CN106046132A - 水稻RPS3a基因及其编码蛋白的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了水稻RPS3a基因及其编码蛋白的应用，属于基因工程领域。水稻RPS3a基因序列如SEQ ID No.2所示，其编码蛋白序列如SEQ ID No.1所示。本发明通过对水稻突变体sd110图位克隆得到RPS3a基因。RPS3a基因在水稻植株中广泛表达，其中幼嫩组织中表达量较高。RPS3a基因具有控制水稻叶型、株高等功能，有望对水稻株型进行定向设计，改善叶片光合速率，以提高水稻产量。

Description

水稻RPS3a基因及其编码蛋白的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及水稻RPS3a基因、其编码蛋白及应用。
背景技术
水稻是世界上重要的粮食作物之一，随着耕地面积的减少和人口的增多，培育高产稳产的水稻品种成为一个重要的育种目标。水稻叶片的形态是水稻植株器官发生和形态形成的一个重要组成部分，直接影响水稻株型和农业产量的形成。叶片是植物进行光合作用和呼吸作用的主要器官，绿色植物物质积累中有90％-95％来自作物叶片的光合作用，植物通过叶片进行光合作用，高效吸收光能，最终将光能转化为可供植物生长所用的生物能，叶片形态对整个植株的生命活动有着重要的影响。因此，叶片性状成为水稻高产育种及株型改良过程中关注的焦点。
目前的高产及超高产水稻品种，包括杂交稻，在叶片形态上往往表现出叶片较长较宽，叶面积较大，但是叶源大的叶片往往因叶脉支持力不足导致叶片披垂，上部叶片的披垂会影响整个植株以至群体的透光情况，最终会导致光合效率降低，从而影响最终产量。窄叶在一定程度上有利于保持叶片直立，从而有助于减少叶片披垂。叶片发育是一个复杂的生物学过程，可人为将其划分为两个阶段，即叶原基的起始和叶轴性的建立。茎顶端分生组织(shoot apical meristem，SAM)是植物地上器官，如叶、花和枝节的发育源泉，其主要通过一系列的网络调控及激素信号的改变，使位于顶端的干细胞群由多潜能性朝着定向分化的方向发育，从而在其周边区分化出叶原基。再沿着近-远轴、基-顶轴和中-侧轴三个极性的轴性发育，最终形成完整的叶片。在这些过程中发育发生异常，将直接或间接地影响叶片的形态建成，从而导致各种畸形叶的产生。
水稻窄叶突变性状主要是受质量性状基因控制。目前，根据Gramene网站和Oryzabase数据库报道的窄叶突变体大约有11个，nal1，nrl1，nal2，nal3，nal4，nal5，nal6，nal7，nal8，nal9，nal10，以单基因控制为主，主要分布在第1、3、4、11、12号染色体上，且以第3、4号染色体居多，其中NAL1、NAL2/3、NAL7和NRL1已完成了基因克隆和部分功能分析。
NAL1编码一个生长素极性运输相关的植物特异蛋白,能够影响茎秆维管系统和叶脉数目的发育,该基因突变后可造成植株矮化和窄叶等表型。NAL2/3基因是WUSCHEL-related homeobox(WOX)的两个同源基因，NAL2和NAL3分别定位在第11，12号染色体上。单独nal2和nal3突变体在叶片形态上没有任何缺陷，只有在nal2/3双突变体中叶片才会表现出窄叶，分蘖数增加，侧根数变少等性状，从幼苗期到成熟期，突变体的叶片宽度都明显变窄。NAL2/3主要在维管束组织中起作用，研究已表明，NAL2/3是玉米NS1/2基因和拟南芥PRS基因的直系同源基因，这三个基因在SAM侧域器官生成细胞的聚集过程中起作用。SAM大小的改变直接影响了叶片生成细胞的聚集，叶片生成细胞存在缺陷也极大地影响了叶片最终形态。NAL7与OsCOW1(constitutively wilted 1)是等位基因，编码一个YUCCA家族蛋白的含黄素单氧化酶，该酶与YUCCA具有序列同源性，是COW1的等位基因，能够通过调控植株生长素的生物合成，从而影响叶片的宽度。位于第12号染色体的NRL1(narrow and rolledleaf 1)则编码一个纤维素合酶类似蛋白OsCSLD4(cellulose synthase-like proteinD4)，能够影响植物细胞壁的生物合成，该基因突变后可导致植株出现窄叶微卷表型。
此外，还有一些与核糖体发育相关的基因突变后也会使植株表现出生长延缓，如叶片变窄等突变性状。目前水稻中还没有关于编码核糖体蛋白基因突变影响叶片发育的报道，而在拟南芥中对此研究的比较深入，已发现了48个核糖体蛋白家族(S2，S3，S6，L4，L5，L6，L7a，L8等)，主要研究特殊核糖体蛋白的功能。在某些情况，核糖体蛋白(ribosomalproteins,RPs)基因的突变体影响DNA复制，RNA加工和DNA修饰。从目前的研究成果看，核糖体蛋白突变会引起生长停滞或延缓，最终导致物种生长发育有缺陷。这些都证明了RPs在蛋白质翻译过程中的作用。拟南芥pfl1(pointed first leaf 1)突变体表现为剑叶变窄，生长延缓，根系生长明显被抑制，且突变体的生长周期延长了10天左右。突变体rpl27ac-1d是半显性突变体，表现为叶片变尖，胚胎发育延缓，其胚胎的顶端结构发育显著延缓和分生组织中组织特异性基因的错误表达。RPL27aC基因的突变造成远轴基因FILAMENTOUS FLOWER(FIL)的延迟表达和对生长素向外转运蛋白PIN-FORMED1(PIN1)的错误调控，从而导致子叶原基在最初和最终生长表现出延缓发育。
发明内容
本发明的目的是提供水稻RPS3a基因及其编码蛋白的应用。
本发明首先提供水稻RPS3a蛋白，其为：
1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
2)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
本发明提供了编码水稻RPS3a蛋白的基因。
进一步地，上述基因其具有：
1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
2)SEQ ID No.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或
3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
本发明提供了含有上述基因的载体。
本发明提供了含有上述载体的宿主细胞。
含有上述述基因或其特异片段的转化植物细胞也属于本发明的保护范围。
本发明提供了水稻RPS3a蛋白或其编码基因在制备转基因植物中的应用。
优选地，所述植物为水稻。
本发明提供了水稻RPS3a蛋白或其编码基因在水稻遗传育种中的应用。
本发明提供了水稻RPS3a蛋白或其编码基因在水稻种质资源改良中的应用。
本发明提供了水稻RPS3a蛋白或其编码基因在提高水稻产量中的应用。
本发明还提供了一种水稻RPS3a基因突变体，水稻RPS3a基因编码区的第二内含子5’端拼接点处，由GT突变为AT，所述水稻RPS3a基因含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明提供了含有上述基因突变体的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞或表达盒。
本发明提供了检测水稻RPS3a基因的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ IDNO.36-37所示。
本发明提供了上述特异性引物对在检测水稻RPS3a基因中的应用，具体为使用上述特异性引物对对待测水稻DNA进行扩增，若扩增条带大小为1965bp，则待测水稻RPS3a基因为野生型；若扩增条带有两条，且大小分别为789bp和1596bp，则待测水稻RPS3a基因第二内含子5’端拼接点处发生GT突变为AT。
本发明的优点在于：(1)本发明提供了水稻RPS3a基因(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)及其编码的蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)。该基因编码一个核糖体蛋白小亚基，目前在水稻中研究甚少，是一个新的研究方向。
(2)通过转化水稻突变体sd110，发现互补转基因植株表现出野生型的表型，同时通过转化水稻野生型SD808，发现RNAi转基因植株表现出突变体的表型，因而RPS3a基因具有控制水稻叶型的功能，有望对水稻叶片的形成进行调控进而对株型定向设计，改善叶片光合速率，以提高水稻产量。
附图说明
图1为野生型圣稻808与突变体sd110的表型。A图为株高；B图为剑叶叶长；C图为穗茎节；D图为剑叶叶宽；E图为主茎穗型。
图2为野生型圣稻808与突变体sd110的叶型。A、B、C图分别为倒一叶、倒二叶和倒三叶整体叶型；D、E、F图分别为倒一叶、倒二叶和倒三叶叶宽。
图3为野生型圣稻808与突变体sd110的叶脉分析。A,C,E图分别为野生型倒一、倒二和倒三叶叶脉；B,D,F图分别为突变体倒一、倒二和倒三叶叶脉；G图为大叶脉数目比较；H图为小叶脉数目比较。
图4为野生型圣稻808与突变体sd110的细胞大小和数目。A,B,C图分别为野生型倒一、倒二和倒三叶下表皮细胞；D,E,F图分别为突变体倒一、倒二和倒三叶下表皮细胞；G图为沿叶片宽度方向上叶片下表皮细胞宽度；H图为沿叶片宽度方向上叶片下表皮细胞数目。
图5为RPS3a图位克隆结果与半定量分析。A图为目标基因的图位克隆；B图为候选基因LOC_Os03g10340的基因结构及突变位点；C图为除Marker外，由左及右分别为野生型基因组DNA和cDNA、突变体cDNA的PCR扩增结果。
图6为水稻互补和干扰转基因植株的表型及数据分析。A图互补转基因整体株型；B-D图为互补转基因整体叶片；E-G图为互补转基因局部叶片；H图为干扰转基因植株；I-K图为干扰转基因整体叶片；L-N图为干扰转基因局部叶片；O图为植株高度比较；P图为叶片长度比较；Q图为叶片宽度比较。
图7为水稻GUS-RPS3a基因转化水稻植物的植株染色及定量PCR结果。A图幼叶、B图成熟叶、C-D图成熟根、E图幼嫩及成熟分蘖芽、F图成熟茎干、G-I图幼嫩穗、J图成熟穗、K图不同组织中RPS3A的表达量比较。
图8为RPS3a的亚细胞定位结果。A图为转基因植株整体株型；B图为转基因植株叶片表型；C图为植株高度比较；D图为叶片长度比较；E图为叶片宽度比较；F图为亚细胞定位结果，A-E图中，由左及右分别为WT空白对照，突变体sd110及转基因植株line-1、line-2。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的水稻(Oryza sativa)品种圣稻808(SD808)，籼稻品种Dualr，Shiokari为标准品种，水稻窄叶突变体sd110来自中国农业科学院作物科学研究所。
实施例1 突变体的获得与表型分析
突变体sd110是经EMS诱变粳稻品种圣稻808(SD808)得到的。本实施例中选用甲基磺酸乙酯(EMS)作为诱变剂，挑选籽粒饱满的野生型SD808种子置于网袋中，清水浸种8-10h后，清洗数次后沥干，将沥干的种子浸没于新鲜配制的2.0％的EMS溶液中，然后置于28℃恒温培养箱中，10h后将网袋取出，然后用清水冲洗种子数次，尽可能洗去残留在种子表面的处理液。将种子放入37℃恒温培养箱中催芽，2-3天出芽后即可移栽至大田育秧。因为EMS诱变剂具有强致癌性，所以进行处理时用特别注意，避免徒手接触。此外，该诱变剂见光分解，容易发生光化学反应，诱变时应注意避光进行。突变体sd110表型上与野生型相比有着多方面的改变。在成熟期时，突变体sd110主要突变性状表现在叶片大小上，包括叶长变短，叶宽变窄，其中叶片宽度在倒一叶、倒二叶、倒三叶上有不同程度的减少，相对于野生型分别减少了30.0％、50.2％和64.6％，倒三叶的突变表型更为严重，三者叶片长度变化一致，通过表型观察发现，突变没有导致叶片整体形态发生变化(见图2)；此外，与野生型相比，突变体株高也明显降低50％，主要是穗长、穗茎节、第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV、V茎节长度有不同程度缩短、茎节数目减少造成的，其主茎穗长及茎节长度分别缩短了22.7％、33.9％、44.1％、59.1％、68.6％、80.3％，在数目上，突变体缺失了第V茎节；同时突变体还表现出主茎穗粒数减少，结实率降低，但籽粒大小和形状并无明显差异，分蘖数目也无明显变化(见图1)。
实施例2 突变体叶片细胞学观察
为了明确突变体sd110叶型在细胞学上的变化，本发明通过徒手切片和刮除叶片上表皮细胞，寻求突变体叶脉与细胞大小的变化规律。通过比较野生型与突变体倒一叶，倒二叶和倒三叶的大、小叶脉数目，发现突变体大叶脉数目分别减少了5％、14％和14.6％，小叶脉数目分别减少了20.3％、24％和33.9％，数据显示突变体小叶脉数目的变化幅度比大叶脉显著，且在倒三叶上差异率达到最大，证明突变体sd110叶片宽度的变化主要是由于小叶脉数目减少造成的，同时在显微镜下观察到突变体倒二、倒三叶片边缘粗大，推测突变体叶片在发育过程中存在一定缺陷(见图3)。此外，又进一步研究叶片变窄与叶片下表皮细胞大小之间的关系，在显微镜下观察和测量细胞宽度(沿叶片宽度方向)，结合实际叶片宽度，计算出叶片下表皮细胞数目。通过比较不同位置野生型和突变体叶片的细胞大小和数目，发现突变体的细胞宽度和细胞数目均小于野生型细胞，突变体的细胞宽度分别减少了34.62％、29.86％和46.32％，且在倒三叶变异程度达到最大，细胞总数目分别减少了52.76％、50.28％和66.94％，且在倒三叶变异程度达到最大。这些数据表明突变体sd110倒三叶表型最为明显，而且叶片宽度变窄与细胞宽度缩短、细胞数目减少有关，其中细胞数目减少起关键作用(见图4)。
实施例3 水稻RPS3a基因的获得
本发明的RPS3a基因是采用图位克隆法通过突变体sd110克隆得到的。经EMS诱变得到的突变体sd110经过多代自交种植确认该突变具有稳定遗传的特性。纯合突变体sd110与正常表型的籼稻Dular进行杂交，所有杂交F1中个体均无窄叶表型。在F2种植群体中出现了明显分离，通过调查分析，发现在3个不同群体中野生型与突变体的分离比列符合3:1遗传分离比例。(χ2<χ20.05＝3.84)。由此可以推测，该水稻窄叶突变体的突变性状是由1对隐性基因控制的。
为了定位控制该窄叶突变体基因的位置，利用突变体sd110构建的F2分离群体作为定位群体，以BSA(集团分离分析)法选取10株F2突变单株构建DNA混池，利用能较均匀覆盖水稻12条染色体的170对Indel标记对两个亲本与基因混池进行多态性筛选，结果发现在第3染色体上的标记R3-2，R3-3表现出连锁性，对10株F2突变株进行连锁分析，证明两个标记均与目标性状连锁。用这两标记及两侧标记R3-1与R3-4扩增23株F2群体突变体单株，R3-1、R3-2、R3-3、R3-4分别筛选出10、1、0、3个交换单株，说明目标基因位于标记R3-2和R3-3之间。由于交换个体较少，且范围太大，为了能将基因定位在更小的范围内，在R3-2和R3-3之间设计更多新的Indel标记，并对F2群体232个突变表型明显的单株进行分析，最终在标记C3-5与C3-6只有2和3株交换个体，结果表明该基因位于C3-5和C3-6之间，物理距离为59kb。
根据MSU Rice Genome Annotation Release 7(http://rice.plantbiology.msu.edu)上提供的基因注释信息，在定位区间内共有15个ORFs。其中6个表达蛋白，2个预测蛋白，7个预测功能基因。重点对7个预测功能基因进行测序分析，并结合突变体sd110的突变性状，发现是基因RPS3a(LOC_Os03g10340)发生突变。根据预测的基因结构，RPS3a基因共有6个外显子和5个内含子，基因组全长3090bp(SEQ ID NO.52)，CDS区789 bp，总共编码262个氨基酸，该基因编码一个核糖体40S小亚基蛋白S3a。在拟南芥中，已克隆研究了一系列核糖体蛋白(ribosomal protein,RP)基因，它们对叶片性状的改变有至关重要的作用。
通过对野生型SD808和突变体sd110基因组DNA进行测序分析，该突变位点位于第二内含子5’端拼接点处，由GT突变为AT，可能导致外显子不能够正常拼接。因此本发明设计一对cDNA特异性扩增引物Os10340g-CDSF/R，对野生型SD808基因组DNA、野生型SD808cDNA、突变体sd110 cDNA分别进行PCR扩增，预测条带大小分别为1965bp(SEQ ID NO.2)，789bp，1596bp，经琼脂糖电泳检测，发现突变体sd110 cDNA有两条不同大小的条带，条带1是预测到的条带，是由于突变导致内含子无法正常拼接掉，外显子变长；预测外的条带2则与野生型SD808 cDNA条带大小基本一致，疑似突变产生新的拼接错误。经测序显示，该基因在原有的第二内含子拼接处前8个碱基又识别了一个新的拼接点。以上结果表明，突变确实导致内含子拼接错误，共分为两种：一种是由于突变导致第二内含子拼接点缺失，造成外显子增多；另一种是基因通过自身修复识别到新的拼接点，造成读码框错乱，从而氨基酸序列发生改变，最终导致蛋白翻译发生严重错误，这两者都导致基因不能够正常转录和翻译(见图5)。引物序列如表1所示，精细定位区间内的基因如表2所示。
表1 实施例3中涉及的引物序列
表2 实施例3中精细定位区间内的全部基因及相关基因信息
实施例4 RPS3a蛋白的生物信息学分析
本发明明确基因发生两种突变类型后，在进行生物信息学分析时以第二种基因突变为主。根据野生型和突变体蛋白质序列，利用生物信息学相关网站和软件进行了一系列预测分析。首先在Jpred网站(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/)上预测野生型核糖体40S小亚基蛋白S3a(RPS3a)二级结构，发现RPS3a中只含有最常见的α-螺旋(α-helix)和β折叠(beta sheet)结构，无复杂的二级结构。随后利用软件Swiss-PdbViewer4.1.0进一步预测野生型和突变体蛋白质的三级结构，比较后发现野生型蛋白质由7个His α-螺旋和5个β折叠结构组成，突变体蛋白质仅含有3个较为短小的α-螺旋和4个β折叠结构，由此推测基因突变后导致蛋白质缺失了3个长α-螺旋、一个小α-螺旋和一个短小β折叠结构。由于α-螺旋(α-helix)是蛋白质二级结构的主要形式之一，在DNA结合基序(DNAbinding motif)中有非常重要的作用，它的缺失或改变会严重影响生物体最终形态，故得出结论rps3a基因突变后导致三个主要α-螺旋结构全部缺失，蛋白质结构发生严重变化，从而产生突变体严重的叶片和株型表型。
将野生型核糖体40S小亚基蛋白S3a(RPS3a)氨基酸序列在NCBI上BLAST，获得单、双子叶植物(Arabidopsis thaliana、Maize、Soybean、Sorghum、Sugar cane、Tobacco、Medicago)中与其同源性最高的蛋白质序列，在MEGA 6中采用Clustal W方法对序列进行比对。结果表明突变造成位于保守区域的第55位氨基酸之后的氨基酸序列完全改变，从而导致了植株形态发生明显变化。进化树分析得知，该蛋白质与其它三个单子叶植物(Maize、Sorghum、Sugar cane)同源性最高。
实施例5 水稻RPS3a基因的功能验证
本发明为了进一步验证RPS3a基因功能，分别构建了目的基因的功能互补载体和RNAi干扰载体，并分别转化突变体sd110和野生型SD808(其中互补载体的构建是将目的基因基因组DNA分为两个片段S1和S2，分别使用引物Hubu-S1EBF/R和Hubu-S2BPF/R进行扩增，重组到pCAMBIA1305.1载体中。而干扰载体的构建是使用引物RNAi-SacIF/R和RNAi-SnaBIF/R将扩增的两个片段，分别重组到1390RNAi载体中)。最终获得了7个转基因功能互补T0代株系和5个RNAi T0代株系。待植株达到成熟时，调查统计了不同株系的表型数据(株高、不同位置的叶片长度和宽度)，发现5个转基因互补株系的株高和叶片性状均能够恢复成野生型表型，证明该基因确为目的基因，并且4个RNAi干扰株系表现出叶片变窄、植株矮小，与突变体表型相似，进一步证实RPS3a基因功能的缺失确实能够产生突变体性状(见图6)。
本实施例中涉及的引物序列如下所示，互补和干扰载体各分两步构建(方框内代表酶切位点)。
Hubu-S1EBF:CCATGATTACGTGTGAGGCTGCAACA
Hubu-S1EBR:CGACTCTAGACTTCTTCCCCTTGGA
Hubu-S2BPF:GGGGAAGAAGAAGAAGAAGACGTGA
Hubu-S2BPR:GTCACCAATTCATGTCGATCGCAAGAA
RNAi-SacIF:TTCTGCACTAGGTACCAGGCCTGTTTCTCCTCGCCG
RNAi-SacIR:CTGACGTAGGGGCGATAGAGCTCAGATCAGCTAAG
RNAi-SnaBIF:CGGGGATCCGTCGACTACTTTCTCCTCGCCGCTTC
RNAi-SnaBIR:AGGTGGAAGACGCGTTACAGATCAGCTAAGGAG
实施例6 水稻RPS3a基因表达模式
提取粳稻品种日本晴在不同时期的不同组织(种子、根、茎、茎节、颖壳、叶片、叶枕、叶鞘、穗)的RNA，反转录为cDNA进行Real-time PCR(RT-PCR)，以水稻Ubiquitin基因为内参，检测RPS3a基因在水稻不同组织中的表达差异，结果显示，RPS3a基因广泛在水稻各组织中表达，其中在叶片、叶鞘、茎、种子和穗中的表达量相对较高，在种子、茎节、颖壳中表达量较低。为了进一步验证RPS3a基因的时空表达模式，本发明构建了RPS3aprom:GUS载体(构建过程中使用引物PromENF/R扩增目的基因启动子序列，重组到pCAMBIA1305.1载体EcoRI和NcoI位点中)，并转化了水稻Shiokari品种，对已获得的2个T0代转基因水稻株系进行组织化学GUS染色，结果两个株系均能检测到GUS活性。从染色结果中发现，RPS3a在幼嫩组织中的表达量比较高，如幼叶，幼穗，幼嫩分蘖芽，根尖和侧根发生处，尤其在幼穗中的表达量极高。在成熟组织中几乎不表达，如老叶，成熟茎等(见图7)。
本实施例中涉及的引物序列如下所示(方框内代表酶切位点)。
PromENF:CCATGATTACGTATCTGAACTCACACGC
PromENR:CTCAGATCTAAGATGCGCTTGTTCTTAC
实施例7 水稻RPS3a的亚细胞定位
为了准确进行RPS3a的亚细胞定位，本发明构建了RPS3a与绿色荧光蛋白基因GFP的融合表达载体并转化突变体sd110，得到Actinprom:RPS3a-GFP转基因植株(line-1，line-2)(构建过程中使用引物10340CDSEKF/R扩增目的基因CDS序列，使用引物ActinPromEEF/R扩增Actin基因的promoter，将这两个片段重组到pCAMBIA1305.1载体中)。在田间统计野生型SD808，突变体sd110及转基因植株line-1，line-2的农艺性状，发现转基因植株不论是在株高，还是叶片长度、宽度，都恢复至野生型大小，从而证明该融合表达载体ActinpromRPS3a-GFP不影响RPS3a功能。
随后我们提取转基因植株Actinprom:RPS3a-GFP叶片的原生质体，用特异染料染色后观察定位结果。在真核细胞中，核糖体分为游离在细胞质中的游离核糖体和附着在内质网表面的附着核糖体，并且核糖体的体积较小，大量存在于线粒体、叶绿体和细胞质中。由于核糖体体积小，分布广，移动性强，同时目前市场上没有核糖体特异性染料，故本发明选用LifeTechnology公司生产的ER-Tracker Red内质网染料进行特异性染色，在波长λ＝587-615nm激发下，观察发现内质网呈红色，与GFP绿色荧光信号融合后呈黄色，最终确定该蛋白定位于内质网上(见图8)。
本实施例中涉及的引物序列如下所示，分两步构建载体(方框内代表酶切位点)。
10340CDSEKF:CCATGATTACATGGCCGTAGGTAA
10340CDSEKR:CCCTTGCTCACCATATACTCGGCAGCA
ActinPromEEF:CCATGATTACACCGTCATTCATATGCT
ActinPromEER:CTACGGCCATCTTCTACCTACAAAAA
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.水稻RPS3a蛋白，其特征在于，其具有：
1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
2)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因，其具有：
1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
2)SEQ ID No.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或
3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述基因的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞或表达盒。
4.权利要求1所述水稻RPS3a蛋白或其编码基因在制备转基因植物中的应用。
5.权利要求1所述水稻RPS3a蛋白或其编码基因在水稻遗传育种中的应用。
6.水稻RPS3a蛋白或其编码基因在提高水稻产量中的应用。
7.一种水稻RPS3a基因突变体，其特征在于，水稻RPS3a基因编码区的第二内含子5’端拼接点处，由GT突变为AT，所述水稻RPS3a基因含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
8.含有权利要求7所述基因突变体的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞或表达盒。
9.检测水稻RPS3a基因的特异性引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.36-37所示。
10.权利要求9所述的特异性引物对在检测水稻RPS3a基因中的应用，其特征在于，对待测水稻DNA进行扩增，若扩增条带大小为1965bp，则待测水稻RPS3a基因为野生型；若扩增条带有两条，且大小分别为789bp和1596bp，则待测水稻RPS3a基因第二内含子5’端拼接点处发生GT突变为AT。
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