CN114457106B

CN114457106B - 番茄基因SlCIPK7在调控植物抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN114457106B
Application number: CN202110439680.7A
Authority: CN
Inventors: 李厦; 吴举华; 刘琪; 李恩; 张彦
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2041-04-23
Also published as: CN114457106A

Abstract

本发明公开了一种番茄基因SlCIPK7在调控植物抗旱性中的应用，属于植物基因工程和分子育种技术领域。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除番茄基因SlCIPK7，能够在后代中筛除Cas9序列，避免了转基因技术造成的外源基因插入的问题，不会影响其它基因的正常表达。本发明获得了敲除SlCIPK7的纯合突变体，通过一系列实验证明：与野生型相比，SlCIPK7基因敲除突变体植株的干旱胁迫耐受性显著增强，且不干扰植株的生长发育，是一种理想的抗旱种质资源。

Description

番茄基因SlCIPK7在调控植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和分子育种技术领域，具体涉及一种番茄基因SlCIPK7在调控植物抗旱性中的应用。

背景技术

番茄是世界普遍栽培的果蔬之一，具有重要的经济价值和食用价值。番茄的生长发育过程需要大量的水分，干旱胁迫会严重影响番茄的生长发育，造成番茄产量降低。我国是世界上重要的番茄种植和出口国之一，同时也是世界上淡水资源最缺乏的国家之一。因此，探究番茄抗旱机理，挖掘抗旱基因，培育番茄抗旱新品系，从源头解决番茄不耐旱的问题，具有非常重要的实际生产价值。

目前，通过转基因的方法已经分离和鉴定了许多与番茄抗旱性相关的基因。然而很多的抗旱基因对番茄正常生长或增产潜力会有负面影响，例如在遭遇干旱胁迫时，会使番茄植株变得矮小，减少能量或水分的流失以适应逆境。因此，尽管已经有一些策略能提高番茄的抗旱性，但由于抗旱性状的生理和遗传复杂性，在提高植株抗旱能力的同时，可能还会影响植株在正常条件下的生长发育。所以现有技术在改善番茄抗旱性或开发抗旱种质资源方面仍进展缓慢。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种番茄基因SlCIPK7在调控植物抗旱性中的应用。本发明研究发现：在番茄中敲除SlCIPK7基因可以有效的增强番茄植株的抗旱性，且不影响番茄的正常生长发育。本发明为番茄抗旱新品种的选育提供了重要的种质资源。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供番茄基因SlCIPK7在如下(1)-(2)至少一项中的应用：

(1)调控番茄抗旱性；

(2)培育番茄抗旱种质资源；

所述番茄基因SlCIPK7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述应用中，所述番茄基因SlCIPK7作为负调控因子调控番茄抗旱性；且不影响番茄的正常生长发育。

上述应用中，所述番茄基因SlCIPK7通过调控番茄植株的气孔关闭对ABA的敏感性来提高番茄抗旱性。

进一步的，包含上述番茄基因SlCIPK7的CRISPR/Cas9基因编辑表达载体、重组菌和/或转基因细胞系在调控番茄抗旱性中的应用，也是本发明的保护范围。

本发明的第二方面，提供番茄基因SlCIPK7编码的蛋白在调控番茄抗旱性中的应用。

上述应用中，番茄基因SlCIPK7编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：

MVVRKVGKYEVGRTIGEGTFAKVKFAQNTETGESVAMKVLDRSTIIKHKMVDQIKQEISIMKLVRHPYVVRLHEVIATRTKIYIILEFITGGELFDKIVHHGRLSEAESRRYFQQLIDGVDYCHIKGVYHRDLKPENLLLDSQANLKISDFGLSASPGEGVNILKTTCGTPNYVAPEVLSHKGYDGAVADIWSCGVILYVLMAGYLPFDEVDLTTLYAKIDKADFSCPSWFPVGAKSLIHRILDPNPQTRIRIEEIRNDEWFKKNYDPVKVMEYEDVNLDDINAAFDDTEEEASNEQCDNADAGPLALNAFDLIILSQGLNLSILFDRGQDSMKHHQTRFLTQKPAKVVLSSMEVVAQSMGFKTHIRNFKMRVEGLSTNKTSHFSVILEVFEVAPTFFMVDVQKAAGDASEFLKFYKNFCGNLEDIIWRPPDESCKSKVTKARSRKR

本发明的第三方面，提供一种提高番茄抗旱性的方法，包括将番茄中SEQ ID NO.1所示的SlCIPK7基因敲除的步骤。

优选的，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将番茄中SEQ ID NO.1所示的SlCIPK7基因敲除。

本发明的第四方面，提供一种培育抗旱能力提高的番茄种质资源的方法，包括如下步骤：

(1)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，设计特异性靶向SlCIPK7基因编码序列的sgRNA，并构建CRISPR/Cas9载体；通过CRISPR/Cas9载体转化出发番茄，将出发番茄中的SlCIPK7基因敲除，获得T₁代转基因番茄；

(2)将T₁代转基因番茄自交一代，在T₂代中筛选不含转基因筛选标记的番茄，最终获得不含外源转基因的敲除SlCIPK7的番茄纯合突变体；所述番茄纯合突变体的抗旱能力高于出发番茄。

步骤(1)中，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.3所示；具体如下：

sgRNA：5’-GCTTCGATCGAGGACTTTCA-3’。

本发明的有益效果：

本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除番茄基因SlCIPK7，能够在后代中筛除Cas9序列，避免了转基因技术造成的外源基因插入的问题，不会影响其它基因的正常表达。本发明获得了敲除SlCIPK7的纯合突变体，通过一系列实验证明：与野生型相比，SlCIPK7基因敲除突变体植株的干旱胁迫耐受性显著增强，且不干扰植株的生长发育，是一种理想的抗旱种质资源。

附图说明

图1：番茄SlCIPK7基因敲除突变体的CRISPR/Cas9靶位点测序分析。其中，(A)：番茄SlCIPK7基因结构分析及CRISPR/Cas9靶位点位置。▆代表编码序列，━代表非编码序列。(B)：CRISPR/Cas9转基因植株的基因编辑模式分析。红色箭头表示突变位置。slcipk7-1和slcipk7-10为SlCIPK7基因敲除突变体的两个独立株系。

图2：番茄SlCIPK7基因敲除突变体对干旱胁迫的响应。其中，(A)：干旱处理后不同植株的生长状况。(B)：干旱处理前后，不同植株的叶片相对含水量；*代表差异显著(Two-Way ANOVA，多重T检验，P<0.05)，ns代表没有显著差异。(C)：不同植株的离体叶片失水率。

图3：SlCIPK7基因敲除突变体气孔对ABA的响应。其中，(A)：slcipk7突变体气孔密度的代表性图片。比例尺为50μm。(B)：不同背景植株叶片下表皮气孔密度量化结果。(C)：ABA诱导气孔关闭实验中，番茄气孔的代表性图片；比例尺为10μm。(D)：ABA处理前后，气孔开度的量化结果。*代表差异显著(Two-Way ANOVA，多重T检验，P<0.05)，ns代表没有显著差异。

图4：干旱胁迫后，slcipk7植株中活性氧及丙二醛的积累量少，抗氧化酶SOD的活性升高。其中，(A)：干旱处理前后，不同植株中H₂O₂含量的变化。(B)：干旱处理前后，不同植株中O₂ ^-含量的变化。(C)：干旱处理前后，不同植株中丙二醛含量变化。(D)：干旱处理前后，不同植株中超氧化物岐化酶活性的变化。*代表差异显著(Two-Way ANOVA，多重T检验，P<0.05)，ns代表没有显著差异。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，番茄属于需水量较多的一种蔬菜作物，环境胁迫中干旱胁迫是限制番茄产量的主要制约因素。因此，探究番茄抗旱机理，挖掘抗旱基因，培育番茄抗旱新品系，从源头解决番茄不耐旱的问题，具有非常重要的实际生产价值。

对于番茄抗旱基因的开发而言，其所面临的主要技术难点为：在干旱胁迫下，番茄植株体内会有上千个基因的表达量发生变化，因此仅从基因表达量的变化是难以确定与番茄抗旱性相关的功效基因的。而且，即使定位到了与番茄抗旱性相关的基因，但很多的抗旱基因对番茄正常生长或增产潜力会有负面影响。

因此，从诸多的番茄基因中寻求既可以有效的增强番茄植株的抗旱性，且不影响番茄的正常生长发育的抗旱基因的难度较大。

本发明研究发现，在番茄中敲除SlCIPK7基因可以有效的增强番茄植株的抗旱性，且不影响番茄的正常生长发育。所述番茄基因SlCIPK7(基因号为Solyc04g076810)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。因此，番茄基因SlCIPK7可以作为抗旱基因进行应用。

CRISPR/Cas9基因编辑技术能够定向编辑基因的DNA序列，不引入外源基因，且该技术在番茄中的应用已经相对成熟，具有转化效率高，转化周期短，成本较低廉等特点。本发明中，我们通过CRISPR/Cas9技术创制了SlCIPK7翻译提前终止的突变体slcipk7-1和slcipk7-10。具体为：

针对SlCIPK7的核苷酸序列设计了CRISPR/Cas9的原间隔基序(ProtospacerAdjacent Motif，PAM)靶位点并构建CRISPR/Cas9载体，通过遗传转化手段将该CRISPR/Cas9载体转入“Ailsa Craig”生态型的番茄。将“Ailsa Craig”生态型番茄中的SlCIPK7基因敲除，获得SlCIPK7纯合突变的T₁代转基因番茄；

提取T₁代转基因番茄叶片基因组DNA，利用基因鉴定引物进行PCR扩增，检测SlCIPK7基因敲除情况。将T₁代转基因番茄株自交一代，获得T₂代植株；提取T₂代植株叶片基因组进行PCR鉴定。利用载体鉴定引物进行PCR扩增，筛选不含CRISPR/Cas9载体的植株；

载体鉴定引物为：

正向引物：5’-CACCATCTACCACCTGAGAA-3’；(SEQ ID NO.4)

反向引物：5’-CGAAGTTGCTCTTGAAGTTG-3’。(SEQ ID NO.5)

然后利用基因鉴定引物进行PCR扩增；基因鉴定引物如下：

F：5’-CACCATGGTGGTAAGGAAAGTTGGTAAG-3’；(SEQ ID NO.6)

R:5’-CAGGTGATGCACTAAGTCC-3’。(SEQ ID NO.7)

将PCR产物送测序鉴定突变情况，最终获得不含外源转基因的敲除SlCIPK7的番茄纯合突变体。避免了转基因技术造成的外源基因插入的问题，不会影响其它基因的正常表达。

通过比较SlCIPK7的2个敲除突变体及其对照品种Ailsa Craig植株的生长发育及抗旱能力，发现slcipk7植株的营养生长与野生型相比没有明显差异，但是slcipk7的气孔关闭对ABA的诱导超敏感，植株抗旱能力显著增强。干旱胁迫后，slcipk7的叶片相对含水量高于野生型，活性氧及丙二醛(MDA)的积累量低于野生型，而抗氧化酶SOD的活性高于野生型。这些结果说明SlCIPK7通过调节气孔运动来参与番茄的抗旱过程。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：CRISPR/Cas9创制番茄SlCIPK7敲除突变体

(1)CRISPR/Cas9载体的构建

根据SlCIPK7基因的编码序列(SEQ ID NO.1)，利用网站(http://crispr.dbcls.jp/)设计了CRISPR/Cas9编辑的靶点序列sgRNA：5’-GCTTCGATCGAGGACTTTCA-3’(SEQ ID NO.3)。根据靶点设计引物，进行PCR扩增。回收PCR产物，将其通过酶切连接到CRISPR/Cas9载体上。将重组载体进行测序鉴定，将鉴定结果正确的载体提质粒、保存菌种，进行后续实验。

(2)CRISPR/Cas9载体转化番茄

利用番茄叶盘转化法，将构建完成的CRISPR/Cas9表达载体转化番茄品种AilsaCraig，获得转基因番茄植株。

(3)转基因番茄的测序分析

番茄基因组的提取：剪取新鲜的番茄叶片于1.5mL离心管中，加入400μL植物DNA提取液[250mM NaCl、200mM Tris-HCl(pH 7.5)、25mM EDTA(pH 8.0)、0.5％(w/v)SDS]，充分研磨。13000rpm离心5min。将上清液转移至新的离心管中，加入300μL异丙醇，上下颠倒混匀。室温静置15min。静置完成后，13000rpm离心5min。弃上清。加入300μL 70％乙醇，13000rpm离心2min，弃上清。将离心管倒扣于桌面，待乙醇挥发干净后，加入30μL去离子水回溶基因组。

对转基因植株阳性植株的靶点编辑方式进行测序鉴定。方法如下：在靶点上下游各300bp左右处设计引物，

F：5’-CACCATGGTGGTAAGGAAAGTTGGTAAG-3’，(SEQ ID NO.6)

R:5’-CAGGTGATGCACTAAGTCC-3’。(SEQ ID NO.7)

以转基因植物基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系按照产品说明书操作。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸10min。将PCR产物送测序。

借助Vector NTI软件读取峰图，将峰图与番茄基因组进行比对分析。鉴定出了SlCIPK7基因的两种纯合突变体slcipk7-1和slcipk7-10。两个突变体分别缺失了1个碱基和4个碱基(图1)，导致SlCIPK7基因发生移码突变，从而造成该基因功能缺失。

实施例2：SlCIPK7基因对番茄抗旱性的调控研究

为了检测slcipk7植株的抗旱性，我们对其进行自然干旱处理。将实施例1鉴定出的SlCIPK7基因的两个突变体(slcipk7-1和slcipk7-10)与对照品种Ailsa Craig种植在光照培养箱，待番茄长至六周龄时，选取长势一致的野生型和突变体，将需要处理的植株浸泡于3～4cm水中过夜，次日倒掉多余的水，进行为期10d的干旱处理。

结果如图2A。正常浇水时，slcipk7突变体和野生型植株的营养生长没有显著差异(图2A中的D0)。干旱处理后，野生型和slcipk7生长均受到明显影响。野生型植株叶片明显萎蔫，底部叶片严重干枯，但slcipk7植株萎蔫程度较轻，叶片黄化程度较轻，底部叶片萎蔫下垂程度轻(图2A中的D10)。复水2d后，野生型和slcipk7植株均可恢复生长，但野生型植株底部叶片已经干枯死亡，而slcipk7底部叶片也可恢复生长(图2A中的R2)。

叶片的相对含水量(RWC)是评价植物抗旱能力强弱的指标之一。我们检测了干旱处理前后slcipk7和野生型番茄叶片的相对含水量变化情况。结果如图2B，在干旱处理之前，slcipk7植株和野生型植株叶片相对含水量均为80％左右(图2B中的D0)。干旱处理10d后，slcipk7和野生型植株的叶片相对含水量均显著下降，其中slcipk7叶片相对含水量为70％左右，而对照组番茄叶片相对含水量仅为40％左右，远低于slcipk7叶片相对含水量(图2B中的D10)。

离体失水率一般与植物的抗旱性呈负相关。我们选取六周龄的野生型和slcipk7突变体的成熟叶片，室温下进行自然干燥处理，分别在0h、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h测定叶片重量，计算并绘制离体叶片失水率变化图。结果如图2C，随着时间的延长，野生型和slcipk7突变体离体叶片失水率逐渐升高，但自始至终，slcipk7的叶片失水率均明显慢于野生型。以上结果表明，SlCIPK7负调控番茄植株的抗旱性。

实施例3：slcipk7植株抗旱机理研究

1.slcipk7植株气孔表型分析

气孔是植物与外界进行水分交流的通道。为了分析slcipk7植株抗旱性增强的原因，我们对slcipk7植株的气孔进行分析。我们首先检测了slcipk7植株的气孔密度是否异常。选取长势一致的番茄野生型和slcipk7突变体(slcipk7-1和slcipk7-10)，撕取成熟叶片下表皮，置于63×DIC显微镜下对气孔进行观察拍照。结果如图3A，slcipk7突变体气孔密度与野生型相比并没有明显异常，均为200个/mm²左右(图3B)。

植物可以通过调节气孔的运动来调节水分利用效率。气孔快速关闭是植物响应并调节植物抗旱性的另一个有效途径。SlCIPK7的缺失是否会影响气孔对脱落酸(ABA)的敏感性，进而参与植物干旱胁迫响应过程呢？我们对野生型和slcipk7突变体(slcipk7-1和slcipk7-10)进行ABA诱导的气孔关闭实验。

ABA诱导的气孔关闭实验的具体实验方法为：

(1)待番茄长至六周龄时，剪取成熟叶片，置于番茄气孔开放缓冲液(50mM KCl，10mM MES，0.05mM CaCl2，pH＝6.15)中，26℃光照处理2～3h使气孔完全开放。

(2)将叶片转移至添加10μM ABA或10μM无水乙醇的新的气孔开放缓冲液中，继续光照处理2h。

(3)处理结束后，撕取叶片下表皮，置于63×DIC显微镜下拍照观察气孔闭合情况。利用软件Image J量化气孔孔径大小。

结果如图3C-D，当不施加ABA时，slcipk7和野生型的气孔孔径没有明显差别，当施加10μM ABA时，野生型和slcipk7的气孔孔径均明显减小，野生型气孔孔径降为3.6μm，而slcipk7突变体气孔降到2.7μm左右，显著小于野生型。

以上数据说明，SlCIPK7缺失时，番茄植株的气孔密度没有明显改变，但是气孔关闭对ABA的敏感性显著增强，进而赋予了番茄更强的耐旱性。

2.slcipk7植株中活性氧及丙二醛的积累量及SOD抗氧化酶活性研究

挑选长势一致的slcipk7突变体(slcipk7-1和slcipk7-10)和野生型植株，当植株长至六周龄时进行为期10d的干旱胁迫处理。在干旱处理前后取叶片检测植株中的活性氧(H₂O₂及O₂ ^-)及丙二醛含量的变化情况。利用DAB染色检测叶片中H₂O₂含量的变化，利用NBT染色检测叶片中O₂ ^-含量的变化，丙二醛含量的检测方法参考(Shietal.,2014)。

结果如图4所示。干旱胁迫处理前(D0)，野生型和slcipk7叶片经NBT和DAB化学染色后，叶片着色深浅并无明显差异。干旱胁迫处理后(D10)，野生型和slcipk7叶片经NBT和DAB化学染色后，叶片着色均加深，且野生型叶片着色深于slcipk7(图4A-B)。与活性氧的变化结果相似，干旱处理后slcipk7植株中丙二醛含量也低于野生型(图4C)。这说明干旱胁迫后，slcipk7叶片中活性氧积累量少，细胞膜受伤害程度小。

酶促系统在活性氧清除过程中发挥重要作用。为了探究干旱胁迫下，slcipk7如何降低体内活性氧的含量，我们检测了干旱处理前后，slcipk7和野生型中活性氧清除系统中的SOD抗氧化酶活性的变化。结果如图4D所示，干旱处理前，野生型和slcipk7叶片中SOD抗氧化酶的活性无明显差异。干旱胁迫后，野生型和slcipk7叶片中SOD抗氧化酶的活性均升高，且slcipk7植株中升高程度更大。这说明干旱胁迫时，SlCIPK7可以通过调节植株体内的SOD抗氧化酶的活性来更加有效地清除体内的活性氧，进而降低干旱胁迫对植株的损伤。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 番茄基因SlCIPK7在调控植物抗旱性中的应用

<130> 2021

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1344

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum L

<400> 1

atggtggtaa ggaaagttgg taagtatgaa gttggaagga caattggaga aggaacattt 60

gctaaggtta aatttgctca gaatactgag acaggtgaaa gtgtcgccat gaaagtcctc 120

gatcgaagca ctatcatcaa gcacaagatg gttgaccaga taaagcagga gatatccata 180

atgaagcttg ttagacatcc atatgtagtt cgattacatg aggttatagc aactcgcacg 240

aagatctata ttatcttgga atttatcaca ggcggggaac tttttgataa gatagtccac 300

catggacgat taagtgaggc cgagtctcga agatactttc aacaattgat tgatggagtt 360

gattattgtc acatcaaggg agtttatcac agagacctaa agcctgaaaa tcttctgcta 420

gattcccaag caaatctgaa aatatcagat tttggactta gtgcatcacc tggcgaagga 480

gtcaacattc ttaagactac atgtggaact cccaactatg ttgcaccaga ggttcttagt 540

cacaaaggtt atgatggtgc tgtggctgat atctggtcct gtggtgtcat cctttatgtt 600

ctgatggcag gttatctccc ttttgatgag gttgatctca ctacactgta cgcaaagatt 660

gacaaagcag atttttcctg cccatcttgg tttcctgttg gagcaaaatc tctgatacat 720

cgaattttag acccaaatcc tcaaactcgt attcggattg aagagatccg taatgatgag 780

tggtttaaaa aaaattatga tcctgtcaaa gtcatggagt atgaagatgt caatttagat 840

gatattaatg cagcttttga tgatactgag gaggaagcat ccaacgagca atgtgacaat 900

gcggatgctg ggcctctggc tttaaatgcc tttgacctaa ttattctctc tcaaggattg 960

aacttatcca tattgtttga ccgtgggcag gactcaatga agcatcatca aacacgcttc 1020

ctaacacaga aaccagcaaa agttgtttta tcaagtatgg aagttgtggc ccagtccatg 1080

ggtttcaaga cccatatccg caattttaag atgagggtag aaggtctctc cacaaacaag 1140

acttcacatt tctctgtaat actggaggtt ttcgaagttg ctcctacatt tttcatggta 1200

gacgttcaga aagcagccgg tgatgctagt gaattcctca agttttacaa gaacttttgt 1260

ggcaatcttg aggacattat ctggaggcca ccggatgaat catgcaaatc aaaagttaca 1320

aaagcaagga gtagaaagag atga 1344

<210> 2

<211> 447

<212> PRT

<213> Solanum lycopersicum L

<400> 2

Met Val Val Arg Lys Val Gly Lys Tyr Glu Val Gly Arg Thr Ile Gly

1 5 10 15

Glu Gly Thr Phe Ala Lys Val Lys Phe Ala Gln Asn Thr Glu Thr Gly

20 25 30

Glu Ser Val Ala Met Lys Val Leu Asp Arg Ser Thr Ile Ile Lys His

35 40 45

Lys Met Val Asp Gln Ile Lys Gln Glu Ile Ser Ile Met Lys Leu Val

50 55 60

Arg His Pro Tyr Val Val Arg Leu His Glu Val Ile Ala Thr Arg Thr

65 70 75 80

Lys Ile Tyr Ile Ile Leu Glu Phe Ile Thr Gly Gly Glu Leu Phe Asp

85 90 95

Lys Ile Val His His Gly Arg Leu Ser Glu Ala Glu Ser Arg Arg Tyr

100 105 110

Phe Gln Gln Leu Ile Asp Gly Val Asp Tyr Cys His Ile Lys Gly Val

115 120 125

Tyr His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp Ser Gln Ala

130 135 140

Asn Leu Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Gly

145 150 155 160

Val Asn Ile Leu Lys Thr Thr Cys Gly Thr Pro Asn Tyr Val Ala Pro

165 170 175

Glu Val Leu Ser His Lys Gly Tyr Asp Gly Ala Val Ala Asp Ile Trp

180 185 190

Ser Cys Gly Val Ile Leu Tyr Val Leu Met Ala Gly Tyr Leu Pro Phe

195 200 205

Asp Glu Val Asp Leu Thr Thr Leu Tyr Ala Lys Ile Asp Lys Ala Asp

210 215 220

Phe Ser Cys Pro Ser Trp Phe Pro Val Gly Ala Lys Ser Leu Ile His

225 230 235 240

Arg Ile Leu Asp Pro Asn Pro Gln Thr Arg Ile Arg Ile Glu Glu Ile

245 250 255

Arg Asn Asp Glu Trp Phe Lys Lys Asn Tyr Asp Pro Val Lys Val Met

260 265 270

Glu Tyr Glu Asp Val Asn Leu Asp Asp Ile Asn Ala Ala Phe Asp Asp

275 280 285

Thr Glu Glu Glu Ala Ser Asn Glu Gln Cys Asp Asn Ala Asp Ala Gly

290 295 300

Pro Leu Ala Leu Asn Ala Phe Asp Leu Ile Ile Leu Ser Gln Gly Leu

305 310 315 320

Asn Leu Ser Ile Leu Phe Asp Arg Gly Gln Asp Ser Met Lys His His

325 330 335

Gln Thr Arg Phe Leu Thr Gln Lys Pro Ala Lys Val Val Leu Ser Ser

340 345 350

Met Glu Val Val Ala Gln Ser Met Gly Phe Lys Thr His Ile Arg Asn

355 360 365

Phe Lys Met Arg Val Glu Gly Leu Ser Thr Asn Lys Thr Ser His Phe

370 375 380

Ser Val Ile Leu Glu Val Phe Glu Val Ala Pro Thr Phe Phe Met Val

385 390 395 400

Asp Val Gln Lys Ala Ala Gly Asp Ala Ser Glu Phe Leu Lys Phe Tyr

405 410 415

Lys Asn Phe Cys Gly Asn Leu Glu Asp Ile Ile Trp Arg Pro Pro Asp

420 425 430

Glu Ser Cys Lys Ser Lys Val Thr Lys Ala Arg Ser Arg Lys Arg

435 440 445

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcttcgatcg aggactttca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caccatctac cacctgagaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgaagttgct cttgaagttg 20

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caccatggtg gtaaggaaag ttggtaag 28

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caggtgatgc actaagtcc 19

Claims

1.番茄基因SlCIPK7在如下（1）-（2）至少一项中的应用：

（1）调控番茄抗旱性；

（2）培育番茄抗旱种质资源；

所述番茄基因SlCIPK7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述番茄基因SlCIPK7作为负调控因子调控番茄抗旱性，且不影响番茄的正常生长发育；

所述应用中，包括将番茄基因SlCIPK7敲除的步骤。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述番茄基因SlCIPK7通过调控番茄植株的气孔关闭对ABA的敏感性来提高番茄抗旱性。

3.包含权利要求1所述番茄基因SlCIPK7的CRISPR/Cas9基因编辑表达载体、重组菌和/或转基因细胞系在调控番茄抗旱性中的应用。

4.番茄基因SlCIPK7编码的蛋白在调控番茄抗旱性中的应用；

番茄基因SlCIPK7编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述应用中，包括将编码蛋白的番茄基因SlCIPK7敲除的步骤。

5. 一种提高番茄抗旱性的方法，其特征在于，包括将番茄中SEQ ID NO.1所示的SlCIPK7基因敲除的步骤。

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将番茄中SEQ ID NO.1所示的SlCIPK7基因敲除。

7.一种培育抗旱能力提高的番茄种质资源的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，设计特异性靶向SlCIPK7基因编码序列的sgRNA，并构建CRISPR/Cas9载体；通过CRISPR/Cas9载体转化出发番茄，将出发番茄中的SlCIPK7基因敲除，获得T₁代转基因番茄；

（2）将T₁代转基因番茄自交一代，在T₂代中筛选不含转基因筛选标记的番茄，最终获得不含外源转基因的敲除SlCIPK7的番茄纯合突变体；所述番茄纯合突变体的抗旱能力高于出发番茄；

步骤（1）中，SlCIPK7基因编码序列如SEQ ID NO.1所示；所述sgRNA的序列如SEQ IDNO.3所示。