CN101294160A - 水稻OsPT6:1基因编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体为一种水稻OsPT6:1基因编码序列及其应用。本发明提供的水稻OsPT6:1其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。将该水稻基因OsPT6:1的核苷酸序列转入酵母细胞，可提高酵母在低磷下对磷酸盐吸收的应用，进而能相应的提高植物的耐受低磷营养的能力。本发明还涉及包含上述基因的重组表达载体，以及将所说的表达载体同源重组转化的酵母细胞的方法。

Description

水稻OsPT6:1基因编码序列及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，具体涉及一种从水稻中克隆出高亲和磷酸盐转运蛋白基因(水稻高亲和磷酸盐转运蛋白，high affinity phosphate transporter，OsPT6:1)以及拷贝数分析，基因表达模式分析，酵母表达载体的构建，电击转化，同源重组细胞的获得以及相应的生理生化特性的鉴定。

背景技术

土壤缺磷是世界范围内普遍存在的问题。据统计，全世界有43％的耕地存在不同程度的缺磷问题，我国有2/3的耕地缺磷(刘建中等，1994)。因此土壤缺磷是我国及世界农业生产中限制作物产量的一个重要因子，提高缺磷土壤中作物生产力的研究工作倍受关注。

解决这一问题主要从两方面着手：一是提高土壤的磷素含量，二是提高植物自身吸收磷的能力。提高耕地土壤磷素含量的目的，主要通过施加磷肥来实现。但是，我国磷矿资源并不丰富；磷肥施入土壤后易被石灰性土壤中钙盐及酸性土壤中的铁、铝氢氧化物固定或被土壤胶体吸附转化为难溶性磷，并不易于植物吸收(张福锁等，1993)，磷利用效率很低；；增加磷肥施入量，还可能造成江河湖泊富营养化、环境污染加重等弊端。提高植物自身吸收磷的能力，主要就是利用生物学的方法，挖掘作物高效吸收利用土壤磷素的遗传潜力、培育适应低磷胁迫的作物品种。农业可持续发展要求高效益、低投入、少污染，因此这是提高缺磷土壤中作物生产力的经济有效的途径之一。

水稻是我国乃至世界的主要粮食作物，水稻产量占粮食总产的44％(1987年数据)(李庆逵，1989)。我国水稻耕地主要分布于秦岭-淮河一线以南、青藏高原以东的长江流域和华南地区，其面积约占全国水稻土的93％；但是这些地区多为酸性和微酸性土壤，土壤中磷素形态主要是磷酸铁，此种形态的磷难于被作物吸收。水稻土磷肥短缺的现状，大大限制了水稻产量，因而改善水稻磷营养特性，对于提高水稻产量意义重大。

本发明研究了一种从水稻中获得编码磷酸盐转运蛋白的cDNA，研究该基因的表达模式及初步功能，明确该基因在植物耐低磷反应中的具体作用，通过同源重组技术可以提高酵母突变体对磷素的吸收能力，可以使植物在低磷环境下正常生长，扩大植物(如水稻)等的栽培范围。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的水稻OsPT6:1序列及其核酸序列。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的水稻基因OsPT6:1，该基因是一个高亲和磷酸盐转运蛋白基因。

本发明的另一目的是提供这种水稻蛋白OsPT6:1编码序列在利用同源重组技术提高酵母磷酸盐吸收，以及在改良植物对低磷耐受性方面的应用。

本发明一方面提供一种新的水稻基因，是一种具有特定序列的DNA分子，其编码水稻高亲和磷酸盐转运蛋白的开放阅读框，具体见SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

本发明的另一方面还提供由上述基因翻译出的蛋白质分子，是一种上述序列编码的具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。

本发明还提供了一种利用同源重组技术将编码具有水稻OsPT6:1活性的核苷酸序列转化入酵母细胞以提高磷酸盐吸收的方法，其步骤如下：

(1)将水稻OsPT6:1基因的开放读框可操作地连接于酵母表达调控序列，形成含有水稻OsPT6:1基因(SEQ ID NO.1的核苷酸序列)的表达载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体通过电击法转入酵母；

(3)通过抗生素筛选，PCR鉴定，获得水稻OsPT6:1基因的转化细胞。含有水稻OsPT6:1基因的酵母磷酸盐吸收能力有较大程度的提高。

本发明还提供了一种检测样品中水稻高亲和磷酸盐转运蛋白拷贝数的方法，它包括用SEQ ID NO.1所示序列与样品杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是水稻基因组DNA，经限制性内切酶酶切后的核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于检测OsPT6:1基因在水稻原植株组织中表达分布状况的方法。取小块组织材料，经多聚甲醛处理和梯度脱水，包埋于石蜡组织中。实验检测时取复水和蛋白酶K处理过的切片与事先制备的DNA探针分子在杂交液中混合杂交，显色后观察拍照。而杂交使用的DNA探针分子为包含于OsPT6:1基因的某特异区段的DNA序列。

本发明的水稻OsPT6:1蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，在转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离到有关序列。表1为本发明的水稻OsPT6:1基因编码的蛋白质序列与拟南芥(AtPT1)、菌根菌(GvPT)、酵母(PHO84)、水稻(OsPT11)和粗糙脉孢菌(PHO-5)氨基酸序列同源性比较(相同氨基酸序列以“^*”表示；阴影序列为N-糖基化位点；加框序列为酪蛋白激酶II作用位点；加框+阴影为蛋白激酶C作用位点；罗马数字I～XII为12个跨膜区。)

附图说明

图1水稻OsPT6:1基因的Southern blot鉴定。其中1-3分别为5μg基因组DNA经EcoR I、Hin dIII和Dra I酶切图片右侧为λ-EcoT14 I digest marker。结果表明为目的基因多拷贝存在于水稻基因组中。

图2OsPT6:1基因在正常与缺磷处理下根系与叶片的原位杂交结果(a)缺磷处理叶片的反义(A)探针和正义(B)探针的杂交信号；正常培养下叶片的反义(C)探针和正义(D)探针的杂交信号；(b)缺磷处理根系的反义(E)探针和正义(F)探针的杂交信号；正常培养下根系的反义(G)探针和正义(H)探针的杂交信号.Ep(epidermis)示表皮；en(endodermis)示内皮；mp(mesophyll cells)示叶肉细胞；xp(xylem parenchyma)示木质部；vb(vascular bundle)示维管束；st(stele)示中柱。原位杂交结果显示，缺磷处理5天，OsPT6:1在叶片中的表达信号主要集中在叶肉细胞、维管束和木质部薄壁组织细胞中；在正常磷素供给下，仅表达在木质部薄壁组织细胞中。对于根系，缺磷处理下表达信号多集中在表皮与皮层，而在正常培养下，微弱的表达信号出现。

图3OsPT6:1在酵母SMD1168中表达吸收磷素的Km值分析◆为空载体pPIC9K，■为pPIC9K-OsPT6:1，单位为μmol/(min.g细胞)；1/v是磷素吸收最大速度的倒数，1/S是磷素浓度的倒数单位为L.mmol^-1。重组目的基因的酵母细胞Km降低近三分之一；最大吸收速率由原来的3.09μmol/(min.g细胞)增加至3.70μmol/(min.g细胞)，均说明目的基因的同源重组有利于酵母细胞对低磷的吸收。

图4高亲和力磷酸盐突变体MB192的功能互补实验MB192为只含有载体的菌株，而MB192-OsPT6:1为含有目的基因的菌株.两菌株等份加入含有0.02，0.06，0.1，1mmol/LPi培养液中，培养后观察。结果显示，突变体MB192细胞(表达载体)只有在Pi浓度＞60μmol/L生长良好，具有酸性反应；而在20和60μmol/L Pi细胞生长显著受抑，无酸性反应。而表达含有OsPT6:1的细胞可以在20μmol/L Pi的培养基上生长良好，具有酸性反应。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

水稻OsPT6:1基因的克隆

1.取温室(25℃)生长的水稻叶片(两叶一心期)立即置于液氮中冷冻保存，应该注意到本实验所选取的材料与选用的水稻品种没有必然的联系。

2.DNA的提取

取部分组织，用研钵研碎，加入盛有预热的裂解液的50ml离心管，65℃保温40min，离心。上清中加入RNaseA(0.5μg/ml)，65℃消化RNA 1h；以等体积的酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽一次蛋白，以乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤两遍，最后用TE溶液溶解DNA。用0.8％琼脂糖凝胶检测DNA的质量。

3.全长基因的克隆

根据其他植物PT同源序列设计简并引物，采用RT-PCR方法从水稻cDNA中扩增出一条1.6kb左右的条带。将PCR产物回收，连接到T-载体上，用SP6和T7做为通用引物进行测序。将测序结果提交至NCBI非冗余数据库，BLAST结果表明该序列和其他物种中相应的柠檬酸合酶序列高度保守。

实施例2

水稻OsPT6:1基因的序列信息与同源性分析

本发明新的获得一个编码水稻磷酸盐转运蛋白全基因OsPT6:1，全长为1634个碱基(GenBank No.AF335588)，详细序列见SEQ ID NO.1。ORFs为1605个碱基，5′与3′区分别具有20个和9个非编码区，该基因编码的多肽由535个氨基酸残基组成。相对分子质量为57663.33道尔顿，等电点为8.564，详细序列见SEQ ID NO.2。OsPT6:1具有明显的12个跨膜区，序列中具有高亲和力磷酸盐转运蛋白的保守区域，如位于244-246位置的蛋白激酶C作用部位(TAR)、位于424-427序列的N端糖基化部位(NSTT)与位于512-515位置的酪蛋白激酶II部位(SLEE)。

将水稻OsPT6:1全长基因的编码区序列及其编码的蛋白质序列用BLAST程序再Non-redundant GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GeneBank CDS translations+PDB+SwissPort+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检测，结果发现它与拟南芥(AtPT1)、菌根菌(GvPT)、酵母(PHO84)、水稻(OsPT11)和粗糙脉孢菌(PHO-5)氨基酸序列同源性很高(见表1)。由上可见，该OsPT6:1基因与拟南芥、菌根菌、酵母的PT基因存在较高的同源性，可以认为在功能上也有很高的相似性。

BLAST的结果表明从水稻中得到的基因可能为高亲和力磷酸盐转运蛋白编码基因。已知的高亲和力磷酸盐转运蛋白能够在低磷营养下表达，转入植物中能提高植物对磷素的吸收与转运功能，同时提高低磷耐受能力，故推测此基因具有相同的功能。

实施例3

水稻OsPT6:1基因的拷贝数分析

以CTAB方法大量抽提水稻基因组DNA，取10μg DNA分别用Dra I、EcoR I和HindIII酶切，以0.8％琼脂糖凝胶进行片段分离，将DNA转到Hybond-N⁺尼龙膜上，固定；以水稻OsPT6:1基因为探针进行Southern杂交。

实施例4

水稻OsPT6:1基因表达模式分析

正常与磷素处理5天后，分别取水稻幼苗(二叶一心期)的叶片和根，经石蜡切片，杂交，显色。原位方法如下：

1取得较小的组织材料，以4％的多聚甲醛固定12小时。再以乙醇梯度脱水，包埋于石蜡块当中。

2将载玻片和盖玻片浸于铬酸洗液中2天，然后蒸馏水漂洗。再以多聚赖氨酸(PLL，1mg/ml)浸泡或涂片，37℃或42℃烘干备用。

3特异性探针分子为OsPT6:1的ORF 1579～1605和3′UTR部分片段基因3’末端非转录区域一段特异的DNA序列。

4石蜡样品切片后脱腊，复水并以蛋白酶消化组织蛋白。经预杂交后与事先变性处理的探针分子在杂交液中50℃共浴16h。

5杂交后，以血清封闭探针，利用特异性抗体与杂交上的探针分子结合，并予染色。

6水溶性封片剂封片，显微观察并照相。

实施例5

水稻OsPT6:1基因在酵母细胞中进行真核表达及磷素吸收的评价

含目的基因的载体构建与酵母的同源重组

以目的基因的cDNA为模板，经EcoR I-Sma I酶切后将目的片段插入pEGFP-N2(Clontech)。然后再经EcoR I和Not I酶切后分别插入到酵母表达载体pIC9K和p112A1NE中，通过酵母同源重组方法分别将目的质粒pIC9K-OsPT6:1-GFP和p112A1NE-OsPT6:1-GFP整合到毕氏酵母SMD1168和突变体MB192(高亲和力磷酸盐转运蛋白缺陷型)菌株中。通过含G418(200mg/L)YEPD培养基进行筛选并经基因组的PCR鉴定后获得了转入目的基因的毕氏酵母SMD1168的阳性菌落，突变体同源重组的阳性菌落的获得则通过含低磷的YEPD培养基进行筛选.磷素吸收研究中，以只含有载体pIC9k的SMD1168菌株为对照。对于突变体的功能互补实验，则以含有p112A1NE的MB192为对照。

Km与最大吸收速率

对含有目的基因的SMB1168阳性菌落和仅含有载体的SMB1168菌落同时进行培养至生长对数期，离心后用无磷无菌水洗涤3次以上，然后等份地悬浮培养到分别含20，40，100，200，400和500μmol/L磷素的YEPD培养液中，培养0.5h后沉淀细胞，取上清液测定磷素。磷含量测定为标准的钒钼黄染色方法，计算Km与最大吸收速率。

突变体功能互补实验

分别将MB192和MB192-OsPT6:1菌株同时进行培养，对数生长期的转化子等份添加到含有不同磷浓度(20，60，100和1000μmol/L)的YNB液体培养基中，以溴甲酚紫作为pH指示剂，进行颜色观察，即颜色由深红转变成黄色为酸化反应。结果显示，表达含有OsPT6:1的酵母细胞可以在20μmol/L Pi的培养基上生长良好，具有酸性反应。根据功能互补实验，OsPT6:1介导了酵母细胞膜高亲和力磷酸盐转运蛋白吸收磷素的功能。

表1

水稻OsPT6:1基因编码的蛋白质序列与拟南芥(AtPT1)、菌根菌(GvPT)、酵母(PHO84)、水稻(OsPT11)和粗糙脉孢菌(PHO-5)氨基酸序列同源性比较

PHO-5    ---------MAKK------------------------------GKEVLNALDAAKTQMYHFTAIVIAGMGFFTDAYDL

AtPT1    ---------MAEQ------------------------------QLGVLKALDVAKTQLYHFTAIVIAGMGFFTDAYDL

OrLPT1   ----MGGGGGEQQ------------------------------QLEVLHALDVAKTQWYHFTAIVVAGMGFFTDAYDL

OsPT11   -----MADADGGS------------------------------NLAVLDALDSARTQMYHMKAIVIAGMGFFTDAYDL

PHO84    MSSVNKDTIHVAERSLHKEHLTEGGNMAFHNHLNDFAHIEDPLERRRLALESIDDEGFGWQQVKTISIAGVGFLTDSYDI

GvPT     MSTSDRVTIDVDK--------------------------------RRAALKEIDDAKFGWQHIRACLVAGTGFFMDAYDL

                                                         .*. :*      :. :   :**** :* :**:

                                   II                            III

PHO-5    FSISLVTKLLGRIYYHVDSSK--KPGTLPPNVAAAVNGVAFCGTLAGQLFFGWLGDKLGRKKVYGITLMLMVLCSLGSGL

AtPT1    FCVSLVTKLLGRIYYFNPESA--KPGSLPPHVAAAVNGVALCGTLSGQLFFGWLGDKLGRKKVYGLTLVMMILCSVASGL

OrLPT1   FCISLVTKLLGRIYYRVDGSP--SPGTLPPHVSASVNGVAFVGTLSGQLFFGWLGDKLGRKRVYGITLMLMVLCSLASAL

OsPT11   FCISTVSKLLGRLYYQPDGSTDSKPGALSKTANNMVIGVALVGTLMGQLVFGYFGDKLGRKRVYGVTLILMAACAIGSGL

PHO84    FAINLGITMMSYVYWH---------GSMPGPSQTLLKVSTSVGTVIGQFGFGTLADIVGRKRIYGMELIIMIVCTILQTT

GvPT     FAVNFASTMIGYVYYG---------GKTPANIDLGLKVTGSIGTLLGQLFFGYLADRLGRKRMYGVELMIIIVATVASAL

         *.:.   .::. :*:          *  .    :        **: **: ** :.* :***::**: *:::  .:: .

                          IV                                          V

PHO-5    SFGH---------SANGVMATLCFFRFWLGFGIGGDYPLSATIMSEYANKKTRGAFIAAVFAMQGFGILAGGIVSLIVSS

AtPT1    SFGH---------EAKGVMTTLCFFRFWLGFGIGGDYPLSATIMSEYANKKTRGAFIAAVFAMQGVGILAGGFVALAVSS

OrLPT1    SFGH---------TPTSVMATLCFLRFWLGFGIGGDYPLSATIMSEYANKKTRGAFIAAVFAMQGFGIITGGLVAILVSA

OsPT11    SFGS---------SRKAVIGTLCFFRFWLGFGIGGDYPLSATIMSEYSNKKTRGAFIAAVFAMQGVGIIFAGLVSMIVSS

PHO84     VAHSPAINFVAHSPAINFVAVLTFYRIVMGIGIGGDYPLSSIITSEFATTKWRGAIMGAVFANQAWGQISGGIIALILVA

GvPT      SGES---------RAVTVVGTIMFWRVIMGVGIGGDYPLSAIITSEFATKKRRGAMMASVFAMQGFGILGSAIVALAVLA

                            .:.: * *. :*.*********: * **::..* ***::.:*** *. * : ..:::: : :

                                   VI

          :                     *  ***::  *:. .   *:*  .:**:.**   :  . : *:    .  .

PHO-5    EEEAQSNSNS------------SNPNFTFGLFTREFARR-HGLHLLGTTTTWFLLDIAYYSSNLFQKDIYTAIGWIPAA

                                 VII

AtPT1    EERVEDDVK---------------DPKQNYGLFSKEFLRR-HGLHLLGTTSTWFLLDIAFYSQNLFQKDIFSAIGWIPKA

OrLPT1   EMRNIGNNG---------------GSRRPFGLFSGEFVRR-HGLHLVGTSATWLLLDIAFYSQNLFQKDIFSAVGWIPKA

OsPT11   EQEKLAKFN---------------AAN-NYPLLSMEFARR-HGLHLIGTTTTWFLLDIAFYSQNLTQKDIFPAMGLISGA

PHO84    TSDEDMAINGLERASTAVESLDNHPPKASFKDFCRHFGQWKYGKILLGTAGYWFTLDVAFYGLSLNSAVILQTIGYAGSK

GvPT     VNEDDTNTG------NHVG-----VPKASWSDFVSYFGKWSNGKVLLGTSMSWFALDIAFYGIGLNNGIILSAIGYSETH

                                 . .  :  :   * :   *  *:**:  *: **:*:*. .* .  *  ::*

 VIIIIXX

PHO-5    ET---MNAIHEVFTVSKAQTLIALCGTVPGYWFTVAFIDILGRFFIQLMGFIFMTIFMFALAIPYDHWRHR-ENRIGFLI

AtPT1    AT---MNATHEVFRIARAQTLIALCSTVPGYWFTVAFIDTIGRFKIQLNGFFMMTVFMFAIAFPYNHWIKP-ENRIGFVV

OrLPT1   AT---MSALEELFRIARAQTLIALCGTVPGYWFTVALIDVVGPFQDPAVGFFMMTLFMLTLALPYHHWTAPGKNHVGFLL

OsPT11   AE---VNALTEMFQISKASFLVALLGTFPGYWVTVALIDKMGRYMIQLIGFFMMSMFMLAMGILYDYLKTH---HFLFGL

PHO84    N------VYKKLYDTAVGNLILICAGSLPGYWVSVFTVDIIGRKPIQLAGFIILTALFCVIGFAYHKLGDH-----GLLA

GvPT     EADLNLRAYNSLKNMAVGNIIITIMGTAPGYWVTAALVDSWGRKPIQLMGFGVLTALFIVMGAAFNPLKEHS--IPAFII

                .  .:   : ..::   .: ****.:.   :* *       ** .:: :: .:.  :.           :

                                                XI

PHO-5    MYSLTMFFANFGP

FVVPAEIFPARLRSTCHGISAASGKAGAIVGAFGFLYAAQSSDSEKTDAGYPPGIGVRNSLLM

AtPT1    MYSLTFFFANFGP

FIVPAEIFPARLRSTCHGISAAAGKAGAIVGAFGFLYAAQSQDKAKVDAGYPPGIGVKNSLIM

OrLPT1   LYGLTFFFANFGP

FIVPAEIFPARLRATCHGISAASGKLGAIVGSFGFLYLAQSPDRSKTEHGYPPGIGVRNSLFL

OsPT11   LYALTFFFANFGPFVLPAELFPTRVRSTCHAISAAAGKAGAIVAAFGIQKLTYN---SQVKS-------IKKALII

PHO84    LYVICQFFQNFGP

FIVPGECFPTRYRSTAHGISAASGKVGAIIAQTALGTLIDHN-CARDGK--PTNCWLPHVMEI

GvPT     LFTLLQFFQNFGP

FIVPGEVFPTRYRSTGHGISAASGKLGAIVAQVGFSKLKDIG-GS--------NAFVGPLLLI

         :: :  ** *****:***::*.* **:* *:* *.****:** ***:.  .:                     :   : :

            XII

PHO84   FALFMLLGIFTTLLIPETKRKTLEEINELYHDEIDPATLN FRNKNNDIESSSPSQLQHEA--------------

GvPT    FSAWMFIGGLFSILIPETKGLSLEELANEEH------TYD VEERKERIKADA----------------------

        :.   ::* . ::*:**.   :***:

序列表

本发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：1634bp(ORF 21-1625)

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链-

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：核酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

1    cggattcaaa ttaagctggc atgggcggcg gcggcgggga gcagcagcag cttgaggtgc

61   tccacgccct ggacgtggcc aagacgcaat ggtaccattt cacggccatc gtggtggccg

121  gaatggggtt cttcaccgac gcctatgacc tcttctgcat ctccctcgtc accaagctgc

181  tgggccgcat ctactaccgc gtcgacgggt ccccgtcccc cggcacgctc cccccgcacg

241  tctccgcctc cgtcaacggc gtggccttcg tgggcacgct ctcagggcaa ctcttctttg

301  gctggctggg cgacaagctc ggccgtaagc gcgtctatgg catcaccctc atgctcatgg

361  tgctctgctc cctcgcctcc gcgctctcct ttggccacac cccgacctcc gtcatggcca

421  ccctctgctt cctccgcttc tggctcggct tcggcatcgg cggcgactac ccgctctccg

481  ccaccatcat gtccgagtac gccaacaaga agacgcgtgg cgccttcatc gccgccgtct

541  tcgcgatgca gggcttcggc atcatcaccg gcggcctcgt cgccatcctc gtctccgcct

601  ccttcagggc cgccttcccg gcgcctccct acggcgagga ccccgtggcc tccacgccgc

661  cgcaggccga cttcgtgtgg aggatcatac tcatgctggg cgcgctgccg gcggcgctca

721  cctactactg gcgcaccaag atgcccgaga cggcgcgcta cacggcgctc gtggccaaca

781  acgccaagca ggccgcggcc gacatgtcca aggtgctgca ggtggtggag atgcgtaata

841  ttggtaataa tggtggcagc aggaggccgt tcgggctgtt ctccggcgag tttgtccggc

901  ggcacgggct gcacctggtg ggcacgtcgg cgacgtggtt gctgctggac attgcgttct

961  acagccagaa cctgttccag aaggacatat tcagcgcggt ggggtggatc cccaaggcgg

1021 cgacgatgag cgcgctggag gagctgttcc gcatcgcgcg ggcgcagacg ctgatcgcgc

1081 tgtgcgggac ggtgcccggc tactggttca ccgtcgcgct catcgacgtg gtgggcccgt

1141 ttcaagatcc agccgttggc ttcttcatga tgaccctctt catgctcacc ctcgccctgc

1201 cgtaccacca ctggacggcg ccggggaaga accacgtcgg cttcctgctg ctctacggcc

1261 tcaccttctt cttcgccaac ttcggcccca actccaccac cttcatcgtg ccggcggaga

1321 ttttcccggc gcggctgcgg gccacgtgcc acggcatctc ggcggcgtcg gggaagctgg

1381 gcgccatcgt cggatccttc gggttcctgt acctggcgca gagccccgac cggagcaaga

1441 cggagcacgg gtaccctccg ggcatcggcg tccgcaactc gctcttcctg ctcgccgcct

1501 gcaacctgct gggcctgctc ttcaccttcc tcgtgccgga gtccaagggg aagtcgctgg

1561 aggagatgtc cggcgacgcc gaggcccagg aggaggcgcc gccgcccctg caaactgtac

1621 tgtagcgctg tcgc

(2)SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：534氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

1   MGGGGGEQQQ LEVLHALDVA KTQWYHFTAI VVAGMGFFTD AYDLFCISLV

51  TKLLGRIYYR VDGSPSPGTL PPHVSASVNG VAFVGTLSGQ LFFGWLGDKL

101 GRKRVYGITL MLMVLCSLAS ALSFGHTPTS VMATLCFLRF WLGFGIGGDY

151 PLSATIMSEY ANKKTRGAFI AAVFAMQGFG IITGGLVAIL VSASFRAAFP

201 APPYGEDPVA STPPQADFVW RIILMLGALP AALTYYWRTK MPETARYTAL

251 VANNAKQAAA DMSKVLQVVE MRNIGNNGGS RRPFGLFSGE FVRRHGLHLV

301 GTSATWLLLD IAFYSQNLFQ KDIFSAVGWI PKAATMSALE ELFRIARAQT

351 LIALCGTVPG YWFTVALIDV VGPFQDPAVG FFMMTLFMLT LALPYHHWTA

401 PGKNHVGFLL LYGLTFFFAN FGPNSTTFIV PAEIFPARLR ATCHGISAAS

451 GKLGAIVGSF GFLYLAQSPD RSKTEHGYPP GIGVRNSLFL LAACNLLGLL

501 FTFLVPESKG KSLEEMSGDA EAQEEAPPPL QTVL

Claims (4)

1.一种分离出的水稻OsPT6:1基因，其特征在于编码具有高亲和磷酸盐转运蛋白活性的开放读框，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.一种编码如权利要求1所述的水稻OsPT6:1基因的蛋白质分子，其特征在于具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。

3.一种将如权利要求1所述的水稻OsPT6:1基因活性的核苷酸序列转入酵母细胞提高磷酸盐吸收的方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)将水稻OsPT6:1基因的开放读框可操作的连接于酵母表达调控序列，形成含有水稻OsPT6:1基因的表达的载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体通过电击法转入酵母细胞；

(3)通过抗生素筛选，PCR鉴定，获得水稻OsPT6:1基因的转化细胞，转化细胞的磷酸盐吸收能力有提高。

4.一种用于检测样品中水稻OsPT6:1基因拷贝数的方法，其特征在于它包括用SEQ IDNO.1所示序列作为探针与样品杂交，然后检测探针是否发生了结合；该样品是水稻基因组DNA，经限制性内切酶酶切后的核苷酸序列。

Images