CN112359029B

CN112359029B - 砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN112359029B
Application number: CN202011280166.5A
Authority: CN
Inventors: 孙天国; 马天意; 张梅娟; 沙伟; 孙玉斌
Original assignee: Qiqihar University
Current assignee: Qiqihar University
Priority date: 2020-11-16
Filing date: 2020-11-16
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2040-11-16
Also published as: CN112359029A

Abstract

砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因及其编码蛋白和应用,它涉及一种砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因及其编码蛋白和应用。其目的在于提供一种砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因及其编码蛋白和应用。砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示，氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示，该基因应用在提高植物抗旱性上。RcGST基因具有抗旱性能，将其转入植株中可提高其抗旱性，为培育耐旱的植物新品种，增强植物的抗逆性奠定基础，具有重要意义。本发明应用于分子育种领域。

Description

砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明涉及一种基因及其编码蛋白和应用，尤其涉及砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因及其编码蛋白和应用

背景技术

随着全球气候变暖，人口持续增长，水资源短缺已成为全球性环境焦点问题。水资源的短缺已经对农业生产带来巨大威胁。随着分子生物学技术在农业领域的应用，植物抗旱基因的挖掘和基因功能的验证工作受到重视，抗旱性植物的培育已成为当前相关研究的热点。

植物谷胱甘肽-S-转移酶是一类普遍存在的，由一个庞大而复杂的基因家族所编码，具有多种生物学功能的一组同工酶。这类酶用于催化谷胱甘肽与有毒异源物或氧化产物结合，从而促进此类物质的代谢、区域化隔离或清除。一般情况下，可溶性GSTs蛋白分为同源二聚体和异源二聚体两种，每个亚基分子大小在25kDa左右。二聚体两个亚基都具有独立的催化位点，催化位点由两个结构域组成，包括结构域Ⅰ和结构域Ⅱ，中间由一段5-10个碱基不等的区域连接而成。结构域Ⅰ(G位点)是GSH特异性结合位点，位于多肽的N末端区域，由一系列氨基酸残基组成；结构域Ⅱ(H位点)是亲电物质结合位点，位于多肽C末端区域，两个结构域共同组成可溶性GSTs蛋白的催化活性位点。由于结构域Ⅱ在基因序列以及结构上存在多样性，因而GSTs可以与多种亲电化合物结合，丰富了底物种类的多样性。GSTs亚基之间的二级折叠结构对称相关，并且两个亚基之间通过一个亚基的结构域Ⅰ与另外一个亚基的结构域Ⅱ发生相互作用。

在植物中，许多GST多基因家族成员在生物和非生物胁迫反应中也扮演重要角色。研究发现，GST基因不仅对病原体攻击、臭氧、H₂O₂、重金属、除草剂、热休克、脱水、伤害、生物诱发子和有毒化学物质具有抗性，而且对生物和非生物胁迫表现出不同的调节反应，研究发现与胁迫相关的激素，包括脱落酸、乙烯、水杨酸和茉莉酸可以调节GST基因的表达。在植物中GST之所以对生物体的保护效应是由于GST可以催化还原型谷胱甘肽的硫醇亲核反应将其转化为多种亲电试剂，与GSH发生偶联，使GSH与外源化合物结合，达到降低该种化合物反应活性的目的，从而起到保用作用。

苔藓植物是最古老的由水生向陆生过渡的植物类群，现存的种类数量仅次于被子植物，广泛分布于世界各地。苔藓植物对逆境环境有很强的适应性，可在干旱、高温等极端气候中生存。苔藓植物结构相对简单，配子体为单倍体，对基因水平上研究其耐性提供了极大的便利。砂藓(Racomitrium canescens)是藓纲紫萼藓科(Grimmiaceae)砂藓属(Racomitrium)一种常见小型旱生藓类，以岩石或山丘上沙土为基质。其最主要的特点是具有极强的抗旱性，可以在干旱环境中存放数年，复水后立刻恢复正常生长。因此，从砂藓中克隆与抗旱相关的基因，初步研究其潜在的生物学功能，可为深入研究该基因的抗旱相关机理和苔藓植物的耐旱机制提供理论依据，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因及其编码蛋白和应用。

本发明砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。

本发明砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表SeqID No：2所示。

本发明砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因的应用是指在提高植物抗旱性上的应用。

本发明的有益效果是：

本发明提供的砂藓谷胱甘肽硫转移酶来自砂藓。以砂藓为实验材料，克隆出与抗旱相关的谷胱甘肽硫转移酶基因，并进行转基因，将RcGST基因转入植株中可提高其抗旱性，复水后植株恢复正常生长，为培育耐旱的植物新品种，增强植物的抗逆性奠定基础，具有重要意义。

附图说明

图1为实施例中RcGST基因的扩增结果图；其中1:水对照；2-3:RcGST；M:DL2000Marker；

图2为实施例中重组质粒RcGST双酶切结果图；其中M：DL2000 Marker；1：克隆载体双酶切产物；

图3为实施例中重组质粒pRI-RcGST双酶切结果图；M：DL2000 marker；1:对照；2：pRI101-AN-RcGST双酶切产物；

图4T0代过表达转基因拟南芥种子的抗生素筛选；

图5为实施例中转基因拟南芥PCR结果图；M：marker；1-3：T2代RcGST过表达转基因拟南芥；4：野生型拟南芥；5:重组质粒pRI101-AN-RcGST；6：水对照；

图6为实施例中RcGST过表达转基因基因拟南芥干旱胁迫15d植株表型图；

图7为实施例中野生型拟南芥干旱胁迫15d植株表型图；

图8实施例中RcGST过表达转基因基因拟南芥干旱胁迫复水5d植株表型图；

图9实施例中野生型拟南芥干旱胁迫复水5d植株表型图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。

本实施方式提供的砂藓谷胱甘肽硫转移酶来自砂藓。以砂藓为实验材料，克隆出与抗旱相关的谷胱甘肽硫转移酶基因，并进行转基因，将RcGST基因转入植株中可提高其抗旱性，复水后植株恢复正常生长，为培育耐旱的植物新品种，增强植物的抗逆性奠定基础，具有重要意义。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：该基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因的应用是指在提高植物抗旱性上的应用。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因提高了植物的复水抗旱性。其他与具体实施方式三相同。

通过以下实验验证本发明的效果：

实施例1：

一、RcGST基因的克隆

以砂藓cDNA为模板，进行目的基因RcGST的PCR扩增，反应体系及反应程序如下：

RcGST-F：5′-GTCGACATGTCTACCGAAGGGCAAGTCATCA-3′

RcGST-R：5′-GAATTCTTAGTCTGATAGTTGGAGCACACAG-3′

将得到的PCR产物进行电泳检测和胶回收，与pMD-19T载体进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序，得到648bp的序列，其核苷酸序列如序列表中的SeqID No：1所示，编码具有序列表中Seq ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。将基因序列通过NCBI上进行Blast比对，通过亲/疏水性分析，RcGST蛋白为疏水性蛋白，这与膜蛋白的疏水性吻合。通过信号肽预测，RcGST没有信号肽，不属于分泌蛋白质。符合谷胱甘肽硫转移酶蛋白GST亚家族的基本特征，初步确定获得了砂藓谷胱甘肽硫转移酶蛋白的新成员，命名为RcGST。结果如图1所示。

二、含有目的基因RcGST表达载体的构建

1、提取含有RcGST基因的T载体质粒和表达载体pRI101-AN质粒，用Sal I和SacI限制性内切酶进行双酶切，获得带有粘性末端的RcGST基因的cDNA片段，结果如图2所示。

克隆载体双酶切反应体系如表1所示。

表1

三、连接转化至根癌农杆菌EHA105

1、将RcGST基因克隆载体酶切产物和表达载体pRI101-AN的酶切产物用T₄DNALigase连接，具体操作按说明书进行，命名为PRI-RcGST。连接反应体系如表2所示。

表2

混合均匀后离心，16℃连接过夜。

连接后进行重组质粒的双酶切鉴定，结果如图3所示，显示出现两条条带，大片段为载体小片段为目的片段，说明重组质粒鉴定成功。

2、采用冻融法转化根癌农杆菌。

(1)将1重组质粒pRI-RcGST加入到根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min；

(2)快速置于液氮中冷冻5min，即刻取出置于37℃温水中放置5min；

(3)加入700μL液体YEP培养基，28℃环境下，160rpm振动培育4h；

(4)常温4000rpm快速离心5min，倒掉上层溶液，加入60μL的液体YEP培养基悬浮沉淀；

(5)将悬浮液匀称平铺在添加抗生素的固体YEP培养基上，28℃环境中倒放培养2d；

(6)挑取单菌落于20mL含抗生素的液体YEP培养基内，28℃恒温以200rpm的速度震动培养；

(7)提取质粒，以菌液为模板使用特异性引物进行PCR鉴定；

四、转基因拟南芥的获得

1、农杆菌介导法转化拟南芥

(1)向装有拟南芥的种子离心管加入1mL 10％次氯酸钠清洗7min，离心弃10％次氯酸钠，用无菌水清洗3次，加入1mL 75％酒精消毒15S，离心去酒精，加入无菌水清洗3次，装有拟南芥的种子离心管存放于4℃冰箱中春化2-3d；

(2)将春化后的野生型拟南芥种子点种在MS平板培养基上，将平板放置于22℃培养室中培养2周；

(3)将腐殖土和蛭石按1：1混合灭菌后，分装于小花盆中，一次性浇透水，将野生型拟南芥幼苗移至黑色小花盆中，在黑暗处培养1d，然后放入黑暗16h，光照8h短日照的培养室中培养；

(4)将培养盆放于22℃培养室中培养，大约30d左右，拟南芥待侵染；

(5)挑取含有目的基因表达载体的农杆菌单克隆于含有15mL液体YEP的培养瓶中(含Rif和Kan)，28℃，180rpm振荡培养1-2d；

(6)将培养菌液全部转移到400mL液体YEP中(含Rif和Kan)，28℃，180rpm培养OD₆₀₀＝1.0-1.2；

(7)4000rpm，4℃，离心10min，弃上清收集菌体，用5％蔗糖溶液重悬菌体，使其OD₆₀₀＝0.8左右，作为侵染液；

(8)将浇透水野生型拟南芥植株地上部分倒扣在装侵染液的塑料杯中进行侵染，侵染时间为120s，黑暗平放培养24h后正常培养；

(9)待种子成熟后单株收获T₀代种子。

2转基因植株的鉴定

(1)将消毒后T₀代种子(方法同前)点种在MS(含Kan)培养基上，筛选出阳性植株(图4)，将筛选出的T₁代抗性植株移栽至小花盆中常规培养。

(2)收获T₁呈阳性植株的种子；种植T₁阳性植株的种子，筛选T₂代转基因株系，剪取其叶片，提取叶片总DNA；

(3)将提取的DNA作为模板，以目的基因克隆引物进行常规PCR验证，留下阳性植株(图5)；

五、野生型和过表达拟南芥植株干旱和复水处理

1、野生型和过表达拟南芥植株干旱、复水处理和变型观察

将T₂代和野生型拟南芥种子培养成植株(T₃代)。将野生型拟南芥和RcGST过表达转基因拟南芥植株进行自然干旱处理，观察其表型变化。干旱胁迫前(对照)，各株系拟南芥植株没有明显的表型差异，生长发育正常，叶色、等方面差别不大，但在自然干旱胁迫15d后，野生型植株萎蔫严重，RcGST过表达转基因拟南芥干旱影响相对较小(图6-7))。干旱后15d后对野生型拟南芥和RcGST过表达转基因拟南芥植株进行复水处理，复水5d后观察表型变化。复水5天后野生型拟南芥表型没有变化，而RcGST过表达转基因拟南芥植株生长状况良好(图8-9)。

2、野生型和过表达拟南芥植株生理指标测定

1)、实验方法：

叶绿素含量采用混合液法，可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝法，NBT法测定过氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，愈创木酚法测定过氧化物酶(peroxidase，POD)活性，过氧化氢酶(catalase，CAT)活性的测定采用碘量法，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，蒽酮法测定可溶性糖含量，脯氨酸含量采用茚三酮比色法测定。

2)、实验数据：

测定干旱15d和复水第5d生理指标。抗氧化酶活性、叶绿素、MDA、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量的反映植物抗逆性的重要生理指标。

(1)干旱和复水处理对野生型和RcGST过表达转基因拟南芥叶绿素含量的影响

干旱15d后，野生型拟南芥叶绿素含量为对照的18.34％，RcGST过表达转基因拟南芥为对照的30.81％。复水后野生型叶绿素含量仅为对照的28.05％；RcGST过表达转基因拟南芥叶绿素含量为对照的63.35％。

(2)干旱和复水处理对野生型和RcGST过表达转基因拟南芥抗氧化酶活性的影响

SOD、POD和CAT是生物体抗氧化酶系统重要成员，在生物体受到外界环境胁迫时发挥重要作用。干旱处理15d后，野生型拟南芥SOD活性为对照的50.21％，RcGST过表达转基因拟南芥为对照的63.39％；野生型POD活性为对照的60.69％，RcGST过表达转基因拟南芥为对照的79.94％；野生型拟南芥CAT为对照的50.52％，RcGST过表达转基因拟南芥为对照的70.93％。复水后野生型拟南芥SOD活性达到对照的56.49％，RcGST过表达转基因拟南芥达到对照的73.82％；野生型拟南芥POD活性为对照的64.97％，RcGST过表达转基因拟南芥为对照的86.18％；野生型拟南芥CAT活性为对照的74.63％，RcGST过表达转基因拟南芥为对照的87.77％。

(3)干旱和复水处理对野生型和RcGST过表达转基因拟南芥MDA含量的影响

干旱15d后，野生型拟南芥MDA含量高于对照111.78％，RcGST过表达转基因拟南芥高于对照81.72％。复水后野生型拟南芥MDA含量高于对照47.32％，RcGST过表达转基因拟南芥MDA含量仅高于对照9.39％。

(4)干旱和复水处理对野生型和RcGST过表达转基因拟南芥脯氨酸含量的影响

干旱15d后，与对照相比，野生型拟南芥脯氨酸含量增加了230.53％，RcGST过表达转基因拟南芥增加了346.53％。复水后野生型拟南芥脯氨酸含量高于对照134.74％，RcGST过表达转基因拟南芥脯氨酸高于对照96.40％。

(5)干旱和复水处理对野生型和RcGST过表达转基因拟南芥可溶性蛋白含量的影响

干旱15d后，野生型拟南芥可溶性蛋白含量高于对照65.08％，RcGST过表达转基因拟南芥高于对照105.36％。复水后野生型可溶性蛋白含量高于对照31.88％；RcGST过表达转基因拟南芥含量高于对照25.44％。

(6)干旱和复水处理对野生型和RcGST过表达转基因拟南芥可溶性糖含量的影响干旱15d后，野生型拟南芥可溶性糖含量高于对照130.20％，RcGST拟南芥高于对照250.01％。复水后野生型可溶性蛋白质含量高于对照67.67％，RcGST过表达转基因拟南芥比对照高36.96％。

由以上数据可以看出干旱15d处理后野生型叶绿素含量下降明显高于RcGST过表达转基因拟南芥，说明野生型拟南芥光合速率降低，叶绿体受损严重。在干旱胁迫下，RcGST过表达转基因拟南芥3种抗氧化酶活性的升高幅度显著高于野生型，说明过表达转基因拟南芥清除超氧自由基(O₂ ^-)和过氧化氢(H₂O₂)的能力强于野生型，有利于提高植株的抗旱性。野生型MDA含量高于RcGST过表达转基因拟南芥的含量，说明野生型细胞在干旱胁迫下受损越严重。渗透物质含量的提高能够有效减少逆境条件下的植株受损，RcGST过表达转基因拟南芥中脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖3种渗透物质含量的增大幅度显著高于野生型，说明RcGST过表达转基因拟南芥抗旱性能优于野生型。

植物自身是否具有适应干旱胁迫的能力，可以在植物遭受干旱胁迫后通过复水检测。由以上数据可以看出无论是叶绿素含量、抗氧化酶活性、MDA含量还是3种渗透物质含量在复水5d后，RcGST过表达转基因拟南芥各项指标更接近于对照，说明RcGST过表达转基因拟南芥在复水后植株生长得以恢复，说明具有很强的抗旱性。

由此可知，将RcGST基因转入植株中可提高其抗旱性，为培育耐旱的植物新品种，增强植物的抗逆性奠定基础，具有重要意义。

序列表

<110> 齐齐哈尔大学

<120>砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因及其编码蛋白和应用

<160> 4

<210> 1

<211> 648

<212> DNA

<213> 砂藓Racomitrium canescens

<400> 1

atgacgctca tcgtgcacgg cgttgcgtac tccacttgca cgcagaggat cctcaccact 60

ctggcggagc tcaatgtcac tgactacaag ctggagctcg tcgacatctc caagggcgct 120

cacaagagcc cagctttcct caagcttcag cccttcggac agattcccgt gctccaggat 180

ggcgacctca cgatattcga gtcgcgcgcc atagtgcgct acctggtgga gaagttcgcg 240

gggcagggca cggcgctgat ggggaagacg accaaggaca aggcgctggt gtcgcagtgg 300

ctggaggtgg agtcgcagaa ctacaacccg cccgcgtcga caatcgtggc ccagaaggtg 360

ttcctgccca tgatgggcat ggcgtgcgac gactcggtcg tgacggcgca gacggcgaag 420

ctggagaccg tcctggacgt ttacgaggcg catctggcga agagcaagta cctggcgggt 480

gatttcttca gcctggcgga tctgagccac ctgccctaca ccaacatgct ggtgtccgcc 540

gcgggcaagg ccgatctcat tacgtcgcgc ccgcacgtga gcgcgtggtg gaagtccatc 600

tcgcagcgcc cctcattcca gaaggtgctc gccatgtcga agcgctag 648

<210> 2

<211> 215

<212> PRT

<213> 砂藓Racomitrium canescens

<400> 2

Met Thr Leu Ile Val His Gly Val Ala Tyr Ser Thr Cys Thr Gln

1 5 10 15

Arg Ile Leu Thr Thr Leu Ala Glu Leu Asn Val Thr Asp Tyr Lys

20 25 30

Leu Glu Leu Val Asp Ile Ser Lys Gly Ala His Lys Ser Pro Ala

35 40 45

Phe Leu Lys Leu Gln Pro Phe Gly Gln Ile Pro Val Leu Gln Asp

50 55 60

Gly Asp Leu Thr Ile Phe Glu Ser Arg Ala Ile Val Arg Tyr Leu

65 70 75

Val Glu Lys Phe Ala Gly Gln Gly Thr Ala Leu Met Gly Lys Thr

80 85 90

Thr Lys Asp Lys Ala Leu Val Ser Gln Trp Leu Glu Val Glu Ser

95 100 105

Gln Asn Tyr Asn Pro Pro Ala Ser Thr Ile Val Ala Gln Lys Val

110 115 120

Phe Leu Pro Met Met Gly Met Ala Cys Asp Asp Ser Val Val Thr

125 130 135

Ala Gln Thr Ala Lys Leu Glu Thr Val Leu Asp Val Tyr Glu Ala

140 145 150

His Leu Ala Lys Ser Lys Tyr Leu Ala Gly Asp Phe Phe Ser Leu

155 160 165

Ala Asp Leu Ser His Leu Pro Tyr Thr Asn Met Leu Val Ser Ala

170 175 180

Ala Gly Lys Ala Asp Leu Ile Thr Ser Arg Pro His Val Ser Ala

185 190 195

Trp Trp Lys Ser Ile Ser Gln Arg Pro Ser Phe Gln Lys Val Leu

200 205 210

Ala Met Ser Lys Arg

215

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物RcGST-F的核苷酸序列。

<400> 3

GTCGACATGT CTACCGAAGG GCAAGTCATC A 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物RcGST -R核苷酸序列。

<400> 4

GAATTCTTAG TCTGATAGTT GGAGCACACA G 31

Claims

1.砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SeqID No：1所示。

2.如权利要求1所述的砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。

3.如权利要求1所述的砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因的应用，其特征在于砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因应用在提高植物抗旱性上。

4.根据权利要求3所述的砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因的应用，其特征在于砂藓谷胱甘肽硫转移酶RcGST基因提高了植物的复水抗旱性。