CN111341384A - 一组大豆数量性状qtl位点及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组大豆数量性状QTL位点及其筛选方法，属于分子遗传学领域。该方法包括：确定目标性状；筛选亲本，构建遗传群体；获得目标性状的表型数据；提取亲本和遗传群体的基因组DNA；构建混合池，进而在双亲及混合池间筛选与目标性状连锁的分子标记，选择p＜0.0001的分子标记进一步鉴定遗传群体中的基因型；QTL定位分析。利用此方法筛选出两个控制大豆蛋白质含量的QTL位点和一个控制大豆分枝数的QTL位点。本发明取得的有益效果为：建立了一种筛选大豆数量性状QTL位点的方法，为大豆有关性状的基因初定位、精细定位、克隆及新品种选育奠定基础，同时为大豆分子标记辅助选择提供可用标记。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传学技术领域，更具体的说是涉及一组大豆数量性状QTL位点及其筛选方法。
背景技术
动物和植物的性状一般分为质量性状和数量性状。质量性状由主基因控制，效应较大，而数量性状由多个基因控制，各基因的效应微小。对质量性状单基因或数量性状主效基因的定位常规的方法为集群分离分析法(Bulked SegregantAnalysis,BSA)，该方法对微效基因的定位则显得无能为力。
BSA方法是从近等基因系分析法演化而来的，在尚无遗传连锁图或图谱饱和程度较低的情况下，该方法也可以快速、高效地进行基因定位。BSA法需要分离群体中的表型差异非常显著，更倾向于对质量性状单基因进行初步定位；该方法对群体中不存在多态性的基因座位无法直接分析，这是该方法的一些不足。我们利用BSA方法定位到了与大豆数量性状相关的QTL。
大豆是我国仅次于水稻、小麦和玉米的第四大作物，是我国主要的粮食和油料作物之一。大豆具有极高的营养价值，且大豆的需求日益增加。大豆的大部分性状如株高、产量、品质、抗性等是多基因控制的数量性状，对数量性状进行QTL定位和图位克隆是解析多基因控制的有效方法，也是大豆数量性状基因挖掘与功能研究的重要途径。
本发明的目的在于利用BSA法对大豆数量性状进行QTL定位，利用基于BSA连锁分析的方法筛选出与目标性状相关的主效QTL，获得与之紧密关联的分子标记，为大豆有关性状的基因初定位、精细定位、克隆及新品种选育奠定基础，同时为大豆分子标记辅助选择提供可用标记。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一组大豆数量性状QTL位点及其筛选方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一组大豆数量性状QTL位点，包括两个控制大豆蛋白质含量的QTL位点和一个控制大豆分枝数的QTL位点；
所述控制大豆蛋白质含量的QTL位点，命名为qPro-8-1和qPRO-19-1，所述qPro-8-1位于8号染色体的SSR_50-SSR_51之间，所述qPRO-19-1位于19号染色体的SSR_19_38-SSR_19_59之间；
所述控制大豆分枝数的QTL位点，位于6号染色体的06_0993-06_1441之间。
一组大豆数量性状QTL位点的筛选方法，包括如下步骤：
(1)确定目标性状；
(2)筛选亲本，构建遗传群体；
群体构建时选择的亲本目标性状需存在较大差别，子代可稳定遗传，蛋白质含量亲本相差4％及以上构建的遗传群体较好；分枝数亲本相差4个及以上构建的遗传群体较好；
(3)获得目标性状的表型数据；
(4)提取亲本和遗传群体的基因组DNA；
(5)根据目标性状的表型数据，选择表型稳定的极端单株构建两个混合池，进而在双亲及两个混合池间筛选与目标性状连锁的分子标记，选择p＜0.0001的分子标记进一步鉴定亲本和遗传群体中的基因型；
(6)利用亲本和遗传群体中的基因型，结合目标性状的表型数据，进行QTL定位分析。
优选的，筛选大豆蛋白质含量的QTL位点时，所述亲本为黑河50和中引1106，中黄35和十胜长叶。
当亲本为黑河50和中引1106时筛选出了QTL位点qPro-8-1，当亲本为中黄35和十胜长叶时筛选出了QTL位点qPRO-19-1。
优选的，筛选大豆分枝数的QTL位点时，所述亲本为KN24和KF19。
优选的，步骤(2)所述构建遗传群体，包括F2及其衍生的F3、F4家系、回交群体的暂时性群体和重组自交系、由DH或RIL创造的永久F2、近等基因系的永久性群体。
优选的，所述步骤(6)的具体操作为：
(61)设定QTL的显著性水平为0.05，利用分析软件进行模拟运算，得出LOD的阈值；当某一位点的LOD值大于阈值时，则存在一个显著QTL位点；
(62)同时采用区间作图法和完备区间作图法进行QTL定位，并估算QTL位置、加性效应、对表型变异的加性贡献率，及存在的QTL定位区间
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：建立了一种筛选大豆数量性状QTL位点的方法，同时获得一至多个目标性状的QTL，筛选出两个尚未见报道、与大豆蛋白质含量相关的主效QTL，一个与大豆分枝数紧密相关的QTL，为大豆有关性状的基因初定位、精细定位、克隆及新品种选育奠定基础，同时为大豆分子标记辅助选择提供可用标记。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1大豆BC1F4、BC1F5和BC1F6群体蛋白质含量分布分析图，图中，A表示BC1F4群体，B表示BC1F5群体，C表示BC1F6群体；
图2附图为本发明实施例1步骤6)中部分SSR标记在亲本间的多态性；
图3附图为本发明实施例1步骤7)中与蛋白质含量连锁的标记；
图4附图为本发明实施例1中检测到的QTL在染色体上的分布；
图5附图为本发明实施例2步骤3)中F15和F16群体的蛋白质含量分布图，其中，A为F15的蛋白质含量分布图，B为F16的蛋白质含量分布图；
图6附图为本发明实施例2步骤7)中检测到的QTL在19号染色体上的分布；
图7附图为本发明实施例3中KN24×KF19群体F2代分枝数性状正态分布图；
图8附图为本发明实施例3中小样本群体在6号染色体上的分枝数QTL定位；其中，图a为LOD值分布图，图b为连锁图谱；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1大豆蛋白质含量QTL定位分析：黑河50与中引1106构建的BC1群体
1)亲本筛选
选择来自黑龙江省农业科学院黑河分院选育的黑河50和引进的优异种质中引1106，黑河50为母本，其特性主要为早熟、抗倒、高产，蛋白质含量为41.27％；中引1106为父本，特性主要为晚熟、抗倒，蛋白质含量为45.88％。
2)遗传群体构建
2011年黑河50和中引1106均种植于黑龙江省黑河市实验基地，人工授粉杂交，获得F1，于2012年在黑河分院试验田种植F1，2013年种植F2，从中选择蛋白含量为45.79％的一个单株与黑河50杂交构建回交群体，得到BC1F1，再经过连续加代(海南)自交，于2017年获得384个家系的BC1F6群体。
3)蛋白质含量的测定及分布
每株选择完整的大豆籽粒，用德国Bruker公司生产的傅立叶变换近红外光谱仪测定回交群体的BC1F4、BC1F5和BC1F6的蛋白质含量。每份样品扫描3次，收集近红外吸收光谱信息，用已构建好的大豆蛋白质干基模型在软件OPUS中分析样品光谱数据得到蛋白质含量数据，以三次平均值代表每份样品的蛋白质含量，5株的平均值作为该株系的蛋白质含量。
利用SPSS19.0对BC1F4、BC1F5和BC1F6群体的蛋白质含量进行统计分析，结果如表1、表2所示。
表1 BC1F4、BC1F5和BC1F6群体蛋白质含量基本数据分析
表2 BC1F4、BC1F5和BC1F6群体蛋白质含量的相关性
注：**表示极显著相关。
由表1、表2结果可知，蛋白质含量变异丰富且世代间呈现极显著正相关。
大豆BC1F4、BC1F5和BC1F6群体蛋白质含量分布分析如图1所示，由图1可知，BC1F4、BC1F5和BC1F6群体的蛋白质含量分布呈现正态分布。
4)DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳
BC1F6群体的384个家系分别取不同单株叶片等量混合，采用CTAB法提取基因组DNA，同时提取亲本的基因组DNA。
用分布于20个染色体的872对SSR引物进行多态性筛选，选择多态性高、扩增性强、条带清晰的SSR引物，SSR引物由北京博迈德生物技术有限公司合成。
PCR反应采用20μL反应体系，反应体系组成为5μL的DNA模板(20ng/μL)，2μL 10×Easy Taq Buffer(含Mg2+)，1.5μL 2.5mmol/L dNTPs，8.3μL的ddH2O，0.2μL EasyTaq酶(5U/μL)，3μL 2umol/L SSR引物(正反向引物混合)。PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃(SSR引物)退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸5min，12℃保存。扩增产物中加入6μL6×loadingbuffer(0.125g的溴酚蓝，0.125g的二甲苯青，49mL的甲酰胺，1mL0.5M，PH8.0的EDTA)，95℃变性3min，取出后迅速置于冰水混合物中冷却。
用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定基因型，鉴定方法为取1μL变性后的PCR产物上样，恒定功率100W，电泳1～2h，最后进行银染显色。将与轮回亲本黑河50的条带相同的记为A，与供体亲本中引1106的条带相同的记为B，杂合的带型记为H，缺失或模糊不清的带型记为“-”。
5)混合池的构建
根据BC1F4和BC1F5的蛋白质含量，筛选世代间蛋白质含量稳定、蛋白质含量极高和极低的株系分别构建极高混池(HP)和极低混池(LP)，其中LP由21个株系构成，HP由17个株系构成，具体如表3所示，表中a代表BC1F4蛋白质含量，b代表BC1F5蛋白质含量。
表3 HP和LP株系及蛋白质含量
6)SSR标记筛选
利用872个SSR引物扩增亲本黑河50和中引1106的基因组DNA，共检测出365个多态性SSR标记，如图2所示，占引物总数的41.86％。
7)连锁标记的检测
用亲本间的多态性引物鉴定HP和LP的基因型，365个标记中共有23个引物(具体见表4)在两个混池间存在规律性的差异，表现为LP基因型与低蛋白亲本黑河50基因型一致，HP基因型与高蛋白亲本中引1106基因型一致或呈现杂合带型(如图3所示)，推测这23个引物与蛋白质含量连锁，同时鉴定BC1F6群体的基因型，进行单因素方差分析，选择p<0.0001的连锁标记，并在这些标记周围加密标记，鉴定群体基因型，进行蛋白含量QTL分析。
表4混池间存在规律性差异的23个引物序列
8)主效QTL定位分析
根据BC1F6群体每个家系鉴定的SSR基因型及对应的蛋白质含量，利用QTLICIMapping4.1的IM和ICIM进行数据分析，permutation times模拟运算1000次，设定QTL的显著性水平为0.05，结果如图4、表5所示。
由图4结果可知，在不同的分析方法中共同出现了一个蛋白QTL，命名为qPro-8-1，位于8号染色体的SSR_50-SSR_51之间；由表5结果可知，IM和ICIM可解释的表型变异分别为2.26％和7.85％，该基因座上来自中引1106的等位基因，增加蛋白质含量。
表5 IM和ICIM检测到的大豆蛋白QTL的染色体位置和参数
利用BC1F7的蛋白质含量进行QTL分析，可在SSR_50-SSR_51定位到QTL。
另外，在BC1F7的384个家系中，筛选了184个家系，这184个家系的蛋白质含量分布呈现正态分布，每个家系随机挑选5粒种子，育苗混合提取DNA，进行芯片测序获得SNP数据，利用QTL ICIMapping4.2进行分析后发现在8号染色体上存在一个QTL，且与SSR_50-SSR_51区间重叠。
实施例2大豆蛋白质含量QTL定位分析：中黄35与十胜长叶构建的RIL群体
1)亲本筛选
选择高油、高产的中黄35为母本，连续两年的蛋白质含量分别为40.31％和39.25％；日本引进的高蛋白品种十胜长叶为父本，连续两年的蛋白质含量分别为46.21％和44.47％。
2)遗传群体构建
母本中黄35与父本十胜长叶杂交后获得F2群体。利用单粒传法在北京、海南两个地点进行加代繁殖，形成一个稳定的由199个家系组成的重组自交系群体(F15和F16)。
3)蛋白质含量的测定及分布
蛋白质含量测定方法同实施例1。
利用SPSS19.0对F15和F16群体的蛋白质含量进行统计分析，结果如表6所示。两个世代的蛋白质含量相关性系数为0.393，呈现极显著正相关，结果如表7所示。
表6 F15和F16蛋白质含量统计分析
表7 F15和F16蛋白质含量统计分析
F15和F16群体蛋白质含量分布分析如图5所示，A为F15群体的蛋白质含量分布，B为F16群体的蛋白质含量分布，由图5可知，F15和F16群体的蛋白质含量分布呈现正态分布。
4)DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳
DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳方法同实施例1。
5)混合池的构建
参照实施例1混合池构建的方法，构建极高混池(HP)和极低混池(LP)，均由10个株系构成，具体如表8所示，其中a代表F15的蛋白质表型，b代表F16的蛋白质表型。
表8 HP和LP株系及蛋白质含量
6)SSR标记筛选
与实施例1一样，利用872个SSR引物扩增中黄35和十胜长叶的基因组DNA，共检测出316个多态性SSR标记，占引物总数的36.2％。
7)连锁标记的检测及QTL定位
用上述筛选出的多态性引物鉴定HP和LP的基因型，其中有9个标记在蛋白高低“基因池”中具有差异。包括3号染色体2个，相距为1.2Mb。18号染色体4个，相距为3Mb。19号染色体3个，相距为1.2Mb。其中，3号染色体和18号染色体被前人报道过。3号染色体与前人定位区间重叠，并且连锁标记的位置在前人定位区间内。18号染色体与前人发表过的区间未完全重叠，连锁标记左端标记与前人定位区间右端标记具有重叠部分，重叠部分为440Kb，19号染色体连锁标记位置未见报道。因此，进一步对19号染色体连锁标记附近进行筛选，共筛选出25对多态性标记。
利用22对亲本间具有多态性的SSR引物分析RIL群体基因型，结合蛋白质含量定位与蛋白质含量相关的QTL。利用QTL ICIMapping4.1的ICIM进行数据分析，permutationtimes模拟运算1000次，设定QTL的显著性水平为0.05，结果如图6、表9所示。
F15、F16两代数据均将蛋白质含量QTL定位在分子标记SSR_19_38和SSR_19_59之间，区间命名为qPRO-19-1。其中，F15群体LOD值为3.43，可解释的表型变异率为7.81％，加性效应为-0.56。F16群体LOD值为3.98，可解释的表型变异率为14.87％，加性效应为-0.84。两代蛋白质含量QTL定位区间中加性效应均为负值，表明定位高蛋白的基因来自于高蛋白亲本十胜长叶。
表9 F15、F16群体蛋白质含量QTL的染色体位置和参数
实施例3大豆分枝数QTL定位分析
1)亲本筛选
选择多分枝品种KN24为母本和少分枝品种KF19为父本配制杂交组合，2015年KN24的分枝数为6.0个，KF19的分枝数为0.6个；2016年KN24的分枝数为7.9个，KF19的分枝数为1.1个。
2)遗传群体构建
利用多分枝品种KN24为母本，少分枝品种KF19为父本人工杂交，获得F1，自交产生F2，F2由3株F1自交产生，F2共有549个单株，种植于黑龙江省克山县，常规大田管理，大豆成熟后，去除边株，测定每个单株的株高、主茎节数、分枝数等农艺性状。
3)分枝数鉴定及分布
KN24×KF19群体F2代共有549个单株，分枝数的变异范围为0-8个，接近亲本的表型变异范围。对F2代进行正态性检验，发现F2代的分枝数性状符合正态分布，如图7所示，均值为2.846，标准差为1.784。表明KN24×KF19群体F2代的分枝数性状是典型的多基因控制的数量性状。
4)遗传图谱构建
因群体量大，从中选择一个小样本进行分枝数QTL初定位，小样本群体的筛选以不改变表型多态性为原则，尽可能模拟每一种分枝类型在总群体中所占的比例。
在F2中筛选237个单株组成小样本群体，用于分枝数QTL初定位。首先在亲本间筛选20条染色体上的SSR标记，发现在6号染色体上的SSR标记在亲本间多态性标记较多，利用这些多态性标记鉴定小群体个体基因型，结合表型数据进行QTL初定位，在6号染色体上定位到1个QTL(如图8b中红色标记所示)，位于06_0717-06_1441之间，由定位软件可直接计算出LOD值为4.5(图8a)，可解释的遗传变异为11.5％。
利用同样的方法对总群体的QTL进行定位，在6号染色体上定位到1个QTL，位于06_0993-06_1441之间，由定位软件可直接计算出可解释的表型变异为6.5％。
之后利用同样的方法对F7:8代进行定位，在6号染色体上定位到1个QTL，位于06_1048和06_1053之间，可解释的表型变异为22％，与F2代定位到的QTL重叠。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 一组大豆数量性状QTL位点及其筛选方法
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgggataaat agaagtggaa ca 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttggcaaatg tgaaatgtat a 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcggcgttaa tttatgccgg aaa 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgtttggtc tagaatagtt ctca 24
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggcttcatt ttagatggag tc 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggagctcat attcgtcaca aag 23
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gattaggttt tgttttgttt ctgg 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcgttttgtg atttgttttc ctcatttact 30
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcggctatca aacattttta catgatggtt a 31
<210> 11
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tgccactagt tataatccaa tcca 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcatgcatag aaaaatcatc aaa 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggaccttcag ctagagccta ca 22
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ttgcgtttca ttaattcatt tttc 24
<210> 15
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cctcaaattc atctcacatt tttg 24
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tcaccctaca actgctacat gc 22
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tggtctggca agtctttaat ttt 23
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caacctgtat tccacaaaaa atctcacc 28
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<212> DNA
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gcgccccaat ttgactataa ataaaagt 28
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<212> DNA
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gcgcacctag ttgactcttg 20
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actaccccac atacttcctt ttat 24
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<212> DNA
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ggtggatttt gccctcaata 20
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gcgttgtgca ccttgttttc t 21
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tgacatgtgg tgaaggagga 20
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agcctgcaga aaattggaaa 20
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tgatctttaa cacctgatcc ga 22
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gcccaatcaa ttgcattctt 20
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atcggcccct tgattaagtt 20
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tggtttgagt cgcatttcag 20
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cgaaaagtgc tcaaagatcc a 21
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aactcaaatc caaactcact 20
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actcagtaaa taacaaaagt catt 24
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ttgaaggaaa gggtaaacct atat 24
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tcttatcgtt ccgtgctcca gat 23
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ttttgcatta aaggctaata tgaa 24
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gcgaaacaac tcacttaagc aatacat 27
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gcgtcctcct acctttctta tc 22
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gcgcctctca tatggtat 18
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gcggggggga aatgtaga 18
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aaaagaagga gtgtcgggtg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
caaaaagatc aattggtggg 20
Claims (6)
1.一组大豆数量性状QTL位点，其特征在于，包括两个控制大豆蛋白质含量的QTL位点和一个控制大豆分枝数的QTL位点；
所述控制大豆蛋白质含量的QTL位点，命名为qPro-8-1和qPRO-19-1，其中，所述qPro-8-1位于8号染色体的SSR_50-SSR_51之间，所述qPRO-19-1位于19号染色体的SSR_19_38-SSR_19_59之间；
所述控制大豆分枝数的QTL位点，位于6号染色体的06_0993-06_1441之间。
2.如权利要求1所述的一组大豆数量性状QTL位点的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)确定目标性状；
(2)筛选亲本，构建遗传群体；
(3)获得目标性状的表型数据；
(4)提取亲本和遗传群体的基因组DNA；
(5)根据目标性状的表型数据，选择表型稳定的极端单株构建两个混合池，进而在双亲及两个混合池间筛选与目标性状连锁的分子标记，选择p＜0.0001的分子标记进一步鉴定亲本和遗传群体中的基因型；
(6)利用亲本和遗传群体中的基因型，结合目标性状的表型数据，进行QTL定位分析。
3.如权利要求2所述的一组大豆数量性状QTL位点的筛选方法，其特征在于，筛选大豆蛋白质含量的QTL位点时，所述亲本为黑河50和中引1106，中黄35和十胜长叶。
4.如权利要求2所述的一组大豆数量性状QTL位点的筛选方法，其特征在于，筛选大豆分枝数的QTL位点时，所述亲本为KN24和KF19。
5.如权利要求2所述的一组大豆数量性状QTL位点的筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述构建遗传群体，包括F2及其衍生的F3、F4家系、回交群体的暂时性群体和重组自交系、由DH或RIL创造的永久F2、近等基因系的永久性群体。
6.如权利要求2所述的一组大豆数量性状QTL位点的筛选方法，其特征在于，所述步骤(6)的具体操作为：
(61)设定QTL的显著性水平为0.05，利用分析软件进行模拟运算，得出LOD的阈值；当某一位点的LOD值大于阈值时，则存在一个显著QTL位点；
(62)同时采用区间作图法和完备区间作图法进行QTL定位，并估算QTL位置、加性效应、对表型变异的加性贡献率，及存在的QTL定位区间。
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