CN104745599B - 一种水稻粒型基因qSS7及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻粒型基因qSS7及制备方法和应用，一种水稻粒型基因qSS7，其序列为SEQ ID NO.1所示，该基因可增加粒长和长宽比，减小粒宽，同时减小垩白率和垩白度，在利用该基因改良水稻外观品质时，不用担心其他品质和产量受到负面影响；同时针对qSS7设计了基因标记，可以在苗期鉴定出长短粒等位基因，剔除不需要的杂合及纯和短粒基因型植株，排除了选育后代粒型存在分离的可能，至少减少一季的选育环节。因此，在品质育种实践中可以缩小后代选育材料的面积75%、提高基因选择准确性、缩短育种进程。

Description

一种水稻粒型基因qSS7及制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。更具体涉及一种水稻粒型基因qSS7，同时还涉及一种水稻粒型基因qSS7的制备方法，还涉及一种水稻粒型基因qSS7的用途，具体包含了一个控制粒型的主效基因qSS7，针对该基因设计分子标记QS1，并利用分子标记技术将一个控制水稻长粒等位基因导入到短粒品种中，使短粒品种籽粒变长，改良水稻外观品质，创制品质改良新材料的方法。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。为了满足日益增长的人口对粮食的需求，育种家一直以来把提高单产作为水稻育种的主攻方向，而忽视了对水稻品质的提高。随着人们生活水平的日益提高，稻米品质要求越来越高。目前的稻米品质远未达到消费的需求。因此，改良品质已经成为育种家的迫切任务。

水稻品质可分为加工品质、外观品质、蒸煮食味品质和营养品质，其中外观品质和蒸煮食味品质尤为重要。水稻外观品质包括粒型（一般用粒长、粒宽、长宽比来表示）、垩白率和垩白度等。国家优质稻谷质量标准明确规定，籼稻一级长宽比不小于2.8，垩白粒率不大于10%，垩白度不大于1.0%（GB/T17891-19992000-04-01实施）。粒型对外观品质影响很大，同时粒型对水稻产量影响也较大。因此，研究者对水稻粒型的遗传研究较为深入，在水稻12条染色体上已定位了大量控制粒型的数量性状位点（http://www.gramene.org）。人们也克隆了许多粒型基因，包括GS3、GW5/qSW5、GS5、GW8和qGL3.1（Fan et al.,2006；Song etal.,2007；Ayahiko et al.,2008；Weng et al.,2008；Li et al.,2011；Wang et al.,2012；Zhang et al.,2012）。其中GW2、qSW5/GW5和GW8影响产量和外观品质的作用表现为相反的效应，即增加产量会降低品质，利用它们进行水稻品质改良过程中不能同时兼顾产量和品质的改良。利用GS3和qGL3.1虽然可同时改良产量和品质，但由于短粒等位基因对长粒基因为显性，因此，在水稻育种利用，特别是杂交稻育种中，操作相对复杂，利用起来较困难。

垩白率和垩白度受环境影响很大，由于该性状遗传上受到三倍体胚乳基因型的影响，遗传机理十分复杂。目前为止，人们虽然定位到了一些影响垩白的QTL，但还没有用图位克隆法分离鉴定出垩白基因的报道，因此，利用遗传手段降低垩白率和垩白度也具有一定难度。

本发明利用图位克隆法分离得到1个粒型基因qSS7，其来源于热带粳稻的等位基因增加粒长，改善长宽比。转基因抑制该基因表达可以缩短粒长。根据该基因序列的变异，设计了该基因的分子标记；通过分子标记辅助选择的方法将该基因导入到水稻短粒品种中，可以增加粒长和长宽比，减小垩白率和垩白度，极大地改良外观品质，创造品质改良的水稻新材料。

本发明在国内外未见报道，所在课题组尽管公开发表了该基因的精细定位结果，但未公开发表涉及本发明内容的文章，本发明在国内外公众未知。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种改良水稻籽粒外观品质的基因qSS7，其序列为SEQ ID NO.1所示，其对应的cDNA编码区序列为SEQ ID NO.2所示，编码的氨基酸为SEQ IDNO.3所示。导入qSS7长粒等位基因能够增加粒长，改善长宽比，减小垩白率和垩白度，极大地改良外观品质。

本发明的另一个目的是在于提供了一种改良水稻籽粒外观品质的基因的制备方法，该方法易行，操作简便。

本发明还有一个目的在于提供了一种基于qSS7基因的分子标记QS1引物，针对Cypress和珍汕97的qSS7基因序列差异设计基因标记QS1，通过分子标记辅助选择方法，能够准确、快捷的区分长短粒等位基因。

本发明最后一个目的在于提供了一种水稻粒型基因qSS7在改良水稻籽粒外观品质中的应用，利用基因在水稻染色体片段代换系后代中选择外观品质显著改善、单株产量不变或有提高、其他品质性状不变的株系，创造品质改良的新材料。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种改良水稻籽粒外观品质的基因的制备方法，其步骤是：

提取Cypress（来源于国际水稻研究所，编号为：IRGC117282）的DNA，用引物qs2(左引物：ATATCATACTTATATGGCA，右引物：GACAAGTGGCTATGCTGTAT)进行聚合酶链式反应（PCR），PCR程序:94℃预变性5分钟；35个循环（94℃变性40秒；55℃退火40秒；72℃延伸8分钟），72℃延伸10分钟；用扩增产物测序，获得Cypress基因全长序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

以Cypress幼穗cDNA为模板，用引物qs3（左引物：ATGCCTCCGGCGAGGGTGCT，右引物：TCAGCTTGTACTACTAAATG）进行聚合酶链式反应，获得Cypress基因编码序列（CDS），其序列为SEQ ID NO.2所示。

利用Primer3软件（http://frodo.wi.mit.edu/）翻译编码序列（CDS）获得Cypress的氨基酸序列，由940个氨基酸组成，其序列为SEQ ID NO.3所示。该蛋白分子量为104211.9道尔顿，富含丝氨酸（14.1%），不稳定系数为73.47，脂肪系数66.96，亲水。

一种水稻粒型基因qSS7在改良水稻籽粒外观品质中的应用，其步骤如下：

1）粒型变短的稳定转基因材料的获得：

（1）将该基因3’端234bp的一段cDNA片段连接到RNAi表达载体pDS1301（Chu ZH,etal.2006）上，构建qSS7抑制表达载体；

（2）利用根癌农杆菌介导的转基因方法将qSS7抑制表达载体导入到含qSS7区段的染色体片段代换系Q043(Qiu et al.,2012)中，获得转基因植株；

（3）利用聚合酶链式反应对T0代转基因植株进行阳性检测（图2），利用RT-PCR的方法鉴定qSS7的表达，选择表达量下降且粒长变短的单株（图3），收获单株自交种子；

（4）将步骤4选留的转基因植株的种子种成家系(T1代)，继续利用聚合酶链式反应对T1代单株进行阳性检测，收种后分析粒型；

（5）将步骤5选留的转基因植株的种子种成家系(T2代)，获得粒型变短的稳定转基因材料。通过抑制基因qSS7表达得到稳定的短粒株系，直接证实了qSS7控制粒长的功能。

2）粒型变长的转基因材料的获得：

（1）将该基因的CDS（SEQ ID NO.2），与超表达载体PU1301（Zhao Y et al.,2009）连接，构建qSS7超表达载体（图5）；

（2）利用根癌农杆菌介导的转基因方法将超表达载体导入到短粒品种中花11（中国公开品种）中，获得转基因植株；

（3）利用聚合酶链式反应对T0代转基因植株进行阳性检测（图6），收获单株自交种，测量粒型，获得粒长变长的材料。

3）水稻qSS7基因在改良水稻品种珍汕97的应用，其步骤是：

（1）针对Cypress和珍汕97中（中国公开品种）qSS7的基因序列差异设计一个基因标记QS1，引物序列为CGATGCTAGGGGCTTTTG和CCAGCCTCCCATTGTAGT；

（2）以珍汕97为受体，热带粳稻品种Cypress为供体构建含qSS7区段的染色体片段代换系Q043(Qiu et al.,2012)，以珍汕97为母本，Q043为父本杂交，得到F1，F1套袋自交得到166个单株的F2分离群体。利用基因标记QS1从该分离群体中选择基因qSS7分别含有来源于Cypress和珍汕97的单株，命名为近等基因系NILCYP和NILZS97；

（3）对qSS7的近等基因系NILCYP和NILZS97进行产量和品质相关性状考察。与NILZS97相比，NILCYP能够显著改良粒型和垩白品质（增加粒长1mm，增大长宽比0.6，减小粒宽0.1mm，降低垩白率18%，降低垩白度8%）。选择粒型和垩白品质改良的稳定株系，培育新材料。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

A、qSS7同时增加粒长和长宽比，减小粒宽（增加粒长1mm，增大长宽比0.6，减小粒宽0.1mm），因此，可以极大地改良水稻外观品质；

B、qSS7同时减小垩白率和垩白度（降低垩白率18%，降低垩白度8%），不影响其他品质和水稻产量。在利用该基因改良水稻外观品质时，不用担心其他品质和产量受到负面影响；

C、遗传上qSS7表现出长粒对短粒为显性(Qiu et al.,2012)，因此在杂交稻选育过程中，只需改良杂交组合的其中一个亲本，方法易行，操作简便。

D、本方法针对qSS7设计了基因标记，可以在苗期鉴定出长短粒等位基因，剔除不需要的杂合及纯和短粒基因型植株（剔除比例占总体样本的3/4，排除了选育后代粒型存在分离的可能，至少减少一季的选育环节。因此，在品质育种实践中可以缩小后代选育材料的面积75%、提高基因选择准确性、缩短育种进程。

附图说明

图1为一种抑制表达载体构建示意图。

先将qSS73’端234bp的一段cDNA片段连接到RNAi表达载体pDS1301上，形成中间载体，再将该片段连接到中间载体，形成抑制表达载体。

图2为一种T0代转基因植株阳性检测示意图。

第1泳道为空白（灭菌双蒸水，d₂H₂O），第2-12泳道为部分T0代转基因植株扩增结果。其中有10个单株为转基因阳性。

图3为RT-PCR检测T0代转基因植株中qSS7的表达量示意图。

上排qSS7的表达量，下排内参Actin的表达量。第1泳道为对照CK（阴性转基因植株）。

图4为一种T2代家系转基因植株阳性检测示意图。

第一泳道为Marker(全式金公司，货号：BM111)，第36泳道为空白(灭菌双蒸水,d₂H₂O)。“+”代表阳性单株，“-”代表阴性单株。

图5为一种超表达载体构建示意图。

将基因qSS7的CDS（SEQ ID NO.2）与超表达载体PU1301（Zhao Y et al.,2009）连接，构建qSS7超表达载体；

图6为一种T0代转基因植株阳性检测示意图。

第1-4泳道为阳性植株扩增结果，5、6泳道为阴性单株扩增结果。

图7为一个基因标记分析亲本基因型的电泳示意图。

其中珍汕97和Cypress PCR扩增产物大小均为487碱基对（bp），经限制性内切酶HinP1I（纽英伦生物技术有限公司产品）酶切2小时后，珍汕97的DNA扩增片段被酶切为363bp和124bp。点样顺序从右至左为：Marker(全式金公司，货号：BM111)；酶切前Cypress，珍汕97；酶切后Cypress，珍汕97。

具体实施方式

本发明通过以下详细的实施例给出。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。所述的分子克隆方法及试剂配方如未特别说明，均参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002；测序工作由北京六合华大基因股份有限公司完成。

实施例1：

基因qSS7的制备方法：

（1）提取Cypress（来源于国际水稻研究所，编号为：IRGC117282）的DNA，用引物qs2(左引物：ATATCATACTTATATGGCA，右引物：GACAAGTGGCTATGCTGTAT)进行聚合酶链式反应（PCR），PCR程序:94℃预变性5分钟；35个循环（94℃变性40秒；55℃退火40秒；72℃延伸8分钟），72℃延伸10分钟；用扩增产物测序，获得Cypress基因全长序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

（2）从Cypress的幼穗组织提取RNA,反转录获得cDNA。以Cypress幼穗cDNA为模板，用引物qs3（左引物：AAAGGATCCATGCCTCCGGCGAGGGTGCT，右引物：AAAGGATCCTCAGCTTGTACTACTAAATG）进行聚合酶链式反应（PCR），PCR程序:94℃预变性5分钟；35个循环（94℃变性40秒；55℃退火40秒；72℃延伸3分钟），72℃延伸7分钟；用扩增产物测序，获得Cypress基因编码序列（CDS），其序列为SEQ ID NO.2所示。

（3）利用Primer3软件（http://frodo.wi.mit.edu/）翻译编码序列（CDS）获得Cypress的氨基酸序列，其序列为SEQ ID NO.3所示。

实施例2：

qSS7抑制表达载体的构建和转化农杆菌的建立：

（1）根据粳稻qSS7cDNA序列的3’端的序列设计标记，并分别在序列5’端增加BamHⅠ、KpnⅠ、SacⅠ和SpeⅠ酶切位点，设计左引物GL260MF序列为

AAAGAGCTCGGATCCGTTGAGGATCCACTGAATGG，右引物GL260MR序列为AAAACTAGTGGTACCGTGTAGTTGCTAAGCTTCCTA（引物由上海生工生物技术有限公司负责合成）。以Cypress幼穗cDNA为模板进行聚合酶链式反应（PCR）。PCR反应程序为94℃预变性5分钟；35个循环（94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸40秒），72℃延伸7分钟，获得目的片段。

将该片段连接到载体上。方法为:用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切，分离回收目的片段，与用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切后的pDS1301（抑制载体，Chu ZH,et al.2006.Promotermutations of an essential gene for pollen development result in diseaseresistance in rice.Genes Dev20:1250-1255）用T4连接酶连接形成中间载体，再将该片段用SacⅠ和SpeⅠ双酶切，分离回收目标片段，与用SacⅠ和SpeⅠ双酶切过中间载体用T4连接酶连接形成抑制表达载体。以上限制性内切酶（BamHⅠ、KpnⅠ、SacⅠ和SpeⅠ）和T4连接酶均购于Takara公司（图1）。

（2）将抑制表达载体转化大肠杆菌感受态DH5ɑ（Takara公司产品），在含X-Gal、IPTG和卡那霉素(上海生工公司产品)的抗性培养基上挑选白色单菌落。

（3）将挑选的白色单菌落富集抽提质粒，用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切后电泳检测，挑选连接正确的质粒转化农杆菌EHA105（Takara公司产品），转化后的菌株命名为S1。

实施例3：

农杆菌介导的籼稻遗传转化：

（1）诱导：

将成熟的水稻材料Q043（长粒型水稻材料，含qSS7区段的染色体片段代换系(Qiuet al.,2012)）种子去壳，然后依次用70%体积比的乙醇处理1分钟，0.15%浓度的氯化汞（HgCl₂）种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在籼稻诱导培养基上；将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

（2）继代：

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于籼稻继代培养基上黑暗下培养2-3周，温度25±1℃。

（3）预培养：

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于籼稻预培养基上黑暗下培3-4天，温度25±1℃。

（4）农杆菌培养：

在带有卡那霉素抗性（上海生工公司产品)选择的LA培养基（LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002）上预培养农杆菌株S1两天，温度28℃；刮取农杆菌至悬浮培养基中悬浮培养，温度28℃。

（5）侵染：

将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；调节农杆菌S1的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在籼稻共培养基上培养3天，温度19-20℃。

（6）筛选：

用灭菌水洗涤愈伤8遍；浸泡在含400毫克/升羧苄青霉素（CN）（上海生工公司产品）的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至含有250毫克/升羧苄青霉素（CN）、50毫克/升潮霉素（Hn）（Roche公司产品）籼稻选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

（7）分化：

将抗性愈伤转移至籼稻分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

（8）生根：

剪掉再生苗分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

（9）移栽：

洗掉再生植株根上的残留培养基，移入钵中盆栽，同时在最初的几天保持水分湿润，待植株存活健壮后移入大田。

实施例4：

qSS7抑制表达转基因植株粒长的鉴定：

取转基因植株叶片抽提DNA，用引物PMCG1（左引物序列：CTGCTCCACACATGTCCATT；右引物序列：CCCACCATCTTGTGGAGCTA)和PMCG2（左引物序列：GGCTCACCAAACCTTAAACAA；右引物序列：CTGAGCTACACATGCTCAGGTT）进行聚合酶链式反应（PCR），PCR程序：94℃预变性5分钟；30个循环（94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸40秒），72℃延伸7分钟；电泳检测扩增产物，能分别扩增出750bp和500bp大小条带的单株即为阳性转化单株(图2)。抽提阳性单株幼穗中的RNA进行RT-PCR，以Actin为对照（Qiu et al.,2012），用引物GL256（左引物序列：AGGTCTCGAAGAGTCCAAGA,右引物序列：CCTTCGAATGAATATGACAGT）检测基因qSS7表达量的变化，有6份阳性单株（编号：R3,R5,R8,R9,R10,R11）qSS7的表达量下降（图3）。收获转基因材料的自交种，粒型考察方法（参照范楚川，2006，稻米品质性状的遗传基础研究以及粒长基因GS3的图位克隆，博士学位论文：25-26）；其中3株（编号：R3,R5,R8）的粒长明显变短（见表1），与阴性对照R6(CK)相比，3个单株粒长分别减少0.54mm、0.24mm和0.34mm。

以上所有引物序列均由上海生工生物技术有限公司合成。

表1T0代材料粒型

实施例5：

qSS7抑制表达阳性株T1代粒长鉴定：

将实施例4中谷粒变短的2个转基因单株（编号：R3和R8）的种子种成T1代家系(编号：RT3和RT8)，利用聚合酶链式反应（PCR）(方法同实施例4)检测各家系中的阳性单株，同时收获自交种，考察粒型（方法同实施例4），其粒长比阴性单株粒长显著变短、粒宽显著变宽、长宽比显著变小（见表2）。从中筛选获得转基因阳性单株，编号为RT3-1,RT3-2,RT3-5,RT8-2,RT8-3,RT8-4。

表2T1代材料粒型

*，**，表示0.05和0.01水平的显著性

实施例6：

qSS7抑制表达阳性株T2代粒长的鉴定：

在实施例4中两个转基因T1代家系内各选取3个阳性单株和1个阴性单株收获种子种成T2代家系，利用聚合酶链式反应（方法同实施例4）检测家系中的34个单株的阴阳性（见图4），同时收获自交种，考察粒型（方法同实施例4），获得6份粒型显著改变的转基因阳性单株材料，编号为RT3-1-2,RT3-2-8,RT3-5-7,RT8-2-3,RT8-3-3,RT8-4-6（见表3）。

表3T2代材料粒型

*，**，表示0.05和0.01水平的显著性

实施例7：

qSS7超表达载体的构建和转化农杆菌的建立：

（1）将实施例1得到的CDS（SEQ ID NO.2所示）用BamHI酶切，分离回收目标产物，与用BamHI酶切过的PU1301载体（Zhao Y et al.,2009）用T4连接酶连接形成超表达载体（图5）。上述引物由上海生工合成，限制性内切酶BamHI和T4连接酶均购于Takara公司；

（2）将超表达载体转化大肠杆菌感受态DH5ɑ（Takara公司产品），在含X-Gal、IPTG和卡那霉素(上海生工公司产品)的抗性培养基上挑选白色单菌落。

（3）将挑选的白色单菌落富集抽提质粒，用BamHⅠ酶切后电泳检测，挑选连接正确的质粒转化农杆菌EHA105（Takara公司产品），转化后的菌株命名为S2。

实施例8：

农杆菌介导的粳稻遗传转化：

（1）诱导：

将成熟的水稻品种中花11（短粒型水稻品种，中国公开品种）种子去壳，然后依次用70%体积比的乙醇处理1分钟，0.15%浓度的氯化汞（HgCl₂）种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在粳稻诱导培养基上；将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

（2）继代：

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于粳稻继代培养基上黑暗下培养2-3周，温度25±1℃。

（3）预培养：

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于粳稻预培养基上黑暗下培3-4天，温度25±1℃。

（4）农杆菌培养：

在带有卡那霉素抗性（上海生工公司产品)选择的LA培养基（LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002）上预培养农杆菌株S1两天，温度28℃；刮取农杆菌至悬浮培养基中悬浮培养，温度28℃。

（5）侵染：

将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；调节农杆菌S1的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在粳稻共培养基上培养3天，温度19-20℃。

（6）筛选：

用灭菌水洗涤愈伤8遍；浸泡在含400毫克/升羧苄青霉素（CN）（上海生工公司产品）的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至含有250毫克/升羧苄青霉素（CN）、50毫克/升潮霉素（Hn）（Roche公司产品）粳稻选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

（7）分化：

将抗性愈伤转移至粳稻分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

（8）生根：

剪掉再生苗分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

（9）移栽：

洗掉再生植株根上的残留培养基，移入钵中盆栽，同时在最初的几天保持水分湿润，待植株存活健壮后移入大田。

实施例9：

qSS7超表达转基因植株粒型鉴定：

由实施例7和实施例8获得的qSS7超表达T0代转基因植株共6株，分别命名为OX1至OX6，取T0代转基因植株叶片抽提DNA，用超表达载体PU1301上报告基因β-葡糖醛酸酶(GUS)的引物（引物序列为：CGTCTGTTGACTGGCAGGT和TTTTTGTCACGCGCTATCAG，Zhao Y et al.,2009）进行PCR检测阳性转化植株，PCR程序:94℃预变性5分钟；35个循环（94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸1.5分钟），72℃延伸7分钟；）能扩增出1.2kb大小条带的单株即为阳性转化植株。其中，OX1、OX2、OX3、OX4为阳性，OX5、OX6为阴性（图6）。

收获转基因材料的自交种，粒型考察方法（参照范楚川，2006，稻米品质性状的遗传基础研究以及粒长基因GS3的图位克隆，博士学位论文：25-26）；阳性单株（OX1、OX2、OX3、OX4）粒长均显著长于阴性植株（0X5、OX6）（表4）。阳性单株的粒长平均为8.45mm，阴性单株长平均为7.97mm，粒长显著增加0.48mm。

表4T0代材料粒型

*，表示0.05水平的显著性

实施例10：

qSS7基因标记的设计：

针对Cypress和珍汕97qSS7编码区第1552个碱基突变（T-C），利用Primer3软件（http://frodo.wi.mit.edu/）设计了一个酶切扩增多态性序列（Cleaved AmplifiedPolymorphism Sequences,CAPS）标记QS1，左引物序列为CGATGCTAGGGGCTTTTG，右引物为CCAGCCTCCCATTGTAGT，限制性内切酶为HinP1I（纽英伦生物技术有限公司产品）。两材料PCR扩增片段大小均为487bp，珍汕97扩增片段经HinP1I酶切为363bp和124bp大小的两个片段，而Cypress经HinP1I酶切仍为487bp1个片段。该标记可区分珍汕97和Cypress的qSS7等位基因。

PCR反应程序：94℃预变性5分钟；35个循环（94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸40秒），72℃延伸5分钟。酶切反应体系：10xNEBuffer4 2μl（纽英伦生物技术有限公司产品）,PCR反应产物10μl，限制性内切酶HinP1I0.5μl，灭菌双蒸水7.5μl；37℃酶切2小时，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定（见图7）。

实施例11：

一种水稻粒型基因qSS7在改良水稻籽粒外观品质中的应用，应用过程如下：

以珍汕97为母本，Q043为父本杂交，得F1，套袋自交构建166个单株的F2分离群体，用基因标记QS1鉴定分离群体单株的qSS7基因型，分析粒型（方法同实施例4）。qSS7表现为长粒对短粒为显性，窄粒对宽粒为显性，大长宽比对小长宽比为显性，来源于Cypress的等位基因同时增加粒长和长宽比，减小粒宽(Qiu et al.,2012)。

利用基因标记QS1筛选上述分离群体中分别为珍汕97和Cypress纯合基因型的单株，获得近等基因系NILZS97和NILCYP，NILCYP含有Cypress的qSS7基因，在武汉种植NILZS97和NILCYP，考察近等基因系的产量及品质性状。考察性状项目及方法如下：

抽穗期：单株调查。单株主穗至少抽出2cm以上的时间与播种时间之间的天数，即为抽穗期。

株高：单株主穗颖尖距离地面的高度（cm）。

有效穗数：凡一个穗子上有超过5粒饱满的种子即为有效穗，单株有效穗的个数即为有效穗数。

穗长：穗颈节到最上部颖尖之间的距离（cm）。

一次枝梗数：穗轴上着生分枝的个数。

二次枝梗数：一次枝梗上着生分枝的个数。

每穗实粒数：穗上全部实粒的个数。

每穗颖花数：穗上所有实粒数和空粒数之和。

着粒密度：每穗颖花数与穗长的比值。

千粒重：选取200粒饱满的种子称重，再转换成1000粒的重量即为千粒重（g）。

单株产量：单株所有实粒的总重量（g）。

糙米率：用1/100天平称取饱满种子30克，精确到0.01克。同时将砻谷机（中国华昌粮油机械有限公司，型号：JLGJ45-B）开机，空转1分钟，打出之前残留在机器里的种子。将样品均匀倒入砻谷机中去壳，并称取去壳后糙米的重量。糙米的重量与稻谷重量的比值即为糙米率（用百分比表示）。

精米率：将糙米放入碾米机（北京和信昌吉科技发展有限公司，型号：凯特AH002876）中去除种皮，每次5分钟，将糙米打成精米，并称取精米的重量。精米的重量与稻谷重量的比值即为精米率（用百分比表示）。

整精米率：在打好的精米中逐一挑拣出碎米，留下整精米（整精米的标准为长度≥完整精米4/5的非完整米），并称重。整精米的重量与稻谷重量的比值即为整精米率（用百分比表示）。

垩白率：使用大米外观品质检测仪（东孚久恒公司，北京）测定。垩白是米粒中胚乳的淀粉和蛋白质颗粒积累不够紧密所致，在日光灯下为阴影部分。有垩白的米粒数与全部米粒的比值即为垩白率（用百分比表示）。

垩白大小：垩白面积占整个米粒面积的比值，取平均值，即为该样品的垩白大小。

垩白度：垩白率与垩白大小的乘积即为垩白度。

直链淀粉含量：使用近红外品质快速分析仪（Foss公司，瑞士）测定直链淀粉含量。该仪器已经有配套的标准回归方程。将精米用捶式旋风磨（上海嘉定粮油仪器有限公司，型号JXFM110）打成米粉，置于分析盘的样品杯（高18mm，直径25mm）内。在光程为18mm，波长为850-1050nm的范围内，每个样品重复扫描5次，得到1条平均近红外光谱图，通过分析仪适配器转换，把每个光谱数据储存于计算机内，再通过标准回归方程的计算，即可得到该样品的直链淀粉含量。每份材料重复2次，取平均值，即为该样品的直链淀粉含量。

胶稠度：

（1）将精米用捶式旋风磨打成米粉，并过100目筛。

（2）称取125毫克麝香草酚蓝溶于500毫升95%乙醇中，配成0.025%麝香草酚蓝溶液。

（3）称取11.22克KOH溶于50毫升蒸馏水中，用容量瓶定容至100毫升，配成0.2mol/L的溶液。

（4）打开水浴锅，将温度调整到100℃。

（5）准确称取100毫克±1毫克米粉，放入试管底部。

（6）向试管中加入0.2毫升麝香草酚蓝溶液，并轻摇试管使米粉充分分散。

（7）向试管中准确加入2.0毫升KOH溶液，立即将试管置于涡旋振荡器上振荡，摇匀。

（8）将试管放入沸水浴中，立即在试管口盖上玻璃珠，在沸水浴中加热8分钟。水温不低于95℃，溶液沸腾高度保持在试管长度的1/2-2/3处。

（9）8分钟后，立即取出试管，拿去玻璃珠，室温静置5分钟，再将试管放入0℃冰箱中冷凝20分钟。

（10）将坐标纸置于水平台面上，横向沿粗线放置直尺。

（11）将冷凝好的试管放置在坐标纸上，试管底部靠直尺，以保证底部在同一基准线上。

（12）室温静置1小时。

（13）测量米胶在试管中的流动长度。该长度即为胶稠度。

每份材料测定2个重复，取平均值，即为该样品的胶稠度。

糊化温度：在快速黏度测定仪（Perten公司，瑞士）上完成该性状的测定。称取3克米粉充分溶于25毫升蒸馏水，置于该仪器中。设置转速为2000rpm，温度范围为25℃-99℃，升降速率为14℃/min。12分钟后即可得到糊化温度的数据。重复2次，取平均值，即为该样品的糊化温度。

蛋白质含量：使用近红外品质快速分析仪（Foss公司，瑞士）测定蛋白质含量。该仪器已经有配套的标准回归方程。将糙米置于分析盘的样品杯（高18mm，直径25mm）内。在光程为18mm，波长为850-1050nm的范围内，每个样品重复扫描5次，得到1条平均近红外光谱图，通过分析仪适配器转换，把每个光谱数据储存于计算机内，再通过标准回归方程的计算，得到蛋白质含量的数据。每份材料重复3次，取平均值，即为该样品的蛋白质含量。

含有Cypress来源的qSS7的NILCYP与NILZS97相比，生育期缩短约1天，穗长增加2cm，每穗着粒密度减小0.7，但有效穗数、每穗实粒数、粒重和产量没有变化；在外观品质方面，NILCYP增加粒长1mm，增大长宽比0.6，减小粒宽0.1mm，降低垩白率18%，降低垩白度8%，其他加工品质（糙米率、精米率、整精米率）和蒸煮食味品质(如直链淀粉含量、蛋白质含量、胶稠度、糊化温度等没有改变。因此，NILCYP可作为改良品质的新材料。

表5近等基因系产量及品质性状比较

*，**，0.05和0.01水平的显著性

本发明所用到的遗传转化的培养基及其配制的方法如下所述：

（1）试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：

6-BA（6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤）；

CN（Carbenicillin，羧苄青霉素）；

KT（Kinetin，激动素）；

NAA（Napthalene acetic acid，萘乙酸）；

IAA（Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸）；

2,4-D（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸）；

AS（Acetosringone，乙酰丁香酮）；

CH（Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白）；

HN（Hygromycin B，潮霉素）；

DMSO（Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜）；

MSmax（MS大量元素成分溶液）；

MSmix（MS微量元素成分溶液）；

N6max（N6大量元素成分溶液）；

N6mix（N6微量元素成分溶液）；

（2）主要溶液配方

1）继代A母液贮存液（按照100X浓缩液配制）

加蒸馏水定容至1000毫升，室温保存备用。

2）继代B母液贮存液（按照100X浓缩液配制）

加蒸馏水定容至1000毫升，室温保存备用。

3）铁盐（Fe₂EDTA）贮存液（按照100X浓缩液配制）

将3.73克乙二铵四乙酸二钠（Na₂EDTA·2H₂O）和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混

合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4）维生素贮存液（按照100X浓缩液配制）

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5）MS培养基大量元素母液（MSmax母液）(按照10X浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

6）MS培养基微量元素母液（MSmin母液）(按照100X浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

7）2,4-D贮存液（1毫克/毫升）的配制：

称取2,4-D100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

8）6-BA贮存液（1毫克/毫升）的配制：

称取6-BA100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。

9）萘乙酸（NAA）贮存液（1毫克/毫升）的配制：

称取NAA100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

10）吲哚乙酸（IAA）贮存液（1毫克/毫升）的配制：

称取IAA100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

11）葡萄糖贮存液（0.5克/毫升）的配制：

称取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

12）AS贮存液的配制：

称取AS0.392克，加入DMSO10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。13）1N氢氧化钾贮存液

称取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。

14）N6培养基大量元素母液（按照10倍浓缩液（10X）配制）：

15）N6培养基微量元素母液（按照100倍浓缩液（100X）配制：

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

（3）用于水稻遗传转化的培养基配方

1）诱导培养基

籼稻：

加H₂O600-700毫升并用氢氧化钾调节pH到6.0，煮沸后加H₂O定容到1000毫升，分装到50毫升三角瓶中(25毫升/瓶)，封口膜封口灭菌。

粳稻：

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶（25毫升/瓶），封口后按常规方法灭菌（例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同）。

2）继代培养基

籼稻：

加H₂O900毫升并用氢氧化钾调节pH到6.0，煮开后加水定容到1000毫升，分装到50毫升三角瓶中(25毫升/瓶)，封口膜封口灭菌。

粳稻：

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶（25毫升/瓶），封口，按上述方法灭菌。

3）预培养基

籼稻：

加H₂O250毫升并用氢氧化钾调节pH到5.6，封口膜封口灭菌。

使用前，煮溶培养基，加入5毫升葡萄糖母液（灭菌的50%葡萄糖溶液）和250μl AS母液，然后分装到培养皿中（25毫升/皿）。

粳稻：

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。

4）共培养基

籼稻：

加H₂O250毫升并调节pH到5.6，封口膜封口灭菌。

使用前，煮溶培养基，加入5毫升葡萄糖母液（灭菌的50%葡萄糖溶液）和250微升AS母液，然后分装到培养皿中（25毫升/皿）。

粳稻：

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中（25毫升/每皿）。

5）悬浮培养基

籼稻：

加H₂O100毫升并调节pH到5.4，过滤灭菌，加入100微升AS母液，分装到2个100毫升三角瓶（50毫升/瓶）。

粳稻：

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

6）选择培养基

籼稻：

加H₂O250毫升并调节pH到6.0，封口膜封口灭菌。

使用前，煮溶培养基，加入250μl Hn和200ppm CN，然后分装到培养皿中（25毫升/皿）。

粳稻：

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN（50毫克/毫升）和400微升CN（250毫克/毫升）分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。（注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升）。

7）分化培养基

籼稻：

加H₂O1000毫升并用氢氧化钠调节pH到6.0，煮开后分装到100毫升三角瓶中（50毫升/瓶），封口膜封口灭菌。

粳稻：

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶（50毫升/瓶），封口，按上述方法灭菌。

9）生根培养基

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中（25毫升/管），封口，按上述方法灭菌。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种水稻粒型基因 qSS7及制备方法和应用

<130> 一种水稻粒型基因 qSS7及制备方法和应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7348

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 1

atatcatact tatatggcat agttaacacc ggcaacaaca ataagatgag cttgatctta 60

atctcttctc ctttcaagtg cactaaagtc caatgaccgt actacgtgtt actaccacat 120

tcacatagct agctgtgccc tcataattgt gctgtccaac gtactggtac tactacacgg 180

tttggaaaac cagtccgttc caaaccaaac atctccaaga tccgttctct tttcggctaa 240

ccagtagcag cagcagcagc agatcgagcc ttaattcaac tagaaccaac ctgcaagatc 300

caaaaaaaaa aaaaacaact gatgcagcag taataaaaga gatcacacat tcacagtggc 360

tttggttgca tcttttgcat tggtgatcac catttggagt gaccacacac actgcagatg 420

catgaactcc atcatggcga ggtgttttta ctgctgctgc ccctacacga ggaatctatc 480

cgtcagatca gatgggcctc tgggtaaaaa ttttagctat ggtggtagta gtaggagcga 540

gtaggcattt tcacgagcat gtggtgtgca cgagagaaag cgagtgagtg agtgagagcg 600

tgtgcgtagt ggcaatgtca cacgaatcgc tgtgcatctc gcgtatgatg agacgcgacg 660

cggctgtcgc tggcgcacgc gttaacctcg gactctcctg gcaacgatcg acatccgggg 720

tgggcgttca cctttccgat tgaatgtccg atccctaacc tctggcggta cgatggtttt 780

cgtcgaattc cgaccatttt ttttctttga aatttgaatg tctaggagcc attcggagtt 840

ttactcggag tctgcttttg ttccgtgtcg aaaccaaaga aattttgcgg tcttcgatcg 900

atcttcatcg gaaaaaccgt ctccgtaacg cggcgcggtg cgaggtgagt cacatactcc 960

atcaccgttt catattatac gtcgtttaac tttttctctt agtcaaaatt cttctaagtt 1020

tgactaaatt tatagaaaaa aatagcaata tctataacac gacattagtt tcattaaatt 1080

tagtattgaa tatattttga tacaatactt gttttctact ggaaatgtta ctatattttt 1140

aataaactta aataactttt cctaaaagtc agacgaatta tgatatgaaa cggaagaagt 1200

atctagcaaa ttactactct ctctgtccct ctctaaattc atagaattat gacgtgtcac 1260

atctacgtac ggagggaata aaacgtaagt gaggtgtttg aatcttctta agatgaagat 1320

gaagataaag attaagtgtt ccacgcaaaa cgaggtggta ataacgtgtg attaattagg 1380

ttttacttat tacaaacttg aataatggat taatctgata ttaatatcag agcaactttc 1440

atacaccaaa aacgccgttt agctatccaa aatgttggag aaacgaacgc agcagccaga 1500

acgtaatcca aagccgtcaa gaggaaccta atcgaaacca tatacccccg ttgcggcagc 1560

gggttggaca atatggtatt gtggccgtgg tagggagagg tggtggtgcg cgcgcggtca 1620

catgcccaac cccgcaacaa tgatcgaagc cccccctcac atgcgtggcc ggctcgcgtc 1680

gcgggcagca gcattcggcc gtgggtgccg ggagctggac atggaccatc gacacgcctt 1740

gacccacacc ccccccaccc caccaatccc ccatccctcc cgcttatttc aaccccccct 1800

ctccctctcc tcacgacacc ctgcatggca ttcgcacgcc attgacacat atctcatcat 1860

accatcacca taccacatct catctcacgc gtcccaagtg tacgtacctc tgcttgctcc 1920

ttggctttct gagctgagct gctctgcagt tggatgtgcg tgagctggtg atctgggagg 1980

agtcggagtc ggaggaggag atgcctccgg cgagggtgct cggcggcggt ggtggaggag 2040

gggggttggg ggacgaggcg ccggagctgg agaggcagat ggggtgcatg gccggcatct 2100

tccagatctt cgaccgccgc cagcgcctgc tcaccgcgcg ccgccgccgc ccgccgccca 2160

agatgctgcc cccgggccca ggttaacggc gcattttttt ttctctgcac atttcttcct 2220

gtggcatctg ctcctcttcc cctgttctgt tttcacaatc accagcttca ctccattcac 2280

acacccaaga tcatgtcagc tgcgtctcaa gcatttttac aagctgtttc tcttttcttt 2340

tccctctcta tcttggttac tgtttttaag tattactact actgtttttc ctcctaaaaa 2400

aagtgttact tttttcagtt tgtaaaaaaa ggtttttttt ttgggacata ctttctgaat 2460

tattagctgc aactcgttct gcaaatgttg accagagatt agaaaagttg ggtgcttttt 2520

ttgtgggaca gagaactact aatttcatgt gttggttgaa actcgagaga caagtccttt 2580

cagactatta ttcaaagttt ggtaacagat aacagttgga aggtgcagta gaacatgcat 2640

tggttggtaa agcagtttat tgctagtaga aagttttttt ttttaaaaaa atgctattaa 2700

ttggaaaatg ggagttttct tcacttcttc acaactgcag gatactaatt tcatctttaa 2760

ccttctttta ttgaaaacag agtacccccc tcaccctaga taaaagacaa cagtacaaaa 2820

aaacagatgg cttacagtag ttgtgatcat aaaggccttt ctttaaagaa tgtaatatgg 2880

cagcacacat tgacataagg acaggcactg acgtggattt gggtgcccag aagtagcatg 2940

aggggataac ttttcgcact gactgaaaag gacagattat cagttagtta ctaaaatttt 3000

cattaatata atgaaactga agaggacagc ttaacatttg gttttaaaat ttccattctc 3060

gtcaatgata aattaactga agaagacagc ttaacaattg attataaaac ttccattcat 3120

gtatatgatt aattgattat attattgaac aacaattaag aaaacacaca ccttttcacc 3180

gctcaaatcc atccattttg ctcataccag actgtcttaa taaatagcta taattcctca 3240

attcacagtt taggctgtaa ttataatgtc ttcttttttt tcttttctag gccatactct 3300

tccaagaagc agcagcaatg ttgcagcgca gagctcaagt acctccaaga tcgttctggt 3360

aattttccta ttcgaactcc aactgttgtt tgttaccact tgccagtaaa aaaaccatcc 3420

catgcatgca tcagaagtat actttggcca catcaagaag agtactctaa cttatggatt 3480

gcctttgcag gagaaaacat tcagcaagag catgaccgag aacagtagcc tttcaataga 3540

gtcatcaagg gcttcctgtt cttcctcctc atgctcatcc ttttcatcac ttgatggcaa 3600

caaatcgatc caacaagagc tgccatacat caacgagcag ctctttgtac agaggccact 3660

gaagagctca ccaagtctga aggacccagt catggacacc aggtctggac agtcaaacat 3720

tggcttcaga gacattgtga aggactccat taaccgggac accggaggcc ttactgtcaa 3780

gacctcggtg aaggatgcaa ggaggaatgg gcagtacaaa gactcaccaa ggcccttgct 3840

gctctccaaa tcaatggatg ggacctacgt catcgggatc gataggagca ccaaggtccc 3900

tgctaatgct gttgaatcca gcaggcgatt cccagagcag tcgcgcttct catgcgatga 3960

tcggcggctc ctgaggccag ttgaagctca agagaacaag aagccttcca caaggctcaa 4020

agagcttccc agactgtcct tggacagtag gaaagaaacc ctgagctcga gttctcgcca 4080

gaagaccttc agttacagga gaaccgacga cagtctcatg gatgctctta ggcctcaaga 4140

ttccccaggc cataggcgtg ccagcagtgt cattgccaag ctgatggggt tggaagaagc 4200

acccaatgct acaggggtgc taactgttga tagctacgag cctgaaagat caccaagacc 4260

agcagaagac acacagaagg agcatccagt accttcccct agaagatttt gtcaggatcc 4320

acgcgagtcg ctgccaaaag atgagtctcc ggcaatgaaa accaagcctt ctccaagaat 4380

tcttactgaa tctgctcctt ggaggcagca ggagaagatt gccaccagta gcaaggcttc 4440

acaatgccga gatgctgaag ttcgaccaag gactgcatct ctctatgcct acattgagag 4500

aaggggcggg gggcttgagt tcttggagtg caacaaggac ttcagggctc tcaggatact 4560

ggaagcgctg cacgcaaagg atgccaagcg ccagaacgat ggcaatggcg cattaacagt 4620

ggctgctcag caggcagggg atgcactgaa caccagttcc agacacttcc agcctcccat 4680

tgtagtcatg aagccagcaa gaagcactga gaagcagcca ggggtttcac ttgcttcagt 4740

tgatcccctt gcagggttca gaaacctcag gaagctgcag gccagagatg cgtcttgcat 4800

tggcgagcat gagaccagca caaatgagaa ggtccattct cgcatttcaa gggcacaatc 4860

caagtccgat gaacctgcta gccgtgcaag ctctccaagg cctacaggat catcaagccc 4920

caggacagtg cagcggaagg cagagtcaga aaggaggtct cgtccacctg tctcaccgaa 4980

gtccccaagc aagaagtcca gtgaagcagc ctctcctgga ggaagaacaa gaacaaagcc 5040

ttctcaaggg aagaaccacc gtgacaatga ggtctcgaag agtccaagaa gcagaatcgg 5100

catggtgaag gagatcgaca taagcatcat ggattttcaa aagcccctag catcgacacc 5160

aagtcacaag gtatacataa taaaatcaga tataaggaac cagccagttc aatcaatgtt 5220

ttttaccttg tacatcacta attagtaaat atgttctcct tttttacagg gaactccttc 5280

agttcttgct tcagatcaga agattaattc actggagaat gccccaagtc ccatctctgt 5340

cctcgacacg tcatattacc atacaagact gtcatattca ttcaaaggtg agaagttgat 5400

acagtatttt ttctgcatta agataaccaa ctgcaagaac agcaacatga tggattctac 5460

tgtttgctct cattcaatcc agaagcccat agtgtcattc aaaggacaag catagttagc 5520

tgtaagcgtg ccaatgacgc tagtgacaga taatctgcaa taaaagctac aaccaggtag 5580

cttgtggtcc tgatatgggg aggaaccaca gcagatggac tgttgcagag ttgcagctag 5640

atgaccagaa cattgttagg ttatagcaag gcccacatgt tgcacttgct tatgcaggac 5700

agcaggagca tgatgtgtgt cttctggtgt atatgcattg ctagtataga cgtgcccacc 5760

aatgtccccc tctacaaata cacctagcat gagtatgatt cagttgatcc gtagacagat 5820

agtgatatca gatctcctgt ccagtacatg tttttctgca gttgttaggt ctgataatga 5880

ataccgtatt tctgtctggt atattactat tttctgcagt tgtattgaac actggtttct 5940

gaatacatgc atatcctttt ctgcttgttc agatggggag acacattctt cagaggagtg 6000

ctggaacccg aacagcctgc ctgacacgcc acagtccaag acgagcagtg aagtcagcca 6060

gatcaaacca gaaaattttg aggccctcat ccagaagctt gagcaattgc agtcaatgaa 6120

tgatgaagtt gcaaacaaga aagatcatca gtacatttac gagatactct tagcatctgg 6180

cctcctgcac aaagaactta gcttcgtagc catgcctggt caagcatggc catcaagctg 6240

cctgatcaat ccagagctct tcctcattct tgaacaaaca aagccagatt ttgcttcagc 6300

agaccaaact gttaccaaga gctccaaagc taacacagaa aagcttcatc gaagaattgt 6360

attcgatctg gtaaacgaaa ttacagctca gaagatgaac attcattgct cggcaagtca 6420

gtcagccaag tcgcttcaat taaggaagta caacggatgg cgacttttta aggacctgtg 6480

cacagaggtt gacaggcttc aatctgagag ttcagcgata aaatgctctg aagaggatgg 6540

ggatgaaaga atgctattgg ttgaggatcc actgaatgga atagaagatt ggagcttcga 6600

tagtgaatcg ccaagcacgg ttttggagat cgaaagatta atctacaagg acctcattga 6660

cgaggtcata tgggatgagg ccacagggaa gatgcaaggt ggacagtgga acctaaagag 6720

gcagctgtca tttagtagta caagctgaat atgcttggca atacatgttt cccctaggaa 6780

gcttagcaac tacactacac tagtgaatgt aacatcttgt attttgctga agattaaact 6840

atagaagaaa tataaatatt cctcaacacg gggcctcagt gtctcactgc aactgaccct 6900

agatgaagaa gcaaccaata gagtgtccac aacattcttc tctatgtgcc ttttaaccag 6960

gacacgctct tgttctcaat ttaacaatgt attatttgtc tcatgaaaaa aggtctcacc 7020

tcaagcaata aacttaccca atattcatta gttagggata ggaagtggcc attctgcatc 7080

tgcttgccag gaacatttta cactgttata ggtaacgaga ttgccatatt ggtgataaca 7140

tccactataa gtttcaaccc tgtagttctc aaactgtttt catatcttcc ttttttttta 7200

gaaaaaagaa aaaccgcagc agccataccc cgacattcgc acgaggatat tgtcaccaaa 7260

tcaatcatcg agttagtaat ccggataagc gcattgtacg aactccatgt gagcaaacac 7320

ttctctgtat acagcatagc cacttgtc 7348

<210> 2

<211> 2823

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 2

atgcctccgg cgagggtgct cggcggcggt ggtggaggag gggggttggg ggacgaggcg 60

ccggagctgg agaggcagat ggggtgcatg gccggcatct tccagatctt cgaccgccgc 120

cagcgcctgc tcaccgcgcg ccgccgccgc ccgccgccca agatgctgcc cccgggccca 180

ggccatactc ttccaagaag cagcagcaat gttgcagcgc agagctcaag tacctccaag 240

atcgttctgg agaaaacatt cagcaagagc atgaccgaga acagtagcct ttcaatagag 300

tcatcaaggg cttcctgttc ttcctcctca tgctcatcct tttcatcact tgatggcaac 360

aaatcgatcc aacaagagct gccatacatc aacgagcagc tctttgtaca gaggccactg 420

aagagctcac caagtctgaa ggacccagtc atggacacca ggtctggaca gtcaaacatt 480

ggcttcagag acattgtgaa ggactccatt aaccgggaca ccggaggcct tactgtcaag 540

acctcggtga aggatgcaag gaggaatggg cagtacaaag actcaccaag gcccttgctg 600

ctctccaaat caatggatgg gacctacgtc atcgggatcg ataggagcac caaggtccct 660

gctaatgctg ttgaatccag caggcgattc ccagagcagt cgcgcttctc atgcgatgat 720

cggcggctcc tgaggccagt tgaagctcaa gagaacaaga agccttccac aaggctcaaa 780

gagcttccca gactgtcctt ggacagtagg aaagaaaccc tgagctcgag ttctcgccag 840

aagaccttca gttacaggag aaccgacgac agtctcatgg atgctcttag gcctcaagat 900

tccccaggcc ataggcgtgc cagcagtgtc attgccaagc tgatggggtt ggaagaagca 960

cccaatgcta caggggtgct aactgttgat agctacgagc ctgaaagatc accaagacca 1020

gcagaagaca cacagaagga gcatccagta ccttccccta gaagattttg tcaggatcca 1080

cgcgagtcgc tgccaaaaga tgagtctccg gcaatgaaaa ccaagccttc tccaagaatt 1140

cttactgaat ctgctccttg gaggcagcag gagaagattg ccaccagtag caaggcttca 1200

caatgccgag atgctgaagt tcgaccaagg actgcatctc tctatgccta cattgagaga 1260

aggggcgggg ggcttgagtt cttggagtgc aacaaggact tcagggctct caggatactg 1320

gaagcgctgc acgcaaagga tgccaagcgc cagaacgatg gcaatggcgc attaacagtg 1380

gctgctcagc aggcagggga tgcactgaac accagttcca gacacttcca gcctcccatt 1440

gtagtcatga agccagcaag aagcactgag aagcagccag gggtttcact tgcttcagtt 1500

gatccccttg cagggttcag aaacctcagg aagctgcagg ccagagatgc gtcttgcatt 1560

ggcgagcatg agaccagcac aaatgagaag gtccattctc gcatttcaag ggcacaatcc 1620

aagtccgatg aacctgctag ccgtgcaagc tctccaaggc ctacaggatc atcaagcccc 1680

aggacagtgc agcggaaggc agagtcagaa aggaggtctc gtccacctgt ctcaccgaag 1740

tccccaagca agaagtccag tgaagcagcc tctcctggag gaagaacaag aacaaagcct 1800

tctcaaggga agaaccaccg tgacaatgag gtctcgaaga gtccaagaag cagaatcggc 1860

atggtgaagg agatcgacat aagcatcatg gattttcaaa agcccctagc atcgacacca 1920

agtcacaagg gaactccttc agttcttgct tcagatcaga agattaattc actggagaat 1980

gccccaagtc ccatctctgt cctcgacacg tcatattacc atacaagact gtcatattca 2040

ttcaaagatg gggagacaca ttcttcagag gagtgctgga acccgaacag cctgcctgac 2100

acgccacagt ccaagacgag cagtgaagtc agccagatca aaccagaaaa ttttgaggcc 2160

ctcatccaga agcttgagca attgcagtca atgaatgatg aagttgcaaa caagaaagat 2220

catcagtaca tttacgagat actcttagca tctggcctcc tgcacaaaga acttagcttc 2280

gtagccatgc ctggtcaagc atggccatca agctgcctga tcaatccaga gctcttcctc 2340

attcttgaac aaacaaagcc agattttgct tcagcagacc aaactgttac caagagctcc 2400

aaagctaaca cagaaaagct tcatcgaaga attgtattcg atctggtaaa cgaaattaca 2460

gctcagaaga tgaacattca ttgctcggca agtcagtcag ccaagtcgct tcaattaagg 2520

aagtacaacg gatggcgact ttttaaggac ctgtgcacag aggttgacag gcttcaatct 2580

gagagttcag cgataaaatg ctctgaagag gatggggatg aaagaatgct attggttgag 2640

gatccactga atggaataga agattggagc ttcgatagtg aatcgccaag cacggttttg 2700

gagatcgaaa gattaatcta caaggacctc attgacgagg tcatatggga tgaggccaca 2760

gggaagatgc aaggtggaca gtggaaccta aagaggcagc tgtcatttag tagtacaagc 2820

tga 2823

<210> 3

<211> 940

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 3

Met Pro Pro Ala Arg Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu

1 5 10 15

Gly Asp Glu Ala Pro Glu Leu Glu Arg Gln Met Gly Cys Met Ala Gly

20 25 30

Ile Phe Gln Ile Phe Asp Arg Arg Gln Arg Leu Leu Thr Ala Arg Arg

35 40 45

Arg Arg Pro Pro Pro Lys Met Leu Pro Pro Gly Pro Gly His Thr Leu

50 55 60

Pro Arg Ser Ser Ser Asn Val Ala Ala Gln Ser Ser Ser Thr Ser Lys

65 70 75 80

Ile Val Leu Glu Lys Thr Phe Ser Lys Ser Met Thr Glu Asn Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Ile Glu Ser Ser Arg Ala Ser Cys Ser Ser Ser Ser Cys Ser

100 105 110

Ser Phe Ser Ser Leu Asp Gly Asn Lys Ser Ile Gln Gln Glu Leu Pro

115 120 125

Tyr Ile Asn Glu Gln Leu Phe Val Gln Arg Pro Leu Lys Ser Ser Pro

130 135 140

Ser Leu Lys Asp Pro Val Met Asp Thr Arg Ser Gly Gln Ser Asn Ile

145 150 155 160

Gly Phe Arg Asp Ile Val Lys Asp Ser Ile Asn Arg Asp Thr Gly Gly

165 170 175

Leu Thr Val Lys Thr Ser Val Lys Asp Ala Arg Arg Asn Gly Gln Tyr

180 185 190

Lys Asp Ser Pro Arg Pro Leu Leu Leu Ser Lys Ser Met Asp Gly Thr

195 200 205

Tyr Val Ile Gly Ile Asp Arg Ser Thr Lys Val Pro Ala Asn Ala Val

210 215 220

Glu Ser Ser Arg Arg Phe Pro Glu Gln Ser Arg Phe Ser Cys Asp Asp

225 230 235 240

Arg Arg Leu Leu Arg Pro Val Glu Ala Gln Glu Asn Lys Lys Pro Ser

245 250 255

Thr Arg Leu Lys Glu Leu Pro Arg Leu Ser Leu Asp Ser Arg Lys Glu

260 265 270

Thr Leu Ser Ser Ser Ser Arg Gln Lys Thr Phe Ser Tyr Arg Arg Thr

275 280 285

Asp Asp Ser Leu Met Asp Ala Leu Arg Pro Gln Asp Ser Pro Gly His

290 295 300

Arg Arg Ala Ser Ser Val Ile Ala Lys Leu Met Gly Leu Glu Glu Ala

305 310 315 320

Pro Asn Ala Thr Gly Val Leu Thr Val Asp Ser Tyr Glu Pro Glu Arg

325 330 335

Ser Pro Arg Pro Ala Glu Asp Thr Gln Lys Glu His Pro Val Pro Ser

340 345 350

Pro Arg Arg Phe Cys Gln Asp Pro Arg Glu Ser Leu Pro Lys Asp Glu

355 360 365

Ser Pro Ala Met Lys Thr Lys Pro Ser Pro Arg Ile Leu Thr Glu Ser

370 375 380

Ala Pro Trp Arg Gln Gln Glu Lys Ile Ala Thr Ser Ser Lys Ala Ser

385 390 395 400

Gln Cys Arg Asp Ala Glu Val Arg Pro Arg Thr Ala Ser Leu Tyr Ala

405 410 415

Tyr Ile Glu Arg Arg Gly Gly Gly Leu Glu Phe Leu Glu Cys Asn Lys

420 425 430

Asp Phe Arg Ala Leu Arg Ile Leu Glu Ala Leu His Ala Lys Asp Ala

435 440 445

Lys Arg Gln Asn Asp Gly Asn Gly Ala Leu Thr Val Ala Ala Gln Gln

450 455 460

Ala Gly Asp Ala Leu Asn Thr Ser Ser Arg His Phe Gln Pro Pro Ile

465 470 475 480

Val Val Met Lys Pro Ala Arg Ser Thr Glu Lys Gln Pro Gly Val Ser

485 490 495

Leu Ala Ser Val Asp Pro Leu Ala Gly Phe Arg Asn Leu Arg Lys Leu

500 505 510

Gln Ala Arg Asp Ala Ser Cys Ile Gly Glu His Glu Thr Ser Thr Asn

515 520 525

Glu Lys Val His Ser Arg Ile Ser Arg Ala Gln Ser Lys Ser Asp Glu

530 535 540

Pro Ala Ser Arg Ala Ser Ser Pro Arg Pro Thr Gly Ser Ser Ser Pro

545 550 555 560

Arg Thr Val Gln Arg Lys Ala Glu Ser Glu Arg Arg Ser Arg Pro Pro

565 570 575

Val Ser Pro Lys Ser Pro Ser Lys Lys Ser Ser Glu Ala Ala Ser Pro

580 585 590

Gly Gly Arg Thr Arg Thr Lys Pro Ser Gln Gly Lys Asn His Arg Asp

595 600 605

Asn Glu Val Ser Lys Ser Pro Arg Ser Arg Ile Gly Met Val Lys Glu

610 615 620

Ile Asp Ile Ser Ile Met Asp Phe Gln Lys Pro Leu Ala Ser Thr Pro

625 630 635 640

Ser His Lys Gly Thr Pro Ser Val Leu Ala Ser Asp Gln Lys Ile Asn

645 650 655

Ser Leu Glu Asn Ala Pro Ser Pro Ile Ser Val Leu Asp Thr Ser Tyr

660 665 670

Tyr His Thr Arg Leu Ser Tyr Ser Phe Lys Asp Gly Glu Thr His Ser

675 680 685

Ser Glu Glu Cys Trp Asn Pro Asn Ser Leu Pro Asp Thr Pro Gln Ser

690 695 700

Lys Thr Ser Ser Glu Val Ser Gln Ile Lys Pro Glu Asn Phe Glu Ala

705 710 715 720

Leu Ile Gln Lys Leu Glu Gln Leu Gln Ser Met Asn Asp Glu Val Ala

725 730 735

Asn Lys Lys Asp His Gln Tyr Ile Tyr Glu Ile Leu Leu Ala Ser Gly

740 745 750

Leu Leu His Lys Glu Leu Ser Phe Val Ala Met Pro Gly Gln Ala Trp

755 760 765

Pro Ser Ser Cys Leu Ile Asn Pro Glu Leu Phe Leu Ile Leu Glu Gln

770 775 780

Thr Lys Pro Asp Phe Ala Ser Ala Asp Gln Thr Val Thr Lys Ser Ser

785 790 795 800

Lys Ala Asn Thr Glu Lys Leu His Arg Arg Ile Val Phe Asp Leu Val

805 810 815

Asn Glu Ile Thr Ala Gln Lys Met Asn Ile His Cys Ser Ala Ser Gln

820 825 830

Ser Ala Lys Ser Leu Gln Leu Arg Lys Tyr Asn Gly Trp Arg Leu Phe

835 840 845

Lys Asp Leu Cys Thr Glu Val Asp Arg Leu Gln Ser Glu Ser Ser Ala

850 855 860

Ile Lys Cys Ser Glu Glu Asp Gly Asp Glu Arg Met Leu Leu Val Glu

865 870 875 880

Asp Pro Leu Asn Gly Ile Glu Asp Trp Ser Phe Asp Ser Glu Ser Pro

885 890 895

Ser Thr Val Leu Glu Ile Glu Arg Leu Ile Tyr Lys Asp Leu Ile Asp

900 905 910

Glu Val Ile Trp Asp Glu Ala Thr Gly Lys Met Gln Gly Gly Gln Trp

915 920 925

Asn Leu Lys Arg Gln Leu Ser Phe Ser Ser Thr Ser

930 935 940

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cgatgctagg ggcttttg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ccagcctccc attgtagt 18

Claims (1)

1.一种分子标记引物在筛选降低水稻垩白率、降低水稻垩白度、增加水稻穗长和减小水稻着粒密度的水稻中的应用；

所述分子标记引物由左引物和右引物组成，

所述左引物：CGATGCTAGGGGCTTTTG；

所述右引物：CCAGCCTCCCATTGTAGT。