CN105555797A

CN105555797A - 包含ABA受体的突变体Pyrabactin样(PYL4)调节组件的转基因植物

Info

Publication number: CN105555797A
Application number: CN201480039261.2A
Authority: CN
Inventors: 佩德罗·路易斯·罗德里格斯·埃赫亚
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Politecnica de Valencia
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Politecnica de Valencia
Priority date: 2013-05-13
Filing date: 2014-05-13
Publication date: 2016-05-04
Also published as: CA2911623A1; US20160068860A1; BR112015028410A2; WO2014184193A2; WO2014184193A3; AU2014267394A1; EP2997038A2

Abstract

本发明涉及用于操纵ABA信号传导通路的方法和具有改善的胁迫耐受性的转基因植物。

Description

包含ABA受体的突变体Pyrabactin样(PYL4)调节组件的转基因植物

发明领域

本发明涉及具有改善的表型特征(包括增强的胁迫耐受性)的转基因植物。所述改善的特征由增强的ABA受体信号传导赋予。相关的方法、用途、分离的核酸和载体构建体也在本发明的范围之内。

介绍

持续增长的世界人口和日益缩小的可用于农业的耕地供应刺激对增加农业效率的研究。常规的作物和园艺改进措施使用选择育种技术来鉴定具有合乎需要的特征的植株。然而，所述选择育种技术具有一些缺点，即，这些技术典型地是劳动力密集的，并且产生通常含有异源遗传成分的植株，所述异源遗传成分可能不是总是产生从母本植株传下来的合乎需要的特征。分子生物学的进展已经允许人类改良动物和植物的种质。植物遗传工程需要分离和处理遗传物质(典型地以DNA或RNA的形式)以及随后将所述遗传物质引入到植物中。备选地，可以使用方法来以靶向方式改良或改变或“编辑”现有的遗传物质，仅改变编码的蛋白的一个或几个氨基酸，例如，使用诱变或CRISPR技术。此种技术具有产生具有多种改进的经济、农艺或园艺特征的作物或植株的能力。特别有经济利益的特征是生长和胁迫耐受性，原因在于这些是最终的作物产量的决定因素。

植物通过改变其生长来适应变化的环境条件。植物生长和发育是一种复杂的过程，涉及多种环境和内源性信号的综合，所述环境和内源性信号与固有的遗传程序一起决定植物形式。该过程所涉及的因素包括一些统称为植物激素(planthormone或phytohormone)的生长调节剂。该组包括生长素(auxin)，细胞分裂素(cytokinin)，赤霉素(gibberellin，GA)，脱落酸(ABA)，乙烯，油菜素甾类(brassinosteroids，BR)和茉莉酸(jasmonicacid，JA)，它们中的每一种以低浓度起作用调节植物生长和发育的多个方面。非生物性和生物性胁迫可能不利地影响植物生长，导致显著的农业损失。甚至中等的胁迫都可能对植物生长具有显著的不利影响，并且由此减少农业重要性作物植物的产量。在任意给定的季节或地区，作物非常常见地经历中等胁迫期或一种或另一种胁迫，这限制该作物的生产力。因此，找到改善生长，特别是在胁迫条件下的生长的方式具有巨大的经济利益。

ABA在植物生物性和非生物性胁迫反应中都起至关重要的作用(Cutler等人，2010)。由于公认ABA是植物针对水胁迫反应的至关重要的激素调节剂，因此ABA生物合成和信号传导通路都可以被认为是改善植物在干旱下的表现的潜在靶标。因此，已经证明，与野生型相比，产生高水平ABA的转基因植物表现出改善的干旱下生长(Iuchi等人，2001；Qin&Zeevaart2002)。ABA生物合成的引发可以通过直接过表达9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(生物合成途径中的一种关键酶)(Iuchi等人，2001；Qin&Zeevaart2002)或通过使用加快ABA累积的化学剂(Jakab等人，2005)而获得。另一方面，表现出增强的ABA反应和耐旱性表型的影响ABA信号转导的拟南芥(Arabidopsis)突变体(era1、abh1、pp2c联合突变体)的一些实例也是已知的(Pei等人，1998；Hugouvieux等人，2001；Saez等人，2006)。例如，在拟南芥中已经通过组合失活2C型蛋白磷酸酶(PP2C)ABI1和HAB1实现脱落酸敏感性增强和水消耗减少，产生耐旱性植物(Saez等人，2006)。

通过最近发现的PYR/PYLABA受体增强ABA信号传导是另一种改善植物耐旱性的方法，例如，通过过表达所述受体或产生组成型活性版本(Santiago等人，2009；Xaavedra等人，2009；Mosquna等人，2011，WO2013/006263)。然而，因为非生物性胁迫反应转变正常生长所需要的资源，所以由高ABA水平或活性ABA信号传导的持续作用导致的多向性作用可能不利地影响植物生长。在Mosquna等人，2011和WO2013/006263中，公开了组成型活性ABA突变体PYR1、PYL2和PYL9多肽，其在不存在ABA的情况下抑制PP2C。表明仅若干特定氨基酸置换的组合才足以提供所需的作用并且产生具有与ABA饱和野生型PYR1几乎不可区分的激活水平的变体。

最近的研究揭示了至少两个亚类的PYR/PYL受体，包括单体和二聚体PYL(Dupeux等人，2011a；Hao等人，2011)。二聚体受体显示出比单体受体(～1μM)更高的对于ABA的Kd(>50μM，亲和性较低)；然而，在特定的进化枝A蛋白磷酸酶2C(PP2C)的存在下，两组受体形成具有针对ABA的高亲和力(Kd30-60nM)的三元复合物(Ma等人，2009；Santiago等人，2009a，b)。当我们考虑反式-二聚体PYL3受体时，出现了第三亚类，所述反式-二聚体PYL3受体在配体结合时经受顺式到反式-二聚体的转换，从而促进随后解离为单体(Zhang等人，2012)。二聚体受体将其与PP2C相互作用的表面封闭在二聚体中，因此它们对于解离和采用PP2C结合构象是强ABA依赖性的(Dupeux等人，2011)。在体外，尽管与和ABA的三元复合物相比，形成稳定性较差的复合物，但是，单体ABA受体能够在不存在ABA的情况下以某种程度与PP2C的催化核心相互作用(Dupeux等人，2011；Hao等人，2011)。在planta中，PYL8-相互作用配偶体的串联亲和性纯化(TAP)和质谱分析主要依赖于ABA来回收PYL8-PP2C复合物(Antoni等人，2013)。

酵母双杂交(Y2H)测定揭示了PYR/PYL与PP2C之间的ABA-独立性和ABA-依赖性相互作用。PYR/PYL与PP2C依赖于外源性ABA的Y2H相互作用提供建立目的在于鉴定允许ABA-独立性相互作用的突变的包括产生等位基因文库和生长测试的筛选的可能性。此类突变可能产生针对这样的受体的植物细胞：通过增强的缔合动力学、空间位阻干扰PP2C功能的受体，或在不存在ABA的情况下抑制PP2C的组成型活性受体(不依赖于ABA-诱导的构象变化)。在Y2H测定中，显示PYL4和PP2CA(分别为PYR/PYL和进化枝APP2C家族的两个代表性成员)的相互作用是ABA-依赖性的(Lackmann等人，2011)。PYL4在不同的组织中表现出高表达水平，并且需要其失活以产生强ABA-不敏感的联合pyr/pyl突变体(Gonzalez-Guzman等人，2012)。PP2CA起至关重要的作用调节针对ABA的种子和植物性反应，并且通过与阴离子通道SLAC1和激酶SnRK2.6/OST1相互作用调节气孔开口(Kuhn等人，2006；Yoshida等人，2006；Lee等人，2009)。在不存在ABA的情况下，PP2C磷酸酶与SnRK2激酶相互作用以抑制其自身磷酸化和激活。在存在ABA的条件下，通过ABA-受体复合物抑制PP2C磷酸酶导致SnRK2激酶的磷酸化和激活，其又使促进ABA-反应性基因的转录的转录因子磷酸化。

因此，PP2CA是一种生理学相关的靶标用来设计表现出与磷酸酶的组成型相互作用的PYR/PYL受体，从而影响ABA信号传导和植物胁迫反应。通过产生PYL4(At2g38310)等位基因文库和Y2H测定，我们鉴定了几种允许酵母中的与PP2CA的不依赖于ABA的相互作用的PYL4突变。有趣的是，当在拟南芥中过表达一些PYL4突变体受体后，我们获得了与野生型PYL4相比在种子和营养组织中都增强的对ABA的敏感性。此外，与野生型或35S:PYL4植物相比，35S:PYL4A194T和5S:PYL4H82rV97A转基因植物表现出增强的耐旱性。

由此，我们描述了一种在植物中通过引入诱变版本的PYR/PYL(特别是PYL4)受体增强植物胁迫耐受性(例如，耐旱性)的方式。这些携带单一或多个突变并且在营养组织和非营养组织中表现出作用。

发明概述

本发明人已经表明PYL/PYR多肽中的特定修饰能够改变该蛋白的特性，导致农艺学重要性植物特征的改善。具体地，本发明人已经表明特定的修饰允许突变体蛋白与PP2C不依赖于ABA的相互作用，并且与野生型受体相比，导致增强的PP2C抑制作用。不依赖于ABA的相互作用在不存在ABA的情况下不导致PP2C的主要抑制；然而，其提高PP2C的ABA依赖性抑制，例如，在低ABA水平。换言之，所述修饰导致受体蛋白与PP2C的组成型相互作用，在受体与PP2C之间产生另外的接触点，这导致提高的PP2C的ABA依赖性抑制。本发明人还已经表明，当在转基因植物拟南芥和大麦中表达突变体蛋白时，甚至在不存在胁迫诱导型启动子的情况下，所述植物仍表现出提高的胁迫耐受性，特别是针对干旱胁迫的耐受性。因此，本发明涉及与野生型序列相比包含一个或多个氨基酸突变或修饰(例如，置换)的PYL和PYR突变体多肽，并且其提供PYL/PYR受体与PP2C的不依赖于ABA的相互作用并且增强PP2C的ABA依赖性抑制，并且涉及其在赋予植物胁迫耐受性的方法中的用途。突变在本文中关于AtPYL4野生型多肽(SEQIDNO:3)示例。然而，AtPYL4的突变体同系物/直向同源物也在本发明的多个方面的范围之内，并且这些在关于SEQIDNO:3的对应/等效位置具有如本文所定义的突变。

具体地，本发明涉及分离的突变体核酸或包含突变体核酸的核酸构建体，其中所述核酸编码包含对应于下述的氨基酸置换的突变体PYL或PYR多肽：

a)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置A194、V97、C176和/或F130中的一个或多个，或

b)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97。

因此，所述突变体核酸包含SEQIDNO:1、2或4但是具有所述序列的一个或多个修饰，导致所述核酸编码包含氨基酸置换的突变体PYL或PYR多肽。具有根据本发明的特定突变的根据本发明的多肽的实例显示在SEQIDNO:60-65中。

在另一方面，本发明涉及载体，所述载体包含分离的突变体核酸或包含突变体核酸的核酸构建体，其中所述核酸编码包含在/对应于以下位置的氨基酸修饰(优选置换)的突变体PYL或PYR多肽：

b)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97。

在另一方面，本发明涉及宿主细胞，所述宿主细胞包含载体，所述载体包含编码突变体PYL或PYR多肽的分离的核酸，所述突变体PYL或PYR多肽包含对应于下述的氨基酸置换：

b)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97。

在另一方面，本发明涉及转基因植物，所述转基因植物表达编码突变体PYL或PYR多肽的分离的核酸，所述突变体PYL或PYR多肽包含对应于下述的氨基酸置换：

a)如SEQIDNO:2中所示的PYL4中的位置A194、V97、C176和/或F130中的一个或多个，或

b)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97，

或所述转基因植物包含含有所述分离的核酸的载体。

在另一方面，本发明涉及用于增加转基因植物的胁迫耐受性的方法，所述方法包括向植物中引入并表达编码包含对应于下述的氨基酸置换的突变体PYL或PYR多肽的核酸或包含所述核酸的载体：

b)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97。

在另一方面，本发明涉及用于在转基因植物中延长种子休眠/防止早熟萌发/诱导超休眠的方法，所述方法包括向植物中引入并表达编码包含对应于下述的氨基酸置换的突变体PYL或PYR多肽的核酸或包含所述核酸的载体：

b)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97。

在另一方面，本发明涉及用于组成型激活ABA信号传导通路的方法，所述方法包括向植物中引入并表达编码包含对应于下述的氨基酸置换的突变体PYL或PYR多肽的核酸或包含所述核酸的载体：

b)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97。

本发明还涉及用于抑制转基因植物中的PP2C活性的方法，所述方法包括向植物中引入并表达编码包含对应于下述的氨基酸置换的突变体PYL或PYR多肽的核酸或包含所述核酸的载体：

b)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97。

本发明涉及用于产生具有增加的胁迫耐受性的转基因植物的方法，所述方法包括向植物中引入并表达编码包含对应于下述的氨基酸置换的突变体PYL或PYR多肽的核酸或包含所述核酸的载体：

b)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97。

本发明涉及通过本文所述的本发明的方法获得或可通过本文所述的本发明的方法获得的植物。所述方法包括用于有害转基因植物的方法以及使用靶向基因编辑或诱变的方法。

在最后方面，本发明涉及编码突变体PYL或PYR多肽的核酸或包含所述核酸的载体用于在植物中增加胁迫耐受性、延长种子休眠或激活ABA信号传导通路的用途，其中所述突变体PYL或PYR多肽包含对应于下述的氨基酸置换：

b)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97。

在上述多个面的一个实施方案中，所述突变体PYL或PYR多肽是AtPYL4。在另一个实施方案中，所述突变体PYL或PYR多肽是AtPYL4的同系物/直向同源物或功能变体。

在下述非限制性附图中进一步描述本发明。

附图

图1.在Y2H测定中鉴定产生与PP2CA的不依赖于ABA的相互作用的PYL4突变。A，PYL4或PYL4突变体(诱饵，与Gal4结合结构域融合)与PP2CA或HAB1(猎物，与Gal4激活结构域融合)的相互作用。相互作用通过在缺少His和Ade的培养基上的生长测定来确定。当指示时，将培养基补充以50μMABA。将饱和培养物的稀释液(10^-1，10^-2，10^-3)点到平板上，并且在7天后拍摄照片。B，PYR1，PYL1，PYL2和PYL4氨基酸序列和二级结构的比对。PYL4突变的位置在下方用星号标出。黑色框表示门(gate)和门锁环(latchloop)的位置。灰色框表示C-端α-螺旋的位置。上方的星号标记参与ABA结合的K59，E94，Y120，S122和E141残基。

图2.PYL4和PYL4突变体的活性测定。A、B，在体外使用对硝基苯基磷酸作为底物在不存在或存在PYL4或不同PYL4突变体版本的条件下在所示的ABA浓度测量PP2CA(A)或HAB1(B)的磷酸酶活性。测定在包含2μM磷酸酶和4μM受体的100μl反应体积中进行。数据是三次独立的实验的平均数±SE。*表示当在相同测定条件下比较突变体和野生型PYL4的数据时p<0.05(Student′st检验)。C，PYL4A194T或PYL4对PP2CA-介导的OST1、ΔC-ABF2、ΔC-ABI5和SLAC11-186磷酸化蛋白的去磷酸化的作用。在该测定中使用1:10磷酸酶:受体化学计量。放射自显影的定量(下面的数字)表示相对于第一反应(100％，在不存在PP2CA的条件下)每次实验中被磷酸化的底物的百分数。

D，PYL4^A194T比PYL4更好地防止PP2CA-介导的OST1、ABF2(1–173)、ABI5(1–200)和SLAC1(1–186)的去磷酸化。值1表示在不存在ABA的情况下对各种底物的保护，并且归一化的比率表示在所示的ABA浓度的PYL4^A194T或PYL4增强底物保护的倍数。在本测定中使用1:1的磷酸酶:受体化学计量。

图3.BiFC测定显示烟草叶中PYL4或PYL4A194T与PP2CA的不同相互作用。在体外，在不存在ABA的情况下，PYL4A194T结合ΔNPP2CA。A，用携带所示的BiFC构建体和沉默抑制物p19的土壤杆菌(Agrobacterium)悬浮液浸润的表皮叶细胞的激光扫描共聚焦成像。B，荧光蛋白信号的定量。图A的图像用ImageJ软件分析，并且在减去平均背景密度后计算信号强度。C，SDS-PAGE显示从包含重组6His-ΔNPP2CA和PYL4(上)或PYL4A194T(下)的细胞裂解物的Ni2+亲和层析纯化。显示PYL4和PYL4A194T的泳道还显示在每块凝胶的右侧。SF、FT和E1-E4分别代表可溶级分、通过柱的流穿和以500mM咪唑洗脱的级分。在不存在ABA时，PYL4A194T与6His-ΔNPP2CA共纯化，而PYL4则不。D，在不存在ABA的情况下纯PYL4A194T(灰色曲线，在约0.22处具有峰)、6His-ΔNPP2CA(灰色曲线，具有最低的峰)和上文所述的包含共纯化的PYL4A194T/6His-ΔNPP2CA(黑色)蛋白的洗脱级分在尺寸排阻层析后的洗脱模式。每个峰的插入图显示SDS-PAGE分析。该图显示1:1PYL4A194T:6His-ΔNPP2CA复合物的形成和PYL4A194T的单体性质。E，SDS-PAGE显示拉下测定(pull-downassay)，其中在不存在或存在100μMABA的情况下将6His-ΔNPP2CA与PYL4或PYL4A194T一起温育。

图4.与未转化的Col植物相比，在PYL4和PYL4^A194TOE株系中对ABA-介导的幼苗建立和早期幼苗生长的抑制的敏感性增强。A，使用针对HA标签的抗体的免疫印迹分析定量T3转基因株系的21日龄幼苗中的PYL4、PYL4V97A、PYL4A194T、PYL4C176RF130Y和PYL4H82RV97A的表达(上图)。下面显示丽春红染色作为蛋白上样对照。B、C，与未转化的Col植物相比，PYL4和不同PYL4^突变体OE株系中ABA-介导的幼苗建立和早期幼苗生长的抑制。B，各基因型的约100粒种子(三次独立的实验)被播种在缺少或补充以0.25或0.5μMABA的MS平板上。8天后依据存在绿色的子叶和第一对真正的叶片对幼苗进行评分。值为平均数±SE。C，播种后20天拍摄代表性幼苗的照片。D，与未转化的Col植物相比的PYL4和不同PYL4突变体OE株系中ABA-介导的早期幼苗生长抑制的定量。数据通过测量20天后的最大莲座(rosette)半径获得，并且是三次独立的实验的平均数±SE。

图5.与未转化的Col植物相比，PYL4和PYL4^A194TOE株系对ABA-介导的根生长抑制的敏感性增强。A，将4日龄的幼苗转移到缺少或补充了10μMABA的MS平板后10天的代表性幼苗的照片。B、C，分别是ABA-介导的根或茎生长抑制的定量(值是平均数±SE，将Col野生型在MS培养基上的生长视为100％)。*表示当在相同测定条件下将PYL4或PYL4^A194TOE植物与未转化的Col植物的数据比较时p<0.05(Student′st检验)。D，PYL4^A194TOE植物在不存在外源性ABA的情况下表现出ABA响应性基因的部分组成型上调。通过在空白(mock)或用10μMABA处理3小时的2周龄幼苗的RNA样品中的定量RT-PCR分析Col、PYL4和PYL4^A194TOE植物中的两种ABA诱导型基因RAB18和RD29B的表达。数据表示相对于空白处理的Col(值1)的各柱中RAB18和RD29B基因的表达水平(值是平均数±SE)。

图6.叶片气体交换测量揭示，与未转化的Col和PYL4OE植物相比，PYL4^A194TOE植物中气孔导度和蒸腾作用下降。A，Gst，B，未转化的Col、PYL4和PYL4^A194TOE植物的蒸腾作用值。植物被保持在定制的全莲座气体交换测量装置中(见Kollist等人，2007)，并且在每日暗/光循环过程中追踪Gst和蒸腾作用27小时。值为平均数±SE(n＝5)。上面的白色和黑色条分别表示光和暗周期。C，与未转化的Col植物相比，PYL4和PYL4^A194TOE株系气孔导度减少。D，经受层流通风橱的干燥气氛的15日龄植物的鲜重损失。E，不浇水11天后4周龄植物的水分损失的量化。显示的数据是在从5株不同的植物收集的10片叶中测量的水分损失的平均量(μL/g鲜重)。值是平均数±SE(n＝10)。*表示将在相同测定条件下的OE株系和未转化的Col植物的数据相比时，p<0.05(Student′st检验)。

图7.PYL4A194TOE植物表现出增强的耐旱性和耐脱水性。A，相对于未转化的Col或PYL4OE植物，PYL4^A194TOE植物的耐旱性增强。使两周龄植物缺水达19天，然后重新浇水。在实验开始时(第0天)、干旱16和19天后(第16天，第19天)和重新浇水后2天(从第0天开始的第21天)拍摄照片。将幼芽切下以更好地显示干旱对莲座叶的影响。B，实验过程期间未转化的Col、PYL4和PYL4^A194TOE植物的幼芽生长(最大莲座半径)。在实验开始后不同的时间(2、5、7和9天)进行测量，并且将第0天的值视为100％。值为平均数±SE(n＝10)。C，重新浇水后第3天，未转化的Col、PYL4和PYL4A194TOE植物的存活百分数。值为三次独立实验的平均数±SE((每次实验n＝10)。D，PYL4A194T和PYL4H82RV97AOE植物表现出增强的耐脱水性。将在MS平板上生长的2周龄的植物通过在层流通风橱中打开盖子12小时进行脱水(25℃±1℃，25％±2％相对湿度)，然后再水合，并且3天后对存活进行评分。

图8.AtPYL4蛋白与作物植物中的PYL4直向同源蛋白的比对。

图9.过表达PYL4A194T或PYL4H82RV97A的转基因大麦植物在营养阶段表现出增强的耐旱性。(A、C)将四周龄的植物用自来水浇水12天(-D)或者进行干旱处理12天(+D)。(B、D)对进行干旱的植物重新浇水(RW)并且在重新浇水后5天拍摄照片(+D，+RW)。

图10.与未转化的植物相比，过表达PYL4A194T或PYL4H82RV97A的转基因大麦在干旱t处理后表现出增加的鲜重t(FW)。将四周龄的植物用自来水浇水12天(-D)或者进行干旱处理12天(+D)。每株植物称重一片叶片(FW)(对于每个遗传背景有10株个体植物)，并且在70℃干燥16小时，并且再次称重以获得干重(DW)。数据表示平均FW或DW/叶片±SE。*表示在相同测定条件下比较转基因株系与未转化的植物的数据时p<0.05(Student′st检验)。

图11.与未转化的植物相比，过表达PYL4A194T或PYL4H82RV97A的转基因大麦表现出增强的耐旱性。(A)四周龄的植物用自来水浇水18天或(B)进行干旱处理12天并且重新浇水。各遗传背景称重十株个体植物(FW)。数据表示平均FW/植物±SE。*表示当在相同测定条件下比较转基因株系与未转化的植物的数据时p<0.05(Student′st检验)。

详述

现在将进一步描述本发明。在下述段落中，更详细地定义本发明的不同方面。这样定义的每个方面可以与任意另一个方面或多个方面组合，除非清楚给出相反指示。特别地，显示为优选的或有利的任何特征可以与任意另一个或另一些显示为优选或有利的特征组合。

除非另外指明，本发明的实施将使用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术、生物信息学的常规技术，这些在本领域技术人员的能力范围内。此类技术在参考文献中充分解释。用于本文时，词语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如，mRNA)，天然存在的、突变的、合成的DNA或RNA分子，以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。其可以是单链的或双链的。此类核酸或多核苷酸包括，但不限于，结构基因的编码序列，反义序列和不编码mRNA或蛋白产物的非编码调节序列。这些术语还包括基因。术语“基因”或“基因序列”广义上用来指与生物功能相关的DNA核酸。因此，基因可以包括如在基因组序列中的内含子和外显子，或可以仅包含如在cDNA中的编码序列，和/或可以组合地包含cDNA和调节序列。在一个实施方案中，分离的核酸和用于根据本发明的多种方法和植物中的分离的核酸是PYL/PYRcDNA。本文中给出了所述序列的实例。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，并且指通过肽键连接在一起的任意长度的多聚形式的氨基酸。

为了本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”具有关于例如以下的含义：核酸序列、表达盒、包含所述核酸序列的基因构建体或载体或用根据本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物体，所有这些构建通过重组方法产生，其中

(a)编码可用于本发明的方法的蛋白的核酸序列，或

(b)与根据本发明的核酸序列可操作连接的遗传控制序列，例如，启动子，或

(c)a)和b)

不位于其天然的遗传环境中或者已经通过重组方法修饰，所述修饰可以采取例如一个或多个核苷酸残基的置换、添加、缺失、倒置或插入的形式。天然遗传环境理解为意指原始植物中的天然基因组或染色体座或在基因组文库中存在。在基因组文库的情形中，优选地至少部分地保留核酸序列的天然遗传环境。所述环境侧连在核酸序列的至少一侧，并且具有至少50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp的序列长度。天然存在的表达盒–例如，核酸序列的天然启动子与编码可用于本发明的方法的多肽的相应核酸序列(如上文定义)的天然存在的组合–在该表达盒通过非天然的、合成的(“人工的”)方法(诸如例如，诱变处理)修饰时，变成转基因表达盒。适当的方法记述在例如US5,565,350或WO00/15815中，二者都通过引用结合。

由此，用于本发明目的的转基因植物被理解为意指，如上文，用于本发明方法的核酸不是位于其在所述植物的基因组中的天然基因座处，可能的是同源或异源地表达所述核酸。然而，如提及的，转基因还意指，尽管根据本发明不同实施方案的核酸位于其在植物基因组中的天然位置处，但是所述序列相对于天然序列已被修饰，和/或天然序列的调节序列已被修饰。优选地，转基因被理解为意指根据本发明的核酸在基因组中的非天然基因座处的表达，即，发生所述核酸的同源表达，或优选地异源表达。根据本发明，转基因以稳定的方式整合到植物中，并且优选地，所述植物对于所述转基因是纯合的。

本发明的多个方面涉及重组DNA技术、诱变或基因组编辑，并且排除仅基于传统育种方法产生植物的实施方案。

本发明涉及分离的植物PYL和PYR突变体核酸和由所述突变体核酸编码的分离的突变体植物PYL和PYR多肽，其中，与野生型序列相比，所述突变体多肽包含一个或多个氨基酸突变或修饰，例如，置换或缺失，其促进与PP2C的不依赖ABA的相互作用和增强的对PP2C的ABA-依赖性抑制，例如，在低的ABA水平。如本文所阐释的，所述突变体核酸中特定的核酸被修饰，以使得到的突变体蛋白不同于野生型蛋白。本文所示的序列显示野生型序列，并且本文中显示了关于这些序列中的位置的突变体蛋白中的突变。本发明还涉及用于制备表达所述突变体多肽的具有改善的特征的转基因植物的方法。优选地，这些突变位于与PP2C(例如PP2CA)相互作用的蛋白结构域中，和/或位于与ABA相互作用的结构域(如在图1B中所示并且关于AtPYL4蛋白序列SEQIDNO:3的AtPYL4中的残基K59、E94、Y120、S122和E141)。所述突变在本文中称为激活突变/置换。此外，影响ABA信号传导的任何突变，例如，在不存在ABA的情况下激活(促进与PP2C的不依赖ABA的相互作用)PYL/PYR受体并且增强ABA-依赖性PP2C抑制的突变在本文中被称为激活突变/置换。因此，根据本发明的突变体多肽/蛋白是非天然存在的肽，其可以通过定向诱变产生并且稳定引入到植物中，并在所述植物中表达，产生具有改善特征的稳定的转基因植物。所述植物优选对于所述转基因是纯合的。所述突变/修饰是置换或缺失，其中所述缺失不引入终止密码子。优选地，所述修饰是置换。

在一个实施方案中，本发明各个方面的多肽在本文定义的位置中的一个或多个处具有一个或多个突变，但是不具有在关于SEQIDNO:3的以下位置中的一个或多个处的突变：H82、V105、V106、L109、A111、D177、F178、V181、C185和/或S189。还排除如WO2013/006263中公开的特定激活突变，包括对应于PYR1中的下述位置的PYL/PYR多肽中的突变：V83、I84、L87、A89、M158、F159、T162、L166、K170(通过引用结合)。在本发明各个方面的一个实施方案中，本发明的多肽不具有除本文所述的这些突变中的一个或多个之外的任何另外的突变。在一个实施方案中，本发明的多肽不具有任何激活突变，即影响ABA信号传导的突变。

因此，在第一方面，本发明涉及编码突变体PYL或PYR多肽的分离的突变体核酸，所述突变体PYL或PYR多肽包含对应于如SEQIDNO:3中所示和图1B显示的PLY4中的位置A194、V97、F130和/或C176中的一个或多个或与其对应的位置的一个或多个氨基酸置换。因此，在一个实施方案中，所述置换是在关于SEQIDNO:3中所示的AtPLY4的A194处(还参见SEQIDNO:55和60)或在与其对应的位置处。在另一个实施方案中，所述置换是在关于如SEQIDNO:3中所示的AtPLY4的V97处(还参见SEQIDNO:61)或在与其对应的位置处。在另一个实施方案中，所述置换是在关于如SEQIDNO:3中所示的AtPLY4的F130处(还参见SEQIDNO:64)或与其对应的位置处。在另一个实施方案中，所述置换是在关于如SEQIDNO:3中所示的AtPLY4的C176处(还参见SEQIDNO:65)或与其对应的位置处。在另一个实施方案中，在对应于如SEQIDNO:3中所示的PLY4的A194、V97、F130和/或C176的位置处的一个或多个残基缺失。

本发明还涉及编码突变体PYL或PYR多肽的分离的核酸，所述突变体PYL或PYR多肽包含对应于/等效于SEQIDNO:3所述和图1B所示的位置H82和V97的两个氨基酸置换(还参见SEQIDNO:56和62)。优选地，与野生型序列相比，编码突变体PYL或PYR多肽的分离的核酸具有在位置H82和V97或在与其对应的位置处的置换，但是不具有其他激活氨基酸置换。在另一方面，在位置H82和V97处的氨基酸置换可以与在A194和/或V97和/或F130和/或C176的氨基酸置换和/或在与ABA或PP2C相互作用的结构域中的其他残基的突变组合。

因此，所述多肽优选包含上述一个、两个、三个、四个或更多个突变。上文特别描述的置换或缺失的任意组合在本发明的范围之内。例如，在位置A194或与其对应的位置处的氨基酸置换可以与在V97和/或F130和/或C176或与其对应的位置处的氨基酸置换组合。在一个实施方案中，位置A194、V97和/或F130和/或C176的突变的其他组合也是可能的，例如，与H82和/或与ABA或PP2C相互作用的结构域中的其他残基的突变组合。

在一个实施方案中，位置V97或与其对应的位置处的氨基酸置换可以与F130、A194和/或C176或与其对应的位置处的氨基酸置换组合。在一个实施方案中，位置F130处的氨基酸置换可以与A194、V97和/或C176或与其对应的位置处的氨基酸置换组合。在一个实施方案中，位置C176处的氨基酸置换可以与A194、V97和/或F130或与其对应的位置处的氨基酸置换组合。

PP2C可以选自HAB1(与AB11同源)、ABI1(脱落酸不敏感1)、ABI2(脱落酸不敏感2)或PP2CA。优选地，所述PP2C是PP2CA。

上文所述位置处的氨基酸置换优选是保守氨基酸置换。保守置换表在本领域中是公知的。备选地，可以进行插入以使所述位点无功能。

本文所述的PYL/PYR多肽中的突变关于SEQNO:3中所示的氨基酸位置显示，SEQNO:3指明由SEQIDNO:1、2或4所示的核酸编码的AtPLY4野生型多肽序列。因此，在一个实施方案中，突变体PYL或PYR多肽由包含与SEQIDNO:1、2或4基本上相同的序列或由与SEQIDNO:1、2或4相同的序列组成或基本上由与SEQIDNO:1、2或4相同的序列组成的核酸、其功能变体、直向同源物或同系物编码，但是其具有修饰，从而使得突变体核酸的转录产生包含在上文列出的位置的一个或多个突变的突变体蛋白。换言之，突变体PYL或PYR多肽由这样的核酸、其功能变体、直向同源物或同系物编码，所述核酸包含与SEQIDNO:1、2或4基本上相同的序列由与SEQIDNO:1、2或4基本上相同的序列组成或基本上由与SEQIDNO:1、2或4基本上相同的序列组成，但是其包含编码上文列出的一个或多个残基的一个或多个密码子的修饰。这些密码子为AtPYL4中的82、97、130、176和/或194。如下文所阐释的，其他PYL/PYR多肽与AtPYL4具有同源性，并且与AtPYL4中的位置A194、V97、F130，H82和C176中的一个或多个相对应的用于靶向操作的残基可以通过本文所述的序列比较和比对鉴定。

如本文中使用的并且根据本发明各个方面的PYL/PYR核酸包括SEQIDNO:1、2或4或其功能变体或同系物/直向同源物，但是其中所述核酸不是这些序列中所示的野生型核酸，而是在一个或多个密码子中具有突变的突变体核酸，其导致所编码的多肽中的一个或多个突变。所述多肽中的所述突变是对应于下述的氨基酸置换：

b)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97。

术语SEQIDNO:1、2或4的功能变体或同系物/直向同源物如下文所述，并且此种核酸的具体实例也在下文中给出。

下述序列显示AtPYL4的开放阅读框(SEQIDNO：2)

ATGCTTGCCGTTCACCGTCCTTCTTCCGCCGTATCAGACGGAGATTCCGTTCAGATTCCGATGATGATCGCGTCGTTTCAAAAACGTTTTCCTTCTCTCTCACGCGACTCCACGGCCGCTCGTTTTCACACACACGAGGTTGGTCCTAATCAGTGTTGCTCCGCCGTTATTCAAGAGATCTCCGCTCCAATCTCCACCGTTTGGTCCGTCGTACGCCGCTTTGATAACCCACAAGCTTACAAATTTCTCAAAAGCTGTAGCGTCATCGGCGGAGACGGCGATAACGGTAGCCTCCGTCAAGTCCACGTCGTCTCTGGTCTCCCCGCCGCTAGCTCCACCGAGAGACTCGATATCCTCGACGACGAACGCCACGTCATCAGCAGCGTTGTTGGTGGTGACCACCGGCTCTCTAACTACCGATCCGTAACGACCCTTCACCCTTCTCCGATCTCCGGGACCGTCGTTGTCGAGTCTTACGTCGTTGATGTTCCTCCAGGCAACACAAAGGAAGAGACTGACTTCGTTGACGTTATCGTACGATGCAATCTTCAATCTCTTGCGAAAATAGAGAATACTGCGGCTGAGAGCAAGAAGAAGATGTCTCTGTGA

根据本发明的不同方面被突变以获得本发明的多肽中的突变的一个或多个密码子以粗体和下划线表示。这也显示如下。

根据本发明的具有根据本发明的特定突变的多肽的实例显示在SEQIDNO：60-65中。其具有在与AtPYL4中的突变位置相对应的位置处的突变的功能变体或同系物/直向同源物也在本发明的范围内。

在一个实施方案中，根据本发明的突变体多肽包含对应于关于SEQIDNO：3的位置A194的氨基酸置换。因此，本发明涉及编码包含对应于关于SEQIDNO：3的位置A194的氨基酸置换的突变体PYL或PYR多肽的分离的突变体核酸(参见SEQIDNO.55和60)。A194位于C-端螺旋的C-端部分。本发明人已经证明，与对照野生型植物相比，在与ABA或PP2C相互作用的结构域中不存在其他激活突变的情况下，该突变单独地在不存在另外的突变的条件下可以赋予植物耐干旱的表型。在种子和营养组织中观察到该作用。在一个实施方案中，所述突变体多肽因此不包含任何另外的激活突变。AtPYL4同系物/直向同源物中的位置194或与其对应的位置处的A残基可以用T、V、L、M、I或S置换。在优选的实施方案中，所述置换是用T置换，例如，SEQIDNO:3中的A194T。在另一个实施方案中，根据本发明各个方面的突变体多肽不包含任何另外的突变。

因此，在一个实施方案中，所述多肽具有选自A194T的氨基酸置换，并且不存在与ABA或PP2C相互作用的结构域中的其他残基的其他激活突变。在一个实施方案中，不存在其他突变。在一个实施方案中，所述多肽不具有在关于SEQIDNO:3的下述位置中的一个或多个处的突变：H82、V105、V106、L109、A111、D177、F178、V181、C185和/或S189。如在WO2013/006263(通过引用结合)中公开的具体激活突变也被排除在外。在一个实施方案中，所述在关于SEQIDNO:3的A194处具有突变的突变体多肽是PYL4、其功能变体、同系物或直向同源物，如本文所述。

在本发明各个方面的另一个实施方案中，所述突变体多肽包含对应于关于SEQIDNO:3的位置V97的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述多肽不包含任何另外的激活突变。在另一个实施方案中，所述多肽不包含任何另外的突变。在一个实施方案中，所述多肽不具有在关于SEQIDNO:3的以下位置处或与其对应的位置处的突变：H82、V105、V106、L109、A111、D177、F178、V181、C185和/或S189。如在WO2013/006263中公开的具体的激活突变也排除在外。在一个实施方案中，所述突变体多肽是PYL4、其功能变体、同系物或直向同源物，如本文所述。

根据不同的实施方案，位置97或与其对应的位置处的V残基可以用L，M，I，S或T置换。在优选的实施方案中，所述置换是97A。在一个实施方案中，所述突变体多肽是PYL4、其功能变体、同系物或直向同源物，如本文所述。

在另一个实施方案中，所述突变体多肽包含对应于关于SEQIDNO:3的位置F130和/或C176或与其对应的位置处的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述多肽不包含任何其他另外的激活突变。在另一个实施方案中，所述多肽不包含任何另外的突变。位置130处的F残基可以用W置换。位置176处的C残基可以用K或H置换。

在一个实施方案中，所述多肽不具有在关于SEQIDNO:3的下述位置处或与其对应的位置处的突变：H82、V105、V106、L109、A111、D177、F178、V181、C185和/或S189。WO2013/006263中公开的具体激活突变也被排除在外。在优选的实施方案中，所述置换是F130Y和/或C176R。在一个实施方案中，所述突变体多肽是PYL4、其功能变体、同系物或直向同源物，如本文所述。在一个实施方案中，不存在其他的突变。

在另一个实施方案中，所述突变体多肽包含关于SEQIDNO:3的对应于位置H82的氨基酸置换和对应于位置V97的氨基酸置换。因此，在所述多肽中至少存在两个突变。优选地，所述多肽不包含任何另外的激活突变。在另一个实施方案中，所述多肽不包含任何另外的突变。在一个实施方案中，所述多肽不具有在关于SEQIDNO:3的下述位置处或与其对应的位置处的突变：V105、V106、L109、A111、D177、F178、V181、C185和/或S189。WO2013/006263中公开的具体激活突变也被排除在外。位置82处的H残基可以用K、N、Q、F、Y、W或P置换。在一个实施方案中，所述残基不是P。在优选的实施方案中，所述置换是H82R。位置97处的V残基可以用L、M、I、S、T置换。在一个实施方案中，所述突变体多肽是PYL4、其功能变体、同系物或直向同源物，如本文所述。

如本文中关于本文所述的SEQIDNO:1、2、3或4或其同系物的突变体使用的术语“核酸或肽序列的功能变体”是指变体基因序列或所述基因序列的部分，其保留完整突变体序列的生物学功能，例如，当在转基因植物中表达时，赋予增加的胁迫耐受性/产量和与PP2C的不依赖于ABA的相互作用。功能变体还包括目的基因的变体，其具有不影响功能的序列改变，例如，在非保守残基中的改变。还包括这样的变体，其与野生型序列基本上相同(即，仅在例如非保守残基中具有一些序列变化)，但是包括本文所示的靶突变，并且具有生物学活性。变体与野生型序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的整体序列同一性。变体可以例如具有在编码区中引入的限制性位点以促进克隆(见实施例)。

因此，理解的是，如本领域技术人员将理解的，包括方法和用途在内的本发明的各个方面不仅涵盖包含SEQIDNO:1、2或4、由SEQIDNO:1、2或4组成或基本上由SEQIDNO:1、2或4组成的突变体核酸序列或包含SEQIDNO:3、基本上由SEQIDNO:3组成或由SEQIDNO:3组成的突变体多肽(其具有本文所述的突变，但是另外显示在参考序列中)，还涵盖不影响产生的突变体蛋白的生物学活性和功能的SEQIDNO:1-4的突变体序列的功能变体或其同系物。换言之，变体中存在的另外的变异不影响ABA相互作用或其他生物学功能，并且表达所述变体的转基因植物的表型是表达上述突变体肽的转基因植物的表型。本领域中公知核酸序列中导致在给定的位点产生不同的氨基酸然而不影响所编码的多肽的功能性质的变化。例如，氨基酸丙氨酸(一种疏水氨基酸)的密码子可以被编码另外一种疏水性较弱的残基(如甘氨酸)或疏水性较强的残基(如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子置换。类似地，还可以预期导致一个带负电荷的残基置换成另一个带负电荷的残基(如天冬氨酸置换成谷氨酸)或一个带正电荷的残基置换成另一个带正电荷的残基(如赖氨酸置换成精氨酸)的变化产生功能等效产物。还预期导致多肽分子的N-端和C-端部分变化的核苷酸变化不改变多肽的活性。提议的每一种修饰都充分在本领域的常规技能之内，如确定所编码的产物的生物学活性的保留。变体的变化不是激活突变。

此外，包括方法和应用在内的本发明的各个方面，不仅涵盖PYL，还涵盖其片段。“片段”旨在表示核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分以及由其编码的蛋白的一部分。核苷酸序列的片段编码保留天然蛋白的生物学活性并且由此起作用调节针对ABA的反应的蛋白片段。

在根据本发明各个方面的一个实施方案中，PYL/PYR突变体多肽是如SEQIDNO:3中所示的AtPYL4的突变体PYL4多肽。所述突变体具有如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置A194、V97、C176和/或F130中的一个或多个处或如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97处的修饰，优选置换。实例显示在SEQIDNO:60-65中。

然而，本发明还延伸至与AtPYL4序列相比具有在对应的/等效位置处的突变的AtPYL4的功能同系物/直向同源物。如SEQIDNO:3中所示的AtPYL4的功能变体或同系物是以与SEQIDNO:3相同的方式具有生物学活性的PYL4肽，换言之，例如，其赋予增加的胁迫耐受性，优选耐旱性。术语功能同系物包括其他植物物种中的AtPYL4直向同源物。在本发明各个方面的优选实施方案中，本发明具体涉及AtPYL4或其他植物中的AtPYL4的直向同源物。这些的非限制性实例显示在图8中，并且核酸和蛋白的相应序列显示为SEQIDNO:5-42。在一个实施方案中，AtPYL4蛋白同系物/直向同源物如在SEQIDNO:7、9、12、14、16、19、21、23、26、28、31、34、37、39或42中所示，但是其中所述蛋白在对应于本文关于SEQIDNO:3所述的位置的一个或多个位置处具有一个或多个突变，所述位置是对应于本文所述的AtPYL4中的靶残基的位置。所述位置选自：

b)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97。

相应的野生型核酸序列也在本文中显示，其为SEQIDNO:6、8、10、11、13、15、17、18、20、22、24、25、27、29、30、32、33、37、38、40和41。这些在与本文阐释的AtPYL4中的突变的密码子等效的密码子中具有突变。还包括保留突变体序列的生物学活性并且与上文列出的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的整体序列同一性的同源蛋白/核酸序列的变体。该列表是非限制性的，并且本文所述的植物的其他同源序列，例如，来自其他优选植物(如来自作物植物)的根据本发明各个方面的AtPYL4同系物/直向同源物。在优选的实施方案中，AtPYL4同系物/直向同源物来自玉米、水稻、小麦、油菜(oilseedrape)、高粱、大豆、马铃薯、番茄、葡萄、大麦、豌豆、豆、芸豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他蔬菜类芸苔(brassicas)或白杨，也包括在本发明的范围内。在一个实施方案中，AtPYL4蛋白同系物/直向同源物如在SEQIDNO:43-54中所示。

因此，本发明还涉及编码与本发明的AtPYL4突变体序列相比在相应的位置具有一个或多个突变的AtPYL4多肽的功能同系物/直向同源物的分离的突变体核酸，并且涉及与AtPYL4序列相比在相应的位置具有一个或多个突变的AtPYL4突变体多肽的分离的功能同系物/直向同源物。还延伸到转基因植物，所述转基因植物表达与AtPYL4序列相比在对应于A194、V97、F130、H82和/或C176或H82和V97的位置处具有一个或多个突变的AtPYL4多肽的功能同系物/直向同源物。

根据本发明各个方面的AtPYL4多肽的同系物与由SEQIDNO:3表示的野生型氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的整体序列同一性(以递增的优选性顺序)。优选地，整体序列同一性是85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在另一个实施方案中，AtPYL4核酸序列的同系物与由SEQIDNO:1、2或4表示的核酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的整体序列同一性(以递增的优选性顺序)。优选地，整体序列同一性为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。整体序列同一性使用本领域已知的整体比对算法确定，如程序GAP中的NeedlemanWunsch算法(GCGWisconsinPackage，Accelrys)。

优选地，根据本发明各个方面的AtPYL4同系物/直向同源物包含保守的门(gate)基序(AtPYL4中的残基107-111：SGLPA；SEQIDNO:57)和/或门锁环(latchloops)(AtPYL4中的残基135-139：GDHRL；SEQIDNO:58)和/或保守的C-端α螺旋(AtPYL4中的残基173-198：EETCDFVDVIVRCNLQSLAKIAENTA；SEQIDNO:59)，如图1B中所示。在一个实施方案中，所述AtPYL4同系物/直向同源物具有与SGLPA至少99％同源的结构域和/或与GDHRL至少99％同源的结构域和/或与EETCDFVDVIVRCNLQSLAKIAENTA(SEQIDNO:59)至少95％、96％、97％或99％同源的结构域。在优选的实施方案中，与全部三个结构域相同或具有如上文定义的同源性的所有结构域都存在。因此，术语AtPYL4同系物/直向同源物是指至少部分特征在于存在这些结构域中的一个或多个或全部的蛋白。

适当的同系物或直向同源物可以通过使用诸如NCBI与Palntensemble的数据库和技术人员已知的比对程序对保守结构域进行序列比较和鉴定而鉴定出来。同系物或直向同源物的功能可以如本文所述鉴定，并且技术人员由此能够证实当在植物中表达时的功能。因此，本领域技术人员将认识到，以上关于SEQIDNO:3列出的类似的氨基酸置换可以通过比对要突变的PYL4受体多肽序列与如SEQIDNO:3所示的AtPYL4受体多肽序列而在来自其他植物的PYL4受体中进行。

因此，本发明和本文所述的核苷酸序列可以用于从其他生物体、特别是其他植物、更特别地是从谷物分离相应的序列。以这种方式，可以使用诸如PCR、杂交等的方法来基于其与本文所述的序列的序列同源性鉴定此类序列。序列可以基于其与完整序列或其片段的序列同一性进行分离。在杂交技术中，将全部或部分的已知核苷酸序列用作探针，所述探针选择性地与在来自所选植物的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段(即，基因组或cDNA文库)的群体中存在的其他相应的核苷酸序列杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团或任何其他可检测的标记进行标记。因此，例如，用于杂交的探针可以通过标记基于本发明的ABA-相关序列的合成寡核苷酸而制备。用于制备杂交用探针的方法和用于构建cDNA或基因组文库的方法在本领域中是公知的，并且被公开在Sambrook等，(1989)MolecularCloning:ALibraryManual(分子克隆：实验室手册)(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，NewYork)。

此类序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格的杂交条件”旨在表示这样的条件，在所述条件下，与同其他序列杂交相比，探针与其靶序列以可检测到的更高程度杂交(例如，相对于背景至少2倍)。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情形中是不同的。通过控制杂交的严格性和/或洗涤条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源性探测)。备选地，严格性条件可以进行调整以允许序列中的一些错配，从而检测到较低的相似性程度(异源性探测)。通常，探针长度少于约1000个核苷酸，长度优选少于500个核苷酸。

典型地，严格条件将是这样的条件，其中在pH7.0-8.3盐浓度小于约1.5MNa离子，典型地约0.01-1.0MNa离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如，10-50个核苷酸)温度为至少约30℃而对于长探针(例如，大于50个核苷酸)温度为至少约60℃。杂交的持续时间通常小于约24小时，通常约4-12小时。严格条件还可以通过加入去稳定剂如甲酰胺而获得。

作为非限制性实例，与如SEQIDNO:3中所示的AtPYL4中的氨基酸置换A194类似/等效的PYL4中的氨基酸置换可以通过将AtPYL4的氨基酸序列(SEQIDNO:3)与来自另一种植物物种的PYL4氨基酸序列比对并且在与AtPYL4的氨基酸位置A194比对时鉴定来自另一种植物物种的PYL4中的与A194对应的位置来确定。这显示在图8中。可以以相同的方式确定本文所述的PYL4中的其他氨基酸置换。

例如，根据本发明的各个方面，编码突变体PYL/PYR多肽(例如，植物中作为内源野生型的突变体版本的PYL4，突变体PYL/PYR多肽，例如PYL4肽)的核酸可以通过重组方法在所述植物中表达。在另一个实施方案中，植物中的突变体PYL/PYR多肽，例如PYL4(其是突变体版本的突变体PYL/PYR多肽，例如PYL4肽)可以通过重组方法在本文定义的任何第二植物物种中表达。

例如，根据本发明的突变体AtPYL4或其同系物可以在作物植物中表达。例如，突变体AtPYL4可以在大麦中表达。

在本发明各个方面的一个具体的实施方案中，所述突变体核酸基本上与如SEQIDNo.1、2或4所示的AtPYL4、其功能变体、同系物或直向同源物相同，但是具有一个或多个本文所述的密码子修饰，以使其编码包含对应于关于SEQIDNO:3的位置A194(还参见SEQIDNO:55和60)或与其对应的位置的氨基酸置换的突变体多肽。

在另一个实施方案中，本发明的各个方面涉及PYL/PYR受体家族的另一个成员，其中所述PYL/PYR多肽是包含一个或多个氨基酸修饰的突变体多肽，所述氨基酸修饰选自对应用于SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置A194、V97、F130和/或C176中的一个或多个的一个或多个氨基酸置换或对应于SEQIDNO:3中所示的PLY4中的H82和V97或与其对应的位置处的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述突变体多肽包含对应于位置A194中的一个或多个的氨基酸置换，例如A194T。这可以在不存在其他修饰的情况下存在，或者可以与氨基酸序列中的其他突变组合。

PYL/PYR通过PP2C结合界面与PP2C结合，PP2C结合界面的特征在于保守残基，包括AtPYL4中的H82。PYL/PYR受体家族的共有基序还有保守的C-端螺旋，其包括AtPYL4中的A194。编码PYR/PYL多肽的核酸或PYR/PYL多肽与SEQIDNO:1、2或4所示的核酸或与SEQIDNO:3所示的多肽或其同系物具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的整体序列同一性(以递增的优选性顺序)。优选地，整体序列同一性是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

因此，术语“PYR/PYL受体多肽”是指这样的蛋白，其部分特征在于存在聚酮化合物环化酶结构域2(PF10604)、聚酮化合物环化酶结构域1(PF03364)和BetVI结构域(PF03364)中的一个或多个或全部，其在野生型形式中调节脱落酸(ABA)和ABA类似物信号传导。多种PYR/PYL受体多肽序列在本领域中是已知的。在一些实施方案中，PYR/PYL受体多肽包括与AtPYL4(SEQIDNO:3)，AtPYL1(SEQIDNO:43)，AtPYL2(SEQIDNO:44)，AtPYL3(SEQIDNO:45)，AtPYL5(SEQIDNO:46)，AtPYL6(SEQIDNO:347)，AtPYL7(SEQIDNO:48)，AtPYL8(SEQIDNO:49)，AtPYL9(SEQIDNO:50)，AtPYL10(SEQIDNO:51)，AtPYL11(SEQIDNO:52)，AtPYL12(SEQIDNO:53)或AtPYL13(SEQIDNO:4)或其同系物基本上相同但是在与本文所述的AtPYL4中的靶标相对应的位置处具有一个或多个突变的多肽。在一些实施方案中，PYR/PYL受体多肽包括PYR多肽。在一些实施方案中，所述PYR/PYL受体多肽是如图1B中所示的具有相应的突变。

其他植物物种中的PYR/PYL受体多肽的直向同源物，例如，如在图8和SEQIDNo.43-54中所示的，也在本发明的各个方面内。

在另一方面，本发明涉及包含本文所述的分离的核酸的核酸构建体或载体。因此，所述载体包含编码突变体PYL/PYR多肽(例如PYL4)的分离的核酸，所述突变体PYL/PYR多肽包含对应于SEQIDNO:3中所示的PLY4中的位置A194、H82、V97、F130或C176中的一个或多个的一个或多个氨基酸置换，或包含对应于SEQIDNO:3中所示的位置H82和V97的氨基酸置换。例如，所述置换可以在位置A194，诸如A194T。如上文所阐释的，在一个实施方案中，不存在其他激活突变。优选地，所述载体还包含指导所述核酸表达的调节序列。在一个实施方案中，不存在其他的突变。

术语“调节元件”、“调节序列”、“控制序列”和“启动子”在本文中全部可互换使用，并且在广泛的情形中理解为指能够影响它们所连接的序列的表达的调节性核酸序列。术语“启动子”典型地是指位于基因转录起点上游的核酸控制序列，并且其参与RNA聚合酶和其他蛋白的识别和结合，由此指导可操作连接的核酸的转录。前述术语包括来源于典型真核基因组基因的转录调节序列(包括TATA盒，其是准确的转录起始所需的，具有或不具有CCAAT盒序列)和另外的调节元件(即，上游激活序列、增强子和沉默子)，其响应发育和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达。该术语还包括典型的原核基因的转录调节序列，在该情形中，其可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调节序列。术语“调节元件”还包括合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中的表达。

“植物启动子”包括调节元件，所述调节元件调节编码序列片段在植物细胞中的表达。因此，植物启动子不需要是植物来源的，而是可以来源于病毒或微生物，例如，来自攻击植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以来源于植物细胞，例如，来自用在本发明的方法要被表达的和本文中所述的核酸序列转化的植物。这还适用于其他“植物”调节信号，诸如“植物”终止子。可用于本发明的方法的核苷酸序列上游启动子可以被一个或多个核苷酸置换、插入和/或缺失修饰而不干扰所述启动子、开放阅读框(ORF)或诸如终止子的3'-调节区或远离ORF的其他3'调节区的功能性或活性。还可能的是，启动子的活性通过修饰其序列而增加，或者其完全被活性更强的启动子替换，甚至是被来源于异源生物体的启动子替换。为了在植物中表达，如上文所述，核酸分子必须可操作地连接或者包含适当的启动子，所述启动子在正确的时间点并且以需要的空间表达模式表达基因。术语“可操作连接”用在本文中是指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，以致启动子序列能够起始目的基因的转录。

“组成型启动子”是指在生长和发育的大部分阶段(而不一定是所有阶段)并且在大部分环境条件下在至少一种细胞、组织或器官中具有转录活性的启动子。组成型启动子的实例包括，但不限于，肌动蛋白、HMGP、CaMV19S、GOS2、水稻亲环蛋白、玉米H3组蛋白、紫花苜蓿H3组蛋白、34SFMV、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)小亚基、OCS、SAD1、SAD2、nos、V-ATP酶、超级启动子、G-盒蛋白和合成的启动子。

“强启动子”是指导致基因增加的或过量表达的启动子。强启动子的实例包括，但不限于，CaMV-35S、CaMV-35Sω、拟南芥泛素UBQ1、水稻泛素、肌动蛋白或玉米醇脱氢酶1启动子(Adh-1)。术语“增加的表达”或“过量表达”用在本文中意指相对于对照(例如野生型)表达水平增加的任何形式的表达。在一个实施方案中，所述启动子是CaMV-35S。

在一个实施方案中，所述启动子是组成型或强启动子。在优选的实施方案中，调节序列是诱导型启动子、胁迫诱导型启动子或组织特异性启动子。胁迫诱导型启动子选自下述非限制性列表：HaHB1启动子、RD29A(其驱动DREB1A的干旱诱导型表达)、玉米rabl7干旱诱导型启动子、P5CS1(其驱动脯氨酸生物合成酶P5CS1的干旱诱导型表达)、拟南芥进化枝APP2C(ABI1、ABI2、HAB1、PP2CA、HAI1、HAI2和HAI3)或其相应的作物直向同源物的ABA-和干旱诱导型启动子。

在一个实施方案中，所述启动子不是胁迫诱导型启动子。所述启动子还可以是组织特异性的。

还可以包括其他调节序列，诸如终止子序列。

本发明还涉及用上述核酸或载体转化的分离的宿主细胞。所述宿主细胞可以是细菌细胞，诸如根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)，或是分离的植物细胞。本发明还涉及培养基或包含培养基和上述分离的宿主细胞的试剂盒。

使用本领域已知的转化方法，使用上述突变体核酸或载体产生转基因植物。因此，根据本发明的各个方面，将包含编码本文所述的突变体PYL/PYR多肽的序列的核酸(例如，相对于SEQIDNo.1、2或4中所示的野生型核酸序列的突变体PYL4)引入到植物中并且作为转基因表达。通过称为转化的方法将所述核酸序列引入到所述植物中。本文提及的术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移到宿主细胞中，而与用于转移的方法无关。可以用本发明的遗传构建体转化能够后续克隆繁殖的植物组织(不管是通过器官发生还是胚芽发生)并由其再生完整的植物。所选的特定组织将取决于可用于和最适于被转化的特定物种的克隆繁殖系统而不同。示例性的组织靶标包括叶片、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子体、愈伤组织、现有的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以被瞬时或稳定地引入到宿主细胞中，并且可以保持不整合，例如，作为质粒。备选地，其可以整合到宿主基因组中。然后可以以本领域技术人员已知的方式利用产生的转化植物细胞再生转化的植物。

将外源基因转移到植物基因组中称为转化。现在，在多种物种中植物的转化是常规技术。有利地，可以利用一些转化方法中的任一种将目的基因引入到适当的祖先细胞中。可以将所述的用于转化和从植物组织或植物细胞再生植物的方法用于瞬时或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄入的化学剂、将DNA直接注射到植物中、粒子枪轰击、使用病毒或花粉转化和显微投影(microprojection)。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法、原生质体电穿孔、显微注射到植物材料中、DNA或RNA-包被的粒子轰击、用(非整合型)病毒感染等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地经由根癌土壤杆菌介导的转化产生。

为了选择转化的植物，原则上使在转化中获得的植物材料经历选择条件，以使转化的植物可以与未转化的植物区分开。例如，可以种植以上述方式得到的种子，并且在初始生长期后，通过喷雾进行适当的选择。另一种可能性是在琼脂平板上使用适当的选择剂培育种子(在灭菌后，如果适当的话)，以使仅转化的种子可以长成植物。备选地，筛选转化的植物是否存在选择性标记，如上文所述的那些标记。在DNA转移和再生后，还可以评价推定的转化植物，例如，使用Southern分析，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组组成。备选地或另外地，可以用Northern和/或Western分析监测新引入的DNA的表达水平，所述两种技术都是本领域普通技术人员公知的。

因此，本发明涉及转基因植物，所述转基因植物包含并表达突变体核酸、包含突变体核酸的核酸构建体或包含突变体核酸的载体，其中所述突变体核酸是编码本文所述的本发明的多肽的本发明的核酸。在一个实施方案中，所述突变体核酸编码突变体PYL/PYR(例如PYL4)多肽，所述多肽包含SEQIDNO:3所示的序列、其功能变体或同系物，但是包含在下述位置处的氨基酸置换：

a)对应于SEQIDNO:3所示的PYL4中的位置A194、V97、C176和/或F130中的一个或多个，或

b)对应于SEQIDNO:3所示的PYL4中的位置H82和V97。

因此，所述转基因植物表达具有上述一个或多个突变的突变体版本的SEQIDNO:3(例如，SEQIDNO:60-65中任一个)或表达作为AtPYL4的同系物/直向同源物的突变体。

在一个实施方案中，所述转基因植物包含并表达突变体核酸，所述突变体核酸编码突变体PYL/PYR(例如PYL4)多肽，所述多肽包含SEQID.NO:3所示的序列、其功能变体或同系物，但是其包含在位置A194处的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述转基因植物包含并表达突变体核酸，所述突变体核酸编码突变体PYL4多肽，所述突变体PYL4多肽包含SEQIDNO:3所示的序列、其功能变体或同系物，但是包含在位置V97或与其对应的位置处的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述转基因植物包含并表达突变体核酸，所述突变体核酸编码突变体PYL4多肽，所述突变体PYL4多肽包含SEQIDNO:3所示的序列、其功能变体或同系物，但是包含在位置C176或与其对应的位置处的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述转基因植物包含并表达突变体核酸，所述突变体核酸编码突变体PYL4多肽，所述突变体PYL4多肽包含SEQIDNO:3所示的序列、其功能变体或同系物，但是其包含在位置F130或与其对应的位置处的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述转基因植物包含并表达突变体核酸，所述突变体核酸编码突变体PYL4多肽，所述突变体PYL4多肽包含SEQIDNO:3所示的序列、其功能变体或同系物，但是包含在位置H82和V97或与其对应的位置处的氨基酸置换。如上文关于本发明的核酸所阐释的，SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置A194、V97、C176和/或F130处的突变的任何组合在本发明的范围内。

因此，AtPYL4突变体多肽的序列基本上与SEQIDNO:3相同，但是包含在上述位置中的一个或多个处的氨基酸置换。如其他地方所阐释的，包含突变体核酸、含有突变体核酸的核酸构建体或含有突变体核酸的载体的转基因植物也在本发明的范围内，其中所述核酸编码在关于SEQIDNO:3的一个或多个或相应位置处具有一个或多个突变的AtPYL4的直向同源物。在一个实施方案中，所述转基因植物包含并表达突变体核酸，所述突变体核酸编码多肽，所述多肽包含对应于关于SEQIDNO:3的位置A194的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述多肽因此不包含任何另外的激活突变。在一个实施方案中，所述多肽不具有在关于SEQIDNO:3的下述位置处的突变：H82、V105、V106、L109、A111、D177、F178、V181、C185和/或S189。WO2013/006263中公开的具体激活突变也被排除在外。在另一个实施方案中，所述多肽不包含任何另外的突变。位置194处的A残基可以用V、L、M、I或S置换。在优选的实施方案中，所述置换是A194T。在一个实施方案中，所述突变体多肽是PYL4，其功能变体、同系物或直向同源物，例如，如图8中所示的或如SEQIDNO:7、9、12、14、16、19、21、23、26、28、31、34、37、39或42中所示的，具有在相应位置处的突变。

在另一个实施方案中，所述转基因植物包含并表达突变体核酸，所述突变体核酸包含关于SEQIDNO:3对应于位置H82的氨基酸置换和对应于位置V97的氨基酸置换。优选地，所述多肽不包含任何另外的激活突变。在一个实施方案中，所述多肽不具有在关于SEQIDNO:3的下述位置处的突变：V105、V106、L109、A111、D177、F178、V181、C185和/或S189。WO2013/006263中公开的具体激活突变也被排除在外。在另一个实施方案中，所述多肽不包含任何另外的突变。位置82处的H残基可以用K、N、Q、F、Y、W或P置换。在优选的实施方案中，所述置换是H82R。位置97处的V残基可以用L、M、I、S、T或A置换。在一个实施方案中，所述突变体多肽是PYL4，其功能变体，同系物或直向同源物，例如，如图8中所示的或如SEQIDNO:7、9、12、14、16、19、21、23、26、28、31、34、37、39或42中所示的，具有在相应位置处的突变。

产生的转化植物可以通过各种方式繁殖，诸如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可以自交，并且选择纯合的第二代(或T2)转化体，然后，可以通过经典育种技术进一步繁殖T2植物。产生的转化的生物体可以采取多种形式。例如，其可以是转化的细胞和未转化的细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，所有细胞都被转化从而包含表达盒)；转化的和未转化的组织的嫁接(例如，在植物中，将转化的根茎嫁接到未转化的幼枝上)。

因此，本发明涉及用于产生上述具有改善的胁迫耐受性的转基因植物的方法，所述方法包括：通过转化的方式将编码以下的核酸结合到植物细胞中：SEQIDNO:3所定义的突变体PYL/PYR多肽、其功能变体、同系物或直向同源物，但是其包含对应于SEQIDNO:3中所示的PLY4中的A194、V97、F130和/或C176的一个或多个氨基酸的置换或在SEQIDNO:3所示的PLY4中对应于H82的氨基酸的置换和对应于V97的氨基酸的置换；并且由一个或多个转化的细胞再生植物。用于该方法的突变体多肽在本文其他地方描述。在一个实施方案中，所述PYL/PYR多肽是如图8中所示的PLY4多肽。在另一个实施方案中，所述修饰是在对应于AtPYL4中的A194的位置处，并且所述PYL/PYR多肽是如图8中所示的或如SEQIDNO:7、9、12、14、16、19、21、23、26、28、31、34、37、39或42中所示的PYL4多肽。

本发明的另一方面提供由本文所述的方法产生的植物，所述植物与对照植物相比展现出改善的胁迫耐受性。

本文定义的对照植物是不表达上述核酸或构建体的植物，例如，野生型植物或35S::PYL4植物。

本发明各个方面的植物的特征在于其表现出提高的胁迫耐受性，特别是耐旱性。

本发明还涉及用于改善植物的胁迫抗性或耐受性(例如，耐旱性)的方法，所述方法包括：通过转化的方式将这样的核酸结合到植物细胞中，所述核酸编码SEQIDNO:3、43-54所定义的突变体PYL/PYR多肽、这些序列中任一个的功能变体、同系物或直向同源物，但是其包含对应于SEQIDNO:3中所示的PLY4中的A194、V97、F130和/或C176的一个或多个氨基酸的置换或在SEQIDNO:3所示的PLY4中对应于H82的氨基酸的置换和对应于V97的氨基酸的置换；并且由一个或多个转化的细胞再生植物。用于该方法的突变体多肽如本文其他地方所述。在一个实施方案中，所述PYL/PYR多肽是PLY4多肽，例如，如图8中所示的。在另一个实施方案中，所述修饰是在位置A194处，并且所述PYL/PYR多肽是PLY4多肽，例如，如图8中所示的。

胁迫优选是非生物性胁迫，并且可以选自干旱、盐度、冰冻(由0℃以下的温度引起)、激冷(由0℃以上的低温引起)和热胁迫(由高温引起)。优选地，所述胁迫是干旱。

胁迫可以是严重的或者优选是中度胁迫。在拟南芥研究中，胁迫通常在对野生型植物是致死性的苛刻条件下进行评估。例如，耐旱性主要在非常苛刻的条件下进行评估，在所述条件下，在延长的土壤干燥期后对植物存活进行评分。然而，在温带气候中，有限的水可用性极少引起植物死亡，而是限制生物量和种子产量。中度水胁迫，即对于生长来说欠佳的水可用性，可以在灌溉事件之间的数天或数周的间断性间隔期间发生，并且可以限制叶生长、光截留、光合作用，以及因此限制产量潜力。在早期建立(earlyestablishment)期间水胁迫对叶生长的抑制尤其是不理想的。需要制备在中度胁迫条件下具有增加的产量的植物的方法。换言之，尽管在制备耐胁迫性植物中的植物研究通常被导向鉴定在将引起野生型植物死亡的苛刻条件下表现出增加的耐胁迫性的植物，但是这些植物在中度胁迫条件下表现不好，并且通常表现出引起不必要的产量损失的生长减少。因此，在本发明方法的一个实施方案中，在中度胁迫条件下，产量提高。根据本发明各个方面的转基因植物与对照植物相比表现出对这些类型的胁迫的增强的耐受性，并且能够减少任何的产量/生长损失。因此，耐受性可以被测量为产量的增加，如实施例中所示。术语中度或温和胁迫/胁迫条件可互换使用，并且是指不严重的胁迫。换言之，与严重胁迫不同，中度胁迫不导致植物死亡。在非致死性的中度胁迫条件下，野生型植物能够存活，但是表现出生长和种子生产的减少，并且延长的中度胁迫还可以导致发育停滞。减少可能是至少5％-50％或更多。对严重胁迫的耐受性以存活的百分数进行测量，而中度胁迫不影响存活，而是影响生长率。定义中度胁迫的精确条件在植物与植物之间不同，并且在气候带之间也不同，但是最终，这些中度条件不引起植物死亡。例如，关于高盐度，在约4-8dS/m，大部分植物可以耐受并且存活。具体地，在水稻中，认为超过ECe～4dS/m的土壤盐度是中度盐度，而大于8dS/m的盐度变成高盐度。类似地，认为pH8.8-9.2是非胁迫，而9.3–9.7是中度胁迫，而等于或大于9.8是更高的胁迫。

干旱胁迫可以通过叶片水势进行测量。通常来说，中度干旱胁迫定义为–1至–2Mpa的水势。中度温度在植物间不同，并且尤其在物种间不同。拟南芥的正常温度生长条件定义为22-24℃。例如，在28℃，拟南芥植物生长并存活，但是，由于与持久暴露于该温度相关的“高”温胁迫而表现出严重的损失。然而，同样的28℃的温度对向日葵是最佳的，对于该物种，22℃或38℃引起轻度而非致死性胁迫。换言之，可以针对各物种和基因型来限定最适温度范围以及诱发轻度胁迫或致死的严重胁迫的温度范围。耐旱性可以使用本领域已知的方法进行测量，例如，评估转基因植物较之对照植物的存活，或通过确定膨压、莲座半径、叶中水损失、生长或产量。ABA对气孔孔径的调节是应对干旱胁迫的关键的适应性反应。因此，耐旱性也可以通过评估完整植物在基础条件下的气孔导度(Gst)和蒸腾作用来测量(见图6A和B)。

根据本发明，如果在暴露于干旱后或在暴露于干旱并重新浇水后，存活率比对照植物存活率高至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，则转基因植物具有增强的耐旱性。此外，根据本发明，如果在暴露于干旱后或暴露于干旱并重新浇水后，莲座半径比对照植物的莲座半径大至少10、20、30、40、50％，则转基因植物具有增强的耐旱性。植物可以缺水10-30天，例如20天，并且重新浇水。此外，根据本发明，如果气孔导度(Gst)和蒸腾作用低于对照植物，例如至少低10、20、30、40、50％，则转基因植物具有增强的耐旱性。

因此，在一个实施方案中，本发明的方法涉及增加对中度(非致死性)胁迫或严重胁迫的耐受性。在前者实施方案中，根据本发明的转基因植物表现出增强的耐胁迫性，并且因此，与暴露于胁迫后产量减少的野生型产量相比，植物产量不受所述胁迫影响或影响较小。换言之，可以观察到在中度胁迫条件下的产量提高。

在一个实施方案中，所述方法涉及提高植物营养组织的耐旱性。

术语“增加”、“提高”或“增强”可互换。例如，与对照植物相比，产量增加至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选至少15％或20％，更优选25％、30％、35％、40％或50％或更多。术语“产量”一般指产生可测量的经济价值，典型地与特定的作物、区域和时间期间有关。个体植物部分基于其数量、尺寸和/或重量直接有助于产量，或者实际产量是作物每平方米和每年的产量，其用总产量(包括收获的和鉴定的产量)除以种植平方米而确定。术语植物的“产量”可以涉及所述植物的营养生物量(根和/或芽生物量)、生殖器官和/或繁殖体(如种子)。因此，根据本发明，产量包括下述中的一种或多种并且可以通过评估下述进行测量：每株植物增加的种子产量，增加的种子灌浆率、增加的灌浆种子数目，增加的收获指数，增加的种皮/种荚数目、增加的种子尺寸、增加的生长或增加的分枝，例如，具有更多分枝的花序。优选地，增加的产量包括增加的种皮/种荚数目和/或增加的分枝。产量相对于对照植物增加。

因此，本发明还涉及在胁迫条件下、优选在中度胁迫条件下提高产量，包括通过转化的方式将核酸结合到植物细胞中，所述核酸编码SEQIDNO:3定义的突变体PYL/PYR多肽、其功能变体、同系物或直向同源物，但是其包含对应于SEQIDNO:3中所示的PLY4中的A194、V97、F130和/或C176的一个或多个氨基酸的置换或在SEQIDNO:3中所示的PLY4中对应于H82的氨基酸的置换和对应于V97的氨基酸的置换；并且从一个或多个转化的细胞再生植物。用于该方法的突变体多肽在本文其他地方描述。在一个实施方案中，所述PYL/PYR多肽是PLY4多肽，如图8中所示的，或如SEQIDNO:7、9、12、14、16、19、21、23、26、28、31、34、37、39或42中所示的，具有关于AtPYL4所示的一个或多个对应的突变。在另一个实施方案中，修饰是在对应于AtPYL4中的A194的位置，并且所述PYL/PYR多肽是PYL4多肽，如图8中所示的，或如SEQIDNO:7、9、12、14、16、19、21、23、26、28、31、34、37、39或42所示，具有对应的突变。

除非另外指明，本文所述的本发明的各个方面清楚地延伸至通过本文所述的任一种方法产生、获得或可获得的任何植物细胞或任何植物，和其所有的植物部分和繁殖体。本发明进一步延伸至包括通过前述任一种方法产生的原代转化的或转染的细胞、组织、器官或完整植物的后代，唯一的要求是所述后代表现出与在根据本发明的方法中亲本所产生的那些基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。

本发明还延伸至如上所述的本发明的植物的可收获部分，诸如，但不限于，种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。此外，本发明涉及来源于、优选直接来源于所述植物可收获部分的产品，诸如干燥的团块或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及包含本发明的植物或其部分的食物产品和食品补充物。

本文所述的根据本发明各个方面的转基因植物可以是单子叶植物或双子叶植物。植物PYL/PYR核酸/多肽是单子叶植物或双子叶植物PYL/PYR核酸/多肽。下文中给出单子叶植物或双子叶植物的非限制性实例。

双子叶植物可以选自包括、但不限于下述的科：紫莞目(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)(例如，芸苔(Brassicanapus))、藜科(Chenopodiaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、豆科(Leguminosae)(苏木科(Caesalpiniaceae)、Aesalpiniaceae含羞草科(Mimosaceae)、蝶形花科(Papilionaceae)或豆科(Fabaceae))、锦葵科(Malvaceae)、蔷薇科(Rosaceae)或茄科(Solanaceae)。例如，所述植物可以选自莴苣、向日葵、拟南芥、花椰菜、菠菜、西瓜、南瓜、甘蓝、番茄、马铃薯、山药、辣椒、烟草、棉花、秋葵、苹果、玫瑰、草莓、紫花苜蓿、豆、大豆、芸豆(蚕豆)(field(fava)bean)、豌豆、小扁豆、花生、鹰嘴豆、杏、梨、桃、葡萄藤或柑桔物种。在一个实施方案中，所述植物是油菜(oilseedrape)。

还包括生物燃料和生物能量作物，如油菜/芸苔、甘蔗、甜高粱、黍稷(Panicumvirgatum)(柳枝稷(switchgrass))、亚麻子、羽扇豆和柳树、白杨、白杨杂交种、芒草(Miscanthus)或裸子植物，如火炬松。还包括用于青贮饲料(玉米)、草牧或草料(草、苜蓿、sanfoin、紫花苜蓿)、纤维(例如，棉花、亚麻)、建筑材料(例如，松树、橡树)、纸浆(例如，白杨)、化学工业的给料储备(例如，高芥酸油菜、亚麻子)和用于环境舒适目的(例如，用于高尔夫课的草皮)的作物、用于公共和私家花园的观赏植物(例如，金鱼草、牵牛花、玫瑰花、天竺葵、烟草属物种(Nicotianasp.))和用于家庭的植物和切花(非洲紫罗兰(Africanviolets)、秋海棠(Begonias)、菊花(chrysanthemums)、天竺葵、Coleusspider植物、龙血树属(Dracaena)、橡胶植物)。

例如，单子叶植物可以选自下述科：槟榔科(Arecaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)或禾本科(Poaceae)。例如，所述植物可以是谷物作物，诸如小麦、水稻、大麦、玉米、燕麦、高粱、黑麦、粟、乔麦、草皮草、意大利黑麦草、甘蔗或羊茅属(Festuca)物种，或作物如洋葱、韭菜、山药或香蕉。

优选地，所述植物是作物植物。作物植物意指以商业规模培养用于人或动物消耗或应用的任何植物。

最优选的植物是玉米、水稻、小麦、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、芸豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他蔬菜类芸苔或白杨。

优选的PYL4直向同源物的非限制性列表的序列显示为SEQIDNO:7、9、12、14、16、19、21、23、26、28、31、34、37、39或42，但是当根据本发明使用时，这些在对应于本文对于SEQIDNO:3所示的那些的位置处具有突变。例如，可以将具有一个或多个相应突变的编码SEQIDNo.28的核酸引入到水稻中并表达，可以将具有一个或多个相应突变的编码SEQIDNO:19的核酸引入到大豆中并表达，可以将具有一个或多个相应突变的编码SEQIDNO:14的核酸引入到烟草中并表达，可以将具有一个或多个相应突变的编码SEQIDNO:34的核酸引入到玉米中并表达，或者可以将具有一个或多个相应突变的编码SEQIDNO:31的核酸引入到大麦中并表达。备选地，所述植物是本文定义的植物中的任一种，优选是作物植物，如玉米、小麦、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、芸豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他蔬菜类芸苔或白杨，并且表达的序列是编码本文定义的SEQIDNO:3的突变体的核酸序列。

术语“植物”用在本文中包括完整的植物、所述植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括根茎)、花和组织与器官，其中前述的每一种包含目的基因/核酸。术语“植物”还包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样地，其中前述的每一种包含目的基因/核酸。

本发明还涉及本文所述的分离的核酸、核酸构建体或载体在增加植物的胁迫耐受性(例如耐旱性)和/或产量中的应用。本发明还涉及本文所述的分离的突变体核酸、核酸构建体或载体在减小气孔导度中的应用。本发明还涉及本文所述的分离的核酸、核酸构建体或载体在增加水利用效率中的应用。术语水利用效率当在本文中使用时涉及植物在正常或缺水条件下有效利用水分供应的能力。本发明还涉及相应的方法，即，用于增加转基因植物的胁迫耐受性、减小气孔导度、增加水利用效率的方法，所述方法包括向植物中引入并表达核酸，所述核酸编码SEQIDNO:3定义的突变体PYL/PYR多肽、其功能变体、同系物或直向同源物，但是其包含对应于SEQIDNO:3中所示的PLY4中的A194、V97、F130和/或C176或与其对应的位置的一个或多个氨基酸的置换或在SEQIDNO:3中所示的PYL4中对应于H82的氨基酸的置换和对应于V97或与其对应的位置的氨基酸的置换。优选地，所述方法在低ABA水平进行。

本发明还涉及用于在转基因植物中延长种子休眠/防止早熟萌发/诱导超休眠的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸，所述核酸编码SEQIDNO:3定义的突变体PYL/PYR多肽、其功能变体、同系物或直向同源物，但是其包含对应于SEQIDNO:3中所示的PLY4中的A194、V97、F130和/或C176的一个或多个氨基酸的置换或在SEQIDNO:3中所示的PLY4中对应于H82的氨基酸的置换和对应于V97的氨基酸的置换。用于该方法的突变体多肽在本文中其他地方描述。在一个实施方案中，所述PYL/PYR多肽是PLY4多肽，如图8中所示，或如SEQIDNO:7、9、12、14、16、19、21、23、26、28、31、34、37、39或42所示，在相应的位置具有一个或多个突变。在另一个实施方案中，修饰在位置A194，并且所述PYL/PYR多肽是PYL4多肽，如图8中所示，或如SEQIDNO:7、9、12、14、16、19、21、23、26、28、31、34、37、39或42所示，在相应的位置具有突变。

本发明还涉及用于组成型激活包括PLY4受体的ABA信号传导通路的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸，所述核酸编码SEQIDNO:3定义的突变体PYL/PYR多肽、其功能变体、同系物或直向同源物，但是其包含对应于SEQIDNO:3中所示的PLY4中的A194、V97、F130和/或C176的一个或多个氨基酸的置换或在SEQIDNO:3中所示的PLY4中对应于H82的氨基酸的置换和对应于V97的氨基酸的置换。用于该方法的突变体多肽在本文中其他地方描述。在一个实施方案中，所述PYL/PYR多肽是PLY4多肽，如图8中所示，或如SEQIDNO:7、9、12、14、16、19、21、23、26、28、31、34、37、39或42所示，在相应的位置具有一个或多个突变。在另一个实施方案中，修饰在位置A194，并且所述PYL/PYR多肽是PYL4多肽，如图8中所示，或如SEQIDNO:7、9、12、14、16、19、21、23、26、28、31、34、37、39或42所示，在相应的位置具有突变。

本发明还涉及用于抑制转基因植物中PP2C(优选PP2CA)的活性的方法，所述方法包括在植物中引入并表达核酸，所述核酸编码SEQIDNO:3定义的突变体PYL/PYR多肽、其功能变体、同系物或直向同源物，但是其包含对应于SEQIDNO:3中所示的PLY4中的A194、V97、F130和/或C176的一个或多个的氨基酸置换或在SEQIDNO:3中所示的PLY4中对应于H82的氨基酸的置换和对应于V97的氨基酸的置换。用于该方法的突变体多肽在本文中其他地方描述。在一个实施方案中，所述PYL/PYR多肽是PLY4多肽，如图8中所示，或如SEQIDNO:7、9、12、14、16、19、21、23、26、28、31、34、37、39或42所示，在相应的位置具有一个或多个突变。在另一个实施方案中，修饰在位置A194，并且所述PYL/PYR多肽是PYL4多肽，如图8中所示，或如SEQIDNO:7、9、12、14、16、19、21、23、26、28、31、34、37、39或42所示，在相应的位置具有突变。

本发明还涉及用于提高转基因植物中ABA-依赖性PP2C(优选PP2CA)抑制的方法，所述方法包括在植物中引入并表达突变体核酸，所述突变体核酸编码SEQIDNO:3定义的突变体PYL/PYR多肽、其功能变体、同系物或直向同源物，但是其包含对应于SEQIDNO:3中所示的PLY4中的A194、V97、F130和/或C176的一个或多个的氨基酸置换或在SEQIDNO:3中所示的PLY4中对应于H82的氨基酸的置换和对应于V97的氨基酸的置换。优选地，抑制在低ABA水平被提高。

本发明还涉及用于鉴定PYL/PYR多肽中赋予营养组织耐旱性的突变的方法，所述方法包括：诱变植物群体，再生后代植物，将植物暴露于干旱条件，并且与对照植物和表达在位置A194具有突变的AtPYL4的植物的表型进行比较。鉴定具有与表达AtPYL4的植物类似的表型的植物，并且分析PYL/PYR多肽的序列。

在另一方面，本发明涉及用于制备表达PYR/PYL变体并且特征在于本文所述的表型之一的突变体植物的方法，其中所述方法利用诱变和基因组中靶向诱导的局部病变(TargetingInducedLocalLesionsinGenomes，TILLING)来靶向表达PYR/PYL多肽的基因。根据该方法，产生携带特定突变的株系，其具有已知的表型效应。例如，诱变利用TILLING进行，其中传统的化学诱变之后是高通量筛选点突变。因此，该方法不包括产生转基因植物。针对本文所述的表型中的一种来筛选植物，例如，筛选表现出增加的胁迫耐受性的植物。然后分析PYR/PYL基因座以鉴定负责所观察到的表型的特定PYR/PYL突变。植物可以进行繁殖以获得具有需要的表型并且携带PYR/PYL基因座中的突变的稳定株系。

可以用于靶向DNA编辑的另一种技术是规律成簇间隔短回文重复(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR)(美国专利号8,697,359，Ran等，通过引用结合)。CRISPR系统可以用于在靶序列引入特定的核苷酸修饰。最初在细菌中发现，其中一些不同的CRISPR级联充当先天性免疫系统和天然防御机制，改造的CRISPR-Cas9系统可以被设计成靶向遗传密码的特定片段，并且在精确的位置切割。在过去几年中，这些技术已被利用并且用作基因组编辑工具，使得研究者能够永久性地修饰哺乳动物和植物细胞中的基因。

因此，本发明涉及用于产生编码突变体PYL或PYR多肽的PYL/PYR突变体核酸的方法，所述突变体PYL或PYR多肽包含对应下述的氨基酸置换：

b)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97，其中所述方法包括使用CRISPR修饰植物内源基因组。

所述方法包括通过单导向RNA(single-guideRNA)的20nt引导序列将Cas9靶向特定的基因组基因座(在该情形中，为PYL/PYR)。在线CRISPR设计工具可以鉴定适当的靶位点(http://tools.genome-engineering.org，Ren等)。

通过所述方法获得的植物也在本发明的范围内。因此，本发明涉及通过诱变或基因组编辑获得的非转基因植物，所述非转基因植物包含并表达PYL/PYR核酸，所述PYL/PYR核酸编码与野生型序列相比具有不同序列的PYL/PYR突变体多肽。所述突变体多肽包含对应下述的氨基酸置换：

b)如SEQIDNO:3中所示的PYL4中的位置H82和V97。

尽管前述公开内容提供了包含在本发明范围内的主题的一般描述，包括进行和使用本发明的方法以及其最佳方式，仍然提供下述实施例，进一步使本领域技术人员能够实施本发明并且提供其完整的书面描述。然而，本领域的那些技术人员应该理解，这些实施例的详情不应该认为是限制本发明，其范围应该从本公开内容所附的权利要求书及其等效物进行理解。关于本公开内容，本领域技术人员将清楚本发明的各个其他方面和实施方案。

本说明书中提及的所有文件，包括基因和蛋白数据库中的所有SEQIDNO参考，都通过引用完全结合在本文中。除非另外指明，序列版本是版本1。

用于本文的“和/或”应该理解为这两个特定特征或成分中每一个(具有或不具有另一个)的特别公开。例如，“A和/或B”应该理解为(i)A，(ii)B和(iii)A与B中每一个的特别公开，正如每一个在本文中单独列出。除非上下文另外指示，上述特征的描述和定义不限制本发明的实施方案的任何具体方面，并且同等适用于所述的所有方面和实施方案。

在下述非限制性实施方案中进一步描述本发明。

实施例

鉴定酵母中促进不依赖于ABA的与PP2CA的相互作用的PYL4突变

在Y2H测定中，PYL4以ABA-依赖性方式与PP2CA相互作用(Lackman等人，2011；图1A)。我们进行PYL4受体的易错PCR诱变，并且产生约在pGBKT7载体中的10,000个克隆的等位基因文库。将所述文库通过与pGAD7-PP2CA共转化转移到酵母AH109中。汇集酵母转化体，并且选择能够在缺少组氨酸和腺嘌呤的培养基中在不存在内源性ABA的条件下生长的克隆。提取酵母质粒，测序，并且重新转化到酵母细胞中以重现表型。因此，鉴定编码的PYL4蛋白中的不同突变，所述突变允许与PP2CA的组成型相互作用(图1，A和B)。通过PYR1的位点饱和诱变，Mosquna等人(2011)鉴定了位于所述受体的10个不同残基处的突变，所述突变在不存在ABA的情况下促进PYR1-HAB1相互作用。这些激活突变簇集在受体-磷酸酶相互作用表面，具体在PYR1的门控环、其C端α-螺旋和H60中。PYR1的H60是激活突变的热点，例如，H60P置换使PYR1二聚体不稳定，并且增加其表观ABA亲和力，并且PYR1H60P和PYR1H60R都在不存在ABA的情况下结合HAB1(Dupeux等人，2011a；Mosquna等人，2011)。PYL4中的H60等效残基是H82，并且有趣地，我们在我们的筛选中发现导致与PP2CA的不依赖ABA的相互作用的PYL4H82R突变(图1A)。发现H82R突变是与V97A联合的，而单个的V97A突变在不存在ABA的情况下不影响相互作用，尽管其在存在ABA的条件下增加酵母生长(图1A)。在不存在ABA的情况下增强PYL4与PP2CA的相互作用的其他突变是A194T和双重突变F130YC176R(图1，A和B)。A194T和C176R突变都位于PYL4的C端螺旋中，其代表PYR1中激活突变的另一个热点，因为该α-螺旋形成受体-磷酸酶结合界面的一部分(Mosquna等人，2011)。还发现PP2CHAB1与PYL4的相互作用在酵母中是ABA-依赖性的(Lackman等人，2011)，因此我们决定检测所述的PYL4突变是否在不存在ABA的情况下影响与HAB1的相互作用。然而，与其对与PP2CA的相互作用的影响相反，当用HAB1测定时，这些突变版本的PYL4的表现与PYL4大致一样(图1A)。

PYL4突变在体外对PP2CA活性的影响

Y2H测定揭示PYR/PYL与PP2C之间的ABA-不依赖性和-依赖性相互作用；然而，PYR/PYL受体主要以ABA-依赖性方式抑制进化枝APP2C的活性(Park等人，2009；Ma等人，2009；Santiago等人，2009；Fujii等人，2009)。因此，Y2H测定中不依赖于ABA的相互作用不一定表示在不存在ABA的情况下抑制磷酸酶活性的能力。实际上，尽管大部分单体PYR/PYL受体在Y2H测定中表现出与不同PP2C的不依赖ABA的相互作用，但是有效的磷酸酶抑制需要ABA，并且，例如，PYL8与五种进化枝APP2C的体内结合主要依赖于ABA(Park等人，2009；Ma等人，2009；Santiago等人，2009；Antoni等人，2013)。因此，我们检测这些突变是否真正影响两种进化枝APP2C(即PP2CA和HAB1)的活性。使用对硝基苯基磷酸(pNPP)作为底物，我们能够检测在不存在ABA的情况下，相对于PYL4，PYL4^A194T对PP2CA活性的小抑制作用(20％)(图2A)。然而，尽管H82RV97A和F130YC176R突变在Y2H测定中促进不依赖ABA的相互作用，但是，在不存在ABA的情况下，它们不影响PP2CA活性。在存在1μMABA的条件下，PYL4^A194T还表现出比PYL4更高的PP2CA抑制作用(图2A)。除F130YC176R之外，其他突变与PYL4表现相似，所述F130YC176R在存在ABA的条件下表现出较低的抑制PP2CA的能力。PYL4抑制HAB1比抑制PP2CA更有效(IC50分别为0.25和1μM)，并且所有的PYL4突变体与PYL4相似地抑制HAB1(图2B)。

尽管磷酸酶活性通常使用小的磷酸化的分子如pNPP或磷酸肽进行测量，但是体内磷酸酶活性针对磷酸化的蛋白，并且因此可能包括底物-依赖性作用。因此，我们还进行ABA信号传导级联的体内重建，并且测量PYL4^A194T或PYL4抑制一些PP2CA靶标(即OST1/SnRK2.6，ΔC-ABF2(残基1-173)和ΔC-ABI5(残基1-200)转录因子或阴离子通道SLAC1的N端片段(残基1-186))的去磷酸化的能力(图2C)。首先，进行磷酸化反应，其中OST1在体外自磷酸化，并且其又磷酸化ΔC-ABF2，ΔC-ABI5和SLAC1^1-186蛋白。然后，将这些蛋白用作PP2CA的底物，所述PP2CA在不存在或存在30μMABA的条件下与PYL4或PYL4^A194T预先温育10分钟(或不预先温育)。在不存在ABA的情况下，我们没有发现PYL4与PYL4^A194T之间的显著不同。在存在30μMABA的条件下，PYL4^A194T比PYL4更好地抑制PP2CA对ΔC-ABI5和SLAC1^1-186的去磷酸化，尽管其不比PYL4更有效地抑制ΔC-ABF2的去磷酸化(图2C)。在不存在ABA的情况下，PYL4^A194T表现出增强的与PP2CA相互作用的能力，这可能是由于突变产生了新的接触点。因此，我们推论该突变还可能在存在ABA的条件下，特别是低ABA水平或低磷酸酶:受体比率下导致增强的结合动力学。我们以低ABA浓度(0.1、0.5和1μM)和1:1的磷酸酶:受体比率进行去磷酸化测定(图2D)。在存在0.5-1μMABA的条件下，PYL4^A194T比PYL4更好地(2-3倍)抑制ΔC-ABF2、ΔC-ABI5和SLAC1^1-186的去磷酸化。与PYL4相比，通过PYL4^A194T还提高了OST1磷酸化的保护(图2D)。

PYL4A194T与PP2CA的体外和体内相互作用

下述关于35S:PYL4A194T植物的表型(见图4-7)促使我们使用体内和体外蛋白-蛋白相互作用检测进一步分析PYL4A194T与PP2CA之间的相互作用。首先，使用BiFC测定来分析烟草细胞中PYL4或PYL4A194T与PP2CA或HAB1的相互作用(图3A)。为了这一目的，我们使用土壤杆菌渗入(Agroinfiltration)在本氏烟(N.benthamiana)的表皮细胞中进行PP2CA-YFPN和YFPC-PYL4的瞬时表达。PP2CA与PYL4之间的相互作用不需要加入外源ABA；土壤杆菌渗入后烟草细胞中的内源ABA水平表现为足以促进这样的相互作用，其主要定位在细胞核中。相反，与PYL4相比，PYL4A194T与PP2CA的相互作用在细胞质中相对丰富得多，并且在PYL4A194T-PP2CA相互作用中，相对荧光发射更高(图3B)。HAB1与PYL4或PYL4A194T的相互作用没有显著不同(图3A和B)，

然后，我们进行体外蛋白-蛋白相互作用测定。与PYL4相反，可以在不存在ABA的情况下用Ni-亲和层析法共同纯化无His标记的PYL4^A194T与6His-ΔNPP2CA(图3C)。洗脱级分的尺寸排阻层析和SDS-PAGE分析证实，在不存在ABA的情况下，两种蛋白形成1:1的复合物(图3D)。最后，拉下测定显示，尽管PYL4与PP2CA的相互作用依赖于加入ABA，但是，对于PYL4A194T与PP2CA可以观察到不依赖ABA的结合(图3E)。因此，体内和体外测定都显示相对于PYL4的PYL4A194T与PP2CA的差异性相互作用。

分析过表达PYL4突变体的转基因株系

为了研究PYL4突变对体内ABA信号传导的推定作用，我们产生过表达血凝素(HA)-标记版本的PYL4或突变版本PYL4V97A、PYL4A194T、PYL4C176RF130Y和PYL4H82RV97A的转基因植物。蛋白在营养组织中的表达通过免疫印迹分析进行检测，并且选择表达相似水平的PYL4和突变体PYL4蛋白的转基因株系用于进一步分析；然而，与PYL4或其他突变体蛋白相比，PYL4H82RV97A株系始终表现出较低的转基因表达(图4A)。与未转化的植物相比，过表达PYL4或PYL4V97A增强ABA-介导的幼苗建立抑制，而PYL4C176RF130Y过表达(OE)植物的ABA敏感性与未转化的植物相似。有趣的是，PYL4A194T和PYL4H82RV97AOE植物都表现出比PYL4OE植物更高的针对ABA-介导的幼苗建立的抑制的敏感性(图4B)。低浓度的ABA(0.25-0.5μM)延缓未转化的Colwt的幼苗建立，并且对幼苗的进一步生长具有有限的抑制作用(图4C)。该作用在PYL4或PYL4V97AOE植物中增强，在0.5μMABA尤其明显(图4C)。在PYL4A194T和PYL4H82RV97AOE植物的情形中，所述作用甚至可见于0.25μMABA，表明这些株系表现出比PYL4OE植物更高的对ABA介导的芽生长的抑制的敏感性(图4C和4D)。

我们集中对PYL4A194T转基因株系进一步分析，其中转基因的表达在T4株系中保持稳定。PYL4A194TOE株系的种子萌发和幼苗建立分析证实在T3种子中观察到对ABA的增强的敏感性。此外，根和芽生长分析也揭示营养组织中增强的对ABA的敏感性(图5)。我们将4日龄幼苗转移到缺少或补充有10μMABA的MS培养基平板上，并且在转移后10天测量根生长。与未转化的植物相比，PYL4和PYL4A194TOE植物都表现出增强的ABA介导的根生长抑制(图5，A和B)。通过测量在缺少或补充有10μMABA的MS培养基中生长11天的植物的最大莲座半径来评价芽生长(图5C)。最后，我们测量两种ABA-响应性基因RAB18和RD29B在空白或10μMABA-处理的植物中的表达(图5D)。在不存在外源ABA处理的条件下，与未转化的植物相比，在PYL4A194TOE植物中RAB18和RD29B的表达分别上调6-和23-倍。这些结果表明，与未转化的植物相比，在该株系中ABA响应性基因的部分去抑制。然而，在ABA处理后，这些基因的诱导并不比在未转化的植物中更高。

PYL4A194TOE植物表现出增强的耐旱性

通过ABA调节气孔孔径是应对干旱胁迫的关键适应性反应。为了探测未转化的Col、PYL4和PYL4A194TOE植物中的气孔功能，我们在基础条件下在完整植物中进行气孔导度(Gst)和蒸腾作用的分析(图6A和B)。有趣的是，PYL4和PYL4A194TOE株系都表现出比未转化的Col植物更低的Gst和蒸腾作用值。此外，PYL4A194TOE植物表现出比PYL4OE植物更低的Gst值。在转化的植物中，Gst的昼夜过程通常不受影响；两种OE株系与未转化的Col野生型一样在夜间关闭其气孔，并且约在中午时表现出最大Gst值，接着是黑暗前气孔关闭。仍然，与PYL4A194TOE植物相比，在未转化的Col野生型和PYL4OE中，黎明前气孔开放更明显。后一结果可能直接与PYL4A194TOE植物增强的ABA-敏感性相关，因为昼夜气孔运动经由ABA浓度对离子和糖通量的作用而与ABA浓度相关(Tallman，2004)。

PYL4和PYL4A194TOE植物较低的Gst值表明，在稳态条件下，PYL4和PYL4A194TOE植物的气孔较未转化的Col植物具有减小的孔径。实际上，使用全叶片成像直接测量气孔孔径揭示，与未转化的Col植物的气孔相比，PYL4并且尤其是PYL4A194TOE植物的气孔更加闭合(图6C)。最后，我们还进行了未转化的Col、PYL4和PYL4A194TOE株系的水分损失测定(图6，D和E)。开始，使用在生长室中生长的15日龄幼苗进行水分损失实验，所述幼苗切离自培养皿，并且使其承受层流通风橱的干燥气氛(图6D)。水分损失动力学表明PYL4A194TOE株系失去的水分比未转化的或PYL4OE株系少(图6D)。还在温室条件下在经受干旱胁迫的植物中测量水分损失(图6E)。为了这一目的，在不灌溉11天后从植物上分离叶片，然后将其称重，在软化水中温育3小时，并且再次称重(图6E)。结果，我们发现，与未转化的Col和PYL4OE植物相比，PYL4A194TOE株系表现出减少的水分损失。有趣的是，与未转化的植物相比，PYL4OE株系也表现出减少的水分损失(图6E)。

最后，我们在温室条件下进行耐旱性实验(图7)。植物在温室中在正常浇水条件下生长15天，然后终止灌溉。将这一天视为第0天，并且在未转化的Col、PYL4OE和PYL4A194TOE植物之间平均莲座半径没有显著不同(图7，A和B)。然而，我们发现在随后的5天中，与PYL4A194TOE植物相比，在未转化的Col和PYL4OE植物中植物生长减少(图7B)。在第16天，在野生型中观察到叶片的严重萎蔫和变黄，这与PYL4A194TOE株系相反。最后，在第19天，继续浇水，并且在第23天评分植物的存活。图7C显示Col野生型植物在干旱胁迫后没有存活，而分别有约30％和60-70％的PYL4与PYL4A194TOE株系存活下来。最后，由于PYL4A194T和PYL4H82RV97AOE株系对ABA高度敏感，并且该激素对耐脱水性至关重要，我们检测其在培养皿中经受严重的脱水后是否表现出增强的存活。这些实验使用15日龄的幼苗进行：通过将其在层流通风橱中进行脱水12小时，然后再给水，并且在之后的第3天对存活率进行评分。脱水实验揭示，与PYL4OE和未转化的植物相比，PYL4A194T和PYL4H82RV97AOE株系的耐受性增强。因此，在12小时脱水然后再给水后，大约40％的PYL4A194T和25％的PYL4H82RV97A植物存活下来(图7D)。

过表达PYL4A194T或PYL4H82RV97A的转基因大麦植物在营养阶段表现出增强的耐旱性

为了证实突变受体在作物植物中的效力，我们制备过表达突变体版本的拟南芥PYL4受体(由SEQIDNO:55和56编码)的大麦(Hordeumvulgare)转基因植物。除了其固有的价值之外，PYL4技术在大麦中的验证在为其他的具有巨大农业价值的谷物作物(如玉米、小麦和水稻)指出道路中是无价的。制备转基因大麦植物(见方法)，并且使其经受干旱胁迫(见方法)。结果，我们发现在12天的干旱期后，与未转化的Goldenpromise野生型植物相比，过表达PYL4A194T或PYL4H82RV97A的转基因植物表现出增强的耐旱性(图9，在转基因植物中黄色叶片较少并且叶膨压更高)。将经受干旱的植物重新浇水2天，然后停水，并且在5天后拍照(图9)。与未转化的植物相比，过表达PYL4A194T或PYL4H82RV97A的植物表现出增强的存活和营养生长(图9)，更高的鲜重/叶(图10)和更高的重量/植物(图11)。

讨论

在非胁迫条件下，ABA的内源水平起调节气孔孔径的关键作用，如由多重pyr/pyl突变体的开放气孔表型所揭示的，并且基础ABA信号传导也是合适的植物生长和发育所必需的(Barrero等人，2005；Gonzalez-Guzman等人，2012；Antoni等人，2013)。另一方面，植物对干旱的反应主要依赖于增强的ABA生物合成和信号传导，从而在水胁迫条件下调节气孔孔径和基因表达。因此，一些表现出增强的对ABA的反应的突变体或转基因植物还表现出增强的耐旱性和减少的水分消耗(Pei等人，1998；Hugouvieux等人，2001；Saez等人，2006)。在这一工作中，我们描述了通过基因改造突变的ABA受体加强PYL4与PP2CA的相互作用并且赋予耐旱性的新途径。我们通过易错PCR诱变产生PYL4等位基因文库，并且选择允许PYL4与PP2CA的不依赖于ABA的相互作用的突变。Y2H、体外蛋白-蛋白相互作用和BiFC测定揭示，相对于PYL4，PYL4A194T表现出不同的与PP2CA相互作用的模式(图1和3)。因此，Y2H和落下测定都表明，在不存在ABA的条件下，PYL4A194T与PP2CA组成型相互作用。BiFC测定表明，与PYL4相比，在土壤杆菌渗入的烟草细胞中存在的内源ABA水平，PYL4A194T与PP2CA的相互作用增强。该相互作用在不存在ABA条件下不显著影响PP2CA的体外磷酸酶活性(约20％)；然而，其可能通过空间位阻在体内干扰PP2CA靶标识别。体外磷酸酶活性通常使用仍然可以接近酶的活性位点的小的底物来测量，但是体内活性需要磷酸酶的接近但不同于活性位点的另外的接触位点(Soon等人，2012)。例如，已经描述，PP2CA的失活形式能够仅通过形成复合物而抑制OST1激酶活性(Lee等人，2009)。我们还发现，在存在ABA的条件下，与PYL4相比，PYL4A194T提高一些PP2CA底物(如ABI5和SLAC1)的去磷酸化抑制，而其不提高其他底物(如ABF2)的去磷酸化抑制。可能的是，在存在ABA的条件下，特别是在低-中等的ABA水平，PYL4A194T也表现出比PYL4更快的与PP2CA的结合动力学，这可以解释所述突变的ABA-依赖性作用。最后，因为PP2CA与其靶标相互作用的能力似乎是磷酸酶功能所必需的，所以可预期的是，增强的PYL4A194T与PP2CA的相互作用在基础和胁迫条件下均削弱磷酸酶活性。

通过突变稳定激动剂结合构象来激活ABA受体导致HAB1、ABI1和ABI2的不依赖ABA的抑制(Mosquna等人，2011)。构建三重和四重突变体组合以产生具有组成型活性的(CA)PYR1、PYL2和PYL9受体，其在不存在ABA的情况下有效阻断磷酸酶活性。结果，在拟南芥种子中表达35S:GFP-PYL2CA转基因激活ABA信号传导。然而，消除PYL2CA在营养组织中的表达的转录后机制的存在阻碍了进一步分析(Mosquna等人，2011)。相反，可以在35S:PYL4A194T转基因植物的营养组织中检测到PYL4A194T的表达，其表现出关于种子和营养组织针对ABA的反应的超敏感性。此外，与未转化的或35S:PYL4OE植物相比，35S:PYL4A194T表现出增强的耐旱性。特别有趣的特征是这些株系在基础条件下的ABA响应性基因的部分去抑制、减少的气孔孔径和蒸腾作用，其可能有助于在这些植物中观察到的增强的耐旱性。实际上，这些植物在基础条件下表现出减少的Gst和蒸腾作用并且在经受干旱胁迫时表现出减少的水分损失(图6E)。

相对于HAB1，PYL4A194T的作用表现为对PP2CA具有特异性，因为其与PYL4相比没有对HAB1表现出不同的作用。然而，在该阶段，我们不能排除其他进化枝A磷酸酶(例如，PP2CA分支的其他成员)也可能受PYL4A194T的差异性影响。进化枝APP2C的比对揭示在蛋白的一些区域中可能影响与PYR/PYL的相互作用的两个亚组(ABI1和PP2CA分支)和细微的区别(Santiago等人，2012)。实际上，之前的结果揭示9个进化枝APP2C和14种PYR/PYL的多重相互作用中的特定特异性(Santiago等人，2009；Szostkiewicz等人，2009)，并且最近报告了PYR/PYL对PP2CA的差异性抑制(Antoni等人，2012)。目前尚没有关于PYL4^A194T-PP2CA复合物的结构证据；然而，视为模型，其他复合物可以观察到进化枝APP2C的α2β4环长度的明显差异，所述环与受体-磷酸酶结合界面接近。另外，A194残基位于PYL4的C端螺旋处，接近受体-磷酸酶结合界面。因此，A194T突变还可能间接影响PYL4的C端螺旋与PP2CA的相互作用。

总之，考虑到本文关于PYL4A194T所述的表型，在PYR/PYL基因中引入促进与特定PP2C的不依赖于ABA的相互作用的突变可以充当提高耐旱性的新工具。由强组成型启动子驱动的表达可能导致一些不利地影响作物植物生长或产量的多向性作用。所述缺点可以通过引入胁迫诱导型或组织特异性启动子而避开，所述启动子仅在胁迫条件下或在特定的组织中驱动受体的表达。然而，在转基因大麦植物中在泛素启动子控制下的PYL4A194T或PYL4H82RV97A的表达不削弱在非胁迫条件下的营养生长，并且另一方面，其在胁迫条件下增强耐旱性(图9、10和11)。

材料和方法

植物材料和生长条件

将拟南芥(Arabidopsisthaliana)植物在温室条件下(40-50％的相对湿度)常规培养在含有1:3蛭石-土壤混合物的盆中。对于在生长室条件下生长的植物，对种子进行表面灭菌：用70％乙醇处理20分钟，然后通过含有0.05％TritonX-100的商业漂白剂(2.5％次氯酸钠)处理10分钟，最后用无菌蒸馏水清洗四次。在暗处在4℃进行种子层化3天。将种子播种在由MS基础盐、0.1％2-[N-吗啉代]乙磺酸、1％蔗糖和1％琼脂组成的Murashige-Skoog(MS)平板上。在高压灭菌之前用KOH将pH调节至5.7。将平板密封，并且在控制环境生长室中在22℃在16小时光照、8小时黑暗光周期下以80-100μEm-2sec-1进行培育。

构建PYL4突变体文库并且分析与PP2CA的酵母双杂交相互作用

我们通过使用下述引物扩增PYL4开放阅读框而进行易错PCR诱变：FPYL4NcoI，5′-GCAGCAGCCATGGTTGCCGTTCACCGTCCTTCT和RPYL4EcoRIstop:CGCACGAATTCACAGAGACATCTTCTTCTT，并且使用下述条件：2mMdGTP，dCTP和dTTP，0.5mMdATP，12mMMgCl2和Taq聚合酶。将PCR产物用NcoI-EcoRI双重消化，克隆到pGBKT7载体中，并且通过电穿孔转化DH10B细胞。因此，我们在大肠杆菌(E.coli)中产生约10,000个PYL4突变体克隆的等位基因文库。50个克隆的测序揭示PYL4序列(207个氨基酸)中每个克隆平均1.7个非沉默突变。通过与pGAD7-PP2CA共转化将该文库转移到酵母AH109中。汇集酵母转化体，并且选择能够在缺少组氨酸和腺嘌呤的培养基中在不存在外源ABA的条件下生长的克隆。提取酵母质粒，测序，并且重新转化到酵母细胞中以重现表型。关于酵母双杂交测定的流程与之前所述的那些相似(Saez等人，2008)。

在本氏烟中的BiFC测定

实验基本上如Voinnet等人(2003)所述那样进行。将上述不同的二元载体通过电穿孔引入到根癌土壤杆菌C58C1(pGV2260)中(Deblaere等人，1985)，并且在补充了卡那霉素(50μg/ml)的LB平板中选择转化的细胞。然后，将它们在液体LB培养基中培养至对数期晚期，并且通过离心收集细胞，并将其重悬在含10mMMgCl2和150mM乙酰丁香酮的10mM吗啉乙磺酸(MES)-KOHpH5.6中至OD600nm为1。将这些细胞与等体积的表达番茄丛矮病毒(tomatobushystuntvirus)的沉默抑制剂p19的土壤杆菌C58C1(pCH3235S:p19)(Voinnet等人，2003)混合，使土壤杆菌溶液的终密度约为1。将细菌在室温温育3小时，然后注射到4周龄本氏烟植物的幼小的完全展开的叶片中。在3-4天后在LeicaTCS-SL共聚焦显微镜和激光扫描共聚焦成像系统下检查叶片。荧光蛋白信号的定量按所述(Gampala等人，2007)使用国立卫生研究院(NIH)成像软件ImageJv1.37进行。

构建体完成于pSPYNE-35S(Walter等人，2004)以及入口载体(gatewayvector)pYFPC43(pMDC43的衍生物，其中GFP被替换为YFPC，Belda-Palazon等人，2012)中。将At2g38310(PYL4)的编码序列克隆到pENTR223.1-Sfi进入载体中，该载体由ABRC馈赠(克隆G12806)。PCR扩增PYL4A194T的编码序列，将其克隆到pCR8/GW/TOPO中并且通过测序验证。然后，将含有PYL4和PYL4A194T的构建体通过LR反应重组到pYFPC43目的载体(destinationvector)中。使用BamHI-StuI双重消化将HAB1和PP2CA的编码序列从pCR8/GW/TOPO构建体上切下，并且亚克隆到BamHI-SmaI双重消化的pSPYNE-35S中。

蛋白表达和纯化

对于小规模的蛋白纯化，将转化了相应的构建体的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在100mlLB培养基中培养至OD600为0.6-0.8。在该时间点，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，并且在20℃培养过夜后收集细胞。将沉淀重悬在裂解缓冲液(50mMTrispH7.5，250mMKCl，10％甘油，1mMβ-巯基乙醇)中，并且用BransonSonifier250超声裂解。通过Ni-亲和性纯化离心后得到的澄清裂解液。使用50mMTris，250mMKCl，20％甘油，30mM咪唑和1mMβ-巯基乙醇洗涤缓冲液进行洗涤步骤，最后用50mMTris，250mMKCl，20％甘油，250mM咪唑和1mMβ-巯基乙醇洗脱缓冲液洗脱蛋白。对于蛋白-蛋白相互作用实验，将pET28a_ΔNPP2CA、pETM11_PYL4wt和pETM11_PYL4A194T质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。将总计8ml的过夜培养物在800ml新鲜2TY肉汤(每升溶液有16gBacto胰蛋白胨，10g酵母提取物，5gNaCl)加卡那霉素(50μgml-1)中传代培养。用0.3mMIPTG诱导蛋白表达，并且在20℃过夜温育后收集细胞。将沉淀重悬在25mMTrisHClpH8.0，50mMNaCl，50mM咪唑，5mMβ-巯基乙醇中，并且通过超声破碎。在277K离心(40min，40000g)后，将澄清的上清过滤(孔径为0.45mm；MilliporeCorporation，Bedford，MA，USA)。用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)根据生产商的使用说明纯化带6His标签的蛋白。将过滤的上清与预先平衡的珠子混合。温育后，进行利用十体积的25mMTrisHClpH8.0，50mMNaCl，20mM咪唑，5mMβ-巯基乙醇缓冲液的洗涤步骤，然后在含500mM咪唑的缓冲液中从Ni2+树脂上洗脱。使用PD-10柱(GEHealthcare)去除咪唑，并且用TEV蛋白酶切割His-标签。

6His-ΔNPP2CA和PYL4的结合测定

将6His-ΔNPP2CA沉淀重悬在25mMTrisHClpH8.0，150mMNaCl，50mM咪唑，5mMβ-巯基乙醇，5mMMg2+中，与8mg纯的无标签的(通过TEV切割)PYL4或PYL4A194T混合，并且通过超声破碎。将粗提取物如上所述用来自GEHealthcare的His-TrapHP柱根据生产商的使用说明处理至捕获步骤。在所有情形中，将纯化的蛋白用Superdex20010/300(AmershamBiosciencesLimited，UK)进行尺寸排阻层析，以分析每种蛋白在凝胶过滤中的表现并且分离复合物。为了进行拉下测定，纯化6His-ΔNPP2CA，然后将其固定在Ni-NTA琼脂糖珠子(Qiagen)上，并且与纯的无标签的PYL4或PYL4A194T温育。将混合物在4℃涡旋30分钟，并且在不存在或存在100μMABA的条件下温育。三次洗涤后，通过加入500mM咪唑洗脱蛋白，并且通过SDS-PAGE分析。

PP2C和OST1体外活性测定

使用pNPP或磷酸化的ΔC-ABF2、ΔC-ABI5和SLAC11-186蛋白作为底物测量磷酸酶活性。对于pNPP底物，测定在100μl含有25mMTris-HClpH7.5，2mMMnCl2和5mMpNPP的溶液中进行。测定包含2μM磷酸酶(PP2CA或HAB1)、4μM受体和所示浓度的ABA。在30分钟内用ViktorX5读数仪在405nm每60秒记录磷酸酶活性，并且在图表中显示30分钟后获得的活性。为了获得磷酸化的ΔCABF2、ΔC-ABI5和SLAC11-186蛋白，基本上按之前所述进行OST1磷酸化测定(Dupeux等人，2011b)。如所述的(Antoni等人，2012；Vahisalu等人，2010)制备ΔC-ABF2与SLAC11-186N-端片段。在pETM11载体中表达ΔC-ABI5重组蛋白(氨基酸残基1-200，包含ABA-激活的SnRK2s的C1、C2和C3靶位点)，如上所述。将包含OST1激酶和ΔCABF2、ΔC-ABI5或SLAC11-186重组蛋白的反应混合物在30μl激酶缓冲液(20mMTris-HClpH7.8，20mMMgCl2，2mMMnCl2和3.5μCi的γ-32ATP(3000Ci/mmol))中在室温下温育50分钟。因此，OST1自磷酸化，并且其又使ΔC-ABF2、ΔC-ABI5和SLAC11-186蛋白磷酸化。然后，将它们用作PP2CA的底物，所述PP2CA在不存在或存在30μMABA的条件下用PYL4或PYL4A194T(1:10磷酸酶:受体比率)预温育10(或不预先温育)。通过加入Laemmli缓冲液终止反应，并且利用8％丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE分离蛋白，并将其转移到Immobilon-P膜(Millipore)上。使用Phosphorimage系统(FLA5100，Fujifilm)检测并定量放射性。扫描后，将相同的膜用于Ponceau染色。显示的数据为至少三次独立的实验的平均。

制备转基因株系

将PYL4或PYL4突变体克隆到pCR8/GW/TOPO进入载体(Invitrogen)中，并且通过LR反应重组到入口相容性ALLIGATOR2载体(Bensmihen等人，2004)中。该构建体在35SCaMV启动子的控制下驱动PYL4的表达，并且在蛋白的N端引入三联HA表位。转基因株系的选择基于种子中GFP的可视化，其表达由特异性种子启动子At2S3驱动。将ALLIGATOR2-35S:3HA-PYL4或突变体构建体通过电穿孔转移到根癌土壤杆菌C58C1(pGV2260)(Deblaere等人，1985)中，并且用于通过花浸染法转化Columbia野生型植物。基于GFP可视化选择T1转基因种子，并且播种到土壤中以获得T2代。对于每个构建体至少产生三个独立的转基因株系。纯合T3代用于进一步的研究，并且带HA标签的蛋白在21日龄幼苗中的表达通过使用抗-HA-过氧化物酶(Roche)的免疫印迹分析进行验证。

种子萌发和幼苗建立测定

在种子表面灭菌后，在暗处在4℃进行3天层化。将每个基因型约100粒种子播种在按实验补充有不同浓度的ABA的MS平板上。为了对种子萌发进行评分，在播种后72小时分析根出现(radicalemergence)。幼苗建立评分为在第7天发育绿色展开的子叶和第一对真叶的种子的百分数。

根和芽生长测定

将幼苗在垂直放置的MS平板上培养4-5天。然后，将20株植物转移到缺少或补充有所示浓度的ABA的新MS平板上。10天后在平台扫描仪上扫描平板以产生适于用NIH软件ImageJv1.37定量分析根生长的图像文件。作为芽生长的指示，测量最大莲座半径。

RNA分析

ABA处理后，进行RNA提取和定量RT-PCR扩增，如之前所述(Saez等人，2004)。

整莲座气孔导度和蒸腾作用测量

之前已经描述了拟南芥整莲座(whole-rosette)气体交换测量装置、用于计算水蒸气的蒸腾作用和Gst的植物生长实践和定制书面程序(Kollist等人，2007；Vahisalu等人，2008)。对于气体交换实验，使用25-28日龄的植物(莲座面积为6-18cm2)。将植物在生长室(AR-66LX和AR-22L，PercivalScientific，IA，USA)中以12/12光周期，23/18℃温度，70-80％的空气相对湿度和150μmolm-2s-1光培养直至测量。在气体交换测量期间，将比色皿中的温度、空气相对湿度、光周期和光尽可能地保持与生长室中的值相似。在实验前后给植物拍照，并且使用NIH软件ImageJ1.37v计算莲座叶面积。中间实验期的叶面积值使用开始和最终叶面积间的线性回归计算。

水分损失和气孔孔径测定

对于水分损失测定，使用在MS平板上生长的2-3周龄的幼苗。使每种基因型四棵具有相似的生长的幼苗(三次独立的实验)经受层流通风橱的干燥气氛。进行水分损失的动力学分析，并且表示为在每个评分时间点的初始鲜重的百分数。使用整叶成像(Chitrakar和Melotto，2010)在温室条件下生长的5周龄植物的叶中进行气孔孔径测量。用碘化丙啶进行整叶染色，并且使用LeicaTCS-SL共聚焦显微镜测量30-40个气孔的孔径(宽/长比，两次独立的实验)。

干旱胁迫

将在温室条件下生长的植物(每个实验10株个体，三个独立的实验)在正常的浇水条件下培养15天，然后通过在20天期间停止灌溉而使其经受干旱胁迫。然后，继续浇水，并且在3天后通过计数具有多于四片绿叶的植物的百分数来计算存活率。在实验开始时(第0天)、干旱16天和19天后和重新浇水后3天拍照。测量芽生长和水分损失，如下所述。在停止灌溉(第0天)后的第2、5、7和9天通过测量植物的最大莲座半径来进行芽生长定量。在实验开始后第11天从每株植物上摘下的两片叶子中进行水分损失测量，然后称重，在软化的水中温育3小时，并且再次称重。认为重量的差异为水分损失并且与初始鲜重相关(μlH2O/gFW)。

脱水处理

将在MS平板上生长的2周龄幼苗用于这些实验。使每种基因型二十棵幼苗(两次独立的实验)经受层流通风橱的干燥气氛达12小时(25℃±1℃，25％±2％相对湿度)，然后用25ml水再给水。在再给水后3天通过计数具有至少四片绿叶的植物的百分数对存活百分数进行评分。

登记号

PYL4和PP2CA的拟南芥基因组初始基因座标识符分别为At2g38310和At3g11410。

大麦中的表达

大麦植物材料.构建载体和转基因株系.

为了证明突变体受体在作物植物中的功效，我们制备过表达突变体版本的拟南芥PYL4受体(由SEQIDNO:55和56编码)的大麦(Hordeumvulgare)转基因植物。经由土壤杆菌介导的转化(Bartlett等人，2008)制备表达由pBract214载体的泛素启动子驱动的拟南芥PYL4^A194T或PYL4^H82RV97A开放阅读框的转基因大麦(cv.GoldenPromise)。将编码PYL4^A194T或PYL4^H82RV97A开放阅读框的核苷酸序列通过LR反应从pCR8/GW/TOPO进入载体重组到Gateway相容性pBract214目的载体中。引入大麦中的序列是携带所示突变的拟南芥开放阅读框。此外，(如SEQIDNO；2所示的序列的)第二密码子被修饰成GTT，以得到NcoI位点从而有助于克隆。

将不成熟的胚与包含已经克隆有目的基因的过表达载体pBract214的土壤杆菌菌株AGL1温育。pBract214还包含潮霉素抗性基因从而允许选择转基因组织和植物。在共同温育3天后，将不成熟的胚转移到包含潮霉素(以允许选择转化的组织)和特美汀(timentin)(以去除土壤杆菌)的选择性愈伤组织诱导培养基。在总计6周的愈伤组织诱导后，将愈伤组织移到低光下的过渡培养基中，然后在2周后移到在全光下的再生培养基中。当芽长度达到2-3cm时，将再生的植物转移到生根管中。然后将在包含潮霉素的培养基中具有强壮的根的植物植于土壤中，并且在控制环境条件下培养至成熟，以获得T1种子后代。

生长条件和干旱胁迫处理

将大麦植物(cv.GoldenPromise)在温室条件(40-50％相对湿度，23-24℃)下在含有1:3蛭石-土壤混合物的盆中常规培养。将盆在托盘中分组，其中保持水在所述托盘底部之上约0.2-1cm。对于干旱(D)胁迫实验，将四周龄的植物用自来水浇水12天(-D，水保持在托盘底部之上0.2-1cm)或者经受干旱达12天(+D，取消浇水)。每株植物称重一片旗叶(每个遗传背景-和+D处理10株个体植物)，以获得其鲜重，并且在70℃干燥16小时并再次称重以获得其干重。在12天的干旱期后，将经受干旱的植物重新浇水(RW，水在托盘底部之上1cm达2天，然后取消浇水)，并且在5天后获得每株植物的重量(破坏性测量，以获得地上生物量)(+D，+RW)。得到的结果记述在图9、10和11中。

参考文献列表

AntoniR，Gonzalez-GuzmanM，RodriguezL，RodriguesA，PizzioGA，RodriguezPL(2012)SelectiveInhibitionofCladeAPhosphatasesType2CbyPYR/PYL/RCARAbscisicAcidReceptors(PYR/PYL/RCAR脱落酸受体对2C型进化枝A磷酸酶的选择性抑制).PlantPhysiol158:970-980

AntoniR，Gonzalez-GuzmanM，RodriguezL，Peirats-LlobetM，PizzioGA，FernandezMA，DeWinneN，DeJaegerG，DietrichD，BennettMJ，RodriguezPL(2013)PYRABACTINRESISTANCE1-LIKE8playsanimportantrolefortheregulationofabscisicacidsignalinginroot(PYRABACTINRESISTANCE1-LIKE8在调节根部脱落酸信号传导中起重要作用).PlantPhysiol161:931-941

BarreroJM，PiquerasP，Gonzalez-GuzmanM，SerranoR，RodriguezPL，PonceMR，MicolJL(2005)AmutationalanalysisoftheABA1geneofArabidopsisthalianahighlightstheinvolvementofABAinvegetativedevelopment(拟南芥(Arabidopsisthaliana)ABA1基因的突变分析突出ABA1参与营养发育).JExpBot56:2071-2083

BartlettJG，AlvesSC，SmedleyM，SnapeJW，HarwoodWA(2008)High-throughputAgrobacterium-mediatedbarleytransformation(高通量土壤杆菌介导的大麦转化).PlantMethods4:22

Belda-PalazonB，RuizL，MartiE，TarragaS，TiburcioAF，CulianezF，FarrasR，CarrascoP，FerrandoA(2012)Aminopropyltransferasesinvolvedinpolyaminebiosynthesislocalizepreferentiallyinthenucleusofplantcells(参与聚胺生物合成的氨基丙基转移酶优先定位在植物细胞的核中).PLoSOne7:e46907

BensmihenS，ToA，LambertG，KrojT，GiraudatJ，ParcyF(2004)AnalysisofanactivatedABI5alleleusinganewselectionmethodfortransgenicArabidopsisseeds(使用用于转基因拟南芥种子的新选择方法分析激活的ABI5等位基因).FEBSLett561:127-131

ChitrakarR，MelottoM(2010)Assessingstomatalresponsetolivebacterialcellsusingwholeleafimaging(使用完整叶片成像评估针对活细菌细胞的气孔反应).JVisExp

CutlerSR，RodriguezPL，FinkelsteinRR，AbramsSR(2010)Abscisicacid:emergenceofacoresignalingnetwork(脱落酸：核心信号传导网络的出现).AnnuRevPlantBiol61:651-679

DeblaereR，BytebierB，DeGreveH，DeboeckF，SchellJ，VanMontaguM，LeemansJ(1985)EfficientoctopineTiplasmid-derivedvectorsforAgrobacterium-mediatedgenetransfertoplants(用于土壤杆菌介导的基因向植物转移的有效的章鱼肉碱Ti质粒-来源的载体).NucleicAcidsRes13:4777-4788

DupeuxF，SantiagoJ，BetzK，TwycrossJ，ParkSY，RodriguezL，Gonzalez-GuzmanM，JensenMR，KrasnogorN，BlackledgeM，HoldsworthM，CutlerSR，RodriguezPL，MarquezJA(2011a)Athermodynamicswitchmodulatesabscisicacidreceptorsensitivity(热力学转换调节脱落酸受体敏感性).EMBOJ30:4171-4184

DupeuxF，AntoniR，BetzK，SantiagoJ，Gonzalez-GuzmanM，RodriguezL，RubioS，ParkSY，CutlerSR，RodriguezPL，MarquezJA(2011b)ModulationofAbscisicAcidSignalinginVivobyanEngineeredReceptor-InsensitiveProteinPhosphataseType2CAllele(通过改造的受体-不敏感性蛋白磷酸酶2C型等位基因调节体内脱落酸信号传导).PlantPhysiol156:106-116

GampalaSS，KimTW，HeJX，TangW，DengZ，BaiMY，GuanS，LalondeS，SunY，GendronJM，ChenH，ShibagakiN，FerlRJ，EhrhardtD，ChongK，BurlingameAL，WangZY(2007)Anessentialrolefor14-3-3proteinsinbrassinosteroidsignaltransductioninArabidopsis(14-3-3蛋白在拟南芥油菜素甾醇信号转导中的基本作用).DevCell13:177-189

Gonzalez-GuzmanM，PizzioGA，AntoniR，Vera-SireraF，MeriloE，BasselGW，FernandezMA，HoldsworthMJ，Perez-AmadorMA，KollistH，RodriguezPL(2012)ArabidopsisPYR/PYL/RCARReceptorsPlayaMajorRoleinQuantitativeRegulationofStomatalApertureandTranscriptionalResponsetoAbscisicAcid(拟南芥PYR/PYL/RCAR受体在气孔孔径的定量调节和针对脱落酸的转录响应中起主要作用).PlantCell24:2483-2496

HaoQ，YinP，LiW，WangL，YanC，LinZ，WuJZ，WangJ，YanSF，YanN(2011)TheMolecularBasisofABA-IndependentInhibitionofPP2CsbyaSubclassofPYLProteins(PYL蛋白亚类对PP2C的不依赖ABA的抑制作用的分子基础).MolCell42:662-672

HugouvieuxV，KwakJM，SchroederJI(2001)AnmRNAcapbindingprotein,ABH1,modulatesearlyabscisicacidsignaltransductioninArabidopsis(mRNA帽结合蛋白ABH1调节拟南芥中的早期脱落酸信号转导).Cell106:477-487

IuchiS，KobayashiM，TajiT，NaramotoM，SekiM，KatoT，TabataS，KakubariY，Yamaguchi-ShinozakiK，ShinozakiK(2001)Regulationofdroughttolerancebygenemanipulationof9-cisepoxycarotenoiddioxygenase,akeyenzymeinabscisicacidbiosynthesisinArabidopsis(通过9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(拟南芥中脱落酸生物合成中的关键酶)的基因操作调节耐旱性).PlantJ27:325-333

JakabG，TonJ，FlorsV，ZimmerliL，MetrauxJP，Mauch-ManiB(2005)EnhancingArabidopsissaltanddroughtstresstolerancebychemicalprimingforitsabscisicacidresponses(通过化学引发其脱落酸反应而增强拟南芥的盐和干旱胁迫耐受性).PlantPhysiol139:267-274

KollistT，MoldauH，RasulovB，OjaV，RammaH，HuveK，JaspersP，KangasjarviJ，KollistH(2007)Anoveldevicedetectsarapidozone-inducetransientstomatalclosureinintactArabidopsisanditsabsenceinabi2mutant(新型装置检测完好的拟南芥中的快速臭氧-诱导的瞬时气孔关闭，并且其在abi2突变体中不存在).PhysiolPlant129:796-803

KuhnJM，Boisson-DernierA，DizonMB，MaktabiMH，SchroederJI(2006)TheproteinphosphataseAtPP2CAnegativelyregulatesabscisicacidsignaltransductioninArabidopsis,andeffectsofabh1onAtPP2CAmRNA(蛋白磷酸酶AtPP2CA不利地调节拟南芥中的脱落酸信号转导和abh1对AtPP2CAmRNA的作用).PlantPhysiol140:127-139

LackmanP，Gonzalez-GuzmanM，TillemanS，CarqueijeiroI，PerezAC，MosesT，SeoM，KannoY，HakkinenST，VanMontaguMC，TheveleinJM，MaaheimoH，Oksman-CaldenteyKM，RodriguezPL，RischerH，GoossensA(2011)JasmonatesignalinginvolvestheabscisicacidreceptorPYL4toregulatemetabolicreprogramminginArabidopsisandtobacco(Jasmonate信号传导包括脱落酸受体PYL4，以调节拟南芥和烟草中的代谢重编程).ProcNatlAcadSciUSA108:5891-5896

LeeSC，LanW，BuchananBB，LuanS(2009)Aproteinkinase-phosphatasepairinteractswithanionchanneltoregulateABAsignalinginplantguardcells(蛋白激酶-磷酸酶对与离子通道相互作用来调节植物保卫细胞中的ABA信号传导).ProcNatlAcadSciUSA106:21419-21424

MaY，SzostkiewiczI，KorteA，MoesD，YangY，ChristmannA，GrillE(2009)RegulatorsofPP2CPhosphataseActivityFunctionasAbscisicAcidSensors(PP2C磷酸酶活性调节剂作用为脱落酸感受器).Science324:1064-1068

MosqunaA，PetersonFC，ParkSY，Lozano-JusteJ，VolkmanBF，CutlerSR(2011)Potentandselectiveactivationofabscisicacidreceptorsinvivobymutationalstabilizationoftheiragonist-boundconformation(通过突变稳定其激动剂-结合的构象而在体内有效且选择性的激活脱落酸受体).ProcNatlAcadSciUSA108:20838-20843

PeiZM，GhassemianM，KwakCM，McCourtP，SchroederJI(1998)RoleoffarnesyltransferaseinABAregulationofguardcellanionchannelsandplantwaterloss(法尼基转移酶在保卫细胞阴离子通道和植物水分损失的ABA调节中的作用).Science282:287-290

QinX，ZeevaartJA(2002)Overexpressionofa9-cis-epoxycarotenoiddioxygenasegeneinNicotianaplumbaginifoliaincreasesabscisicacidandphaseicacidlevelsandenhancesdroughttolerance(在Nicotianaplumbaginifolia中过表达9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶增加脱落酸和红豆菜豆酸水平并且增强耐旱性).PlantPhysiol128:544-551

Ran等GenomeengineeringusingtheCRISPR-Cas9systemnatureprotocols(使用CRISPR-Cas9系统天然流程进行基因组改造)，VOL.8NO.11，2281-2308，2013

SaavedraX，ModregoA，RodriguezD，Gonzalez-GarciaMP，SanzL，NicolasG，LorenzoO(2010)ThenuclearinteractorPYL8/RCAR3ofFagussylvaticaFsPP2C1isapositiveregulatorofabscisicacidsignalinginseedsandstress(欧洲山毛榉(Fagussylvatica)FsPP2C1的核相互作用剂PYL8/RCAR3是种子和胁迫下脱落酸信号传导的正调节剂).PlantPhysiol152:133-150

SaezA，ApostolovaN，Gonzalez-GuzmanM，Gonzalez-GarciaMP，NicolasC，LorenzoO，RodriguezPL(2004)Gain-of-functionandloss-of-functionphenotypesoftheproteinphosphatase2CHAB1revealitsroleasanegativeregulatorofabscisicacidsignaling(蛋白磷酸酶2CHAB1获得功能和失去功能的表型揭示其作为脱落酸信号传导的负调节剂的作用).PlantJ37:354-369

SaezA，RobertN，MaktabiMH，SchroederJI，SerranoR，RodriguezPL(2006)EnhancementofabscisicacidsensitivityandreductionofwaterconsumptioninArabidopsisbycombinedinactivationoftheproteinphosphatasestype2CABI1andHAB1(在拟南芥中通过联合失活蛋白磷酸酶2C型ABI1和HAB1而增强脱落酸敏感性并减少水分消耗).PlantPhysiol141:1389-1399

SaezA，RodriguesA，SantiagoJ，RubioS，RodriguezPL(2008)HAB1-SWI3BinteractionrevealsalinkbetweenabscisicacidsignalingandputativeSWI/SNFchromatin-remodelingcomplexesinArabidopsis(HAB1-SWI3B相互作用揭示拟南芥中脱落酸信号传导与推定的SWI/SNF染色质-重建复合物之间的联系).PlantCell20:2972-2988

SantiagoJ，RodriguesA，SaezA，RubioS，AntoniR，DupeuxF，ParkSY，MarquezJA，CutlerSR，RodriguezPL(2009a)ModulationofdroughtresistancebytheabscisicacidreceptorPYL5throughinhibitionofcladeAPP2Cs(通过脱落酸受体PYL5经由抑制进化枝APP2C而调节耐旱性).PlantJ60:575-588

SantiagoJ，DupeuxF，RoundA，AntoniR，ParkSY，JaminM，CutlerSR，RodriguezPL，MarquezJA(2009b)TheabscisicacidreceptorPYR1incomplexwithabscisicacid(与脱落酸复合的脱落酸受体PYR1).Nature462:665-668

SantiagoJ，DupeuxF，BetzK，AntoniR，Gonzalez-GuzmanM，RodriguesL，MarquezJ，RodriguezPL(2011)StructuralinsightsintoPYR/PYL/RCARABAreceptorandPP2Cs(对PYR/PYL/RCARABA受体与PP2C的结构理解).PlantScience182:3-11

SoonFF，NgLM，ZhouXE，WestGM，KovachA，TanMH，Suino-PowellKM，HeY，XuY，ChalmersMJ，BrunzelleJS，ZhangH，YangH，JiangH，LiJ，YongEL，CutlerS，ZhuJK，GriffinPR，MelcherK，XuHE(2012)MolecularmimicryregulatesABAsignalingbySnRK2kinasesandPP2Cphosphatases(分子模拟物通过SnRK2激酶和PP2C磷酸酶调节ABA信号传导).Science335:85-88

TallmanG(2004)ArediurnalpatternsofstomatalmovementtheresultofalternatingmetabolismofendogenousguardcellABAandaccumulationofABAdeliveredtotheapoplastaroundguardcellsbytranspiration？(气孔运动的白天模式是内源性保卫细胞ABA的交替机制和通过蒸腾作用递送到保卫细胞附近的质外体的ABA的累积的结果吗？)JExpBot55:1963-1976VahisaluT，KollistH，WangYF，NishimuraN，ChanWY，ValerioG，LamminmakiA，BroscheM，MoldauH，DesikanR，SchroederJI，KangasjarviJ(2008)SLAC1isrequiredforplantguardcellStypeanionchannelfunctioninstomatalsignaling(气孔信号传导中植物保卫细胞Stype阴离子通道功能需要SLAC1).Nature452:487-491

VahisaluT，PuzorjovaI，BroscheM，ValkE，LepikuM，MoldauH，PechterP，WangYS，LindgrenO，SalojarviJ，LoogM，KangasjarviJ，KollistH(2010)Ozone-triggeredrapidstomatalresponseinvolvestheproductionofreactiveoxygenspecies，andiscontrolledbySLAC1andOST1(Ozone-介导的快速气孔反应包括产生活性氧物种，并且受SLAC1和OST1的控制).PlantJ62:442-453

VoinnetO，RivasS，MestreP，BaulcombeD(2003)Anenhancedtransientexpressionsysteminplantsbasedonsuppressionofgenesilencingbythep19proteinoftomatobushystuntvirus(植物中基于通过番茄丛矮病毒的p19蛋白阻抑基因沉默的增强的瞬时表达系统).PlantJ33:949-956

WalterM，ChabanC，SchutzeK，BatisticO，WeckermannK，NakeC，BlazevicD，GrefenC，SchumacherK，OeckingC，HarterK，KudlaJ(2004)Visualizationofproteininteractionsinlivingplantcellsusingbimolecularfluorescencecomplementation(利用生物分子荧光互补性显现活的植物细胞中的蛋白相互作用).PlantJ40:428-438

YoshidaT，NishimuraN，KitahataN，KuromoriT，ItoT，AsamiT，ShinozakiK，HirayamaT(2006)ABA-hypersensitivegermination3encodesaproteinphosphatase2C(AtPP2CA)thatstronglyregulatesabscisicacidsignalingduringgerminationamongArabidopsisproteinphosphatase2Cs(ABA-超敏感性萌发3编码拟南芥蛋白磷酸酶2Cs中强烈调节萌发过程中的脱落酸信号传导的蛋白酶2C(AtPP2CA)).PlantPhysiol140:115-126

ZhangX，ZhangQ，XinQ，YuL，WangZ，WuW，JiangL，WangG，TianW，DengZ，WangY，LiuZ，LongJ，GongZ，ChenZ(2012)ComplexstructuresoftheabscisicacidreceptorPYL3/RCAR13revealauniqueregulatorymechanism(脱落酸受体PYL3/RCAR13的复合结构揭示一种独特的调节机制).Structure20:780-790

序列表

SEQIDNO:1:AtPYL4核酸序列(基因组；包含自5’和3’UTR的残基的编码序列)

SEGIDNO：2：AtPYL4核酸序列(cDNA；编码序列)

SEQIDNO：3：AtPYL4蛋白序列(＞lcl|AT2G38310.1)

MLAVHRPSSAVSDGDSVQIPMMIASFQKRFPSLSRDSTAARFHTHEVGPNQCCSAVIQEISAPISTVWSVVRRFDNPQAYKHFLKSCSVIGGDGDNVGSLRQVHVVSGLPAASSTERLDILDDERHVISFSVVGGDHRLSNYRSVTTLHPSPISGTVVVESYVVDVPPGNTKEETCDFVDVIVRCNLQSLAKIAENTAAESKKKMSL

SEQIDNO：4：AtPYL4mRNA

SEQIDNO:5:PYL4葡萄(Vitisvinifera)核酸序列(基因组；包含自5’UTR的残基的编码序列)XP_002264158.1

SEQIDNO:6PYL4葡萄核酸序列(cDNA；编码序列)

SEQIDNO:7:PYL4葡萄蛋白序列

SEQIDNO:8:PYL4杨树(Populustrichocarpa)核酸序列(基因组/cDNA序列；编码序列)；XP_002323024.1

SEQIDNO:9:PYL4杨树蛋白序列

SEQIDNO:10:PYL4番茄(Solanumlycopersicum)核酸序列(基因组:包含自5’和3’UTR的残基的编码序列)；XP_004249671.1

SEQIDNO:11:PYL4番茄核酸序列(cDNA:编码序列)

SEQIDNO:12:PYL4番茄蛋白序列

SEQIDNO:13:PYL4烟草(Nicotianatabacum)核酸序列(基因组/cDNA序列；编码序列)；CAI84653.1

ATGCCTCCTAGTTCTCCAGATTCATCTGTTTTACTCCAAAGAATAAGCTCCAACACTACTCCTGATTTTGCCTGTAAACAATCTCAGCAATTACAAAGGCGTACTATGCCGATACCTTGT

ACGACACAAGTCCCAGATTCCGTTGTCCGATTCCATACTCACCCAGTGGGTCCCAACCAGTGCTGCTCCGCCGTGATCCAGCGGATTTCCGCCCCCGTCTCCACCGTATGGTCAGTTGTCCGCCGCTTCGACAACCCGCAAGCATACAAGCATTTCGTCAAGAGCTGCCACGTCATCGTAGGGGATGGTGACGTCGGCACTCTCCGCGAGGTTCGCGTGATCTCAGGCCTTCCAGCTGCGTCCAGCACGGAAAGACTCGAGATCCTCGACGACGAGCGCCATGTCATCAGCTTCAGCGTAGTCGGCGGGGACCACCGACTCGCGAATTACCGTTCCGTCACCACCCTCCACCCGGAACCGTCTGGTGACGGGACGACCATCGTCGTTGAATCCTACGTTGTTGATGTACCACCTGGTAATACTAGAGATGAAACGTGTGTTTTCGTCGATACCATCGTCAAATGCAACCTCACATCGTTATCGCAGATCGCAGTAAACGTGAACAGAAGAAAAGATTCTTGA

SEQIDNO：14：PYL4烟草蛋白序列

SEQIDNO：15：PYL4黄瓜(Cucumissativus)核酸序列，XP_004148626.1

SEQIDNO：16：PYL4黄瓜蛋白序列

SEQIDNO:17:PYL4大豆(Glycinemax)核酸序列(基因组；包含自5’和3’UTR的残基的编码序列)；XP_003519420.1

SEQIDNO:18:PYL4大豆核酸序列(cDNA；编码序列)

SEQIDNO:19:PYL4大豆蛋白序列

SEQIDNO:20:PYL4野草莓亚种野草莓(Fragariavescasubsp.Vesca)核酸序列；XP_004302617.1

SEQIDNO:21:PYL4野草莓亚种野草莓蛋白序列

SEQIDNO:22:PYL4蓖麻(Ricinuscommunis)核酸序列；XP_002520792.1

SEQIDNO:23:PYL4蓖麻蛋白序列

SEQIDNO:24:PYL4蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)核酸序列(基因组；包含自5’UTR的残基的编码序列)；XP_003623366.1

SEQIDNO:25:PYL4蒺藜苜蓿核酸序列(cDNA；编码序列)

SEQIDNO:26:PYL4蒺藜苜蓿蛋白序列

SEQIDNO:27:桃树(Prunuspersica)核苷酸序列(基因组/cDNA；编码序列)

SEQIDNO:28:PYL4桃树蛋白序列；EMJ20866.1

SEQIDNO:29:PYL4大麦亚种大麦(Hordeumvulgaresubsp.Vulgare)核酸序列(基因组；包含自5’和3’UTR的残基的编码序列)；BAJ93794.1

SEQIDNO:30:PYL4大麦亚种大麦核酸序列(cDNA；编码序列)

SEQIDNO:31:PYL4大麦亚种大麦蛋白序列

SEQIDNO:32:PYL4玉米(Zeamays)核酸序列(基因组)；ACG26321.1

SEQIDNO:33PYL4玉米核酸序列(cDNA；编码序列，GenBank:BT067140.1，ZM_BFb0206N02mRNA)

SEQIDNO:34:PYL4玉米蛋白序列，GenBank:ACN34037.1

SEQIDNO:35:PYL4日本晴水稻(OryzasativaJaponicaGroup)核酸序列(基因组；包含自5’和3’UTR的残基的编码序列)

SEQIDNO:36:PYL4日本晴水稻核酸序列(cDNA；编码序列)

SEQIDNO:37:PYL4日本晴水稻蛋白序列

SEQIDNO:38:PYL4小麦(Triticumaestivum)核苷酸序列(基因组/cDNA；编码序列)；GenBank:GAEF01112574.1

SEQIDNO:39:PYL4小麦部分蛋白序列

SEQIDNO:40:PYL4甜橙(Citrussinensis)核苷酸序列(基因组；包含5’和3’UTR的编码序列)

SEQIDNO:41:PYL4甜橙核苷酸序列(cDNA；编码序列)

SEQIDNO:42:PYL4甜橙蛋白序列

SEQIDNO:43-54是At蛋白序列

SEQIDNO:43:PYL1氨基酸序列，NP_199491.2；At5g46790

MetAlaAsnSerGluSerSerSerSerProValAsnGluGluGluAsnSerGlnArgIleSerThrLeuHisHisGlnThrMetProSerAspLeuThrGlnAspGluPheThrGlnLeuSerGlnSerIleAlaGluPheHisThrTyrGlnLeuGlyAsnGlyArgCysSerSerLeuLeuAlaGlnArgIleHisAlaProProGluThrValTrpSerValValArgArgPheAspArgProGlnIleTyrLysHisPheIleLysSerCysAsnValSerGluAspPheGluMetArgValGlyCysThrArgAspValAsnValIleSerGlyLeuProAlaAsnThrSerArgGluArgLeuAspLeuLeuAspAspAspArgArgValThrGlyPheSerIleThrGlyGlyGluHisArgLeuArgAsnTyrLysSerValThrThrValHisArgPheGluLysGluGluGluGluGluArgIleTrpThrValValLeuGluSerTyrValValAspValProGluGlyAsnSerGluGluAspThrArgLeuPheAlaAspThrValIleArgLeuAsnLeuGlnLysLeuAlaSerIleThrGluAlaMetAsnArgAsnAsnAsnAsnAsnAsnSerSerGlnValArg

SEQIDNO：44：PYL2多肽序列；O80992版本1；At2g26040

MetSerSerSerProAlaValLysGlyLeuThrAspGluGluGlnLysThrLeuGluProValIleLysThrTyrHisGlnPheGluProAspProThrThrCysThrSerLeuIleThrGlnArgIleHisAlaProAlaSerValValTrpProLeuIleArgArgPheAspAsnProGluArgTyrLysHisPheValLysArgCysArgLeuIleSerGlyAspGlyAspValGlySerValArgGluValThrValIleSerGlyLeuProAlaSerThrSerThrGluArgLeuGluPheValAspAspAspHisArgValLeuSerPheArgValValGlyGlyGluHisArgLeuLysAsnTyrLysSerValThrSerValAsnGluPheLeuAsnGlnAspSerGlyLysValTyrThrValValLeuGluSerTyrThrValAspIleProGluGlyAsnThrGluGluAspThrLysMetPheValAspThrValValLysLeuAsnLeuGlnLysLeuGlyValAlaAlaThrSerAlaProMetHisAspAspGlu

SEQIDNO：45：PYL3氨基酸序列；Q9SSM7版本1；At1g73000

MetAsnLeuAlaProIleHisAspProSerSerSerSerThrThrThrThrSerSerSerThrProTyrGlyLeuThrLysAspGluPheSerThrLeuAspSerIleIleArgThrHisHisThrPheProArgSerProAsnThrCysThrSerLeuIleAlaHisArgValAspAlaProAlaHisAlaIleTrpArgPheValArgAspPheAlaAsnProAsnLysTyrLysHisPheIleLysSerCysThrIleArgValAsnGlyAsnGlyIleLysGluIleLysValGlyThrIleArgGluValSerValValSerGlyLeuProAlaSerThrSerValGluIleLeuGluValLeuAspGluGluLysArgIleLeuSerPheArgValLeuGlyGlyGluHisArgLeuAsnAsnTyrArgSerValThrSerValAsnGluPheValValLeuGluLysAspLysLysLysArgValTyrSerValValLeuGluSerTyrIleValAspIleProGlnGlyAsnThrGluGluAspThrArgMetPheValAspThrValValLysSerAsnLeuGlnAsnLeuAlaValIleSerThrAlaSerProThr

SEQIDNO：46：PYL5氨基酸序列，At5g05440

MetArgSerProValGlnLeuGlnHisGlySerAspAlaThrAsnGlyPheHisThrLeuGlnProHisAspGlnThrAspGlyProIleLysArgValCysLeuThrArgGlyMetHisValProGluHisValAlaMetHisHisThrHisAspValGlyProAspGlnCysCysSerSerValValGlnMetIleHisAlaProProGluSerValTrpAlaLeuValArgArgPheAspAsnProLysValTyrLysAsnPheIleArgGlnCysArgIleValGlnGlyAspGlyLeuHisValGlyAspLeuArgGluValMetValValSerGlyLeuProAlaValSerSerThrGluArgLeuGluIleLeuAspGluGluArgHisValIleSerPheSerValValGlyGlyAspHisArgLeuLysAsnTyrArgSerValThrThrLeuHisAlaSerAspAspGluGlyThrValValValGluSerTyrIleValAspValProProGlyAsnThrGluGluGluThrLeuSerPheValAspThrIleValArgCysAsnLeuGlnSerLeuAlaArgSerThrAsnArgGln

SEQIDNO：47：PYL6氨基酸序列.At2g40330

MetProThrSerIleGlnPheGlnArgSerSerThrAlaAlaGluAlaAlaAsnAlaThrValArgAsnTyrProHisHisHisGlnLysGlnValGlnLysValSerLeuThrArgGlyMetAlaAspValProGluHisValGluLeuSerHisThrHisValValGlyProSerGlnCysPheSerValValValGlnAspValGluAlaProValSerThrValTrpSerIleLeuSerArgPheGluHisProGlnAlaTyrLysHisPheValLysSerCysHisValValIleGlyAspGlyArgGluValGlySerValArgGluValArgValValSerGlyLeuProAlaAlaPheSerLeuGluArgLeuGluIleMetAspAspAspArgHisValIleSerPheSerValValGlyGlyAspHisArgLeuMetAsnTyrLysSerValThrThrValHisGluSerGluGluAspSerAspGlyLysLysArgThrArgValValGluSerTyrValValAspValProAlaGlyAsnAspLysGluGluThrCysSerPheAlaAspThrIleValArgCysAsnLeuGlnSerLeuAlaLysLeuAlaGluAsnThrSerLysPheSer

SEQIDNO：48：PYL7氨基酸序列；At4g01026

MetGluMetIleGlyGlyAspAspThrAspThrGluMetTyrGlyAlaLeuValThrAlaGlnSerLeuArgLeuArgHisLeuHisHisCysArgGluAsnGlnCysThrSerValLeuValLysTyrIleGlnAlaProValHisLeuValTrpSerLeuValArgArgPheAspGlnProGlnLysTyrLysProPheIleSerArgCysThrValAsnGlyAspProGluIleGlyCysLeuArgGluValAsnValLysSerGlyLeuProAlaThrThrSerThrGluArgLeuGluGlnLeuAspAspGluGluHisIleLeuGlyIleAsnIleIleGlyGlyAspHisArgLeuLysAsnTyrSerSerIleLeuThrValHisProGluMetIleAspGlyArgSerGlyThrMetValMetGluSerPheValValAspValProGlnGlyAsnThrLysAspAspThrCysTyrPheValGluSerLeuIleLysCysAsnLeuLysSerLeuAlaCysValSerGluArgLeuAlaAlaGlnAspIleThrAsnSerIleAlaThrPheCysAsnAlaSerAsnGlyTyrArgGluLysAsnHisThrGluThrAsnLeu

SEQIDNO：49：PYL8氨基酸序列；At5g53160

MetGluAlaAsnGlyIleGluAsnLeuThrAsnProAsnGlnGluArgGluPheIleArgArgHisHisLysHisGluLeuValAspAsnGlnCysSerSerThrLeuValLysHisIleAsnAlaProValHisIleValTrpSerLeuValArgArgPheAspGlnProGlnLysTyrLysProPheIleSerArgCysValValLysGlyAsnMetGluIleGlyThrValArgGluValAspValLysSerGlyLeuProAlaThrArgSerThrGluArgLeuGluLeuLeuAspAspAsnGluHisIleLeuSerIleArgIleValGlyGlyAspHisArgLeuLysAsnTyrSerSerIleIleSerLeuHisProGluThrIleGluGlyArgIleGlyThrLeuValIleGluSerPheValValAspValProGluGlyAsnThrLysAspGluThrCysTyrPheValGluAlaLeuIleLysCysAsnLeuLysSerLeuAlaAspIleSerGluArgLeuAlaValGlnAspThrThrGluSerArgVal

SEQIDNO：50：PYL9氨基酸序列；At1g01360

MetMetAspGlyValGluGlyGlyThrAlaMetTyrGlyGlyLeuGluThrValGlnTyrValArgThrHisHisGlnHisLeuCysArgGluAsnGlnCysThrSerAlaLeuValLysHisIleLysAlaProLeuHisLeuValTrpSerLeuValArgArgPheAspGlnProGlnLysTyrLysProPheValSerArgCysThrValIleGlyAspProGluIleGlySerLeuArgGluValAsnValLysSerGlyLeuProAlaThrThrSerThrGluArgLeuGluLeuLeuAspAspGluGluHisIleLeuGlyIleLysIleIleGlyGlyAspHisArgLeuLysAsnTyrSerSerIleLeuThrValHisProGluIleIleGluGlyArgAlaGlyThrMetValIleGluSerPheValValAspValProGlnGlyAsnThrLysAspGluThrCysTyrPheValGluAlaLeuIleArgCysAsnLeuLysSerLeuAlaAspValSerGluArgLeuAlaSerGlnAspIleThrGln

SEQIDNO：51：PYL10氨基酸序列；At4g27920

MetAsnGlyAspGluThrLysLysValGluSerGluTyrIleLysLysHisHisArgHisGluLeuValGluSerGlnCysSerSerThrLeuValLysHisIleLysAlaProLeuHisLeuValTrpSerIleValArgArgPheAspGluProGlnLysTyrLysProPheIleSerArgCysValVal

GlnGlyLysLysLeuGluValGlySerValArgGluValAspLeuLysSerGlyLeuProAlaThrLysSerThrGluValLeuGluIleLeuAspAspAsnGluHisIleLeuGlyIleArgIleValGlyGlyAspHisArgLeuLysAsnTyrSerSerThrIleSerLeuHisSerGluThrIleAspGlyLysThrGlyThrLeuAlaIleGluSerPheValValAspValProGluGlyAsnThrLysGluGluThrCysPhePheValGluAlaLeuIleGlnCysAsnLeuAsnSerLeuAlaAspValThrGluArgLeuGlnAlaGluSerMetGluLysLysIle

SEQIDNO：52：PYL11氨基酸序列；At5g45860

MetGluThrSerGlnLysTyrHisThrCysGlySerThrLeuValGlnThrIleAspAlaProLeuSerLeuValTrpSerIleLeuArgArgPheAspAsnProGlnAlaTyrLysGlnPheValLysThrCysAsnLeuSerSerGlyAspGlyGlyGluGlySerValArgGluValThrValValSerGlyLeuProAlaGluPheSerArgGluArgLeuAspGluLeuAspAspGluSerHisValMetMetIleSerIleIleGlyGlyAspHisArgLeuValAsnTyrArgSerLysThrMetAlaPheValAlaAlaAspThrGluGluLysThrValValValGluSerTyrValValAspValProGluGlyAsnSerGluGluGluThrThrSerPheAlaAspThrIleValGlyPheAsnLeuLysSerLeuAlaLysLeuSerGluArgValAlaHisLeuLysLeu

SEQIDNO：53：PYL12氨基酸序列；At5g45870

MetLysThrSerGlnGluGlnHisValCysGlySerThrValValGlnThrIleAsnAlaProLeuProLeuValTrpSerIleLeuArgArgPheAspAsnProLysThrPheLysHisPheValLysThrCysLysLeuArgSerGlyAspGlyGlyGluGlySerValArgGluValThrValValSerAspLeuProAlaSerPheSerLeuGluArgLeuAspGluLeuAspAspGluSerHisValMetValIleSerIleIleGlyGlyAspHisArgLeuValAsnTyrGlnSerLysThrThrValPheValAlaAlaGluGluGluLysThrValValValGluSerTyrValValAspValProGluGlyAsnThrGluGluGluThrThrLeuPheAlaAspThrIleValGlyCysAsnLeuArgSerLeuAlaLysLeuSerGluLysMetMetGluLeuThr

SEQIDNO：54：PYL13氨基酸序列；At4g18620

MetGluSerSerLysGlnLysArgCysArgSerSerValValGluThrIleGluAlaProLeuProLeuValTrpSerIleLeuArgSerPheAspLysProGlnAlaTyrGlnArgPheValLysSerCysThrMetArgSerGlyGlyGlyGlyGlyLysGlyGlyGluGlyLysGlySerValArgAspValThrLeuValSerGlyPheProAlaAspPheSerThrGluArgLeuGluGluLeuAspAspGluSerHisValMetValValSerIleIleGlyGlyAsnHisArgLeuValAsnTyrLysSerLysThrLysValValAlaSerProGluAspMetAlaLysLysThrValValValGluSerTyrValValAspValProGluGlyThrSerGluGluAspThrIlePhePheValLysMetMetLys

SEQIDNO：55

核酸序列拟南芥(Arabidopsis)PYL4^A194T，突变的密码子以粗体和下划线表示。第二个密码子修饰成GTT以得到NcoI位点

ATGGTTGCCGTTCACCGTCCTTCTTCCGCCGTATCAGACGGAGATTCCGTTCAGATTCCGATGATGATCGCGTCGTTTCAAAAACGTTTTCCTTCTCTCTCACGCGACTCCACGGCCGCTCGTTTTCACACACACGAGGTTGGTCCTAATCAGTGTTGCTCCGCCGTTATTCAAGAGATCTCCGCTCCAATCTCCACCGTTTGGTCCGTCGTACGCCGCTTTGATAACCCACAAGCTTACAAACACTTTCTCAAAAGCTGTAGCGTCATCGGCGGAGACGGCGATAACGTTGGTAGCCTCCGTCAAGTCCACGTCGTCTCTGGTCTCCCCGCCGCTAGCTCCACCGAGAGACTCGATATCCTCGACGACGAACGCCACGTCATCAGCTTCAGCGTTGTTGGTGGTGACCACCGGCTCTCTAACTACCGATCCGTAACGACCCTTCACCCTTCTCCGATCTCCGGGACCGTCGTTGTCGAGTCTTACGTCGTTGATGTTCCTCCAGGCAACACAAAGGAAGAGACTTGTGACTTCGTTGACGTTATCGTACGATGCAATCTTCAATCTCTTGCGAAAATAGAGAATACTGCGGCTGAGAGCAAGAAGAAGATGTCTCTGTGA

SEQIDNO：56

核酸序列拟南芥PYL4^H82RV97A，突变的密码子以粗体和下划线表示。第二个密码子修饰成GTT以得到NcoI位点

ATGGTTGCCGTTCACCGTCCTTCTTCCGCCGTATCAGACGGAGATTCCGTTCAGATTCCGATGATGATCGCGTCGTTTCAAAAACGTTTTCCTTCTCTCTCACGCGACTCCACGGCCGCTCGTTTTCACACACACGAGGTTGGTCCTAATCAGTGTTGCTCCGCCGTTATTCAAGAGATCTCCGCTCCAATCTCCACCGTTTGGTCCGTCGTACGCCGCTTTGATAACCCACAAGCTTACAAATTTCTCAAAAGCTGTAGCGTCATCGGCGGAGACGGCGATAACGGTAGCCTCCGTCAAGTCCACGTCGTCTCTGGTCTCCCCGCCGCTAGCTCCACCGAGAGACTCGATATCCTCGACGACGAACGCCACGTCATCAGCTTCAGCGTTGTTGGTGGTGACCACCGGCTCTCTAACTACCGATCCGTAACGACCCTTCACCCTTCTCCGATCTCCGGGACCGTCGTTGTCGAGTCTTACGTCGTTGATGTTCCTCCAGGCAACACAAAGGAAGAGACTTGTGACTTCGTTGACGTTATCGTACGATGCAATCTTCAATCTCTTGCGAAAATAGCCGAGAATACTGCGGCTGAGAGCAAGAAGAAGATGTCTCTGTGA

SEQIDNO.60AtPYLA194T-突变的残基以粗体和下划线表示

MLAVHRPSSAVSDGDSVQIPMMIASFQKRFPSLSRDSTAARFHTHEVGPNQCCSAVIQEISAPISTVWSVVRRFDNPQAYKHFLKSCSVIGGDGDNVGSLRQVHVVSGLPAASSTERLDILDDERHVISFSVVGGDHRLSNYRSVTTLHPSPISGTVVVESYVVDVPPGNTKEETCDFVDVIVRCNLQSLAKIENTAAESKKKMSL

SEQIDNO.61AtPYLV97A-突变的残基以粗体和下划线表示

MLAVHRPSSAVSDGDSVQIPMMIASFQKRFPSLSRDSTAARFHTHEVGPNQCCSAVIQEISAPISTVWSVVRRFDNPQAYKHFLKSCSVIGGDGDNGSLRQVHVVSGLPAASSTERLDILDDERHVISFSVVGGDHRLSNYRSVTTLHPSPISGTVVVESYVVDVPPGNTKEETCDFVDVIVRCNLQSLAKIAENTAAESKKKMSL

SEQIDNO.62AtPYLH82和V97A-突变的残基以粗体和下划线表示

MLAVHRPSSAVSDGDSVQIPMMIASFQKRFPSLSRDSTAARFHTHEVGPNQCCSAVIQEISAPISTVWSVVRRFDNPQAYKFLKSCSVIGGDGDNGSLRQVHVVSGLPAASSTERLDILDDERHVISFSVVGGDHRLSNYRSVTTLHPSPISGTVVVESYVVDVPPGNTKEETCDFVDVIVRCNLQSLAKIAENTAAESKKKMSL

SEQIDNO.63AtPYLF130Y和C176R-突变的残基以粗体和下划线表示

MLAVHRPSSAVSDGDSVQIPMMIASFQKRFPSLSRDSTAARFHTHEVGPNQCCSAVIQEISAPISTVWSVVRRFDNPQAYKHFLKSCSVIGGDGDNVGSLRQVHVVSGLPAASSTERLDILDDERHVISSVVGGDHRLSNYRSVTTLHPSPISGTVVVESYVVDVPPGNTKEETDFVDVIVRCNLQSLAKIAENTAAESKKKMSL

SEQIDNO.64AtPYLF130Y突变的残基以粗体和下划线表示

MLAVHRPSSAVSDGDSVQIPMMIASFQKRFPSLSRDSTAARFHTHEVGPNQCCSAVIQEISAPISTVWSVVRRFDNPQAYKHFLKSCSVIGGDGDNVGSLRQVHVVSGLPAASSTERLDILDDERHVISSVVGGDHRLSNYRSVTTLHPSPISGTVVVESYVVDVPPGNTKEETCDFVDVIVRCNLQSLAKIAENTAAESKKKMSL

SEQIDNO.65AtPYLC176R-突变的残基以粗体和下划线表示

MLAVHRPSSAVSDGDSVQIPMMIASFQKRFPSLSRDSTAARFHTHEVGPNQCCSAVIQEISAPISTVWSVVRRFDNPQAYKHFLKSCSVIGGDGDNVGSLRQVHVVSGLPAASSTERLDILDDERHVISFSVVGGDHRLSNYRSVTTLHPSPISGTVVVESYVVDVPPGNTKEETDFVDVIVRCNLQSLAKIAENTAAESKKKMSL

Claims

1.分离的突变体核酸，所述突变体核酸编码突变体植物PYL或PYR多肽，所述突变体植物PYL或PYR多肽包含对应于下述的氨基酸置换：

c)SEQIDNO:3所示的PYL4中的位置A194、V97、C176和/或F130中的一个或多个，或

d)SEQIDNO:3所示的PYL4中的位置H82和V97。

2.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述突变体植物PYL或PYR多肽是单子叶植物或双子叶植物PYL或PYR多肽。

3.根据权利要求2所述的分离的核酸，其中所述单子叶植物或双子叶植物选自玉米、水稻、小麦、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、葡萄、大麦、豌豆、豆、芸豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他蔬菜类芸苔或白杨。

4.根据权利要求1或2所述的分离的核酸，其中所述突变体PYL或PYR多肽由包含序列SEQIDNO:1、2或4的核酸、其功能变体、直向同源物或同系物编码，但是所述包含序列SEQIDNO:1、2或4的核酸、其功能变体、直向同源物或同系物在一个或多个密码子中具有变化以编码权利要求1所述的置换。

5.根据权利要求4所述的分离的核酸，其中所述突变体PYL或PYR多肽包括SEQIDNO:43-54。

6.根据权利要求4所述的分离的核酸，所述核酸编码基本上如SEQIDNO:7、9、12、14、16、19、21、23、26、28、31、34、37、39或42所示的多肽，但是在一个或多个密码子中具有变化以编码权利要求1所述的置换。

7.根据在前的一个权利要求所述的分离的核酸，其中所述多肽包含在位置A194处的氨基酸置换。

8.根据权利要求7所述的分离的核酸，其中所述多肽不具有在不存在ABA的情况下激活PYL/PYR受体的其他突变。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的分离的核酸，其中所述置换是A194T。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述多肽包含在位置F130和/或C176处的一个或多个氨基酸置换。

11.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述置换是V97。

12.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述多肽包含在位置H82处的氨基酸置换，并且还包含在位置V97处的氨基酸置换。

13.根据权利要求12所述的分离的核酸，其中所述置换是H82R和V97A。

14.根据权利要求12或13所述的分离的核酸，其中所述多肽不具有在不存在ABA的情况下激活PYL/PYR受体的其他突变。

15.包含根据权利要求1-14中任一项所述的分离的核酸的载体。

16.根据权利要求15所述的载体，其还包含指引所述核酸表达的调节序列。

17.根据权利要求15所述的载体，其中所述调节序列是组成型启动子、强启动子、诱导型启动子、胁迫诱导型启动子或组织特异性启动子。

18.根据权利要求17所述的载体，其中所述调节序列是CaMV35S启动子。

19.根据权利要求17所述的载体，其中所述调节序列是胁迫诱导型启动子。

20.根据权利要求19所述的载体，其中所述胁迫诱导型启动子选自Hahb1、RD29A或rab17、P5CS1或拟南芥(Arabidopsis)进化枝APP2C，例如ABI1、ABI2、HAB1、PP2CA、HAI1、HAI2和HAI3或其对应的作物直向同源物的ABA-和干旱-诱导型启动子。

21.包含根据权利要求15-16中任一项所述的载体的宿主细胞。

22.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌或植物细胞。

23.转基因植物，所述转基因植物表达根据权利要求1-14中任一项所述的分离的核酸或包含根据权利要求15-20中任一项所述的载体。

24.根据权利要求21所述的植物，其中所述植物是作物植物或生物燃料植物。

25.根据权利要求21所述的植物，其中所述作物植物选自玉米、水稻、小麦、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、葡萄、大麦、豌豆、豆、芸豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其他蔬菜类芸苔或白杨。

26.来源于如权利要求23-25中任一项所定义的植物或来源于其部分的产品。

27.用于增加转基因植物中的胁迫耐受性的方法，所述方法包括向植物中引入并表达根据权利要求1-14中任一项所述的核酸或根据权利要求15-20中任一项所述的载体。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述胁迫是干旱。

29.根据权利要求257-28中任一项所述的方法，其中所述胁迫是严重胁迫。

30.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述胁迫是中度胁迫。

31.用于在转基因植物中延长种子休眠/防止早熟萌发/诱导超休眠的方法，所述方法包括向植物中引入并表达根据权利要求1-14中任一项所述的核酸或根据权利要求15-20中任一项所述的载体。

32.用于组成型激活ABA信号传导通路的方法，所述方法包括向植物中引入并表达根据权利要求1-14中任一项所述的核酸或根据权利要求15-20中任一项所述的载体。

33.用于抑制转基因植物中的PP2C活性的方法，所述方法包括向植物中引入并表达根据权利要求1-12中任一项所述的核酸或根据权利要求15-20中任一项所述的载体。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述PP2CA为PP2CA。

35.用于产生具有增加的胁迫耐受性的转基因植物的方法，所述方法包括向植物中引入并表达根据权利要求1-14中任一项所述的核酸或根据权利要求15-20中任一项所述的载体。

36.通过根据权利要求34所述的方法获得的或可通过根据权利要求34所述的方法获得的植物。

37.根据权利要求1-14中任一项所述的核酸或根据权利要求15-20中任一项所述的载体用于在植物中增加胁迫耐受性、增加水利用效率、延长种子休眠、增加PP2C的ABA-依赖性抑制或激活ABA信号传导通路的用途。

38.通过诱变或基因组编辑获得的非转基因植物，其包含并表达编码PYL/PYR突变体多肽的PYL/PYR核酸，所述PYL/PYR突变体多肽与野生型序列相比具有不同的序列，所述突变体多肽包含对应于下述的氨基酸置换：

a)SEQIDNO:3所示的PYL4中的位置A194、V97、C176和/或F130中的一个或多个，或

b)SEQIDNO:3所示的PYL4中的位置H82和V97。