CN112980996A - 与花生出仁率主效QTL位点qSPA07.1和qSPA08.2连锁的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子标记技术领域,具体涉及与花生出仁率主效QTL位点qSPA07.1和qSPA08.2连锁的分子标记及应用。本发明的与花生出仁率主效QTL位点连锁的分子标记为A07.Indel或A08.Indel;分子标记A07.Indel与QTL位点qSPA07.1连锁,所述分子标记A07.Indel能够通过如SEQ ID NO.1‑2所示的引物对扩增得到;分子标记A08.Indel与QTL位点qSPA08.2连锁,所述分子标记A08.Indel能够通过如SEQ ID NO.3‑4所示的引物对扩增得到。采用本发明的分子标记能够在花生育种中辅助选择高出仁率的材料,有利于提高高出仁率品种的选育效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域,具体涉及与花生出仁率主效QTL位点连锁的分子标记及其应用。
背景技术
花生(Arachis hypogea L.)是世界范围内重要的油料作物和经济作物,是重要的食用植物油脂和蛋白质来源。花生种子富含油脂、蛋白质、维生素和其他优异的矿质元素,除了鲜食外还可以加工为食用油、花生酱、坚果、点心等。出仁率是花生籽仁重量占荚果重量的百分比,是影响花生产量的重要因素。因此提高出仁率是花生生产上重要的育种目标之一。如何快速、准确选育高出仁率的花生品种是花生遗传改良研究的重要方向。
常见花生核心种质中出仁率表型变异在59.9%-81%之间,具有较大的遗传改良潜力。出仁率与大多数重要的产量性状一样是数量性状,容易受到环境的影响。因此常规育种直接对材料出仁率表型的选择往往效率不高,周期长。
QTL分析是通过对样本的表型结果和分子标记基因型进行连锁分析,在高密度遗传连锁图谱上定位控制某一性状的多个位点,从而将复杂的数量性状进行分解为控制数量性状的多个基因。随着测序成本的降低,可以通过重测序、简化基因组测序等开发全基因组高密度的分子标记,以此构建高密度的遗传连锁图谱,结合表型数据,利用连锁分析方法可以在基因组上精细定位到多个控制目标农艺性状的QTL位点。通过与QTL紧密连锁的分子标记对目标表型性状进行选择,可以提高目标性状的育种效率。
目前检测到的花生出仁率的QTL数目相对较少,效应值偏低,在不同环境表达的稳定性未知,在花生育种中应用有限。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,目的在于提供两个稳定的花生出仁率主效 QTL位点及其连锁的标记,用于高出仁率的花生材料的分子标记辅助选择。
具体地,本发明提供如下技术方案:
第一方面,本发明提供与花生出仁率主效QTL位点连锁的分子标记,所述分子标记为A07.Indel或A08.Indel;
分子标记A07.Indel与QTL位点qSPA07.1连锁,所述分子标记A07.Indel能够通过如SEQ ID NO.1-2所示的引物对扩增得到;
分子标记A08.Indel与QTL位点qSPA08.2连锁,所述分子标记A08.Indel能够通过如SEQ ID NO.3-4所示的引物对扩增得到。
第二方面,本发明提供与花生出仁率主效QTL位点连锁的分子标记组合,所述分子标记组合包括A07.Indel和A08.Indel,分子标记A07.Indel和分子标记 A08.Indel如上所述。
第三方面,本发明提供用于扩增上述分子标记或分子标记组合的引物。
所述引物包括如SEQ ID NO.1-2和/或SEQ ID NO.3-4所示的序列。
第四方面,本发明提供含有上述引物的试剂或试剂盒。
第五方面,本发明提供上述分子标记或分子标记组合或引物或试剂或试剂盒的以下任一应用:
(1)在鉴定花生出仁率性状表型中的应用;
(2)在花生种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用;
(3)在花生出仁率性状早期预测中的应用;
(4)在筛选或创制花生出仁率性状不同的花生中的应用;
(5)在花生出仁率基因分型中的应用。
第六方面,本发明提供鉴定花生出仁率性状表型的方法,包括:
(1)提取待鉴定花生的DNA;
(2)以DNA为模板,利用SEQ ID NO.1-2或SEQ ID NO.3-4所示引物进行PCR扩增;
(3)根据PCR扩增产物中DNA片段的大小判断待鉴定花生出仁率性状表型。
步骤(3)中判断待鉴定花生出仁率性状表型的方法如下:
当利用SEQ ID NO.1-2所示引物进行PCR扩增后,产物中DNA片段的大小为297bp时,判断待鉴定花生具有高出仁率;
当利用SEQ ID NO.3-4所示引物进行PCR扩增后,产物中DNA片段的大小为377bp时,判断待鉴定花生具有高出仁率。
第七方面,本发明提供另一种鉴定花生出仁率性状表型的方法,包括:
(1)提取待鉴定花生的DNA;
(2)以DNA为模板,分别利用SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示引物进行PCR扩增;
(3)根据PCR扩增产物中DNA片段的大小判断待鉴定花生出仁率性状表型。
步骤(3)中判断待鉴定花生出仁率性状表型的方法如下:
当利用SEQ ID NO.1-2所示引物进行PCR扩增后,产物中DNA片段的大小为297bp,且当利用SEQ ID NO.3-4所示引物进行PCR扩增后,产物中DNA 片段的大小为377bp时,判断待鉴定花生具有高出仁率。
本发明的有益效果在于:
本发明获得的与花生出仁率主效QTL位点qSPA07.1和qSPA08.2连锁标记能够在花生育种中辅助选择高出仁率的材料,有利于提高高出仁率品种的选育效率。
附图说明
图1为本发明中花生出仁率主效QTL位点qSPA07.1在染色体A07的定位和该 QTL在多地多年间检测到的置信区间。
图2为本发明中花生出仁率主效QTL位点qSPA08.2在染色体A08的定位和该 QTL在多地多年间检测到的置信区间。
图3为74份花生资源材料出仁率的统计结果;其中,A为在QTL位点qSPA07.1 的不同基因型出仁率统计结果,B为在QTL位点qSPA08.2的不同基因型出仁率统计结果,C为在QTL位点qSPA07.1和qSPA08.2的不同基因型出仁率统计结果。** 代表在0.01水平上的极显著差异(t检验),*代表在0.05水平上的显著差异(t检验)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的,并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下,可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
以徐花13为母本,中花6号为父本进行杂交并通过单粒传法构建重组自交系群体F5(2014年)代,F6(2015年)代和F7(2016年)代。
取亲本和重组自交系F6代群体186份样本嫩叶,用天根公司基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。采用双酶切(EcoRI和MseI)RAD构建文库,文库质检合格后上机测序,测序平台为Hiseq4000,测序类型为PE101。对下机的原始数据进行数据质控得到高质量的cleandata后,利用cstack对两亲本的所有loci进行聚类,获得所有可能位点的Catalog;利用sstack将每个个体比对至两个亲本形成的 Catalog上,确定每个个体在每个loci的单体型。对获得的marker按照缺失率小于 90%进行过滤,过滤后获得7868个marker。再利用Probabilistic PCA(PP)方法对获得的7868个标记中获得的标记进行填补,填补后的数据按照缺失率0.5进行过滤,得到7858个marker。将这些标记与野生花生的AA和BB基因组进行blast比对(期望值设为1e-10)进行分群,经过滤筛选后,最终获得分布在20个群上6405个标记进行遗传图谱的构建。过滤掉连锁群上太过密集、严重偏分离或杂合率很高的标记后,采用Joinmap4.0软件的回归算法(Regressionmapping),构图函数选为“Haldane's”,对每个连锁群进行遗传距离的计算并作图。该遗传图谱共含有 2,595个遗传标记,覆盖花生基因组总长2465.62cM,标记间的平均遗传距离为 0.95cM。
分别在2016年黄冈市农业科学院实验基地(HG2016)和2014-2016年中国农业科学院油料作物研究所武汉实验基地(WH2014、WH2015、WH2016)种植双亲和RIL群体186个株系。采用完全随机区组实验设计三次重复,每次重复每个株系种植1行12个单株,株距20厘米,行距30厘米。采取标准的田间管理方式,收获生长正常的8个单株成熟的荚果,统计出仁率(种子重量÷荚果重量×100%)。
结合基因型数据和四个环境的表型数据,采用Windows QTL Cartographer 2.5软件的复合区间作图法开展出仁率的连锁分析。分别在A07和A08染色体上鉴定获得主效QTL位点qSPA07.1和qSPA08.2。QTL位点qSPA07.1四个环境的LOD值分别为9.12、5.07、8.94、7.54,表型解释率分别为16.04%、7.88%、13.34%、10.98%,其加性等位位点来源于父本中花6号,该QTL比对到物理区间为A07的 0.12-0.85Mb(见图1)。QTL位点qSPA08.2四个环境的LOD值分别为6.54、7.42、 5.14、3.87,表型解释率分别为10.02%、10.80%、7.30%、5.22%,其加性等位位点来源于母本徐花13,该QTL比对到物理区间为A08的26.46-32.93Mb(见图2)。
通过对双亲基因组重测序获得亲本间SNP和Indel变异数据,根据QTL所在的物理区间分别设计与qSPA07.1紧密连锁的Indel标记A07.Indel(正向引物序列: 5’-TTCACCAACAGGCAAAGAAAGTG-3’,SEQ ID NO.1;反向引物序列:5’-CCCAAAATAACTATGGTCTCTCAGG-3’,SEQ ID NO.2;母本带型片段297bp,父本带型片段313bp),与qSPA08.2紧密连锁的Indel标记A08.Indel正向引物序列: 5’-TGAGAGTTTCTCCCAATTTAGCTTT-3’,SEQ ID NO.3;反向引物序列: 5’-AATAGTGTGTTCATCACTCGTCCGT-3’,SEQ ID NO.4;母本带型片段369bp,父本带型片段377bp)。利用上述两个与出仁率主效位点紧密连锁的分子标记 A07.Indel和A08.Indel引物对,对74份花生资源材料进行PCR扩增。
PCR扩增条件为:94℃预变性3min;94℃变性30s,65℃复性30s、每个循环降低1℃,72℃延伸45s,共10个循环;94℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸45s,共30个循环;最后72℃延伸10min,4℃保温。
具体材料名称与结果参见表1。
标记A07.Indel引物对扩增出与母本徐花13相同带型(DNA片段的大小为 297bp)记为AA(优异等位位点),扩增出父本中花6号相同带型(DNA片段的大小为313bp)记为aa,其中21份材料具有优异等位位点AA,53份材料具有等位位点aa。分析这些材料2016年和2017年武汉实验基地(WH2016、WH2017)出仁率表型数据发现,AA基因型材料的出仁率平均为2016年武汉77.06±2.73%、 2017年武汉74.68±3.13%,aa基因型材料的出仁率平均为2016年武汉74.07±3.52%、 2017年武汉71.79±4.05%(图3中的A,表1)。两年数据显示具有qSPA07.1优异等位位点能够提高的出仁率分别为2.99%和2.89%。
标记A08.Indel扩增出与母本徐花13相同带型(DNA片段的大小为369bp)记为BB,与父本中花6号相同带型(DNA片段的大小为377bp)记为bb(优异等位位点),其中47份材料具有等位位点BB,27份材料具有优异等位位点bb。分析这些材料出仁率的表型数据发现,BB基因型材料的出仁率平均为2016年武汉73.98±3.60%,2017年武汉71.72±4.13%,bb基因型材料的出仁率平均为2016年武汉76.54±2.92%,2017年武汉74.16±3.32%(图3中的B,表1)。两年数据显示具有qSPA08.2优异等位位点能够提高的出仁率分别为2.56%和2.44%。
同时具有两个优异等位位点AAbb的材料21份,均为非优异等位位点 aaBB的材料43份。分析这些材料出仁率的表型数据发现,AAbb基因型材料的出仁率平均为2016年武汉76.89±2.88%,2017年武汉74.32±3.14%,aaBB 基因型材料的出仁率平均为2016年武汉73.63±3.52%,2017年71.30±3.99%(图 3中的C,表1)。两年数据显示具有双优异等位位点能够提高的出仁率分别为 3.26%和3.02%。
以上结果说明使用出仁率主效位点qSPA07.1和qSPA08.2紧密连锁的标记A07.Indel和A08.Indel可以有效的选择高出仁率的花生材料。
表1花生材料出仁率表型和基因型
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 与花生出仁率主效QTL位点qSPA07.1和qSPA08.2连锁的分子标记及应用
<130> KHP211112282.0
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttcaccaaca ggcaaagaaa gtg 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccaaaataa ctatggtctc tcagg 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgagagtttc tcccaattta gcttt 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatagtgtgt tcatcactcg tccgt 25
Claims (10)
1.与花生出仁率主效QTL位点连锁的分子标记,其特征在于,所述分子标记为A07.Indel或A08.Indel;
分子标记A07.Indel与QTL位点qSPA07.1连锁,所述分子标记A07.Indel能够通过如SEQID NO.1-2所示的引物对扩增得到;
分子标记A08.Indel与QTL位点qSPA08.2连锁,所述分子标记A08.Indel能够通过如SEQID NO.3-4所示的引物对扩增得到。
2.与花生出仁率主效QTL位点连锁的分子标记组合,其特征在于,所述分子标记组合包括A07.Indel和A08.Indel,分子标记A07.Indel和分子标记A08.Indel如权利要求1中所述。
3.用于扩增权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的分子标记组合的引物。
4.根据权利要求3所述的引物,其特征在于,包括如SEQ ID NO.1-2和/或SEQ ID NO.3-4所示的序列。
5.含有权利要求3或4所述的引物的试剂或试剂盒。
6.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的分子标记组合或权利要求3或4所述的引物或权利要求5所述的试剂或试剂盒的以下任一应用:
(1)在鉴定花生出仁率性状表型中的应用;
(2)在花生种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用;
(3)在花生出仁率性状早期预测中的应用;
(4)在筛选或创制花生出仁率性状不同的花生中的应用;
(5)在花生出仁率基因分型中的应用。
7.鉴定花生出仁率性状表型的方法,其特征在于,包括:
(1)提取待鉴定花生的DNA;
(2)以DNA为模板,利用SEQ ID NO.1-2或SEQ ID NO.3-4所示引物进行PCR扩增;
(3)根据PCR扩增产物中DNA片段的大小判断待鉴定花生出仁率性状表型。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤(3)中判断待鉴定花生出仁率性状表型的方法如下:
当利用SEQ ID NO.1-2所示引物进行PCR扩增后,产物中DNA片段的大小为297bp时,判断待鉴定花生具有高出仁率;
当利用SEQ ID NO.3-4所示引物进行PCR扩增后,产物中DNA片段的大小为377bp时,判断待鉴定花生具有高出仁率。
9.鉴定花生出仁率性状表型的方法,其特征在于,包括:
(1)提取待鉴定花生的DNA;
(2)以DNA为模板,分别利用SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示引物进行PCR扩增;
(3)根据PCR扩增产物中DNA片段的大小判断待鉴定花生出仁率性状表型。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,步骤(3)中判断待鉴定花生出仁率性状表型的方法如下:
当利用SEQ ID NO.1-2所示引物进行PCR扩增后,产物中DNA片段的大小为297bp,且当利用SEQ ID NO.3-4所示引物进行PCR扩增后,产物中DNA片段的大小为377bp时,判断待鉴定花生具有高出仁率。
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CN113308564A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-08-27 | 山东省农业科学院 | 一种与花生深红色种皮紧密连锁的分子标记AhyRscc及其应用 |
CN113308564B (zh) * | 2021-06-30 | 2022-04-29 | 山东省农业科学院 | 一种与花生深红色种皮紧密连锁的分子标记AhyRscc及其应用 |
CN113584204A (zh) * | 2021-07-23 | 2021-11-02 | 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 | 与油茶种子出仁率相关的dna片段、其紧密连锁的snp分子标记及其应用 |
CN113684299A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-11-23 | 中国热带农业科学院湛江实验站 | 一种基于花生基因组的InDel标记、引物组合和应用 |
CN113684299B (zh) * | 2021-08-20 | 2024-02-06 | 中国热带农业科学院湛江实验站 | 一种基于花生基因组的InDel标记、引物组合和应用 |
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