CN102010464B - 水稻磷吸收转运调控基因OsPHF1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻磷吸收转运调控基因OsPHF1编码的蛋白质，其为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了编码上述蛋白质的基因OsPHF1，其包含cDNA序列和启动子序列，cDNA序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，启动子序列为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。本发明还同时公开了基因OsPHF1的用途：用于构建转基因水稻。经转基因实验及植物组织有效磷浓度测定实验鉴定，该基因调控水稻对磷的吸收和转运。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种用图位克隆技术克隆的水稻OsPHF1基因的cDNA序列，该cDNA编码的蛋白属于结构上与Sec12类似的伴侣蛋白，经转基因实验及植物组织有效磷浓度测定实验鉴定，该基因调控水稻对磷的吸收和转运。
背景技术
磷是植物体内核酸、磷脂和ATP的重要组成成分，其作为植物体内能量转移的物质，能够活化体内蛋白质、调控植物体的整个代谢过程(Marschner，1995)。在植物所需多种无机营养之中，磷作为最重要的元素之一，却极难从土壤中获取。尽管生态系统中磷含量丰富，但是可被植物同化吸收的磷的化学形式却主要是无机磷-磷酸盐(Pi)。土壤中磷酸盐分布极不均衡，而且大多数磷酸盐都无法自由移动，因而不利于根系的吸收(Raghothama，1999)。因此，土壤有效磷的供应状况和植物对磷素营养的吸收能力便成为植物生长发育的主要决定因素之一(Schachtman D R.et al，1998)。
地球上的磷矿作为一种不可再生资源在人类不断的开采利用下正逐渐减少。美国地质勘探的数据显示，2008年全球磷酸盐开采总量为一亿六千万吨，而化肥的需求量在未来五年内将以每年2.5-3％的速率增长。长此以往，世界磷矿资源只能再支撑人类需求125年左右(Natasha Gilbert，2009)。同时，过度施用的磷也会对环境造成巨大的危害；因此，改善作物对磷素的吸收和利用对生态和经济都具有重要意义。
影响植物获取磷的两个关键因子是土壤中根际磷的有效性和植物根系获取有效磷的能力。由于土壤中的有效磷含量很低，植物在生理生化代谢和根系形态等方面进行自身调节来提高对磷素的吸收能力。通过改变根系形态结构和增强分泌物质提高的土壤生物有效态磷，最终需要通过植物根系高效的吸收和转运系统——高亲和磷酸盐转运体(PTs)来直接吸收利用(Marschner，1995；Raghothama，1999)。
植物对磷的吸收是一个由磷酸盐转运蛋白介导的跨质膜的转运过程。在大部分植物中，磷吸收系统分为低亲和力系统(low-affinity phosphate transporter system，Km值在mmol/L范围内)和高亲和力系统(high-affinity phosphate transporter system，Km≈1.8～9.9μmol/L)两大类(Muchhal U S et al.，1996)。高亲和力磷酸盐转运蛋白主要负责通过根表皮细胞质膜从根围吸收磷，而低亲和力磷酸盐转运蛋白负责植物体内磷元素的传导(Rae A L et al.，2003)。
绝大部分已经克隆出来的植物磷转运蛋白基因于H2PO4 -/nH+共运体的Pht1小家族都属于高亲和力的磷转运蛋白基因，即利用质膜上的氢离子浓度梯度来驱动植物对磷素的吸收(Raghothama K G.，2000)，这一家族的基因负责对磷的吸收和体内转运的基本过程。根据基因序列相似性和转录分析，推断拟南芥和水稻整个基因组可能分别含有9个和11个Pht1家族的成员，用于从土壤溶液中(包括水稻的菌根菌丝体)吸收磷以及植物体内磷的转运(Goff et al.，2002；Mudge S R et al.，2002)。这些Pht1家族的磷酸盐转运蛋白基因主要是存在细胞质膜上(Chiou et al.，2001；Shin et al.，2004)。
低磷对编码磷转运蛋白基因的激活可能是植物对磷吸收的重要调控机制，磷素缺乏会使其根部转运蛋白的丰度增加，并且发现该蛋白的表达水平和外界磷素供应是呈显著相关的(Karthikeyan et al.，2002；Mudge et al.，2002)。此外，对于磷转运蛋白基因的活性来说，其转录后的调控无疑是潜在的关键点。其中之一就是磷酸盐转运体在通过分泌途径向质膜运输的过程中存在的调控作用。多项研究均表明，生物中蛋白分泌迁移的第一个也是最重要的步骤便是蛋白由内质网输出到高尔基体的过程。这一关键步骤是由COPII囊泡调节的(Barlowe，2003)。COPII的形成是由SAR1GTPase启动的，SAR1GTPase经SEC12鸟苷酸置换因子活化后，可推动COPII囊泡包被的形成以及选择输出底物(Barlowe andSchekman，1993；Barlowe，2003)。研究发现，编码拟南芥中的磷酸盐转运体运输协助因子(PHF1)是一个植物特有的与SEC12类似的蛋白，编码该蛋白的基因突变后显著降低了植株对磷酸盐的吸收。该基因受缺磷诱导，且参与调控了拟南芥中的磷酸盐转运体AtPht1；1从内质网上膜的运输过程(Gonzalez，et al.，2005)。
关于水稻参与该途径的相关基因及调控机制目前还未见相关报道。
文中所用的参考文献具体如下：
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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种水稻磷吸收转运调控基因OsPHF1及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻磷吸收转运调控基因OsPHF1编码的蛋白质，为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
作为本发明的水稻磷吸收转运调控基因OsPHF1编码的蛋白质的改进：还包括在SEQID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
本发明还同时提供了编码上述蛋白质的基因OsPHF1，包含cDNA序列和启动子序列，cDNA序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，启动子序列为SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列。
作为本发明的基因OsPHF1的改进：还包括在SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
本发明还同时提供了上述基因OsPHF1的用途：用于构建转基因水稻。
本发明还同时提供了一种转基因植物细胞，为包含SEQ ID NO：1所示的cDNA序列或SEQ ID NO：3所示的启动子序列的转基因植物细胞。
本发明所述的蛋白是一个结构上与SEC12类似的伴侣蛋白。
本发明的目的是提供一种从水稻磷吸收突变体Osphf1中克隆的新基因OsPHF1，如SEQ ID NO：1所示的cDNA序列以及SEQ ID NO：3所示的启动子序列，也包括与SEQ IDNO：1所示的cDNA序列及SEQ ID NO：3所示的启动子序列至少有80％同源性的基因序列。本发明中SEQ ID NO：2所示的蛋白质与SEC12类似，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。
本发明的另一个目的是提供一种用OsPHF1基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID NO：1所示的序列的基因片段的载体。
本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞提高水稻叶片有效磷浓度的方法。
本发明的具体内容如下：
从本实验室发展的EMS(ethyl methylsulfonate)诱变的OsPHR2超表达材料(Oryzasativa Nipponbare)突变体库中筛选到一个水稻叶片有效磷浓度极低的突变体Osphf1，该突变体是一个符合单基因控制的遗传规律的隐性突变体(图1)。
为了分离OsPHF1基因，本发明采用基因图位克隆方法。首先创建了一个F2定位群体，由Osphf1突变体为母本，野生型籼稻Kasalath为父本杂交获得的F2中的隐性个体组成。利用来源于Gramene(http://www.gramene.org/)网站提供的已经公知的SSR(SimpleSequence Repeats)标记对OsPHF1位点进行初步定位。定位结果表明，OsPHF1初步定位在第7染色体短臂介于STS07g404W(M1)和RM125(M2)两个标记之间。通过对两个标记之间的BAC序列分析，发展新的STS(Sequence Tagged Site)标记将Osphf1精确定位于BAC P0506C07和OSJNBb0084L07交界处STS07g479W(M3)标记附近(图2A)，根据水稻基因注释信息，该标记附近有一个具有WD40结构域的基因与拟南芥中AtPHF1同源。突变体和野生型的该基因的基因组测序结果表明三个等位突变体中，Osphf1-1和Osphf1-3分别在基因cDNA序列的980bp和990bp处产生点突变，使一个编码酪氨酸的密码子突变成终止密码子，从而导致该蛋白质的跨膜结构域无法表达而造成蛋白质失去功能。Osphf1-2则是在基因cDNA序列的653bp处产生点突变，使亮氨酸突变成脯氨酸。
为了进一步证明突变体突变表型是由OsPHF1的突变引起的。我们对突变体进行了转基因回复验证。将由35S强启动子启动的完整的OsPHF1的cDNA序列(SEQ ID NO.1)克隆到双元植物转基因载体pCAMBIA1300改中。将构建好的回复载体通过农杆菌介导转化突变体的愈伤，进而分化成转基因苗。测定T0代转基因苗的叶片有效磷浓度的结果表明，转化了正常OsPHF1基因的突变体的叶片有效磷浓度回复到高于Nipponbare野生型的水平(图3A)。抽提Nipponbare野生型和五个回复表型明显的转基因株系的叶片的RNA，逆转录成cDNA。定量qRT-PCR结果表明，磷得到增加的转基因阳性植株的确超表达了OsPHF1基因(图3B)。上述结果证明了该突变体的确是由于OsPHF1的突变引起的，表明本发明获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻。
由这些结果表明，我们克隆的水稻OsPHF1基因具有一定的应用价值。我们可以通过利用该基因对作物品种进行转基因改造，如通过外源导入超表达OsPHF1基因来提高作物吸收磷养分的能力，从而提高作物产量。
附图说明
下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对发明作限定。
图1是水稻磷吸收突变体Osphf1的表型：
在三种不同磷含量的水培液中，突变体(phf1-1)及野生型(Nipponbare)、OsPHR2超表达转基因植株(OsPHR2over)的叶片有效磷浓度。
图2是OsPHF1基因在水稻第7染色体上的定位图及与其他同源基因的进化关系；
A、OsPHF1的精细定位结果及基因结构；B、OsPHF1与植物中其他相关蛋白的进化树分析；
图3是突变体中OsPHF1基因的功能互补验证图；
A.超表达实验的转基因水稻的叶片有效磷浓度；B阳性株系的qRT-PCR检测；
图4是野生型水稻中OsPHF1基因的功能验证实验图；
A.超表达实验的转基因日本晴的叶片有效磷浓度；B.超表达实验的转基因明恢63的叶片有效磷浓度；
图5是超表达转化载体pCAMBIA1300改的结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
实施例1、突变体的筛选和表型
对OsPHR2超表达材料(Oryza sativa Nipponbare，可购自浙江大学)的单拷贝纯合株系大量繁种，经浓度为1％(体积浓度)的EMS(甲磺酸乙酯)在室温浸泡12小时后，在海南大量繁种。将突变体自交两代后的种子(M2)建成突变体库，作为突变体筛选对象。M2种子用蒸馏水冲洗干净，用0.6％(体积浓度)的稀HNO3破休眠处理16hr，37℃暗处催芽至露白。将露白的种子播于砷酸钠浓度为50μM的水稻培养液(培养液配方为国际水稻所标准配方)上浮着的尼龙网纱上面，在温度为30℃/22℃(昼/夜)左右、光照12小时条件下，培养7天，以主根长度的改变为筛选标准进行突变体的筛选，从中筛选到三个主根明显长于被砷毒害的野生型根长的突变体株系。这些突变体株系的地上部(包括株高等)与野生型之间都没有显著性差异。为了进一步观察突变体与野生型对磷吸收的差异，我们利用植物组织有效磷测定及养分流动分析仪技术对野生型和突变体的叶片有效磷浓度进行了详细的研究。筛出的苗与野生型于清水中放置一天后(稀释根上残留的砷酸钠)，于水稻完全培养液(培养液配方为国际水稻所标准配方)中培养，水稻完全培养液每隔两星期换一次，每3天调PH至5.2-5.6。培养20天后，从筛出的三个突变体株系其中之一的突变体株系与野生型取相同的叶片测定有效磷含量(一般取生长最好的地上部分，即水稻的倒一叶)，取样后立即称取鲜重。有效磷(磷酸盐)的测定按照公知方法进行(Nanamoriet al.，2004)。用1mL 10％(体积浓度)的高氯酸溶液匀浆样品，研钵和研棒必须提前预冷。匀浆用5％(体积浓度)的高氯酸溶液10倍稀释并于冰上静置30分钟。4℃，10000g离心十分钟，上清用于钼蓝法测定：按照4克/升(质量浓度)将钼酸铵溶于0.5M H2SO4配制成溶液A，将溶液A与溶液B，即10％(体积浓度)的抗坏血酸，按6∶1的体积比例混合成反应液。向每毫升样品中加入两毫升该反应液，42℃水浴20分钟。冰上冷却后，于700nm波长处测定吸收光值。磷浓度参照鲜重为标准进行计算。
结果如图1所示。根据该结果说明：利用砷酸钠筛选体系筛选出来的水稻EMS突变体对砷酸钠毒害不敏感，且地上部分的有效磷浓度仅为野生型的五分之一到十分之一，其对磷吸收与野生型存在差异。被选择测定了地上部分有效磷浓度的那个突变体株系，因为其表型和生理特征与拟南芥中磷酸盐转运体运输协助因子1编码基因(AtPHF1)突变以后的植株极其相似，故将其命名为Osphf1-1。
实施例2、基因定位
F2定位群体是由纯合体(Osphf1-1)和籼稻Kasalath杂交获得的，总共鉴定出28个叶片有效磷浓度为野生型五分之一到十分之一的F2个体，有效磷(磷酸盐)的测定按照公知方法进行(Nanamori et al.，2004)。采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约0.1g水稻幼嫩叶片，经液氮冷冻，在1.5ml的离心管中将叶片磨成粉末，提取总DNA，获得的DNA溶解于200μl无菌水中。每个SSR和STS反应用2μl DNA样品。
在OsPHF1基因的初步定位试验中，对28个F2个体进行SSR分析。根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，SSR标记来源于Gramene(http://www.gramene.org/)网站提供的已经公知的标记。
水稻1号染色体
RM1282，RM1167，RM272，RM243，RM600，RM3412，RM8115，RM329，RM5638，RM6716，RM1349，RM1297，RM3411，RM6547，RM1198，RM165，RM6141；
水稻2号染色体
RM6938，RM279，RM6378，RM174，RM5699，RM1358，RM7426，RM341，RM3688，RM6，RM425，RM5607；
水稻3号染色体
RM523，RM6038，RM1022，RM157A，RM5551，RM1164，RM6881，RM6266，RM347，RM1350，RM5813，RM143，RM148；
水稻4号染色体
RM25054，RM3471，RM2416，RM16604，RM5688，RM1100，RM1359，RM6997，RM3866，RM2441，RM348，RM567，RM3648；
水稻5号染色体
RM3334，RM267，RM3193，RM3381，RM6645，RM1237，RM3573，RM334，RM3170；
水稻6号染色体
RM170，RM190，RM584，RM276，RM50，RM3183，RM6536，RM3，RM3187，RM5371，RM7434，RM6458，RM5307，RM5814；
水稻7号染色体
RM5344，RM82，RM125，RM1186，RM3755，RM1135，RM3826，RM7564，RM3589，RM1209，RM3555；
水稻8号染色体
RM1235，RM8018，RM1376，RM310，RM6429，RM3395，RM325A，RM8264，RM556，RM334，RM3120，RM3754；
水稻9号染色体
RM5688，RM2855，RM444，RM7390，RM105，RM409，RM3700，RM257，RM328，RM6174；
水稻10号染色体
RM474，RM7545，RM25185，RM3311，RM25369，RM271，RM1108，RM5666，RM228；
水稻11号染色体
RM286，RM7557，RM1124，RM552，RM3701，RM4862，RM3428，RM6272，RM254，RM144，RM5349，RM4601，RM2191；
水稻12号染色体
RM628，RM3455，RM83，12-9528k，RM7102，RM1261，RM101，RM1246，RM1103，RM3739，RM1296。
根据以下反应条件进行PCR扩增，然后在6％的丙烯酰胺凝胶电泳分离，检测PCR产物的多态性。
PCR反应体系为10μl，DNA模板1μl，扩增循环数为35个。取2μl PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后用1克/升(质量浓度)的硝酸银对聚丙烯酰胺凝胶染色10-15分钟，取出凝胶用蒸馏水冲洗1分钟，然后在显色液中显色10分钟，最后用蒸馏水停止显色，在扫描仪下扫描凝胶图象。
PCR反应体系：
聚丙烯酰胺凝胶(6％)配方
注：40％Arc-Bis(丙烯酰胺38g和亚甲基双丙烯酰胺2g溶于100ml水)
聚丙烯酰胺凝胶显色液配方
注：甲醛是临用前现加，其他三个按相应量提前配好。
在精细定位OsPHF1基因时，由纯合体(Osphf1-1)和籼稻Kasalath杂交获得的F2个体中重新鉴定出56个叶片有效磷浓度为野生型五分之一到十分之一的，无机磷(磷酸盐)的测定按照公知方法进行(Nanamori et al.，2004)。对由这56个F2个体组成的Osphf1-1群体进行STS分析。根据分子标记RM125附近的BAC序列和公布的Kasalath BAC末端序列，我们设计了2个STS分子标记(STS07g404W，STS07g479W)，引物序列为：
STS07g404W U-5’CTGACGTCGAGATCAAATGTC 3’，
STS07g404W L-5’GTCACTGATGCGAATGGGATC 3’；
STS07g479W U-5’TTTGTCTGGGTGGGAGAGTAAGC 3’，
STS07g479W L-5’GACGGTAGTAAGAGCCACAATGC 3’；
利用这3个分子标记对56F2个体进行连锁分析。
实施例3、基因预测和序列分析
根据精细定位的结果，OsPHF1基因位于BAC克隆P0506C07和OSJNBb0084L07交界处STS07g479标记附近70kb范围之内(图2A)。根据TIGR(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osal/)的水稻基因注释信息和EST数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，对定位的染色体区段内基因预测分析，该标记附近有一个基因，其所编码的具有WD40结构域的蛋白的与拟南芥中AtPHF1同源，因此将这个基因命名为OsPHF1，OsPHF1基因的cDNA序列即为SEQ ID NO：1所示的cDNA序列。由OsPHF1基因的cDNA序列编码的氨基酸序列即为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。根据NCBI提交的水稻基因组序列信息(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，染色体上OsPHF1基因上游部分序列即为SEQ ID NO：3所示的启动子序列，对OsPHF1基因的表达具有调控作用。用Nipponbare野生型和三个突变体基因组DNA为模板对OsPHF1基因所在的染色体区段进行扩增，扩增产物分别测序，测序结果进行比对分析，发现在三个独立筛选出来的突变体株系中，有两个分别在OsPHF1基因的cDNA序列的980bp和990bp处产生点突变(OsPHF1基因的cDNA序列即为SEQ ID NO：1所示的cDNA序列)，都是使一个编码酪氨酸的密码子突变成终止密码子，从而可能导致OsPHF1基因的cDNA序列所编码的蛋白质的跨膜结构域无法表达而造成蛋白质失去功能。而三个突变体株系中的另外一个也在OsPHF1基因的cDNA序列的653bp处产生点突变，使OsPHF1基因的cDNA序列所编码的蛋白质的其中一个亮氨酸突变成脯氨酸，可能发生功能突变。按照突变体筛选出来的先后顺序，分别将这三个突变体依次编号为Osphf1-1，Osphf1-3，Osphf1-2。
结果如图2所示。由此说明：图位克隆的结果证明水稻中控制该突变体表型的基因OsPHF1所编码的蛋白质与拟南芥中磷酸盐转运体运输协助因子1(AtPHF1)在进化上极其相似，并且OsPHF1基因突变后产生的水稻突变体与Atphf1的表型及生理学特性极其相似，因而证明OsPHF1基因突变后造成蛋白功能丧失。
实施例4，突变体中OsPHF1基因的功能互补验证
根据OsPHF1基因的cDNA序列(即为SEQ ID NO：1所示的cDNA序列)，设计引物如下：F：5’GCT CTA GAA TGG CAG GCG GCG GAG GTG GCG AG’3’；R：5’CCG CTCGAG TCA CCA GGG GTT CTG GTC CTC AGG 3’。以粳稻Nipponbare的根部cDNA为模板，扩增出OsPHF1基因的编码区，与pUCm-T连接，得到的连接产物为T-OsPHF1，将该连接产物热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。测序确定序列正确后继续以下操作：
T-OsPHF1用XbaI、XhoI双酶切，连入用XbaI、XhoI双酶切的pCAMBIA1300改载体中，连接产物热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，酶切检测正确后备用。pCAMBIA1300改载体为本实验室改造的载体，该载体是以pCAMBIA-1300载体为基本骨架，将烟草花叶病毒的35S启动子亚克隆到pCAMBIA-1300载体的EcoRI、SacI的酶切位点中间。然后把花生中Rubisco E9的多聚腺苷酸的加尾序列插入到pCAMBIA-1300载体的HindIII和PstI酶切位点中间而得到的增强表达载体(图4)。将得到的正确克隆的质粒35S-OsPHF1通过农杆菌株系EHA105介导的水稻遗传转化体系导入到突变体Osphf1-1中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗移栽，得到转基因阳性植株。农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人(1994)报道的方法。
如图3A所示，从转基因植株中总共鉴定出5个叶片有效磷浓度恢复到为野生型3倍到4倍的转基因阳性植株，有效磷(磷酸盐)的测定按照公知方法进行(Nanamori et al.，2004)。
为了检测叶片有效磷得到回复的转基因阳性植株是否超表达了OsPHF1基因，采用Trizol法分别提取Nipponbare和5个转基因回复株系叶片的总RNA(所构建的回复载体为CaMV 35S组成型表达启动子，如果为转基因阳性植株，那么植株体会整体超表达OsPHF1基因)，逆转录成cDNA，并以定量PCR反应测定转基因植株表达丰度。
试剂及qRT-PCR体系和程序：
Master为TakaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM。
反应体系(5μl)
2×Master： 2.5μl
cDNA模板： 0.1μl(cDNA模板可根据具体实验要求进行调整。)
Primer-Up(10μM)： 0.1μl
Primer-Low(10μM)：0.1μl
H2O： 2.2ul
Total： 5ul
定量PCR反应仪器为Roche LightCycle480定量PCR仪。
PCR程序
initial： 95℃ 1min
Melting curve：95℃ 5sec
65℃ 1min
97℃ Continuous.Acquisition(per℃)
Cooling： 40℃ 30sec
用参照基因(如Actin或GAPDH)作为标准进行相对定量，优点是能准确量化初始材料的载量，缺点是这个方法要求得到一个或多个在所有测试样本中恒定表达的已知参照基因。用相对定量比较多个样本，样本之一常被选为参照。在其它所有样本中目的基因的表达都相对于参照上调或下调，通常用未处理的或基准样本作为参照样本，一般选择野生型样本。
进行相对基因表达分析普遍采取2-ΔΔCT法，条件是目的基因和参照基因扩增效率都接近100％且相互效率偏差在5％以内。
如图3B所示，定量PCR反应结果显示经过叶片有效磷浓度测定的五个转基因阳性株系均超表达了OsPHF1基因，其表达量均为野生型对照的十倍以上。
结果证明，向突变体愈伤中转入OsPHF1基因的超表达载体确实可以回复突变体叶片有效磷浓度降低的表型，并且通过定量PCR反应验证，表型得到回复的转基因阳性株系，植株体内的OsPHF1基因的表达丰度得到大幅度提高。
同时如图3数据所示，通过对突变体、野生型、以及OsPHF1基因的超表达载体的转基因阳性株系的叶片有效磷分析，发现将本发明的基因OsPHF1导入水稻，从而使所构建的转基因水稻的有效磷吸收和转运功能获得显著提高。
实施例5、野生型水稻中OsPHF1基因的功能验证
将得到的正确克隆的35S-OsPHF1质粒(见实施例4)通过农杆菌株系EHA105介导的水稻遗传转化体系导入到野生型水稻日本晴(Nipponbare)和栽培品种明恢63(Indica)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗移栽，得到转基因阳性植株。农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人(1994)报道的方法。
如图4数据所示，对野生型日本晴(Nipponbare)和明恢63(MH63)材料以及OsPHF1基因的超表达载体的转基因阳性株系的叶片进行有效磷分析，有效磷(磷酸盐)的测定按照公知方法进行(Nanamori et al.，2004)。发现将本发明的基因OsPHF1导入水稻，从而使所构建的转基因阳性水稻植株的叶片有效磷浓度明显提高，证明水稻有效磷吸收和转运功能获得显著提高。
结果证明OsPHF1基因对于提高水稻有效磷吸收和转运有显著功效。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (1)
1.水稻磷吸收转运调控基因OsPHF1的用途，其特征是：用于构建转基因水稻；所述转基因水稻具有磷吸收转运调控功能；所述磷吸收转运调控功能包括上调功能和下调功能；所述基因OsPHF1包含cDNA序列和启动子序列，所述cDNA序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，启动子序列为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；所述基因OsPHF1编码的蛋白质序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
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