CN118127066A - 利用GhXTH23基因功能调控植物开花时间的方法及其生物材料与应用 - Google Patents

利用GhXTH23基因功能调控植物开花时间的方法及其生物材料与应用 Download PDF

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CN118127066A
CN118127066A CN202410334812.3A CN202410334812A CN118127066A CN 118127066 A CN118127066 A CN 118127066A CN 202410334812 A CN202410334812 A CN 202410334812A CN 118127066 A CN118127066 A CN 118127066A
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ghxth
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regulating
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魏恒玲
吴洪梅
孙璐
王寒涛
付小康
马亮
崔红印
芦建华
喻晓云
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Handan Academy Of Agricultural Sciences
Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Handan Academy Of Agricultural Sciences
Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
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Abstract

本发明涉及基因工程和植物育种技术领域，尤其涉及一种利用GhXTH23基因功能调控植物开花时间的方法及其生物材料与应用。本发明所述调控植物开花时间的方法包括如下步骤：调节植物中GhXTH23基因活性。本发明研究表明：植物中GhXTH23基因的活性直接影响植物开花时间。当GhXTH23基因高表达时，植株开花时间推迟。进而，可通过对植物中GhXTH23基因活性的调节，实现对植物开花时间的调控。

Description

利用GhXTH23基因功能调控植物开花时间的方法及其生物材 料与应用
技术领域
本发明涉及基因工程和植物育种技术领域，尤其涉及一种利用GhXTH23基因功能调控植物开花时间的方法及其生物材料与应用。
背景技术
短季棉通常称为早熟棉，其特点是植株结构矮小、紧凑，生长期短，成铃集中。通过早熟品种来缩短生长期，允许晚播早收，以尽量减少这些自然限制造成的作物损失(Fenget al.,2017；Li et al.,2010)。因此，鉴定棉花开花相关基因，阐明其调控机制，并创制早熟棉优异种质资源，对于早熟棉品种的培育及产业化具有重要的意义。
研究表明，木葡聚糖内切糖基酶/水解酶(XTH)是一种细胞壁松弛蛋白，可以参与细胞扩张或细胞壁的修饰。据报道，拟南芥中，XTH7在成熟花的花瓣中高表达，可能通过调节花瓣细胞扩张参与开花过程(Klepikova et al.,2016)，且ERF72与BZR1相互作用后可以通过调节XTH7参与植物的光形态建成以及下胚轴的生长(Liu et al.,2018)。花序茎节间的细胞伸长受到XTH9的调控，XTH9正向调节花序茎节间的细胞伸长，协调植物发育，包括营养和生殖分生组织的分化(Hyodo et al.,2003)。牵牛花中，InXTH2、InXTH3和InXTH4在开花前的黑暗期表达上调，并且它们的表达与花开放率呈正相关(Shinozaki et al.,2014)。据报道，桂花中，XTH24、27、32、35和36可能对环境温度变化做出反应，并有助于低环境温度加速桂花的开花过程(Yang et al.,2022)。细胞壁结构的调节在植物的生长和分化中起着核心作用(Hyodo,Hideki et al.,2003)，目前，关于XTH在植物发育过程的研究大多集中在花的开放，但对于植物开花时间(由营养生长转变为生殖生长)相关的研究报道较少。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种调控植物开花时间的方法，包括如下步骤：调节植物中GhXTH23基因活性。
优选地，所述调节植物中GhXTH23基因活性的方式包括敲除GhXTH23基因、沉默GhXTH23基因、降低GhXTH23基因表达、导入GhXTH23基因、提升GhXTH23基因表达中的至少一种。
优选地，所述GhXTH23基因编码的蛋白氨基酸序列为：
MSSSGFKFTLLVPLIVACLMASSARNFHNDFDITWGDGRGKIVNNGEVLTLSLDKASGSGFQSKNEYLFGKIDMQLKLVPGNSAGTVTAYYLSSKGSTWDEIDFEFLGNLSGDPYILHTNVFSQGKGNREQQFYLWFDPTADFHTYSILWNPQRIIFSVDGTPIREFKNMESFGVPFPKNQPMRIYSSLWNADDWATRGGLVKTDWTQAPFTASYRNFNADACVWSNGASSCKSNASPSSASTNSAWFSQEMDSAKQQRLKWVQKNYMIYNYCNDAKRFP QGLPLECNMS(SEQID NO.2)。
优选地，所述GhXTH23基因的CDS核苷酸序列为：
ATGAGTTCTTCAGGTTTCAAATTTACCTTGCTTGTTCCTCTTATTGTTGCTTGTCTCATGGCATCATCAGCCAGAAATTTCCACAATGATTTTGACATAACATGGGGAGATGGCCGTGGTAAAATCGTCAACAATGGAGAGGTTCTCACTCTCTCCCTCGATAAAGCTTCTGGTTCTGGTTTCCAATCCAAGAACGAGTACCTATTCGGCAAGATTGATATGCAGCTCAAGCTTGTCCCTGGAAACTCCGCTGGCACAGTCACTGCTTACTATCTATCTTCGAAAGGATCAACATGGGATGAAATTGATTTCGAGTTCCTTGGGAATTTAAGTGGTGACCCTTACATTCTTCACACAAATGTGTTCAGTCAAGGAAAGGGTAACAGAGAACAACAATTCTACCTCTGGTTTGACCCAACTGCAGATTTCCATACTTATTCAATCCTTTGGAATCCCCAACGTATAATCTTCTCTGTTGACGGTACACCCATTAGAGAGTTCAAAAACATGGAATCATTTGGTGTCCCGTTTCCTAAGAACCAGCCGATGAGAATTTACTCTAGTTTGTGGAATGCTGATGATTGGGCCACAAGGGGTGGTTTGGTTAAGACCGACTGGACTCAAGCTCCTTTCACTGCCTCTTACAGGAACTTCAATGCTGATGCTTGTGTGTGGTCCAATGGGGCTTCTTCGTGTAAATCGAATGCTTCACCATCTTCTGCATCGACAAACAGTGCATGGTTCTCTCAAGAAATGGATTCAGCTAAGCAGCAAAGGTTGAAATGGGTGCAAAAGAACTACATGATATACAACTACTGCAATGATGCTAAGAGATTTCCTCAAGGTCTACCTCTAGAGTGCAATATGTCTTAA(SEQ ID NO.1)。
优选地，所述植物为棉花或拟南芥。
本发明通过对GhXTH23基因在棉华棉一号的根、茎、叶、花芽、花瓣、雄蕊、雌蕊和纤维中的表达模式进行分析，结果显示：该基因在花瓣中的表达水平最高，其次是雌蕊、雄蕊、花芽和茎，在叶和根中表达水平较低，在纤维中表达水平最低，说明该基因在棉花的花器官中高表达，可能与调控开花时间有关。本发明对GhXTH23的基因功能作出进一步研究，在拟南芥中异源表达GhXTH23得到转基因植株。该转基因植株相比于野生型开花时间延迟，表明GhXTH23基因对棉花开花时间起到负调控作用。
本发明基于前述发现，进一步提供了如下技术方案：
第二方面，本发明提供了一种培育开花时间发生变异的植物品种的方法，包括如下步骤：调节植物中GhXTH23基因活性。
第三方面，本发明提供了靶向编辑GhXTH23基因的生物材料在调控植物开花时间，或者培育开花时间发生变异的植物品种中的应用。
优选地，所述生物材料包括具有GhXTH23基因表达功能的表达载体和/或工程菌。
第四方面，本发明提供了用于调控植物开花时间的生物材料，所述生物材料为具有GhXTH23基因表达功能的表达载体或工程菌。
有益效果：
本发明提供了一种调控植物开花时间的方法，包括如下步骤：调节植物中GhXTH23基因活性。本发明通过异源表达GhXTH23的方式得到转基因植株，该转基因植株相比于野生型开花时间延迟，表明GhXTH23基因对棉花开花时间起到负调控作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1为本发明实施例1中GhXTH23在华棉一号不同组织中的表达模式。
图2为本发明实施例1中GhXTH23超表达的拟南芥开花时间延迟结果。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
以下实施例所用试验材料、试剂和耗材如下：
棉花材料：本实验选取的棉花材料为陆地棉华棉一号，种植于中国农业科学院棉花研究所试验田(河南省安阳市白璧镇)，管理措施为正常大田管理。取样方式为棉华棉一号的根、茎、叶、花芽、花瓣、雄蕊、雌蕊和纤维，至于液氮中，在提取样品RNA之前放置-80℃留存。
试剂和耗材：限制性内切酶，修饰酶、PCR反应体系相关酶、同源重组酶、胶回收试剂盒、克隆试剂盒、质粒小提试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司，荧光定量试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司公司，RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技公司。
其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，卡那霉素等索莱宝生物有限公司，大肠杆菌感受态细胞DH5α和农杆菌感受态购自擎科生物公司
培养基：LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L；LB固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L；LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55度时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板；1/2MS固体培养基：1/2MS22g/L，琼脂粉(agarpowder)8g/L，蔗糖(sucrose)30g/L。
主要仪器：PCR扩增仪(BIO-RAD)，高速离心机(HettichMIKRO 200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)、电热恒温培养箱(上海森信)、恒温培养振荡器(上海智城)、人工气候试验箱(赛福)、人工气候室。
实施例1
1、基因克隆和序列分析
从CottonFGD(http://www.cottonfgd.org/)上获得GhXTH23(GH_D05G0061)基因的CDS序列和编码的氨基酸序列，其CDS序列为873bp，编码290个氨基酸，将该基因命名为GhXTH23，并对其功能进行研究。
GhXTH23的CDS序列为：
ATGAGTTCTTCAGGTTTCAAATTTACCTTGCTTGTTCCTCTTATTGTTGCTTGTCTCATGGCATCATCAGCCAGAAATTTCCACAATGATTTTGACATAACATGGGGAGATGGCCGTGGTAAAATCGTCAACAATGGAGAGGTTCTCACTCTCTCCCTCGATAAAGCTTCTGGTTCTGGTTTCCAATCCAAGAACGAGTACCTATTCGGCAAGATTGATATGCAGCTCAAGCTTGTCCCTGGAAACTCCGCTGGCACAGTCACTGCTTACTATCTATCTTCGAAAGGATCAACATGGGATGAAATTGATTTCGAGTTCCTTGGGAATTTAAGTGGTGACCCTTACATTCTTCACACAAATGTGTTCAGTCAAGGAAAGGGTAACAGAGAACAACAATTCTACCTCTGGTTTGACCCAACTGCAGATTTCCATACTTATTCAATCCTTTGGAATCCCCAACGTATAATCTTCTCTGTTGACGGTACACCCATTAGAGAGTTCAAAAACATGGAATCATTTGGTGTCCCGTTTCCTAAGAACCAGCCGATGAGAATTTACTCTAGTTTGTGGAATGCTGATGATTGGGCCACAAGGGGTGGTTTGGTTAAGACCGACTGGACTCAAGCTCCTTTCACTGCCTCTTACAGGAACTTCAATGCTGATGCTTGTGTGTGGTCCAATGGGGCTTCTTCGTGTAAATCGAATGCTTCACCATCTTCTGCATCGACAAACAGTGCATGGTTCTCTCAAGAAATGGATTCAGCTAAGCAGCAAAGGTTGAAATGGGTGCAAAAGAACTACATGATATACAACTACTGCAATGATGCTAAGAGATTTCCTCAAGGTCTACCTCTAGAGTGCAATATGTCTTAA
GhXTH23编码的氨基酸序列为：
MSSSGFKFTLLVPLIVACLMASSARNFHNDFDITWGDGRGKIVNNGEVLTLSLDKASGSGFQSKNEYLFGKIDMQLKLVPGNSAGTVTAYYLSSKGSTWDEIDFEFLGNLSGDPYILHTNVFSQGKGNREQQFYLWFDPTADFHTYSILWNPQRIIFSVDGTPIREFKNMESFGVPFPKNQPMRIYSSLWNADDWATRGGLVKTDWTQAPFTASYRNFNADACVWSNGASSCKSNASPSSASTNSAWFSQEMDSAKQQRLKWVQKNYMIYNYCNDAKRFP QGLPLECNMS
2、模式分析
为进一步研究该基因在棉花组织中的表达模式，我们选取了华棉一号，提取根、茎、叶、花芽、花瓣、雄蕊、雌蕊和纤维的RNA，使用qRT-PCR技术对GhXTH23进行了组织表达模式分析。
2.1、取样、磨样
选取华棉一号，根、茎、叶、花芽、花瓣、雄蕊、雌蕊和纤维置于液氮中，使用研钵和研杵将其研磨至粉末，取大约1g样品于1.5ML离心管中。
2.2、提取
RNA提取利用试剂盒FastPure Universal PlantTotal RNAIsolation Kit(诺维赞，中国南京)进行，具体步骤如下：
(1)实验在常温下进行，在加有植物组织的离心管中立即加入600μl BufferPSL(多酚多糖植物)，剧烈涡旋振荡30sec，使样本与裂解液充分混合均匀，12,000rpm(134,00×g)离心5min，立即进行后续操作。
(2)取上清约500μl至FastPure gDNA-Filter Columns III(FastPure gDNA-Filter Columns III已放入收集管中)中，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，弃掉FastPure gDNA-Filter Columns III，收集滤液。
(3)向收集管中加入0.5倍滤液体积的无水乙醇(约250μl，根据上清实际情况调整)，振荡混匀15sec。将上述混合液转移至FastPure RNA Columns V(FastPure RNAColumns V已放入收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，弃滤液。
(4)向FastPure RNA Columns V中加入700μl Buffer RWA，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，弃滤液。
(5)向FastPure RNA Columns V中加入500μl Buffer RWB(使用前请检查是否已加入48ml无水乙醇，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，弃滤液。
(6)重复步骤6。
(7)将FastPure RNA Columns V放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2min。
(8)将FastPure RNA Columns V转移至新的RNase-free CollectionTubes 1.5ml离心管中，向吸附柱膜中央悬空滴加30-100μl的RNase-free ddH2O，12,000rpm(13,400×g)离心1min。
其中，洗脱体积不少于30μl，体积过小会影响核酸回收效率。为提高RNA产物浓度：滴加RNase-free ddH2O后室温静置5min；将第一次洗脱液重新加入吸附柱进行洗脱。
(9)提取的RNA可直接用于下游实验或-85～-65℃保存。
2.3、反转录cDNA的合成
反转录cDNA的合成利用试剂盒IIQ RT SuperMix for qPCR(+gDNAwiper)(诺维赞，中国南京)进行，可以分为基因组gDNA的去除和RNA的反转录两部分，反应在冰上进行，反应步骤如下：
(1)基因组gDNA的去除，反应体系配置见表1。
表1反应体系
试剂 用量
RNase-freeddH2O to16μl
4×gDNAwiperMix 4μl
模板RNA 1pg-1μg
用移液器轻轻吹打混匀。42℃2min。
(2)配制逆转录反应体系见表2。
表2逆转录反应体系
试剂 用量
第一步的反应液 16μl
5×HiScriptIIqRTSuperMixII 4.0μl
用移液器轻轻吹打混匀，将上述混合溶液20μl在PCR仪中50℃15min，85℃5sec。产物可立即用于qPCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用。
2.4、荧光定量PCR
(1)利用Oligo 7软件设计GhXTH23基因的特异性引物，用棉花GhActin基因为内参基因，见表3。
表3特异性引物
(2)荧光定量PCR
利用Cwbio(China)的UltraSYBR Mixture(Low ROX)试剂盒和AppliedBiosystems 7500仪器完成。具体过程如下：
1)将上述的cDNA原液稀释5倍；
2)反应体系的配置(冰上操作)见表4。
表4反应体系
试剂 用量
2×UltraSYBRMixture 10.0μl
PCRForwardPrimer(10μM) 0.4μl
PCRReversePrimer(10μM) 0.4μl
cDNA模板(稀释后的工作液) 2.0μl
dH2O(灭菌蒸馏水) upto20μl
将配置好的体系混匀，离心至无气泡，然后利用Applied Biosystems 7500进行荧光定量PCR：按照两步法设置PCR程序：预变性：95℃2min；95℃，5s；60℃，34s(这一步收集荧光信号)，这两步设置40个循环；最后溶解曲线分析：95℃，15s；60℃，20s；95℃，15s。利用Microsoft Excel 2019软件处理数据，计算基因的表达量，Origin 2022软件绘图。
2.5、GhXTH23定量结果分析
GhXTH23在华棉一号的根、茎、叶、花芽、花瓣、雄蕊、雌蕊和纤维中的相对表达量利用2-△△Ct方法计算。由图1可以看出，GhXTH23基因在花瓣中的表达水平最高，其次是雌蕊、雄蕊、花芽和茎，在叶和根中表达水平较低，在纤维中表达水平最低，说明该基因在棉花的花器官中高表达，可能与调控开花时间有关。
3、GhXTH23基因的克隆和pBI121-GhXTH23植物表达载体的构建
3.1、GhXTH23基因克隆引物设计
将GhXTH23的CDS序列全长连接pBI121载体，构建35S启动子载体。分别在起始密码子和终止密码子处设计含有适合酶切位点的引物。pBI121载体所用酶切位点为Xba I和SacI。
GhXTH23酶切位点引物序列如下表5。
表5引物序列
引物名称 引物序列(5'to3')
pBI121-GhXTH23-F CACGGGGGACTCTAGAATGAGTTCTTCAGGTTTCAAA
pBI121-GhXTH23-R GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAAGACATATTGCACTCTAGAG
3.2、PCR克隆GhXTH23基因
(1)PCR反应体系
根据PrimeSTAR GXL DNA聚合酶说明书，PCR反应体系如下表6。
表6反应体系
试剂名称 试剂用量
5×PrimeSTARGXLBuffer 10μl
dNTPMixture 4μl
引物F(10μM) 2μl
引物R(10μM) 2μl
TM-1cDNA 2μl
ddH2O Upto50μl
(2)PCR反应程序：
95℃预变性3min；
95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸90s；35个循环；
16℃延伸。
(3)PCR产物的检测
取2μl PCR产物，加入3μl 6×Loading Buffer，混匀，点样于1％琼脂糖凝胶，电泳检测条带大小是否873bp左右。
(4)PCR产物纯化
使用产物纯化试剂盒(Vazyme，DC301)，步骤如下：
1)在紫外灯下速切下含有目的DNA片段的凝胶，称凝胶重量，100mg凝胶等同于100μl体积，作为一个凝胶体积。
2)加入等体积的Buffer GDP。50～55℃水浴至凝胶完全溶解。
3)将吸附柱置于收集管中，把≤700μl溶胶液转移至吸附柱中，12,000×g离心30-60sec。
4)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300μl Buffer GDP至吸附柱中。静置1min。12,000×g离心30-60sec。
5)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入700μl Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12,000×g离心30-60sec。
6)重复步骤5。
7)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。12,000×g离心2min。
8)将吸附柱置于1.5ml离心管中，加入20-30μl的灭菌水至吸附柱中央，放置2min。12,000×g离心1min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20℃。
3.3、pBI121-GhXTH23植物表达载体的构建
(1)pBI121质粒的双酶切及胶回收
将pBI121质粒用XbaI和SacI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化pBI121载体酶切后的产物。酶切反应体系如下表7。
表7反应体系
(2)PCR胶回收产物和酶切pBI121质粒的连接
使用Vazyme同源重组酶试剂IIOne Step Cloning Kit进行连接反应，体系见表8。
表8反应体系
试剂名称 试剂用量
5XCEⅡBuffer 2μl
ExnaseⅡ 1μl
pBI121双酶切载体 25～100ng
PCR片段 10～100ng
ddH2O Upto10μl
体系完成后，吹打混匀各组分，37℃反应30min。
(3)连接产物转化大肠杆菌
1)向连接反应体系中加入100ul大肠杆菌DH5α感受态连接反应体系中加入连接反应产物，冰浴25min。
2)42℃水浴热激45s。
3)冰浴2min；加入700ul无抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm，孵育1h。
4)5000rpm，离心1min，留约100ul上清，混匀后涂布在含卡那抗性的LB平板。
5)37℃，恒温培养过夜。
(4)阳性克隆的检测及测序
1)从转化平板上挑取单克隆，放入含有Kan的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养8h。
2)菌落PCR验证阳性克隆，将验证正确的单克隆送到尚亚生物科技有限公司测序，每个序列测3个重复。
(5)阳性菌液的保存
菌液PCR验证且测序正确的菌液中加甘油至终浓度在20％以上，-80℃保存。返还测序正确的质粒用于转化农杆菌。
(6)转化农杆菌
利用冻融法转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞：
1)-80℃农杆菌融化，冰水混合状态插入冰中。
2)100μl感受态中加入1μg质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min，液氮5min，37℃5min，冰浴5min。
3)加入700ul无抗性的LB液体培养基，28℃振荡培养2-3h
4)取100-150ul菌液于含有卡那、利福平的LB平板上，倒置放于28℃培养箱2-3天。
5)挑选阳性克隆，在加有抗性的LB液体培养基上28℃培养48h，菌液PCR验证条带正确的菌液加入甘油后-80℃保存备用。
3.4、农杆菌介导的拟南芥转化
(1)拟南芥培养
在人工气候室种植哥伦比亚野生型拟南芥，长至盛花期，将已经结的果荚剪去。
(2)拟南芥花序侵染转化
1)菌液活化：取-80℃保存的农杆菌菌液20μl，接种到1ml LB液体培养基(加入对应的抗生素：卡纳霉素、利福平)中，28℃，180rpm，培养14-18h。
2)扩摇：取活化后的菌液500μl加入到50ml LB加入对应的抗生素的液体培养基中，28℃，180rpm，培养至菌液OD600值约在0.8-1.2之间(约18-20h)，5000rpm，离心10min，弃上清，收集菌体。
3)侵染转化的介质配制：1/2MS减半、5％蔗糖、0.02％的SilwetL-77，用NaOH将pH调至5.6-5.7，0.1mM的AS(乙酰丁香酮)。
4)用转化介质重悬菌体，将OD600调至0.6-0.8。
5)浸染：将拟南芥花序置于转化介质中60s，浸染后弱光或者避光条件下培养24h。
6)将处理后的拟南芥放置正常条件下培养，在一周后使用同样方法进行二次侵染。
7)待成熟后，收获拟南芥种子，即为转基因的T0代种子。
3.5、转基因拟南芥植株的表型鉴定
(1)将收获的种子消毒后种植在含卡那霉素的1/2MS上，后进行4℃春化2天，转移到人工气候试验箱中，10天左右阳性植株生长正常，而阴性植株叶片变黄不再生长。
(2)将阳性拟南芥植株移栽至营养土中，待生长一个月后提取DNA，
PCR检测阳性植株，检测时所用引物见表9：
表9引物序列
引物名称 引物序列(5'to3')
35S GACGCACAATCCCACTATCC
GhXTH23-R TTAAGACATATTGCACTCTAGAGGT
(3)繁殖至T3代，获得纯合转基因拟南芥株系。
(4)将T3代植株与野生型植株(WT)种植在营养土中，10天左右拟南芥幼苗长出真叶即移到花盆里生长，同等条件下种植栽培，使用qRT-PCR技术发现GhXTH23转基因植株中GhXTH23基因的表达量显著高于野生型，表型观察发现GhXTH23转基因拟南芥开花明显晚于野生型(图2),该结果表明GhXTH23在调控开花时间过程中发挥负调控作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.调控植物开花时间的方法，其特征在于，包括如下步骤：调节植物中GhXTH23基因活性。
2.根据权利要求1所述调控植物开花时间的方法，其特征在于，调节植物中GhXTH23基因活性的方式包括敲除GhXTH23基因、沉默GhXTH23基因、降低GhXTH23基因表达、导入GhXTH23基因、提升GhXTH23基因表达中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述调控植物开花时间的方法，其特征在于，所述GhXTH23基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述调控植物开花时间的方法，其特征在于，所述GhXTH23基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求1-4任意一项所述调控植物开花时间的方法，其特征在于，所述植物为棉花或拟南芥。
6.培育开花时间发生变异的植物品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：调节植物中GhXTH23基因活性。
7.靶向编辑GhXTH23基因的生物材料在调控植物开花时间，或者培育开花时间发生变异的植物品种中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述生物材料包括具有GhXTH23基因表达功能的表达载体和/或工程菌。
9.用于调控植物开花时间的生物材料，其特征在于，所述生物材料为具有GhXTH23基因表达功能的表达载体或工程菌。
CN202410334812.3A 2024-03-22 利用GhXTH23基因功能调控植物开花时间的方法及其生物材料与应用 Pending CN118127066A (zh)

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