein of interest, and 3-hydroxyhispidine E. coli colonies were screened by acquiring luminescent images under the addition conditions.
  • the following mutants were obtained that exhibited higher expression intensity than the wild type on E. coli colonies.
  • An example of the results is shown in FIG.
  • the following mutation sites are amino acid positions in the amino acid sequence of Mycena chlorophos luciferase (SEQ ID NO: 1).
  • mc mutant 1 mutant: R26L
  • mc mutant 2 mutant: V161A
  • mc mutant 3 mutant: R26L V161A
  • E. coli colony screening was performed using the following procedure. Escherichia coli (JM109 (DE3)) transformed with a plasmid expressing the target protein was cultured (37° C./16 hours) on an LB agar medium containing 100 ⁇ g/mL ampicillin. After preparing a replica using a membrane in the same manner as in the screening, the protein was expressed on a medium containing IPTG. After soaking the membrane in 5 mL of buffer (PBS pH 8.0), the membrane was transferred to an empty 10 cm dish, and 5 mL of 10 ⁇ M 3-hydroxyhispidine solution (10 ⁇ M 3-hydroxyhispidine, PBS pH 8.0) was added.
  • buffer PBS pH 8.0
  • Figure 1 shows the normalized luminescence intensity in E. coli colonies for the wild type and mc mutants 1 and 3.
  • the luminescence intensity of mc mutant 1 was more than 1.5 times higher than that of the wild type, and the luminescence intensity of mc mutant 3 was more than 4 times higher than that of the wild type.
  • the V161A mutation causes a change in luminescence intensity in cooperation with the R26L mutation.
  • Example 2 Multiple alignment of amino acid sequences of various luciferases
  • a multiple alignment of the amino acid sequences of the luciferases of nine types of luminescent mushrooms that have already been identified was performed using GENETYX ver12. (GENETYX).
  • the amino acid sequences of nine types of Luz (luciferase) were obtained using NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The results are shown in FIG.
  • GenBank IDs are Mycena chlorophos luciferase (GenBank: BBH43507.1, SEQ ID NO: 1), Neonothopanus nambi luciferase (GenBank: BBH43509.1, SEQ ID NO: 3), Armillaria gallica luciferase (GenBank: BBH43503.1, array No.
  • Example 1 the 26th arginine of the Mycena chlorophos luciferase mutated in Example 1 is conserved in 8 of the 9 types, and the 161st position valine is conserved in all 9 types. It was preserved.
  • Example 3 Production of mutant luciferase 2
  • SEQ ID NO: 4 An example of the results is shown in FIG.
  • nn mutant 1 mutant 1 (mutation: R40I) nn mutant 2 (mutation: R40I V175S) nn mutant 3 (mutation: R40Q) nn mutant 4 (mutation: R40Q V175A) nn mutant 5 (mutation: R40Q V175G)
  • Figure 3 shows the normalized luminescence intensities in E. coli colonies for the wild type and nn mutants 1-5. The luminescence intensity of all mutants was approximately 1.5 times higher than that of the wild type.
  • Xaa can be any naturally occurring amino acid or none. Xaa other than the above can be any naturally occurring amino acid. Sequence number 29: FPXXXXDYXTFLXXGPSYAPQNXXGYXIVXVLXLFRXEXXXXXIYXXXPEKRXWLXXLPXRXGXRPXXTSHIIQRQXXQXXDXXFXXXXLXXXXIXRXQXRHXXXTXXXXSXFEFHAXAIFXXXXXXXXXXXPXXPXXXXTVRRTKXEIAHMHDYHDXTXHLALAAXDXKXVXXKGWGQRHPLAGPGXPGPPXEWTFXYAPRXEX EXXVXEXIXEAXXYMXN ⁇ 222> (3)..(3) ⁇ 223> Xaa is P
  • Xaa is Ile or Val. ⁇ 222> (5)..(6) ⁇ 223> Xaa is Arg or Lys. ⁇ 222> (9)..(9) ⁇ 223> Xaa is Gln, Glu or His. ⁇ 222> (13)..(13) ⁇ 223> Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (14)..(14) ⁇ 223> Xaa is Gly or Val. ⁇ 222> (23)..(23) ⁇ 223> Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (24)..(24) ⁇ 223> Xaa is Arg, Lys or Gln.
  • ⁇ 222> (27)..(27) ⁇ 223> Xaa is Ile Phe or Leu. ⁇ 222> (30)..(30) ⁇ 223> Xaa is Leu or Cys. ⁇ 222> (33)..(33) ⁇ 223> Xaa is Ser or Ala. ⁇ 222> (37)..(37) ⁇ 223> Xaa is Gly or Gln. ⁇ 222> (39)..(39) ⁇ 223> Xaa is Glu or Gln. ⁇ 222> (40)..(40) ⁇ 223> Xaa is Lys, Leu or Thr.
  • ⁇ 222> (41)..(41) ⁇ 223> Xaa is Gly or Asp. ⁇ 222> (42)..(42) ⁇ 223> Xaa is Leu or Val. ⁇ 222> (43)..(43) ⁇ 223> Xaa is Ala or Glu. ⁇ 222> (46)..(46) ⁇ 223> Xaa is Glu or Asp. ⁇ 222> (47)..(47) ⁇ 223> Xaa is Pro or Arg. ⁇ 222> (48)..(48) ⁇ 223> Xaa is Leu or Met. ⁇ 222> (53)..(53) ⁇ 223> Xaa is Thr or Arg.
  • Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (57).
  • Xaa is Glu, Asp or Asn.
  • Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (62).
  • Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (64).
  • Xaa is Asp, Thr or Pro.
  • Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (68)..(68) ⁇ 223> Xaa is Thr or Ile. ⁇ 222> (77)..(77) ⁇ 223> Xaa is Leu or Arg. ⁇ 222> (78)..(78) ⁇ 223> Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (80)..(81) ⁇ 223> Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (83)..(83) ⁇ 223> Xaa is Pro, Gln, Leu, Ser or Ala.
  • Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (86)..(86) ⁇ 223> Xaa is Val, Ala or Gly. ⁇ 222> (87)..(88) ⁇ 223> Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (89)..(89) ⁇ 223> Xaa is Ala, Glu, Tyr or Ser. ⁇ 222> (91)..(91) ⁇ 223> Xaa is Lys, or Ile.
  • Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (93)..(93) ⁇ 223> Xaa is Thr, Lys or Ser. ⁇ 222> (94)..(94) ⁇ 223> Xaa is Val or Ile. ⁇ 222> (96)..(96) ⁇ 223> Xaa is Pro or Arg. ⁇ 222> (98)..(98) ⁇ 223> Xaa is Val or Leu. ⁇ 222> (100)..(100) ⁇ 223> Xaa is Ala or Ser. ⁇ 222> (103)..(103) ⁇ 223> Xaa is Thr, Ala or Gln.
  • ⁇ 222> (104)..(104) ⁇ 223> Xaa is Asp, Ala or Asn. ⁇ 222> (105)..(105) ⁇ 223> Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (107)..(107) ⁇ 223> Xaa is His, Phe or Gln. ⁇ 222> (108)..(108) ⁇ 223> Xaa is Leu or Ile. ⁇ 222> (109)..(109) ⁇ 223> Xaa is Ala or Ser. ⁇ 222> (110)..(110) ⁇ 223> Xaa is Leu, Thr or Arg.
  • ⁇ 222> (130)..(130) ⁇ 223> Xaa is Asp or none.
  • ⁇ 222> (132)..(132) ⁇ 223> Xaa is Lys, Leu, Glu, or Gln.
  • ⁇ 222> (133)..(133) ⁇ 223> Xaa is His, Asn or Gly. ⁇ 222> (134)..(134) ⁇ 223> Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (136)..(136) ⁇ 223> Xaa is Ser or Ala. ⁇ 222> (137)..(137) ⁇ 223> Xaa is His or Ser. ⁇ 222> (138)..(138) ⁇ 223> Xaa is Asp or Glu. ⁇ 222> (145)..(145) ⁇ 223> Xaa is Arg or Gly.
  • Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (158)..(158) ⁇ 223> Xaa is Leu or Cys. ⁇ 222> (160)..(160) ⁇ 223> Xaa is Leu or Ile. ⁇ 222> (165)..(165) ⁇ 223> Xaa is Gln or Ala. ⁇ 222> (167)..(167) ⁇ 223> Xaa is Ala or Gly. ⁇ 222> (169)..(169) ⁇ 223> Xaa is Gln or Glu.
  • Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (186).
  • Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (208)..(208) ⁇ 223> Xaa is Val or Leu. ⁇ 222> (210)..(210) ⁇ 223> Xaa is Thr, Met or Gln. ⁇ 222> (212)..(212) ⁇ 223> Xaa can be any naturally occurring amino acid ⁇ 222> (215)..(215) ⁇ 223> Xaa is Ser or Ala. ⁇ 222> (216)..(216) ⁇ 223> Xaa is Ile or Val. ⁇ 222> (217)..(217) ⁇ 223> Xaa is Ala, Gly or Val. ⁇ 222> (220)..(220) ⁇ 223> Xaa is Thr or Ser.

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Abstract

本開示は、一態様において、発光強度が向上した改変型ルシフェラーゼ及びその利用を提供する。　発光キノコ由来の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン、及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入され、前記変異導入前と比較して増強された発光を有する、改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片に関する。また、本開示の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片をコードする単離核酸に関する。

Description

発光タンパク質
　本開示は、改変型ルシフェラーゼ及びその利用に関する。
　分子イメージングとは観察対象が生きている状態で、生体内における様々な分子の動きや変化を観察する手法である。分子イメージング手法の一つとして、化学発光イメージングがある。化学発光イメージングは、発光基質（ルシフェリン）の酸化反応を化学発光タンパク質（ルシフェラーゼ）が触媒することで発光する現象（Luciferin-luciferase反応）を利用して生体内の観察を行う手法である。
　ホタル、ウミホタル、及び発光キノコなど、多くの生物が化学的に光を放つ能力を有する。この化学発光反応は、発光性タンパク質の１つである化学発光タンパク質（ルシフェラーゼ）とその発光基質（ルシフェリン）によって起こり、これらの構造は生物種によって多種多様である。現在、さまざまな発光性タンパク質がレポーターやプローブとして生命科学研究に応用されている。
　近年、発光キノコ（発光菌類）のルシフェラーゼの発光基質が３－ヒドロキシヒスピジンであることが判明し、さらには発光キノコのルシフェラーゼ遺伝子が特定されている（非特許文献１～３、特許文献１）。
Kotlobay et al., Genetically encodable bioluminescent system from fungi, 12728-12732, PNAS December 11, 2018 vol. 115 no. 50www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1803615115 Khakhar et al., Building customizable auto-luminescent luciferase-based reporters in plants, eLife 2020;9:e52786.https://doi.org/10.7554/eLife.52786 Mitiouchkina T, et al., Plants with genetically encoded autoluminescence. Nat Biotechnol. 2020 Aug;38(8):944-946
特表2020-505028号公報
　ルシフェラーゼを細胞等に発現させてレポーターやプローブとして用いる場合、細胞等に対して発光基質（ルシフェリン）の添加が必要である。このルシフェリンの添加という問題を解決する方法として、ルシフェリンの生合成サイクルを構成する遺伝子群を同時に生体に導入し、イメージングを行う自律的発光イメージング（自発光イメージング）がある。自発光系の一つとして発光キノコ由来の系（Ｆｕｎｇａｌ　ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｐａｔｈｗａｙ：ＦＢＰ）がある。ＦＢＰは、特に、植物における自発光イメージングに適しているといえる。
　しかしながら、発光キノコ由来自発光系の発光強度では、細胞内や細胞間で起こる生理現象の観察に限界があり、発光キノコ由来の自発光系における発光強度の向上が求められている。
　本開示は、一態様において、発光強度が向上した改変型ルシフェラーゼ及びその利用を提供する。
　本開示は、一態様において、発光キノコ由来の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン、及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入され、前記変異導入前の又は発光キノコ由来野生型ルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片に関する。
　本開示は、一態様において、本開示の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片をコードする単離核酸に関する。
　本開示は、一態様において、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入された、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有する改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片をコードする単離核酸に関する。
　（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載の発光キノコ由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列；
　（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列；
　（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列。
　本開示は、一態様において、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入された、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有する改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片に関する。
　（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載の発光キノコ由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列；
　（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列；
　（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列。
　本開示によれば、一態様において、発光強度が向上した改変型ルシフェラーゼを提供することができる。
図１は、実施例１におけるMycena chlorophosのルシフェラーゼにおける野生型及び変異体についての大腸菌コロニーでの発光強度比較を示す。 図２は、実施例２における発光キノコのルシフェラーゼ（９種類）の配列のアラインメントを示す。 図３は、実施例３におけるNeonothopanus nambiのルシフェラーゼにおける野生型及び変異体についての大腸菌コロニーでの発光強度比較を示す。
　本開示は、発光キノコ由来ルシフェラーゼにおいて、特定のアミノ酸（配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸及び１６１番目に相当するアミノ酸）に変異を挿入することによって得られた改変型ルシフェラーゼの発光強度が、該変異導入前のルシフェラーゼと比較して向上するという、知見に基づく。
　本開示における「ルシフェラーゼ」は、発光基質（ルシフェリン）の酸化反応を触媒する活性を有する酵素をいう。ルシフェラーゼによるルシフェリンの酸化プロセスにおいて生成されるエネルギーが、光として放出される。「本開示の改変型ルシフェラーゼ」は、本開示における改変がなされたルシフェラーゼ、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン、及び／又は１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入されたルシフェラーゼをいう。
　本開示における「発光キノコ」とは、発光を生じるキノコであって、ルシフェラーゼによる酵素反応により緑色の発光を生じるキノコをいう。発光キノコとしては、一又は複数の実施形態において、Mycena chlorophos、Neonothopanus nambi、Armillaria gallica、Armillaria mellea、Armillaria ostoyae、Omphalotus olearius、Panellus stipticus、Mycena citricolor、及びNeonothopanus gardnerが挙げられる。
　本開示における「発光キノコ由来ルシフェラーゼ」は、発光キノコから抽出されたルシフェラーゼをいう。発光キノコ由来ルシフェラーゼとしては、一又は複数の実施形態において、Mycena chlorophosのルシフェラーゼ、Neonothopanus nambiのルシフェラーゼ、Armillaria gallicaのルシフェラーゼ、Armillaria melleaのルシフェラーゼ、Armillaria ostoyaeのルシフェラーゼ、Mycena citricolorのルシフェラーゼ、Neonothopanus gardnerのルシフェラーゼ、Omphalotus oleariusのルシフェラーゼ、Panellus stipticusのルシフェラーゼが挙げられる。
　本開示における「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、互いに同義であるものとする。ポリヌクレオチドは、一又は複数の実施形態において、任意のタイプのヌクレオチド配列であってもよい。ポリヌクレオチドは、一又は複数の実施形態において、合成ＲＮＡ配列、合成ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、及び部分的ゲノムＤＮＡ配列等が挙げられる。
　本開示における「ポリペプチド」は、「タンパク質」と同義である。「ポリペプチド」は、隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボキシル基とがペプチド結合により結合した連続した一連の残基をいう。ポリペプチドは、一又は複数の実施形態において、糖鎖及びイソプレノイド等の構造を含んでいてもよい。
　本開示における「単離」又は「単離された」は、本開示の核酸又はポリペプチドがインビトロで調製又は単離されていること、又は実質的にインビトロの物質から精製されていることを含みうる。また「単離」又は「単離された」は、本開示の核酸又はポリペプチドが、それらが自然の状態で存在する場合に付随するその他の物質・コンポーネントから実質的に分離していること、又は自然の状態で存在する環境とは異なる環境にあることをいう。
　本開示における「単離ポリペプチド」は、ｃＤＮＡ又は組換えＲＮＡによってコードされたポリペプチド、ペプチド又はタンパク質、又はそれらの組み合わせを含みうる。
　本開示において「本開示の単離核酸」を単に「本開示の核酸」という場合もある。
　本開示における「機能的断片」は、発光を伴うルシフェリンの酸化反応を触媒可能なルシフェラーゼの部分若しくは領域であって、全長の当該ルシフェラーゼと同じ活性か又は類似の活性を有するものをいう。本開示において機能的断片は、一又は複数の実施形態において、全長のルシフェラーゼの活性の、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は１００％を有しうる。
　本開示において「ポリペプチドをコードする核酸（ヌクレオチド配列）」とは、当該核酸（ヌクレオチド配列）によってコードされたポリペプチドが、ｍＲＮＡの転写及び翻訳により該ヌクレオチド配列から生成されることをいう。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、一又は複数の実施形態において、イントロンを含む配列を含みうる。
　本開示において「配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目及び／又は１６１番目のアミノ酸に相当するアミノ酸」とは、ホモロジー解析により配列番号１に示されるアミノ酸配列の２６番目及び／又は１６１番目に相当すると特定されるアミノ酸をいう。ホモロジー解析は、一又は複数の実施形態において、一般に入手可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。ホモロジー解析の方法としては、一又は複数の実施形態において、Pairwise Sequence Alignmentによる方法や、ClustalW法等のMultiple Sequence Alignmentによる方法等が挙げられる。当業者であれば、これら方法に基づき、例えば、マルチプルアライメントを行うことにより、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照配列として使用し、解析対象のアミノ酸配列中における「配列番号１の２６番目及び／又は１６１番目に相当するアミノ酸」を理解することができる。
　なお、マルチプルアライメントにおいては、一又は複数の実施形態において、ギャップが存在していてもよい。
　本開示におけるアミノ酸配列の「変異」とは、アミノ酸残基の置換、欠失又は挿入をいう。変異は、一又は複数の実施形態において、置換又は欠失であり、好ましくは置換である。
　本開示における「発現カセット」とは、宿主細胞内で機能的な発現制御領域（調節エレメント）と、当該発現制御領域と動作可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む発現単位をいう。本開示において「動作可能に連結された」とは、宿主細胞内で機能的な発現制御領域（調節エレメント）と、ポリヌクレオチドとが、互いに物理的又は機能的に連結されていることをいう。発現カセットは、一又は複数の実施形態において、当該発現制御領域（調節エレメント）と、本開示の核酸（ポリヌクレオチド）とが、遺伝子工学的に連結されている。
　本開示において発現カセットは、一又は複数の実施形態において、発現ベクターの形態であってもよい。発現ベクターは、通常、染色体外エレメントとして細胞に導入されることで、宿主細胞におけるその複製を確保する複製起点を有し得る。発現ベクターにおいて、本開示の核酸（ポリヌクレオチド）は、一又は複数の実施形態において、発現調節配列と機能的に連結される。発現調節配列としては、一又は複数の実施形態において、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、オペレーター、リプレッサー、サイレンサー、サイレンシングサプレッサー、インスレーター、インデューサー、開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及び停止コドン等を含み得る。
　本開示において「増強された発光」とは、一態様において、変異導入前よりも発光強度が増加されたことをいう。本開示のルシフェラーゼの発光強度が、一又は複数の実施形態において変異導入前のルシフェラーゼ（参照ルシフェラーゼ）の発光強度よりも、１％以上、２％以上、３％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、２５％以上、５０％以上、７５％以上、９０％以上、１００％以上、２００％以上、３００％以上又は４００％以上大きいことをいう。本開示において「変異が導入される前のルシフェラーゼ（参照ルシフェラーゼ）」とは、本開示にしたがった改変（アミノ酸配列の変異）がなされていない、つまり、改変がなされる前のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼをいう。
　［改変型ルシフェラーゼ］
　本開示は、一態様において、改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片に関する。本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、本開示にしたがった改変（本開示の変異導入）前のルシフェラーゼと比較して増強された発光を有するという効果を奏する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン、及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入され、該変異が導入される前のルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１９又は２９に記載のアミノ酸配列を有する発光キノコのルシフェラーゼを改変した改変体である。本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１９又は２９に記載のアミノ酸配列における５番目のアルギニン又はリジン及び１４０番目のバリンの少なくとも一方に変異が導入された、配列番号１９又は２９に記載のアミノ酸配列を有する。なお、特に限定されない一又は複数の実施形態において、配列番号１９及び２９における２９番目及び１３０番目のＸの少なくとも一方又は両方は、ギャップ（アミノ酸が欠失）であってもよい。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入された、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有する。
　（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載の発光キノコ由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列。
　（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列。同一性は、一又は複数の実施形態において、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上である。
　（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列。置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸の個数は、一又は複数の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１個である。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、保存置換されうる相同体を含みうる。
　配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列は、発光キノコのルシフェラーゼのアミノ酸配列である。配列番号１はMycena chlorophosのルシフェラーゼのアミノ酸配列を示し、配列番号３はNeonothopanus nambiのルシフェラーゼのアミノ酸配列を示し、配列番号５はArmillaria gallicaのルシフェラーゼのアミノ酸配列を示し、配列番号７はArmillaria melleaのルシフェラーゼのアミノ酸配列を示し、配列番号９はArmillaria ostoyaeのルシフェラーゼのアミノ酸配列を示し、配列番号１１はMycena citricolorのルシフェラーゼのアミノ酸配列を示し、配列番号１３はNeonothopanus gardneriのルシフェラーゼのアミノ酸配列を示し、配列番号１５はOmphalotus oleariusのルシフェラーゼのアミノ酸配列を示し、配列番号１７はPanellus stipticusのルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、Mycena chlorophosのルシフェラーゼ（配列番号１）、Neonothopanus nambiのルシフェラーゼ（配列番号３）、Armillaria gallicaのルシフェラーゼ（配列番号５）、Armillaria melleaのルシフェラーゼ（配列番号７）、Armillaria ostoyaeのルシフェラーゼ（配列番号９）、Mycena citricolorのルシフェラーゼ（配列番号１１）、Neonothopanus gardneriのルシフェラーゼ（配列番号１３）、Omphalotus oleariusのルシフェラーゼ（配列番号１５）、Panellus stipticusのルシフェラーゼ（配列番号１７）において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入されている。変異は、一又は複数の実施形態において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸（アルギニン又はリジン）のみに導入されていてもよく、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当するアミノ酸（バリン）のみに導入されていてもよく、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸（アルギニン又はリジン）と１６１番目に相当するアミノ酸（バリン）との両方に導入されていてもよい。
　配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目のアミノ酸（アルギニン）に相当するアミノ酸としては、Neonothopanus nambiのルシフェラーゼでは４０番目のアルギニン、Armillaria gallicaのルシフェラーゼでは４２番目のアルギニン、Armillaria melleaのルシフェラーゼでは４２番目のアルギニン、Armillaria ostoyaeのルシフェラーゼでは４２番目のアルギニン、Mycena citricolorのルシフェラーゼでは２７番目のリジン、Neonothopanus gardneriのルシフェラーゼでは３６番目のアルギニン、Omphalotus oleariusのルシフェラーゼでは２９番目のアルギニン、Panellus stipticusのルシフェラーゼでは２５番目のアルギニンである。
　本開示において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目のアミノ酸（アルギニン）に相当するアミノ酸の変異後のアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、アルギニン又はリジン以外の天然のアミノ酸であってもよいし、非天然のアミノ酸であってもよい。変異後のアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、側鎖が非電荷のアミノ酸が挙げられる。変異後のアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、側鎖の炭素数が３又は４の側鎖が非電荷のアミノ酸が挙げられる。変異後のアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、ロイシン、イソロイシン、及びグルタミン等が挙げられる。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、２６番目のアルギニンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ２６Ｌ、Ｒ２６Ｉ又はＲ２６Ｑである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Mycena chlorophosのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する４０番目のアルギニンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ４０Ｌ、Ｒ４０Ｉ又はＲ４０Ｑである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Neonothopanus nambiのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
 本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する４２番目のアルギニンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ４２Ｌ、Ｒ４２Ｉ又はＲ４２Ｑである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Armillaria gallicaのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する４２番目のアルギニンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ４２Ｌ、Ｒ４２Ｉ又はＲ４２Ｑである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Armillaria melleaのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する４２番目のアルギニンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ４２Ｌ、Ｒ４２Ｉ又はＲ４２Ｑである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Armillaria ostoyaeのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する２７番目のリジンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｋ２７Ｌ、Ｋ２７Ｉ又はＫ２７Ｑである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Mycena citricolorのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する３６番目のアルギニンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ３６Ｌ、Ｒ３６Ｉ又はＲ３６Ｑである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Neonothopanus gardneriのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する２９番目のアルギニンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ２９Ｌ、Ｒ２９Ｉ又はＲ２９Ｑである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Omphalotus oleariusのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する２５番目のアルギニンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ２５Ｌ、Ｒ２５Ｉ又はＲ２５Ｑである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Panellus stipticusのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目のアミノ酸（バリン）に相当するアミノ酸は、Neonothopanus nambiのルシフェラーゼでは１７５番目のバリン、Armillaria gallicaのルシフェラーゼでは１７７番目のバリン、Armillaria melleaのルシフェラーゼでは１７７番目のバリン、Armillaria ostoyaeのルシフェラーゼでは１７７番目のバリン、Mycena citricolorのルシフェラーゼでは１６０番目のバリン、Neonothopanus gardneriのルシフェラーゼでは１７１番目のバリン、Omphalotus oleariusのルシフェラーゼでは１６４番目のバリン、Panellus stipticusのルシフェラーゼでは１６０番目のバリンである。
　本開示において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目のアミノ酸（バリン）に相当するアミノ酸の変異後のアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、バリン以外の天然のアミノ酸であってもよいし、非天然のアミノ酸であってもよい。変異後のアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、側鎖が非電荷のアミノ酸が挙げられる。変異後のアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、側鎖の炭素数が０又は１の側鎖が非電荷のアミノ酸が挙げられる。変異後のアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、アラニン、セリン、及びグリシンが挙げられる。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、１６１番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｖ１６１Ａ、Ｖ１６１Ｓ又はＶ１６１Ｇである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Mycena chlorophosのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１７５番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｖ１７５Ａ、Ｖ１７５Ｓ又はＶ１７５Ｇである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Neonothopanus nambiのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１７７番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｖ１７７Ａ、Ｖ１７７Ｓ又はＶ１７７Ｇである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Armillaria gallicaのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１７７番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｖ１７７Ａ、Ｖ１７７Ｓ又はＶ１７７Ｇである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Armillaria melleaのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１７７番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｖ１７７Ａ、Ｖ１７７Ｓ又はＶ１７７Ｇである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Armillaria ostoyaeのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１６０番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｖ１６０Ａ、Ｖ１６０Ｓ又はＶ１６０Ｇである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Mycena citricolorのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１７１番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｖ１７１Ａ、Ｖ１７１Ｓ又はＶ１７１Ｇである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Neonothopanus gardneriのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１６４番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｖ１６４Ａ、Ｖ１６４Ｓ又はＶ１６４Ｇである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Omphalotus oleariusのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１６０番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｖ１６０Ａ、Ｖ１６０Ｓ又はＶ１６０Ｇである。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Panellus stipticusのルシフェラーゼ）と比較して、増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、さらに強い発光強度を得る点から、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジンと１６１番目に相当するバリンとの双方に変異が導入されていることが好ましい。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、２６番目のアルギニンと１６１番目のバリンとに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ２６Ｌ、Ｒ２６Ｉ又はＲ２６Ｑと、Ｖ１６１Ａ、Ｖ１６１Ｓ又はＶ１６１Ｇとを含む。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Mycena chlorophosのルシフェラーゼ）と比較して、さらに増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する４０番目のアルギニンと配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１７５番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ４０Ｌ、Ｒ４０Ｉ又はＲ４０Ｑと、Ｖ１７５Ａ、Ｖ１７５Ｓ又はＶ１７５Ｇとを含む。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Mycena chlorophosのルシフェラーゼ）と比較して、さらに増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する４２番目のアルギニンと配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１７７番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ４２Ｌ、Ｒ４２Ｉ又はＲ４２Ｑと、Ｖ１７７Ａ、Ｖ１７７Ｓ又はＶ１７７Ｇとを含む。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Mycena chlorophosのルシフェラーゼ）と比較して、さらに増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する４２番目のアルギニンと配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１７７番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ４２Ｌ、Ｒ４２Ｉ又はＲ４２Ｑと、Ｖ１７７Ａ、Ｖ１７７Ｓ又はＶ１７７Ｇとを含む。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Mycena chlorophosのルシフェラーゼ）と比較して、さらに増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する４２番目のアルギニンと配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１７７番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ４２Ｌ、Ｒ４２Ｉ又はＲ４２Ｑと、Ｖ１７７Ａ、Ｖ１７７Ｓ又はＶ１７７Ｇとを含む。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Mycena chlorophosのルシフェラーゼ）と比較して、さらに増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する２７番目のリジンと配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１６０番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｋ２７Ｌ、Ｋ２７Ｉ又はＫ２７Ｑと、Ｖ１６０Ａ、Ｖ１６０Ｓ又はＶ１６０Ｇとを含む。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Mycena chlorophosのルシフェラーゼ）と比較して、さらに増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する３６番目のアルギニンと配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１７１番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ３６Ｌ、Ｒ３６Ｉ又はＲ３６Ｑと、Ｖ１７１Ａ、Ｖ１７１Ｓ又はＶ１７１Ｇとを含む。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Mycena chlorophosのルシフェラーゼ）と比較して、さらに増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する２９番目のアルギニンと配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１７１番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ２９Ｌ、Ｒ２９Ｉ又はＲ２９Ｑと、Ｖ１７１Ａ、Ｖ１７１Ｓ又はＶ１７１Ｇとを含む。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Mycena chlorophosのルシフェラーゼ）と比較して、さらに増強された発光を有する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当する２５番目のアルギニンと配列番号１に示されるアミノ酸配列における１６１番目に相当する１６４番目のバリンに変異が導入された単離ポリペプチドであって、前記変異が、Ｒ２５Ｌ、Ｒ２５Ｉ又はＲ２５Ｑと、Ｖ１６４Ａ、Ｖ１６４Ｓ又はＶ１６４Ｇとを含む。本態様の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ（Mycena chlorophosのルシフェラーゼ）と比較して、さらに増強された発光を有する。
　Neonothopanus nambiは、Ｎ末端から６、９、１２、１５、２５、３１、３３又は３５個のアミノ酸が欠失したルシフェラーゼ断片であっても、ルシフェラーゼとしての発光機能が維持されることが知られている。発光キノコ由来のルシフェラーゼの機能的断片のアミノ酸配列の一例を、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８に示す。本開示における改変型ルシフェラーゼの機能的断片は、一又は複数の実施形態において、下記（ｄ）～（ｆ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列において、５番目のアルギニン又はリジン及び１４０番目のバリンの少なくとも一方に変異が導入された、下記（ｄ）～（ｆ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有する。
　（ｄ）配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８に記載のアミノ酸配列。
　（ｅ）配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、５番目のアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１４０番目のアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列。同一性は、一又は複数の実施形態において、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上である。
　（ｆ）配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８に記載のアミノ酸配列に対して、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列であって、５番目のアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１４０番目のアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列。置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸の個数は、一又は複数の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１個である。
　配列番号２０は、Mycena chlorophosのルシフェラーゼの機能的断片の一例であって、配列番号１の２２番目～２４２番目のアミノ酸配列に相当する。
　配列番号２１は、Neonothopanus nambiのルシフェラーゼの機能的断片の一例であって、配列番号３の３６番目～２５６番目のアミノ酸配列に相当する。
　配列番号２２は、Armillaria gallicaのルシフェラーゼの機能的断片の一例であって、配列番号５の３８番目～２５８番目のアミノ酸配列に相当する。
　配列番号２３は、Armillaria melleaのルシフェラーゼの機能的断片の一例であって、配列番号７の３８番目～２５８番目のアミノ酸配列に相当する。
　配列番号２４は、Armillaria ostoyaeのルシフェラーゼの機能的断片の一例であって、配列番号９の３８番目～２５８番目のアミノ酸配列に相当する。
　配列番号２５は、Mycena citricolorのルシフェラーゼの機能的断片の一例であって、配列番号１１の２３番目～２４１番目のアミノ酸配列に相当する。
　配列番号２６は、Neonothopanus gardneriのルシフェラーゼの機能的断片の一例であって、配列番号１３の３２番目～２５２番目のアミノ酸配列に相当する。
　配列番号２７は、Omphalotus oleariusのルシフェラーゼの機能的断片の一例であって、配列番号１５の２５番目～２４５番目のアミノ酸配列に相当する。
　配列番号２８は、Panellus stipticusのルシフェラーゼの機能的断片の一例であって、配列番号１７の２１番目～２４１番目のアミノ酸配列に相当する。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、発光基質（ルシフェリン）の酸化反応により、検出可能な光を放出することができる。本開示の改変型ルシフェラーゼの発光基質としては、一又は複数の実施形態において、下記構造を有する３－ヒドロキシヒスピジンが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　その他の発光基質としては、一又は複数の実施形態において、下記構造を有する化合物（(E)-6-(4-diethylamino)styryl)-3,4-dihydroxy-2H-pyran-2-one、(E)-3,4-dihydroxy-6-(4-hydroxystyryl)-2H-pyran-2-one、(E)-6-(2-1H-indol-3-yl)vinyl)-3,4-dihydroxy-2H-pyran-2-one、及び(E)-6-(2-(1,2,3,5,6,7-hexahydropyrido[3,2,1-ij]quinoline-9-yl)vinyl)-3,4-dihydroxy-2H-pyran-2-one）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、セレンテラジンを発光基質としてもよい。セレンテラジンとしては、一又は複数の実施形態において、米国出願第１２／０５６０７３号（段落［００８６］）で開示されるもの、例えば、セレンテラジン－ｎ、セレンテラジン－ｆ、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈｃｐ、セレンテラジン－ｃｐ、セレンテラジン－ｃ、セレンテラジン－ｅ、セレンテラジン－ｆｃｐ、ビス－デオキシセレンテラジン（「セレンテラジン－ｈｈ」）、セレンテラジン－ｉ、セレンテラジン－ｉｃｐ、セレンテラジン－ｖ、及び２－メチルセレンテラジンが含まれうる。また、「セレンテラジン」としては、その他の一又は複数の実施形態において、ＷＯ２０１２／０６１５２９で開示されるものが含まれうる。米国出願第１２／０５６０７３号及びＷＯ２０１２／０６１５２９の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、化学合成により合成されてもよい。
　［融合タンパク質］
　本開示の改変型ルシフェラーゼは、一又は複数の実施形態において、Ｎ末端及び／又はＣ末端に付加的なアミノ酸を有する融合タンパク質又は融合ポリペプチドであってもよい。本開示は、一態様において、本開示の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片と、その他のタンパク質とを融合させて得られる融合タンパク質に関する。融合させるその他のタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、蛍光物質、及び抗体等が挙げられる。本開示の融合タンパク質は、一又は複数の実施形態において、蛍光ポリペプチドと融合させた融合タンパク質等が挙げられる。
　本開示の融合タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、本開示の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片と蛍光タンパク質とが、該改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片から、前記蛍光タンパク質へ共鳴エネルギー移動が可能なように、リンカー配列を介して連結されている融合タンパク質が挙げられる。共鳴エネルギー移動としては、生物発光共鳴エネルギー移動（bioluminescence resonance energy transfer：BRET）が挙げられる。本開示の融合タンパク質は、特に限定されない一又は複数の実施形態において、融合タンパク質のＮ末端側に本開示の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片、Ｃ末端側に蛍光物質を有していてもよい。
　本開示の融合タンパク質は、一又は複数の実施形態において、化学合成により合成されてもよいし、遺伝子組み換え技術により作製されてもよい。
　［単離核酸（核酸分子）］
　本開示は、一態様において、本開示の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片をコードする単離核酸に関する。
　本開示の核酸は、一又は複数の実施形態において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン、及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入され、該変異が導入されていない若しくは導入前の発光キノコのルシフェラーゼ又は発光キノコ由来の野生型ルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片をコードする。
　本開示の核酸は、一又は複数の実施形態において、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入された、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその機能的断片をコードする単離核酸に関する。
  （ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載の発光キノコ由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列。
　（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列。同一性は、一又は複数の実施形態において、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上である。
　（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列。置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸の個数は、一又は複数の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１個である。
　本開示の核酸は、一又は複数の実施形態において、下記（ｄ）～（ｆ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列において、５番目のアルギニン又はリジン及び１４０番目のバリンの少なくとも一方に変異が導入された、下記（ｄ）～（ｆ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有する、本開示における改変型ルシフェラーゼの機能的断片をコードする単離核酸に関する。
　（ｄ）配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８に記載のアミノ酸配列。
　（ｅ）配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、５番目のアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１４０番目のアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列。同一性は、一又は複数の実施形態において、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上である。
　（ｆ）配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８に記載のアミノ酸配列に対して、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列であって、５番目のアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１４０番目のアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列。置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸の個数は、一又は複数の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１個である。
　本開示の核酸は、一又は複数の実施形態において、Mycena chlorophosのルシフェラーゼ（配列番号１）、Neonothopanus nambiのルシフェラーゼ（配列番号３）、Armillaria gallicaのルシフェラーゼ（配列番号５）、Armillaria melleaのルシフェラーゼ（配列番号７）、Armillaria ostoyaeのルシフェラーゼ（配列番号９）、Omphalotus oleariusのルシフェラーゼ（配列番号１１）、Panellus stipticusのルシフェラーゼ（配列番号１３）、Mycena citricolorのルシフェラーゼ（配列番号１５）、Neonothopanus gardneriのルシフェラーゼ（配列番号１７）において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入された、改変型ルシフェラーゼをコードする。
　本開示の核酸は、さらに強い発光強度を得る点から、一又は複数の実施形態において、Mycena chlorophosのルシフェラーゼ（配列番号１）、Neonothopanus nambiのルシフェラーゼ（配列番号３）、Armillaria gallicaのルシフェラーゼ（配列番号５）、Armillaria melleaのルシフェラーゼ（配列番号７）、Armillaria ostoyaeのルシフェラーゼ（配列番号９）、Omphalotus oleariusのルシフェラーゼ（配列番号１１）、Panellus stipticusのルシフェラーゼ（配列番号１３）、Mycena citricolorのルシフェラーゼ（配列番号１５）、及びNeonothopanus gardneriのルシフェラーゼ（配列番号１７）において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジンと１６１番目に相当するバリンとの双方に変異が導入された、改変型ルシフェラーゼをコードする。
　配列番号１に示されるルシフェラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列としては、一又は複数の実施形態において、配列番号２に示される塩基配列が挙げられる。配列番号３に示されるルシフェラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列としては、一又は複数の実施形態において、配列番号４に示される塩基配列が挙げられる。配列番号５に示されるルシフェラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列としては、一又は複数の実施形態において、配列番号６に示される塩基配列が挙げられる。配列番号７に示されるルシフェラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列としては、一又は複数の実施形態において、配列番号８に示される塩基配列が挙げられる。配列番号９に示されるルシフェラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列としては、一又は複数の実施形態において、配列番号１０に示される塩基配列が挙げられる。配列番号１１に示されるルシフェラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列としては、一又は複数の実施形態において、配列番号１２に示される塩基配列が挙げられる。配列番号１３に示されるルシフェラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列としては、一又は複数の実施形態において、配列番号１４に示される塩基配列が挙げられる。配列番号１５に示されるルシフェラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列としては、一又は複数の実施形態において、配列番号１６に示される塩基配列が挙げられる。配列番号１７に示されるルシフェラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列としては、一又は複数の実施形態において、配列番号１８に示される塩基配列が挙げられる。
　特に限定されない一又は複数の実施形態において、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に示される塩基配列に変異を導入することによって、本開示の改変型ルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸を容易に得ることができる。
　本開示の核酸は、一又は複数の実施形態において、配列番号１９又は２９に記載のアミノ酸配列における５番目のアルギニン又はリジン及び１４０番目のバリンの少なくとも一方に変異が導入された、配列番号１９又は２９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその機能的断片をコードする単離核酸に関する。
　本開示の核酸は、一又は複数の実施形態において、本開示の融合タンパク質をコードする核酸を含みうる。
　［発現カセット］
　本開示は、一態様において、本開示の改変型ルシフェラーゼ若しくは本開示の融合タンパク質を得るため、又は本開示の核酸を複製するために用いられる発現カセットに関する。発現カセットは、一又は複数の実施形態において、染色体外エレメントとして存在していてもよいし、該発現カセットを細胞に導入することで、細胞のゲノムに組み込まれうる。
　よって、本開示の発現カセットは、一又は複数の実施形態において、宿主細胞における核酸の発現に必要な調節エレメントの制御下にある、本開示の核酸を含む発現カセットであって、細胞ゲノムに組み込まれているか、又は染色体外エレメントの形態で前記細胞に導入されている、本開示の核酸によってコードされるルシフェラーゼの発現をもたらすことができる発現カセットに関する。
　［形質転換体］
　本開示の核酸及び発現カセットは、一又は複数の実施形態において、形質転換体の作製に使用することができる。本開示の形質転換体は、一又は複数の実施形態において、遺伝子導入により導入された本開示の核酸を含む。
　形質転換体を得る方法は、既に報告され確立された方法を適宜利用できる。形質転換体を得る方法としては、一又は複数の実施形態において、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ－リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。
　アグロバクテリウム法には、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、及び植物体そのものを用いる場合（ｉｎ　ｐｌａｎｔａ法）がある。プロトプラストを用いる場合は、Ｔｉプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルスに感染させる等により行うことができる。また種子或いは植物体を用いるｉｎ　ｐｌａｎｔａ法を適用する場合、すなわち植物ホルモン添加の組織培養を介さない系では、吸水種子、幼植物（幼苗）、鉢植え植物などへのアグロバクテリウムの直接処理等にて実施可能である。
　本開示は、一態様において、本開示の核酸によってコードされるルシフェラーゼを産生する細胞に関する。当該細胞は、宿主細胞における核酸の発現に必要な調節エレメントの制御下にある、本開示の核酸を含む発現カセットを含み、前記発現カセットは、細胞ゲノムに組み込まれているか、又は染色体外エレメントの形態で前記細胞に導入されており、前記染色体外エレメント又は前記細胞ゲノムに組み込まれたエレメントの形態で、本開示の核酸によってコードされるルシフェラーゼの発現をもたらすことができる細胞に関する。
　宿主としては、一又は複数の実施形態において、原核細胞及び真核細胞を用いることができる。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、植物、昆虫細胞、及びヒト以外の脊椎動物細胞等が挙げられる。植物としては、シロイヌナズナ、ベンサミアナタバコ、及びヒメツリガネゴケ等が挙げられる。
　［トランスジェニック生物］
　本開示は、一態様において、本開示の核酸を含む、トランスジェニック生物に関する。トランスジェニック生物としては、一又は複数の実施形態において、トランスジェニック植物及びトランスジェニック動物が挙げられる。
　トランスジェニック植物としては、一又は複数の実施形態において、シロイヌナズナ、ベンサミアナタバコ、ヒメツリガネゴケ、ミナトカモジグサ、イネ、コムギ及びオオムギ等の植物のトランスジェニックが挙げられる。トランスジェニック動物としては、一又は複数の実施形態において、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット及びブタ等のヒト以外の動物のトランスジェニックが挙げられる。
　本開示のトランスジェニック生物は、一又は複数の実施形態において、本開示の核酸、本開示の改変型ルシフェラーゼ、本開示の発現カセット又は本開示のベクターを対象（生物）に導入することにより作製できる。トランスジェニック生物を作製する方法は、一又は複数の実施形態において、トランスジェニック生物の種類に応じて適宜決定できる。トランスジェニック植物の作製方法としては、一又は複数の実施形態において、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ－リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、及びマイクロインジェクション法等が挙げられる。トランスジェニック動物の作製方法としては、一又は複数の実施形態において、本開示の核酸を生物から採取した受精卵に導入すること、及び、生体外において、レトロウイルス等のウイルスベクターを、ドナー生物に由来する初期発生肺の細胞に感染させること等が挙げられる。
　本開示のトランスジェニック生物は、一又は複数の実施形態において、３－ヒドロキシヒスピジン等の発光基質の生合成サイクルを構成する遺伝子群がさらに導入されていてもよい。本態様のトランスジェニック生物によれば、一又は複数の実施形態において、イメージングを行う自律的発光イメージング（自発光イメージング）を行うことができる。
　［キット］
　本開示は、一態様において、本開示の改変型ルシフェラーゼ、本開示の改変型ルシフェラーゼをコードする核酸、本開示の発現カセット、及び／又は本開示の融合タンパク質を含むキットに関する。本開示のキットは、一又は複数の実施形態において、本開示の改変型ルシフェラーゼの発光基質（ルシフェリン）をさらに含みうる。発光基質（ルシフェリン）としては、上記のとおりである。
　キットの構成成分は、一又は複数の実施形態において、容器に内包されていてもよい。キットの構成成分は、一又は複数の実施形態において、乾燥状態で保存されていてもよいし、緩衝液等の媒体中に保存されていてもよい。
　本開示のキットは、一又は複数の実施形態において、各構成成分を使用するための使用説明書を備えていてもよい。
　［用途］
　本開示の改変型ルシフェラーゼ、融合タンパク質、核酸、発現カセット及びキットは、医学及び生物工学等の様々な分野で用いることができる。用途としては、一又は複数の実施形態において、自発光系イメージングが挙げられる。その他の用途としては、一又は複数の実施形態において、細胞内の機能の解析や、診断、品質管理、及び環境試験等が挙げられる。さらにその他の用途としては、一又は複数の実施形態において、イルミネーション等の光源として利用できる生物発光トランスジェニック植物の作製等が挙げられる。
　本開示は、その他の態様として、本開示の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片を発現する方法に関する。本態様の方法は、一又は複数の実施形態において、本開示の核酸を、細胞又は植物に導入すること、及び導入した細胞又は植物において、発光基質の酸化反応を生じさせることを含む。
　本開示は、その他の態様において、生物発光を生成する方法に関する。本態様の方法は、一又は複数の実施形態において、本開示の核酸を有するトランスジェニック植物が配置された培地又は土壌に、発光基質を添加することを含む。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の核酸を有し、かつ、発光基質の生合成サイクルを構成する遺伝子群を有する、トランスジェニック植物の使用に関する。
　本開示はさらに以下の限定されない一又は複数の実施形態に関する。
［１］　発光キノコ由来の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片であって、
　配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン、及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入され、前記変異導入前のルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片。
［２］　前記改変型ルシフェラーゼは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列：FPXXXXDYXTFLXXGPSYAPQNXXGYXIVXVLXLFRXEXXXXXIYXXXPEKRXWLXXLPXRXGXRPXXTSHIIQRQXXQXXDXXFXXXXLXXXXIXRXQXRHXXXTXXXXSXFEFHAXAIFXXXXXXXXXPXXXPXXXTVRRTKXEIAHMHDYHDXTXHLALAAXDXKXVXXKGWGQRHPLAGPGXPGPPXEWTFXYAPRXEXEXXVXEXIXEAXXXYMXN、又は配列番号２９に記載のアミノ酸配列：FPXXXXDYXTFLXXGPSYAPQNXXGYXIVXVLXLFRXEXXXXXIYXXXPEKRXWLXXLPXRXGXRPXXTSHIIQRQXXQXXDXXFXXXXLXXXXIXRXQXRHXXXTXXXXSXFEFHAXAIFXXXXXXXXXPXXXPXXXTVRRTKXEIAHMHDYHDXTXHLALAAXDXKXVXXKGWGQRHPLAGPGXPGPPXEWTFXYAPRXEXEXXVXEXIXEAXXXYMXNを有する発光キノコのルシフェラーゼを改変した改変体である、［１］記載の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片。
［３］　［１］又は［２］に記載の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片をコードする単離核酸。
［４］　下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入された、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有する改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片をコードする単離核酸。
　（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載の発光キノコ由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列；
　（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列；
　（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列。
［５］　前記改変型ルシフェラーゼは、上記変異が導入される前のルシフェラーゼと比較して、増強された発光を有する、［３］又は［４］に記載の単離核酸。
［６］　宿主細胞における核酸の発現に必要な調節エレメントの制御下にある、［３］から［５］のいずれかに記載の核酸を含む発現カセットであって、
　細胞ゲノムに組み込まれているか、又は染色体外エレメントの形態で前記細胞に導入されている、
　［３］から［５］のいずれかに記載の核酸によってコードされるルシフェラーゼの発現をもたらすことができる発現カセット。
［７］　［３］から［５］のいずれかに記載の核酸によってコードされるルシフェラーゼを産生する細胞であって、
　宿主細胞における核酸の発現に必要な調節エレメントの制御下にある、［３］から［５］のいずれかに記載の核酸を含む発現カセットを含み、
　　前記発現カセットは、細胞ゲノムに組み込まれているか、又は染色体外エレメントの形態で前記細胞に導入されており、
　前記染色体外エレメント又は前記細胞ゲノムに組み込まれたエレメントの形態で、［３］から［５］のいずれかに記載の核酸によってコードされるルシフェラーゼの発現をもたらすことができる、細胞。
［８］　下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入された、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有する改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片。
　（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載の発光キノコ由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列；
　（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列；
　（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列。
［９］　前記改変型ルシフェラーゼは、上記変異が導入される前のルシフェラーゼと比較して、増強された発光を有する、［８］記載の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片。
［１０］　［１］、［２］、［８］又は［９］に記載の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片と、その他のタンパク質とを融合させて得られる融合タンパク質。
［１１］　［１］、［２］、［８］又は［９］に記載の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片と蛍光タンパク質とが、前記改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片から、前記蛍光タンパク質へ共鳴エネルギー移動が可能なように、リンカー配列を介して連結されている、融合タンパク質。
［１２］　［１０］又は［１１］に記載の融合タンパク質をコードする単離核酸。
［１３］　下記（１）～（６）からなる群から選択される少なくとも一つと、［１］、［２］、［８］又は［９］に記載の改変型ルシフェラーゼの発光基質とを含むキット。
　（１）［３］から［５］及び［１２］のいずれかに記載の単離核酸；
　（２）［１］、［２］、［８］又は［９］に記載の単離ルシフェラーゼ又はその機能的断片；
　（３）［３］から［５］及び［１２］のいずれかに記載の核酸を含む発現カセット；
　（４）［６］に記載の発現カセット；
　（５）［１］、［２］、［８］又は［９］に記載の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片とその他のタンパク質とを融合させて得られる融合タンパク質；
　（６）［１０］又は［１１］に記載の融合タンパク質。
　［１４］　前記発光基質は、３－ヒドロキシヒスピジン、(E)-6-(4-diethylamino)styryl)-3,4-dihydroxy-2H-pyran-2-one、(E)-3,4-dihydroxy-6-(4-hydroxystyryl)-2H-pyran-2-one、(E)-6-(2-1H-indol-3-yl)vinyl)-3,4-dihydroxy-2H-pyran-2-one、(E)-6-(2-(1,2,3,5,6,7-hexahydropyrido[3,2,1-ij]quinoline-9-yl)vinyl)-3,4-dihydroxy-2H-pyran-2-one）、セレンテラジン－ｎ、セレンテラジン－ｆ、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈｃｐ、セレンテラジン－ｃｐ、セレンテラジン－ｃ、セレンテラジン－ｅ、セレンテラジン－ｆｃｐ、ビス－デオキシセレンテラジン（「セレンテラジン－ｈｈ」）、セレンテラジン－ｉ、セレンテラジン－ｉｃｐ、セレンテラジン－ｖ、及び２－メチルセレンテラジンからなる群から選択される、［１３］記載のキット。
　［１５］　［３］から［５］及び［１２］のいずれかに記載の単離核酸を含む、トランスジェニック生物。
　以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
　［実施例１：変異型ルシフェラーゼの作製１］
　Mycena chlorophosのルシフェラーゼの遺伝子配列（配列番号２）全長に対してランダム変異を誘発して変異体ｃＤＮＡライブラリを作製した。該遺伝子を含むプラスミドを形質転換した大腸菌（ＪＭ１０９（ＤＥ３））を１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有のＬＢ寒天培地上で培養（３７℃／１６時間）して目的のタンパク質を発現させ、３－ヒドロキシヒスピジン添加条件にて、発光画像を取得して大腸菌コロニーをスクリーニングした。
　その結果、大腸菌コロニー上で、野生型よりも高い発現強度を示す下記の変異体を得た。その結果の一例を図１に示す。下記の変異箇所は、Mycena chlorophosのルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）におけるアミノ酸の位置である。
　　ｍｃ変異体１（変異：Ｒ２６Ｌ）
　　ｍｃ変異体２（変異：Ｖ１６１Ａ）
　　ｍｃ変異体３（変異：Ｒ２６Ｌ　Ｖ１６１Ａ）
　大腸菌コロニーのスクリーニングにおける発光強度の測定は、以下の手順で行った。目的タンパク質を発現するプラスミドを形質転換した大腸菌（ＪＭ１０９（ＤＥ３））を１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有のＬＢ寒天培地上で培養（３７℃／１６時間）した。スクリーニングと同様にメンブレンを用い、レプリカを作製した後、ＩＰＴＧを含有する培地上でタンパク質を発現させた。メンブレンをバッファー（ＰＢＳ　ｐＨ８．０）５ｍＬに浸した後、メンブレンを空の１０ｃｍディッシュに移し、１０μＭ ３－ヒドロキシヒスピジン溶液（１０μＭ ３－ヒドロキシヒスピジン，ＰＢＳ　ｐＨ８．０）５ｍＬを加えた。これをＬＡＳ３０００（Fujifilm）で撮影した（観察条件：感度：Ｈｉｇｈ、露光時間：５分間）。得られた発光画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、バックグラウンドノイズを取り除いた後、同一画像を複製した。一方の画像に対してはＴｈｒｅｓｈｏｌｄを用いて、シグナルを規格化し、自動で蛍光発光強度を調べる領域（ＲＯＩ：Region Of Interest）を設定した。他方の画像（複製した画像）において、設定したＲＯＩのそれぞれのシグナルを測定した。Thresholdには、野生型のmcLuz（Mycena chlorophosのルシフェラーゼ）を使用した。その結果を図１に示す。
　図１は、野生型、並びｍｃ変異体１及び３についての大腸菌コロニーでの規格化発光強度を示す。ｍｃ変異体１は野生型に比べて発光強度が１．５倍以上高く、ｍｃ変異体３は野生型に比べて発光強度が４倍以上高くなった。また、Ｖ１６１Ａの変異は、Ｒ２６Ｌの変異と共同して発光強度変化をもたらすことが分かった。
　［実施例２：種々のルシフェラーゼのアミノ酸配列のマルチプルアラインメント］
　実施例１における変異位置が、その他の発光キノコのルシフェラーゼにおいても、発光強度に影響を与えるのかを調べるために、すでに同定されている９種類の発光キノコのルシフェラーゼのアミノ酸配列マルチプルアラインメントを、ＧＥＮＥＴＹＸ　ｖｅｒ１２（ＧＥＮＥＴＹＸ）を用いて行った。
　９種類のＬｕｚ（ルシフェラーゼ）のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を用いて取得した。その結果を図２に示す。それぞれのＧｅｎＢａｎｋ　ＩＤは、Mycena chlorophosのルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＢＨ４３５０７．１、配列番号１）、Neonothopanus nambiのルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＢＨ４３５０９．１、配列番号３）、Armillaria gallicaのルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＢＨ４３５０３．１、配列番号５）、Armillaria melleaのルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＢＨ４３５０４．１、配列番号７）、Armillaria ostoyaeのルシフェラーゼｚ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＢＨ４３５０５．１、配列番号９）、Mycena citricolorのルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＢＨ４３５０６．１、配列番号１１）、Neonothopanus gardneriのルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＢＨ４３５０８．１、配列番号１３）、Omphalotus oleariusのルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＢＨ４３５１０．１、配列番号１５）、Panellus stipticusのルシフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＢＨ４３５１３．１、配列番号１７）である。
　上記の９種類の発光キノコのルシフェラーゼにおいて、実施例１で変異させたMycena chlorophosのルシフェラーゼの２６番目のアルギニンは９種類のうち８種類で保存されており、同１６１番目のバリンは９種類すべてで保存されていた。
　［実施例３：変異型ルシフェラーゼの作製２］
　実施例２のアライメントの結果、Mycena chlorophosのルシフェラーゼの２６番目のアルギニン及び１６１番目のバリンは、それぞれ、Neonothopanus nambiのルシフェラーゼの４０番目のアルギニン及び１７５番目のバリンに対応することが予測された。この結果に基づき、実施例１と同様にして、Neonothopanus nambiのルシフェラーゼ（配列番号４）における４０番目のアルギニン及び１７５番目のバリンを変異させた下記の変異体を作製した。その結果の一例を図３に示す。下記の変異箇所は、Neonothopanus nambiのルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号３）における位置である。
　　ｎｎ変異体１（変異：Ｒ４０Ｉ）
　　ｎｎ変異体２（変異：Ｒ４０Ｉ　Ｖ１７５Ｓ）
　　ｎｎ変異体３（変異：Ｒ４０Ｑ）
　　ｎｎ変異体４（変異：Ｒ４０Ｑ　Ｖ１７５Ａ）
　　ｎｎ変異体５（変異：Ｒ４０Ｑ　Ｖ１７５Ｇ）
　図３は、野生型、並びにｎｎ変異体１～５についての大腸菌コロニーでの規格化発光強度を示す。いずれの変異体も、野生型に比べて発光強度が１．５倍程度以上高くなった。
配列

配列番号１
Mycena chlorophos_amino acid sequence
Genbank ID: BBH43507
MVQLTRTSGFIAAAAIVAAIAFPFIRRDYQTFLRGGPSYAPQNIRGYIIVLVLSLFRGEEKGLAIYEPLPEKRTWLPELPRRAGDRPKTTSHIIQRQLDQYPDPDFVLKALKATVIPRVQARHTDKTHLALSKFEFHAEAIFVRPEIAIDDPKHIPSHDTVRRTKREIAHMHDYHDCTLHLALAAQDAKQVLQKGWGQRHPLAGPGMPGPPTEWTFLYAPRTEEEVKVVETIVEASIAYMTNAEKPVELVQ

配列番号２
Mycena chlorophos_nucleotide sequence
Genbank ID: LC435377
ATGGTCCAACTCACCCGAACCTCCGGATTCATCGCCGCTGCGGCCATTGTTGCTGCCATCGCCTTCCCGTTCATTCGTCGAGACTACCAGACGTTCCTTCGTGGTGGGCCGTCCTATGCCCCACAGAACATCCGCGGCTATATCATCGTCCTGGTTCTGTCCCTCTTCCGCGGCGAGGAGAAGGGTCTTGCAATCTACGAGCCCCTTCCTGAGAAGCGCACATGGCTGCCGGAGCTTCCGCGGCGCGCGGGAGACCGGCCCAAGACGACGAGCCACATCATCCAACGGCAGCTCGACCAGTACCCCGACCCGGACTTTGTCCTCAAAGCCCTGAAAGCGACGGTCATCCCGCGTGTCCAAGCCCGGCACACAGACAAGACTCACCTCGCGCTGTCCAAGTTCGAGTTCCATGCTGAGGCCATCTTCGTGCGCCCGGAAATCGCCATCGACGACCCGAAGCATATCCCCAGCCACGACACGGTGCGACGGACGAAGCGCGAGATTGCGCACATGCACGACTATCACGACTGCACGCTGCATTTGGCGCTAGCGGCGCAGGACGCGAAGCAGGTGCTGCAGAAGGGCTGGGGCCAGCGCCATCCGCTGGCAGGGCCTGGGATGCCCGGGCCGCCCACGGAGTGGACGTTCTTGTATGCCCCGAGGACCGAGGAGGAAGTGAAGGTTGTGGAGACCATTGTCGAGGCCTCTATCGCGTACATGACGAACGCGGAGAAGCCGGTCGAGCTGGTGCAG

配列番号３
Neonothopanus namb_amino acid sequence
Genbank ID:
MRINISLSSLFERLSKLSSRSIAITCGVVLASAIAFPIIRRDYQTFLEVGPSYAPQNFRGYIIVCVLSLFRQEQKGLAIYDRLPEKRRWLADLPFREGTRPSITSHIIQRQRTQLVDQEFATRELIDKVIPRVQARHTDKTFLSTSKFEFHAKAIFLLPSIPINDPLNIPSHDTVRRTKREIAHMHDYHDCTLHLALAAQDGKEVLKKGWGQRHPLAGPGVPGPPTEWTFLYAPRNEEEARVVEMIVEASIGYMTNDPAGKIVENAK

配列番号４
Neonothopanus namb_nucleotide sequence
Genbank ID: LC435379
ATGCGCATTAACATTAGCCTCTCGTCTCTCTTCGAACGTCTCTCCAAACTTAGCAGTCGCAGCATAGCGATTACATGTGGAGTTGTTCTCGCCTCCGCAATCGCCTTTCCCATCATCCGCAGAGACTACCAGACTTTCCTAGAAGTGGGACCCTCGTACGCTCCGCAGAACTTTAGAGGATACATCATCGTCTGTGTCCTCTCGCTATTCCGCCAAGAGCAGAAAGGGCTCGCCATCTATGATCGTCTTCCCGAGAAACGCAGGTGGTTGGCCGACCTTCCCTTTCGTGAAGGAACCAGACCCAGCATTACCAGCCATATCATTCAGCGACAGCGCACTCAACTGGTCGATCAGGAGTTTGCCACCAGGGAGCTCATAGACAAGGTCATCCCTCGCGTGCAAGCACGACACACCGACAAAACGTTCCTCAGCACATCAAAGTTCGAGTTTCATGCGAAGGCCATATTTCTCTTGCCTTCTATCCCAATCAACGACCCTCTGAATATCCCTAGCCACGACACTGTCCGCCGAACGAAGCGCGAGATTGCACATATGCATGATTATCATGATTGCACACTTCATCTTGCTCTCGCTGCGCAGGATGGAAAGGAGGTGCTGAAGAAAGGTTGGGGACAACGACATCCTTTGGCTGGTCCTGGAGTTCCTGGTCCACCAACGGAATGGACTTTTCTTTATGCGCCTCGCAACGAAGAAGAGGCTCGAGTAGTGGAGATGATCGTTGAGGCTTCCATAGGGTATATGACGAACGATCCTGCAGGAAAGATTGTAGAAAACGCCAAG

配列番号５
Armillaria gallica_amino acid sequence
Genbank ID: PBL02715
MSFIDSMKLDLVGHLFGIRNRGLAAACCALAVASTIAFPYIRRDYQTFLSGGPSYAPQNIRGYFIVCVLALFRQEQKGLAIYDRLPEKRRWLPDLPPRNGPRPITTSHIIQRQRNQAPDPKFALEELKATVIPRVQARHTDLTHLSLSKFEFHAEAIFLLPSVPIDDPKNVPSHDTVRRTKREIAHMHDYHDFTLHLALAAQDGKEVVSKGWGQRHPLAGPGVPGPPTEWTFIYAPRNEEELAVVEMIIEASIGYMTNDPAGVVIA

配列番号６
Armillaria gallica_nucleotide sequence
Genbank ID: LC435373
ATGTCCTTCATCGACAGCATGAAACTTGACCTCGTCGGACACCTCTTTGGCATCAGGAATCGCGGCTTAGCCGCCGCTTGTTGTGCTCTAGCAGTCGCCTCTACTATCGCCTTCCCTTACATTCGTAGGGACTACCAGACATTTTTATCTGGCGGTCCCTCTTACGCTCCCCAGAATATCAGAGGATATTTCATCGTCTGCGTTCTGGCCTTGTTCCGTCAGGAGCAAAAGGGCCTTGCGATATATGATCGCCTTCCCGAGAAGCGCAGGTGGCTGCCTGACTTGCCTCCTCGCAATGGCCCGCGGCCGATCACGACCAGCCATATAATCCAAAGACAGCGCAACCAGGCGCCGGACCCCAAGTTCGCCCTCGAGGAACTCAAGGCCACGGTTATTCCACGGGTGCAGGCTCGCCATACTGACCTCACCCATCTCAGCCTATCCAAATTCGAGTTCCATGCTGAAGCAATTTTCCTGCTCCCCTCTGTACCCATCGATGATCCAAAAAATGTTCCAAGTCACGACACGGTGCGCAGGACGAAAAGGGAGATCGCGCATATGCACGACTACCATGACTTCACGCTGCATCTTGCACTGGCCGCCCAAGACGGGAAGGAAGTCGTGTCGAAGGGATGGGGGCAGCGACACCCCCTAGCAGGCCCTGGCGTTCCTGGTCCACCTACGGAGTGGACATTTATTTATGCGCCACGTAACGAAGAGGAACTGGCAGTGGTGGAAATGATTATCGAGGCATCAATAGGCTATATGACCAATGACCCTGCTGGAGTAGTTATCGCA

配列番号７
Armillaria mellea_amino acid sequence
Genbank ID: BBH43504
MSFFDSVKLDLVGRLFGIRNRGLAVTCCAVAVASIIAFPYIRRDYQTFLSGGPSYAPQNIRGYLIVCVLALFRQEQKGLAIYDRLPEKRRWLPDLPPRDGPRPITTSHIIQRQRNQAPDLKFALEELKATVIPRVQARHTDLTHLSLSKFEFHAEAIFLLPSVPIDDPKNVPSHDTVRRTKREIAHMHDYHDYTLHLALAAQDGKEVVSKGWGQRHPLAGPGVPGPPTEWTFIYAPRNEEELAVVEMIIEASIGYMTNDPAGKTIA

配列番号８
Armillaria mellea_nucleotide sequence
Genbank ID: LC435374
ATGTCCTTCTTCGACAGCGTGAAACTTGACCTCGTCGGACGCCTCTTTGGCATCAGGAATCGCGGCTTAGCTGTTACTTGTTGTGCTGTGGCAGTCGCCTCTATCATCGCGTTCCCTTACATTCGTAGGGACTACCAGACATTTTTATCTGGGGGTCCCTCCTACGCTCCCCAGAACATCAGAGGATACCTCATTGTCTGCGTCCTGGCCTTGTTCCGTCAGGAGCAAAAAGGCCTTGCGATATACGACCGCCTTCCCGAGAAGCGCAGGTGGCTACCTGACTTGCCTCCTCGCGATGGCCCACGGCCCATCACGACCAGCCATATAATCCAAAGACAGCGCAACCAGGCGCCGGACCTCAAGTTCGCCCTCGAGGAACTCAAGGCCACGGTCATTCCACGGGTGCAGGCTCGCCACACTGACCTCACCCATCTCAGCCTATCCAAGTTCGAGTTCCATGCTGAAGCAATCTTCCTGCTCCCCTCTGTACCCATCGATGATCCAAAGAATGTGCCAAGTCACGACACGGTGCGCAGGACGAAGAGGGAAATTGCGCATATGCACGACTACCATGACTACACGCTGCATCTTGCGTTGGCCGCCCAAGACGGGAAGGAAGTCGTATCAAAGGGATGGGGGCAGCGACACCCGCTGGCAGGCCCTGGCGTTCCTGGTCCACCGACGGAGTGGACGTTTATTTATGCGCCACGTAACGAAGAGGAGCTGGCAGTGGTGGAAATGATTATCGAGGCATCGATAGGCTATATGACCAATGACCCTGCAGGAAAAACTATCGCA

配列番号９
Armillaria ostoyae_amino acid sequence
Genbank ID: BBH43505
MSFIDSMKLDFVGHLFGIRNRGLATACCAVAVASAIAFPYIRRDYQTFLSGGPSYAPQNIKGYLIVCVLALFRQEQKGLAIYDRLPEKRRWLPDLPPRNGPRPITTSHIIQRQRNQAPDSKFALEELKATVIPRVQARHTDLTHLSLSKFEFHAEAIFLLPSVPIDDPKNVPSHDTVRRTKREIAHMHDYHDFTLHLALAAQDGKEVVAKGWGQRHPLAGPGVPGPPTEWTFIYAPRNEEELAVVEMIIEASIGYMTNDPAGTVIV

配列番号１０
Armillaria ostoyae_nucleotide sequence
Genbank ID: LC435375
ATGTCCTTCATCGACAGCATGAAACTTGACTTCGTCGGACACCTCTTTGGCATCAGGAATCGCGGCTTAGCCACCGCTTGTTGTGCTGTGGCAGTCGCTTCTGCCATCGCCTTCCCTTACATTCGTAGGGACTACCAGACATTCTTATCTGGCGGTCCCTCTTACGCTCCCCAGAACATCAAAGGATATCTCATCGTCTGCGTCCTGGCCTTGTTCCGTCAGGAGCAAAAGGGCCTTGCGATATATGACCGCCTTCCCGAGAAGCGCAGGTGGCTACCTGACTTGCCTCCTCGCAATGGCCCGCGGCCCATCACGACCAGCCATATAATCCAAAGACAGCGCAACCAGGCGCCAGACTCCAAGTTCGCCCTCGAGGAACTCAAGGCTACGGTCATTCCACGGGTGCAGGCTCGCCACACTGACCTCACCCATCTCAGCCTATCCAAGTTCGAGTTCCATGCTGAAGCAATCTTCCTGCTCCCCTCTGTACCCATCGATGATCCAAAAAATGTTCCAAGTCATGACACGGTGCGCAGGACGAAGAGGGAGATCGCGCATATGCACGACTACCATGACTTTACGTTGCATCTTGCACTGGCCGCCCAAGACGGGAAGGAAGTCGTGGCGAAGGGATGGGGGCAGCGACACCCGCTGGCAGGCCCTGGCGTTCCTGGTCCACCTACGGAGTGGACGTTTATTTATGCGCCACGTAACGAAGAGGAACTGGCAGTGGTGGAAATGATTATCGAGGCATCAATAGGCTATATGACCAATGACCCTGCTGGAACAGTTATCGTA

配列番号１１
Mycena citricolor_amino acid sequence
Genbank ID: BBH43506
MAYQLTWIQTLVLGALVAMAVAFPFIKKDYETFLKGGPSYAPQNVRGYIIVLVLALFRQEQLGLEIYDRMPEKRRWLANLPQREGPRPKTTSHIIQRQLSQHTDPAFGAAYLKDTVIPRVQARHAANTHIARSTFEFHAAAIFLNADVPLPEGLPASETVRRTKGEIAHMHDYHDFTLHLALAAADGKEVVGKGWGQRHPLAGPGVPGPPNEWTFVYAPRNEEEMGVVEQIVEAAIGYMSNVPALE

配列番号１２
Mycena citricolor_nucleotide sequence
Genbank ID: LC435376
ATGGCTTATCAGCTCACTTGGATTCAGACTCTCGTGCTGGGTGCCCTTGTGGCAATGGCAGTAGCGTTCCCCTTCATCAAGAAAGACTACGAGACGTTCCTGAAGGGCGGCCCCTCCTATGCGCCCCAAAACGTTCGCGGATACATCATCGTGCTCGTGCTCGCGCTCTTCCGCCAAGAGCAGCTCGGGCTGGAGATCTACGACCGCATGCCCGAGAAACGTCGCTGGCTCGCGAATCTCCCTCAGCGCGAGGGCCCCCGCCCCAAGACCACAAGTCACATCATCCAGCGGCAGCTCAGCCAGCACACGGACCCCGCATTCGGCGCCGCGTACCTCAAAGACACCGTCATTCCGCGCGTCCAGGCGCGGCACGCAGCCAACACGCACATCGCGCGCTCGACGTTCGAGTTCCACGCCGCCGCGATCTTCCTGAACGCGGACGTGCCGCTGCCCGAGGGCCTGCCCGCAAGCGAGACGGTGCGGCGGACCAAGGGCGAGATCGCGCACATGCACGACTACCACGACTTCACGCTGCACCTCGCGCTCGCGGCGGCGGATGGGAAGGAGGTGGTCGGCAAGGGCTGGGGGCAGCGCCATCCGCTGGCGGGACCCGGTGTGCCGGGTCCGCCGAACGAGTGGACCTTTGTGTATGCGCCGAGGAATGAAGAGGAGATGGGCGTGGTCGAGCAGATCGTAGAGGCGGCGATTGGGTACATGTCGAACGTGCCTGCGCTGGAA

配列番号１３
Neonothopanus gardneri_amino acid sequence
Genbank ID: BBH43508
MNLPSFVQRLSTASSRSIAITCVVVLASAIAFPFIRRDYQTFLEVGPSYAPQNFRGYIIVCVLSLFRQEQKGLEIYDRLPEKRRWLSDLPFRDGPRPSITSHIIQRQRTQLVDPDFATQELIGKVIPRVQARHTDKTFLSTSKFEFHAKAIFLLPSIPINDPLNVPSHDTVRRTKREIAHMHDYHDCTLHIALAAQDGKEVLKKGWGQRHPLAGPGVPGPPTEWTFLYAPRNEEEVRVVEMIIEAAIGYMTNDPAGKVVEATGK

配列番号１４
Neonothopanus gardneri_nucleotide sequence
Genbank ID: LC435378
ATGAATCTTCCGTCTTTCGTCCAACGTCTCTCCACAGCAAGCAGTCGCAGTATAGCGATTACTTGCGTAGTTGTCCTTGCCTCTGCAATCGCCTTTCCCTTCATCCGCAGAGACTACCAGACCTTCCTGGAAGTGGGACCCTCGTACGCCCCGCAGAACTTTAGAGGATACATCATCGTCTGTGTCCTCTCGTTGTTCCGCCAAGAACAAAAAGGACTCGAAATCTACGATCGGCTCCCAGAGAAACGAAGGTGGTTGTCCGACCTTCCCTTTCGTGACGGGCCCAGACCCAGCATCACAAGCCATATCATTCAACGACAGCGTACCCAACTAGTTGATCCGGACTTCGCTACCCAGGAGCTCATAGGCAAAGTCATCCCTCGTGTGCAAGCACGACACACCGACAAAACATTCCTCAGCACCTCCAAATTCGAATTTCACGCAAAAGCCATATTCCTCCTGCCTTCCATCCCAATCAACGACCCTCTGAACGTTCCAAGCCACGACACTGTCCGACGAACGAAGCGCGAGATCGCGCATATGCATGATTATCATGATTGCACTCTTCACATCGCTCTCGCTGCTCAGGACGGAAAGGAGGTTTTGAAGAAGGGATGGGGGCAACGACACCCACTCGCTGGACCTGGAGTGCCCGGCCCACCGACGGAGTGGACGTTTCTCTATGCGCCTCGAAACGAAGAAGAGGTTCGAGTTGTGGAGATGATTATTGAGGCTGCCATAGGTTACATGACGAATGATCCGGCAGGAAAAGTTGTAGAAGCCACTGGAAAG

配列番号１５
Omphalotus olearius_amino acid sequence
Genbank ID: BBH43510
MLPAFIYKPRLVITCVFVLASALAFPFIRKDYQTFLEVGPSYAPQNLQGYIIVCVLSLFRQEQKDVAIYDRLPEKRRWLGDLPFREGPRPSITSHIIQRQRTQLADAEFATKELIGKIIPRVQARHTNTTFLSTSKFEFHAQAIFLLPSIPINDPQNIPSHDTVRRTKREIAHMHDYHDCTLHLALAAQDGKEVLEKGWGQRHPLAGPGVPGPPTEWTFLYAPRSEEEVRVVEMIVEASVVYMTNDPADKIVEATVQGTEE

配列番号１６
Omphalotus olearius_nucleotide sequence
Genbank ID: LC435380
ATGCTCCCAGCTTTCATCTACAAACCAAGGCTAGTGATCACTTGTGTATTCGTTCTGGCCTCCGCACTCGCATTTCCCTTCATACGCAAAGATTACCAGACTTTCCTGGAGGTGGGACCCTCGTACGCCCCGCAGAACCTCCAAGGATACATCATCGTCTGTGTACTCTCTCTGTTCCGGCAAGAACAGAAAGACGTAGCGATTTATGATCGCCTTCCTGAGAAAAGGAGGTGGTTAGGAGACCTCCCGTTTCGCGAGGGGCCAAGACCGAGTATCACTAGCCATATCATCCAGCGACAGCGCACCCAATTGGCTGACGCCGAGTTCGCTACCAAAGAGCTGATAGGCAAAATCATCCCTCGCGTCCAAGCCCGACACACCAACACAACATTCCTCAGCACATCTAAATTCGAATTCCACGCCCAGGCCATCTTCCTTTTGCCCTCTATCCCAATCAACGACCCTCAAAACATTCCAAGCCACGATACCGTTCGTCGCACGAAACGCGAGATCGCGCATATGCATGATTATCACGACTGTACGTTGCATCTCGCACTTGCTGCTCAAGATGGGAAGGAGGTTTTAGAGAAAGGATGGGGTCAGCGACATCCTCTTGCTGGACCTGGTGTTCCTGGCCCGCCGACGGAGTGGACGTTTCTTTATGCACCGCGCAGCGAAGAGGAGGTTCGGGTTGTGGAGATGATTGTTGAGGCATCAGTTGTGTATATGACGAATGATCCTGCGGATAAAATCGTAGAAGCTACTGTGCAGGGTACTGAAGAA

配列番号１７
Panellus stipticus_amino acid sequence
Genbank ID: BBH43511
MNINLKALIGVCAVLITAAVFPFVRKDYHTFLEGGPSYAPQNLQGYIIVLVLSLFRGEETGLEIYDRLPEKRRWLEELPVREGPRPKTTSHIIQRQLNQHVDPDFGMNSLKGSVIRRLQSRHQDITQLALSKFEFHAEAIFLRPDIAINDPKHVPSHDTVRRTKREIAHMHDYHDYTCHLALAAQDGKQVIAKGWGQRHPLAGPGMPGPPTEWTFLYAPRNEAEVQVLETIIEASIGYMSNAPALGGSE

配列番号１８
Panellus stipticus_nucleotide sequence
Genbank ID: LC435381
ATGAACATCAACCTGAAAGCTCTGATCGGAGTCTGTGCCGTGCTCATCACCGCTGCAGTGTTCCCCTTCGTTCGTAAAGACTATCACACCTTTCTTGAAGGTGGACCATCCTACGCGCCGCAGAATTTGCAAGGCTATATCATCGTGTTGGTGCTCTCACTCTTTCGAGGGGAGGAGACGGGATTGGAAATATACGACCGCTTGCCCGAAAAACGCCGCTGGCTCGAGGAGCTGCCTGTTCGCGAAGGCCCGCGCCCAAAGACAACCAGCCACATCATTCAGAGACAATTGAATCAGCACGTTGACCCGGACTTCGGAATGAACTCTTTGAAAGGCTCCGTCATCCGGCGCCTTCAATCCCGCCACCAGGACATAACTCAACTCGCACTCTCGAAATTCGAATTCCACGCCGAGGCCATATTTCTGCGCCCCGATATCGCGATCAACGATCCCAAACACGTCCCGAGCCACGACACGGTGCGCCGCACAAAGCGCGAGATAGCTCACATGCACGACTACCATGATTACACGTGTCATTTGGCGCTCGCAGCGCAGGATGGGAAGCAAGTGATTGCAAAAGGGTGGGGCCAGAGACATCCGCTCGCGGGACCGGGCATGCCGGGGCCGCCGACGGAGTGGACATTTTTGTATGCGCCGAGGAATGAGGCGGAGGTTCAAGTGTTGGAGACGATTATCGAAGCGTCAATCGGGTACATGTCGAACGCACCAGCCTTGGGTGGGAGCGAG

配列番号１９：
FPXXXXDYXTFLXXGPSYAPQNXXGYXIVXVLXLFRXEXXXXXIYXXXPEKRXWLXXLPXRXGXRPXXTSHIIQRQXXQXXDXXFXXXXLXXXXIXRXQXRHXXXTXXXXSXFEFHAXAIFXXXXXXXXXPXXXPXXXTVRRTKXEIAHMHDYHDXTXHLALAAXDXKXVXXKGWGQRHPLAGPGXPGPPXEWTFXYAPRXEXEXXVXEXIXEAXXXYMXN

<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa is Arg or Lys.
<222>  (129)..(130)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid or none.
Xaa other than the above can be any naturally occurring amino acid.

配列番号２９：
FPXXXXDYXTFLXXGPSYAPQNXXGYXIVXVLXLFRXEXXXXXIYXXXPEKRXWLXXLPXRXGXRPXXTSHIIQRQXXQXXDXXFXXXXLXXXXIXRXQXRHXXXTXXXXSXFEFHAXAIFXXXXXXXXXPXXXPXXXTVRRTKXEIAHMHDYHDXTXHLALAAXDXKXVXXKGWGQRHPLAGPGXPGPPXEWTFXYAPRXEXEXXVXEXIXEAXXXYMXN

<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa is Phe, Ile or Tyr.
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa is Ile or Val.
<222>  (5)..(6)
<223>  Xaa is Arg or Lys.
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Gln, Glu or His.
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (14)..(14)
<223>  Xaa is Gly or Val.
<222>  (23)..(23)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (24)..(24)
<223>  Xaa is Arg, Lys or Gln.
<222>  (27)..(27)
<223>  Xaa is Ile Phe or Leu.
<222>  (30)..(30)
<223>  Xaa is Leu or Cys.
<222>  (33)..(33)
<223>  Xaa is Ser or Ala.
<222>  (37)..(37)
<223>  Xaa is Gly or Gln.
<222>  (39)..(39)
<223>  Xaa is Glu or Gln.
<222>  (40)..(40)
<223>  Xaa is Lys, Leu or Thr.
<222>  (41)..(41)
<223>  Xaa is Gly or Asp.
<222>  (42)..(42)
<223>  Xaa is Leu or Val.
<222>  (43)..(43)
<223>  Xaa is Ala or Glu.
<222>  (46)..(46)
<223>  Xaa is Glu or Asp.
<222>  (47)..(47)
<223>  Xaa is Pro or Arg.
<222>  (48)..(48)
<223>  Xaa is Leu or Met.
<222>  (53)..(53)
<223>  Xaa is Thr or Arg.
<222>  (56)..(56)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (57)..(57)
<223>  Xaa is Glu, Asp or Asn.
<222>  (60)..(60)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (62)..(62)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (64)..(64)
<223>  Xaa is Asp, Thr or Pro.
<222>  (67)..(67)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (68)..(68)
<223>  Xaa is Thr or Ile.
<222>  (77)..(77)
<223>  Xaa is Leu or Arg.
<222>  (78)..(78)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (80)..(81)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (83)..(83)
<223>  Xaa is Pro, Gln, Leu, Ser or Ala.
<222>  (84)..(84)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (86)..(86)
<223>  Xaa is Val, Ala or Gly.
<222>  (87)..(88)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (89)..(89)
<223>  Xaa is Ala, Glu, Tyr or Ser.
<222>  (91)..(91)
<223>  Xaa is Lys, or Ile.
<222>  (92)..(92)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (93)..(93)
<223>  Xaa is Thr, Lys or Ser.
<222>  (94)..(94)
<223>  Xaa is Val or Ile.
<222>  (96)..(96)
<223>  Xaa is Pro or Arg.
<222>  (98)..(98)
<223>  Xaa is Val or Leu.
<222>  (100)..(100)
<223>  Xaa is Ala or Ser.
<222>  (103)..(103)
<223>  Xaa is Thr, Ala or Gln.
<222>  (104)..(104)
<223>  Xaa is Asp, Ala or Asn.
<222>  (105)..(105)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (107)..(107)
<223>  Xaa is His, Phe or Gln.
<222>  (108)..(108)
<223>  Xaa is Leu or Ile.
<222>  (109)..(109)
<223>  Xaa is Ala or Ser.
<222>  (110)..(110)
<223>  Xaa is Leu, Thr or Arg.
<222>  (112)..(112)
<223>  Xaa is Lys or Thr.
<222>  (118)..(118)
<223>  Xaa is Glu, Lys, Ala or Gln.
<222>  (122)..(122)
<223>  Xaa is Val or Leu.
<222>  (123)..(123)
<223>  Xaa is Arg, Leu, or Asn.
<222>  (124)..(124)
<223>  Xaa is Pro or Ala.
<222>  (125)..(125)
<223>  Xaa is Glu, Ser or Asp.
<222>  (126)..(126)
<223>  Xaa is Ile or Val.
<222>  (127)..(127)
<223>  Xaa is Ala or Pro.
<222>  (128)..(128)
<223>  Xaa is Ile or Leu.
<222>  (129)..(129)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid or none.
<222>  (130)..(130)
<223>  Xaa is Asp or none.
<222>  (132)..(132)
<223>  Xaa is Lys, Leu, Glu, or Gln.
<222>  (133)..(133)
<223>  Xaa is His, Asn or Gly.
<222>  (134)..(134)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (136)..(136)
<223>  Xaa is Ser or Ala.
<222>  (137)..(137)
<223>  Xaa is His or Ser.
<222>  (138)..(138)
<223>  Xaa is Asp or Glu.
<222>  (145)..(145)
<223>  Xaa is Arg or Gly.
<222>  (156)..(156)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (158)..(158)
<223>  Xaa is Leu or Cys.
<222>  (160)..(160)
<223>  Xaa is Leu or Ile.
<222>  (165)..(165)
<223>  Xaa is Gln or Ala.
<222>  (167)..(167)
<223>  Xaa is Ala or Gly.
<222>  (169)..(169)
<223>  Xaa is Gln or Glu.
<222>  (171)..(172)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (186)..(186)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (191)..(191)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (196)..(196)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (201)..(201)
<223>  Xaa is Thr, Asn or Ser.
<222>  (203)..(203)
<223>  Xaa is Glu or Ala.
<222>  (205)..(206)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (208)..(208)
<223>  Xaa is Val or Leu.
<222>  (210)..(210)
<223>  Xaa is Thr, Met or Gln.
<222>  (212)..(212)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<222>  (215)..(215)
<223>  Xaa is Ser or Ala.
<222>  (216)..(216)
<223>  Xaa is Ile or Val.
<222>  (217)..(217)
<223>  Xaa is Ala, Gly or Val.
<222>  (220)..(220)
<223>  Xaa is Thr or Ser.

Claims (14)

  1. 　発光キノコ由来の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片であって、
    　配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン、及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入され、前記変異導入前のルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片。
  2. 　前記改変型ルシフェラーゼは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列：FPXXXXDYXTFLXXGPSYAPQNXXGYXIVXVLXLFRXEXXXXXIYXXXPEKRXWLXXLPXRXGXRPXXTSHIIQRQXXQXXDXXFXXXXLXXXXIXRXQXRHXXXTXXXXSXFEFHAXAIFXXXXXXXXXPXXXPXXXTVRRTKXEIAHMHDYHDXTXHLALAAXDXKXVXXKGWGQRHPLAGPGXPGPPXEWTFXYAPRXEXEXXVXEXIXEAXXXYMXNを有する発光キノコのルシフェラーゼを改変した改変体である、請求項１記載の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片。
  3. 　請求項１又は２に記載の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片をコードする単離核酸。
  4. 　下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入された、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有する改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片をコードする単離核酸。
    　（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載の発光キノコ由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列；
    　（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列；
    　（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列。
  5. 　前記改変型ルシフェラーゼは、上記変異が導入される前のルシフェラーゼと比較して、増強された発光を有する、請求項４記載の単離核酸。
  6. 　宿主細胞における核酸の発現に必要な調節エレメントの制御下にある、請求項３～５のいずれかに記載の核酸を含む発現カセットであって、
    　細胞ゲノムに組み込まれているか、又は染色体外エレメントの形態で前記細胞に導入されている、
    　請求項３～５のいずれかに記載の核酸によってコードされるルシフェラーゼの発現をもたらすことができる発現カセット。
  7. 　請求項３～５のいずれかに記載の核酸によってコードされるルシフェラーゼを産生する細胞であって、
    　宿主細胞における核酸の発現に必要な調節エレメントの制御下にある、請求項３～５のいずれかに記載の核酸を含む発現カセットを含み、
    　　前記発現カセットは、細胞ゲノムに組み込まれているか、又は染色体外エレメントの形態で前記細胞に導入されており、
    　前記染色体外エレメント又は前記細胞ゲノムに組み込まれたエレメントの形態で、請求項３～５のいずれかに記載の核酸によってコードされるルシフェラーゼの発現をもたらすことができる、細胞。
  8. 　下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列において、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアルギニン又はリジン及び１６１番目に相当するバリンの少なくとも一方に変異が導入された、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有する改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片。
    　（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載の発光キノコ由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列；
    　（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列；
    　（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は１７に記載のアミノ酸配列に対して、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２６番目に相当するアミノ酸がアルギニン又はリジンであり、１６１番目に相当するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列。
  9. 　前記改変型ルシフェラーゼは、上記変異が導入される前のルシフェラーゼと比較して、増強された発光を有する、請求項８記載の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片。
  10. 　請求項１、２、８若しくは９に記載の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片と、その他のタンパク質とを融合させて得られる融合タンパク質。
  11. 　請求項１、２、８若しくは９に記載の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片と蛍光タンパク質とが、前記改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片から、前記蛍光タンパク質へ共鳴エネルギー移動が可能なように、リンカー配列を介して連結されている、融合タンパク質。
  12. 　請求項１０又は１１に記載の融合タンパク質をコードする単離核酸。
  13. 　下記（１）～（４）からなる群から選択される少なくとも一つと、請求項１、２、８若しくは９に記載の改変型ルシフェラーゼの発光基質とを含むキット。
    　（１）請求項３～５及び１２のいずれかに記載の単離核酸；
    　（２）請求項１、２、８若しくは９に記載の単離ルシフェラーゼ又はその機能的断片；
    　（３）請求項３～５及び１２のいずれかに記載の核酸を含む発現カセット；
    　（４）請求項１、２、８若しくは９に記載の改変型ルシフェラーゼ又はその機能的断片とその他のタンパク質とを融合させて得られる融合タンパク質。
  14. 　請求項３～５及び１２のいずれかに記載の核酸を含む、トランスジェニック生物。
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