CN109468408B - 一种与番茄耐旱基因紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于番茄遗传改良和分子生物学领域，公开了一种与番茄耐旱基因紧密连锁的分子标记及应用，利用潘那利野生番茄LA0716渐渗系群体中筛选得到的重要耐旱系IL2‑5与不耐旱栽培番茄M82构建亚系群体，对群体进行耐旱性鉴定和QTL定位；开发了与番茄耐旱基因紧密连锁的分子标记为ID68。本发明为番茄耐旱品种开发提供了紧密连锁的分子标记，具有重要的利用价值；本发明可以在苗期简单、准确和高效地鉴定耐旱番茄种质，极大地缩短了育种周期、材料种植规模和后期鉴定工作，省时、省力、节约成本，有效地解决了常规耐旱育种技术繁杂、成本高昂和周期漫长等问题。
Description
技术领域
本发明属于番茄遗传改良和分子生物学领域，尤其涉及一种与番茄耐旱基因紧密连锁的分子标记及应用。具体涉及一种与番茄耐旱基因紧密相关分子标记在番茄耐旱性遗传改良中的应用。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
干旱是全球农作物生产面临的一种主要逆境，严重影响着作物的生长发育、产量和品质。全球干旱、半干旱地区面积约占陆地表面的41％，预计2025年至少有18亿人将生活在极度缺水的国家或地区，全球2/3的人口可能处于水分短缺的环境。与此同时，随着气候变化加剧，灾害性干旱在全球频繁发生，每年造成的损失巨大。我国新疆地区虽然国土辽阔，但用水短缺成为突出的问题。随着新疆的社会和经济快速发展，水资源短缺问题日益严峻，成为经济可持续发展特别是农业发展的重要制约因素。因此，如何避免或减轻干旱对农作物造成的损失，如何在大面积的干旱、半干旱土地上发展农业，如何节约农业灌溉用水，成为亟待解决的问题。
番茄(Solanum lycopersicum)是全球最重要的蔬菜作物之一。据联合国粮农组织2013年统计数据，全球番茄产量达到1.64亿吨，其中超过30％产自我国，而加工番茄产量的比重更高。新疆是我国加工番茄主产区，产量高达全国的90％左右，加工番茄产业已成为新疆的一个重要优势产业。然而干旱等非生物逆境成为制约番茄产业持续、稳定、健康发展的重要因素，逆境在降低番茄产量的同时也直接影响果实品质。
干旱是植物生长发育的重要制约因素。轻度干旱胁迫使植物气孔关闭、CO2吸收减少、光合作用降低、细胞壁弹性改变，随着干旱强度增加，进一步引起有毒代谢物产生和渗透胁迫加剧以致植物死亡。受到干旱胁迫后植物的水分状况发生变化，进而影响植物的生长，主要包括4个方面：营养物质吸收、光合作用、呼吸作用和氧化还原状态。植物受到干旱胁迫后水分供应量减少，导致蒸腾速率降低，进而降低植物对营养物质的利用率、摄取量、转运和代谢，最终导致总营养吸收降低。研究表明，植物受到干旱胁迫后的光合作用降低，是作物减产的主要原因之一。一方面，植物受到干旱胁迫后，为了防止蒸腾导致的水分流失，气孔逐渐关闭，引起CO2吸收减少，随后净光合作用下降。另一方面，干旱胁迫后非气孔因素限制植物光合作用，当植物受到干旱胁后能量物质ATP和二磷酸核酮糖RuBP的含量降低，随着干旱胁迫程度增加，二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶RuBisCO羧化效率大大下降，严重影响植物光合作用。呼吸作用是植物的重要代谢过程，通过呼吸消耗碳水化合物产生CO2和H2O，为植物生长发育提供能量。然而干旱胁迫条件下交替呼吸增强，由于交替呼吸途径不需经过质子的跨膜转运因而只产生少量ATP，从而影响植物的生长和代谢过程。植物受到干旱胁迫后，活性氧清除机制受损，活性氧在植物体内积累，产生毒害作用。活性氧引起脂质过氧化，导致膜损伤、蛋白质降解和酶失活，引起氧化损伤并影响细胞的正常功能。
目前还没有番茄耐旱分子标记开发及育种的相关报道，番茄抗逆育种仍然主要采用常规手段。常规育种手段获得新品种的周期长，对于抗逆性状来说成功率极低，成本却极高。分子标记辅助育种具有快速、准确、不受外界环境条件干扰的诸多优势，是抗逆育种的必然趋势。
业界现在几乎没有针对番茄开展过耐旱育种(因为育种过程太麻烦，基本都会失败)。
创建番茄耐旱新材料，培育耐旱新品种，对保障番茄稳产和增产具有重大意义。分子标记辅助育种能够大大提高番茄育种效率。分子标记与决定目标性状的基因紧密连锁，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。分子标记可用于亲本亲缘关系的鉴别，回交育种中数量性状和隐性性状的转育，多基因聚合，杂种后代的选择，杂种优势的预测以及品种纯度鉴定等。
综上所述，现有技术存在的问题是：
传统育种在耐旱性研究方面成功率极低，成本极高，周期漫长。由于育种过程的每一代都需要对耐旱性进行鉴定，需要特殊的设施或环境条件，而而且每个世代都不能用单株进行抗性鉴定，需要一个群体进行鉴定，所以周期比一般性状的常规育种周期长至少一倍。实际上，目前育种单位很少具备进行大规模抗旱性鉴定的设施，而依赖于干旱少雨的自然条件进行鉴定可靠性低。耐旱性的鉴定本身受环境影响很大，自然风险高。正由于此，目前在番茄上还没有特定的以耐旱性为育种目标的育种工作。
目前也还没有番茄耐旱分子标记开发及育种的相关报道。现有技术没有利用分子标记辅助对耐旱表型进行预判，因此耐旱表型的选择无法做到快速、准确、不受外界环境条件干扰。开发耐旱分子标记也是一个投入多、周期长的研究工作，但开发成功以后可以迅速地开展分子标记辅助选择的育种工作。
传统的回交育种对于耐旱性是低效的，而开展多性状的聚合则更是困难重重。利用本发明所开发的分子标记可以方便地开展耐旱性的回交转育、基因聚合和其他定向改良。
此外，传统技术没有办法分离到耐旱位点的控制基因，而本分子标记的开发和应用有助于耐旱基因的克隆。
解决上述技术问题的难度和意义：
干旱是农作物面临的最主要逆境之一，严重影响作物的生长发育、产量和品质。栽培番茄不耐干旱，水分供应减少30％，产量损失可达40％。新疆是我国加工番茄的主产区，加工番茄产业已成为新疆的一个重要优势产业。水资源短缺成为加工番茄产业发展的一个重要瓶颈，番茄与棉花争水的局面愈演愈烈。培育节水耐旱的加工番茄品种对于产业的持续发展具有决定性的意义。创建番茄耐旱新材料，培育耐旱新品种，对保障番茄稳产和增产具有重大意义。但是采用常规育种选育耐旱品种的难度极大，先锋公司选育耐旱玉米品种
AQUAmaxTM用了数十年之久。主要的原因是耐旱性为非常复杂的性状，必须依赖于特殊的设施或环境条件进行筛选，并且容易受到环境条件变化的影响，自然风险高。
正由于此，目前在番茄上还没有特定的以耐旱性为育种目标的育种工作进展报道。耐旱分子标记的开发为耐旱育种提供了极大的便利，由于耐旱分子标记与耐旱性状的控制基因紧密连锁，通过检测分子标记，即可检测到耐旱基因的存在，达到选择耐旱性的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。耐旱分子标记可以方便地应用于耐旱性状的转育、多基因聚合、杂种后代的选择以及品种纯度鉴定等。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种与番茄耐旱基因紧密连锁的分子标记及应用。本发明提供一种与番茄耐旱基因紧密相关的InDel(Insertion and Deletion)标记，所述的InDel起始位置为位于番茄参考基因组第2条染色体第44221403位碱基(SL2.40ch02)，InDel片段大小为191bp，DNA序列为SEQ ID NO：1。本发明的另一个目的在于提供针对番茄耐旱基因紧密相关InDel标记所设计的分型引物在番茄耐旱性育种中的应用。
本发明是这样实现的，一种与番茄耐旱基因紧密连锁的分子标记，所述与番茄耐旱基因紧密连锁的InDel分子标记ID68起始位置为番茄参考基因组第2条染色体第44221403位碱基，InDel片段大小为191bp。
本发明的另一目的在于提供一种所述与番茄耐旱基因紧密连锁的分子标记的获取方法，所述获取方法包括：
步骤一，耐旱渐渗系的获得：针对耐旱的潘那利野生番茄LA0716为供体、不耐旱栽培番茄M82为受体的渐渗系IL群体；利用苗期反复干旱法进行筛选，得到耐旱性渐渗系IL2-5；
步骤二，多态性分子标记的开发：针对LA0716和M82提取全基因组水平的InDel；对目标区段的InDel提取上下游各300bp序列，利用Primer5设计引物，通过PCR扩增LA0716、M82、IL2-5以及IL2-5与M8杂交得到的F1植株的DNA，对扩增产物进行凝胶电泳分析，筛选多态性良好的引物用于基因型分析【基因分型是采用一批引物对每个亚系的基因型进行分析，确定该亚系含有耐旱材料的哪一个片段，并通过不同亚系的耐旱表型比较确定哪个片段含有耐旱基因。】。步骤三，纯合亚系的获得：以耐旱系IL2-5为父本，M82为母本杂交获得F1，进一步自交获得F2分离群体；从F2分离群体中，利用IL2-5渐渗系区段上端标记ID72(ID72-F：5′-TATAGAGTACATTTGCCTGTGGGG-3′DNA序列为SEQ ID NO：2；ID72-R：5′-TGGTGAAGTGAGGCCAAATAAAG-3′DNA序列为SEQ ID NO：3)和下端标记ID83(ID83-F:5′-GTTTGATAGCCGAGCGAATTG-3′DNA序列为SEQ ID NO：4；ID83-R:5′-AACGTGTTTCGTGTTGTATGCC-3′DNA序列为SEQ ID NO：5)鉴定出重组单株；进一步利用分子标记对鉴定出的重组单株基因型进行分析，自交留种并进一步在子代中鉴定得到F2:4家系的纯系，即为渐渗系亚系；
步骤四，耐旱亚系的筛选：挑选各亚系和M82种子，催芽后播种于穴盘，随机区组设计，将幼苗置于生长室中生长，进行水肥管理；待幼苗长至5叶期时，对材料进行干旱处理，处理3周达到重度干旱后复水，统计各个系成活率；根据统计分析结果，将耐旱遗传位点锁定在cd和ef区段；
步骤五，与耐旱基因连锁的分子标记的获得：根据耐旱位点的定位结果，对耐旱亚系含有的渗入片段的InDel设计分子标记，并验证多态性；InDel标记ID68与耐旱位点紧密连锁，为耐旱分子标记。
进一步，步骤二中，引物为：
ID68-F:5′-GTCAAACCAGACCCCTAACACC-3′DNA序列为SEQ ID NO：6；
ID68-R:5′-GTACAACCCCAAGAACCACCAG-3′DNA序列为SEQ ID NO：7。
进一步，步骤四中，待幼苗长至2叶1心时，挑选长势一致的幼苗移栽至营养钵，钵内基质成分为等比例的蛭石、泥炭和珍珠岩；每种材料设3次重复，每重复10株幼苗，随机区组设计。
进一步，步骤五中，InDel标记ID68在PCR扩增和凝胶电泳分析后，条带大小与耐旱亲本LA0716相同的亚系耐旱性高于条带与敏感亲本M82相同的亚系。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明利用潘那利野生番茄LA0716渐渗系群体中筛选得到的重要耐旱系IL2-5与不耐旱栽培番茄M82构建亚系群体，对群体进行耐旱性鉴定和QTL定位。基于LA0716和M82的基因组测序信息以及耐旱QTL定位结果开发了与番茄耐旱基因紧密连锁的分子标记ID68。根据该标记的状态即可判断番茄植株中是否含有与该标记连锁的耐旱基因，从而推断植株是否耐旱。这一点得到了育种实例的验证。以新疆的传统加工番茄品种里格尔87-5、加工番茄骨干亲本M3为改良对象，通过与耐旱亚系杂交，利用ID68判断杂交材料的真实性；之后与育种亲本回交，并不断以回交材料为母本、育种亲本为父本，连续进行回交。回交育种过程中利用ID68检测判断耐旱基因是否存在于回交材料中，以此判断耐旱性是否成功导入。通过ID68辅助判断将含有耐旱基因的片段导入了里格尔87-5以及骨干亲本M3的材料，经过干旱处理实验证实原始材料的耐旱性得到改良。对育种亲本和改良后的育种亲本进行重度干旱处理，干旱后复水成活率结果表明：里格尔87-5成活率仅为17.6％，而改良后的里格尔87-5同期成活率为92.85％。类似地，加工番茄骨干亲本M3干旱处理后成活率仅为8.3％，而改良后的骨干亲本M3同期成活率为100％。因此，本发明为番茄耐旱品种开发提供了紧密连锁的分子标记，具有重要的利用价值。
本发明可以在苗期简单、准确和高效地鉴定耐旱番茄种质，极大地缩短了育种周期、材料种植规模和后期鉴定工作，省时、省力、节约成本，有效地解决了常规育种技术繁杂、成本高和周期长等问题。
附图说明
图1本发明实施例提供的与番茄耐旱基因紧密相关InDel标记的获得方法流程图。
图2是本发明实施例提供的利用IL2-5的亚系群体进行耐旱QTL分析图。
图中：黑色代表来自IL2-5的渗入片段、白色代表M82的染色体片段。顶部为分子标记，左侧为各系干旱处理成活率，底部为定位的3个遗传位点，绿色为正效，红色为负效。
图3是本发明实施例提供的ID68扩增产物的凝胶电泳检测结果图。
图中：M为DNA ladder，H2O为阴性对照，S为来自干旱敏感材料的带型，D为来自耐旱供体亚系1040的带型，D/S为杂合带型。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
目前还没有番茄耐旱分子标记开发及育种的相关报道，番茄抗逆育种仍然主要采用常规手段。常规育种手段获得新品种的周期长，对于抗逆性状来说成功率极低，成本极高。
为解决现有技术，下面结合方案对本发明作详细描述。
本发明实施例提供的与番茄耐旱基因紧密相关的InDel(Insertion andDeletion)标记ID68在番茄耐旱育种中的应用，所述的InDel起始位置为番茄参考基因组第2条染色体第44221403位碱基(SL2.40ch02)，InDel片段大小为191bp。DNA序列为SEQ IDNO：1为：GGATCCTTGTAAATAGGAAAACAATGAATAAATGATAAAGTGGGTAATCGTTGAATAATAAACTATATTACCAAATATAAGCGCAAGTGTTGGCAGAATTGGTCAAAATCACTACAATAATTACTGGAATTTTGGGTTTAACAGAGTTGTTAATTAGTAACTAATCTGAACTACAGTTGGGACATCACATC。
InDel为耐旱相关分子标记。
所述的引物序列为
ID68-F:5′-GTCAAACCAGACCCCTAACACC-3′SEQ ID NO：6；
ID68-R:5′-GTACAACCCCAAGAACCACCAG-3′SEQ ID NO：7。
所述的引物为针对番茄耐旱基因紧密相关的该InDel设计的引物。
如图1所示，本发明实施例提供的与番茄耐旱基因紧密相关InDel标记的获得方法包括：
S101:耐旱渐渗系的获得：针对耐旱的潘那利野生番茄LA0716为供体、不耐旱栽培番茄M82为受体的渐渗系(IL)群体。利用苗期反复干旱法进行筛选，得到耐旱性强且表现稳定的渐渗系IL2-5。
S102:多态性分子标记的开发：针对LA0716和M82提取了全基因组水平的InDel。进一步对目标区段的InDel提取其上下游各300bp序列，利用Primer5设计引物，通过PCR扩增LA0716、M82、IL2-5以及IL2-5与M8杂交得到的F1植株的DNA，对扩增产物进行凝胶电泳分析，筛选多态性良好的引物用于基因型分析。
S103:纯合亚系的获得：以耐旱系IL2-5为父本，M82为母本杂交获得F1，进一步自交获得F2分离群体。从2000株F2分离群体中，利用IL2-5渐渗系区段上端标记ID72和下端标记ID83共鉴定出52个重组单株。进一步利用开发的一系列多态性分子标记对鉴定出的重组单株基因型进行分析(图2)，自交留种并进一步在子代中鉴定得到F2:4家系的纯系，即为渐渗系亚系。
S104:耐旱亚系的筛选：挑选各亚系和M82种子各100粒，催芽后播种于穴盘，待幼苗长至2叶1心时，挑选长势一致的幼苗移栽至营养钵，钵内基质成分为等比例的蛭石、泥炭和珍珠岩。每种材料设3次重复，每重复10株幼苗，随机区组设计，将幼苗置于生长室中生长，按植株正常生长要求进行水肥管理。待幼苗长至5叶期时，开始对材料进行干旱处理，处理前将所有材料的营养钵置于水中浸泡12h以吸足水分，之后开始断水处理，处理约3周达到重度干旱后复水，统计各个系成活率。成活率较高的亚系耐旱性较强，为耐旱亚系(图2)。根据统计分析结果，将耐旱遗传位点锁定在cd和ef区段(图2)。
S105:与耐旱基因连锁的分子标记的获得：根据耐旱位点的定位结果，对耐旱亚系含有的渗入片段的InDel设计分子标记，并验证其多态性，方法同步骤S102，结果表明InDel标记ID68在PCR扩增和凝胶电泳分析后，条带大小与耐旱亲本LA0716相同的亚系耐旱性显著高于条带与敏感亲本M82相同的亚系，因此ID68与耐旱位点紧密连锁，确定为耐旱分子标记(图3)。
步骤S103中，ID72的引物为：
ID72-F：5′-TATAGAGTACATTTGCCTGTGGGG-3′DNA序列为SEQ ID NO：2；
ID72-R：5′-TGGTGAAGTGAGGCCAAATAAAG-3′DNA序列为SEQ ID NO：3；
ID83的引物为：
ID83-F:5′-GTTTGATAGCCGAGCGAATTG-3′DNA序列为SEQ ID NO：4；
ID83-R:5′-AACGTGTTTCGTGTTGTATGCC-3′DNA序列为SEQ ID NO：5。
在本发明实施例中，图3是本发明实施例提供的ID68扩增产物的凝胶电泳检测结果图；图中：M为DNA ladder，H2O为阴性对照，S为来自干旱敏感材料的带型，D为来自耐旱供体1040的带型，D/S为杂合带型。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
实施例1：
分子标记辅助加工番茄品种里格尔87-5的耐旱性改良
1)耐旱性的回交转育
以里格尔87-5为母本、耐旱渐渗系IL2-5研究中获得的耐旱亚系1040为父本杂交获得F1，利用PCR和耐旱分子标记ID68对F1进行检测，确认真杂种。将上述F1为母本，里格尔87-5为父本进行多代回交转育，每个回交世代均利用耐旱分子标记ID68进行PCR检测，筛选含有1040特征条带的植株进行种植和下一代回交，获得BC4F2回交群体，并在BC3F2世代对回交材料的耐旱性进行了验证性鉴定。
2)里格尔87-5回交转育BC3F2材料的耐旱性鉴定
挑选里格尔87-5、耐旱亚系1040以及利用二者所构建的BC3F2回交材料的种子各100粒，催芽后播种于穴盘，待幼苗长至2叶1心时，挑选长势一致的幼苗移栽至营养钵内，钵内基质成分为等比例的蛭石、泥炭和珍珠岩，置于生长室中生长，正常肥水管理。
在幼苗期利用CTAB法提取BC3F2群体各植株的DNA，利用耐旱分子标记ID68通过PCR技术对各植株基因型进行筛选，筛选含有1040亚系特征条带的植株。
待幼苗长至5叶期时对材料进行干旱处理，处理前将所有材料的营养钵置于中浸泡12h，吸足水分后开始断水处理，处理约3周达到重度干旱后再复水，统计各个系成活率。
干旱复水后的成活率统计结果表明BC3F2群体中含有1040亚系特征条带的植株复水后成活率为92.85％，里格尔87-5为17.6％，前者显著高于后者，表明里格尔87-5的回交转育材料耐旱性得到改良。
实施例2：
分子标记辅助加工番茄骨干亲本M3的耐旱性改良
1)耐旱性的回交转育
以加工番茄骨干亲本M3为母本、耐旱渐渗系IL2-5研究中获得的耐旱亚系1040为父本杂交获得F1。利用PCR和耐旱分子标记ID68对F1进行检测，确认真杂种。将上述F1为父本，M3为母本进行多代回交转育，每世代均利用标记ID68进行PCR检测，筛选含有1040特征条带的植株进行种植和下一代回交，获得BC4F2回交群体，并在BC3F2世代对回交材料的耐旱性进行了验证性鉴定。
2)M3回交转育BC3F2材料的耐旱性鉴定
挑选加工番茄骨干亲本M3及其BC3F2回交群体的种子各100粒，催芽后播种于穴盘，待幼苗长至2叶1心时，挑选长势一致的幼苗移栽至营养钵内，钵内基质成分为等比例的蛭石、泥炭和珍珠岩。各材料置于生长室中生长，温度为25±2℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为3500Lux，正常肥水管理。
在幼苗期利用CTAB法提取BC3F2群体各植株的DNA，利用耐旱分子标记ID68通过PCR技术对各植株基因型进行筛选，筛选含有1040亚系特征条带的植株。
待幼苗长至5叶期时对材料进行干旱处理，处理前将所有材料的营养钵置于中浸泡12h，吸足水分后开始断水处理，处理约3周达到重度干旱后再复水，统计各个系成活率。
干旱复水后的成活率统计结果表明M3的BC3F2群体中含有1040亚系特征条带的植株复水后成活率为100％，M3仅为8.3％，前者显著高于M3，表明加工番茄骨干亲本M3的回交转育材料耐旱性得到改良。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种与番茄耐旱基因紧密连锁的分子标记及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 191
<212> DNA
<213> 番茄(Tomato)
<400> 1
ggatccttgt aaataggaaa acaatgaata aatgataaag tgggtaatcg ttgaataata 60
aactatatta ccaaatataa gcgcaagtgt tggcagaatt ggtcaaaatc actacaataa 120
ttactggaat tttgggttta acagagttgt taattagtaa ctaatctgaa ctacagttgg 180
gacatcacat c 191
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatagagtac atttgcctgt gggg 24
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggtgaagtg aggccaaata aag 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtttgatagc cgagcgaatt g 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacgtgtttc gtgttgtatg cc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcaaaccag acccctaaca cc 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtacaacccc aagaaccacc ag 22
Claims (1)
1.一种鉴定番茄耐旱基因的分子标记，其特征在于，所述鉴定番茄耐旱基因的分子标记片段大小为191 bp，DNA序列为SEQ ID NO：1。
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