CN106232818A - 改良植株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及产率增加的改良植株。植株在低磷酸盐条件下显示产率增加，因此需要更少的肥料。植株的特征在于突变体磷酸盐运送蛋白基因的表达。

Description

改良植株

技术领域

本发明涉及表达核酸结构的转基因单子叶植株。

背景技术

为了维持高产率而在农业上大量施用磷肥，这导致了严重的环境问题，人们预期非再生Pi将在70到200年内(1,2)用完，因而必需的植株大量营养元素磷酸盐(essentialplant macronutrient phosphate,Pi)得到越来越多的关注。因此提高植株Pi利用率成为可持续农业生产的一个重要目标。

磷是植株生长发育的一个必需大量的营养元素。缺Pi植株通常会变成暗绿色并且表现出发育不良。植株从其环境直接通过Pi运送蛋白主动吸收Pi吸收到其根部的表皮和皮层细胞而获得Pi。进入根部表层细胞后，Pi必须最终输入木质部的非原质体空间，输送到根部然后通过Pi运送蛋白在植株内重新分布。作为核酸、磷脂质以及细胞代谢的一种成分，活性细胞需要毫摩尔量量的Pi。但是，大多数的土壤Pi是固定的并且根部可吸收的Pi浓度处于微摩尔量。然而，太多的Pi摄取会导致Pi中毒症状。

为了通过有限的可利用Pi协调植株生长，高亲和性Pi运送蛋白已经进化到可以使从土壤中吸收的Pi增加。植株中的高亲和性植株Pi运送蛋白最初是利用高亲和性酵母菌运送蛋白PHO84通过序列相似性被识别出来的。编码这些运送蛋白中的一些的基因能够补码PHO84酵母菌突变体。这些蛋白质属于Pi/H⁺协同转运子的磷酸盐运送蛋白1(PHT1)家族。拟南芥(Arabidopsis thaliana,阿拉伯芥)的九个PHT1基因已经被识别出来了，并且水稻(Oryza sativa,稻属)的13个PHT1基因也已经被识别出来了。合成蛋白质后，这些质膜(PM)蛋白质最初靶向内质网(ER)，然后它们需要不同的运输步骤以到达它们的最终目的地。

Pi信号路径的另一个调节器是磷酸盐运送蛋白运输促进子1(Phosphatetransporter traffic facilitator 1,PHF1)(3)。这种基因编码位于ER中的蛋白质从而准确地从ER到PM靶向PHT蛋白质。OsPHF1的过表达导致转基因水稻高Pi浓度时Pi积累增加。但是，在拟南芥中，AtPHF1的过表达没有导致Pi(4,5)摄取量显著增加。因而，虽然PHF活性增加导致从ER到PM的PHT易位，这没有导致拟南芥Pi摄取量增加。

在拟南芥中，人们研究了AtPHT1；1的突变，它在分别模拟非磷酸化或磷酸化残基的多个磷酸化位点具有突变。AtPHT1；1的野生型和突变型在拟南芥中得以表达。有人提出PHT1；1的C-终端发生的磷酸化作用和防止PHT1；1从ER离开有关。另外一方面，研究表明AtPHT1；1的非磷酸化突变没有影响PM(5)中PHT1；1的降解和稳定性过程。磷酸化位点也在水稻AtPHT1；1和OsPHT1；8(OsPT8)(4)同系物中得以识别。

OsPT8和水稻的磷酸盐内稳态相关。水稻OsPT8增强基因表达强化了的Pi摄取并且过表达植株表现出生长减缓(9)。因此，也有结果证明Pi摄取量增加不一定产生有益的表型：OsPT2和OsPT8的过表达导致过量的芽Pi积累并且产生Pi中毒表型，和OsPHR2(9)过表达相似。

本发明旨在为植株提供在低外部Pi浓度下增加Pi摄取和提高产率的有益表型。因此，这样的植株需要更少的磷肥以维持更高的产率并且得以解决农业上减少磷肥的需要。

附图说明

本发明通过下列非限制性附图描述。

附图1 CK2β3直接和PT相互作用并且对于CK3和PT的相互作用是必须的。(A)酵母菌双杂交试验表明在四个CK2亚单元(α2、α3、β1和β3)中只有CK2β3和酵母菌细胞的PT2以及PT8相互作用。EV，空载体；SD/LW，-Leu(亮氨酸)-Trp(色氨酸)；SD/LWHA，-Leu(亮氨酸)-Trp(色氨酸)-His(组氨酸)-Ade(腺嘌呤)；+阳性对照(NubI)。(B)用PT2&8(PT2-CT&PT8-CT)CK2α3和CK2β3高度保守的羧基终端胜肽做体内免疫共沉淀试验。蛋白质从表达PT2-CT-GFP(绿色荧光蛋白)或PT8-CT-GFP(绿色荧光蛋白)，和CK2α3-FLAG或CK2β3-MYC的农杆菌渗入的烟草植株中提取。(输入)利用反-GFP(绿色荧光蛋白)免疫沉淀(IP)并且免疫印迹利用特定标签的抗体制作。(C)在酵母菌三杂交试验(Y3H)中，CK2β3是CK2α3与PT2-CT和PT8-CT相互作用所必需的。SD/LMW,-Leu(亮氨酸)-Met(蛋氨酸)-Trp(色氨酸)；SD(变相分离)/LMWH,-Leu(亮氨酸)-Met(蛋氨酸)-Trp(色氨酸)-His(组氨酸)；EV,空载体。(D)体内PT8–CT，CK2α3和CK2β3的免疫共沉淀。从在指示组合(输入)中表达GFP(绿色荧光蛋白)(对照),CK2α3-FLAG,PT8-CT-GFP(绿色荧光蛋白)和CK2β3-MYC的农杆菌渗入的烟草植株中提取的蛋白质利用反-GFP(绿色荧光蛋白)免疫沉淀(IP)并且免疫印迹利用特异性标签的抗体制作。(E)包括单独(左边)包含PT8-GFP(绿色荧光蛋白)结构或同时包含CK2α3(中间)或CK2β3过表达结构(右边)在7天大转基因植株的水稻根部的表皮细胞里进行PT8-GFP(绿色荧光蛋白)(PT8p-PT8-GFP(绿色荧光蛋白))亚细胞定位的共焦分析。条形长度＝20μm。

附图2 CK2α3调整PT8和CK2α3的磷酸化作用与CK2β3相互作用取决于细胞Pi状态并且会削弱PT8和PHF1的相互作用。(A)体内PT8利用CK2α3的磷酸化作用。在野生型(wt)和CK2α3-过表达(Oxα3)植株里而非CK2α3-基因沉默(Ria3)植株(上部)里观察到更低的迁移带。这些带对λ-磷酸酶处理(λ-PPase)(下部)敏感。这些免疫印迹利用反-PT8在磷标记的的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)制作。(B)细胞Pi依赖型磷酸化作用和CK2β3的λ-PPase敏感性。非磷酸化的CK2β3也可利用P还原。考马斯亮蓝(CBB)染色用作总体蛋白质的加载对照。(C)CK2β3和CK2α3之间相互作用的细胞Pi敏感性。β3-FLAG蛋白质分别从+Pi或–Pi条件下生长的转基因植株纯化得到，并且GST(谷胱甘肽巯基转移酶)-α3在E.coli(大肠杆菌)内纯化得到，然后做GST(谷胱甘肽巯基转移酶)下拉试验。这个实验利用在+P和-P提取物(50ng)中相似量的CK2β3进行。β3-FLAG(家禽抗小鼠淋巴细胞球蛋白)/GST(谷胱甘肽巯基转移酶)-α3蛋白质是通过免疫标记利用反-GST(谷胱甘肽S转移酶)或反-FALG(家禽抗小鼠淋巴细胞球蛋白)抗体检测出来。纯化后的GST-α3和β3FALG(家禽抗小鼠淋巴细胞球蛋白)蛋白质在输入泳道上加载。(D)基于下拉试验PHF1在体外没有和磷酸化的PT8相互作用。如图所示的是包含已消退并且亲和纯化了结合反应的蛋白免疫印迹的西方墨点法的凝胶，所述结合反应包含了PHF1-MYC(原癌基因)(上板),GST(谷胱甘肽巯基转移酶)(阴性对照),GST(谷胱甘肽巯基转移酶)-PT8-CTS517和GST(谷胱甘肽巯基转移酶)-PT8-CTS517A(底部)。CK2α3调节的磷酸化的PT8-CTS517是通过利用反磷酸丝氨酸抗体(中间)的处理后制作的信号指示。

附图3 PM上PT8的依赖型磷酸化作用的循环/降解过程。(A)在Pi供给(+P:200μM)和Pi饥饿(-P)条件下生长的水稻秧苗的根部表皮细胞内PT8S517-GFP(绿色荧光蛋白)(PT8p-PT8S517-GFP(绿色荧光蛋白))和PT8S517A-GFP(绿色荧光蛋白)(PT8p-PT8S517A-GFP(绿色荧光蛋白))的亚细胞定位。CHX(放线菌酮)(50μM)处理60分钟后，利用共聚焦显微镜检查GFP(绿色荧光蛋白)图像。条形长度＝10mm。附图5中显示广泛Pi方案下PM级别的PT8S517A稳定性。(B)根据细胞Pi状态、在PHF1和活性CK2α3β3全酶控制下，Pi运送蛋白的ER离去以及PM循环/降解过程的模型。在高Pi水平下，磷酸化的CK2β3和作为活性全酶的CK2α3互相作用使得PT磷酸化从而抑制PHF1和磷酸化的PT作用，致使PT的ER保留。在低Pi水平，CK2β3的磷酸化作用受到抑制，并且PHF1和非磷酸化的PT相互作用，同时进行PT从ER到PM的有效转变以及在PM中的循环过程。非磷酸化的CK2β3易于在细胞溶素液泡中通过-P降解。箭头线代表加强的作用而箭头虚线代表削弱的作用。TGN，反面高尔基网；ER，内质网以及PM,质膜。

附图4具有非磷酸化PT8(PT8S517A)的植株在低Pi方案下显示出改良的性能。(A)为期45天，利用50和10μM Pi的水培试验培养的包含PT8S517A的水稻品种XS134(粳稻cv.)和两个独立转基因株系(T2)的生长性能。条形长度＝10cm。(B)(A)中所示植株的芽和根部的干重。(C和D)(A)中所示植株的芽和根部的细胞Pi浓度(C)和总P(D)。误差条形图代表s.d.(n＝6)。图中指示出了和对应野生型对照(XS134)显著不同的数据(**P<0.01；t检验)。FW，鲜重。(E和F)没有施用磷肥的低P土壤中的XS134和具有PT8S517A的两个株系的转基因植株中一次反叠显示的生长性能(E)和产率(F)。N和K以常用水平(450kg urea/ha；300kgKCl/ha)施用。在随机安排的三次反叠试验中植株以25cm×25cm的4×5植株移植。

附图5非磷酸化的PT8(PT8S517)在富含PM的蛋白质中更加稳定。(a)15天大的对照(wt:XS134,粳稻cv.)和不同Pi水平下进行60分钟50μM的CHX处理后非磷酸化PT8S517A-1或wt PTS517-1单个拷贝的转基因植株的根部富含PM的蛋白质分段的PT8蛋白质水平。PT积累是利用反-PT8抗体制作的西方墨点法检测。考马斯亮蓝(CBB)染色用作富含PM蛋白质的加载对照。Wt，野生型XS134。(b)(a)中所示的定量结果。对PT8S517信号给定Pi水平下相关PT蛋白质(倍)为PT8S517A信号的比例。数值代表平均值±s.d.(n＝3)(c)不同Pi水平下(a)所示的PT蛋白质的相对含量在半对数图中计算和标绘。数值代表平均值±s.d.(n＝3)。

附图6直接同源的OsPHT1；8(OSPT8)的排列。其他单子叶植株(线上)和双子叶植株(线下)的直接同源物。它显示了直接同源物上的保留的S517位点。从顶部序列开始显示的序列：

SEQ NO:5:二穗短柄草Brachypodium distachyon(版本XP_003573982.1 GI:357146410)

SEQ NO:7:AAO72437.1大麦芽亚种.大麦Hordeum vulgare subsp.vulgare(版本AAO72437.1 GI:29367131)

SEQ NO:9:高粱Sorhum bicolor(版本XP_002464558.1 GI:242034327)

SEQ NO:11:玉蜀黍Zea mays(版本NP_001105816.1 GI:162461219)

SEQ NO:13:NP_001105269.1玉蜀黍Zea mays(版本NP_001105269.1 GI:162458548)

SEQ NO:15:NP_001266355.1玉蜀黍Zea mays(版本NP_001266355.1 GI:525343585)

SEQ NO:17:XP_004983000.1腹腔丝虫属斜体Setaria italic(版本XP_004983000.1 GI:514816524)

SEQ NO:19:NP_001048976.1水稻粳稻Oryza sativa Japonica组(版本NP_001048976.1 GI:115450751)

SEQ NO:21:XP_004985679.1腹腔丝虫属斜体Setaria italic(版本XP_004985679.1 GI:514822017)

SEQ NO:23:EAY93198.1水稻籼稻Oryza sativa Indica组(版本EAY93198.1 GI:125547376)

SEQ NO:25:NP_001052194.1水稻粳稻Oryza sativa Japonica组(版本NP_001052194.1 GI:115457188)

SEQ NO:27:XP_003558115.1二穗短柄草Brachypodium distachyon(版本XP_003558115.1 GI:357112638)

SEQ NO:29:XP_002468495.1高粱Sorhum bicolor(版本XP_002468495.1 GI:242042201)

SEQ NO:31:XP_004975146.1腹腔丝虫属斜体Setaria italic(版本XP_004975146.1 GI:514800438)

SEQ ID NO:32:EOX94467.1可可Theonbroma cacao(版本EOX94467.1 GI:508702571；对应cDNA:CM001879.1)

SEQ ID NO:33:XP_002531532.1蓖麻Ricinus communis(版本XP_002531532.1GI:255581449,对应cDNA:XM_002531486.1)

SEQ ID NO:34:AFU07481.1油茶Camellia oleifera(版本AFU07481.1 GI:407316573,对应cDNA:JX403969.1)

SEQ ID NO:35:AAF74025.1烟草Nicotiana tabacum(版本AAF74025.1 GI:8248034,对应cDNA:AF156696.1)

SEQ ID NO:36:ADL27918.1橡胶树Hevea brasiliensis(版本ADL27918.1 GI:302353424；对应cDNA:HM015901.1)

SEQ ID NO:37:XP_006354490.1马铃薯Solanum tuberosum(版本XP_006354490.1GI:565375975,对应cDNA:XM_006354428.1)

SEQ ID NO:38:XP_002879774.1琴叶拟南芥亚种.琴叶Arabidopsis lyratesubsp.Lyrate(版本XP_002879774.1 GI:297823783,对应cDNA:XM_002879728.1)。

附图7利用低P土壤的田间试验在其自身启动子控制下表达PT8^S517和PT8^S517A的转基因植株的果穗数，秸秆干重和营养元素分析。(a)对照植株(PT8^S517)和PT8^S517A植株的果穗数。(b)两种转基因植株的秸秆干重。(c和d)两种转基因植株的根部的元素分析。采收芽后，利用去离子水清洗三遍并且以烤箱在105℃烘干三天，利用电感耦合等离子体光电直读光谱仪进行元素分析(ICP(电感耦合等离子体)-OES(光电直读光谱仪),奥普蒂玛体8000DV,珀金埃尔默,USA)。除了P和Zn之外，元素中没有发现显著的不同。K，钾；Ca，钙；Mg，镁；S，硫；Fe，铁；Zn，锌以及Mn，锰。误差条形图＝s.d.n＝3。它指示了和对应于野生型的对照组显著不同的数据(**P<0.01；t检验)。这个实验是在浙江长欣县的浙江大学农业试验站里施用磷肥的低P土壤田间实验进行的(从2013年的五月到十月)。氮和钾以通常水平(450kg urea/ha；300kg KCl/ha)施用。在随机安排的三次反叠试验中植株以25cm×25cm的4×5植株移植。采收每一次反叠中的50株植株以计算产率、果穗数和秸秆干重。土壤奥尔森P：7.6ppm和pH：6.87(土壤：水＝1:1)。

发明内容

第一方面，本发明涉及表达核酸结构的转基因单子叶植株，所述核酸结构包括编码突变PT多肽的核酸序列，所述突变PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。

另一方面，本发明涉及编码突变植株PT多肽的分离核酸，所述突变PT多肽包括如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰，其中所述植株为单子叶植株。

另一方面，本发明涉及包含编码突变植株PT多肽的分离核酸的载体，所述突变植株PT多肽包括如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰，其中所述植株为单子叶植株。

另一方面，本发明涉及包含根据核酸载体的宿主细胞。

另一方面，本发明涉及提高转基因植株产率的方法，所述方法包括在植株中引入和表达如上所述的核酸载体。

另一方面，本发明涉及提高转基因植株Pi利用效率的方法，所述方法包括在植株中引入和表达如上所述的核酸载体。

另一方面，本发明涉及提高转基因植株锌含量的方法，所述方法包括在植株中引入和表达如上所述的核酸载体。

另一方面，本发明涉及生产产率提高的转基因单子叶植株的方法，所述方法包括在植株中引入和表达如上所述的核酸载体。

另一方面，本发明涉及从上述方法得到或可得到的单子叶植株。

另一方面，本发明涉及如上所述核酸用于提高产率的用途。

另一方面，本发明涉及生产产率提高或锌含量提高植株的方法，包括以下步骤：

(a)将植株种群暴露于诱变剂；以及，

(b)识别突变植株，所述植株在参考SEQ ID No.2的部位517或同源于SEQ ID No.2序列的对应位置上的丝氨酸被非磷酸化残基取代。

另一方面，本发明涉及如上所述方法获得或可获得的植株，其中所述植株不是拟南芥。

另一方面，本发明涉及在PT基因上发生突变的突变体单子叶植株，其中所述突变PT基因编码突变PT多肽，所述突变PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰，所述突变PT多肽通过诱变产生。

具体实施方式

本发明提供具有不会导致Pi中毒症状而令人惊奇地导致Pi摄取量增加的植株。所述植株为表达PT基因的突变植株，该PT基因编码在保守磷酸化作用位点具有点突变的突变PT多肽。如本文所述，这些植株即使在低Pi条件下的Pi摄取量也会增加。同时令人惊奇的是，在这些条件下，当野生型(wt)PT过表达时，Pi摄取量没有增加。虽然这样的过表达增加PT蛋白质的质量，但是在低Pi条件下，所述wt蛋白质的表达增加没有导致Pi摄取量和产率增加。只有对应于OsPT8的517的丝氨酸(S)残基上的保守磷酸化作用位点之一上发生突变的PT非磷酸化突变体的过表达会导致Pi摄取量增加。其他磷酸化作用位点的修饰没有导致Pi摄取量和产率增加。

重要的是，发明人表明OsPT8多肽上部位517的丝氨酸(S)残基的磷酸化作用不只影响从ER到质膜的PT转运，也显著地增加了质膜内PT的稳定性。所述非磷酸化突变PT从所述ER路径并且在质膜内更加稳定。非磷酸化突变体PT离开ER并且在质膜内更为稳定。同时，有人指出AtPHT1:1的S514的磷酸化作用会影响识别拟南芥的ER输出启动子，也有结果显示AtPHT1:1的S514的磷酸化作用没有影响PM的蛋白质降解，因而没有对膜蛋白质稳定性产生影响。进一步地，也有结果显示单子叶植株水稻和双子叶植株拟南芥的Pi摄取量的调节以及PHF1的过表达的差异会导致高Pi浓度下时转基因水稻而非拟南芥的Pi积累量增加。

导致在低Pi条件下产率增加的OsPT8非磷酸化突变体的意外表型可归因于从ER离开的蛋白质和PM内蛋白质稳定性的共同增加。保守磷酸化位点之一的单个修饰由此导致从ER离开的蛋白质和膜内蛋白质稳定性的共同增加。在低Pi条件下，就是这种共同增加出乎意料地导致Pi摄取量和产率增加。

发明人也表明和对照植株相比，表达517上丝氨酸残基(S)发生突变的突变OsPT8的植株的锌含量增加(参见附图7)。

现在进一步描述本发明。在下述段落中，本发明的不同方面以更多细节定义。除非明确指示为相反面，这样定义的每个方面可能和任何其他一个或多个方面结合。特别地，任何指示为优选或有利的特征可能和任何指示为优选或有利的一个或多特征结合。

除非另有所指，本发明的实践采用作为本领域内技术的植株学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和DNA重组技术以及生物信息学。这些技术在文献中有详细说明。

如本文所用的，单词“核酸”、“核酸序列”,“核苷酸”,“核酸分子”或“多核苷酸”意指包含DNA分子(如cDNA(互补DNA)或基因组DNA)、RNA分子(如mRNA(信使RNA))、自然产生的、突变的、合成的DNA或RNA分子以及利用核苷类似物产生的DNA或RNA类似物。它可以是单股或双股的。这样的核酸或多聚核苷酸包括，但不限于结构基因的编码序列，反义序列以及不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调控序列。这些序列也包含基因。广泛使用术语“基因”或“基因序列”以指示和生物功能相关的DNA核酸。因此，基因可像基因组序列一样包含内含子和外显子，或像cDNA一样仅包括编码序列和/或可包括和调控序列结合的cDNA。优选地，如SEQ ID NO:3所示的例子，所述序列是cDNA。

术语“肽”、“胜肽”、“多肽”和“蛋白质”可交换地用在本文中并且指的是任何长度、通过肽键连接在一起的聚合形式。

为了本发明的目的，“转基因的”，“转基因”或“重组体”意指关于，例如根据本发明的核酸序列、表达组件、基因结构或包含核酸序列的载体或与核酸序列转换的有机体，表达组件或载体，所有这些结构通过下述重组方法产生

(a)本发明方法有用的编码蛋白质的核酸序列，或

(b)和根据本发明的核酸序列有效连接的基因控制序列，例如启动子，或

(c)a)和b)

其没有位于它们自然基因环境或通过重组方法修饰，修饰有可能采取，例如一个或多个核苷酸残基的替换、添加、删除、反转或插入的形式。自然基因环境理解为意指原始植株或存在于基因组信息库的自然基因的或染色体的位点。至于基因组信息库，至少部分地，优选保留所述核酸序列的自然基因环境。所述环境在至少一个侧面位于核酸序列并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。当这种表达组件通过一些例如诱变处理的非自然、合成(“人工”)方法修饰，自然出现的表达组件-例如，如上所述，核酸序列的天然启动子和具有编码与对本发明有用的多肽的对应核酸序列的天然启动子自然出现的组合-变成转基因表达组件。合适的方法记载于，例如通过引用并入的US 5,565,350或WO 00/15815。

由此，本发明不同方面的目的的转基因植株可理解为意指，如上所述，本发明方法使用的核酸没有处于所述植株基因组上的自然位置，核酸可能同源或异源的表达。但是，就像所提及的，转基因的也意指，虽然根据本发明不同实施例的核酸处于植株基因组的自然位置，所述序列对于自然序列已经被修饰和/或所述自然序列的调控序列已经被修饰。转基因的优选地理解为意指发生根据本发明基因组的非自然位点的核酸表达，即同源的，或优选地为所述核酸异源表达。根据本发明，所述转基因以稳定方式整合到植株中并且优选地，所述植株对所述转基因是同型结合的。

本发明属于包括重组DNA技术并且排除仅仅基于通过传统繁殖方法生长的转基因植株。

本发明的其他方面涉及对植物的处理，所述处理具有诱变剂以产生在保守磷酸化作用位点具有点突变的突变植株。这些植株没有携带PT转基因。但是，这样生产突变植株的方法需要利用诱变剂处理植株的步骤并且由此也排除了仅仅基于通过传统繁殖方法生长的植株的实施例。

发明人已经生成了表达突变体OsPT8多肽并且产率和Pi转运增加的转基因水稻。因此，这些植株比wt植株更加有效地利用Pi并且当用于农业时，比非修饰植株需要更少肥料。

术语“产率”包括一个或多个下述非限制性的特征列表：早花期，生物量(植株生物量(根部和/或芽生物量)或种子/谷物生物量)，种子/谷物产率，种子/谷物发育能力和发芽率，种子/谷物尺寸，谷物的淀粉含量，早期生长势，绿度指数，生长速度增加，绿色组织的延长衰老。术语“产率”通常意指可测量的具有经济价值的产品，典型地涉及一个区域以及一段时期的特定农作物。根据它们的数量，尺寸和/或重量，单个植株部分直接有助于产率。实际产率是单个农作物一年每平方米的产率，它是总产量(包括采收和评估的产量)除以种植平方米数而确定。

因此，根据本发明，产率包括一个或多个下述内容并且通过评估一个或多个下述内容测量：每个植株的种子产率提高，种子灌浆率增加，灌浆种子的数量增加，采收指数增加，发育能力/发芽率增加，种子/胶囊/豆荚/谷物的数量或尺寸增加，生长或分枝增强，例如具有更多分枝的花序，生物量或籽粒灌浆增加。优选地，产率增加包括谷物/种子/胶囊/豆荚数量增加，生物量增加，生长增加，花瀑数量增加和/或花分枝增加。产率相对于对照植株提高。

本文定义的对照植株为没有表达本文描述的核酸或结构的植株，例如野生型植株。对照植株通常是相同植株种类，优选和修饰植株具有相同的遗传背景。

本文使用的术语“增加”、“改善”或“加强”是可互换的。例如产率增加了至少2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％或10％，优选至少10％至15％,15％或20％，更优选地25％,30％,35％,40％或50％或和对照植株相比更多。例如，产率可增加2％到50％，例如10％到40％。

在第一方面，本发明涉及表达核酸结构的转基因植株，所述核酸结构包括编码突变PT多肽的核酸序列，所述突变PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的多肽序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰，其中所述植株不是拟南芥。

优选地，本发明涉及表达核酸结构的转基因植株，所述核酸结构包括编码突变PT多肽的核酸序列，所述突变PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的多肽序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。

本发明也涉及增加转基因植株产率或锌含量/水平的方法，所述方法包括引入和表达包括编码突变PT多肽的核酸的核酸结构，所述突变PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。在一个实施例中，所述植株不是拟南芥。

和野生型植株相比，锌含量/水平可至少增加2倍。

本发明也涉及增加转基因单子叶植株产率的方法，所述方法包括引入和表达包括编码突变PT多肽的核酸的核酸结构，所述突变PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。

本发明也涉及增加转基因植株Pi摄取的方法，所述方法包括引入和表达包括编码突变PT多肽的核酸的核酸结构，所述突变PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。在一个实施例中，所述植株不是拟南芥。

本发明也涉及增加转基因单子叶植株Pi摄取的方法，所述方法包括引入和表达包括编码突变PT多肽的核酸的核酸结构，所述突变PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸取代或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸取代。在一个实施例中，所述植株不是拟南芥。

本发明也涉及缓解在转基因植株，优选单子叶植株，中锌缺乏的方法，所述方法包括引入和表达包括编码突变PT多肽的核酸的核酸结构，所述突变PT多肽含有如在SEQ IDNo.2所示的部位S517上的氨基酸取代或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ IDNo.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸取代。

根据本发明描述的不同方面的PT突变多肽的修饰/突变参见指定OsPT8野生型多肽序列的SEQ ID No.2显示的氨基酸位置。在wt OsPT8序列中，目标丝氨酸残基位于部位517。wt多肽分别被SEQ ID No.1或SEQ ID No.3(cDNA序列)显示的野生型(wt)核酸编码。因此，根据本发明不同方面的一个实施例，突变PT多肽被包括或由和SEQ ID No.1、功能性变体，或其直接同源物或同系物大致相同的序列构成的核酸编码，但是所述SEQ ID No.1、功能性变体，或其直接同源物或同系物具有密码子修饰，这样核酸的转录导致蛋白质突变，包括对应于，如前所述，SEQ ID No.2上或丝氨酸等效位置的部位517的氨基酸修饰。换句话说，突变PT多肽由包括或由和SEQ ID No.1、功能性变体，或其直接同源物或同系物大致相同的序列构成的核酸编码，但是所述SEQ ID No.1、功能性变体，或其直接同源物或同系物包括编码SEQ ID No.2上或丝氨酸等效位置的部位517的密码子的修饰。

OsPT8上或同系物等效位置的丝氨酸上的部位517的修饰可为删除丝氨酸残基。优选地，修饰使用另一个非磷酸化的氨基酸残基取代丝氨酸。例如，这个残基是丙氨酸(A)或任何其他合适的氨基酸。

本发明不同方面的一个实施例中，PT突变多肽是如SEQ ID No.2显示的突变PT多肽OsPT8，但在SEQ ID No.2的部位517上包括氨基酸取代。因此，编码所述胜肽的核酸大致和SEQ ID No.1显示的OsPT8相同并且编码突变体多肽，但如果当丝氨酸处于SEQ ID No.2的部位517则会包括氨基酸修饰。在一个实施例中，所述修饰为取代。部位517上的S残基可以被A或任何其他合适的氨基酸取代。

但是，本发明的不同方面也延伸到OsPT8的同系物和突变体。如本文所用的，这些是功能性同系物和突变体。如SEQ ID No.2所示的OsPT8的突变体或同系物是和SEQ IDNo.2以相同方法具有生物活性的PT多肽，换句话说，它是Pi运送蛋白并且调控Pi摄取量。本文使用的术语功能性同系物或同系物包括其他植株种类的OsPT8的直系同源物。在本发明不同方面的优选实施例中，本发明具体涉及OsPT8或其他植株中OsPT8直系同源物。优选为单子叶植株中的OsPT8直系同源物。和野生型序列相比，突变体具有改良的序列，但是这没有影响所述蛋白质的机能活性。技术人员应该知道没有包括功能性基序(motifs)的氨基酸部分的氨基酸取代不太会影响蛋白质功能。优选地，本文使用的突变体和野生型氨基酸或核酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％的总体序列的一致性。

如下所解释的，其他PT多肽和OsPT8具有相同的序列同源性并且对应于OsPT8上部位S517进行操作的残基可以通过序列比较和排列轻易地识别这些同系物。这在识别单子叶植株的同源PT多肽序列并且突出OsPT8上部位S517以及同源序列上的等效/对应丝氨酸残基的保守磷酸化作用位点的附图6示出。

根据本发明的不同方面，OsPT8多肽的同系物，性能按照递增顺序，和SEQ ID No.2代表的氨基酸具有至少25％,26％,27％,28％,29％,30％,31％,32％,33％,34％,35％,36％,37％,38％,39％,40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％的整体序列一致性。优选地，整体序列一致性为90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％。在另一个实施例中，OsPT8核酸序列的同系物具有，性能按照递增顺序，和SEQ ID No.1或3代表的氨基酸具有至少25％,26％,27％,28％,29％,30％,31％,32％,33％,34％,35％,36％,37％,38％,39％,40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％的整体序列一致性。优选地，整体序列一致性为90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％。整体序列一致性利用所属领域熟知的球形对准算法而确定，例如项目GAP(GCG威斯康星，材料科学软件)里的里德曼.温斯算法。附图6显示了这种氨基酸序列的非限制性示例。因而，直接同源可从附图6显示的SEQ ID NO.5,7,9,11,13,15 1,17,19,21,23,25,27,29,31,32,33,34,35,36,37,38或小麦的SEQ No.40中选择。可使用于转换的的单子叶物种的的核酸在如SEQID NOs:4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28及30或SEQ ID NO:9所示对应的丝氨酸位置有突变。也包括在内的是和同源氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％的整体序列一致性的这些同系物序列的。

优选地，OsPT8同系物具有下述保守基序，例如“EXE”-ER离开基序以及基序“SLEE”(OsPT8的512-515aa，酪蛋白激酶II目标位点)和邻近“SLE” OsPT8上的丝氨酸517。

合适的同系物可通过保守结构域的序列对比和识别而识别。同系物的功能可如本文描述的得以识别并且当所述功能在植株中表达时，技术人员由此能够确认它。因此所属领域的技术人员可认识到以上列出的关于SEQ ID No.2的类似氨基酸取代可通过排列利用如前所述，SEQ ID No.2的OsPT8多肽序列产生突变的OsPT8多肽序列的其他植株的PT制作。

作为非限制性示例，相似于/对应于或等效于如前所述，SEQ ID No.2的OsPT8的氨基酸取代S517的PT中的氨基酸取代可通过排列OsPT8(SEQ ID No.2)的氨基酸序列和来自其他植株PT的氨基酸序列以及像排列OsPT8的氨基酸部位S517一样识别来自其他单子叶植株种类的对应于OsPT8的部位S517而确认。这在附图6中显示。

例如，根据本发明不同方面，通过重组方法，可以在所述植株中表达编码突变PT的核酸，所述突变PT为植株中内生PT肽的突变体版本。例如，本发明一实施例的转基因植株中，转基因植株为表达核酸结构的水稻植株，所述核酸结构包括编码如SEQ ID No.2所示的突变PT多肽的核酸序列但包括在部位S517上用非磷酸酸化残基取代S的氨基酸取代。在另一个示例中，转基因植株为表达核酸结构的转基因小麦植株，所述核酸结构包括编码如SEQID No.2所示的突变小麦OsPT8同系多肽的核酸序列但具有在等效于OsPT8的S517的部位上用非磷酸化残基取代丝氨酸残基的氨基酸取代。在另一示例中，转基因植株为为表达核酸结构的转基因玉米植株，所述核酸结构包括编码如SEQ ID No.2所示的突变玉米OsPT8同系多肽的核酸序列但具有在等效于OsPT8的S517的部位上用非磷酸化残基取代丝氨酸残基的氨基酸取代。在另一个示例中，转基因植株为表达核酸结构的转基因大麦植株，所述核酸结构包括编码如SEQ ID No.2所示的突变大麦OsPT8同系多肽的核酸序列但具有在等效于OsPT8的S517的部位上用非磷酸化残基取代丝氨酸残基的氨基酸取代。

在另一实施例中，一种植株的PT肽突变版本的突变PT可通过重组方法在如本文所定义的第二物种外生表达。优选地，PT是单子叶植株PT并且表达它的植株也是单子叶植株。例如，OsPT8可在另一种单子叶农作物表达。

根据本发明不同方面，单子叶植株，例如，可从棕榈科、石蒜科、乔本科或禾本科家系选择。例如，植株可为乔谷类农作物。乔谷类农作物可从小麦、大米、大麦、玉米、燕麦、高粱、黑麦、小米、荞麦、草坪草、意大利黑麦草、甘蔗、或羊茅属的物种、或作物如洋葱、韭菜、山药、菠萝和香蕉中选择。这个列表是非限制性的并且其他单子叶植株也在本发明不同方面和实施例的范围内。

本发明不同方面的一个实施例中，PT多肽可包括附加的修饰。在另一个实施例中，多肽没有包括进一步的修饰。

本发明转基因植株的一个实施例中，植株可表达附加的转基因。

根据本发明的不同方面，包括本文描述的方法，植株和用途，在转基因植株中表达的核酸结构可包括调控序列。术语“调控元素”、“调控序列”和“对照序列”在本文中可互换使用并且在广阔环境中指能够影响其所连接的序列表达的调控核酸结构。这样的序列在所属领域是熟知的。

调控序列可为启动子。术语“启动子”通常指的是位于自基因转录起点上游的核酸调控序列，所述核酸调控序列参与到RNA聚合酶和其他蛋白质的辨别与结合，由此指向有效地连接于核酸的转录。术语“调控元素”也包括给予，活化或加强细胞，组织或器官内核酸分子表达的合成融合分子或衍生物。进一步地，术语“调控元素”包括下游转录终止子序列。转录终止子是转录期间标记基因组DNA的基因或操纵子末端的核酸序列的一部分。结构中使用的转录终止子以表达植株基因是所属领域熟知的。

在一个实施例中，本文所描述的结构具有启动子和终止子序列。

“植株启动子”包括调控元素，它会调整植株细胞中编码序列片段的表达。因此，植株启动子不用来自植株，但可能来自病毒或微生物，例如来自入侵植株细胞的病毒。“植株启动子”也可来自植株细胞，例如来自利用本文描述核酸序列转化的植株。这也适用于其他“植株”调控信号，例如“植株”终止子。对本发明方面有用的PT核酸序列上游的启动子可通过一个或多个核苷酸取代，插入和/或删除而修饰，而不干扰启动子，开放阅读框架(OFR)或诸如终止子的3，-调控区域或其他远离ORF的3，-调控区域的功能或活性。此外，也有可能启动子的活性通过修饰它们的序列而增强，或者它们通过更加有活性的启动子甚至来自异源的启动子而完全取代。如上所述，对于植株的表达，核酸分子，有利地有效地连接或包括合适的启动子，所述启动子及时在正确的点以所需的空间表达模式表达基因。本文使用的术语“有效连接”指的是启动子序列和目的基因之间的功能性连接，这样启动子序列能够启动目的转录。

用来表达植株中植株基因的许多启动子是所属领域熟知的。下面为非限制性列表，技术人员可以进一步选择所属领域熟知的实施例。

“组成型启动子”指的是在至少一个细胞，组织或器官内在大多数，但不一定是所有生长和发育期间并且在大多数环境条件下具有转录活性的启动子。组成型启动子的示例包括但不限于肌动蛋白、HMGP(高移动组蛋白质)、CaMV(花椰菜花叶病毒)19S、GOS(低聚糖)2、水稻亲环蛋白，玉米H3组蛋白、苜蓿H3组蛋白、34SFMV、二磷酸核酮羧化酶小亚基、OCS(羰基硫)、SAD1、SAD2、nos(一氧化氮合酶)、V-ATPase(V-腺苷三磷酸酶)，超强启动子，G-box蛋白质和合成启动子。

“强启动子”指的是导致基因增加或过表达的启动子。强启动子的示例包括，但不限于CaMV-35S、CaMV-35Somega、拟南芥泛素UBQ1、大米泛素、肌动蛋白或玉米乙醇脱氢酶1启动子(Adh-1)。本文使用的术语“表达增强”或“过表达”意指任何形式的表达，其相对于例如野生型的对照表达水平是附加的。在本发明不同方面的一个实施例中，启动子是CaMV(花椰菜花叶病毒)-35S。

在另一个实施例中，调控序列是诱导性启动子，应力诱导型启动子或组织特异性启动子。应力诱导型启动子从下述非限制性列表选择：HaHB1启动子、RD29A(它驱动DREB1A的干旱诱导表达)、玉米rabl7干旱诱导启动子、P5CS1(它驱动脯氨酸生物合成酶P5CS1的干旱诱导表达)、ABA-和拟南芥进化枝A PP2Cs(ABI1,ABI2,HAB1,PP2CA,HAI1,HAI2和HAI3)或它们对应的农作物直系同源物的干旱诱导启动子。

启动子也可具有组织特异性。

在一个实施例中，启动子为组成型或强启动子，例如CaMV(花椰菜花叶病毒)-35S。

如上所述，本发明也涉及通过表达本文所描述的突变PT核酸提高产率的方法。本发明因而涉及提高转基因植株产率的方法，所述方法包括引入和表达编码突变植株PT多肽的核酸的核酸结构，所述突变植株PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。其中，所述植株不是拟南芥。因而，植株可为双子叶植株，而非拟南芥。

本发明也涉及提高转基因单子叶植株产率的方法，所述方法包括引入和表达编码突变植株PT多肽的核酸的核酸结构，所述突变植株PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。在一个实施例中，核酸编码如SEQ ID No.2显示的多肽但是其中SEQ ID No.2部位517上的丝氨酸被替换了。在另一个实施例中，核酸编码SEQ IDNo.2同系物的多肽并且包括SEQ ID No.2部位517的等效位置上的丝氨酸取代。在一个实施例中，核酸编码如SEQ ID No.2所示的多肽但其中SEQ ID No.2部位517上的丝氨酸被取代并且植株为水稻。

本发明也涉及增加转基因植株的Pi摄取量的方法，所述方法包括引入和表达编码突变植株PT多肽的核酸的核酸结构，所述突变植株PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。其中所述植株不是拟南芥。因而，所述植株可为双子叶植株，不是拟南芥。

本发明也涉及增加转基因单子叶植株的Pi摄取量的方法，所述方法包括引入和表达编码突变植株PT多肽的核酸的核酸结构，所述突变植株PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。在一个实施例中，核酸编码如SEQ ID No.2所示的多肽但其中SEQ ID No.2的部位517上的丝氨酸被取代了。在另一个实施例中，核酸编码是SEQ ID No.2同系物的多肽并且包括等效于SEQ ID No.2部位517的位置上丝氨酸的取代。在另一个实施例中，核酸编码SEQ ID No.2所示的多肽但其中SEQ ID No.2的部位517上的丝氨酸被取代并且植株是水稻。

本发明也涉及增加转基因植株的Pi利用效率的方法，所述方法包括引入和表达编码突变植株PT多肽的核酸的核酸结构，所述突变植株PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。其中所述植株不是拟南芥。因而，所述植株可为双子叶植株，不是拟南芥。

本发明也涉及增加转基因单子叶植株的Pi利用效率的方法，所述方法包括引入和表达编码突变植株PT多肽的核酸的核酸结构，所述突变植株PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。在一个实施例中，核酸编码如SEQ ID No.2所示的多肽但SEQ ID No.2的部位517的丝氨酸被取代了。在另一个实施例中，核酸编码是SEQID No.2同系物的多肽并且包括SEQ ID No.2部位517等效位置上丝氨酸的取代。在一个实施例中，核酸编码SEQ ID No.2所示的多肽但其中SEQ ID No.2的部位517上的丝氨酸被取代并且植株是水稻。

优选地，上述方法中的丝氨酸残基的修饰为用非磷酸化残基的取代，例如A。

在以上描述方法中的一个实施例中，核酸结构包括一个或多个下述描述的调控序列。它可为35S启动子。

如上所描述的，根据这些方法，通过重组方法，可以在所述植株中表达编码突变PT多肽的改性内生核酸，所述突变PT多肽为植株中内生PT多肽的突变体版本。例如，一个示例中所述方法包括在水稻中表达核酸结构，所述核酸结构包括编码如SEQ ID NO.2所示的突变PT多肽的核酸序列但包括在部位S517的氨基酸取代。在另一个示例中，所述方法包括在小麦中表达核酸结构，所述核酸结构包括编码突变体小麦OsPT8同系多肽的核酸序列，所述突变体小麦OsPT8同系多肽包括在小麦OsPT8的部位S517等效位置上的丝氨酸残基的氨基酸取代。在另一个示例中，所述方法包括在玉米中表达核酸结构，所述核酸结构包括编码突变体玉米OsPT8同系多肽的核酸序列，所述突变体玉米OsPT8同系多肽包括在玉米OsPT8的部位S517等效位置上的丝氨酸残基的氨基酸取代。在另一个实施例中，所述方法包括在大麦中表达核酸结构，所述核酸结构包括编码突变体大麦OsPT8同系多肽的核酸序列，所述突变体大麦OsPT8同系多肽包括在大麦OsPT8的部位S517等效位置上的丝氨酸残基的氨基酸取代。

在另一个实施例中，一种植株中的PT肽的突变体版本的突变PT可通过重组方法如本文所描述的另一种物种的第二植株外生表达。优选地，PT为单子叶PT并且表达它的植株也是单子叶植株。例如，OsPT8也可在另一种单子叶农作物中表达。

以上描述本发明的方法也可选地包括为植株筛选和选择包括如上和对照植株类似的多核苷酸结构的步骤。优选地，根据本文所描述的方法，子代植株得到稳定转化并且包括转基因作为植株细胞内维持的DNA片段可遗传的多核苷酸并且方法可包括确认所述结构得到稳定整合的步骤。方法也可包括从被选择子代植株中收集种子的附加步骤。进一步的步骤包括评估和/或测量产率和/或Pi摄取量。

在一个实施例中，在土壤低Pi条件下产率和Pi摄取量提高。

磷是土壤中最难得到的必需元素之一。植株仅仅能吸收无机Pi。土壤中可利用的Pi受多种因素影响，特别是决定Pi溶解度的土壤pH，但也可是所有可紧密结合Pi诸如二氧化硅，铁和铝的矿物。其他因素，诸如在家禽粪便发现的和来自于食物中的植物材料的植酸水平，因为植酸盐可结合磷酸盐，但是这样对于根部的摄取是无效的。在土壤中自由Pi的水平自2uM以下到10uM的范围内变化。人们通常认为少于10uM的土壤Pi水平为低Pi。这些水平比植株组织的Pi水平更低。Pi水平在植株细胞区室-通常是细胞质内80-80um和胞器内2-8mM以及液泡内多达35-75mM(参见Raghothama)。

全球农业的大片区域，诸如美国东部、东南亚、中欧和东欧、中非和其他具有土壤酸度和其他极度结合Pi的因素的区域。化肥使用量的FAO数据广泛指示全球农业的不同施用方式，从像安哥拉和乌干达的每公顷2kg，46kg/Ha(澳大利亚)，120kg/Ha(美国)，217kg/Ha(巴基斯坦)，251kg/Ha(英国)到1,272Kh/Ha(新西兰)。

定义Pi的水平时，即使在更高Pi水平的土壤内，每年都会考虑施用的Pi肥。例如，在特定地区/农作物内农民正常施用的只有50-60％Pi肥水平的应用会被视为农作物生长的低Pi状况。

因而，如本文所使用的，农作物生长的低Pi条件可被定义为少于10uM的Pi水平。低Pi条件也可被定义为在特定地区/农作物农民正常施用50-60％的Pi肥水平的情况。

本发明也涉及编码突变植株PT多肽的分离核酸，所述突变PT多肽包括如在SEQ IDNo.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体或同源于SEQ IDNo.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰，其中所述植株为单子叶植株，其中所述植株为单子叶植株。SEQ ID No.2的同系物定义如在本文的其他位置中所述。

修饰优选为具有非磷酸化残基的丝氨酸残基取代，所述非磷酸化残基在那个位置提供非磷酸化的多肽。

在一个实施例中，分离的突变核酸为cDNA。例如，分离的突变核酸为对应于SEQ IDNo.3的cDNA，但其编码S517的密码子上具有突变。在另一个实施例中，分离的突变核酸为对应于SEQ ID No.4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30或39的cDNA，但是其在编码等效于SEQ ID No.2的部位S517上的氨基酸的密码子上具有突变。

在一个实施例中，分离的突变核酸编码基本上如SEQ ID No.2所示的多肽，然而其中SEQ ID No.2的部位S517的丝氨酸被取代。分离的野生型核酸在SEQ ID No.1显示，但是构成本部分发明的突变核酸在编码OsPT8的517上的丝氨酸的密码子或等效密码子上包括一个或多个核酸的取代。

本发明也延伸到包括以上所述分离的突变核酸的载体。载体可包括指向调控核酸的一个或多个调控序列。术语调控序列定义在本文的其他位置。在一个实施例中，调控序列是35S启动子。

本发明也涉及由以上所述突变核酸或载体转换的分离宿主细胞。宿主细胞可为细菌细胞，诸如根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens，或分离植株细胞，其中所述植株不是拟南芥并且优选为本文定义的单子叶植株细胞。在一个实施例中，植株细胞为水稻细胞，其充分表达编码如SEQ ID NO.2显示的多肽的分离的突变核酸，但是其中SEQ ID NO.2部位517的丝氨酸被取代。

本发明也涉及培养基或包括培养基和如本文所述的分离宿主细胞的试剂盒。

本发明也涉及利用如上所述的核酸或载体增加植株产率的用途，优选单子叶植株。在一个实施例中，核酸编码SEQ ID NO.2显示的多肽，但是其中SEQ ID NO.2部位517的丝氨酸被另一种氨基酸取代。在一个实施例中，核酸编码SEQ ID NO.2显示的多肽，但是其中SEQ ID NO.2部位517的丝氨酸被取代并且植株是水稻。在另一个实施例中，核酸为SEQID NO.2的同系物，优选为来自单子叶植株，但是其中等效于SEQ ID NO.2部位517的位置的丝氨酸被另一种非磷酸化氨基酸取代。

上述的核酸或载体用来生成转基因植株，特别是本文描述的利用所述领域熟知的转化方法转基因植株。因而，根究本发明的不同方面，包括编码本文所描述的突变核酸的序列的核酸被引入植株并且表达为转基因。核酸序列通过称为转化的过程引入所述植株。术语“引入”或“转化”在本文指的是不考虑使用转移的方法完成外生多核苷酸转移到宿主细胞。能够进行随后克隆繁殖的植株组织，无论是器官发生还是胚胎形成，可利用本发明的基因结构和由此再生的整棵植株转换。选择的特定组织会根据有效的并且最好适合转换的特定物种克隆繁殖系统而变化。示例组织目标包括叶圆盘、花粉、胚胎、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存的分生组织(例如顶端分生组织、腋窝芽和根分生组织)以及诱发型分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可瞬时或稳定地引入宿主细胞并且维持非整合，例如质粒。可选地，它可整合到宿主基因组。然后所得转换植株细胞可以所属领域技术人员熟知的方式用来再生转化的植株。

外源基因到植株基因组的转移称为转换。植株的转换现在是许多物种的常规技术。有利地，任何一个转换方法可用来将目标基因引入合适的原始细胞。所描述的来自植株组织或植株细胞转换和再生的方法可用作瞬时或稳定转换。转换方法包括使用增加自有DNA摄取，直接将DNA注入植株、基因枪射击法、利用病毒或花粉的转换以及显微注射法的脂质体、电穿孔和化学物质。方法可选自于原生质体、原生质体的电穿孔、显微注射到植株物料的钙/聚乙二醇方法、DNA或RNA-包覆粒子轰击阀、病毒注射(非整合的)以及类似方法。转基因植株，包括转基因农作物，优选借助根癌农杆菌通过转转换生成。

生成的转换植株可通过不同方式，例如通过克隆繁殖或典型的繁殖技术来繁殖。例如，第一代(或T1)转换植株可为自花受精以及选择的同型结合的第二代(或T2)的转换子，T2植株进一步可通过典型繁殖技术繁殖。再生转换器官可采取不同形式。例如，它们可能为转换细胞的嵌合体以及非转换细胞；克隆转换子(例如所有转换的以包括表达组件的细胞)；转换的和非转换组织的移植(例如在植株中，嫁接到未转换接穗的已转换根茎)。

为了选择转换植株，转换中获得的植株物料，通常来说，要经历筛选条件，这样转换植株可和非转换植株区别开来。例如，可种植从上述方式获得的种子，并且在初期生长阶段后，通过喷涂法经历合理选择。进一步的可能性是生长种子，如果消毒后合适的话，在琼脂植株上使用合理筛选剂，这样只有转换种子能够长成植株。可选地，转换植株以的存在可选标记来筛选。DNA转换和再生之后，推定转换植株也用来被评估，例如利用Southern分析目标基因的存在，拷贝数和/或基因组组织。可选地或附加地，新引入DNA的表达水平可利用Northern和/或Western分析得以监控，两种技术都是所述领域技术人员所熟知的。

本发明也涉及生产产率增加的转基因单子叶植株的方法，包括将以上描述的核酸或载体引入和表达到植株中，其中所述植株不是拟南芥。优选地，所述植株是本文其他位置所描述的单子叶植株。在一个实施例中，核酸编码SEQ ID NO.2显示的多肽，但是其中SEQID NO.2部位517的丝氨酸被另一种氨基酸取代。在一个实施例中，核酸编码SEQ ID NO.2显示的多肽但是其中SEQ ID NO.2部位517的丝氨酸被取代并且植株为水稻。在另一个实施例中，核酸为SEQ ID NO.2的同系物，但是其中SEQ ID NO.2部位517的丝氨酸被另一种氨基酸取代。

本文所用的术语“植株”包括所有植株，植株的祖系体和子代以及植株部位，包括种子/谷物、果实、芽、茎，叶子、根(包括块茎)、花以及组织和器官，其中每个以上所描述的包括目标基因/氨基酸。术语“植株”也包括植株细胞、悬浮培养、愈伤组织、胚胎、分生区、孢子、孢子体、花粉和小孢子，再次地，其中每个以上所描述的包括目标基因/核酸。

除非另有所指，本文所描述的本发明的不同方面清楚地延伸到任何植株细胞或任何通过本文描述方法产生，得到或可得到的植株，以及延伸到它们的所有植株部位和繁殖体。例如，以上描述的特定方面，水稻明确地被排除。本发明进一步延伸到包括初阶转换或转染细胞，组织，器官或通过任何以上描述方法生长的整棵植株的子代，唯一的要求为如根据本发明的方法产生的亲代以及子代显示相同基因型和/或表型特征。

本发明也延伸到如上描述的本发明植株可收获部分例如，但不限于种子/谷物、叶子、果实、花、茎、根、根茎、块茎和鳞茎。本发明进一步涉及从这种植株的可收获部分中获得，优选为直接获得的产品，例如干颗粒或粉、油、脂肪和脂肪酸、面粉、淀粉或蛋白质。本发明也涉及包括本发明植株或它们部分的食品和食品补充剂。

本发明的一些方面明确放弃拟南芥。因而，本发明的转基因植株不包括拟南芥。在另一个实施例中，本发明的一些方面明确放弃双子叶植株。例如，本发明转基因植株的一个实施例中，这些都排除双子叶植株。也如上所述的，本发明的优选方法，包括转基因植株，方法以及用途，涉及单子叶植株。

本发明的其他方面，由于植株在参考SEQ ID 2的S517或在SEQ ID 2同系物等效位置的丝氨酸发生点突变而提高产率，其可通过随机突变发生而产生。在这些植株中，内生PT目标基因突变了并且SEQ ID 2的部位517的S或在SEQ ID 2同系物等效位置的丝氨酸由非磷酸化的氨基酸残基取代。根据突变发生的方法，方法包括筛选具有突变的突变体用以识别在目标位置以及可选地筛选产率增加和Pi摄取增加或筛选突变体以识别在目标位置具有突变的突变体的随后步骤，然后筛选突变体以识别在目标位置具有突变的突变体。

在筛选步骤中识别出来的植株被分离并且繁殖。

突变发生所用的合适技术是所述领域熟知的并且包括定向诱导基因组局部突变(TILIING)。TILIING为致使特殊目标基因的非-GMO(转基因)来源突变的高通量筛选技术。所属领域的技术人会员也会理解TILIING允许高通量识别目标基因的突变而不产生基因被修饰的器官并且在可能不会自己给予强表型的特定基因内识别突变可为有效方式，它可用来产生人们希望并且导致产率和Pi摄取量变化的突变，由此允许识别有利表型的非转基因植株。

在一个实施例中，用来产生和分析突变的方法为指向基因组内诱变局部病变。用这种方法，种子用化学诱变剂进行诱变处理。诱变剂可为快中子辐射或化学诱变剂，例如选自下述非限制性列表：乙基甲磺酸盐(EMS)、甲基甲磺酸盐(MMS),N-乙基-N-亚硝基脲(ENU),三乙胺三聚氰胺,M-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、甲基苄肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体,美法仑,氮芥、长春新碱、二甲基亚硝胺,N-甲基-N–硝基-亚硝基胍(MNNG)、亚硝基胍,2-氨基嘌呤,7，12二甲基-苯并蒽(DMBA),环氧乙烷,六甲基磷酰胺,二甲磺酸丁酯,双脱氧链烷烃(二环氧辛烷(DEO),双环氧丁烷(BEB)等),2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯乙基)氨丙基氨]吖啶盐酸盐(ICR-170)或甲醛。另一种方法是CRISP-Cas(19.20)。

所得M1植株为自花受精并且个体的M2代是用来为突变筛选准备DNA样品。DNA样品在微量滴定盘上合并和排列并且接收基因特异性PCR。PCR扩增产物可利用识别野生型和突变型之间的异源双股核酸分子的任何方法筛选PT目标基因的突变。例如，可以使用变性高压液相色谱法(dHPLC)、恒定变性剂毛细管电泳(CDCE)、温度梯度毛细管电泳(TGCE)或利用化学切割的破碎。优选地，PCR扩增产物利用优先切割野生型和突变型之间不匹配的异源双股核酸分子的核酸内切酶而培养。切割产品利用自动测序凝胶装置进行电泳，并且在标准商业影像-处理程序帮助下进行分析。任何对PT基因特异的引物可用来放大合并DNA样品内的PT基因。优选地，引物设计为放大有用基因最有可能产生，特别是在高度保守和/或给予活性的PT基因区域。为了促进凝胶上的PCR产品的检测，PCR引物可利用任何常规标记方法而标记。

和对应的非突变发生的野生型植株相比，快速高通量筛选步骤因而允许扩增产物分析以识别给予产率增加的突变，特别是在低Pi条件下，Pi摄取增加。关于SEQ2的S517到非磷酸化残基发生突变，例如A，或同系于SEQ ID No.2的序列等效位置上的丝氨酸在目标PT基因上识别，携带这种突变的M2植株的种子长成成年M3植株并且可选地被筛选和PT基因相关的表型特征。这样就可以识别具有产率增加和Pi使用率增加的突变体。

如上所述生产或识别的植株可有性或无性繁殖或生长后代或子代。植株的后代或子代从一个或多个细胞再生可有性或无性繁殖或生长而再生。所述植株或其后代或子代可和其他植株或自身杂交。

因而，本发明涉及生产具有一个或多个产率增加，Pi摄取量增加和Pi利用率增加的突变体的方法，包括：将植株群体暴露于诱变剂并且识别在参考SEQ ID No.2的部位517的丝氨酸或同系于SEQ ID No.2的序列等效位置上的丝氨酸被非磷酸化残基取代的突变植物。

本方法使用分析从所述暴露于诱变剂的植株种群的DBA样品的步骤以识别上述突变。附加的步骤可包括：确定突变植株的产率以及和对照植株比较所述产率，确定突变植株以及和对照植株比较的所述产率，确定突变植株的Pi利用率以及和对照植株比较的所述产率。产率，Pi摄取量和Pi利用率优选为在低Pi条件下评估。进一步的步骤包括有性或无性繁殖植株，所述植株如上所述生长或识别，以生成子代或后代。

在优选实施例中，本文定义的植株为单子叶植株，例如水稻。

如果所述植株不是拟南芥，通过这种方法获得或可获得的并且在内生PT位点携带功能性突变的植株也在本发明的范围之内。在优选的实施例中，如本文所定义的，所述植株为单子叶植株，例如水稻。

因而，本发明也涉及在PT基因上发生突变的突变植株，其中所述突变PT基因编码突变PT多肽，所述突变PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰，所述突变植株是非转基因的并且通过诱变生成。所述植株不是拟南芥。在优选实施例中，如本文定义的，所述植株为单子叶植株，例如水稻。

修饰优选为用非磷酸化氨基酸残基取代丝氨酸残基。

虽然前述事项公开提供了包括于发明范围之内的标的物的大致描述，包括方法以及制备和使用这个发明的最好模式，提供下述示例用来以进一步使得所述领域的技术人员实施这个发明并且提供它完全书面的描述。但是，所属领域的技术人员可以理解的是，这些实施例的细节不应被看做是对本发明以及从权利要求和附加到这个公开的其等同物可理解的范围的限制。本发明不同的进一步方面和实施例可参见本公开会对所述领域的技术人员显而易见。

本说明书提及的所有文件，明确地包括任何序列Id/注录/版本编号全部通过引用并入本文。

本文应用的“和/或”视为两个含有或不含有其一的特定特征或组件的特定公开。例如“A和/或B”视为(i)A，(ii)B和(iii)A和B的特定公开，就像每个在本文中单独使用。

除非上下文另有规定，如上陈述的特征的描述和定义不限于本发明任何特定方面或实施例并且同样应用于所描述的所有方面和实施例。

本发明以下述非限制性示例进一步描述。

示例

材料和方法

植株材料和生长条件。作为具有CK2α3和CKβ3基因沉默的野生型水稻和转基因植株水稻栽培品系(粳稻，粳稻：NIP和修水134：XS134)在具有12h白天(30℃)/12h夜晚(22℃)光周期，大约200μmol m^-2s^-1光子密度以及大约60％的湿度的温室里的营养液培育生长。除非另有所指，具有充足Pi和低Pi处理的植株通过将其分别在200,50和20μM NaH₂PO₄中生长而制备。烟草植株(本氏烟)为如前所述(21)的生长室内培育。田间试验在浙江省长欣镇的浙江大学农业试验站的低P土壤地块进行。

水稻根部cDNA信息库建设和分散泛素膜酵母双杂交筛选系统。总体RNA生长在正常水载溶液中利用RNA试剂提取盒(德国快而精公司，希尔登，德国)生长的14天大的种子根部而制备。分离RNA利用RNase-free Dnase(无核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶)(德国快而精公司，希尔登，德国)处理并且送到双机系统生物技术(瑞士)做DUALhunter信息库建设服务。简单地说，反转录生成的第一股cDNA通过定量PCR利用两个标记基因(OsActin和OsGAPDH)标准化和确认。然后，标准化的第一股cDNA挑选出尺寸并且分隔成两个标准化集合体以最大化大小片段的显示。第二股cDNA单独在两个尺寸集合体上生成并且定向地整合到两个可变的SfiI位点之间的捕获载体pPR3-N内。

最后，获得2.9×106独立克隆的水稻cDNA信息库的标准化根部。在PT8-蛋白质和自由LexA-VP16通过泛素特异蛋白酶相互作用的情况下，LexA-VP16进入细胞核并且和LexA-结合位点相互作用，导致ADE2,HIS3报告基因转录的活化。为了最小化产生于LexA-VP16的非特异性释放导致组氨酸选择遗漏以及致使HIS3报告基因活化的背景，我们转染信息库cDNAs到上述整合酵母细胞系并且在亮氨酸-色氨酸-组氨酸-腺嘌呤的具有7.5mM的3-氨基三唑的脱落选择盘中做选择，3-氨基三唑是参与组氨酸生物合成的咪唑甘油磷酸酯脱水酶的竞争性抑制剂。结果，我们识别了多个编码全长酪蛋白激酶beta亚组蛋白质的独立cDNAs。为了证实这个尝试，pBT3-STE-PT2/8和阳性捕获质粒转染回到NMY51。两个载体的共同表达导致酵母在包括7.5或甚至10mM 3-AT于选择盘(亮氨酸-色氨酸-组氨酸-腺嘌呤)上生长，但不是阴性对照。因而，在包括7.5mM 3-氨基咪唑的选择盘上的阳性克隆归因于在PT2/8和酪蛋白激酶beta亚组之间的联系。酵母分隔泛素化化验。编码全长的OsPT2和OsPT8(PT2/8)以及4个CK2亚组:α2,α3,β1和β3的cDNA片段分别利用引物PT2-pBT3-STE-U/L和CK2α2/α3/β1/β3-pPR3-N-U/L通过RT-PCR而获得，被SfiI消化后被插入pBT3-STE或pPR3-N(DUAL膜，纹影，瑞士)以产生PT2/8-pBT3-STE和CK2α2/α3/β1/β3-pPR3-N。利用PT8A-P1/2/3/4和PT8D-P1/2/3/4产生全长PT8的S517A或S517D突变，同时PHF1利用引物PHF1-pBT3-N-U/L通过PT-PCR放大，然后包括突变体和野生型PHF1的全长PT8片段被克隆到pPR3-STE和pBT3-N载体以分别产生PT8S517A/S517D-pPR3-STE和PHF-pBT3-N质粒。

免疫共沉淀化验。PT8-CT内编码PT2&PT8(28/36aa)和S517A或S517D突变的C-端(CT)胜肽的cDNA片段被插入pCAMBIA1300-GFP(绿色荧光蛋白)载体(22)以产生和GFP(绿色荧光蛋白)的融合。全长CK2α3/β3 cDNA插入到pF3ZPY122(23)以产生CK2α3/β3-pF3ZPY122质粒。CK2β3编码区域和PHF1的NH2终点(PHF1的WD40亲水区域的编码序列)利用BP反应(生命科学技术，达姆施塔特，德国)克隆到pDONR201质粒之内。在这个阶段，进行DNA序列分析。CK2β3和PHF1的N终端从pDONR201质粒转换到pC-TAPα载体(24)的利用网关反应而进行。表达载体被引入到土壤杆菌属菌种EHA105。如前所述质粒的个体组合共渗透到烟草(本氏烟)叶子并且生长3天。蛋白质提取和共免疫沉淀如所描述的(25)进行。免疫沉淀反应产物煮沸5分钟并且利用电泳通过12％丙烯酰胺凝胶而分离，目标蛋白质利用特异性标签抗体(奥德里奇，密苏里，美国)通过印迹而检测到。

酵母三杂交试验。编码PT2&8-CT,CK2β3的cDNA片段插入到pBridge载体(Clontech，CA，美国)以产生分别具有GAL4DNA结合区域或Met(蛋氨酸)启动子的融合。CK2α3插入到pGADT7载体(Clontech，CA，美国)以产生pGAD-CK2α3以起到Y3H试验捕获的作用。得到的结构载体共转化到酵母菌株AH109并且在缺少亮氨酸，蛋氨酸和色氨酸或亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸和组氨酸的脱落基质上进行选择。

水稻原生质体细胞PT2/8蛋白质的亚细胞定位。水稻原生质体和原生质体瞬变转换的分离如前所述(4)。PT2&8内野生型(粳稻)和模拟非磷酸化的(S512A或S517A)突变通过引物利用PT2&8-pPR3-STE质粒作为模板而产生，所有释放的片段插入pCAMBIA1300-GFP(绿色荧光蛋白)载体以产生和GFP(绿色荧光蛋白)的融合。全长CK2α2/α3/β1/β3片段被克隆到pCAMBIA35S-1300(22)以产生35S-CK2α2/α3/β1/β3质粒或插入到pCAMBIA1300-GFP(绿色荧光蛋白)载体以产生35S-CK2α2/α3/β1/β3-GFP(绿色荧光蛋白)。在蔡司LSM Axiovert 710激光扫描显微镜上进行观察。原物在63x物镜下观察。

转基因植株的生长。在PT8的ATG前利用2679bp序列通过替换CAMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子在从pCAMBIA1300-PT8-GFP(绿色荧光蛋白)获得的天然启动子的控制下的编码PT8S517–GFP(绿色荧光蛋白)和PT8S517A–GFP(绿色荧光蛋白)的质粒。对于RNAi结构，CK2α3/β3片段(CK2α3的179到430和CK2β3的517到763)在pCAMBIA35S-1300载体的两个定向上克隆，通过玉米(玉蜀黍)的NIR1的第二内含子形成发夹结构。根据以上描述的方法(26)，双运载体和35S启动子(参见上面)驱动的CK2α3/β3载体被引入到根癌土壤杆菌菌株EHA105并且转变为野生型水稻)(cv.粳稻)。

重组蛋白质表达。编码成熟CK2α3/β3和PT8-CT的片段以及它的等位基因克隆到表达载体pGEX-4T-1(GE医疗保健)。编码CK2α3的片段插入到pET30a载体(默克)以产生pET30-His(组氨酸)-CK2α3质粒。重组载体通过定序识别。重组质粒在E.coli(大肠杆菌)菌株TransB(DE3)(转基因)[F-omp T hsdSB(rB-mB-)galdcmlacY1ahpC(DE3)gor522::Tn10trxB(KanR,TetR)表达，它编码变异的硫氧还蛋白还原酶(trxB)和谷胱甘肽。

因而根据制造商的使用说明(GE医疗保健，NJ，美国)，还原酶(gor)可以提高重组蛋白质的溶解度并且利用在固定化谷胱甘肽上的GST(谷胱甘肽转移酶)-亲和层析，然后利用过量还原型谷胱甘肽的竞争性洗脱而被纯化。

体外磷酸化试验。必须如前所述(27)利用一些修饰进行溶液中体外激酶试验。激酶亚组和基质蛋白质和1x激酶缓冲液(100mM Tris-HCl,pH8.0,5mMDTT,5mM EGTA和5mMMgCl₂)(New England Biolabs，MA，美国)以及1x ATP溶液(100μM ATP和1μCi[γ-32P]ATP)(珀金-埃尔默，马塞诸塞州，美国)以总体积50μL混合。反应在30℃培养30min然后加入5x加样缓冲液终止培养并且煮沸5分钟。产物品利用12％丙烯酰胺凝胶通过电泳而分离，并且凝胶被染色，干燥，然后通过暴露于X-射线胶片而可视化。

体内磷酸化试验。水稻种子(粳稻)和CK2α3-过表达/基因沉默转基因植株生长了7天，然后采收这些种子的根部。如前所述(28)提取膜蛋白，除了激酶排除在提取缓冲液中。如前所述(29)利用一些修饰来对膜片段进行λ-磷酸酶处理。以量为50μL进行处理：来自三个背景的膜片段以总量50μL加入到1xλ-磷酸酶缓冲液并且200单位λ-磷酸酶(奥德里奇,密苏里,美国)，样品在30℃培养30分钟。通过加入5xSDS加样缓冲液(生工，上海，中国)停止反应并且煮沸。样品在10％磷-标记丙烯酰胺凝胶(和光，大阪，日本)中分离并且利用PT8-特异性抗体探测(1:500)。第二个抗体，羊抗-兔免疫球蛋白过氧化物酶(奥德里奇，密苏里，美国)以1：10000使用。利用加强的化学发光进行检测(皮尔斯/热电科学，红圣里昂，德国)。

下拉试验。PHF1N-MYC利用土壤杆菌属通过多虑烟草叶子而合成。对于体外结合，20μL的总烟草蛋白质加入到600μL结合缓冲液[50mM Tris-HCl,pH7.5；150mM NaCl；1mMEDTA(最终)；10％甘油；2mM Na₃VO₄；25mMβ-甘油磷酸盐；10mM NaF；0.05-0.1％Tween20；1x罗氏蛋白酶抑制剂；1mMPMSF]，然后加入具有结合的GST-PT8-CT或其等位基因的50μL谷胱甘肽琼脂糖小球并且在4℃培养3小时。小球利用结合缓冲液清洗三次。结合蛋白利用5xSDS加样缓冲液洗脱并且利用12％SDSPAGE解析。单波段利用特异性标签抗体通过免疫印迹法而检测。商业抗体从奥德里奇公司购得(anti-FLAG M2,1:3,000 WB；anti-GFP(绿色荧光蛋白),1:2500 WB；anti-MYC,1:3000 WB)(圣路易斯，密苏里，美国)，艾比康(反-磷酸丝氨酸，1:250 WB)(剑桥，英国)和GE健康医疗(反-GST,1:5000 WB)(NJ,美国)。

细胞Pi和总P浓度测量。细胞Pi浓度和³³P摄取量分析如前所述(4)进行。组织内的总P浓度如前所述(30)而确定。

PHF1和PT8多克隆抗体的发展。多克隆兔PHF1抗体被升高对抗对应于氨基酸残基375到387(C-KESPPVPEDQNPW-COOH)的PHF1和通过艾比玛特(上海，中国)亲和力纯化的C-终端片段。对于针对OsPT8的抗体，合成肽C-VLQVEIQEEQDKLEQMVT(位置OsPT8的264-281)用来使兔子免疫。在使用前获得的抗血清通过肽亲和柱纯化。

注录编号

密歇根州立大学水稻基因组注释项目数据库基因注录编号

这次工作研究的是LOC_Os09g09000(OsPHF1),LOC_Os03g05640(OsPT2),and LOC_Os10g30790(OsPT8),LOC_Os07g02350(OsCK2α2),LOC_Os03g10940(OsCK2α3),LOC_Os10g41520(OsCK2β1),LOC_Os07g31280(OsCK2β3)。来自国家的蛋白质生物技术信息注录编号为OsPHF1,NP_001059077；OsPT2,NP_001048979；OsPT8,NP_001064708；OsCK2α2,NP_001058752；OsCK2α3,NP_001049325；OsCK2β1,NP_001065415；OsCK2β3,NP_001059693。

结果和讨论

我们鉴定和高亲和力的Pi-运送蛋白PT8(9)相互作用的推定CK2β亚组(7,8)是在筛选酵母菌双杂交系统里的水稻根部cDNA信息库的PT8配偶体。为了确认最初的信息库筛选，我们使用了另一个双杂交系统并且也使用了第二诱饵，PT2，一种对于Pi迁移(10)的低亲和力PT。CK2作为两个起催化作用的α2亚组的四聚物而出现，α2和α3以及两个调控β亚组，水稻中的β1和β3(11)，4个组件的相互作用的酵母双杂交试验表明只有β3和在酵母菌细胞内的PT2&PT8相互作用(图1A)。前述工作显示拟南芥PT在包含两个高度保守丝氨酸氨基酸的亲水羧基末端区磷酸化(3,4)。因此，包括保守丝氨酸残基(PT2的Ser-507和Ser-512以及PT8Ser-512和Ser-517)的PT2&8C-终端(CT)利用共免疫沉淀(co-IP)试验用来在体内进行它们和CK2β3的相互作用分析(图1B)。结果证实了CK2β3和PT存在相互作用。酵母菌三杂交试验和co-IP显示β3和α3形成和PT2&8的CT相互作用的异质二聚体(图1C、D)。这和之前表明CK2β3亚组作为结合其目标的锚形体并且和亚组相互作用以形成杂聚肽全酶(12)一致。

我们检查了过表达CK2α3/β3水稻原生质体中PT2&8的亚细胞定位并且发现PT2&8在ER中保持滞留(图1E)。我们也生成了利用表达RNAi结构的独立转基因植株CK2α3/β3和CK2β3的基因沉默品系以检查Pi积累量的变化。在30天的+P溶液培养(200μM Pi)中生长的独立转基因品系用来测量Pi浓度。基因沉默转基因植株促进过度Pi积累，特别是在大龄叶尖上表现出坏死性症状的RiCK2α3植株。RiCK2α3和RiCK2β3中增加的Pi，还伴随着和野生型(wt)植株(水稻.粳稻cv)相比更高的Pi摄取能力。为了确定CK2α3/β3对PT转运的作用是否是由PT磷酸化导致，我们利用重组GST-CK2α3或GST-CK2β3和GST-PT8-CT蛋白质在体外进行了磷酸化试验。我们也测试了Ser512或Ser-517被Ala(丙氨酸)替换的突变PT8-CT蛋白质(分别特指PT8-CTS512A和PT8-CTS517A)。结果显示PT8-CT通过催化亚基CK2α3但不是体外调控亚组CKβ3被磷酸化。S517而非S512的突变阻止了PT8-CT的磷酸化，这表明PT8的C-终端的S517为CK2α3的磷酸化位点。对于体内试验，蛋白质从wt，CK2α3过表达(Ox CK2α3)和在Pi供应(+P)(200μM)和(-P)缺乏条件下生长CK2α3基因沉默植株(Ri CK2α3)以及免疫印迹法后利用反-PT8抗体显露的PT8中提取。+P上和Ox CK2α3植株中的磷酸化PT8通过其对λ-磷酸酶(λ-PPase)(图2A)以及CK2特异性抑制剂DRB(5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖苯并咪唑)处理显示为利用反-PT8抗体培养的蛋白印迹里缓慢移动带。为了探究CK2α3/β3对PT的作用是如何被Pi状态控制的，我们提取了生长在+P和-P上的35S-CK2α3-FLAG和35S-CK2β3-FLAG转基因植株根部的蛋白质。利用反-FLAG抗体的免疫印迹显示在+P和-P上CK2α3的蛋白质水平没有变化，但+P下的CK2β3的自磷酸化形式显示为通过λ-PPase而证实。相比之下，非磷酸化的P栽培的植株吸收了低水平的CK2β3(图2B)。和这些结果一致，有一个报告显示CK2β自磷酸化调控哺乳动物的稳定性(13)。CK2α3和磷酸化以及非磷酸化CK2β3之间的相互作用的体外下拉试验显示非磷酸化CK2β3显示CK2α3的亲和力降低(图2C)。这样-P负面地影响CK2β3积累和其与CK2α3的相互作用能力。另外，PHF1蛋白质水平在-P极大的增加。这样，CK2β3降低的磷酸化并且PHF1升高会导致PT的ER-离去增强。

因为CK2α3/β3过表达导致PT的ER-保留(图1E)。PT的磷酸化可削弱其和PT和ER-离去辅因子PHF1的相互作用。为了检验检验此现象，我们在酵母菌和整株中进行了PHF1和wt的PT8突变版本之间的相互作用分析，其中Ser-517被Ala(丙氨酸)-517或Asp(天冬氨酸)-517(特定PT8S517A或PT8S517D)取代，其分别代表非磷酸化PT8或模拟磷酸化PT8。结果显示PHF1和wt以及非磷酸化PT8S517A而非和磷酸化模拟的PT8S517D相互作用(图8)。我们利用重组的GST-PT8-CTS517和GST-PT8-CTS517A蛋白质以及CK2α3是否和PHF1-MYC蛋白质共同存在，通过体外下拉试验证实这些发现(图2D)。在这个实验中，通过CK2α3进行PT8-CT的磷酸化通过磷酸丝氨酸抗体(P-ser(14)检测。结果显示利用CK2α3体外磷酸化的PT8没有和PHF1相互作用。

当培养皿中有足够Pi并且PM上的PT蛋白质数量通过内吞作用对裂解液泡(5)进行降解时，大多数PT显示非常有限的数量。为了测试CK2α3/β3是否参与处于PM水平的PT回收/降解过程，我们检查了CK2的活动是否已超过ER。对于这个，我们进行了CK2α3和CK2β3的亚细胞定位研究，利用来自不同区室的标记(ER标记,PHF1(4)；顺式-高尔基体标记,GmMAN1(15)；以及内体标记VPS29(16)或FM4-64(内吞途径的化学染色(5)。这些研究显示CK2α3和CK2β3不仅在ER里定位，这和在高Pi下其ER离去的负控制里的PT磷酸化的调控角色一致，也在顺式高尔基体和内涵体里定位。下一步，我们分析了在Pi-饥饿(-P)和Pi富足(200μM)条件下生长植株的根部表皮里PM的PT8S517-GFP(绿色荧光蛋白)(wt PT8)和PT8S517A–GFP(绿色荧光蛋白)(非磷酸化的PT8)的稳定性。结果显示在+P条件下PM的非磷酸化相较于wtPT8蛋白质具有清晰的稳定性(图3A)。利用反-PT8抗体的免疫印迹用来检测提取自转基因植株根部的PM-浓缩蛋白质的PT8水平，所述转基因植株采收在不同Pi水平下生长的wtPT8(PT8S517-1)或非磷酸化PT8(PT8S517A-1)的单拷贝。结果显示PT8S517A比PM的PT8S517显著地积累了更高的水平。PT8S517A积累在Pi方案(从200到10μM)的广大范围内相当稳定，并且wtPT8积累对Pi浓度敏感(图5)。从这些结果中，我们提出了CK2α3/β3全酶作为控制ER路径和响应于Pi状态PT回收/降解过程的关键参与者的运作模型(图3B)。

为了确定PT8的非磷酸化形式是否可增强植株的Pi获取，野生型(wt)(XS134，高产率粳稻品种)和具有wtPT8或突变体PT8S517的单拷贝的两个独立转基因株系(T2)用在具有不同Pi水平(200,50和10μM)的水培试验。

结果显示具有在高Pi水平(200μM)下非磷酸化PT8S517A的转基因植株的大龄叶子具有过量芽Pi积累和Pi中毒症状。和高(200μM)以及中等(50μM)Pi水平下的wt植株相比，表达wtPT8的转基因植株根部Pi浓度也显著增加，但其比PT8S517A植株具有更低的程度。但是，和wt以及PT8S517植株相比，在更低Pi水平(10μM)，仅表达非磷酸化PT8S517A的转基因植株显示显著更高的Pi获取能力和更好的生长(图4A-D)。在田间，植株在土壤溶液中没有面对这样非常高水平的Pi。人们希望在农业中，植株最好从非磷酸化PT蛋白质中获益。为了进行此测试，我们利用XS134和具有PT8S517A两个独立株系在没有施用P肥的低P土壤中进行了试验。和XS134相比，田间试验显示在三个随机安排重复中的PT8S517A植株具有显著增加的产率(图4E和F)。从三个复制采收的平均谷物产率比XS134植株高大约40％。三个PT8S517A植株也显示显著更高的秸秆干重以及根部P和Zn浓度。繁殖可从土壤储藏或肥料来源有效获取P的农作物可从了解给予加强摄取本文所示的这种营养物的机制而受益。实际上，我们利用了我们对PT活性的磷酸化控制以发展有效获取Pi的水稻的知识。最近在整株中高效点位定向的诱变方法的发展，诸如基于CRISP-Cas(19,20)，使得在其他农作物利用这种策略可行，就像其在PT基因中必须要改变单个密码子一样。

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Claims (39)

1.一种表达核酸结构的转基因单子叶植株，所述核酸结构包括编码突变PT多肽的核酸序列，所述突变PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ IDNo.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。

2.根据权利要求1所述的转基因单子叶植株，其中所述修饰为丝氨酸残基的取代。

3.一种根据权利要求2所述的转基因单子叶植株，其中所述取代是用丙氨酸。

4.一种根据前述权利要求中任一的转基因单子叶植株，其中所述植株选自于水稻、小麦、大麦、高粱和玉米。

5.一种根据前述权利要求中任一的转基因单子叶植株，其中所述突变PT多肽为SEQ IDNo.2的同系物并且在对应位置上包含氨基酸修饰。

6.一种根据权利要求5所述的转基因单子叶植株，其中所述同系物序列具有和SEQ IDNo.2至少80％,至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％的一致性。

7.一种根据前述权利要求的转基因单子叶植株，其中所述变体或同源序列为单子叶植株PT。

8.一种根据权利要求1到3中任一的转基因单子叶植株，其中所述突变PT多肽包括SEQID No.2但其中在SEQ ID No.2部位517的丝氨酸被取代。

9.一种根据权利要求8所述的转基因单子叶植株，其中所述植株为水稻。

10.一种根据前述权利要求的转基因单子叶植株，其中所述核酸结构进一步包括调控序列。

11.一种根据权利要求1到10中任一项定义的植株或它们的一部分衍生的产品。

12.一种编码突变植株PT多肽的分离核酸，所述突变PT多肽包括如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰，其中所述植株为单子叶植株。

13.一种根据权利要求12所述的分离核酸，其中所述修饰为氨基酸的取代。

14.一种根据权利要求13所述的分离核酸，其中所述取代是用丙氨酸。

15.一种根据权利要求12到14中任一的分离核酸，其中所述突变PT多肽为SEQ ID No.2的同系物并且包括如在对应于SEQ ID No.2所示的部位S517的位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。

16.一种根据权利要求15所述的分离核酸，其中所述同系物序列具有和SEQ ID No.2至少80％,至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％的一致性。

17.一种根据权利要求12到16中任一的分离核酸，其中所述同系物选自于从小麦、大麦、高粱和玉米。

18.一种根据权利要求12的分离核酸，其编码基本上如SEQ ID No.2所示的多肽，然而其中SEQ ID No.2的部位S517的丝氨酸被取代。

19.一种包括根据权利要求12到18中任一项的分离核酸的载体。

20.一种根据权利要求19的载体，进一步包括调控序列。

21.一种根据权利要求20的载体，其中所述调控序列为组成型启动子、强启动子、诱导型启动子、应力诱导型启动子或组织特异性启动子。

22.一种根据权利要求20的载体，其中所述调控序列为CaMV35S启动子。

23.一种包括根据权利要求12到18任一项的核酸或根据权利要求19到22任一项的载体的宿主细胞。

24.一种根据权利要求23的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌或单子叶植株细胞。

25.一种增加转基因植株产率的方法，包括将根据权利要求12到18任一项的核酸或根据权利要求19到22任一项的载体引入和表达到植株中。

26.一种根据权利要求25的增加产率的方法，其中产率在低Pi条件下增加。

27.一种增加转基因植株的Pi摄取量或锌水平的方法，包括将根据权利要求12到18任一项的核酸或根据权利要求19到22任一项的载体引入和表达到植株。

28.一种根据权利要求27的增加Pi摄取量的方法，其中Pi摄取量在低Pi条件下增加。

29.一种增加转基因植株的Pi利用效率的方法，包括将根据权利要求12到18任一项的核酸或根据权利要求19到22任一项的载体引入和表达到植株中。

30.一种根据权利要求30的增加Pi利用效率的方法，其中Pi利用效率在低Pi条件下增加。

31.一种根据权利要求25到30任一项的方法，其中所述植株为单子叶植株。

32.一种生产产率增加的转基因植株的方法，包括将根据权利要求12到18任一项的核酸或根据权利要求19到22任一项的载体引入和表达到植株中。

33.一种通过根据权利要求32的方法获得的或可获得的的单子叶植株。

34.一种根据权利要求31或33的单子叶植株，其中所述植株选自于水稻、小麦、大麦、高粱和玉米。

35.一种将根据权利要求12到19任一项的核酸或根据权利要求19到23任一项的载体用于增加产率的用途。

36.一种生产产率增加的植株的方法，包括以下步骤：

a)将植株种群暴露于诱变剂；以及

b)识别突变植株，所述植株在参考SEQ ID No.2的517位置上的丝氨酸或同源于SEQ IDNo.2序列的对应位置上的丝氨酸被非磷酸化残基取代。

37.一种根据权利要求36的方法，包括有性或无性繁殖或生长在低磷酸盐条件下Pi摄取量增加以及产率增加的植株子代。

38.一种通过根据权利要求36到37的方法获得的或可获得的的植株，其中所述植株不是拟南芥。

39.一种在PT基因上发生突变的突变体单子叶植株，其中所述突变PT基因编码突变PT多肽，所述突变PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ IDNo.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰，所述植株通过诱变生成。