CN103289972B - 一种稻类长粒相关基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种稻类长粒相关基因及其应用。具体地，本发明人通过对大量的稻类数量性状位点的研究，首次揭示了一种水稻长粒相关基因GL3，所述基因编码丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。长/大粒亲本中的GL3蛋白与小粒亲本的GL3蛋白相比，存在氨基酸的突变，这导致长/大粒亲本中GL3蛋白磷酸酶活性下降。本发明还涉及酶活性下降的GL3突变蛋白及其编码序列，及其在改造作物，从而增加粒长和作物增产等方面的应用。

Description

一种稻类长粒相关基因及其应用

技术领域

本发明涉及农学领域，具体地，本发明涉及一种稻类长粒相关基因及其应用。

背景技术

粮食问题是一个世界范围内的问题，随着人口的迅速增加和可用耕地面积的日益减少，尽快提高粮食产量已成为各国的重要战略措施。水稻(Oryzasativa)是亚洲人群的主要粮食品种和经济作物，水稻产量的提高对解决粮食问题具有重要意义。

水稻的产量主要由三个因素决定：粒重，每穗粒数和穗数。这些性状大都是数量性状，而控制这些性状的基因主要是数量性状位点(QTL)。因此鉴定并了解这些基因的功能对育种和解释产量形成机制都有重要的意义。由于产量性状是由多个数量性状位点控制的，因此本领域目前对有大量的相关基因未被克隆。即使近年来应用分子标记技术定位了一些数量性状位点，但是成功克隆和深入研究的基因还非常少。

目前本领域稻类长粒相关基因的克隆和研究至今还没有获得突破。因此本领域迫切需要开展相关基因的定位和功能研究，以便应用于作物高产分子育种。

发明内容

本发明的目的就是提供一种稻类长粒相关基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的多肽，所述多肽具有丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性，所述多肽选自下组：

(1)具有SEQ ID NO.：2所示氨基酸序列的多肽；

(2)将如SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的由(1)衍生的多肽；或

(3)氨基酸序列与SEQ ID NO.：2所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地98％)由(1)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的多肽选自下组：

(A)将如SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、与SEQ ID NO.：2所示的多肽相比具有下降的磷酸酶活性的由(1)衍生的多肽；或

(B)氨基酸序列与SEQ ID NO.：2所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地98％)、与SEQ ID NO.：2所示的多肽相比具有下降的磷酸酶活性的由(1)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述下降的磷酸酶活性是指，与SEQ ID NO.：2所示的多肽相比，所述的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的活性下降幅度≥10％，较佳地≥40％，更佳地≥50％，更佳的≥70％，更佳的≥80％，更佳的≥90％，最佳地≥100％

在另一优选例中，所述的多肽是将SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列的第364位，和/或第499位氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、与SEQ IDNO.：2所示的多肽相比具有下降的磷酸酶活性的由(1)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述多肽选自下组：

具有SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：6、或SEQ ID NO.：8所示氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，具有SEQ ID NO.：4所示氨基酸序列的多肽是将SEQ IDNO.：2所示氨基酸序列的364位由天冬氨酸变为谷氨酸、以及499位由组氨酸变为酪氨酸而形成的。

在另一优选例中，具有SEQ ID NO.：6所示氨基酸序列的多肽是将SEQ IDNO.：2所示氨基酸序列的364位由天冬氨酸变为谷氨酸而形成的。

在另一优选例中，具有SEQ ID NO.：8所示氨基酸序列的多肽是将SEQ IDNO.：2所示氨基酸序列的499位由组氨酸变为酪氨酸而形成的。

在另一优选例中，所述多肽具有促进作物籽粒增长的功能。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸自下组：

(i)编码本发明第一方面所述多肽的多核苷酸；

(ii)序列如SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：5、或SEQ ID NO.：7所示的多核苷酸；

(iii)核苷酸序列与SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：5、或SEQ IDNO.：7所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

(iv)如SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：5、或SEQ ID NO.：7所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；或

(v)与(i)-(iv)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在本发明的第三方面，提供了一种含有本发明第二方面所述多核苷酸的载体。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第三方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述多肽或其编码多核苷酸的用途，其特征在于，所述用途选自下组的一种或多种：

(a)所述多肽或其编码多核苷酸用于控制作物籽粒粒形性状；

(b)所述多肽或其编码多核苷酸用于调节细胞分裂；

(c)所述多肽或其编码多核苷酸用于调节作物粒重或/和作物产量；

(d)所述多肽或其编码多核苷酸用做鉴定作物大粒和小粒的分子标记。

在另一优选例中，所述的籽粒粒形性状选自下组：粒长、粒宽、粒厚、长宽比、长厚比等。

在本发明的第六方面，提供了一种制备转基因植物的方法，包括步骤：

将编码本发明第一方面所述多肽的多核苷酸导入植物细胞中，培养所述植物细胞，再生成植物。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有编码本发明第一方面所述多肽的多核苷酸；

(s2)将植物细胞或组织或器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使编码本发明第一方面所述多肽的多核苷酸转入植物细胞、组织或器官；

(s3)筛选转入编码本发明第一方面所述多肽的多核苷酸的植物细胞或组织或器官；和

(s4)将步骤(s3)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。

在本发明的第七方面，提供了一种制备本发明第一方面所述多肽的方法：培养本发明的第四方面所述的宿主细胞，收集获得本发明第一方面所述的多肽。

在本发明的第八方面，提供了一种改良作物性状的方法，包括步骤：

提高所述作物中本发明第一方面中的具有下降的磷酸酶活性的由SEQ IDNO.：2衍生的多肽的表达，或降低具有SEQ ID NO.：2所示氨基酸序列的多肽的表达或活性；

较佳地，所述的改良作物性状选自下组：

(a)改良作物籽粒粒形性状；

(b)改良作物细胞分裂；或

(c)改良作物粒重或/和作物产量；

更佳地，所述的籽粒粒形性状选自下组：粒长、粒宽、粒厚、长宽比、长厚比等。

在另一优选例中，通过RNAi、Anti-senseRNA、基因敲除、或基因失活等方法降低具有SEQ ID NO.：2所示氨基酸序列的多肽的表达或活性。

在本发明的第九方面，提供了一种鉴定大粒或小粒作物的方法，包括步骤：

鉴定作物样本是否具有SEQ ID NO.：2所示氨基酸序列的多肽或其编码基因；如具有SEQ ID NO.：2所示氨基酸序列的多肽或其编码基因，则为小粒作物，如具有本发明第一方面中的具有下降的磷酸酶活性的由SEQ ID NO.：2衍生的多肽或其编码基因，则为大粒作物；

优选地，所述方法包括步骤：鉴定作物样本中是否具有如SEQ ID NO.：10或SEQ IDNO.：9所示的序列。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：鉴定样本核苷酸序列的Dral限制性内切酶片段长度多态性。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(1)扩增待鉴定样本的GL3基因或基因片段；和

(2)对扩增基因或基因片段进行Dral酶切，分析Dral限制性内切酶片段长度多态性。

在另一优选例中，使用序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的引物对待鉴定样本的GL3基因进行扩增，对扩增基因或基因片段进行Dral酶切，分析Dral限制性内切酶片段长度多态性。

在另一优选例中，所述作物选自下组：水稻、高粱、玉米、大豆、蓖麻、茶树、苜蓿、番茄、二穗短柄草、葡萄、拟南芥、或藻类。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了GL3基因和分子育种位点：方块为该基因的外显子，黑色连接线为内含子，方块和连线上方数字为内含子的片段长度，方块和连线下方数字为外显子的片段长度。

图2显示了近等位基因系(含有GL3的30Kb的WY3片段、其他区域绝大部分为FAZ1片段)与小粒籼稻品种FAZ1的粒型(图2a)和粒长统计(图2b)结果，棒状基线(bar)＝2mm。

图3显示了水稻GL3-WY3、GL3-M1和GL3-M2三种转基因植株的粒型、粒长、及GL3基因的表达水平，其中，图3a显示，水稻GL3-WY3、GL3-M1和GL3-M2的正义转基因植株的谷粒明显比受体品种中花11(ZH11)大，Vector为转入空载体的种子；OE-GL3-WY3-1、OE-GL3-WY3-2、和OE-GL3-WY3-3为GL3-WY3的过表达种子；OE-GL3-M1-1、OE-GL3-M1-2、OE-GL3-M1-3为GL3-M1过表达种子；OE-GL3-M2-1、OE-GL3-M2-2、OE-GL3-M2-3为GL3-M2过表达种子，棒状基线(Bar)＝2mm；图3b为粒长量化统计数据；图3c为转基因植株中GL3基因的表达水平，均以各自的转基因空载体的内源GL3表达为1做相对定量。

图4为丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的酶活测试结果，表明GL3-FAZ1比GL3-WY3、GL3-M1和GL3-M2有更强的去磷酸化能力，GL3-WY3增加了粒长和粒重是磷酸酶酶活降低引起的。

图5为黄花占(GL3)与黄花占的粒长统计结果，黄花占(GL3)的粒长要长于黄花占，粒宽和粒厚稍有增加。

图6显示近等位基因系NIL的颖壳在发育至50％时比FAZ1的颖壳有更快的分裂速度。

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，本发明人通过对大量的稻类数量性状位点的研究，首次揭示了一种水稻长粒相关基因GL3，所述基因编码丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。长粒亲本中的GL3蛋白与小粒亲本的GL3蛋白相比，存在氨基酸的突变，这导致长粒亲本中GL3蛋白磷酸酶活性下降。本发明还涉及酶活性下降的GL3突变蛋白及其编码序列，及其在改造作物，从而增加粒长和作物增产等方面的应用。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“GL3衍生多肽”、“GL3-FAZ1衍生物、或“丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的衍生物”可以互换使用，都是指由SEQ ID NO.：2所示的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶GL3-FAZ1衍生的多肽，优选地，指与SEQ ID NO.：2所示的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶GL3-FAZ1相比，具有下降的磷酸酶活性的多肽。

所述下降的磷酸酶活性是指，与丝氨酸/苏氨酸磷酸酶GL3-FAZ1多肽相比，所述衍生多肽的磷酸酶活性下降幅度幅度≥10％，较佳地≥40％，更佳地≥50％，更佳的≥70％，更佳的≥80％，更佳的≥90％，最佳地≥100％。在本发明的一个优选例中，所述多肽来源于水稻。

在本发明中，具有SEQ ID NO.：4所示氨基酸序列的多肽与SEQ ID NO.：2所示的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶GL3-FAZ1相比，其364位由天冬氨酸变为谷氨酸，499位由组氨酸变为酪氨酸；具有SEQ ID NO.：6所示氨基酸序列的多肽与SEQ IDNO.：2所示的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶GL3-FAZ1相比，其364位由天冬氨酸变为谷氨酸；具有SEQ ID NO.：8所示氨基酸序列的多肽与SEQ ID NO.：2所示的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶GL3-FAZ1相比，其499位由组氨酸变为酪氨酸。

如本文所用，术语“长粒”、“大粒”可以互换使用。

如本文所用，术语“GL3-FAZ1蛋白”、“GL3-FAZ1多肽”、或“丝氨酸/苏氨酸磷酸酶GL3-FAZ1”可以互换使用，都是指小粒水稻FAZ1中的GL3蛋白。

如本文所用，术语“GL3-WY3蛋白”、“GL3-WY3多肽”、或“丝氨酸/苏氨酸磷酸酶GL3-WY3”可以互换使用，都是指大粒水稻WY3中的GL3蛋白。

如本文所用，术语“本发明基因”、“GL3基因”、或“本发明的长粒相关基因”、可以互换使用，都是指来源于稻类的一种编码丝氨酸苏氨酸磷酸酶的核苷酸序列及其衍生序列。在本文中，术语“GL3-FAZ1”指小粒水稻FAZ1中的GL3基因，术语“GL3-WY3”指长/大粒水稻WY3中的GL3基因。

如本文所用，术语“作物”没有特别的限制，包括(但不限于)：水稻、高粱、玉米、大豆、蓖麻、茶树、苜蓿、番茄、二穗短柄草、葡萄、拟南芥、藻类等。

如本文所用，术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明提供了一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶衍生物，在本发明的一个优选例中，所述衍生物的氨基酸序列任选自下组：SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：6、或SEQID NO.：8。“分离的GL3多肽衍生物、蛋白或多肽”是指所述的GL3衍生物、蛋白或多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的普通技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化GL3蛋白。基本上纯的多肽或蛋白在非还原聚丙烯酞胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括具有GL3蛋白活性的GL3蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然GL3蛋白相同的生物学功能或活性的多肤。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明还包括与本发明的GL3蛋白具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。在蛋白质变体可以经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。

表1

本发明包括GL3蛋白质类似物与天然GL3蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

本发明还提供了编码GL3多肽、蛋白或其变体的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ IDNO.：3、SEQ ID NO.：5、或SEQ ID NO.：7所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多苷或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酞胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

应理解，虽然本发明的GL3基因优选来自水稻，但是来自其它植物的与水稻GL3基因高度同源(如具有80％以上，如85％，90`％，95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的GL3核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还提供了一种包括本发明的基因的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

包括本发明基因、表达盒或的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

上面方法的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括(但并不限于)：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明还提供了本发明多肽或其编码多核苷酸的用途，所述用途选自下组的一种或多种：

(a)所述多肽或其编码多核苷酸用于控制作物籽粒粒形性状；

(b)所述多肽或其编码多核苷酸用于调节细胞分裂；

(c)所述多肽或其编码多核苷酸用于调节作物粒重或/和作物产量；

(d)所述多肽或其编码多核苷酸用做鉴定作物大粒和小粒的分子标记。

本领域的普通技术人员可以使用通用的方法将所述多肽或其编码多核苷酸用做鉴定作物大粒和小粒的分子标记。由于大粒和小粒作物的GL3多肽及其编码多核苷酸之间的区别，可以通过核苷酸测序、氨基酸测序或通过抗原抗体之间的特异性结合对大粒和小粒作物进行区分。

作为本发明一种优选的实施方式，可以使用通用的多肽测序方法或多核苷酸测序方法对GL3进行序列鉴定，以区分大粒和小粒作物。优选地，小粒作物的GL3多肽具有如SEQID NO.：2所示的序列；大粒品种的GL3可以是选自下组的多肽：具有SEQ ID NO.：4、SEQ IDNO.：6、或SEQ ID NO.：8所示氨基酸序列的多肽，较佳地，具有SEQ ID NO.：4所示氨基酸序列的多肽是将小粒SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的364位由天冬氨酸变为谷氨酸、以及499位由组氨酸变为酪氨酸；具有SEQ ID NO.：6所示氨基酸序列的多肽是将小粒SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的364位由天冬氨酸变为谷氨酸；具有SEQ ID NO.：8所示氨基酸序列的多肽是将小粒SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的499位由组氨酸变为酪氨酸。

在本发明的一个具体的优选例中，由于大粒、小粒作物GL3多肽的不同，可以根据抗原-抗体的特异性结合，设计抗体对作物进行大粒或小粒的鉴定。抗体的设计和抗原-抗体的结合实验是本领域普通技术人员所熟知的。

本发明还提供了一种鉴定大粒品种作物的方法，所述方法包括：鉴定大粒与小粒品种的基因组的限制性片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphism)。在本发明的一个具体实施例中，利用引物SEQ ID NO.：11和引物SEQ ID NO.：12，对作物的GL3基因(或其片段)进行扩增，并用限制性内切酶DraI酶切得到的扩增产物，检测大粒品种与小粒品种之间存在DNA多态性差异，一般地，小粒品种扩增的分子量约为1kb，大粒品种扩增的分子量约为500bp。这是由于大粒的核苷酸序列中，存在DraI的酶切位点(TTTAAA)，该位点所在的核苷酸序列如SEQ ID NO.：10所示；而小粒品种的同样位置则无该酶切位点的存在，其与大粒对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.：9所示。

由于GL3基因及多肽在作物中的保守性，适用于本发明鉴定方法的作物选自下组：水稻、高粱、玉米、大豆、蓖麻、茶树、苜蓿、番茄、二穗短柄草、葡萄、拟南芥、或藻类。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明人首次定位并分离一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶多肽，该多肽与SEQIDNO.：2所示的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶GL3-FAZ1相比，具有下降的磷酸酶活性；

(2)丝氨酸/苏氨酸磷酸酶衍生多肽能促进细胞分裂，而使水稻颖壳加长、粒重增加。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1GL3的分子标记辅助选择育种

提取长/大粒品种WY3与小粒品种FAZ1的DNA，在GL3基因内设计PCR寡核苷酸引物，引物序列如下：

5′端引物：5′-GGTCGTTGTTGTGTAAGG-3′(SEQ ID NO.：11)；

3′端引物：5′-TAGTGAAGATGGGTGCTG-3′(SEQ ID NO.：12)。

用Taq酶进行PCR扩增；用限制性内切酶DraI酶切扩增产物，经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测出长/大粒品种与小粒品种之间存在DNA多态性。小粒品种扩增的分子量约为1kb，长/大粒品种扩增的分子量约为500bp，因此该引物可以作为成特异性鉴别长粒GL3基因与小粒GL3基因的分子标记。在长/大粒品种与小粒品种的杂交后代群体中用该分子标记可以快速地将携带长粒基因的个体挑选出，达到进一步培育大粒高产新品种的目的。

以长/大粒粳稻品种WY3和小粒籼稻品种FAZ1为亲本，构建遗传群体。利用分子标记在3号染色体上定位了控制水稻粒长的QTL即GL3，进一步通过图位克隆法克隆出了该基因。来自FAZ1的GL3(GL3-FAZ1)编码一个PPKL家族的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，序列分析表明，GL3的基因全长8.027Kb，开放阅读框ORF长度为3.012Kb，编码1003个氨基酸，蛋白产物分子量估计为106KD。长/大粒亲本WY3中的GL3(GL3-WY3)的ORF相对于GL3-FAZ1存在4个碱基突变，其中两个为同义突变，而1092和1495位的碱基突变导致了氨基酸替换。

图1显示了GL3基因和分子育种位点：方块为该基因的外显子，黑色连接线为内含子，方块和连线上方数字为内含子的片段长度，方块和连线下方数字为外显子的片段长度。

分子育种所用的位点序列见下：方框区域为育种位点，在WY3的基因组中，该序列为DraI的酶切位点，FAZ1中的同样位置则无该酶切位点的存在。

育种位点附近的FAZ1基因组序列(SEQ ID NO.：9)

tagtgaagat gggtgctgat ggctgattcc agatgccatg gtcatgggag ctgaaatgtt 60

cgaactgttt catatatcag tcgtattgca taattttgaa ttcttatttt tgaacgtatc 120

ccctgattca ctgggcatgc gctttcatgg acctctcatc taaagtttct aactatcttc 180

aatgttatgc ttagcaagtt ggaaggaaca tttactgcat tctagatttt gtgtcatcgt 240

gttgcacatt gtatgacagt aggagaaacc tttttttttt gtttttcctt ttggcaagtt 300

aaagtaggtg agcggaactt ctaaggcacg actctgatat ggaattgaag gttttctttt 360

ttgggagcta tattattgct gatgtaatct agca tatatacaaa actagttgct 420

ccattgtgta caaaattgtt ttcggttaaa aaaatgttat ctggtataca atgctatttt 480

tactctccag tgagtcacaa aggtggatta ttcattgatc tctccttggt ttataggtct 540

tgccggtgcc acagcagatg tccactgtta tgatgtgtta tcaaataagt ggagcaggta 600

ggatattcca taaatggttt ccaccttctt ttgagcattt aatcgttgcg ttgctacttt 660

ggttgacttt agcaactttt gttttagagt aacacgatta ttttgttggt agcataaagc 720

aactcagcaa acttatttaa tcgcgccacc actttggcag gcttactcca caaggtgagc 780

ctccttcacc aagagccgca catgtagcaa ctgcagttgg aaccatggtt gtcatccagg 840

tatttctata ttttacctgt ggtttctgag atttattacc tagtgcttaa ttagtatcag 900

aaacaattac ttcccaagta acctgtttta tgtactcttt gattgtttac ataaatttta 960

tggaggtaac ttctaaatat ggtttgtttt tgtttcatca ttcgttgcaa tgcagggtgg 1020

cattggccct gctggtttat ctgccgagga tcttcatgtt ctagacctta cacaacaacg 1080

accgcgatgg cacag 1095

育种位点附近的WY3基因组序列(SEQ ID NO.：10)

tagtgaagat gggtgctgat ggctgattcc agatgccatg gtcatgggag ctgaaatgtt 60

cgaactgttt catatatcag tcgtattgca taattttgaa ttcttatttt tgaacgtatc 120

ccctgattca ctgggcatgc gctttcatgg acctctcatc taaagtttct aactatcttc 180

aatgttatgc ttagcaagtt ggaaggaaca tttactgcat tctagatttt gtgtcatcgt 240

gttgcacatt gtatgacagt aggagaaacc tttttttttt ttgtttttcc ttttggcaag 300

ttaaagtagg tgagcggaac ttctaaggca cgactctgat atgaaattga aggttttctt 360

ttttgggagc tatattattg ctgatgtaat ctag catatataca aaactagttg 420

ctccattgtg tacaaaattg ttttcggtta aaaaaatgtt atctggtata caatgctatt 480

tttactctcc agttagtcac aaaggtggat tattcattga tctctccttg gtttataggt 540

cttgccggtg ccacagcaga tgtccactgt tatgatgtgt tatcaaataa gtggagcagg 600

taggatattc cataaatggt ttccaccttc ttttgagcat ttaatcgttg cgttgctact 660

ttggttgact ttagcaactt ttgttttaga gtaacacgat tattttgttg gtagcataaa 720

gcaactcagc aaacttattt aattgcgcca ccactttggc aggcttactc cacaaggtga 780

gcctccttca ccaagagccg cacatgtagc aactgcagtt ggaaccatgg ttgtcatcca 840

g 841

图1显示了GL3基因和分子育种位点：方块为该基因的外显子，黑色连接线为内含子，方块和连线上方数字为内含子的片段长度，方块和连线下方数字为外显子的片段长度。

实施例2GL3水稻转基因实验

本实施例采用市售的双元表达载体pHB，作为水稻转基因载体。该载体具有一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(Kan^r)、潮霉素抗性基因(Hyg^r)、除草剂抗性基因(Bar)、CaMV35S启动子、NOS基因的终止信号序列，以及限制性内切酶克隆位点(MCS)。在限制性内切酶克隆位点可正向或反向插入GL3的cDNA构建成转基因质粒。

GL3正义过量表达的转基因质粒构建

在该实施例中，以构建的来源于长/大粒和小粒品种的RNA为模板，合成第一条链cDNA，用该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸为引物(SEQ ID NO.：3和SEQ ID NO.：4)，用高保真Taq酶Kod进行扩增，获得3.012kb的全长cDNA扩增产物。将该扩增产物通过Taq酶末端加A后接入pTA2载体(购于Toyobo公司)，并对多个重组子进行测序，以验证序列的正确性。该重组的过渡质粒载体称为GL3-PTA2-FAZ1和GL3-PTA2-WY3。引物序列如下：

5′端引物：5′-aaaaagcttatggacgtggactcccgcatgacgacg-3′(SEQ ID NO.：13)；

3′端引物：5′-aaaggatccctatatccaggcaagagaacctcgatc-3′(SEQ ID NO.：14)。

用HindIII和BamHI消化GL3-PTA2-FAZ1和GL3-PTA2-WY3和载体pHB，将GL3-PTA2-FAZ1和GL3-PTA2-WY3消化后的3.012kb目的片段连接到载体pHB。连接物转化市售的大肠杆菌菌株Top10，在含有Kan(50μg/ml)的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，用HindIII和BamHI酶解挑选出有约3Kb片段插入的克隆，并用M13通用引物测序检验核苷酸序列是否正确。成功构建了GL3正义过量表达的转基因质粒：pHB-35S-GL3-FAZ1质粒和pHB-35S-GL3-WY3质粒。

点突变M1和M2过量表达的转基因质粒构建

对于点突变M1和M2的过表达的构建，使用HindIII和SphI消化GL3-PTA2-FAZ1，回收长度为1.2kb的片段A，使用HindIII和SphI消化GL3-PTA2-WY3，回收长度为约4.8kb的片段B；将片段A和B连接获得GL3-PTA2-M1。使用BamHI和SphI消化GL3-PTA2-FAZ1，回收长度为1.8kb的片段C，使用BamHI和SphI消化GL3-PTA2-WY3，回收长度为约4.2kb的片段D；将片段C和D连接获得GL3-PTA2-M2。用HindIII和BamHI消化GL3-PTA2-M1和GL3-PTA2-M2和载体pHB，将GL3-PTA2-M 1和GL3-PTA2-M2消化后的3.012kb目的片段连接到载体pHB。连接物转化大肠杆菌菌株Top10，在含有Kan(50μg/ml)的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，用HindIII和BamHI酶解挑选出有约3Kb片段插入的克隆，并用M13通用引物测序检验核苷酸序列是否正确。这样成功构建了点突变M1和M2过量表达的转基因质粒：pHB-35S-GL3-M1质粒和pHB-35S-GL3-M2质粒。

实施例3GL3转化水稻

1.1实施例2制备的四种重组质粒通过冻融法导入农杆菌菌株EHA105(购于Biovector公司)，方法如下：

每200μl EHA105感受态细胞加0.5-1μg(约10μl)质粒DNA混匀，依次于冰上、液氮和37℃水浴中各放置5分钟；用新鲜的YEB液体培养基稀释至1ml，于28℃振摇培养2-4小时；取200μl涂布于含抗生素Kan(50μg/ml)的YEB平板上，28℃培养2-3天。长出的菌落在含抗生素的YEB平板上划单菌，连续划3次。参考Hiei等(1994)的方法，从YEB平板上挑取农杆菌单菌落接种到3ml含抗生素的YEB液体培养基中于28℃振摇培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含抗生素的AB液体培养基中，200rpm继续振摇培养，至OD₆₀₀为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、4℃离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。

采用常规的农杆菌转化方法转化水稻中花11的幼胚愈伤。取授粉后12-15天的中花11未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后，于NaClO溶液中(与水1∶3混合，加2-3滴吐温-20)消毒90分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和摄子挑出幼胚并接种于N6D₂培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D₂C培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮作为农杆菌Vir基因活化物，使用浓度为100μmol/L。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入选择培养基N6D₂S 1(Hyg 25mg/l)进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到N6D₂S2(Hyg 50mg/l)选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2MS₀H培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室盆土栽培。获得的再生植株移栽成活后以除草剂再次筛选转化植株；阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。用转基因T1代观察水稻粒型表型，验证GL3基因功能。

并使用Real-time PCR来精确定量各个转基因系中的GL3表达情况，方法如下：取幼苗期的叶片，提取RNA后反转录成cDNA，使用Takara公司的SYBRGREEN试剂盒来检测GL3表达水准，GL3检测引物如下：

5′端引物：5′-TCACAACTCCCAGGATAGG-3′(SEQ ID NO.：15)；

3′端引物：5′-TTTGTCTCGCTCGCTCAT-3′(SEQ ID NO.：16)。

使用Ubiquitin作为内参引物，引物序列如下：

5′端引物：5′-GACGGACGCACCCTGGCTGACTAC-3′(SEQ ID NO.：17)；

3′端引物：5′-TGCTGCCAATTACCATATACCACGAC-3′(SEQ ID NO.：18)。

结果分析时使用相对定量分析法，将各个转基因系列的空载体(vector)的GL3表达量作为1，其他各株系的表达量均已相对与空载体的表达量的倍数来表示。

1.2根据实施例1的遗传定位结果，用分子标记选择方法构建一个近等基因系(NIL)：包含有GL3的30Kb的WY3片段、其他区域绝大部分为FAZ1片段，即把长粒基因位点GL3-WY3导入FAZ1的遗传背景中。

结果表明，小粒籼稻品种FAZ1的粒长增加(图2a、图2b)。

1.3将WY3中的GL3、1092位的单点突变M1(GL3-M1)和1495位的单点突变M2(GL3-M2)分别在小粒粳稻品种中花11中过表达。

结果(图3)表明，WY3中的GL3在小粒粳稻品种中花11中过表达，能够产生长粒表型；而将1092位的单点突变M1(GL3-M1)和1495位的单点突变M2(GL3-M2)在中花11中过表达也能够产生长粒的表型。对这些产生表型的植株进行定量PCR的分析，当外源的GL3表达量增高时，这些植株的粒长也会增加。

图3a显示水稻GL3-WY3、GL3-M1和GL3-M2的正义转基因植株的谷粒明显比受体品种中花11(ZH11)大，Vector为转空载体的中花11；OE-GL3-WY3-1、OE-GL3-WY3-2、和OE-GL3-WY3-3为GL3-WY3的过表达种子；OE-GL3-M1-1、OE-GL3-M1-2、OE-GL3-M1-3为GL3-M1过表达种子；OE-GL3-M2-1、OE-GL3-M2-2、OE-GL3-M2-3为GL3-M2过表达种子，棒状基线(Bar)＝2mm。图3b为粒长量化数据。图3c为转基因植株中GL3的表达水平，均以各自的转基因空载体的内源GL3表达为1做相对定量。

导入的GL3衍生多肽通过与本底丝氨酸/苏氨酸磷酸酶竞争，抑制了本底该磷酸酶的活性，这是一种显性负效应的结果。显性负效应指衍生多肽的某一基因产物其自身功能缺陷，但仍保留与野生型该基因产物的底物蛋白结合的能力，在同一细胞或组织内，衍生多肽与野生型的多肽竞争底物蛋白从而影响野生型该基因的正常功能(Ronald GLafreniere et al.Nature Medicine 16，1157-1160，2010；Emmler K et al.Planta，197(1)：103-10，1995)。

实施例4GL3蛋白质分析

1.1以GL3-PTA2-FAZ 1、GL3-PTA2-WY3、GL3-PTA2-M 1和GL3-PTA2-M2为模板，使用引物5′和3′端的PCR寡核苷酸为引物(SEQ ID NO.：15和SEQ IDNO.：16)，用高保真Taq酶Kod进行扩增，获得3.012kb的全长cDNA扩增产物。将该扩增产物通过Taq酶末端加A后接入pTA2载体，并对多个重组子进行测序，以验证序列的正确性。该重组的过渡质粒载体称为GL3-PTA2-protein-FAZ1，GL3-PTA2-protein-WY3、GL3-PTA2-protein-M1和GL3-PTA2-protein-M2。5′端引物序列如(SEQ ID NO.：13所示，3′端引物序列如SEQ ID NO.：14所示。

SalI和EcoRI消化GL3-PTA2-protein-FAZ1、GL3-PTA2-protein-WY3、GL3-PTA2-protein-M1、GL3-PTA2-protein-M2和载体pMALc5x，将GL3-PTA2-protein-FAZ1、GL3-PTA2-FAZ1、GL3-PTA2-protein-WY3、GL3-PTA2-protein-M1、GL3-PTA2-protein-M2消化后的3.012kb目的片段连接到载体pMALc5x。连接物转化市售的大肠杆菌菌株Top10，在含有Amp(50μg/ml)的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，用SalI和EcoRI酶解挑选出有约3Kb片段插入的克隆，并用M13通用引物测序检验核苷酸序列是否正确。这样成功构建pMALc5x-GL3-FAZ1、pMALc5x-GL3-WY3、pMALc5x-GL3-M1、pMALc5x-GL3-M2质粒。

将pMALc5x-GL3-FAZ1、pMALc5x-GL3-WY3、pMALc5x-GL3-M1、pMALc5x-GL3-M2转入市售的大肠杆菌表达菌株TB 1中，在含有Amp(50μg/ml)的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，质粒转化大肠杆菌菌株Top10，在含有Amp(50μg/ml)的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，用SalI和EcoRI酶解挑选出有约3Kb片段插入的克隆，确认转入了正确的质粒。将包含正确质粒的TB 1在Amp(50μg/ml)的TB培养液中37℃210rpm摇菌过夜后按照1∶50的比例稀释至新鲜的Amp(50μg/ml)的500ml TB培养液中，37℃2h后测OD，当OD₆₀₀为0.3时，加入1mM的IPTG，转至20℃210rpm诱导16h。4000rpm离心20min收集菌液，使用NEB公司的Amylose resin按照标准操作说明书法提取蛋白，获得GL3-FAZ1::MBP，GL3-WY3::MBP，GL3-M1::MBP和GL3-M2::MBP。

1.2酶活检测

将检测丝氨酸/苏氨酸磷酸酶酶活的标准底物MyBP使用Protein Kinase A(PKA)在30℃下磷酸化过夜。同时，考虑到大多数的磷酸酶的活性也会受到磷酸化状态的调节，GL3-FAZ1::MBP，GL3-WY3::MBP，GL3-M1::MBP和GL3-M2::MBP也使用同样方法磷酸化。将50ng的GL3-FAZ1::MBP，GL3-WY3::MBP，GL3-M1::MBP、GL3-M2::MBP及MBP分别与1μg的MyBP在30℃反应30min，然后使用Promega公司的的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶分析系统分析酶活。

结果表明，GL3-FAZ1比GL3-WY3、GL3-M1和GL3-M2有着更强的去磷酸化能力(图4)。

实施例5GL3的分子育种

使用优质籼稻品种黄花占和携带长粒基因GL3的近等基因系杂交获得F1，F1自交获得F2，利用分子标记辅助选择出纯合的包含长粒基因GL3的植株，并经过多代自交选择获得稳定的F8代品系，即为新品种黄花占(GL3)。

检测结果(图5)表明，黄花占(GL3)的粒长要长于黄花占，粒宽和粒厚稍有增加，大面积的小区测产结果显示，黄花占(GL3)比黄花占增产9％。

实施例6GL3促进细胞分裂

FAZ1和NIL的生育期是相同的，特别是从孕穗到抽穗期的时间几乎一致，表明两者颖壳发育时间是一致的。通过颖壳成熟颖壳的切片显示，NIL的颖壳细胞在纵向上并不长于FAZ1的颖壳细胞，因此NIL拥有更长的颖壳是由于在纵向上拥有更多的细胞，因此NIL的颖壳在发育过程中有着更快的细胞分裂速度。

将FAZ1和NIL的颖壳发育阶段分成各自的最终长度的25％、50％、65％、80％、和100％的5个时期，分别取每个时期的颖壳50个，泡在贝克曼公司的核提取液中，用锋利的刀片剁碎，使用40μm的滤膜过滤后使用贝克曼公司的MOFOL检测细胞倍性。记录10000个细胞数据，四倍体的比例为四倍体数目除以四倍体与二倍体数目之和。

结果表明，四倍体的细胞一般都处于分裂期，更多的四倍体比例说明更多的细胞处于分裂阶段，可认为在NIL中颖壳发育阶段细胞分裂加速。图6显示，NIL的颖壳在发育至50％时比FAZ1的颖壳有更快的分裂速度。

实施例7GL3序列的保守性

本发明人比较了GL3基因在高粱、玉米、大豆、蓖麻、茶树、苜蓿、番茄、二穗短柄草、葡萄、拟南芥及藻类中的同源性，结果如下：

高粱：3个同源基因，蛋白质同源性分别为100％，100％，93％；

玉米：3个同源基因，蛋白质同源性分别为28％，21％，18％；

大豆：6个同源基因，蛋白质同源性分别为100％，100％，100％，100％，93％，83％；

蓖麻：2个同源基因，蛋白质同源性分别为93％，86％；

茶树：1个同源基因，蛋白质同源性为93％；

苜蓿：4个同源基因，蛋白质同源性分别为100％，86％，57％，40％；

番茄：2个同源基因，蛋白质同源性分别为100％，93％；

二穗短柄草：3个同源基因，蛋白质同源性分别为100％，93％，93％；

葡萄：6个同源基因，蛋白质同源性分别为100％，100％，100％，93％，93％，31％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (17)

1.一种分离的多肽，所述多肽具有丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性，其特征在于，所述多肽为：

将如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列的第364位氨基酸经过一个氨基酸残基的取代而形成的、与SEQ ID NO.:2所示的多肽相比具有下降的磷酸酶活性的多肽，并且所述分离的多肽中第364位由天冬氨酸变为谷氨酸。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的分离的多肽的序列如SEQ ID NO.:6所示。

3.一种分离的多肽，所述多肽具有丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性，其特征在于，所述的分离的多肽的序列如SEQ ID NO.:4或8所示。

4.一种分离的多肽，所述多肽具有丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性，其特征在于，所述的多肽是将SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列的第364位和第499位氨基酸经过取代而形成的、与SEQ ID NO.:2所示的多肽相比具有下降的磷酸酶活性的多肽，其中，所述分离的多肽中第364位由天冬氨酸变为谷氨酸，并且所述第499位氨基酸被选自下组的氨基酸取代：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸。

5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸自下组：

(i)编码权利要求1-4任一所述多肽的多核苷酸；

(ii)序列如SEQ ID NO.:3或SEQ ID NO.:5所示的多核苷酸；

(iii)与(i)-(ii)任一所述的多核苷酸完全互补的多核苷酸。

6.一种含有权利要求5所述多核苷酸的载体。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的载体，或其基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。

8.一种权利要求1所述多肽的用途，其特征在于，所述用途选自下组的一种或多种：

(a)所述多肽用于控制作物籽粒粒形性状；

(b)所述多肽用于调节细胞分裂；

(c)所述多肽用于调节作物粒重或/和作物产量；

(d)所述多肽用做鉴定作物大粒和小粒的分子标记。

9.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，包括步骤：

将编码权利要求1所述多肽的多核苷酸导入植物细胞中，培养所述植物细胞，再生成植物。

10.一种制备权利要求1所述多肽的方法，其特征在于，培养权利要求7所述的宿主细胞，收集获得权利要求1所述的多肽。

11.一种改良作物性状的方法，其特征在于，包括步骤：

提高所述作物中权利要求1所述多肽的表达；

并且所述的作物为水稻。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的改良作物性状选自下组：

(a)改良作物籽粒粒形性状；

(b)改良作物细胞分裂；或

(c)改良作物粒重或/和作物产量。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的籽粒粒形性状选自下组：粒长、粒宽、粒厚。

14.一种鉴定大粒或小粒作物的方法，其特征在于，包括步骤：鉴定作物样本是否具有以下的多肽或其编码基因，所述多肽具有丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性，并且所述多肽选自下组：

(1)SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的多肽；

或所述的多肽为以下(A)多肽：

(A)氨基酸序列如SEQ ID NO.:4、6或8所示的多肽；

其中，如果具有SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的多肽或其编码基因，则为小粒作物，如果具有上述(A)多肽或其编码基因，则为大粒作物；

并且所述的作物为水稻。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：鉴定作物样本中是否具有如SEQ ID NO.:10或SEQ ID NO.:9所示的序列。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，包括步骤：鉴定样本核苷酸序列的Dral限制性内切酶片段长度多态性。

17.一种权利要求1所述多肽的编码多核苷酸的用途，其特征在于，所述用途选自下组的一种或多种：

(a)所述多核苷酸用于控制作物籽粒粒形性状；

(b)所述多核苷酸用于调节细胞分裂；

(c)所述多核苷酸用于调节作物粒重或/和作物产量；

(d)所述多核苷酸用做鉴定作物大粒和小粒的分子标记。