CN116536349B - 一种大豆GmMLP34基因在调控植物耐高温性上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种大豆GmMLP34基因在调控植物耐高温性上的应用。大豆GmMLP34基因的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，大豆GmMLP34基因应用在大豆和拟南芥中，能够抑制植物根系生长育和降低高温胁迫下的存活率。本发明大豆GmMLP34基因在调控植物耐高温性上的应用，能够丰富大豆GmMLP34基因的热(高温)胁迫的理论研究，为培育根系发达的耐高温植物新品种提供理论和实际参考基础，对进一步了解植物根系生长和在高温胁迫下的存活率机制具有深远意义，也能够为分子水平提高作物根系生长发育与高温胁迫下幼苗存活率提供更多遗传资源信息。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种大豆GmMLP34基因在调控植物耐高温性上的应用。
背景技术
全球气候变化研究表明，21世纪末平均气温将比1980～2000年增加1.8～4.0℃或更高。随着全球气温变暖，高温胁迫对植物生长发育的影响越来越频繁。据报道，气温每上升1℃，小麦、水稻、玉米和大豆的产量和品质均会受到显著性影响。为了应对高温胁迫，植物已经进化出多种信号转导途径以感知环境温度的变化，调节自身代谢状态和细胞功能来预防或减轻高温损伤，提高对高温胁迫的抵抗力。
当面对外源性生物或非生物胁迫时，植物依赖于先天免疫机制来适应或调节胁迫带来的危害。非生物胁迫能够启动不同类型蛋白质的合成，包括转录因子、酶、分子伴侣、离子通道和转运蛋白。MLP蛋白(Major latex protein)包含一个Betv1结构和MLP-like蛋白构成了Betv1蛋白超家族的第二大亚家族。MLP首先是从罂粟(Papaver somniferum)乳胶中鉴定出来的，后来在拟南芥、大豆和烟草中也发现了MLP的直系同源物。前人的研究表明，入侵的病原体诱导了MLP家族蛋白的表达，这些蛋白主要利用先天免疫和获得性抗性信号帮助植物进行防御胁迫。MLP43可以作为一个正向调节子在拟南芥响应ABA信号途径和干旱胁迫中通过调控失水率、电解质泄漏、ROS水平以及ABA响应基因的表达，进而增强拟南芥的耐旱性。而过表达NtMLP423的烟草通过ABA途径调控失水率、ROS水平、丙二醛含量和渗透调节物质水平等，提高了植株对干旱胁迫的耐受性。此外，研究发现BrMLP1/6在油菜的抗旱和抗盐性中发挥重要作用。MLP在不同作物响应非生物胁迫中能够发挥重要作用已被广泛证实，然而，有关热(高温)胁迫中MLP的具体功能尚未见报道，MLP蛋白在大豆响应高温胁迫中的生物学作用尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种大豆GmMLP34基因在调控植物耐高温性上的应用，能够抑制大豆和拟南芥的根系生长育和降低高温胁迫下的存活率，丰富大豆GmMLP34基因的热(高温)胁迫的理论研究，为培育根系发达的耐高温植物新品种提供理论和实际参考基础。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种大豆GmMLP34基因在调控植物耐高温性上的应用，所述大豆GmMLP34基因的碱基序列，如序列表SEQ ID NO.1所示，所述大豆GmMLP34基因应用在大豆和拟南芥中，能够抑制植物根系生长育和降低高温胁迫下的存活率。
本发明的有益效果在于：
本发明中，首次克隆并验证了调控植物耐高温性的大豆GmMLP34基因，验证了大豆GmMLP34基因能够抑制大豆和拟南芥是根系生长育和降低高温胁迫下的存活率，丰富大豆GmMLP34基因的热(高温)胁迫的理论研究，为培育根系发达的耐高温植物新品种提供理论和实际参考基础，对进一步了解植物根系生长和在高温胁迫下的存活率机制具有深远意义，也能够为分子水平提高作物根系生长发育与高温胁迫下幼苗存活率提供更多遗传资源信息。
附图说明
图1为GmMLP34蛋白三级结构模型图；
图2为PHZM27-MLP34载体图；
图3为GmMLP34过表达转基因拟南芥阳性苗qRT-PCR表达量对比图；
图4为过表达GmMLP34拟南芥MS培养基高温胁迫实验；
图5为过表达GmMLP34拟南芥高温胁迫存活率统计图；
图6为高温胁迫对过表达GmMLP34拟南芥侧根与主根的影响对比图；
图7为过表达GmMLP34拟南芥高温胁迫下主根长与侧根数目统计图；
图8为高温胁迫对过表达GmMLP34转基因拟南芥生理指标的影响对比图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
实施例1：
一、大豆GmMLP34基因的克隆与鉴定
1、大豆GmMLP34基因的克隆
大豆来源：耐高温型大豆品种(JD21)和高温敏感型大豆品种(HD14)均来自安徽农业大学大豆分子育种实验室。
其中，耐高温型大豆品种JD21，即冀豆21，是河北省农林科学院粮油作物研究所，用ms1雄性不育轮回群体杂交选育的高蛋白大豆新品种。2010年09月09日经第二届国家农作物品种审定委员会第四次会议审定通过，审定编号为国审豆2010004。
其中，高温敏感型大豆品种HD14，即菏豆14号，是山东省菏泽市农业科学院1989年以菏84-5为母本，美国9号为父本进行有性杂交,再经多年单株选择而成。2006年4月通过山东省农作物品种审定，审定编号为鲁农审2006034号。
具体方法是：提取第一片三出复叶完全展开后苗期根系组织mRNA，并反转录备用。
从大豆数据库检索获取GmMLP34的生物学信息，转录本ID为(Glyma.09G102400.1)。以Glyma.09G102400.1基因序列为模板设计特异性扩增引物，同时结合克隆载体的多克隆酶切位点，选择XhoⅠ和AvrⅡ酶切位点引入GmMLP34序列两端，特异性扩增引物序列如下所示：
GmMLP34(5’-3’)-F:AGAGGACACGCTCGAGATGGCATACTCT CAACTTCA；
GmMLP34(5’-3’)-R:CCATGAGCTCCCTAGGGTTGTGCCCCTG AGTAA。
以cDNA为模板，GmMLP34(5’-3’)-F和GmMLP34(5’-3’)-R为引物，利用TAKARA公司生产的高保真酶Primer STAR Max Premix(2×)进行扩增反应，扩增反应体系如下：
PCR扩增程序为：94℃、2min预变性，98℃、10s变性，55℃、15s退火，68℃、10s延伸，共38个循环后，72℃下继续延伸1min完成反应，获得的PCR产物用质量比为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
2、大豆GmMLP34基因的生物信息学分析鉴定
测序结果经MEGA7.0软件与数据库中的序列比对一致后，说明成功克隆获得GmMLP34基因，且得到的GmMLP34基因的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示，具体如下：
ATGGCATACTCTCAACTTCAAAAGGTGGAAACTAGCCTGCAGATCAAGGCTTCTGCTGAACAGTTCTATGATGTTTTTTGCAACAAGCCACACACTATTGCCAACATTTCACCAGAAAATATTCAGTCAGTTGAAGTTCATAAAGGTGAATGGGGCAAAGAGGGATCAATCGTCTCCTGGAACTATTTACATGAGGGAACAGTTTGTGTAGCCAAGCAAGTGCTTGAAGGCATAGACAAGGAAAATAACAAAATGACAATGAAGGTCATAGAGGGTGACGTGCTGGGACTCTACAAGAGCTTCAAGTCTAATTTGCAAGTTACTCCAAAAGGAAAGGGCAGCGTAGTGCTTTGGGCAATGGAATACGAGAAACAAGAGGACCACATTCCTGACGCTCATACCTTGTTGCAACTGGCTGTTGTGGTTAGCAAAAAAATTGATGCTTACCTTACTCAGGGGCACAACTAA。
经序列分析发现GmMLP34基因编码区全长468bp，共计编码155个氨基酸。蛋白质分子质量为17.4kDa，等电点为6.06(https://web.expasy.org/)。蛋白预测(https://swissmodel.expasy.org/)结果显示GmMLP34三级结构的MLP域中存在一个由保守的Cys/His残基形成的带有锌结合带的β-折叠(如图1所示)。转录组测序GO注释结果显示其主要具有“防御响应和响应生物刺激”功能。
二、PHZM27-MLP34基因过表达载体的构建
用添加了xhoⅠ和AvrⅡ酶切位点的过表达载体引物GmMLP34(5’-3’)-F和GmMLP34(5’-3’)-R扩增GmMLP34的CDS序列，酶切后连接到载体PHZM27(购自武汉淼灵生物科技有限公司)，酶切验证结果显示表达载体中插入了一个约为468bp左右大小的片段，符合预期目标，因此PHZM27-MLP34表达载体构建成功。图2为PHZM27-MLP34载体图，如图2所示，PHZM27-MLP34由35s启动子驱动，PHZM27载体带有大肠杆潮毒素抗性基因(hyg)，该基因能编码潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase)，使得潮毒素B发生磷酸化从而失去活性。
三、GmMLP34基因的农杆菌介导的拟南芥遗传转化
1、拟南芥种子处理
S1、拟南芥种子的萌发：将野生型拟南芥种子放于1.5ml的离心管中，在超净工作台中用12％花王震荡消毒15min，离心30s，倒掉液体后加入纯水震荡5min，重复5-6次，将消毒后的种子平铺于1/2MS培养基上，低温4℃春化两天后，在22℃/24℃生长。
S2、过表达株系的构建：将10日龄大的幼苗移栽于营养土(其中，黑土与蛭石的体积为1：3)，在昼夜(22℃/24℃)生长。待花期时采用花序浸沾法侵染拟南芥。
S3、转基因纯和株系的筛选：将单株收获的拟南芥种子采用同上的消毒方法，平铺于潮霉素抗性的1/2MS培养基筛选阳性纯和株系，不发芽种子为WT，发芽种子为过表达纯和或杂合株系，一般筛选三代，待铺的种子全部发芽即筛选为全部纯合，可以进行下一步实验。
四、转基因拟南芥的功能鉴定
1、GmMLP34过表达转基因拟南芥功能验证
用潮霉素抗性筛出19株阳性苗并进行荧光定量分析其相对表达量。图3为GmMLP34过表达转基因拟南芥阳性苗qRT-PCR表达量对比图，如图3所示，19株转基因拟南芥表达量均显著高于野生型。选表达量较高的OE4、OE12、OE19三个株系繁种至T3代，筛纯合用于后续实验。为了验证高温诱导基因在过表达GmMLP34叶片中表达量情况，将4周龄3个过表达株系OE4、OE12、OE19以及WT拟南芥在45℃高温胁迫处理6h，对照28℃，处理结束后取叶片提取RNA，随后逆转录成cDNA用于qRT-PCR相对表达量分析。
2、高温胁迫下过表达GmMLP34拟南芥存活率与根系生长分析
对GmMLP34转基因拟南芥在高温胁迫下存活率和主根长度、侧根数目分析表明，生长10d后对拟南芥幼苗用45℃高温胁迫处理3h，胁迫处理结束后恢复生长12h(如图4所示)。然后，统计各培养基上拟南芥存活率，存活率(％)＝高温胁迫后存活苗数/总苗数×100％)。图5为过表达GmMLP34拟南芥高温胁迫存活率统计图。如图5所示，高温胁迫后WT存活率为34.2％，OE4、OE12、OE19存活率分别为12.9％、4.3％、10.8％，结果表明，高温胁迫下，相较于WT，过表达GmMLP34降低了转基因拟南芥的存活率。
在生长7天后，选择生长一致的植株，移植到新的MS培养基中。将拟南芥幼苗在37/28℃(日/夜)进行HT胁迫5天，分别测定其主根长和侧根数。图6为高温胁迫对过表达GmMLP34拟南芥侧根与主根的影响对比图。如图6所示，经过HT胁迫后，WT的侧根数量和主根长度均优于GmMLP34的三个过表达株系。图7为过表达GmMLP34拟南芥高温胁迫下主根长与侧根数目统计图。如图7所示，与野生型相比，过表达GmMLP34的拟南芥植株的侧根数量和主根长度显著减少。结果表明，过表达GmMLP34抑制了HT胁迫下转基因拟南芥根系的生长。
3、高温胁迫下GmMLP34过表达拟南芥生理基础分析
图8为高温胁迫对过表达GmMLP34转基因拟南芥生理指标的影响对比图。如图8A所示，对GmMLP34转基因拟南芥在高温胁迫下生理指标的分析表明，与对照(28℃)相比，高温胁迫下WT中ABA含量上升，在GmMLP34三个过表达株系中，OE12趋势与WT一致，而OE4与OE19高温胁迫后ABA含量下降。如图8B所示，高温胁迫下类黄酮含量降低，相较于WT，过表达GmMLP34类黄酮含量降低更显著。如图8C所示，POD含量在高温胁迫后也是降低，但与WT相比，过表达GmMLP34下降幅度不显著。如图8D所示，高温胁迫增加了SOD含量，WT在高温胁迫后SOD含量显著性增加，OE4与OE19增加并不显著，OE12几乎没有变化。以上结果表明，高温胁迫降低了拟南芥体内的类黄酮含量和POD酶活，增加了SOD的酶活，相较于WT，过表达GmMLP34促进了转基因拟南芥中类黄酮含量的增加速度，抑制了POD酶活降低和SOD酶活上升。
通过对转基因拟南芥株系在高温胁迫下的存活率，根系长度和侧根数目分析发现，相较于WT，过表达GmMLP34可以降低拟南芥幼苗在高温胁迫下的存活率，以及主根长度和侧根数目。并且，高温胁迫降低了拟南芥体内的类黄酮含量和POD酶活，增加了SOD的酶活，相较于WT，过表达GmMLP34促进了转基因拟南芥中类黄酮含量的增加速度，抑制了POD酶活降低和SOD酶活上升。
本发明中，首次克隆并验证了调控植物耐高温性的大豆GmMLP34基因，验证了大豆GmMLP34基因能够抑制大豆和拟南芥是根系生长育和降低高温胁迫下的存活率，丰富大豆GmMLP34基因的高温胁迫的理论研究，为培育根系发达的耐高温植物新品种提供理论和实际参考基础，对进一步了解植物根系生长和在高温胁迫下的存活率机制具有深远意义，也能够为分子水平提高作物根系生长发育与高温胁迫下幼苗存活率提供更多遗传资源信息。
上述是对发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的这种非实质改进，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种大豆GmMLP34基因在调控植物耐高温性上的应用，其特征在于，所述大豆GmMLP34基因的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示，所述大豆GmMLP34基因应用在拟南芥中过表达，能够抑制拟南芥在高温胁迫下的根系生长和降低拟南芥在高温胁迫下的存活率。
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| WO2014184193A2 (en) * | 2013-05-13 | 2014-11-20 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic) | Transgenic plants |
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