JP7356749B2 - 改変型ルシフェラーゼ - Google Patents
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Description
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有するポリペプチドであって、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有するポリペプチド。(2)配列番号1に示されるアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有するポリペプチドであって、配列番号1に記載のアミノ酸配列と比較して、1~82個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。(3)配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号1に示されるアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有するポリペプチド。
2)上記1)に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸。
3)上記2)に記載の核酸を含むベクター。
4)上記2)に記載の核酸または3)に記載のベクターを備えるキット。
5)上記1)に記載のポリペプチドとD-ルシフェリン以外の少なくとも1つの発光基質とを反応させる工程を含む発光検出方法。
6)D-ルシフェリンと比較してD-ルシフェリン以外の少なくとも1つの発光基質に対する基質特異性が向上した改変型ルシフェラーゼを設計する方法であって、ルシフェラーゼにおいて、配列番号1に示されるアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸を変異させる工程を含む、設計方法。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言できる。「ポリヌクレオチド」は、特に明記しない場合は、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することができる天然に存在するヌクレオチドの既知の類似体を含有するポリヌクレオチドを包含する。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言できる。特に言及のない限り、「塩基配列」はデオキシリボヌクレオチドの配列またはリボヌクレオチドの配列を意図している。また、ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖構造であってもよく、一本鎖の場合はセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。
本発明のポリペプチドは、配列番号1に示されるアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有した改変型ルシフェラーゼであって、且つ以下の(1)~(3)の何れかのアミノ酸配列の特徴を有する発光ポリペプチドである。以下、本発明のポリペプチドを、本発明の改変型ルシフェラーゼ、または、本発明の発光ポリペプチドと称する場合もある。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有する発光ポリペプチド。なお、配列同一性は、90%以上であることが好ましく、95%以上であることがより好ましく、96%以上、97%以上、98%以上、或いは99%以上であることが特に好ましい。
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と比較して、1~82個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有する発光ポリペプチド。なお、置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸の個数は、1~55個であることが好ましく、1~28個であることがより好ましく、1~22個であることがさらに好ましく、1~17個、1~11個、或いは1~5個であることが特に好ましい。
(3)配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号1に示されるアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有するポリペプチド。なお、ストリンジェントな条件については、本発明に係るポリヌクレオチドの欄で後述する。
当該変異後のアミノ酸の好ましい一例として、システイン、メチオニン、アラニン、グリシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、スレオニン、グルタミン、プロリンが挙げられ、より好ましい一例として、システイン、メチオニン、アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン、スレオニン、グルタミンが挙げられ、さらに好ましい一例として、システインおよびアスパラギンが挙げられ、特に好ましい一例として、アスパラギンが挙げられる。
評価の一態様として、本発明の改変型ルシフェラーゼをD-ルシフェリンと反応させて1分間測定した発光強度の積算値を求める。これを基準値とする。本発明の改変型ルシフェラーゼをアカルミネと反応させて1分間測定した発光強度の積算値を求めた後、基準値から当該積算値を相対値に換算する。このとき、本発明の改変型ルシフェラーゼのD-ルシフェリンと比較したアカルミネの基質特異性の相対値は2以上であり、好ましくは4以上であり、より好ましくは10以上であり、さらに好ましくは20以上である。
より好ましい変異の一例として、本発明の改変型ルシフェラーゼは、配列番号1に示されるアミノ酸配列における229番目のアミノ酸に相当するアミノ酸にさらに変異を有する。
・347番目に相当する位置:システイン、229番目に相当する位置:チロシン
・347番目に相当する位置:システイン、229番目に相当する位置:ヒスチジン
・347番目に相当する位置:アスパラギン、229番目に相当する位置:チロシン
・347番目に相当する位置:アスパラギン、229番目に相当する位置:ヒスチジン
・347番目に相当する位置:システイン、229番目に相当する位置:チロシン、310番目に相当する位置:グルタミン
・347番目に相当する位置:アスパラギン、229番目に相当する位置:チロシン、310番目に相当する位置:グルタミン
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記発光ポリペプチドの何れかをコードするものである。このポリヌクレオチドは、具体的には、以下の(1-1)~(1-3)の何れかに記載のポリヌクレオチドである。
(1-1)配列番号1に記載のアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有した発光ポリペプチドであって、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有する発光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、アミノ酸配列の配列同一性は、90%以上であることが好ましく、95%以上であることがより好ましく、96%以上、97%以上、98%以上、或いは99%以上であることが特に好ましい。
(1-2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と比較して、1~82個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有する発光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸の個数は、1~55個であることが好ましく、1~28個であることがより好ましく、1~22個であることがさらに好ましく、1~17個、1~11個、或いは1~5個であることが特に好ましい。
(1-3)配列番号1に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列が配列番号1に記載のアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有する、ポリヌクレオチド。
本発明に係るポリヌクレオチド(例えばDNA)は、適当なベクター中に挿入して、ベクターとして利用してもよい。ベクターの種類は、プラスミドのような自律的に複製するベクターでもよいし、或いは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主細胞の染色体と共に複製されるものであってもよい。
(形質転換体、および形質転換体の作製方法)
本発明に係るポリヌクレオチド、本発明に係る発現カセット、または、本発明に係るベクターを適当な宿主細胞に導入することによって形質転換体を作製することができる。作製された形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドの全長を含んでいるか、少なくとも当該ポリヌクレオチドの一部を含んでいて、本発明の発光ポリペプチドの何れかを発現可能である。同様に、本発明に係る形質転換体を用いて得られた当該形質転換体の子孫も、本発明に係るポリヌクレオチドの全長を含んでいるか、少なくとも当該ポリヌクレオチドの一部を含んでいて、本発明の発光ポリペプチドの何れかを発現可能である。作製された形質転換体またはその子孫において、本発明に係るポリヌクレオチドの全長またはその一部は、ゲノム中に組み込まれていることが好ましい。
上記の形質転換体は、導入された外来核酸分子の発現が可能な条件下で、培養または育成する。
本発明に係る非ヒトトランスジェニック生物は、例えば、高等生物である。トランスジェニック植物としては、例えば、シロイヌナズナなどの双子葉植物;ミナトカモジグサ(Brachypodium distachyon)、イネ、コムギ、オオムギなどの単子葉植物;のトランスジェニックが挙げられる。トランスジェニック動物としては、例えば、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、ブタなどのトランスジェニックが挙げられる。
本発明は、例えば、本発明に係る非ヒトトランスジェニック生物を用いて、そのクローンを作製することも包含する。作製されたクローンは、元となった非ヒトトランスジェニック生物と同様に、ゲノム中に、本発明に係るポリヌクレオチドの全長を含んでいるか、少なくとも当該ポリヌクレオチドの一部を含んでいて、本発明の発光ポリペプチドの何れかを発現可能である。なお、クローンとは、胚細胞クローンも体細胞クローンも含む概念である。
本発明はまた、本発明の核酸または本発明のベクターを備えるキットを提供する。
本発明はまた、ルシフェリンと比較して少なくとも1つの他色発光基質に対する基質特異性が向上した改変型ルシフェラーゼを設計する方法であって、ルシフェラーゼにおいて、配列番号1に示されるアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸を変異させる工程を含む設計方法を提供する。
本発明の範疇には、例えば、以下のような態様が含まれている。
1)以下の(1)~(3)の何れかに示す、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有するポリペプチドであって、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有するポリペプチド。(2)配列番号1に示されるアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有するポリペプチドであって、配列番号1に記載のアミノ酸配列と比較して、1~82個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。(3)配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号1に示されるアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有するポリペプチド。
2)さらに配列番号1に示されるアミノ酸配列における229番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有している、1)に記載のポリペプチド。
3)上記347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸における変異がシステインまたはアスパラギンへの置換である、1)または2)に記載のポリペプチド。
4)上記229番目のアミノ酸に相当するアミノ酸における変異がチロシンまたはヒスチジンへの置換である、2)または3)に記載のポリペプチド。
5)配列番号2~7の何れか1つに示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、1)~4)の何れかに記載のポリペプチド。
6)上記1)~5)の何れかに記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸。
7)上記6)に記載の核酸を含むベクター。
8)上記6)に記載の核酸または7)に記載のベクターを備えるキット。
9)上記1)~5)の何れかに記載のポリペプチドとD-ルシフェリン以外の少なくとも1つの発光基質とを反応させる工程を含む発光検出方法。
10)D-ルシフェリンと比較してD-ルシフェリン以外の少なくとも1つの発光基質に対する基質特異性が向上した改変型ルシフェラーゼを設計する方法であって、ルシフェラーゼにおいて、配列番号1に示されるアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸を変異させる工程を含む、設計方法。
〔材料〕
ルシフェラーゼとして、以下のものを用いた。
(2) luc2の改変体(S347C)
(3) luc2の改変体(S347N)
(4) luc2の改変体(N229Y)
(5) luc2の改変体(N229H)
(6) luc2の改変体(H310Q)
(7) luc2の改変体(N229Y+H310Q)
(8) luc2の改変体(N229H+H310Q)
(9) luc2の改変体(H310Q+S347C)
(10)luc2の改変体(H310Q+S347N)
(11)luc2の改変体(N229Y+S347C)
(12)luc2の改変体(N229H+S347C)
(13)luc2の改変体(N229Y+S347N)(配列番号2)
(14)luc2の改変体(N229H+S347N)(配列番号3)
(15)luc2の改変体(N229Y+H310Q+S347C)
(16)luc2の改変体(N229Y+H310Q+S347N)(配列番号4)
(17)luc2の改変体(N229H+H310Q+S347C)
(18)luc2の改変体(N229H+H310Q+S347N)
(19)luc2の改変体a(表1のa)
(20)luc2の改変体b(表1のb)(配列番号5)
(21)luc2の改変体c(表1のc)(配列番号6)
(22)luc2の改変体d(表1のd)(配列番号7)
プラスミドpcDNA3をBamHI及びEcoRIで処理し、上記ルシフェラーゼのそれぞれについて、コードする遺伝子を挿入してトランスフェクション用プラスミドを作製した。
基質溶液としては、アカルミネまたはD-ルシフェリン(それぞれ80μM)を加えた。発光強度の測定結果は、luc2のサンプルにアカルミネを添加した時の発光強度を1.0としたときの相対値として以下の表2に示した。
蛍光タンパク質Venusと融合した上記改変体cまたは改変体dの各種ルシフェラーゼを一過的に発現したHeLaS3細胞(35mmのガラスボトムディッシュに播種した)に80μMのアカルミネを添加し、発光顕微鏡LV200(オリンパス)で一細胞ごとの発光強度とVenusの蛍光強度を測定した。その後、発光強度を蛍光強度で標準化してタンパク質の量を定量し、各種ルシフェラーゼの発光の強さを測定した。
Claims (6)
- (1)配列番号1に示されるアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有するポリペプチドであって、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の配列同一性を有するポリペプチド、または
(2)配列番号1に示されるアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有するポリペプチドであって、配列番号1に記載のアミノ酸配列と比較して、1~28個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、
上記347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸における変異がシステインまたはアスパラギンへの置換であり、さらに配列番号1に示されるアミノ酸配列における229番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有しており、
上記347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸における変異がシステインへの置換であるとき、上記229番目のアミノ酸に相当するアミノ酸における変異がチロシンまたはヒスチジンへの置換である、
ルシフェラーゼ活性を有する、ポリペプチド。 - 配列番号1に示されるアミノ酸配列における347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有するポリペプチドであって、
上記347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸における変異がシステインまたはアスパラギンへの置換であり、さらに配列番号1に示されるアミノ酸配列における229番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に変異を有しており、
上記347番目のアミノ酸に相当するアミノ酸における変異がシステインへの置換であるとき、上記229番目のアミノ酸に相当するアミノ酸における変異がチロシンまたはヒスチジンへの置換であり、
配列番号2~7の何れか1つに示されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ルシフェラーゼ活性を有する、ポリペプチド。 - 請求項1又は2に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸。
- 請求項3に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項3に記載の核酸または請求項4に記載のベクターを備えるキット。
- 請求項1又は2に記載のポリペプチドとD-ルシフェリン以外の少なくとも1つの発光基質とを反応させる工程を含む発光検出方法。
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